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Tuberculosis and Respiratory Diseases
결핵 및 호흡기질환, Vol. 54, No. 4, Apr, 2003
□원 저□
스테로이드제가 백서 폐의 Surfactant B와 C
유전자 발현에 미치는 영향
한양대학교 의과대학 내과학교실
박익수, 손장원, 윤호주, 신동호, 박성수
=Abstract=
Effect of Dexamethasone on Gene Expression of Surfactant Protein B
and Surfactant Protein C
Ik Soo Park, M.D., Jang Won Sohn, M.D.,
Ho Joo Yoon, M.D., Dong Ho Shin, M.D., Sung Soo Park, M.D.
Department of Medicine, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea
Background
:
Surfactant protein B(SP-B) and surfactant protein C(SP-C) are important in accelerating
surface spreading of surfactant phospholipid. The glucocorticoids accelerate the morphologic differentiation
of epithelial cells into type II cells and increase the rate of phosphatidylcholine synthesis. The
hydrophobic surfactant protein has been shown to be upregulated by glucocorticoids in vitro, however,
its regulation in vivo is not well established.
Methods : The authors investigated the effects of glucocorticoid on the accumulation of mRNA
encoding SP-B and SP-C protein content of the lung. Adult rats were given different doses of
subcutaneous dexamethasone and sacrificed at 24 hours and 1 week. SP-B and SP-C mRNA were
measured by a filter hybridization method.
Results : 1) The accumulation of SP-B mRNA at 24 hours after 0.2 mg/kg dexamethasone treatment
was increased by 23.7%. 2) The accumulation of SP-B mRNA at 1 week after 2 mg/kg dexamethasone
treatment was significantly increased by 96.6%(P<0.001). 3) The accumulation of SP-C mRNA at 24
hours after 0.2 mg/kg dexamethasone treatment was significantly increased by 42.7%(P<0.01). 4) The
accumulation of SP-C mRNA at 1 week after 2 mg/kg dexamethasone treatment was significantly
Address for correspondence:
Sung Soo Park, M.D., Ph.D.
Department of Medicine, College of Medicine, Hanyang University
17 Haeng dang dong, Sung dong ku, Seoul, 133-792, Korea
Phone : 02-2290-8347 Fax : 02-2298-9183 E-mail : [email protected]
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― I. S. Park, et al ―
increased by 60.0% (P<0.01).
Conclusion : The authors concluded that dexamethasone treatment in vivo resulted in increased levels of
SP-B mRNA and SP-C mRNA. These results suggested that dexamethasone stimulates the synthesis of
hydrophobic proteins associated with surfactant.(Tuberculosis and Respiratory Diseases 2003, 54:439-448)
Key Words : Gene expression, Surfactant protein B and C, Dexamethasone.
mRNA의 발현양상이 증가한다고 한다,7,8. 이와 같
서 론
이 표면활성물질 proteolipid의 발생학적 및 호르몬
표면활성물질
단백(surfactant
protein:
SP)B와
SP-C는 배수성 단백이다. SP-B의 비환원형의 분
의 조절은 출생 시 표면활성물질 기능에 중요한
역할을 한다9,10.
