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 AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer en primer lugar a mis profesores guías, Prof. Dra. Marcela
Hernández, Prof. Dra. Andrea Dezerega y Prof. Dr. Jorge Gamonal, por su
paciencia, apoyo y amistad durante el desarrollo de este trabajo, y también del
Programa de Magister, sin su ejemplo de amor a la ciencia y generosidad en el
aprender nada de esto hubiese sido posible.
A mis evaluadores, Prof. Dr. Rolando Vernal, Prof. Dr. Sergio Acosta y Prof.
Irene Morales, por sus valiosos aportes y tiempo dedicado a mi trabajo.
Quisiera también agradecer a todas las personas que trabajan en el Laboratorio
de Biología Periodontal, especialmente a Leslie Henríquez y Jocelyn García, por
toda la ayuda que me brindaron.
A mis compañeros de Magíster, en especial a Constanza Osorio y Franco
Cavalla, por siempre tener una palabra de aliento y un aporte en el desarrollo de
esta tesis.
Al Departamento de Cirugía, que permitieron la toma de muestras durante el
desarrollo de su cátedra, por la paciencia de todos esos alumnos y pacientes
que colaboraron en la recolección de muestras.
Y finalmente, y no menos importante, a mis amigos y familiares que me
ayudaron de alguna manera durante estos años de estudio de postgrado.
2
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS 2 ÍNDICE 3 ABREVIACIONES 5 REACTIVOS 8 INTRODUCCIÓN 9 RESUMEN 10 ASPECTOS TEÓRICOS 1. Periodontitis Apical Crónica 2. Fluido Gingival Crevicular 3. Metaloproteinasas de Matriz Extracelular (MMPs) 3.1. Generalidades 3.2. Características Estructurales 3.3. Clasificación 3.4. Regulación de la actividad de MMPs 4. MMPs y PAC 13 13 16 19 19 20 20 27 31 HIPÓTESIS 38 OBJETIVO GENERAL 38 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 38 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Selección de Pacientes 2. Obtención de las muestras 2.1. FGC y elución 2.2. LPAs y homogeneización de tejido lesional 3. Determinación de la concentración de proteínas totales (CPT) 4. Zimografía en gelatina 5. Ensayo fluorescente de actividad de la MMP-­‐13 6. ELISA 7. “Immunowestern blot” 8. Análisis estadístico 40 40 41 41 42 43 43 44 45 45 46 RESULTADOS 47 1. Características generales de los pacientes 47 2. Concentración de proteínas totales en FGC proveniente de dientes con PAC y sanos 48 3. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -­‐2, -­‐9 y -­‐13, y niveles de α2-­‐
macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos 49 3.1. Formas enzimáticas de las MMPs -­‐9, -­‐2 y -­‐13 en FGC de dientes con PAC y sanos
49 3.2. Niveles totales y actividad de MMPs -­‐2 y -­‐9 en FGC de dientes con PAC y FGC sano 50 3
3.3. Actividad basal y total de MMP-­‐13 en FGC de dientes con PAC y sanos 56 3.4. Niveles de α2-­‐ macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos 57 4. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -­‐2, -­‐9 y -­‐13 en tejido correspondiente a LPAs y ligamento periodontal sano. 58 4.1. Formas enzimáticas de las MMPs -­‐2, -­‐9 y -­‐13 en tejido correspondiente a LPAs y LS 58 4.2. Niveles totales y actividad de MMPs -­‐2 y -­‐9 en tejido correspondiente a LPAs y LS
60 4.3. Actividad basal y total de MMP-­‐13 en tejido correspondiente a LPAs y LS 64 5. Asociación de la presencia, niveles y actividad de los mediadores de interés entre muestras de tejido lesional y FGC de los dientes correspondientes. 65 6. Asociación de la presencia y niveles de estos mediadores con antecedentes generales (edad, género) y características clínicas (tabaquismo y diámetro promedio de la lesión) de los sujetos de estudio. 65 6.1. Edad 66 6.2. Género 66 6.3. Tabaquismo 67 6.4. Tamaño de la lesión 69 DISCUSIÓN 71 CONCLUSIONES 88 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 91 ANEXOS Y APÉNDICE 1. Anexo 1: Formulario de Consentimiento Informado 2. Anexo 2: Ficha clínica 104 104 105 4
ABREVIACIONES
PAC
periodontitis apical crónica
PAa
periodontitis apical asintomática
GPA
granuloma periapical
QRI
quiste radicular inflamatorio
LPAs
lesiones periapicales
PMNs
polimorfonucleares neutrófilos
MEC
matriz extracelular
RANK-L
ligando del receptor activador del factor Nuclear κB
IL
interleuquina
TNF
factor de necrosis tumoral
MMPs
metaloproteinasas de matriz extracelular
IFN
interferón
GM-CSF
factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos
G-CSF
factor estimulador de colonias granulocitos
M-CSF
factor estimulador de colonias de macrófagos
TGF
factor de crecimiento transformante
PGs
prostaglandinas
LTs
leucotrienos
FGC
Fluido Gingival Crevicular
α-PI
inhibidor de proteinasa α-1
ADAMS
metaloproteinasas y disintegrina
ADAMTs
ADAMs con un motivo trompospondina
5
GFR
receptores de factores de crecimiento
MT-MMPs
MMP transmembrana
SDF
factor derivado de células estromales
MCP
proteína quimiotáctica de monocitos
α2M
α2-macroglobulina
PAI
inhibidor del activador del plasminógeno
IGF
factores de crecimiento similares a insulina
PDGF
factor de crecimiento derivado de plaquetas
bFGF
factor básico de crecimiento de fibroblastos
TIMP
inhibidor tisular de metaloproteinasas
IGFP
proteína de crecimiento transportadora
EGF
factor de crecimiento epidermal
BFGF
factor de crecimiento derivado de cerebro
APMA
acetato 4-aminofenilmercurico
SDS
dodecil sulfato sódico
LRP1
receptor de lipoproteína de baja densidad tipo 1
A2MR
receptor α2-macroglobulina
PCP
proteinasa C-terminal de procolágeno
TFPI
inhibidor de la vía del factor tisular
RECK
proteína rica en cisteína con motivos kazal
ICTP
telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I
qPCR
PCR en tiempo real
LS
ligamento sano
CPT
concentración de proteínas total
BSA
albúmina sérica de bovino
6
PF
producto fluorescente
mg
milígramo
pg
picogramo
mL
mililitro
µg
microgramo
ua
unidades arbitrarias
kDa
kilodalton
7
REACTIVOS
Anticuerpos
Monoclonal antihumano MMP-2, R&D Systems, Minneapolis, USA
Monoclonal antihumano MMP-9, R&D Systems, Minneapolis, USA
Monoclonal antihumano MMP-13, R&D Systems, Minneapolis, USA
Secundario anti ratón conjugado con peroxidasa, Thermo Scientific, Pierce
Biotechnology, USA
Kits
Fluorokine E, R&D Systems, Minneapolis, USA
ELISA α2-macroglobulina, Immundiagnostik, Bensheim, Alemania
Sustrato quimioluminiscente, Femto, Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford,
USA
Ácido bicinconínico, BCA, Pierce Biotechnology, Rockford, USA
Otros
Tiras de papel absorbente, PeriopaperTM, ProFlow, Amityville, New York, USA
Cocktail inhibidor de proteasas libre de EDTA, Roche Diagnostics GmbH, Basel, Suiza
Películas radioautográficas Thermo Scientific CL-XPosure Film, Pierce Biotechnology,
USA
8
INTRODUCCIÓN
La Periodontitis Apical Crónica (PAC) corresponde a la inflamación y
destrucción de los tejidos perirradiculares causada por la infección bacteriana de
la pulpa dental. El sello de esta patología es la presencia de una lesión apical
(LPA), que resulta de la destrucción de los tejidos apicales duros y blandos.
Una diversidad de mediadores inflamatorios han sido descritos como
participantes en la patogenia de esta enfermedad. Algunos de ellos han sido
estudiados a partir de exudado periapical, biopsias y, de manera más reciente,
fluido gingival crevicular (FGC). Entre los mediadores estudiados, se ha descrito
la participación de un grupo de enzimas genéticamente distintas pero
estructuralmente similares llamadas metaloproteinasas de matriz extracelular
(MMPs). Éstas son capaces de degradar todos los componentes de la matriz
extracelular (MEC). Entre ellas, las colagenasas y gelatinasas tienen un rol
preponderante, al participar directamente en la degradación del colágeno, uno
de los principales componentes de los tejidos periodontales.
A la fecha no han sido caracterizados los niveles y actividad de las MMPs
-2, -9 y -13, y de α2M en el FGC de dientes con PAC y de dientes sanos, en
LPAs y LS.
9
RESUMEN
La PAC corresponde a la inflamación y destrucción de los tejidos
perirradiculares causada por la infección bacteriana de la pulpa dental, que
genera una activación de la respuesta inmune. Esta respuesta del hospedero
involucra una serie de elementos celulares y mediadores moleculares, entre
ellos, las MMPs, enzimas estructuralmente relacionadas, pero genéticamente
distintas que degradan componentes de la MEC. Éstos mediadores y sus
inhibidores, como α2-macroglobulina (α2m) y TIMPs, han sido estudiados a
partir de biopsias de LPAs, exudado periapical y FGC. Éste último presenta
ventajas sobre estos métodos tradicionalmente utilizados. Por ende, se plantea
que existe un aumento en los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y -13, y
niveles reducidos de α2m en dientes con PAC en comparación con controles sin
patología periapical, cambios que se ven reflejados en el FGC. El objetivo de
este estudio es caracterizar los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y -13, y de
α2m en el FGC de dientes con PAC y de dientes sanos, en LPAs y ligamento
periodontal sano (LS).
Materiales y Métodos: Se seleccionaron pacientes con diagnóstico clínico de
PAC e indicación de endodoncia (n=31), a partir de los cuales se obtuvieron
muestras de FGC; pacientes con diagnóstico de PAC e indicación de extracción
(n=23), a partir de los cuales se obtuvieron muestras de FGC y/o de LPAs
correspondientes al mismo diente, y pacientes con indicación de exodoncia de
10
premolares sanos por ortodoncia (n=27), a partir de los cuales se obtuvo LS. Se
determinó la concentración de proteínas totales (CPT) en las muestras de FGC.
Se midió actividad y niveles totales a todas las muestras mediante zimografía,
actividad basal y total de MMP-13 mediante ensayo de actividad “Fluorokine E”,
niveles de α2M en FGC mediante ELISA, formas enzimáticas en todas las
muestras mediante “immunowestern blot”. Se realizó el análisis estadístico a los
resultados obtenidos con el software Stata10.
Resultados: Se observó una CPT similar entre muestras de FGC provenientes
de dientes con PAC y sanos. Se identificaron las formas enzimáticas de las
MMPs -9, -2 y -13 en FGC de dientes con PAC y sanos, y en muestras de
homogeneizados, y se corroboró la correspondencia entre las bandas
inmunorreactivas identificadas por “immunowestern blot” y zimografía en
gelatina, identificadas como MMPs -9 y -2. No se observaron diferencias
significativas entre los niveles totales, de proformas, formas activas y razón de
activación de MMPs -9 y -2 en FGC mediante zimografía. En FGC de pacientes
con PAC se observó correlación negativa entre la forma activa de MMP-9 y la
forma activa de MMP-2 mientras que en FGC de sujetos sanos se observó
correlación negativa entre la proforma y la forma activa de la MMP-2. No se
observaron diferencias significativas en la actividad basal y total de MMP-13
entre FGC de dientes con PAC y sanos. Los niveles de α2m fueron similares
para ambos tipos de muestras. Los niveles totales, actividad de la proforma,
forma
activa
de
MMP-9
y
razón
de
activación
de
MMP-2
fueron
11
significativamente mayores en LPAs en comparación con LS, mientras que no
hubo diferencias significativas entre los niveles totales, actividad de proforma y
forma activa de MMP-2, razón de activación de MMP-9 y actividad basal y total
de MMP-13 entre ambos tipos de muestras. No se observó correlación en la
actividad tanto de las proformas como de las formas activas de las MMPs en
estudio presentes en el FGC con las presentes en las LPAs. En relación a los
antecedentes clínicos, se observaron correlaciones positivas entre la edad y
proforma de la MMP-9 y forma activa de la MMP-2 en muestras de LS. En LPAs,
no se obtuvieron diferencias significativas de los niveles de los mediadores
estudiados entre los géneros mientras que, en LS, el género femenino presentó
mayores niveles de la proforma de la MMP-9 y de la forma activa de la MMP-2.
Los valores obtenidos para los mediadores en estudio no varían entre el grupo
completo de pacientes y el grupo de no fumadores. Se obtuvo una correlación
positiva entre el diámetro de las LPAs con las formas activas de MMPs -9 y -2.
Conclusiones: Las MMPs -9 y -2 tendrían un rol preponderante en la patogenia
de la PAC. A pesar de que en el presente trabajo la caracterización de los
mediadores en estudio en FGC no ha sido capaz de reflejar los cambios que
ocurren en las LPAs, futuros estudios deben considerar la influencia de esta
patología en la composición y actividad proteolítica de éste. Un conocimiento
más acabado de los mecanismos involucrados en la destrucción del periodonto
apical contribuirán al desarrollo de métodos diagnósticos, de tratamiento y
herramientas de seguimiento de uso rutinario. 12
ASPECTOS TEÓRICOS
1. Periodontitis Apical Crónica
La PAC, o periodontitis apical asintomática (PAa), según la clasificación
recientemente propuesta por la Asociación Americana de Endodoncia [1] ,
corresponde a la inflamación y destrucción de los tejidos perirradiculares
causada por la infección bacteriana de la pulpa dental. Es la consecuencia más
común de la caries dental no tratada y frecuentemente lleva a la pérdida
dentaria. La PAC se define como la inflamación y destrucción del periodonto
apical de origen pulpar asociada con un área radiolúcida periapical en ausencia
de sintomatología clínica [2, 3].
