NFI-C 결손이 생쥐 치수 세포의 유전자 발현에 미치는 영향 : cDNA
Kor J Oral Maxillofac Pathol 2008;32(3):129-138 NFI-C 결손이 생쥐 치수 세포의 유전자 발현에 미치는 영향 : cDNA microarray 분석 이동설1), 김성일2), 한평호2), 김흥중2), 김현만1), 고재승1), 손호현3), 박주철1)* 1) 서울대학교 치과대학 발생생물·구강조직학교실 및 치학연구소 2) 조선대학교 치과대학 구강해부학교실 서울대학교 치과대학 치과보존학교실 및 치학연구소3) 〈ABSTRACT〉 The Effect of NFI-C Disruption on the Gene Expression of Dental Pulp Cells in Mice: cDNA Microarray Analysis Dong Seol Lee1), Sung Il Kim2), Pyung Ho Han2), Heung Joong Kim2), 1) 1) 3) 1)* Hyun Man Kim , Jea Seung Ko , Ho Hyun Son , Joo Cheol Park Department of Developmental Biology & Oral Histology and Dental Research Institute, School of Dentistry, Seoul National University1) Department of Oral Anatomy and 2nd stage of BK21, College of Dentistry, Chosun University2) Department of Conservative Dentistry and Dental Research Institute, School of Dentistry, Seoul National University3) Nuclear factor I-C (NFI-C) null mice demonstrated aberrant odontoblast differentiation, abnormal dentin formation, and thus molar lacking roots. However, the mechanism by which the disruption of NFI-C gene affect the expression of other genes in dental pulp cells remains unknown. In this study, in order to understand this mechanism, the gene expression of pulp cells in NFI-C deficient mice were compared to those of wild-type mice by cDNA microarray analysis. According to the cDNA microarray profile comparison, the disruption of NFI-C gene increased the expression of TGF-β and TGF-βreceptor, whereas it decreased the expression of Smad proteins. Interestingly, most of the FGF-related genes were down-regulated in pulp cells by NFI-C gene disruption. Among the cell cycle-related genes, the expression of p16 and p18 were increased by NFI-C disruption, but the expression of cyclin E1 and cyclin D1 were decreased by NFI-C disruption. These results indicate that the disturbance of NFI-C gene suppressed the proliferation of pulp cells and up-regulated the expression of TGF-βand its downstream signaling molecules during root formation, contributing to the formation of short root containing abnormal dentin. Key words : NFI-C, Pulp cell, TGF-β, Cell cycle arrest, Microarray I. 서론 * Correspondence: Joo-Cheol, Park, Department of Developmental Biology-Oral Histology and Dental Research Institute, School of Dentistry, Seoul National University, 22 Yeongun-dong, Chongro-gu, Seoul, Korea. Tel : 02-740-8668, Fax : 02-763-3613, E-mail : [email protected] * 본 연구는 한국과학재단 특정기초연구(RO1-2006-000-10581-0) 지원으로 수행되었음. 