자량은 18kDa 이고, 표면활성물질의 기능을 위하
시험관에서 덱사메타손은 폐포와 세기관지 상피
여 필수적이며, SP-C의 전체 제조과정 및 인지질
세포들 내의 SP-B mRNA을 자극한다고 한다6. 또
의 포장에 필수적으로 관여한다. 생체내에서 SP-B
한 쥐에서 SP-B mRNA는 덱사메타손처치 후 15
와 SP-C 유전자들은 SP-A와 표면활성 물질의 지
시간에 최고치에 도달한 반면 사람에 있어서는 최
1
질들이 합성되기 전 발현된다 . 기관지폐포 세척액
고치에 달하는 시간이 2배나 더 길었다. 이러한 종
내 SP-B의 양은 급성폐손상, 급성호흡곤란증후군
(species)간에 최고치에 도달하는 시간의 차이는 종
(acute respiratory distress syndrome, ARDS), 폐
간의 역동학의 차이에 기인한다고한다. SP-B에 대
2,3
렴, 바이러스감염 및 미숙아에서 감소한다 . 혈장
한 스테로이드제의 효과에서 글루코코르티코이드
내
(glucocorticoid)는 사람의 선암세포계열에서 SP-B
SP-B가
증가하면
급성호흡부전증환자에서
ARDS으로 발전하는 것을 예측할 수 있다 . SP-B
mRNA의 합성을 강화시킨다11. 태아 폐 조직배양
의 결함은 lamellar body 및 tubular myelin 형성
에서 글루코코르티코이드에 노출 시켰을 때 SP-B
과 표면활성 물질의 인지질과 단백의 세포 내 통
mRNA와 SP-C mRNA뿐만 아니라 SP-B와 SP-C
로를 방해한다. SP-C는 배수성 단백이며, 비환원
의 단백들도 증가한다고 하였다1,5. 이와같이 시험
형의 분자량은 5-8 kDa이고 SP-A와 SP-B에 비
관에서의 실험을 통한 결과들에 의하면 투여한 글
하여 지방친화성이 강하다.
루코코르티코이드제의 용량과 기간에 따라 SP-B
4
SP-B mRNA의 발현은 여러 가지 호르몬에 의
mRNA와 SP-C mRNA은 증가한다. 그러나 동물
하여 영향을 받는다. 즉 시험관 내에서 1-200 nM
실험에서 SP-B mRNA와 SP-C mRNA에 대한 덱
의 덱사메타손(dexamethasone)과 cAMP는 SP-B
사메타손의 효과에 관한 보고는 드물다.
5,6
mRNA의 발현을 증가시킨 반면에 , triiodothy󰠀
이에 저자들은 실험동물에서의 백서에 서로 다
ronine은 시험관에서 SP-B mRNA의 축적을 억제
른 용량의 덱사메타손을 투여한 후 SP-B와 SP-C
6
한다 . 덱사메타손과 dibutyryl-cAMP를 동시에 사
의 유전자의 발현양상을 filter hybridization방법으
용하였을 때 SP-B mRNA축적 증가효과에 상승작
로 검색하여 덱사메타손의 서로 다른 투여양과 기
6
용이 있다 . 산모에게 덱사메타손을 투여하면 태아
간에 따른 실험동물의 SP-B와 SP-C 유전자발현
의 폐발생 단계에 따라 SP-B mRNA와 SP-C
에 대한 덱사메타손의 효과를 관찰하기 위하여 이
― 440 ―
― Effect of dexamethasone on gene expression of surfactant protein B and surfactant protein C ―
음에 담근 후 10,000 G의 microfuge로 5분동안 실
연구를 시행하였다.
온에서 원침하였다. Aqueous phase를 micropipet
로 새로운 Eppendorf tube에 옮긴 후 동량의
대상 및 방법
isopropanol을 가하여 RNA를 침강시켰다. 2시간이
상 -20℃에 잠복시킨 후, 10,000 G에서 5분동안
1. 실험동물
원침하였다. 상층액을 서서이 따른 후 침전물을
Sprague-Dawley쥐
150 μL의 solution D에 녹인 후 -20℃에 하룻밤동
(Sasco, Grand Island, Nebraska)를 새 환경에 2주
안 동량의 isopropanol로 재침전 시켰다. 5분동안
동안 순응 시킨후 본 연구에 사용하였다. 덱사메타
10,000 G로 원심분리 후 침전물을 모은 다음 70%
손을 1일 0.2 mg/kg 및 1일 2 mg/kg를 각각 8마
ethanol로 한차례 씻었다. 침전물을 건조한 후
리의 실험동물의 피하 내 투여 후 1일 0.2 mg/kg
diethyl pyrocarbonate (DEPC)로 처치한 1mM
의 투여군에서는 24시간 경과 후에, 1일 2mg/kg의
EDTA (pH 8)로 다시 부유액을 만들었다. 분리한
투여군에서는 1주일간 투여 후에 각각 희생시켰다.