La PAC se caracteriza por la formación de una lesión osteolítica
perirradicular que histológicamente puede corresponder a un granuloma
periapical (GPA). Este puede progresar eventualmente hacia el desarrollo de un
quiste radicular inflamatorio (QRI), como resultado de la proliferación de los
restos epiteliales de Malassez frente al estímulo inflamatorio crónico [4]. Se ha
descrito que un porcentaje menor al 20% de las lesiones periapicales
corresponden a un QRI [5].
Las LPAs se desarrollan como resultado de la activación de la respuesta
inmune frente a la estimulación antigénica continua proveniente de los restos
pulpares necróticos en los canales radiculares, producto de la infección
bacteriana. Esta respuesta del hospedero involucra una serie de elementos
celulares y mediadores moleculares. El infiltrado inflamatorio perirradicular en las
13
LPAs está constituido principalmente por macrófagos, células T y B. También lo
conforman en menor medida, polimorfonucleares neutrófilos (PMNs), células
plasmáticas y macrófagos [3, 6].
El GPA está formado por células inflamatorias, tejido conjuntivo, cristales
de colesterol y cordones de epitelio proliferante derivados de los restos de
Malassez; mientras que un QRI corresponde a una cavidad patológica,
delimitada por epitelio plano pluriestratificado no queratinizado y una cápsula
conjuntiva
inflamada.
predominantemente
en
El
tejido
pequeños
extra
vasos
epitelial
de
sanguíneos,
un
QRI
linfocitos,
consiste
células
plasmáticas y macrófagos [7]. El GPA y QRI comparten características en
común, como la mantención de un infiltrado inflamatorio crónico, usualmente
asociado con una mayor tasa de degradación de la MEC y reabsorción ósea [8].
El tejido conectivo capsular está formado por densas fibras colágenas que están
firmemente adheridas a la superficie radicular, por lo que la LPA puede ser
removida en su totalidad al realizarse la exodoncia del diente [3].
Esta enfermedad generalmente comienza como una inflamación aguda
del ligamento periodontal apical y del hueso vecino, causada por productos
bacterianos que invaden los tejidos periapicales desde el canal radicular. Este
proceso puede acompañarse de síntomas clínicos como dolor y molestias a la
presión del diente en cuestión [3]. Luego, los agentes causales, usualmente
bacterias, sus antígenos y toxinas presentes en el canal radicular, pueden
sobrepasar la capacidad resolutiva de los mecanismos de defensa del
organismo y la lesión progresará hacia la cronicidad. En esta etapa, la lesión,
14
dominada en la fase aguda por PMNs, pasa a estar principalmente infiltrada por
macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Así, se crea un equilibrio entre los
agentes irritantes y los mecanismos de defensa del hospedero, donde éstos
últimos no son capaces de destruir ni eliminar completamente los factores
patogénicos pero, al formar una barrera circunscrita, previenen efectivamente
una invasión posterior [7]. Esta fase suele ser asintomática, y la lesión generada
al interior del tejido óseo maxilar se evidencia radiográficamente como una zona
radiolúcida [3, 7].
La respuesta inmune del hospedero involucra una serie de elementos
celulares y mediadores moleculares. El infiltrado celular perirradicular en PAC
está principalmente constituido por macrófagos, células T y B. También lo
conforman, en menor medida, células como PMNs, células plasmáticas, y
monocitos/macrófagos [3, 6]. Se han descrito diferentes mediadores moleculares
presentes en PAC, como citoquinas proinflamatorias (IL-1, -6 y -8, y TNF-α,
interferón [IFN] [3], factores estimuladores de colonias [factor estimulador de
colonias de granulocitos-macrófagos GM-CSF] factor estimulador de colonias
granulocitos [G-CSF] y factor estimulador de colonias de macrófagos [M-CSF]),
factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) [3], eicosanoides (prostaglandinas
(PGs) y leucotrienos (LTs) [9], anticuerpos y moléculas efectoras enzimáticas [3].
Estas últimas participan en la destrucción de la MEC, a través de cuatro vías de
degradación: osteoclástica, fagocítica, plasminógeno-dependiente y regulada por
metaloenzimas [3]. Los estadios más tempranos de la progresión de la
enfermedad apical involucran remodelación y degradación de la MEC, las cuales
15
son esenciales para la migración celular, y para la liberación y activación de
factores de crecimiento [10].
Entre los mediadores inflamatorios estudiados en PAC, las MMPs no sólo
son capaces de degradar la MEC periodontal, sino que mediante proteólisis
controlada pueden modificar la actividad biológica de moléculas bioactivas,
actuando como moduladores de los procesos inmunoinflamatorios [11].
2. Fluido Gingival Crevicular
El tratamiento para la PAC es la realización de la endodoncia de la pieza
en cuestión, terapia que ofrece una alta tasa de éxito; sin embargo, existen
casos en los que el tratamiento fracasa, y dicho fracaso muchas veces se
manifiesta en forma tardía con respecto a la rehabilitación del diente. De hecho,
para considerar que la terapia fue exitosa, se requiere de un seguimiento
radiográfico por un período no inferior a 3 años. Dado que un número
considerable de los dientes tratados endodónticamente son restaurados con
pernos de anclaje intrarradicular, el acceso a un retratamiento en estos casos es
sólo quirúrgico, procedimiento que además de ser invasivo tendrá siempre un
pronóstico reservado [12].
Una manera de acceder al estudio molecular de las patologías
inflamatorias que comprometen el periodonto de inserción del diente, es
mediante la caracterización del FGC, que en la actualidad se ha utilizado
ampliamente para el estudio de enfermedades periodontales [13]. Un número
considerable de productos bacterianos y derivados del hospedero encontrados
16
en el FGC han sido asociados con el inicio y progresión de la enfermedad
periodontal [14].
El FGC es una mezcla compleja de sustancias derivadas del suero, tejido
conectivo, epitelio y placa subgingival, incluyendo: leucocitos inflamatorios,
electrolitos, pequeñas moléculas orgánicas, proteínas, citoquinas, anticuerpos,
bacterias y sus antígenos, y enzimas de origen tanto del hospedero como
bacterianas [15-24], que puede obtenerse a partir del surco gingival que rodea el
diente en forma rápida y no invasiva, y es accesible en cualquier etapa del
tratamiento endodóntico o en forma previa a éste.
Con el comienzo de la infección periodontal marginal, el FGC muestra un
cambio desde un transudado del plasma a un exudado inflamatorio que deriva
del aumento de permeabilidad de las barreras vasculares y epiteliales [25]. Esto
a su vez, permite la extravasación de proteínas de alto peso molecular desde la
circulación general [26, 27]. Adicionalmente, este fluido contiene componentes
derivados de los procesos de remodelación y destrucción de la matriz
extracelular de los tejidos circundantes y, por lo tanto, podría representar una
fuente importante de moléculas asociadas con el catabolismo óseo [26-28].
Se ha establecido que el FGC surge desde el plexo gingival de vasos
sanguíneos del corion gingival, subyacente al epitelio de revestimiento en el
espacio dentogingival [29]. El epitelio de revestimiento del surco gingival es
permeable a componentes de pequeño peso molecular y el pasaje de fluido
intersticial al surco actúa como un posible mecanismo de defensa que podría
jugar un importante rol en la homeostasis del entorno crevicular [30].
17
Una ventaja importantísima que presenta el FGC en relación con el
exudado periapical, es que este último impide el uso de irrigantes previo a la
toma de la muestra con el fin de evitar la inactivación de los componentes del
exudado. Sin embargo, la terapia endodóntica exige el uso de dichos irrigantes
desde el primer momento en que se accede a la cámara pulpar y sistema de
canales radiculares, ya que uno de los objetivos biológicos de los
procedimientos de limpieza y remodelado de la terapia endodóntica consiste en
eliminar todo el tejido pulpar, las bacterias y sus toxinas del canal radicular [31],
objetivo que debe postergarse en pro de la recolección de la muestra.
Adicionalmente el FGC representa un método no invasivo y simple que
permite la obtención de muestras en cualquier momento, independientemente
del desarrollo del tratamiento, lo que ofrece la posibilidad de realizar un
seguimiento longitudinal de la respuesta del hospedero frente al tratamiento
realizado.
El potencial valor diagnóstico del FGC y su naturaleza dinámica fueron
reconocidas medio siglo atrás. En los años 1950s se demostró que un papel
filtro colocado en el surco gingival de dientes de animales experimentales podía
detectar una tinta que era inyectada en el sistema circulatorio de estos animales
[32].
18
3. Metaloproteinasas de Matriz Extracelular (MMPs)
3.1.
Generalidades
Las MMPs son una gran familia de endopeptidasas calcio-dependientes
estructuralmente relacionadas, pero genéticamente distintas que degradan
componentes
de
la
MEC,
incluyendo
colágenos,
elastinas,
gelatina,
glicoproteínas de la matriz, componentes de las membranas basales, como
proteoglicanos, laminina y entactina, y diversas moléculas bioactivas, que
incluyen receptores celulares de superficie, citoquinas, quimioquinas, hormonas,
defensinas,
moléculas
de
adhesión,
factores
de
crecimiento,
ligandos
apoptóticos y factores angiogénicos [55-57]. Son secretadas por numerosos
tipos celulares inflamatorios y del tejido conectivo, como leucocitos, fibroblastos,
osteoblastos, queratinocitos, y células endoteliales, entre otros [58]. A la fecha,
se conocen veintiséis MMPs humanas [59, 60]. Se les ha asignado un número a
las presentes en vertebrados, además de nombres triviales a algunas de ellas.
Estudios recientes han demostrado que el rol de las MMPs no está
limitado solamente a los efectos degradativos sobre la MEC, sino que también
tienen dirigida su acción sobre diversos sustratos bioactivos, como receptores de
factores de crecimiento (GFR), moléculas de adhesión celular, quimioquinas,
citoquinas, ligandos apoptóticos y factores angiogénicos [10, 56, 61], lo que las
ubicaría como moduladoras dentro de los distintos procesos en que estas
moléculas participan [11]. Las MMPs se reconocen actualmente como
participantes claves en la regulación de interacciones célula-célula y célulaMEC. Están involucradas en la modificación de la estructura de la matriz,
19
disponibilidad de anticuerpos y la función del sistema de señalización de
superficie celular, con consecuentes efectos en la diferenciación celular,
proliferación y apoptosis. Juegan roles centrales en procesos fisiológicos, tales
como morfogénesis, cicatrización de heridas, reparación tisular y remodelación
en respuesta a injuria; mientras que en condiciones patológicas, participan en la
progresión
de
enfermedades
como
artritis,
cáncer,
enfermedades
cardiovasculares y enfermedades periodontales [62].
3.2.
Características Estructurales
La estructura básica de las MMPs está compuesta por un pro-dominio Nterminal, un dominio catalítico, una región bisagra y un dominio tipo hemopexina
C-terminal (Figura 1) [63].
Dominio tipo
Hemopexina
Dominio
Fibronectina
Dominio
Catalítico
Región
bisagra
Cola
Citoplasmática
TM-I
"#!$%!
Unión a
membrana
Sitio
Furina
!
Pro-dominio
Péptido
señal
Figura 1. Esquema estructural de las MMPs humanas. Se observan los diferentes dominios
que componen una MMP humana (Adaptado de Folgueras y cols., 2004).
3.3.
Clasificación
Basándose en la especificidad sobre el sustrato, similitud de secuencia y
organización de los dominios, las MMPs de vertebrados se dividen
20
tradicionalmente en 6 grupos: colagenasas, gelatinasas, estromelisinas,
matrilisinas, MMP transmembrana (MT-MMPs) y otras (Tabla 1) [63]. Sin
embargo, las MMPs exhiben considerable redundancia respecto de sus
sustratos, y por tanto en sus funciones biológicas [64]. Además, a pesar de que
la estructura de los dominios catalíticos poseen una estructura altamente similar,
existen diferencias con respecto a la especificidad de sustratos, especificidad
celular y degradación tisular, unión a membranas y regulación, que hacen de
esta familia, una familia de enzimas muy versátil con una multitud de funciones
fisiológicas, muchas de ellas aún no completamente entendidas [65]. Otra
clasificación más reciente, basada en sus secuencias primarias a partir métodos
bioinformáticos, propone seis sub-grupos evolucionarios (A-F): sub-grupo A,
MMPs -19, -26 y -28; sub-grupo B, MMPs -11, 21 y -23; sub-grupo C, MMP-17 y
-25; sub-grupo D, MMP-1, -3, -8, -10, -12, -13 y -27; sub-grupo E, MMP-14, -15, 16 y -24; sub-grupo F, MMPs -2, -7, -9 y -20 [66]. Se usará en el texto la manera
tradicional de clasificarlas.
21
Tabla 1. Clasificación de las MMPs humanas descritas a la fecha (Adaptado de Verma y
cols., 2007).