치아의 발생과정은 치성상피와 외배엽성 간엽세포 사이의 상피-간엽상호작용을 통해 조절된다1). 치아발생에 대한 연 구는 세포와 분자 수준까지 많이 진행되어, 초기의 치아발생 129 에는 FGF, BMP, Msx1, Pax9 및 Cbfa1 등의 다양한 유전자 사한 비정상적인 상아질에 세포가 함입되고, DSPP mRNA가 들이 관여하는 것으로 알려졌으며 그들의 신호 전달경로들 발현되지 않는다고 하였다. 이는 NFI-C 결손 생쥐의 상아 2-5) 도 많이 밝혀져 있다 . 그러나 치아의 초기 발생과는 대조 모세포의 변화와 형태학적으로 유사한 것으로, TGF-β1 과 적으로 후기 치아발생, 즉 치근 형성과정에 관한 연구는 상 발현 생쥐와 NFI-C 결손 생쥐의 상아모세포들이 골모세포 아질 형성에 대한 cadherin, osteocalcin, osteonectin 및 와 유사한 세포로 표현형의 변환이 나타날 수 있음을 의미한 dentin sialoprotein 등의 일부 단백질의 역할과 관련된 연 다. 또한 이 연구 결과는 NFI-C 결손으로 초래된 상아모세 6-8) 구를 제외하고는 아직까지 알려진 것이 별로 없다 포의 분화 이상이 다른 유전자들 즉 TGF-β1과 같은 인자들 . 치근 상아질의 발생기전의 이해는 백악질을 포함하는 치주조직의 에 대한 간접작용의 결과에서 기인 할 수 있음을 시사한다. 재생뿐만 아니라 의도적 치아의 재이식 등의 임상적 적용에 이 연구는 치근과 상아질 형성과정에서 NFI-C의 역할과 도 중요하기 때문에 치근 상아질의 발생에 대한 연구는 기초 작용기전을 이해하기 위한 계획의 일환으로, 정상 생쥐와 치의학 뿐만 아니라 임상적으로도 매우 중요하다. NFI-C 결손 생쥐의 치수세포에서 발현되는 유전자의 차이 Nuclear factor I (NFI) family는 전사-복제 인자들로 를 cDNA microarray를 이용하여 비교 분석하였다. 앞으로 닭, 생쥐, 햄스터, 돼지 및 사람에서는 NFI-A, NFI-B, 이 연구 결과에서 얻은 NFI-C 결손에 의해 발현 변화된 유 NFI-C 그리고 NFI-X의 네 가지 유전자들로 이루어져 있으 전자들의 역할에 대한 추가 연구를 통하여 NFI-C 유전자 나, Drosophila melanoster와 Caenorhabditis elegans에 결손에 의한 비정상적인 상아모세포의 분화와 치근 상아질 9-11) 서는 하나의 유전자로 구성되어 있다 형성 과정을 이해하고자 한다. . NFI은 시험관에서 adenovirus의 DNA 복제에 필요한 단백질로 처음 발견되었 으나, 최근에는 많은 세포성 유전자들의 발현에 중요한 역할 12-14) 을 하는 단백질로 알려지고 있다 II. 재료 및 방법 . 예를 들어, NFI-A 유 전자가 없으면 뇌의 발생에 이상이 생기며15), NFI-B가 상실 되면 뇌와 폐의 발생에 이상이 나타난다16). Steele-Perkins 1. 정상 생쥐와 NFI-C 결손 생쥐의 치수세포배양 17) 등 은 NFI-C 결손(유전자 적중) 생쥐는 상·하악 전치의 정상 생쥐와 NFI-C 결손 생쥐의 전치에서 얻은 치수조직 크기가 작아지고 부러지기 쉽게 변형되며, 구치는 치관부는 을 무균상태에서 항생제가 함유된 Hankʼs Balanced Salt 정상이지만 치근이 짧거나 비정상적으로 형성된다고 하여, Solution (Gibco BRL, Rockville, USA) 용액으로 수회 세 NFI-C가 치근 상아질 형성과정 즉 상아모세포의 분화과정 척한 후, 해부현미경하에서 1-2 mm3 정도의 크기로 자른 다 18) 에서 중요한 역할을 함을 보고하였다. 또한 Park 등 은 음, 10% 열 불활성화된 fetal bovine serum (Gibco BRL, NFI-C 결손 생쥐의 비정상적인 상아모세포는 형태학적으로 Rockville, USA) 및 항생제 (penicillin 100 U/ml, strep- 극성과 방향성을 상실하고 자신이 분비한 기질에 묻히며, 상 tomycin 100μg/ml 및 fungizone 2.5μg/ml)가 함유된 아질의 표지자인 dentin sialophosphoprotein (DSPP)을 합 Dulbeccoʼs Modified Eagles Medium (DMEM, Gibco BRL, 성하지 않는 비정상적인 상아질을 형성하고 결과적으로는 Rockville, USA)을 이용하여 5% CO2, 37ﾟC, 100% 습도 상 인접 백악질 형성의 이상과도 연관된다고 하였다. 비정상적 태의 세포 배양기에서 일차 배양하였다. 인 치근 상아모세포가 분화하는 과정에서 Hertwigʼs 상피근 초는 정상적인 역할을 하는 것으로 관찰되어, NFI-C 결손 2. RNA 분리 및 순도 측정 은 Hertwigʼs 상피근초에 대한 영향은 없이 상아모세포의 2계대까지 배양된 각각의 세포를 1×PBS로 3회 세척 후 분화과정의 이상을 야기한다고 하였다. 