RNA는 spectrophotometry의 260 nanometer에서
정상 대조군 8마리는 동량의 증류수를 피하 내 주사
정량 측정하였다. RNA의 질은 ethidium bromide
한 후 24시간 경과 후 및 1주일간 투여 후에 각각
로 염색한 formaldehyde/agarose denaturing gel로
희생하였다. 폐조직을 얻기 위해 실험동물을 희생한
확인하여 붕괴변질된 시료는 분석대상에서 제외시
후 폐를 전부 절취하였다. mRNA를 측정하기 위하
켰다.
실험동물은
300-380
gm의
여 500-750 mg의 폐조직을 10 mL의 solution D
(4M guanidium thiocyanate, 25mM sodium citrate
3. RNA hybridization assay
pH 7, 0.5% sarcosyl, 0.1 M 2-mercaptoethanol)에
넣은 후 Tissumizer (Tekma, Cincinnati, Ohio)로
mRNA의 정량을 전체 RNA의 fraction과 β-cyto󰠀
high speed에서 30-60초 동안 균질화한 후 -70℃
skeletal actin mRNA와 관련지어 filter hybridi󰠀
의 냉동실에 보관하였다.
zation 방법으로 측정하였다. 쥐의 SP-B와 SP-C
의 각각 SP의 complementary DNA (cDNA)에 대
한 완전한 coding부위를 Gem 4Z에 각각 subclone
2. RNA의 분리
하였다. Anti-sense나 sense 복사체를 SP6 RNA
12
Chomczynski와 Sacchi 의 방법으로 총 RNA을
polymerase를 이용하여 얻었다. 복사반응으로부터
solution D의
산출물은 linealized vector microgram (μg)당 전체
균등액으로부터
분리하였다.
즉
Eppendorf tube에 500 μL의 solution D를 넣고 pH
길이가 20-30 μg의 복사체였다(Fig. 1).
4.0인 50 μL 2M sodium acetate를 가하여 산성화
0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5 및 5.0 ng의 sense 복사체와
한 후 pH 7.5인 0.1 M Tris 및 pH 7.5인 10mM
1 μg의 RNA를 65℃에서 10-15분 변성시킨 후 3
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)로 완충한
장의 13 mm nitrocellulose filter (0.45 μm in pore
후 phenol 500 μL을 가하였다. 교반(vortex)으로
size, Schleicher and Schuell, Keene, NH)에 10×
잘 섞은 다음 chloroform과 isoamyl alcohol의 비
standard saline citrate (SSC)/ 50% formaldehyde
가 49 : 1인 용액 100 μL을 가한 후 다시 교반하
을 20 μL씩 가하였다. Filter들을 80℃에서 2시간
였다. Eppendorf tube 내 이 혼합물을 15분동안 얼
구워낸 후 1M sodium chloride, 10% dextran
― 441 ―
― I. S. Park, et al ―
Fig. 1. Schematic of the riboprobe gemini system..
sulfate, 50% formamide, 1% sodium dodecyl sul󰠀
4. 성적 분석
fate (SDS)를 포함하는 prehybridization용액을 fil󰠀
ter당 0.2-0.5mL양으로 56℃에서 12-14시간 50mL
통계학적 평가는 unpaired student's t-test로 정상
Falcon centrifuge tube내에서 흔들면서 prehybri󰠀
대조군과 각 군간의 mRNA값 사이에서 평가하였
dization 하였다. Prehybridization 후 4×SSC, 1×
다. 회귀방정식은 Epistat statistical package를 활
Denhardt's solution, 45% formamide, 10% dex󰠀
용하여 산출하였고, Probability value는 0.05미만을
tran sulfate, 0.5% SDS, 0.1mg/mL salmon sperm
유의한 것으로 판정하였다.
DNA의 용액을 filter당 0.2-0.5 mL 가한 후 특이
활성도가 5×106 cpm/mL인
32
P로 표지시킨 쥐의
결 과
특이 cDNA probe로 56℃에서 흔들면서 17-20시
간 동안 hybridization하였다. 모든 filter는 실온에
1. SP-B와 SP-C에 대한 sense 복사체의 표준곡선
서 2×SSC, 0.2% SDS용액으로 3번, 65℃에서 0.1
×SSC, 0.2% SDS 용액으로 3번 세척하였다.