Tabla 1. Clasificación de las MMPs
•
Nº
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
MMP Nº
MMP-1
MMP-8
MMP-13
MMP-18
MMP-2
MMP-9
MMP-3
MMP-10
MMP-11
MMP-27
MMP-7
MMP-26
MMP-14
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
MMP-15
MMP-16
MMP-17
MMP-24
MMP-25
MMP-12
MMP-19
MMP-20
MMP-21
MMP-22
MMP-23
MMP-28
MMP-29
Clasificación
Colagenasas
Gelatinasas
Estromelisina
Matrilisinas
MT-MMP (tipo
membrana)
Otras enzimas
Nombre
Colagenasa-1
Colagenasa de neutrófilo
Colagenasa-3
Colagenasa-4
Gelatinasa-A
Gelatinasa-B
Estromelisina-1
Estromelisina-2
Estromelisina-3
Homología a estromelisina-2 (51,6%)
Matrilisina (PUMP)
Matrilisina-2
MT1-MMP
MT2-MMP
MT3-MMP
MT4-MMP
MT5-MMP
MT6-MMP
Macrófago elastasa
RASI-1
Enamelisina
MMP identificada en el cromosoma 1
MMP identificada en el cromosoma 1
De cDNA de ovario humano
Epilisina
Sin nombre
MMP-13
La MMP-13 pertenece la familia de las colagenasas, cuyos integrantes
son la MMP-1, MMP-8, MMP-13, y MMP-18 (Xenopus). Sus sustratos principales
son los colágenos intersticiales fibrilares tipo I, II y III, los que corta en un sitio
específico, ¾ desde la región N-terminal, generándose un fragmento ¼ y otro ¾.
También puede degradar otras moléculas de MEC, como colágenos tipo IV, IX,
X, gelatina, agregan, perlecán, biglicán, tenascina C, fibronectina, fibrilina y
22
microfibrillas ricas en fibrilina [67], y sustratos bioactivos no MEC [63]. Los
dominios catalíticos de las colagenasas pueden degradar sustratos no
colágenos, pero son incapaces de degradar colágenos nativos fibrilares en la
ausencia de sus dominios
tipo-hemopexina. La cooperación entre los dos
dominios es por tanto fundamental para la expresión de su actividad
colagenolítica [68].
La MMP-13 juega un importante rol en el desarrollo y remodelación ósea,
en parte por su habilidad de degradar colágeno tipo II, un componente
preponderante del cartílago. Esta función se refleja en un perfil de expresión
más bien limitado durante el desarrollo y adultez, la cual es restringida al
desarrollo de tejido esqueletal. Al contrario de otras colagenasas, MMP-13 tiene
una actividad gelatinasa con relativamente alta especificidad, indicando que el
rol proteolítico de MMP-13 va más allá del primer paso en la degradación de
colágenos triple-hélice [67].
La MMP-13 además tiene propiedades proteolíticas sobre sustratos
bioactivos como proTNF-α, factor derivado de células estromales (SDF)-1,
proteína quimiotáctica de monocitos (MCP)-3, endostatina, inhibidor del
activador del plasminógeno-2 [69] y α2-macroglobulina (α2M). También actúa
sobre pro-MMP-9 y pro-MMP-13 transformándolas en sus formas activas [56].
Otras MMPs, como MMP-2 y -14, tienen actividad colagenolítica, pero están
clasificadas en otros grupos debido a la composición de sus dominios [70].
La expresión de MMP-13 puede estar influenciada por un amplio espectro
de hormonas y citoquinas, como la hormona paratiroidea, indicando el rol
23
importante de MMP-13 en el desarrollo del tejido óseo, factor de crecimiento tipo
a insulina (IGF)-I y -II, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF),
factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y el factor de crecimiento
transformante (TGF) -β1. Este último puede estimular o bien inhibir la expresión
de MMP-13 dependiendo del tipo tisular, IL-1 y -6, TNF-α, entre otros [67].
Además de la ruta de inactivación, vía inhibidores tisulares de
metaloproteinasas, MMP-13 puede unirse a receptores específicos en la
superficie de osteoblastos y fibroblastos, resultando en la internalización y
degradación de la proteasa [71].
•
MMP-2
La MMP-2, gelatinasa A, colagenasa tipo IV de 72-kDa, forma parte del
grupo de las gelatinasas, al cual también pertenece la MMP-9 (gelatinasa B)
[56]. La proenzima de la MMP-2 es activada al formar un complejo con el
inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP)-2, el cual es sustrato de MMP-14
(MMP unida a membrana tipo-I) que remueve el prodominio de proMMP-2 por
clivaje proteolítico, con la ayuda de MMP-2 activa libre (Figura 2). Este proceso
genera una forma activa de 64-kDa de la enzima [72]. Si la concentración de
TIMP-2 es muy alta, tanto la MMP-14 y MMP-2 activa serán inhibidas, y no se
llevará a cabo el proceso. Además de esta vía de activación, proMMP-2 también
puede ser activada por trombina y proteína C activa [73].
24
(1) TIMP-2 en baja
concentración
(2) TIMP-2 en alta
concentración
Extracelular
Extracelular
Intracelular
Intracelular
TIMP-2
MMP-14
Pro-MMP-2
!
Figura 2. Mecanismo de activación de la pro-MMP-2. (1) MMP-14 en la superficie celular
actúa como un receptor para TIMP-2. TIMP-2 se une al sitio activo de MMP-14 a través de su
dominio aminoterminal. Este complejo binario actúa como un receptor para pro-MMP-2, la que se
une a través de su dominio C-terminal al dominio carboxiterminal de TIMP-2. Luego, una
molécula libre de MMP-14 puede hidrolizar la pro-MMP-2, generando especies intermedias.
Después la proteólisis del propéptido a través de un mecanismo autocatalítico genera la enzima
totalmente activa. La activación de MMP-2 en este modelo sólo es posible si las concentraciones
de TIMP-2 son bajas, con suficiente TIMP-2 como para generar el complejo trimolecular, pero
insuficiente como para saturar todas las MMP-14 necesarias para la proteólisis del propéptido.
(2) En altos niveles de TIMP-2, éste se une a las moléculas de MMP-14, inhibiendo su actividad,
evitando de esta forma la activación de la MMP-2 (Adaptado de Lafleur y cols., 2003, [74]).
La MMP-2 degrada principalmente gelatina, que corresponde a colágeno
denaturado [63]. Además degrada colágeno tipo I, II, III con menor afinidad que
MMP-13, y colágeno IV, componente fundamental de las membranas basales, lo
que le otorga un importante rol durante la metástasis en cáncer [63], además de
colágeno V y XI [75, 76]. Sin embargo, debido a que proMMP-2 es reclutada a la
superficie celular y activada por MT-MMPs, puede acumularse pericelularmente
y expresar actividad colagenolítica de manera razonable. Además, actuaría en
25
forma sinérgica con las colagenasas, al digerir el colágeno que se degrada a la
temperatura corporal (37º C) [77]. También degrada elastina y vitronectina [78].
Dentro de las moléculas bioactivas que MMP-2 es capaz de hidrolizar, se
encuentran
pro-IL-1β,
pro-TNF-α,
pro-TGF-β,
proteína
de
crecimiento
transportadora (IGFP)-3 y -5, SDF-1, inhibidor de proteasa α-1, α2M y MCP-3,
quimioquina cuya hidrólisis mediada por MMP-2 le otorga funciones antagónicas
a la molécula íntegra [11, 79]. Además, la MMP-2 actúa sobre pro-MMP-1, proMMP-2 y pro-MMP-13, activándolas [56].
•
MMP-9
La MMP-9 (gelatinasa B), se expresa como una proenzima de 92-kDa,
que puede ser activada a una enzima madura de 83-kDa [80]. De manera
contraria a MMP-2, MMP-9 se expresa solamente de manera constitutiva en
neutrófilos [81], donde es almacenada en gránulos para ser rápidamente
liberada luego de ser estimulada. La expresión en diversos otros tipos celulares
es inducible mediante el estímulo inflamatorio [82].
La MMP-9, al igual que la MMP-2, degrada colágeno denaturado,
colágeno nativo tipo IV, V y XI, laminina y proteína central del agrecán. A
diferencia de MMP-2, MMP-9 no tiene acción colagenolítica frente a colágenos
tipo I, II y III [62].
Dentro de las moléculas bioactivas que MMP-9 es capaz de procesar, se
encuentran citoquinas y quimioquinas de manera similar a MMP-2, como por
ejemplo IL-8, la cual es procesada en su forma truncada más potente, IL-1β y
TGF-β [78].
26
3.4.
Regulación de la actividad de MMPs
Como para la mayoría de los procesos biológicos, la degradación de la
matriz es un evento preciso, atribuido a proteinasas que son producidas y
liberadas por demanda de células activadas. [83]. Las MMPs interactúan con
diversas moléculas de la superficie celular y pericelulares, que modifican la
función de la enzima, así como también el comportamiento celular [84]. Un
desbalance en la actividad de las MMPs puede conducir al desarrollo de
patologías diversas [85]. El conocimiento acerca de la regulación de la actividad
de las MMPs es, por tanto, primordial para la comprensión de diversos procesos
fisiológicos, como también de la patogénesis de un gran número de
enfermedades [86].
En condiciones fisiológicas las MMPs usualmente se expresan de manera
restringida en los tejidos y, por ende, la homeostasis es mantenida [57]. Sin
embargo, existen tres mecanismos fundamentales que regulan la expresión y
actividad de las MMPs, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas:
transcripción génica, activación proteolítica e inhibición de la actividad
enzimática. Colectivamente estos mecanismos deben confinar la actividad
degradativa de las MMPs en aquellos sitios y situaciones en que es
biológicamente necesaria [56].
•
Transcripción génica
A nivel transcripcional, una variedad de citoquinas y factores de
crecimiento (ej. TNF-α, factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de
crecimiento derivado de cerebro (BFGF), IL-1, PDGF, IL-6 y TGF-β) inducen la
27
producción de MMPs, dependiendo de la situación y el tipo celular. También
oncogenes, hormonas y diversos agentes químicos como interacciones célulacélula y célula-matriz pueden inducir o inhibir la expresión de MMPs [87]. Estos
agentes causan variaciones espaciales y temporales en la expresión de las
MMPS [56]. Además, investigaciones recientes indican un importante rol
modulador de procesos epigenéticos en la expresión de MMPs [88].
•
Activación proteolítica
Las MMPs, como muchas enzimas proteolíticas, son sintetizadas como
zimógenos inactivos (pre-pro-MMPs). El péptido señal es removido durante su
transporte, generándose pro-MMPs. La región del propéptido contiene un
residuo Cys que coordina el zinc catalítico cuando la estructura está
correctamente plegada y previene la catálisis enzimática [70]. Las MMPs
latentes secretadas pueden, por tanto, ser activadas mediante un proceso
llamado modelo “switch-cisteína”, que consiste en la disociación del pro-dominio
del dominio catalítico mediante la disrupción de la coordinación del zinc por
remoción del propéptido [70, 89, 90] por enzimas proteolíticas, tales como
proteasas de serina, furina, plasminas, MMPs y otras [57].
El “switch” de cisteína también puede ser modificado por reacciones
químicas; ya sea fisiológica, mediante la oxidación de la cisteína por especies
reactivas de oxígeno, o de manera artificial por componentes mercuriales como
acetato 4-aminofenilmercurico (APMA), surfactantes desnaturantes como sulfato
dodecil sódico (SDS). Esta disrupción de la interacción de zinc lleva a una
relocalización alostérica del prodominio, generándose formas activas de la
28
enzima con el propéptido aún unido; o bien, a la remoción autoproteolítica del
prodominio relocalizado [91]. La activación de las pro-MMPs representa, por
tanto, un paso fundamental en la regulación de la actividad de las MMPs [56].
A pesar de que las MMPs contienen un péptido señal que las dirige a
través de sus vías de secreción, un número creciente de estudios ha
determinado que varias MMPs estarían localizadas también al interior de la
célula. Esto explicaría, en parte, la habilidad de algunas MMPs de procesar
proteínas intracelulares y, además, demuestra los complejos roles de las MMPs
bajo condiciones tanto fisiológicas como patológicas [92, 93].
In vivo, la activación de las MMPs requiere de la participación de otras
proteasas para la remoción del propéptido. En muchos casos, estas proteasas
activadoras forman parte de una cascada proteolítica que tiene lugar en el
espacio pericelular inmediato [94]. Un ejemplo de estas proteasas son las
mismas MMPs [87]. Por ejemplo, MT-MMPs, como MMP-14, pueden reclutar
proMMP-2 inactiva a la superficie celular y activar la proenzima [70].
In vitro su activación se lleva a cabo por agentes químicos, como agentes
tioles, glutatión oxidado, SDS, agentes caotrópicos, y radicales libres del
oxígeno; pH bajo y temperaturas elevadas también pueden generar su
activación. Estos agentes posiblemente trabajarían en la disrupción de la
interacción de la cisteína-Zinc [63].
•
Inhibición de la actividad enzimática
La actividad de las MMPs también puede ser controlada mediante una
serie de inhibidores. Existen inhibidores naturales, dentro de los que se
29
encuentran los dos mayores inhibidores de las MMPs: α2M y los inhibidores
tisulares de MMPs (TIMPs) [56].