그러나 아직까지 Trizol reagent (Invitrogen life tech, california, USA)를 NFI-C 결손이 비정상적인 상아질과 치근을 형성하는 정확 이용하여 total RNA를 추출하였다. RNA 순도를 측정하기 한 기전에 관하여는 잘 알려져 있지 않다. 위해 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Thyagarajan 등19)은 TGF-β1을 과발현시킨 형질전환 생 Clara, CA, USA)을 사용하여 rRNA ratio (28S/18S ribo- 쥐는 상아모세포의 세포 극성이 상실되며, 골양상아질과 유 somal RNA)를 확인하였다. 130 AAA TGG ATA CTG AC-3', 5'-TCT AGA CTA TGT TTG 3. cDNA microarray GAT CGT CAT GG-3'), FGFR2IIIb (5'-CAG GTA GCC 1) cDNA 합성 CAT GGT CTC AG-3', 5'-GGT GTT GGT CCA GTA CGG 일차 cDNA을 합성하기 위하여 total RNA 2μg, T7 TG-3'), TGF-β (5'-TGG TGG AGA GAA GAG GAA AA-3', 5'-TAA TTT GAG GTT GAG GGA GA-3'), Oligo dT primer 그리고 SuperscriptTM II RNase H– re- NFI-C (5'-GAC CTG TAC CTG GCC TAC TTT G-3', verse transcriptase (200 U/ml)와 함께 42ﾟC에서 2시간 5'-TTT CCA CCA AAA ATG CAG GCT GG-3'), GAPDH 동안 반응시켰다. 이차 cDNA를 합성하기 위하여 일차 (5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3', 5'-TCC ACC cDNA에 5 mM dNTP 4μl, DNA polymerase 2μl, RNase ACC CTG TTG CTG T-3'). H 1μl을 첨가하여 16ﾟC에서 2시간 동안 반응시켰다. cRNA 를 합성하기 위하여 dsDNA는 분리하여 증류수에 녹인 후, 5. Western blot 분석 ATP, CTP, GTP 혼합액, UTP, amino allyl UTP 그리고 T7 일차배양 세포를 PBS로 3회 세척한 후 scrapper로 세포 enzyme을 첨가하여 37ﾟC에서 14시간 반응시켰다. cRNA 3 를 회수하여 10,000 g에서 5분간 원심분리하였다. 상층액 μg은 Cy3 (Normal)와 Cy5 (Nfic (-/-))-dye (Amersham 제거 후 lysis buffer (100mM Tris, pH 7.4, 350 mM Pharmacia, Uppsala, Sweden)로 표지하였고, 표지된 NaCl, 10% glycerol 1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 1 cRNA는 hybridization을 하기 위하여 분절화하였다. mM dithiothreitol, 10μg/ml aprotinin, 10μg/ml leu- Hybridization은 100에서 200bp 유전자 절편을 micro- peptin, 10μg/ml pepstatin)로 4ﾟC에서 세포를 용해하였 array에 사용하였다. 다. 용해된 세포는 16,000 g에서 15분간 원심분리 하여 단백 질을 추출하였다. 단백질 정량 후 총 30μg의 단백질을 10% 2) Array hybridization SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel Fragmented target은 Agilent oligo microarray Kit을 electrophoresis)를 시행한 후 NC membrane에 87 V에서 2 이용하여 60ﾟC에서 16시간 동안 hybridization하였다. 시간동안 transfer 하였다. Membrane은 5% nonfat dry Microarray는 solution I (6×SSC, 0.00005% Triton-X milk/PBS- 0.1% Tween 20 (PBS-T)로 1시간 동안 억제한 100)을 사용하여 상온에서 10분간 수세하였다. 그런 다음, 후 PBS-T로 3회 세척하였다. 일차항체는 1:1000으로 solution II (0.1×SSC, 0.00005% Triton-X 100)를 사용하 PBS-T에 희석한 후 4ﾟC에서 밤새 반응시킨 다음 PBS-T로 여 4ﾟC에서 10분간 수세하였다. 3회 세척하였다. 