SP-B와 SP-C의 sense 복사체 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5
Filter는 공기 중에 말린 후 scintillation vial로 각
및 5ng에 대한 cpm과의 표준곡선 및 상관계수(r)는
각 계산하였다. 특이 mRNA는 회귀방정식을 사용
다음과 같다. SP-B에 대한 sense 복사체의 표준곡선
하여 표준곡선으로 부터 산출하였다.
은 Y=0.00037X-0.04 (Y=SP-B mRNA 복사체, X=
― 442 ―
― Effect of dexamethasone on gene expression of surfactant protein B and surfactant protein C ―
Dexamethasone
Dexamethasone
0.2mg/kg
0.2 mg/kg
24h
*
24h
Diluent 24h
Diluent 24h
0
50
100
0
150
50
% compared to diluent 24 h
Values given are mean ± SEM.
150
200
Values given are mean ± SEM.
Fig. 2. SP-B mRNA expression from the rat
lungs 24 hours after subcutaneous admi󰠀
nistration of diluent or dexamethasone of
0.2mg/kg.
Dexamethasone
2mg/kg 1 WK
100
% compared to diluent 24 h
* P < 0.01 compared to diluent 24 h
Fig. 4. SP-C mRNA expression from the rat
lungs 24 hours after subcutaneous admini󰠀
stration of diluent or dexamethasone of 0.2
mg/kg.
Dexamethasone
2mg/kg
1 wk
*
Diluent 1wk
*
Diluent 1wk
0
50
100
150
200
250
0
% compared to diluent 1 wk
50
100
150
200
% compared to diluent 1 wk
* P < 0.001 compared to diluent 1 wk
* P < 0.01 compared to diluent 1 wk
Values given are mean ± SEM.
Values given are mean ± SEM.
Fig. 3. SP-B mRNA expression from the rat
lungs 1 week after subcutaneous admini󰠀
stration of diluent or dexamethasone of 2
mg/kg.
Fig. 5. SP-C mRNA expression from the rat
lungs 1 week after subcutaneous admini󰠀
stration of diluent or dexamethasone of 2
mg/kg.
CPM)이고 r은 0.99 이었다. SP-C에 대한 sense
가 증가하였다(P<0.001) (Fig. 3).
복사체의 표준곡선은 Y=0.0014X-0.19 (Y=SP-C
mRNA 복사체, X=CPM)이고 r은 0.99 이었다.
β-actin mRNA의 축적은 정상대조군과 각 군간
에 의의있는 변화는 없었고, β-actin mRNA의 축
적은 일정하였다.
2. SP-B mRNA의 축적
3. SP-C mRNA의 축적
덱사메타손을 1일 0.2 mg/kg를 투여하고 24시간
경과 후 SP-B mRNA양은 대조군에 비하여 23.7%
덱사메타손을 1일 0.2 mg/kg를 투여하고 24시간
가 증가하였으며(Fig. 2), 덱사메타손을 1일 2
경과 후 SP-C mRNA양은 대조군에 비하여 42.7%
mg/kg씩 1주일간 투여 후 대조군에 비하여 96.6%
가 증가하였으며(P<0.01)(Fig. 4), 덱사마타손을 1
― 443 ―
― I. S. Park, et al ―
일 2 mg/kg씩 1주일간 투여 후 대조군에 비하여
가 각 filter에 부하된 RNA와 관련하여 직선관계
60.0%가 증가하였다(P<0.01) (Fig. 5).
가 성립되고, hybridization이 특이하다면 정상대조
β-actin mRNA의 축적은 정상대조군과 각군간
군 및 스테로이드제로 처치한 군에서 filter당 cpm
에 의의있는 변화는 없었고, β-actin mRNA의 축
을 비교함으로서 상대량을 평가할 수 있다. 본 실
적은 일정하였다.
험에서 사용한 각 nitrocellulose filter는 80 μg/㎠
량의 RNA와 결합할 수 있다. 본 연구에서 사용한
filter hybridization방법은 Northern blot이나 slot
고 찰
blot보다 소량의 변화에도 민감하고 재현성이 높을
SP들은 표면활성물질의 물리적 성상의 결정 및 대
27
뿐 아니라 방법에 있어서도 용이하다 .