α2M es una glicoproteína de 725 kDa que consiste en 4 subunidades
idénticas de 180 kDa. Actúa como un inhibidor general de proteasas, tanto del
hospedero como bacterianas [95], y se encuentra en el plasma y fluidos
tisulares. La mayoría de las endopeptidasas, independientemente de su clase,
son inhibidas al ser atrapadas dentro de la macroglobulina [95]. El complejo es
luego rápidamente eliminado gracias a endocitosis mediada por una proteína
relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad tipo 1 (LRP1),
también conocido como receptor α2M (A2MR) [96].
Los TIMPs son pequeñas proteínas de alrededor de 2500 Da que
contienen dos dominios. El dominio N-terminal se une al sitio activo del dominio
catalítico de las MMPs. Como resultado, el zinc catalítico es quelado por el
grupo amino N-terminal del TIMP y por el grupo carbonil del residuo Cys en la
proMMP, que libera una molécula de agua unida al zinc e inactiva la enzima [70,
97]. La inhibición de la actividad metaloproteinasa se basa en la unión
estequiométrica y no covalente, pero con muy alta afinidad, al sitio activo de la
enzima [98]. Los TIMPs estructuralmente comparten dominios amino- y carboxiterminales, tres puentes disulfuro y doce residuos de cisteína altamente
conservados [98]. A la fecha, cuatro TIMPs han sido identificados: TIMPs -1, -2, 3 y -4 [70, 99]. Algunos TIMPs tienen capacidades inhibitorias preferenciales
para
diferentes
pro-MMPs.
Por
ejemplo,
TIMP-1
forma
un
complejo
preferentemente con pro-MMP-9, mientras que TIMP-2 y -4 inhiben la activación
30
de pro-MMP-2 por MT1-MMP [91] Otra potencial función bioquímica de los
TIMPs ha sido dilucidada, la que incluye un rol de TIMP-2 en la unión con MMP14 en la superficie celular, acción que es crítica para la activación de proMMP-2
[70, 97]. TIMP-1 y -3 posiblemente tienen funciones similares a TIMP-2 [70].
Además de la acción inhibitoria de los TIMPs, la función de las MMPs
también puede ser bloqueada por otras proteínas. Se describen dentro de este
grupo el potenciador de proteinasa C-terminal de procolágeno (PCP), el dominio
NC-1 del colágeno tipo IV y el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI)-2.
Finalmente, un inhibidor natural de las MMPs es la proteína rica en cisteína con
motivos kazal (RECK) [56].
De manera sintética, las MMPs se inhiben mediante peptidomiméticos,
no-peptidomiméticos, tetraciclinas, sus derivados y otros inhibidores exógenos
naturales y sintéticos (bisfosfonatos, neovastat, té verde, ácido acetilsalicílico y
el potenciador de la proteinasa de procolágeno) [11].
4. MMPs y PAC
Un evento clave en el desarrollo y progresión de la PAC es la
degradación de la MEC de los tejidos periodontales periapicales, que incluyen
hueso alveolar, ligamento periodontal y cemento radicular. Debido a que el
componente principal de la MEC de estos tejidos corresponde al colágeno tipo I,
las MMPs de las familias de las colagenasas y gelatinasas jugarían un papel
fundamental en esta patología, particularmente aquellas producidas en el tejido
31
óseo (MMP-1, -2, -9, -13 y -14) [100, 101].
Se ha descrito un incremento en los niveles y actividad de la MMP-13 en
periodontitis crónica, enfermedad que también se caracteriza por la destrucción
de tejidos blandos y duros que componen el periodonto [102]. Previamente, se
demostró un aumento en la expresión de MMP-13 en tejido gingival y FGC de
sujetos con periodontitis crónica [103-105] en asociación con la severidad de los
parámetros clínicos y la pérdida de colágeno [33, 106]. Además, se ha reportado
un aumento en su actividad en lesiones periodontales destructivas durante la
progresión de la enfermedad, conjuntamente con la degradación del tejido
periodontal de inserción, incluyendo la reabsorción del hueso alveolar, que se ha
visto reflejada en altos niveles de telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I
(ICTP). Adicionalmente, se ha descrito una cascada de activación que incluye
las MMPs -13, -9 y posiblemente la -2 en el tejido gingival de sujetos con
periodontitis crónica y se ha propuesto que esta interacción podría representar
un mecanismo de amplificación que podría perpetuar la destrucción de los
tejidos periodontales [107]. Por otro lado, se postula que la MMP-13 estaría
involucrada en la iniciación de la reabsorción ósea mediante la remoción de la
matriz orgánica ósea y generación de fragmentos que podrían activar a los
osteoclastos [108]. Así, se considera que la MMP-13 tiene un rol sustancial en la
degradación de la matriz periodontal, pero los mecanismos que explican cómo la
MMP-13 participa en la hidrólisis de los tejidos blandos y duros aún no se
conocen del todo.
32
De modo similar, en PAC se ha demostrado la expresión de las MMPs 13, -2, -9, además de las MMPs -1, -3 y -8 en LPAs, infiltrado inflamatorio
asociado a estas lesiones y FGC de dientes afectados [109-119].
Se ha demostrado la presencia de MMP-13 en GPAs con y sin epitelio
proliferante mediante inmunohistoquímica. Se observó inmunopositividad en
todas las muestras, con una mayor expresión de MMP-13 en lesiones
periapicales epitelizadas en comparación con lesiones no epitelizadas. A partir
de lo anterior se concluyó que la MMP-13 estaría involucrada en la conversión
de un GPA con epitelio a un QRI, propiedad relacionada no sólo con la
migración de células epiteliales, sino que también con la invasión del tejido de
granulación [111]. En línea con lo anterior, se ha reportado la expresión de
MMP-13 en plasmocitos presentes en GPAs, así como también en otras lesiones
destructivas óseas, como lo son quistes odontogénicos y plasmocitomas
malignos mediante hibridización in situ e inmunohistoquímica. Los autores
concluyeron que la expresión de MMP-13 por parte de los plasmocitos tendría
un rol particularmente importante en lesiones tanto malignas como benignas
asociadas con destrucción ósea [109].
Por
otro
lado,
se
demostró
inmunopositividad
mediante
inmunohistoquímica para MMP-9 en el infiltrado inflamatorio y células
endoteliales de lesiones apicales con y sin epitelio, y células epiteliales en
lesiones con epitelio. Mediante PCR en tiempo real (qPCR), se demostró que
ambos tipos de lesiones presentaban mayores niveles de RNAm de MMP-9
comparados con ligamento sano (LS) [112]. En otro estudio se demostró la
33
presencia de MMP-2 en células inflamatorias como linfocitos, plasmocitos y
macrófagos en LPAs mediante inmunohistoquímica [110]. Además, en
periodontitis apical experimentalmente inducida en modelos animales, MMPs -2
y -9 fueron identificadas mediante inmunohistoquímica, donde se propuso que
ambas jugarían un rol tanto en la iniciación como progresión de esta patología
[115, 117].
De modo similar, se detectaron formas activas y proformas de MMPs -2 y
-9 en muestras de exudado intracanal obtenido de dientes con diagnóstico
clínico de absceso periapical, donde se encontraron mayores niveles de
actividad de MMP-9 en exudados apicales de abscesos apicales agudos versus
crónicos [114].
Otro estudio demostró una mayor expresión génica de MMPs en QRIs y
GPAs que en LS y una actividad gelatinolítica más intensa en el infiltrado
inflamatorio de GPAs en comparación con QRIs. Además, se demostró la
presencia de MMPs -2, -9 y -13 en GPAs y QRIs mediante zimografía in situ e
inmunohistoquímica. Entre éstas, las MMPs -9 y -13 se sobrexpresaron en GPAs
en comparación con QRIs. La mayor expresión simultánea encontrada para
MMP-9 y MMP-13 sugiere una regulación coordinada, posiblemente explicada
por la habilidad de MMP-13 de activar a MMP-9 [119].
Además, nuestro grupo de investigación ha demostrado la expresión de
MMPs -2, -9 y -13 [120] tanto en GPAs como en QRIs, pero no en LS mediante
inmunohistoquímica. Estas MMPs se localizaron fundamentalmente en el
infiltrado inflamatorio de estas lesiones. Las MMPs -2 y -9 se detectaron también
34
en el revestimiento epitelial de QRIs [120] [116]. Resultados previos obtenidos
por nuestro grupo de trabajo describen la presencia de dos formas moleculares
de la MMP-13 en lesiones periapicales, una proforma de 60 kDa y otra forma
activa de 48 kDa [121].
Estudios recientes demostraron por primera vez que la composición del
FGC cambia en dientes afectados por PAC, demostrando incrementos en la
actividad de MMP-9, frecuencia de detección de MMP-2 y mayor concentración
de proteínas total (CPT) en comparación a controles sanos [113, 118].
La α2M es un inhibidor que bloquea la actividad de las MMPs en el
plasma y fluidos tisulares [122]; sin embargo, no existen estudios previos sobre
el rol que pueda presentar este inhibidor en PAC. Estudios en periodontitis
crónica han demostrado que la cantidad total de α2M está significativamente
aumentada en dientes enfermos versus sanos, los que disminuyen a nivel de
sitio y de paciente luego del tratamiento periodontal convencional [123-125]. Se
ha planteado como un posible marcador de seguimiento durante el tratamiento
de la periodontitis [124]. Se observó que los niveles de α2M transformada es
aproximadamente la mitad de la cantidad total del inhibidor. Esto indica que una
notable parte del total de α2M forma complejos con proteinasas [124]. Además,
en un estudio se reportó la presencia de α2M incluso en el FGC de voluntarios
sanos. La concentración aumentaba con la inflamación y disminuía luego del
tratamiento. Interesantemente, no se encontró correlación entre los niveles de
α2M en el FGC y los plasmáticos, indicando que este inhibidor es producido
localmente en la encía, posiblemente por fibroblastos. La producción local de
35
α2M puede estar estimulada por citoquinas inflamatorias, las que también
aumentarían la expresión del receptor de α2M en el tejido [126]. Se sabe que
α2M, en contraste con otros inhibidores de proteasas, es capaz de unir y
disminuir niveles patológicamente elevados de diversas citoquinas y factores de
crecimiento y efectivamente remueve proteasas mediante endocitosis a través
de receptores [127]. Así, este inhibidor juega un rol importante en la regulación
de la respuesta inmune e inflamatoria [128]. La alta concentración de α2M
transformada (complejo α2M-proteinasa) en el FGC en comparación con el
plasma indicarían que el FGC contiene altas concentraciones de proteasas
durante patologías como la periodontitis [124].
En síntesis, existe evidencia de un desbalance en la expresión, niveles y
actividad de las MMPs sobre sus inhibidores en la patogenia de la PAC que
podría reflejarse en el FGC de los dientes afectados. Sin embargo, estos
cambios no se han demostrado en LPAs humanas, como tampoco su asociación
con la composición del FGC en dientes afectados.
Debido a los antecedentes anteriormente expuestos, se plantea que
existe un aumento en los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y -13, y niveles
reducidos de α2-macroglobulina en dientes con PAC en comparación con
controles sin patología periapical, cambios que se ven reflejados en el FGC. El
objetivo de este estudio es caracterizar los niveles y actividad de las MMPs -2, -9
36
y -13, y de α2M en el fluido gingival crevicular de dientes con PAC y de dientes
sanos, en LPAs y LS.
37
HIPÓTESIS
Existe un aumento en los niveles y actividad de las metaloproteinasas de
matriz extracelular -2, -9 y -13, y niveles reducidos de α2-macroglobulina en
dientes con periodontitis apical crónica en comparación con dientes controles sin
patología periapical, cambios que se ven reflejados en el fluido gingival
crevicular.
OBJETIVO GENERAL
Determinar niveles, actividad y formas enzimáticas asociadas de las
MMPs -2, -9 y -13, y niveles de α2-macroglobulina en lesiones periapicales,
ligamento periodontal sano y/o fluido gingival crevicular de dientes con
periodontitis apical crónica y controles.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Determinar y comparar niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs
-2, -9 y -13, y niveles de α2-macroglobulina en FGC de dientes con PAC y
sanos.
2. Determinar y comparar niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs
-2, -9 y -13, en tejido correspondiente a LPAs y ligamento periodontal sano.
3. Asociar presencia, niveles y actividad de los mediadores de interés entre
muestras de tejido lesional y FGC de los dientes correspondientes.
38
4. Asociar la presencia y niveles de estos mediadores con antecedentes
generales (edad, género) y características clínicas (tabaquismo y diámetro
promedio de la lesión) de los sujetos de estudio.
39
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Selección de Pacientes
En este estudio se incluyeron 3 grupos de sujetos que se describen a
continuación:
Se incluyó un primer grupo de pacientes que consultaron en las Clínicas
de Cirugía y Diagnóstico de la Facultad de Odontología de la Universidad de
Chile con diagnóstico clínico de PAC [1] e indicación de endodoncia, a partir de
los cuales se obtuvieron muestras de FGC; un segundo grupo de pacientes con
diagnóstico de PAC e indicación de extracción, a partir de los cuales se
obtuvieron
muestras
de
FGC
y/o
de
lesiones
periapicales
(LPAs)
correspondientes al mismo diente. Finalmente, se incluyó un tercer grupo
compuesto por pacientes con indicación de exodoncia de premolares sanos por
ortodoncia, a partir de los cuales se obtuvo ligamento periodontal sano (LS) [1].
Los tres grupos de pacientes fueron seleccionados mediante muestreo no
probabilístico de casos consecutivos.