이차 항체는 PBS-T에 1:10000으로 희석 하여 실온에서 1시간 동안 반응시킨 다음 PBS-T로 3회 세 3) Data 분석 척하였다. Enhanced chemiluminescence system (Amersham Microarray 영상은 GenePix 4000B 스캐너로 스캔하여 Biosciences, Piscataway, NJ)을 이용하여 암실에서 발현 GenePix v6.0 software을 이용하여 유전자 발현 비율을 분 을 확인하였다. 석하였다. 데이터는 scatter-plot smoother (LOWESS) 표 준화 방법을 이용하여 분석하였다. III. 실험결과 4. RT-PCR 분석 Superscript one-step RT-PCR kit (Invitrogen, 1. RNA 순도와 microarray의 scatter plot 분석 Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였고, 94ﾟC, 정상 생쥐의 치수세포와 NFI-C 결손 생쥐의 치수 세포로 30s; 58ﾟC, 30s; 72ﾟC, 45s; 32 cycle의 PCR 조건으로 유 부터 분리한 total RNA의 28S rRNA와 18S rRNA를 gel에 전자 특이적 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. Primer 서 확인하였으며, 18S rRNA에 대한 28S rRNA의 비율은 정 염기서열은 다음과 같다: FGF-10 (5'-GGA TTC ATG TGG 상 치수세포에서 1.93 그리고 NFI-C 결손 생쥐의 치수 세 131 L 1 2 A NFI-C WT B 18S 20% 28S rRNA 250 200 200 20 20 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 C sample 5% 2% 28S 0 0 18S rRNA 10% 18S 28S 250 50% NFI-C KO A260/280 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 Conc. (Amount) rRNA ratio (28S/18S Ribosomal) 1 NFI-C WT 1.98 4.6 1.6 2 NFI-C KO 1.9 6.5 1.7 Fig. 1. RNA quality control (QC) measured by the Agilent 2100 Bioanalyzer on samples of total RNA from wild type (WT) and NFI-C K/O (KO) pulp cells. A. Electrophoresis gel-like image. B. Assessment of RNA Integrity. C. Bioanalyzer report. Fig. 2. Scatter plot for wild type (WT) and NFI-C knock out (KO). For each spot, the intensity of the hybridization signal by KO was plotted against that by WT on a logarithmic scale. CY3(WT) 포에서 1.9로 분석되어 이 실험에 사용한 RNA는 micro- 2. TGF-β/BMP 신호전달경로에 연관된 유전자군 array에 적합한 것으로 판정 되었다(Fig. 1). 의 분석 Microarray image에서 좌측에 나타난 것은 NFI-C 결손 TGF-β/BMP 신호전달경로에 연관된 유전자군은 총 생쥐의 치수세포에서 많이 발현된 유전자이며, 우측은 19,022개 유전자 중 131개의 유전자가 포함되었다. 대표적 NFI-C 결손 생쥐의 치수 세포에서 정상에 비하여 적게 발 인 TGF-β와 TGF-β 수용체의 발현은 대체로 NFI-C 결 현된 유전자들이고, 중앙에 중첩된 부분은 두 세포 사이에서 손 생쥐의 치수세포에서 정상에 비하여 2배 이상 발현이 증 비슷하게 발현되는 유전자들이다(Fig. 2). 그림의 가운데 선 가하였다(Table 1). RT-PCR 분석에서도 TGF-β1 mRNA 의 위쪽과 아래쪽 선 위쪽에 나타난 유전자는 NFI-C 결손 의 발현은(Fig. 4) 정상 생쥐의 치수세포와 비교하여 NFI-C 생쥐의 치수세포가 정상 생쥐의 치수세포에 비하여 2배 이 결손 생쥐의 치수세포에서 발현이 증가하였다. 그러나 상 증가 또는 감소한 유전자를 나타내는데, 총 19,022개의 TGF-β 신호전달경로에 위치하는 Smad 유전자는 Smad 4 유전자 중 2,338개의 유전자가 NFI-C 결손 생쥐의 치수세 를 제외한 대부분의 유전자의 발현이 NFI-C 결손 생쥐의 포에서 2배 이상 증가 또는 감소한 것으로 나타났다. 치수세포에서 감소하였다(Table 1). 