Abe와
사조절에 있어서 중요한 역할을 담당하는데 SP 중
SP-B와 SP-C는 배수성 단백이지만, 아미노산 염
Tierney28는
히드로코르티손(hydrocor󰠀
tisone)을 1일 8 mg/kg씩 1주일간 쥐에 투여 후
기서열과 이차구조에 있어 현저하게 다르며 폐조
전폐의 saturated phosphatidylcholine이 25%가 증
직내에서만 발현된다. 그러나 새로 생성된 SP-B와
가되었다고 보고하였다. 덱사메타손이 히드로코르
SP-C의 세포내 진행과정은 서로 유사한 경로를
29
티손보다 폐조직에 더 큰 친화력이 있다 . 덱사메
거친다. SP-B유전자의 불활성화는 표면활성물질
타손은 쥐의 폐에서 다른 폐세포들보다 특히 2형
지질분비의 경로를 혼란케 하며 결과적으로 SP-C
폐세포의 핵에서 증명된다30. Young과 Silbajoris31
13
의 비정상적인 제조과정을 초래하게 된다 .
은 덱사메타손을 1일 2 mg/kg씩 1주일간 투여 후
표면활성물질의 신속한 film형성에 있어 필수적
에 쥐의 폐 표면활성물질의 lipid pool이 증가하는
인 배수성 단백인 SP-B와 SP-C, 그리고 SP-A는
것은 lamellar body의 용적에는 변화가 없는 것으
상호협동작용을 하여 단층의 표면장력을 감소시킨
로 보아 lamellar body에서 인지질의 용적변화 때
14
다 . SP-B는 SP-A와 협력하여 tubular myelin을
문이라고 보고하였다. 부신적출술을 시행한 쥐에서
형성하며, 계면필름에 지질 수포를 결합하게 하는
세포외 인지질양의 감소현상이 있었으며, 히드로코
32
15
르티손을 투여하면 감소현상을 방지할 수 있었다 .
능력을 증강시킨다 .
SP-B는 표면활성물질 기능을 위한 필수적인 인
2형 폐포상피세포들과 세기관지 상피세포 중 일부
자이며 동형접합 유전적 SP-B단백의 결함이 있을
세포들의 SP-B mRNA는 덱사메타손의 영향을 받
13,16
때에는 치명적이다
. SP-C는 표면에서 인지질의
33,34
는다
.
흡수를 촉진하고 , film내 인지질의 구성을 변화시
1
Liley등 은 사람의 태아 폐내에서 SP-B mRNA
켜 작은 압축된 영역을 산출한다18. 폐 손상을 입
와 SP-C mRNA은 임신 13주부터 검출할 수 있으
은 쥐에 SP-C만 포함한 SP를 투여하였을 때 폐기
며 임신 24주에 SP-B mRNA 는 성인량의 50%까
17
19
능이 호전되었다 . 이와같이 SP-B와 SP-C는 공
지 도달하며, SP-C mRNA는 15%까지 도달한다
기액체계면에 지질 수포를 결합하게 하여 인지질
하였다. 이와같이 글루코코르티코이드의 작용기전
의 흡착과 표면활성화를 증강시키는데, 이러한 능
은 폐의 형태학적 발생을 촉진시키며, 표면활성물
20-26
력은 SP-B가 SP-C보다 4배 강하다
질 인지질의 생산을 증가시키고, SP-B와 SP-C의
.
전체 RNA에 대한 정상 mRNA의 함량은 sense
9,10,35,36
축적 및 폐탄성을 향상시킨다
.