El diagnóstico de PAC se realizó en aquellos sujetos que presentaron uno
o más dientes con LPAs (compatibles con GPA o QRI) detectadas mediante
radiografía periapical (diámetro mayor a 5 mms.) consecutivas a caries, con
determinación clínica de pulpa no vital y formación radicular completa.
40
Los criterios de exclusión fueron:
} Trauma oclusal
} Presencia de enfermedades periodontales marginales, definida por la
pérdida de inserción clínica mayor o igual a 2 mms., aumento en la
profundidad al sondaje mayor o igual a 3 mms., y sangramiento al
sondaje en más de 10% de los sitios examinados.
} Tratamiento con antibióticos, corticoides o AINES en los últimos 6 meses
anteriores al estudio.
} Presencia de enfermedades sistémicas.
A todos los sujetos de estudio se les explicó el procedimiento a realizar, y
firmaron un Consentimiento Informado aprobado por los Comités de Ética de la
Facultad de Odontología de la Universidad de Chile y CONICYT (Anexo 1).
Los antecedentes y datos clínicos de los pacientes fueron registrados en una
ficha clínica (Anexo 2).
2. Obtención de las muestras
2.1.
FGC y elución
Para la obtención de FGC, los dientes en cuestión se aislaron con tórulas de
algodón, se secaron suavemente y se introdujeron tiras de papel absorbente
(PeriopaperTM, ProFlow, Amityville, New York, USA) en el surco hasta ejercer
una leve resistencia contra el tejido por un período estandarizado de 30
segundos. Se realizó lo anterior en seis sitios por diente: mesiovestibular,
41
vestibular,
distovestibular,
mesiopalatino/lingual,
palatino/lingual,
distopalatino/lingual. Se excluyeron aquellas tiras que se contaminaron con
saliva o sangre. Luego, las tiras fueron guardadas en un tubo Eppendorf a -80ºC
hasta su procesamiento. El FGC fue eluido utilizando amortiguador de elución
Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,2 M, CaCl2 5 mM, Tritón X-100 al 0,01%, con un
cocktail inhibidor de proteasas libre de EDTA (Roche Diagnostics GmbH, Basel,
Suiza), 40 µl/ tira. Luego se vortexeó 30 segundos y se dejó 30 minutos a 4ºC.
Se centrifugó a 9000 x g durante 6 minutos a 4ºC, y se recuperó el
sobrenadante. El procedimiento de elución se realizó dos veces, hasta un
volumen final de 80 µl/ tira, y luego las muestras fueron almacenadas a -80ºC
hasta su posterior análisis.
2.2.
LPAs y homogeneización de tejido lesional
A partir del grupo de sujetos con diagnóstico clínico de PAC e indicación de
exodoncia, se obtuvieron muestras de FGC del diente afectado en forma previa
a la extracción dentaria, y/o la lesión post-exodoncia. La obtención de ligamento
periodontal en sujetos sanos se realizó mediante curetaje del tejido adherido a la
raíz dentaria.
Las muestras de tejido fueron homogeneizadas en un radio peso:volumen de
1 mg:10 µl, con un homogeneizador automático (OMNI International, Kennesaw,
USA) en amortiguador de elución Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,2 M, CaCl2 5
mM, Tritón X-100 al 0,01% con un cocktail inhibidor de proteasas libre de EDTA
(Roche Diagnostics GmbH, Basel, Suiza), se centrifugaron a 13000 x g durante
42
6 minutos a 4ºC y se recuperaron los sobrenadantes que fueron mantenidos a
-80º hasta su posterior análisis.
3. Determinación de la concentración de proteínas totales (CPT)
Se determinó la CPT en homogeneizados tisulares y eluidos de FGC
mediante el método del ácido bicinconínico, según indicaciones del fabricante
(BCA, Pierce Biotechnology, Rockford, USA). Las concentraciones fueron
expresadas como mg/mL obtenidos a partir de una curva estándar usando como
estándar albúmina sérica de bovino (BSA).
4. Zimografía en gelatina
Se realizó zimografía con el objetivo de medir la actividad y, en forma
indirecta, los niveles totales de las MMPs -2 y -9 en muestras de FGC y
homogeneizados de LPAs y LS. Alícuotas de las muestras respectivas se
cargaron en geles SDS-PAGE al 10% con 1mg/mL de gelatina como sustrato; se
lavaron dos veces en Triton X-100 2,5% durante 15 minutos e incubaron en un
tampón (20 mM Tris pH 7.4 and 5 mM CaCl2) durante 17 horas a 37ºC. Para
visualizar las bandas, los geles se tiñeron con Azul de Coomassie R-250 y
destiñeron con solución de ácido acético al 10%. La actividad gelatinolítica
correspondiente se detectó como bandas semitransparentes sobre un fondo
azul. Se realizó densitometría de las bandas obtenidas mediante el software UNSCAN-IT (Silk Scientific Corporation, Orem, Utah, USA). Los resultados se
expresaron en unidades arbitrarias de densidad [129] estandarizadas por 30
segundos de toma de muestra por diente [113, 130] y por CPT en el caso del
43
FGC (ua/µg de proteínas totales [PT]). Las muestras correspondientes a
homogeneizados de tejido se estandarizaron por mg de tejido. Los niveles
totales de MMPs -2 y -9 se determinaron como la suma del total de proformas y
formas activas correspondientes a las MMPs respectivas. La razón de activación
para cada una de las MMPs se determinó como el cuociente entre la forma
activa y la suma entre la proforma y forma activa de la MMP correspondiente.
5. Ensayo fluorescente de actividad de la MMP-13
Para determinar la actividad e indirectamente los niveles totales de la MMP13, se utilizó el kit comercial “Fluorokine E” (R&D Systems, Minneapolis, USA)
que se basa en la captura de la enzima en estudio presente en la muestra por
anticuerpos monoclonales precubiertos en una microplaca de 96 pocillos. Tras
cargar los pocillos con alícuotas de las muestras o estándar para la MMP-13, se
adicionó el sustrato fluorogénico que se encuentra unido a una molécula
apagadora la cual se desliga por la acción proteolítica de la enzima activa,
permitiendo la emisión de una señal fluorescente proporcional a la cantidad de
MMP-13 activa presente en la muestra. Los resultados fueron expresados como
nanogramos de producto fluorescente (ng PF) y como ng PF por µg (ng PF/µg)
de proteínas totales en FGC, y por mg de tejido (ng PF/mg) en homogeneizados.
Para determinar los niveles totales (MMP basal activa más la inactiva) se activó
la fracción inactiva de MMP-13 con APMA 0,25 M por 1 hora a 37ºC. El ensayo
se realizó según indicaciones del fabricante.
44
6. ELISA
Para determinar los niveles de α2-macroglobulina en el FGC de dientes con
PAC y sanos, se utilizó un kit de ELISA (Immundiagnostik, Bensheim, Alemania),
siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los niveles de α2-macroglobulina
se obtuvieron a partir de una curva estándar. Los resultados fueron expresados
en pg, y pg por µg (pg/µg) de proteínas totales.
7. “Immunowestern blot”
Para resolver las formas enzimáticas correspondientes a las MMPs -13, -2 y 9, alícuotas de eluidos de FGC y homogeneizados de LPAs y LS se cargaron en
geles SDS-PAGE al 10% a 150v. Las proteínas así separadas se transfirieron a
una membrana de nitrocelulosa. Luego, la membrana fue bloqueada con leche
descremada al 5% y se incubó con los anticuerpos primarios monoclonales anti
MMP-2, anti MMP-9 y anti MMP-13 humanas (R&D Systems, Minneapolis, USA)
en dilución 1:250, 1:100 y 1:250 respectivamente. La membrana se lavó y luego
se incubó con un anticuerpo secundario anti ratón conjugado con peroxidasa
(Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, USA) durante 1 hora. La reacción
positiva se identificó mediante el sustrato quimioluminiscente (Femto, Thermo
Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford, USA), se expuso la membrana a
películas
radioautográficas
(Thermo
Scientific
CL-XPosure
Film,
Pierce
Biotechnology, USA) y se reveló.
45
8. Análisis estadístico
Se utilizó el paquete estadístico Stata10 (Stata, Texas, USA). La distribución
de los datos se determinó mediante el test de Shapiro Wilk. Aquellos datos que
presentaron distribución normal se analizaron con Test T pareado para la
comparación de niveles y actividad de los mediadores en estudio entre FGC de
dientes enfermos y sanos contralaterales, y Test T no pareado para comparar
niveles y actividad de los mediadores en estudio entre LPA y LS. Los datos que
no presentaron distribución normal, se analizaron con test de Wilcoxon y MannWhitney respectivamente, y correlación de Spearman para asociar niveles y
actividad de los mediadores en estudio en tejido, fluido y con los parámetros
clínicos y demográficos. Los datos cualitativos se analizaron mediante test x2.
46
RESULTADOS
1. Características generales de los pacientes
Las características generales y diagnósticos respectivos de los sujetos de
estudio se presentan en la Tabla I. De los 81 pacientes seleccionados, 31 fueron
diagnosticados clínicamente con PAC e indicación de tratamiento endodóntico, a
partir de los cuales se obtuvieron muestras exclusivamente de FGC. El segundo
grupo estuvo constituido por 23 pacientes con diagnóstico clínico de PAC e
indicación de exodoncia, a partir de los cuales de obtuvieron muestras de tejido
de LPAs y/o FGC. Finalmente, el último grupo estuvo compuesto por 27
pacientes con indicación de exodoncia por ortodoncia de premolares sanos, a
partir de los cuales se obtuvieron muestras de tejido correspondientes a LS. La
distribución de los parámetros analizados no presentó diferencias significativas
entre los grupos 2 y 3 (p>0,05), con excepción de la edad. La edad del grupo
sano fue significativamente menor que la edad del grupo con PAC y LPA
(p<0,001).
47
Tabla I. Características generales de pacientes y controles
Diagnóstico
PAC
(N=31)
PAC
(N=23)
LS
(N=27)
Muestra
FGC
Tejido/FGC
Tejido
Edad
(años)
Género
(Mujeres)
Tabaquismo
(%)
Diámetro
promedio
(mm)
37,16 ± 13,26
44,74 ± 18,49*
23,24 ± 3,78*
19
9
15
22,5
42,3
25
N.A.
6 (2)
N.A.
Los valores están expresados como promedios ± DS o mediana (recorrido intercuartil).
N.A.: no aplicable. *Tejido PAC v/s tejido LS, p<0,05.
2. Concentración de proteínas totales en FGC proveniente de dientes con
PAC y sanos
La concentración de proteínas totales se determinó en 21 muestras de
FGC de dientes con PAC y dientes contralaterales sanos, respectivamente. Para
el grupo con PAC, ésta fue de 0,15 (0,14) mg/mL, y para el grupo sano de 0,15
(0,072) mg/mL. No hubo diferencias significativas entre ambos grupos (p>0,05)
(Figura 1).
48
Figura 1. Concentración de proteínas totales en FGC de dientes con PAC y
contralaterales sanos. CPT: concentración de proteínas totales; FGC: fluido gingival
crevicular (N=42, p=0,88).
3. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13, y
niveles de α2-macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos
3.1.
Formas enzimáticas de las MMPs -9, -2 y -13 en FGC de dientes
con PAC y sanos
Se identificaron las formas enzimáticas de las MMPs -9, -2 y -13 en FGC
de dientes con PAC y sanos (Figura 2). Además, se corroboró la
correspondencia
entre
las
bandas
inmunorreactivas
identificadas
por
“immunowestern blot” y zimografía en gelatina, identificadas como MMPs -9 y -2.
La proforma de la MMP-9 se identificó como una banda única de ~92 kDa,
tanto en FGC de dientes con PAC y sanos, mientras que la forma activa no fue
identificada mediante “immunowestern blot” en las muestras estudiadas. Se
observaron fragmentos de menor peso molecular a los descritos para la
proforma y forma activa de la MMP-9 en ambos tipos de muestra (a).
49
La MMP-2 se identificó como una banda de ~72 kDa correspondiente a la
proforma, y una banda de ~64 kDa correspondiente a la forma activa. Ambas
bandas fueron identificadas en muestras de FGC de dientes con PAC, mientras
que en FGC de dientes sanos, estas bandas fueron levemente apreciables (b).
Finalmente, la proMMP-13 se identificó como una banda única de ~60
kDa, y la forma activa como una banda única de ~48 kDa, ambas presentes en
FGC de dientes con PAC, a diferencia de muestras de FGC de dientes sanos,
donde las bandas fueron levemente apreciables (c).
(a)
(b)
(c)
Figura 2. Formas enzimáticas de MMPs -9 (a), -2 (b) y -13 (c) en muestras de FGC
de dientes con PAC y controles sanos. Figuras representativas que demuestran las
inmunorreactividades correspondientes con la (a) proforma de MMP-9 (proMMP-9) de
~92 kDa, y fragmentos de menor peso molecular (fx), (b) proforma de MMP-2 (proMMP2) de ~72 kDa, MMP-2 activa (aMMP-2) de ~64 kDa. (c) proforma de MMP-13
(proMMP-13) de ~60 kDa, MMP-13 activa (aMMP-13) de ~48 kDa. SPM: Estándar de
peso molecular; PAC: FGC de dientes con PAC; C: FGC de dientes sanos.
3.2.