132 WT WT KO KO FGF10 TGF-β1 KO P21 NFI-C P16 GAPDH GAPDH WT Cyclin D1 FGFR2IIIb NFI-C Cyclin D1 GAPDH Fig. 3. The expression of TGFβ1 and NFI-C mRNA in primary pulp cells of wild type (WT) and knock out (KO) mice analyzed by RT-PCR. Fig. 4. The expression of FGF10, FGFR2IIIb, and NFI-C mRNA in primary pulp cells of wild type (WT) and knock out (KO) mice analyzed by RT-PCR. Fig. 5. The expression of p21, p16, cyclin D1 and cyclin B1 protein in primary pulp cells of wild type (WT) and knock out (KO) mice by western analysis. Table 1. TGF-β-related Genes Showing Fold Changes of Nfic (-/-) normalized with Normal. Gene symbol Gene Bank Number Tgfbr1 NM 009370 Transforming growth factor, beta receptor I 2.81 Tgfbr2 NM 009371 Transforming growth factor, beta receptor II 2.36 Tgfb3 NM 009368 Transforming growth factor, beta 3 3.98 Tgfb2 NM 009367 Transforming growth factor, beta 2 1.69 Tgfb1i1 NM 009365 Transforming growth factor beta 1 induced transcript 1 1.63 Smad1 NM 008539 MAD homolog 1 (Drosophila) Smad1 0.44 Smad2 NM 010754 MAD homolog 2 (Drosophila) Smad2 0.78 Smad3 NM 016769 MAD homolog 3 (Drosophila) Smad3 0.59 Smad4 NM 008540 MAD homolog 4 (Drosophila) Smad4 1.00 Smad5 NM 008541 MAD homolog 5 (Drosophila) Smad5 0.38 Smad6 NM 008542 MAD homolog 6 (Drosophila) Smad6 0.50 Gene Name Fold change 으나, FGFR2IIIb의 발현은 NFI-C 결손생쥐의 치수 세포에 3. Map-Kinase 신호전달경로에 연관된 유전자군 서 강하게 증가하였다(Fig. 5). 의 분석 Map-Kinase 신호전달경로에 연관된 유전자군은 총 19,022개 유전자 중 157개의 유전자가 포함되었다. 이들 유 4. Cell cycle과 연관된 유전자군의 분석 전자중 2배 이상 차이나는 유전자는 총 13개였으며 대표적 Cell cycle과 연관된 유전자군은 총 19,022개 유전자 중 인 FGF계인 FGF 5와 FGF 수용체 2/4는 2배 이상 발현이 227개의 유전자가 포함되었다. 이들 유전자 중 2배 이상 차 증가하였으며, 나머지 유전자들은 2배 이상 감소하였다 이나는 유전자는 총 19개였으며 대표적인 것들을 Table 3에 (Table 2). 치아 발생에 관여한다고 알려진 FGF 10과 그 수 요약하였다. 세포주기를 정지시키는 cyclin dependant kinase 용체인 FGFR2IIIb mRNA는 RT-PCR 분석에서 FGF10은 억제인자인 p16, p18, p35 그리고 p57의 발현은 2배 이상 NFI-C 결손 생쥐의 치수 세포에서 발현이 강하게 감소하였 증가하였으며, 세포주기를 진행시키는 cyclin D1과 E1의 발 133 Table 2. FGF-related Genes Showing Fold Changes of Nfic (-/-) normalized with Normal. Gene symbol Gene Bank Number Fgf5 NM 010203 Fgfr4 Gene Name Fold change Fibroblast growth factor 5 7.06 AF 12740 Fibroblast growth factor receptor 4 2.35 Fgfr2 BC 091652 Fibroblast growth factor receptor 2, mRNA 5.20 Fgf3 NM 008007 Fibroblast growth factor 3 0.32 Fgf9 NM 013518 Fibroblast growth factor 9 0.32 Fgf10 NM 008002 Fibroblast growth factor 10 0.20 Fgf18 NM 008005 Fibroblast growth factor 18 0.21 Fgfr1 NM 010206 Fibroblast growth factor receptor 1 0.43 Fgfr3 NM 008010 Fibroblast growth factor receptor 3 0.25 Fgf1 NM 