본 연구의 결과 덱사메타손을 1일 0.2 mg/kg 투
복사체를 이용한 표준곡선을 이용하여 얻을 수 있
었다. 이와는 대조적으로 β-actin mRNA의 축적은
여하고 24시간 경과 후 SP-B mRNA양은 23.7%가
각 군에 있어서 항상 일정하였다. 이와같이 cpm치
증가하였다. 덱사메타손을 1일 2 mg/kg씩 1주일간
― 444 ―
― Effect of dexamethasone on gene expression of surfactant protein B and surfactant protein C ―
투여 후 SP-B mRNA양은 대조군에 비하여 96.6%
11
바에 의하면 글루코코르티코이드를 투여한 후에
가 유의하게 증가하였다. O'Reilly등 은 시험관에
SP-B mRNA와 SP-C mRNA가 증가한다. 그러나
서 10nM 덱사메타손에 노출 시 SP-B mRNA은
동물실험에서 SP-B mRNA와 SP-C mRNA에 대
12-24시간부터 증가하여 72시간까지 유지된다 하
한 스테로이드제의 효과에 관한 보고는 드물다.
였다. SP-B mRNA은 시험관 내에서 10nM의 덱
방 법:
사메타손에 노출 후 10시간부터 증가하여 48시간
저자들은 실험동물에서 SP-B와 SP-C의 유전자
1
에 4배 증가하였다 . 실험동물에서 SP-B mRNA량
발현를 파악하고자 서로 다른 용량과 기간에 따른
은 덱사메타손을 2mg/kg투여한지 24시간 경과 후
덱사메타손을 백서에 투여한 후 이들 유전자 발현
34
5.2배 증가하였다 .
양상을 filter hybridization방법으로, 덱사메타손의
본 연구성적에서 덱사메타손을 1일 0.2 mg/kg
서로 다른 용양과 기간에 따른 SP-B와 SP-C의
투여한지 24시간 경과 후 SP-C mRNA량은 42.7%
유전자 발현 효과를 평가하였다.
가 유의하게 증가하였다. 덱사메타손을 1일 2
결 과:
mg/kg씩 1주일간 투여 후 SP-C mRNA량은 대조
1) 덱사메타손을 1일 0.2 mg/kg 투여하고 24시간
군에 비하여 60.0%가 유의하게 증가하였다. SP-C
경과 후 SP-B mRNA양은 대조군에 비하여 23.7%
mRNA은 시험관 내에서 10nM의 덱사메타손에 노
가 증가하였다. 2) 덱사메타손을 1일 2 mg/kg씩
출 후 10시간부터 증가하여 48시간에 30배 증가하
일주일간 투여 후 SP-B mRNA양은 대조군에 비
1
였다고 한다 .
하여 96.6%가 증가하였다(P<0.001). 3) 데사메타손
본 연구결과에서 덱사메타손을 투여 후 SP-B
을 1일 0.2 mg/kg 투여하고 24시간 경과 후 SP-C
mRNA와 SP-C mRNA양은 시험관 및 실험동물에
mRNA양은 대조군에 비하여 42.7%가 증가하였다
1,5
서 다른 연구결과들과같이 증가하였다 .
(P<0.01). 4) 덱사메타손을 1일 2 mg/kg씩 1주일
이상의 결과는 실험동물에서 서로 다른 덱사메
간 투여 후 SP-C mRNA양은 대조군에 비하여
타손의 양과 기간에 따른 SP-B mRNA와 SP-C
60.0%가 증가하였다(P<0.01).
mRNA양은 소량을 투여하였을 때보다 대량을 투
결 론:
여 하였을 때, 단기간보다는 장기간 사용하였을 때
이상의 결과는 실험동물에서 서로 다른 덱사메타
유의한 증가가 있음을 알 수 있었다.
손용량과 기간에 따른 SP-B mRNA와 SP-C
mRNA양은 덱사메타손양을 소량을 투여하였을 때
보다 대량을 투여 하였을 때, 또는 단기간보다는
요 약
장기간 사용하였을 때 유의한 증가가 있음을 지적
하고 있다.
연구배경 :
SP는 표면활성물질의 물리적 성상의 결정 및 대사
참 고 문 헌
를 결정하는데 있어서 중요한 역할을 담당한다.
SP-B와 SP-C는 배수성 단백이며 공기액체계면에
지질 수포를 결합하게 하여 인지질의 흡착과 표면
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활성을 증강시킨다. 글루코코르티코이드는 폐의 형
Hawgood
태학적 발생을 촉진시키며, 표면활성물질 인지질의
messenger RNAs for the hydrophobic sur󰠀
생산을 증가시키고, SP-B와 SP-C의 축적 및 폐탄
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