Niveles totales y actividad de MMPs -2 y -9 en FGC de dientes
con PAC y FGC sano
A partir de las 24 muestras de FGC analizadas por cada grupo, se
detectaron ambas formas de MMP-9 (proforma y forma activa) en muestras
50
de FGC de dientes con PAC mediante zimografía. Las proformas y formas
activas de MMP-2 fueron detectables solamente 12 muestras para FGC con
PAC y a 5 para FGC sano (p=0,03). Además, se detectaron bandas
gelatinolíticas adicionales de mayor peso molecular diferentes a las
proformas y formas activas de las gelatinasas, cercano a 130 kDa (Figura
3).
Figura 3. Actividad gelatinolítica en FGC de dientes con PAC y sanos. Figura
representativa de la actividad gelatinolítica en FGC de dientes con PAC y sanos.
SPM: Estándar de peso molecular; ProMMP-9 y -2: formas zimogénicas de MMPs -9 y
-2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMPs -9 y -2; PAC: FGC de dientes con PAC; C:
FGC de dientes sanos.
Los niveles totales de MMPs -9 y -2 para el grupo con PAC y sano se
muestran en la Figura 4. Los niveles totales de la MMP-9 para el grupo con PAC
correspondieron a 29086,84 (30116,12) ua y para el grupo sano a 39098,65
(32116,45) ua (a), mientras que los niveles totales de la MMP-2 correspondieron
a 28237,62 (22931,16) ua y a 2968,50 (2302,50) ua respectivamente (b). No
hubo diferencias significativas en los niveles de MMP-9 ni MMP-2 entre FGC de
dientes con PAC y sanos (p=0,82 y p=0,47 respectivamente). De igual manera,
no hubo diferencias significativas entre los niveles de estas MMPs cuando se
estandarizaron por CPT (datos no mostrados). Los niveles totales MMP-9
51
correspondieron a 252796,60 (341364,20) ua/µg PT para el grupo con PAC y
286928,50 (208787,80) ua/µg PT para el grupo sano, mientras que los niveles
totales de MMP-2 fueron 14324,70 (3929,92) ua/µg PT para el grupo con PAC y
a 24848,47 (152,09) ua/µg PT para el grupo sano (p=0,72 y p=0,18
respectivamente).
(a)
(b)
Figura 4. Niveles totales de MMP-9 (a) y MMP-2 (b) en FGC de dientes con PAC y
sanos. (a) ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=48, p=0,82). (b) ua: unidades arbitrarias
(pixeles) (N=10, p=0,47).
La actividad gelatinolítica de las proformas y formas activas de MMP-9 y
-2 se muestran en la Figura 5. No hubo diferencias significativas entre la
actividad, tanto de la proforma como la forma activa, de MMP-9 en FGC de
dientes con PAC y sanos (p=0,056 y p=0,37 respectivamente) (a). Para el grupo
con PAC, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-9 fue de 11758,17
(9160,30) ua y para la forma activa de 14826,86 (38499,05) ua. Para el grupo
sano, la actividad gelatinolítica de la proforma correspondió a 13223,75
(9121,53) ua y de la forma activa a 22197,67 (34209,65) ua. De igual manera, no
hubo diferencias significativas entre los valores obtenidos cuando se
52
estandarizaron por CPT (datos no mostrados), los cuales correspondieron a
107949,20 ± 51622,70 ua/µg PT para el grupo con PAC, y a 117335,10 ±
47199,46 ua/µg PT para el grupo sano en relación con la proforma de MMP-9; y
a 142068,20 (355709,30) ua/µg PT para el grupo con PAC y 142651,0
(156432,30) ua/µg PT para el grupo sano en relación con MMP-9 activa (p=0,18,
p=0,66 respectivamente).
De modo similar a los resultados obtenidos para MMP-9, no hubo
diferencias significativas en la actividad, tanto de la proforma como la forma
activa de MMP-2, en FGC de dientes con PAC y sanos (p=0,47 y p=0,14
respectivamente) (b). Para el grupo con PAC, la actividad gelatinolítica de la
proforma de MMP-2 fue de 8441,50 (4822,56) ua y para la forma activa de
16538,04 (19813,91) ua. Para el grupo sano, la actividad gelatinolítica de la
proforma correspondió a 2424,0 (2493,50) ua y de la forma activa a 544,5
(108,50) ua. No fue posible determinar las diferencias presentadas entre ambos
grupos estandarizado por CPT, ya que no se detectaron estas formas en las
muestras que se destinaron para el ensayo de medición de CPT.
53
(a)
(b)
Figura 5. Actividad gelatinolítica de la proforma y forma activa de MMP-9 (a) y -2
(b) en FGC de dientes con PAC y sanos. (a) ProMMP-9: forma zimogénica de MMP-9;
aMMP-9: forma activa de MMP-9; ua: unidades arbitrarias (pixeles) (n=48, p=0,056,
p=0,37 respectivamente). (b) ProMMP-2: forma zimogénica de MMP-2; aMMP-2: forma
activa de MMP-2; ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=17, p=0,47, p=0,14
respectivamente).
Adicionalmente se determinó la razón de activación de MMPs -9 y -2 en
FGC de dientes con PAC y sanos. En relación con MMP-9, ésta correspondió a
0,61 (0,48) ua para el grupo con PAC y a 0,58 (0,25) ua para el grupo sano. En
relación con MMP-2, ésta correspondió a 0,61 (0,46) ua para el grupo con PAC y
a 0,18 (0,16) ua para el grupo sano. No se observaron diferencias significativas
entre ambos grupos en estudio (p=0,22, p=0,53 respectivamente) (Figura 6). De
igual manera, no hubo diferencias significativas entre los valores obtenidos
cuando se estandarizaron por CPT, los cuales correspondieron a 3.28 (9,81)
ua/µg PT para el grupo con PAC, y a 2.22 (16,76) ua/µg PT para el grupo sano
(p=0,97).
54
Figura 6. Razón de activación de MMPs -9 y -2 en FGC de dientes con PAC y
sanos. actMMP-9: razón de activación de MMP-9; actMMP-2: razón de activación de
MMP-2 (N=48, N=10 , p=0.22, p=0.53).
Se correlacionaron los valores obtenidos mediante zimografía para las
proformas y formas activas de las MMPs -9 y -2 en FGC de dientes con PAC y
sanos.
En FGC de pacientes con PAC se obtuvo correlación negativa entre la forma
activa de MMP-9 y la forma activa de MMP-2 (r=-0,63, p=0,03) (Tabla III),
mientras que en FGC de pacientes sanos se obtuvo correlación negativa entre la
proforma y la forma activa de la MMP-2 (r=-1,00, p<0,001) (Tabla IV).
Tabla III. Matriz de correlación de Spearman entre formas enzimáticas de
MMPs -9 y -2 en FGC de pacientes con PAC
proMMP-9
aMMP-9
proMMP-2
aMMP-2
(rho)
(rho)
(rho)
(rho)
proMMP-9
1
------aMMP-9
0,18
1
----proMMP-2
0,17
-0,50
1
--aMMP-2
-0,21
-0,63*
0,50
1
ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2.
N=12. *p=0,03.
55
Tabla IV. Matriz de correlación de Spearman entre formas
enzimáticas de MMPs -9 y -2 en FGC de pacientes sanos
proMMP-9
aMMP-9
proMMP-2
aMMP-2
(rho)
(rho)
(rho)
(rho)
proMMP-9
1
------aMMP-9
0,50
1
----proMMP-2
0,30
0,60
1
--aMMP-2
-0,30
-0,60
-1,00*
1
ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2.
N=5. *p<0,001.
3.3.
Actividad basal y total de MMP-13 en FGC de dientes con PAC y
sanos
Se analizó la actividad basal y total de MMP-13 en FGC de 21 dientes con
PAC y 19 sanos. En el grupo con PAC, se observaron niveles detectables en 20
muestras, mientras que en el grupo sano, se observaron niveles detectables en
16 (p>0,05). No se obtuvieron diferencias significativas entre ambos grupos de
estudio tanto para la actividad basal como para la total (p=0,71, p=0,14
respectivamente) (Figura 7). En relación con la actividad basal, se obtuvo 21,60
(8,56) ngPF para el grupo con PAC y 20,97 (16,87) ngPF para el grupo sano; en
relación con la actividad total (niveles), se obtuvo 17,90 (12,36) ngPF para el
grupo con PAC y 18,35 (26,76) ngPF para el grupo sano. De igual manera, no
hubo diferencias significativas entre los valores obtenidos cuando se
estandarizaron por CPT, los cuales correspondieron a 135,06 (130,65) ng PF/µg
PT para el grupo con PAC, y a 132,43 (143,69) ng PF/µg PT para el grupo sano
(p=0,97) en relación con la actividad basal de MMP-13, y a 108,89 (115,23) ng
PF/µg PT para el grupo con PAC, y a 90,90 (224,82) ng PF/µg PT para el grupo
56
sano en relación con la actividad total de MMP-13 (p=0,97, p=0,31
respectivamente; datos no mostrados).
No se pudieron determinar los niveles de MMP-13 en FGC de dientes con
PAC y sanos ya que se encontraron bajo el límite de sensibilidad del ensayo
realizado.
Figura 7. Actividad basal y total de MMP-13 en FGC de dientes con PAC y sanos.
(N=40, N=32, p=0,71, p=0,14 respectivamente).
3.4.
Niveles de α2- macroglobulina en FGC de dientes con PAC y
sanos
Se determinaron los niveles de α2- macroglobulina en 20 muestras de
FGC de dientes con PAC y 20 muestras de dientes sanos destinadas para este
ensayo. No se obtuvieron diferencias significativas entre ambos grupos en
estudio (p=0,64) (Figura 8). De igual manera, no hubo diferencias significativas
entre los valores obtenidos cuando se estandarizaron por CPT, los cuales
57
correspondieron a 599,66 (567,43) pg/ µg PT para el grupo con PAC, y a 502,32
(458,56) pg/ µg PT para el grupo sano (p=0,78; datos no mostrados).
Figura 8. Niveles de α2-macroglobulina en FGC de dientes enfermos y controles
(N=40, p=64).
4. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13 en
tejido correspondiente a LPAs y ligamento periodontal sano.
4.1.
Formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13 en tejido
correspondiente a LPAs y LS
Se identificaron las formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13 en LPAs
y LS (Figura 9). Además, se corroboró la correspondencia entre las bandas
inmunorreactivas identificadas por “immunowestern blot” y zimografía en
gelatina, identificadas como MMPs -2 y -9.
En relación con MMP-9, se identificó como una banda única de ~92 kDa,
correspondiente a la proforma tanto en muestras de LPAs como LS. Por otro
58
lado, se identificó una banda tenue de ~84 kDa, en LPAs, que no fue identificada
en las muestras de LS. Se observaron fragmentos de menor peso molecular en
ambos tipos de muestras (a).
La MMP-2 se identificó como una banda única de ~72 kDa
correspondiente a la proforma, y una banda de ~64 kDa correspondiente a la
forma activa. Ambas bandas fueron identificadas en muestras de LPAs como LS.
Además, se observaron fragmentos de menor peso molecular de los descritos
en muestras correspondientes a LS (b).
Finalmente, la MMP-13 se identificó como una banda única de ~60 kDa,
correspondiente a la proforma, y una banda de ~48 kDa, correspondiente a la
forma activa, ambas presentes en LPAs y LS. También se observaron
fragmentos de menor peso molecular, especialmente en LS (c).
(a)
(b)
(c)
Figura 9. Formas enzimáticas de MMPs -9 (a), -2 (b) y -13 (c) en muestras de
muestras de tejido correspondiente a LPAs y LS. Figuras representativas que
demuestran las inmunorreactividades correspondientes con la (a) proforma de MMP-9
(proMMP-9) de ~92 kDa, MMP-9 activa (aMMP-9) de ~84 kDa y fragmentos de menor
peso molecular (fx), (b) proforma de MMP-2 (proMMP-2) de ~72 kDa, MMP-2 activa
(aMMP-2) de ~64 kDa y fragmentos de menor peso molecular (fx), (c) proforma de
MMP-13 (proMMP-13) de ~60 kDa, MMP-13 activa (aMMP-13) de ~48 kDa y
fragmentos de menor peso molecular (fx). SPM: Estándar de peso molecular; LPA:
homogeneizado de LPAs; LS: homogeneizado de LS.
59
4.2.
Niveles totales y actividad de MMPs -2 y -9 en tejido
correspondiente a LPAs y LS
Se detectaron las proformas y formas activas de las MMPs -2 y -9 tanto
en LPAs como en LS mediante zimografía en gelatina. Tanto las formas
enzimáticas de la MMP-2 como MMP-9 se detectaron en todas las muestras
analizadas (n=25) (Figura 10).
Figura 10. Actividad gelatinolítica en LPAs y LS. Figura representativa de la
actividad gelatinolítica en LPAs y LS. SPM: Estándar de peso molecular; ProMMP-9 y
-2: formas zimogénicas de MMPs -9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMPs -9 y -2;
LPA: homogeneizado de LPAs; LS: homogeneizado de LS.
Los niveles totales de MMPs -9 y -2 en LPAs y LS se muestran en la
Figura 11. Los niveles totales de la MMP-9 para LPAs correspondieron a
9187,77 (5334,78) ua y para LS a 4635,92 (2652,97) ua (a), mientras que los
niveles totales de la MMP-2 para LPAs correspondieron a 24266,30 (29758,23)
ua y para LS a 16606,91 (53796,79) ua (b). Los niveles totales de MMP-9 fueron
significativamente mayores en LPAs que en LS (p=0,001), mientras que no hubo
diferencias significativas entre los niveles totales de MMP-2 en LPAs y LS
(p=0,48).