010197 Fibroblast growth factor 1 0.35 Table 3. Cell cycle-related Genes Showing Fold Changes of Nfic (-/-) normalized with Normal. Gene symbol Gene Bank Number Cdkn2a NM 009877 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (p16) 3.32 Cdkn2c NM 007671 Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C (p18, inhibits CDK4) 2.73 Cables1 NM 022021 Cyclin-dependent kinase 5, regulatory subunit (p35) 1 3.06 Cdkn1a NM 007669 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (P21) 1.19 Cdkn1c NM 009876 Cyclin-dependent kinase inhibitor 1C (P57) 1.89 Ccnb1 NM 172301 Cyclin B1 0.99 Ccnd1 NM 007631 Cyclin D1 0.47 Ccne1 NM 007633 Cyclin E1 0.60 Cdc25a NM 007658 Cell division cycle 25 homolog A (S. cerevisiae) 0.63 E2f8 NM 001013 E2F transcription factor 8 0.48 Rb1 NM 009029 Retinoblastoma 1 0.46 Gene Name Fold change IV. 총괄 및 고안 현은 2배 이상 감소하였다 (Table 3). Western blot에서 세 포주기를 정지시키는 p16과 p21은 NFI-C 결손 생쥐의 치수 세포에서 강하게 증가하였으나, 세포주기를 진행시키는 cy- 치성상피는 치아기를 형성하여 법랑모세포로 분화하는 반 clin D1과 cyclin B1은 정상 생쥐의 치수세포에 비해 NFI-C 면에, 외배엽성 간엽세포는 치유두를 형성하여 상아모세포 결손 생쥐에서 발현이 감소하였다(Fig. 5). 로 분화하고 치관 상아질과 치수를 형성한다1). 치관이 완성 된 후에 내치상피와 외치상피가 치관 아래쪽으로 증식하여 Hertwigʼs 상피 근초를 형성한다. Hertwigʼs 상피 근초는 치 134 근의 형태를 결정하고 치근 상아질을 형성하는 상아모세포 이 관찰된다고 하였다. 따라서 면역조직화학에 의한 20) 의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다 . 그러나 이러한 Smad2/3 단백질의 발현이 microarray에 의한 이 연구의 치근형성 특히 상아질 형성에 관한 명확한 기전은 아직까지 Smad2/3 mRNA의 발현 양상과 상반된 결과를 나타냈다. 잘 알려져 있지 않다. 이와 관련하여 최근에 Yanagisawa 등 은 폐 상피세포에서 24) 이 연구에서는 치근과 상아질 형성과정에서 NFI-C의 역 TGF-β가 Smad3의 단백질 활성은 증가시키지만, 세포내 할과 작용기전을 이해하기위하여 NFI-C 결손 생쥐와 정상 음성 조절과정을 통하여 mRNA 발현은 감소시킨다고 하였 생쥐의 치수세포를 분리하여 두 집단의 변화된 유전자 발현 다. 폐 상피세포와 같이 치수세포에서도 동일한 과정에 의하 의 차이를 확인하기 위하여 cDNA microarray를 수행하였 여 Smad2/3 mRNA와 단백질 발현이 다르게 나타날 수 있 다. 다양한 방법의 cDNA microarray 중 이 실험에서는 으나 이를 명확히 하기 위해서는 향후 보완 연구가 필요하다. oligonucleotide chip을 이용하는 방법을 사용하였다. 이 방 TGF-β는 세포의 증식, 분화, 이주, 그리고 세포 사멸의 법은 두 집단의 세포에서 수만 개의 유전자 발현 정도를 비 조절을 통하여 발생과 조직의 항상성유지를 위한 중요한 역 교하여 세포 주기, 세포의 성장과 유지, 외부자극에 대한 반응, 할을 수행하는 인자이다. 최근에는 다양한 세포에서 TGF- 신호전달, 전사, 세포 자연사에 관련된 유전자의 발현 차이 β가 세포주기 정지와 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려지 를 광범위하게 알아낼 수 있다. 이 실험에서도 총 19,022개 고 있다25). TGF-β는 Smad 신호전달과정을 통하여 cyclin 의 유전자가 발현의 차이를 보였고 그 중 2,338개의 유전자 dependant kinase (Cdk) 억제제인 p15, p21 그리고 p27 등 는 NFI-C 결손 생쥐의 치수세포에서 2배 이상 증가 또는 을 활성화시킴으로써 세포주기를 정지시킨다. p21은 cy- 감소하였다. clin/CDK 복합체에 직접 결합하여 Cdk의 기능을 억제시키 NFI-C 결손이 치근 상아질 형성의 이상을 초래한다는 연 고 Cdc2/cyclinB, Cdk2/cyclinE 등의 활성도 억제하는 것 구 결과들과 더불어 최근에 DSPP나 bone sialoprotein 으로 알려져 있다 . 