60
(a)
(b)
Figura 11. Niveles totales de MMPs -9 (a) y MMP-2 en LPAs y LS. (a) ua: unidades
arbitrarias (pixeles) (N=50, p=0,001), (b) (N=50, p=0,63).
La actividad gelatinolítica de las proformas y formas activas de MMP-9 y 2 se muestran en la Figura 12. Para el grupo de LPAs, la actividad gelatinolítica
de la proforma de MMP-9 fue de 4493,75 (3693,0) ua y de la forma activa fue de
5392,35 (2417,15) ua. Para el grupo de LS, la actividad gelatinolítica de la
proforma correspondió a 3064,63 (2833,37) ua y de la forma activa a 1403,87
(1080,98) ua. Tanto la proforma como la forma activa tuvieron mayor actividad
en LPAs en comparación con LS (p=0,03, p<0,001, respectivamente) (a).
En relación a la actividad de MMP-2 en tejido correspondiente a LPAs y
LS, no hubo diferencias significativas tanto para la proforma como para la forma
activa entre ambos grupos en estudio (p=0.75, p=0.51 respectivamente) (b).
Para el grupo de LPAs, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-2 fue
de 10624,19 (10839,51) ua y de la forma activa fue de 14971,01 (18592,79) ua.
Para el grupo de LS, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-2
correspondió a 6586,27 (25789,58) ua y de la forma activa a 11315,53
(29779,64) ua.
61
(a)
(b)
Figura 12. Actividad gelatinolítica de la proforma y forma activa de MMP-9 (a) y -2
(b) en LPAs y LS. (a) ProMMP-9: forma zimogénica de MMP-9; aMMP-9: forma activa
de MMP-9; ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=50, *p=0,03, #p<0,001). (b) ProMMP-2:
forma zimogénica de MMP-2; aMMP-2: forma activa de MMP-2; ua: unidades arbitrarias
(pixeles) (N=50, p=0,75, p=0,71).
Adicionalmente se determinó la razón de activación de MMPs -9 y -2 en
tejido correspondiente a LPAs y LS. En relación con MMP-9, ésta correspondió a
0,59±0,25 y 0,64±0,11 ua, sin diferencias significativas entre ambos grupos en
estudio (p=0,21). En relación con MMP-2, la razón de activación para LPAs fue
de 0,19 (0,55) ua y 0,20 (0,30) ua respectivamente, siendo significativamente
mayor en LPAs que en LS (p=0,003) (Figura 13).
62
Figura 13. Razón de activación de MMPs -9 y -2 en LPAs y LS. ActMMP-2: razón de
activación de MMP-2; actMMP-9: razón de activación de MMP-9 (N=50, *p=0,003,
p=0,21).
Se correlacionaron los valores obtenidos mediante zimografía para las
proformas y formas activas de las MMPs -9 y -2, niveles totales de éstas y
actividad basal y total de MMP-13 en LPAs y LS. No se obtuvieron correlaciones
entre los mediadores estudiados.
Cuando se analizaron los valores obtenidos mediante zimografía para las
proformas y formas activas de las MMPs -9 y -2, se obtuvieron correlaciones
significativas en LS de la MMP-2 con la proforma y forma activa de la MMP-9
(r=0.70, p=0.001; r=-0.58, p=0.001 respectivamente), y entre la forma activa de
la MMP-2 con la proforma y forma activa de la MMP-9, y con la proforma de la
MMP-2 (r=0.71, p=0.001; r=-0.40, p=0.02; r=0.82, p=0.001 respectivamente). En
LPAs se obtuvo correlación entre la proforma y forma activa de la MMP-2
(r=0.72, p=0.001) (Tabla VI).
63
Tabla VI. Matriz de correlación de Spearman entre formas
enzimáticas de MMPs -9 y -2 en LPAs y controles
proMMP-9
aMMP-9
proMMP-2
aMMP-2
(rho)
(rho)
(rho)
(rho)
LPA
LS
LPA
LS
LPA
LS
LPA
LS
proMMP-9
1
1
------------aMMP-9
-0,01
-0,36
1
1
--------proMMP-2
0,33
0,70*
0,23
-0,58*
1
1
----aMMP-2
0,27
0,71*
0,29
-0,40*
0,72*
0,82*
1
1
ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2.
N=50. *p<0,05.
4.3.
Actividad basal y total de MMP-13 en tejido correspondiente a
LPAs y LS
En relación con la actividad basal de la MMP-13, se obtuvo 10,38±2,43
ngPF/mg para el grupo de LPAs y 18,60 ± 3,87 ngPF/mg para el grupo sano, en
relación con la actividad total se obtuvo 4,73 (3,98) ngPF/mg para el grupo de
LPAs y 6,84 (7,54) ngPF/mg para el grupo sano; por tanto se obtuvo una mayor
actividad basal en LS que en LPAs (p=0,03). No hubo diferencias significativas
en la actividad total de MMP-13 entre ambos grupos en estudio (p=0,53) (Figura
14). No se encontró correlación entre MMP-13 y las demás MMPs (p>0,05).
64
Figura 14. Actividad basal y total de MMP-13 en LPAs y LS. (N=16, *p=0,03,
p=0,53).
5. Asociación de la presencia, niveles y actividad de los mediadores de
interés entre muestras de tejido lesional y FGC de los dientes
correspondientes.
No se obtuvo correlación en la actividad tanto de las proformas como de las
formas activas de las MMPs en estudio presentes en el FGC con las presentes
en las LPAs (p>0.05).
6. Asociación de la presencia y niveles de estos mediadores con
antecedentes generales (edad, género) y características clínicas
(tabaquismo y diámetro promedio de la lesión) de los sujetos de
estudio.
Debido a que sólo se identificaron diferencias en LPAs, las asociaciones se
determinaron entre los valores obtenidos en este tipo de muestra y antecedentes
65
generales y características clínicas de los sujetos en estudio. Se detallan a
continuación las correlaciones obtenidas entre los mediadores en los que se
obtuvieron variaciones significativas entre el grupo enfermo y sano.
6.1.
Edad
La actividad de las proformas y formas activas según edad y estado se
presentan en la Tabla VII. Se obtuvieron correlaciones positivas entre la edad y
proforma de la MMP-9 (r=0,50, p=0,02) y forma activa de la MMP-2 (r=0,44,
p=0,04) en muestras de LS.
Tabla VII. Matriz de correlación de Spearman entre edad y formas enzimáticas
de MMPs -9 y -2 en LPAs y controles
Edad
proMMP-9
aMMP-9
ProMMP-2
aMMP-2
(años)
(rho)
(rho)
(rho)
(rho)
LPA
LS
LPA
LS
LPA
LS
LPA
LS
LPA LS
Edad
1
1
----------------proMMP-9
0,15
0,50*
1
1
------------aMMP-9
-0,12
0,23
0,02 -0,34
1
1
--------proMMP-2
0,22
0,26
0,32 0,67* 0,15 -0,67*
1
1
----aMMP-2
0,29
0,44* 0,26 0,71* 0,24 -0,45
0,67*
0,78*
1
1
ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2.
n=23, n=27. *p<0,05.
6.2.
Género
La actividad de las proformas y formas activas según género y estado se
presentan en la Tabla VIII y Tabla IX. En LPAs, no se obtuvieron diferencias
significativas de los niveles de los mediadores estudiados entre los géneros
femenino y masculino (p>0,05) (Tabla VIII). En cambio, en LS el género
66
femenino presentó mayores niveles de la proforma de la MMP-9 (p=0,01,
p=0,05) y de la forma activa de la MMP-2 (p=0,005) (Tabla IX).
Tabla VIII. Niveles y actividad de MMPs -2 y -9 en LPAs según género
Mediador
Inflamatorio
proMMP-9
aMMP-9
proMMP-2
aMMP-2
Femenino
n
Masculino
n
p
3935,52 (3693,0)
5744.05 (1781,48)
10983,0 (4774,06)
20304,5 (24031,25)
9
9
9
9
4493,75 (4139,47)
4678,91 (2667,65)
11901,5 (13787,9)
11250,98 (18908,54)
14
14
14
14
0,75
0,28
0,80
0,051
Resultados expresados como mediana. ProMMP-9 y -2: formas zimogénicas de MMPs 2 y -9; aMMP-2 y -9: formas activas de MMP-2 y -9; ua: unidades arbitrarias (pixeles).
Tabla IX. Niveles y actividad de MMPs -2 y -9 en LS según género
Mediador
Inflamatorio
proMMP-9
aMMP-9
proMMP-2
aMMP-2
Femenino
n
Masculino
n
p
3843,95 (3491,54)
941,33 (1112,66)
23451,97 (47890,35)
38965,59 (54610,91)
11
11
11
11
1522,18 (2210,58)
1477,18 (704,26)
5353,06 (3675,53)
9185,95 (4591,61)
11
11
11
11
0,01
0,20
0,05
0,005
Resultados expresados como mediana. ProMMP-9 y-2: formas zimogénicas de MMPs 2 y -9; aMMP-2 y -9: formas activas de MMP-2 y -9; ua: unidades arbitrarias (pixeles).
6.3.
Tabaquismo
Se determinaron los niveles y actividad de MMPs -2, -9 y -13 en LPAs y
LS en pacientes fumadores y no fumadores (Tabla X). Debido a que el grupo de
fumadores era pequeño, se eliminaron los valores correspondientes a los
fumadores, y se compararon los valores obtenidos en pacientes no fumadores
con los del grupo completo (Tabla XI). Se observaron niveles mayores de la
67
proforma y forma activa de MMP-9 (p=0,03, p=0,001 respectivamente) y para la
forma activa de MMP-2 (p=0,03), las cuales son mayores en LPAs que en LS.
Tabla X. Determinación de niveles y actividad de MMP-2, -9 y -13 en LPAs
y LS en pacientes fumadores y no fumadores
Mediador
LPAs
LS
N
p
Inflamatorio
proMMP-9 (ua)
4493,75 (3693)
3064,63 (2833,37)
50
0,03
aMMP-9 (ua)
5392,35 (2417,15)
1403,87 (1080,98)
50 0,001
Act MMP-9 (ua)
0,59 ± 0,25
0,64 ± 0,11
50
0,21
MMP-9 (ua)
9187,77 (5334,78)
4635,92 (2652,97)
50 0,001
proMMP-2 (ua)
10624,19 (10839,51) 6586,27 (25789,58)
50
0,75
aMMP-2 (ua)
16147,25 (23966,16) 11506,91 (30556,03) 50
0,51
Act MMP-2 (ua)
0,19 (0,55)
0,20 (0,30)
50 0,003
MMP-2 (ua)
25284,0 (30330,23) 16606,91 (53796,79) 50
0,63
Act. MMP-13
10,38 ± 2,43
18,60 ± 3,87
16
0,03
basal (ngPF/mL)
Act. MMP-13 total
4,73 (3,98)
6,84 (7,54)
16
0,53
(ngPF/mL)
Resultados expresados como mediana y promedios ± DS. ProMMP-9 y -2: formas
zimogénicas de MMPs -9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMPs -9 y -2; ua:
unidades arbitrarias (pixeles); Act: Relación entre formas activas v/s enzima total. PF:
producto fluorescente.
68
Tabla XI. Determinación de niveles y actividad de MMP-2, -9 y -13 en LPAs
y LS en pacientes no fumadores
Mediador
LPAs
LS
N
p
inflamatorio
proMMP-9 (ua)
4034,26 (3932,98)
2940,54 (2808,76)
36
0,03
aMMP-9 (ua)
5744,05 (2108,16)
1376,44 (986,56)
36
0,001
Act MMP-9 (ua)
0,64 (0,51)
0,62 (0,15)
36
0,81
MMP-9 (ua)
9787,0 (4731,12)
4315,93 (2680,12)
36
0,001
proMMP-2 (ua)
10828,87 (13787,90) 6189,81 (19628,22) 36
0,83
aMMP-2 (ua)
16483 (28089,80)
11461,59 (30131,32) 36
0,64
Act MMP-2 (ua)
0,53 (0,28)
0,27 (0,38)
36
0,03
MMP-2 (ua)
20287,5 (33112,59) 16067,02 (49605,53) 36
0,74
Act. MMP-13
12,42 ± 5,20
18,60 ± 3,87
10
0,18
basal (ngPF/mL)
Act. MMP-13 total
5,57 ± 3,66
6,04 ± 1,49
10
0,45
(ngPF/mL)
Resultados expresados como mediana y promedios ± DS. ProMMP-9 y-2: formas
zimogénicas de MMPs -2 y -9; aMMP-2 y -9: formas activas de MMP-2 y -9; ua:
unidades arbitrarias (pixeles); Act: Relación entre formas activas v/s enzima total. PF:
producto fluorescente.
6.4.
Tamaño de la lesión
Se correlacionaron los valores obtenidos para MMPs -9 y -2 en LPAs y el
diámetro de las LPAs respectivas. Los resultados obtenidos se presentan en la
Tabla XII. Se obtuvo una correlación positiva entre el diámetro de las LPAs con
las formas activas de MMPs -9 y -2 (r=0,52, p=0,03; r=0,48, p=0,04
respectivamente).
69
Tabla XII. Matriz de correlación de Spearman entre formas
enzimáticas de MMPs -9, -2 y diámetro de LPAs
Diámetro
de la LPA
proMMP-9
aMMP-9
proMMP-2
aMMP-2
Diámetro de
la LPA (rho)
1
proMMP-9
(rho)
---
aMMP-9
(rho)
---
proMMP-2
(rho)
---
aMMP-2
(rho)
---
0,22
0,52*
0,36
0,48*
1
-0,09
0,45
0,44
--1
0,20
0,27
----1
0,60*
------1
ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2.