흥미롭게도 Ouellet 등 은 NFI이 p21 (BSP) 등의 유전자의 전사영역에서 NFI-C 결합부위와 전사영역에 결합하여 p21의 발현을 억제하는 중요한 인자라 TGF-β 반응영역이 동일한 부위에 중첩된다는 연구 결과들 고 하였다. 따라서 NFI-C 결손 생쥐의 치수세포는 p21의 24) 21,22) 이 알려지고 있다 26) . 이는 Smad2/3와 같은 TGF-β 신호 발현을 억제하는 NFI이 없는 상황에서 TGF-β와 Smad2/3 전달 물질과 NFI-C 사이에 기능적 관련성이 있음을 시사한 의존적인 경로를 통하여 p21 발현이 증가되고 cyclin B1과 다. 이 연구에서는 이들 사실에 기초하여 NFI-C 결손 생쥐 cyclin D1이 감소함으로서 치수세포의 세포증식이 억제된 의 비정상적인 치근 발생의 원인을 규명하기 위하여 cDNA 것으로 판단된다. microarray를 이용하여 TGF-β를 포함하는 다양한 유전자 Fibroblast growth factor (FGF)는 포유류에서 현재까지 발현 양상을 분석하였다. 이 연구에서 TGF-β와 TGF-β 23종이 보고되어 있는데, FGFs는 세포분열 유도, 세포 이 수용체의 발현은 microarray와 RT-PCR에서 모두 NFI-C 주, 증식, 신생 혈관 생성 및 세포 생존 유도 등에 관여하는 결손 생쥐의 치수세포에서 정상에 비하여 2배 이상 발현이 것으로 알려져 있다27). 또한 FGFs는 포유류의 팔과 다리, 증가하였으나, TGF-β 신호전달경로에 위치하는 Smad 유 중뇌, 폐, 머리카락 등의 많은 조직과 기관의 발생에 중요한 전전자는 Smad 4를 제외한 대부분의 유전자 발현이 NFI-C 역할을 수행하며, 그들이 작용할 때에는 FGF 수용체에 의하 23) 결손 생쥐의 치수세포에서 감소한 것으로 나타났다. 윤 등 여 활성화된다. 지금까지 4개의 FGFR (FGFR1-4)가 보고되 은 TGF-βR1과 Smad2/3의 면역조직화학적 연구에서 어있다28). TGF-β 발현을 반영하는 TGF-βR1은 정상 생쥐의 치수세 FGF계 인자 중에서 치아 발생에 중요한 역할을 수행한다 포와 비교하여 NFI-C 결손 생쥐의 비정상적인 상아질모세 고 알려진 것은 FGF10으로 FGF10은 receptor인 FGFR2와 포와 치수세포들에서 발현이 증가한다고 하였는데, 이는 이 작용하여 세포내 신호전달을 유도한다. 치아 발생에서 연구 결과와 부합하였다. 또한, 그들은 정상 생쥐의 치수 세 FGF10은 싹 시기의 외배엽성 간엽세포에서 발현하여 치관 포에서는 Smad2/3의 발현이 관찰되지 않았으나, NFI-C 결 기까지 그 발현이 유지되며 치수의 외배엽성 간엽세포의 세 손 생쥐의 치수세포에서는 Smad2/3 단백질의 발현이 뚜렷 포증식과 줄기세포 집단의 유지에 중요한 역할을 하는 것으 135 29) V. 참고 문헌 로 알려져 있다 . 그러나 치관기가 끝나고 치근 형성이 시 작되는 시기에는 FGF10의 발현이 감소된다. 생쥐의 발생중 인 어금니에 FGF10을 과발현시키면 Hertwigʼs 상피 근초가 1. Mina M, Kollar EJ. The induction of odonto- 형성되지 않고 치근단 상피싹(apical bud)이 형성되어 치근 genesis in non-dental mesenchyme combined with early murine mandibular arch epithelium. Arch 30) 발생에 이상이 초래된다고 하였다 . 반면에, 계속해서 치근 Oral Biol 1987;32:123-127. 이 자라나는 생쥐 전치부에서 FGF10은 치경륜(cervical 2. D'Souza RN, Alerg T, Gaikwad J. Cbfa1 is re- loop) 부근의 치수세포에서 강하게 발현하여 치경륜의 줄기 quired for epithelial-mesenchymal interactions 세포 특성을 유지하고 세포 증식을 유도함으로써 치아가 계 regulating tooth development in mice. Development 속 자라날 수 있게 한다고 하였다. 만약 전치부에서 FGF10 1999;126:2911-2920. 의 발현이 감소하면 어금니와 유사하게 더 이상 자라나지 않 3. Jiang H, Sodek J, Karsenty G, Thomas H, Ranly 는 치근이 형성되는 것이다. 이 연구에서 NFI-C 결손 생쥐 D, Chen J. Expression of core binding factor Osf2 /Cbfa-1 and bone sialoprotein in tooth development. 의 치수세포에서는 FGF4와 FGFR2/4를 제외한 대부분의 Mech Dev 1999;81:169-173. FGFs의 발현이 감소하였다. 이는 NFI-C 유전자의 결손이 4. Peters H, Balling R. Teeth;Where and how to make them. Trends Genet 1999;15:59-65. 전치부에서 FGF10의 발현을 감소시키고 이에 따라 전치부 치아가 짧아진 결과를 보인 것으로 해석된다. 이와 연관하여 5. Bronckers AL, Engelse MA, Cavender A. Cell- 최근 전립선에서 TGF-β1이 FGF10의 발현을 억제한다는 specific patterns of Cbfa1 mRNA and protein expression in postnatal murine dental tissues. Mech 보고도 있어, NFI-C 유전자의 결손에 의한 FGF10의 발현 억제가 NFI-C에 의해 직접적으로 유도된 것인지 TGF-β1 Dev 2001;101:255-258. 에 의하여 간접적으로 이루어진 것인지에 대한 추가 연구도 6. Young CS, Terada S, Vacanti JP. Tissue engineering of complex tooth structures on bio- 필요할 것이다. degradable polymer scaffolds. J Dent Res 2002;81: 결론적으로 이 연구 결과를 종합해 볼 때 NFI-C 유전자 695-700. 가 결손되면 치아의 치근 발생동안 직접적 혹은 TGF-β 세 7. Obara N, Suzuki Y, Nagai Y. Immunofluorescence 포내 신호전달 경로를 통하여 간접적으로 세포의 증식과 관 detection of cadherins in mouse tooth germs dur- 련한 다양한 유전자들이 조절되어 치수 세포와 치경륜 세포 ing root development. Arch Oral Biol 1999;44: 415-421. 의 특성을 변화시켜 치아의 치근 형성에 영향을 끼친 것으로 사료된다. 그러나 최근의 연구에 의하면 TGF-β는 위점막 8. Papagerakis P, Berdal A, Mesbah M, et al. 상피세포에서 Smad 신호전달 경로를 통하여 caspase-9을 Investigation of osteocalcin, osteonectin, and dentin sialophosphoprotein in developing human 활성화시키거나, MAPK (mitogen-activated protein kin- teeth. Bone 2002;30:377-385. ase) 신호전달 경로를 통하여 세포사멸(apoptosis)를 유도 9. Chaudhry AZ, Lyons GE, Gronostajski RM. Expression patterns of the four nuclear factor I 31) 한다고 알려지고 있다 . 또한 TGF-β는 TGF-β receptor I과 TGF-β receptor II 의 heteromeric complex에 의해 genes during mouse embryogenesis indicate a po- 세포내 신호전달을 활성화시키고, TGF-β receptor II는 tential role in development. Dev Dyn 1998;208: 313-325. Fas 관련 단백질인 Daxx와 작용하여 MAPKKK중 하나인 ASK1을 활성화 시켜 MAPK 경로를 통하여 JNK (Jun ami- 10. Chaudhry AZ, Vitullo AD, Gronostajski RM. no-terminal kinase)를 활성화 시켜 세포사멸을 유도한다 Nuclear factor I (NFI) isoforms differentially activate simple versus complex NFI-responsive 는 보고도 있다32). 따라서 향후 NFI-C와 TGF-β 세포내 promoters. J Biol Chem 1999;273:18538-18546. 신호전달 경로를 통한 치수세포의 사멸과 비정상적인 상아 11. Mukhopadhyay SS, Wyszomierski SL, Gronostajski RM, Rosen JM. Differential interactions of spe- 질과 치근 형성의 관련성에 대한 보완 연구도 필요할 것으로 사료된다. cific nuclear factor I isoforms with the gluco- 136 2004;31:184-192. corticoid receptor and STAT5 in the cooperative 21. Ogata Y, Niisato N, Furuyama S, et al. Transforming regulation of WAP gene transcription. 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