N=18. *p<0,05.
70
DISCUSIÓN
Las LPAs constituyen un mecanismo de respuesta del hospedero frente a
la infección bacteriana del sistema de canales radiculares del diente [3]. La
patogénesis de esta enfermedad involucra la degradación de diversos
componentes de la MEC como resultado de la infección bacteriana [3, 132],
siendo la destrucción de tejidos periodontales (normalmente apicales) una
característica clave en la PAC [2]. Diversos mediadores inflamatorios, incluyendo
las MMPs, han sido propuestos como participantes en la destrucción de los
tejidos periodontales durante enfermedades inflamatorias [8, 104, 111]. Las
MMPs pertenecientes a las familias de las colagenasas y gelatinasas, tendrían
un rol preponderante en el inicio y/o progresión de las LPAs al degradar
directamente el colágeno constituyente de los tejidos blandos y duros del
periodonto [133-135].
A la fecha, el diagnóstico y estudio de las LPAs se basa principalmente en
la biopsia y su estudio anatomopatológico, que sólo se obtienen luego de la
exodoncia de la pieza en cuestión en aquellos casos en que no fue posible
realizar el tratamiento endodóntico, o bien, mediante cirugía periapical cuando
está indicada [136]. También se ha propuesto el análisis de muestras de
exudado periapical tomadas a través del canal radicular, pero éstas sólo pueden
obtenerse durante el inicio del tratamiento de endodoncia [137]. Dichos métodos
son invasivos, y no permiten el monitoreo de la evolución de la lesión una vez
finalizado el tratamiento.
71
La caracterización del FGC ha sido ampliamente utilizada en el estudio de
marcadores de enfermedades periodontales [13] ya que, entre otras razones,
contiene moléculas involucradas en el proceso destructivo y podría representar
una fuente de mediadores inflamatorios asociados con actividad osteoclástica
[138]. A pesar de lo anterior, existen escasos datos sobre el estudio de MMPs y
sus inhibidores en el FGC de dientes con PAC. El presente estudio incorpora
nuevo conocimiento sobre el estudio de estos mediadores tanto en el FGC como
en LPAs de dientes con esta patología.
Los resultados mostraron mayores niveles tanto de la proforma como de
la forma activa, niveles totales y razón de activación de MMP-9 en LPAs en
comparación con LS. Además, MMPs -9 y -2 fueron reconocidas mediante
zimografía en gelatina tanto en muestras de homogeneizados de LPA y LS como
de FGC. Por último, fueron reconocidas las formas enzimáticas de MMPs -9, -2 y
-13 en muestras de homogeneizados y FGC. Debido a lo anterior, la hipótesis
propuesta se aprueba de manera parcial.
Este trabajo demuestra por primera vez, mediante “immunowestern blot”,
la presencia de las MMPs -2, -9 [116] y -13 en el FGC de dientes con PAC, y
corresponden a lo descrito previamente en la literatura en patologías como la
periodontitis crónica [33, 80, 102-105]. Adicionalmente, éstas corroboran la
identidad de las MMPs -2 y -9 identificadas en el presente estudio y en forma
previa por zimografía. La forma activa de la MMP-9 no se identificó mediante
“immunowestern blot” en este estudio. Esto podría deberse a que una vez
activas, las MMPs son altamente inestables y rápidamente degradadas a
72
fragmentos de bajo PM, y a que esta técnica presenta una sensibilidad menor en
relación con la zimografía. Al igual que en el estudio de Belmar y cols. [113], se
detectó una banda de mayor peso molecular que las correspondientes para las
formas de las colagenasas estudiadas mediante zimografía, con un PM
correspondiente a ~130 kDa. Ésta ha sido anteriormente descrita como
complejos formados por MMP-9 y lipocalina [139].
En el presente estudio no se demostraron diferencias significativas entre
los niveles totales, proforma y la forma activa de la MMP-9 en FGC de dientes
con PAC versus sanos, en contraste a lo presentado recientemente por otros
investigadores. Belmar y cols. [113] observaron niveles totales de proMMP-9
significativamente elevados en el FCG de dientes con PAC en comparación con
dientes sanos, y variaciones similares en la proforma y forma activa, pero sin
diferencias
significativas.
Además,
estos
autores
demostraron
una
predominancia de detección de la proforma de esta MMP en los dientes con
PAC, mientras que en el presente estudio ambas formas no demostraron
diferencias entre muestras de PAC y sanos. Por último, en el presente estudio
no se demostró una diferencia en el porcentaje de activación para MMP-9 entre
FGC de dientes con PAC y sanos. Estos datos se oponen a lo descrito en la
literatura para MMP-9 en FGC de dientes con periodontitis crónica, donde se
han descrito niveles y actividad significativamente mayores en FGC de pacientes
enfermos en comparación con sujetos sanos [103, 129, 139-146].
73
De modo similar a los resultados obtenidos por Belmar y cols. [113], la
MMP-2 no se identificó en todas las muestras estudiadas. Sin embargo, ambas
formas de MMP-2 fueron detectadas tanto en enfermos como en sanos. Por otro
lado, en ambos estudios las diferencias obtenidas para las proformas y formas
activas de MMP-2 no fueron significativas entre el FGC de dientes con PAC y
dientes sanos. Estudios previos también han fallado en detectar niveles
aumentados de MMP-2 en FGC de muestras de pacientes con periodontitis
crónica [147]. Por el contrario, otros investigadores han descrito mayores niveles
de MMP-2 en el FGC de pacientes con periodontitis en comparación con sujetos
sanos [141-143, 146]. Estos resultados conflictivos pueden ser explicados por
las diferentes técnicas experimentales utilizadas.
En el presente estudio se presentan por primera vez datos en relación a
niveles y actividad basal y total de MMP-13 en FGC de dientes con PAC y
sanos, sin embargo, éstos no presentaron diferencias significativas. Estos
resultados se contraponen con lo descrito en la literatura para otras
enfermedades destructivas del periodonto, como la periodontitis crónica, donde
se ha determinado la presencia de MMP-13 en FGC de pacientes enfermos con
niveles significativamente mayores en comparación con sujetos sanos [102-105,
130, 135, 148, 149] y actividad patológicamente elevada en extractos de tejido
gingival y FGC de sitios con periodontitis crónica comparada con el tejido
periodontal y FGC de dientes sanos [102, 105]. Por el contrario, se ha
demostrado que la actividad basal de la MMP-13 no varía significativamente en
sitios inactivos de pacientes con periodontitis crónica en comparación con
74
sujetos sanos. En cambio, los niveles son significativamente elevados en sitios
periodontales activos.
La falta de diferencias en los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y 13
encontrados en este estudio podría explicarse de distintas formas: se ha
determinado que las MMPs -9 y -13 se expresan de manera diferencial entre
QRIs y GPAs [119]. En este estudio no fue posible identificar QRIs y GPAs
debido a que estos diagnósticos requieren de la extirpación quirúrgica y
subsiguiente estudio histopatológico de cortes seriados de las respectivas
lesiones. Otro factor que podría explicar estos resultados corresponde a la
diversidad de orígenes de los distintos mediadores presentes en el FGC. A
diferencia del análisis de muestras tisulares, tales como las LPAs, donde los
mediadores provienen de la propia lesión, los mediadores presentes en el FGC
se originan a partir del periodonto periapical, periodonto marginal y de la
circulación general. Asimismo, se ha demostrado que los procesos periapicales
pueden inducir cambios inflamatorios sistémicos [150], que podrían manifestarse
en el FGC a nivel del sujeto, determinando cambios en su composición tanto en
dientes afectados como en dientes clínicamente sanos. La determinación de la
influencia de estos factores en la composición del FGC requiere el desarrollo de
nuevos estudios.
Por primera vez se reportan niveles de α2M en FGC de dientes con PAC
y sanos. No se observaron diferencias significativas entre los dos grupos en
estudio. En concordancia con la literatura se encuentra el hecho de que α2M se
detecta en FGC de dientes sanos, como lo describió Junker y cols. [126]. Otros
75
investigadores han reportado que no existen diferencias en los niveles de α2M
en FGC de dientes con gingivitis y periodontitis crónica en sacos de moderada
profundidad y sacos profundos, situación que no sería similar a la estudiada en
el presente trabajo, ya que se comparan tres tipos de sitios con diversos estados
inflamatorios, y no incluye un grupo sano [151]. Por otro lado, se han descrito
niveles significativamente elevados de α2M en FGC de dientes con periodontitis
crónica versus sanos, los que disminuyen luego del tratamiento periodontal
convencional [123-125]. A partir de los datos anteriores, se fortalece la idea
presentada por Junker y cols. acerca de que la producción local de α2M puede
ser estimulada y aumentada por citoquinas inflamatorias, las que también
aumentarían la expresión del receptor de α2M en el tejido [126]. Existen 2
formas de a2M in vivo, una total y otra procesada [152, 153]. La conversión total
de a2M a especies transformadas se debe a la acción de proteasas presentes
en el medio [95, 154]. La determinación de complejos inhibidores de proteasas
puede ser usada como una medición de la carga proteolítica en el FGC. En la
encía sana, hay un balance entre proteinasas y sus inhibidores [125]. Cualquier
aumento en las proteasas, tanto de origen bacteriano como del hospedero,
puede reaccionar con a2M y, por lo tanto, aumentar la fracción de complejos
a2M-proteinasas [124]. La falta de diferencias entre los niveles de a2M entre el
FGC de dientes con PAC y sanos podría indicar que en ambos tipos de
muestras existiría una carga proteolítica similar, o bien, podría deberse a la
acción de otros factores que modifican la composición del FGC.
76
A diferencia de lo descrito en el estudio realizado por Burgener y cols.
[118], la CPT obtenida en FGC de pacientes con PAC no mostró diferencias
significativas con la del FGC de sujetos sanos. La diferencia obtenida en el
presente estudio en comparación con el estudio de Burgener y cols. podría
deberse a las diferencias en la técnica metodológica utilizada.
Una consideración importante en el análisis de mediadores en el FGC es
el método de presentación de los datos. Actualmente existe consenso respecto
que la expresión de niveles de biomarcadores específicos en el FGC como la
cantidad total por un tiempo estandarizado de colección (30s) es la forma más
sensible de reportarlos [155-157]. Estudios previos han evidenciado que, tanto la
CPT como el volumen de FGC varían significativamente de acuerdo al estado de
inflamación de los tejidos periodontales [105, 130, 135], principalmente como
producto de la extravasación desde la circulación y de los procesos de síntesis y
destrucción locales [27, 157].
Con respecto a los tejidos periapicales, en este estudio se identificaron
las formas enzimáticas correspondientes a las MMPs -2, -9 y -13 en LPAs, en
concordancia con aquellas identificadas en el FGC de dientes con PAC y
estudios previos efectuados en tejido gingival de periodontitis crónica [80].
Además,
se
corroboraron
bandas
obtenidas
por
zimografía
mediante
“immunowestern blot” [116].
Por otra parte, en el presente estudio se observaron diferencias
significativas entre niveles totales, proforma y forma activa de MMP-9 en LPAs
versus LS [116], en conjunto con un aumento de la razón de activación para
77
MMP-9. Estos resultados se encuentran en línea con los obtenidos por Carneiro
y cols. [112], los que detectaron una expresión significativamente mayor en
lesiones epitelizadas y no epitelizadas en comparación con LS mediante qPCR,
sugiriendo que esta MMP podría estar directamente involucrada en la
destrucción/remodelación tisular durante el desarrollo de las LPAs. Estos
antecedentes, en conjunto, sugieren que el aumento de la actividad MMP-9 en
LPAs se debería no sólo a una mayor síntesis de la enzima, sino también al
aumento de su activación.
Se ha reportado que MMP-9 es una enzima cooperativa que participa en
el ciclo de activación-reabsorción y formación durante la remodelación ósea y
destrucción patológica de hueso [109]. Asimismo, se ha asociado con la
destrucción de tejido periodontal en otras condiciones como periodontitis crónica
y periimplantitis [144, 158]. Se ha descrito que la MMP-9 actuaría sobre el
reclutamiento de preosteoclastos al tejido óseo y su migración desde la médula
ósea para la diferenciación osteoclástica y reabsorción ósea [159]. También
MMP-9 juega un importante rol en la migración de células inmunes, como ha
sido demostrado por la presencia disminuida de neutrófilos, linfocitos y células
dendríticas en lavado broncoalveolar (BALF) de ratones knockout para MMP-9
luego del desafío antigénico [160]. Debido a su habilidad para degradar
colágeno en membranas basales vasculares, las gelatinasas están involucradas
en neovascularización [161], tanto en condiciones fisiológicas como patológicas
[65], proceso central durante la patogénesis de las LPAs. Además, MMP-9 libera
la forma biológicamente activa del factor de crecimiento endotelial vascular
78
(VEGF), que juega un importante rol en angiogénesis. Este proceso se
complementa por la directa degradación proteolítica de las proteínas de la
membrana basal vascular, indicando que MMP-9, incluso de mayor manera que
MMP-2, puede jugar un rol crucial en la formación de nuevos vasos sanguíneos
[162].
A pesar de presentarse una tendencia a la mayor actividad de MMP-2 en
LPAs en comparación con LS, ésta no fue significativa. Por el contrario, un
estudio previo determinó una mayor expresión génica de MMP-2 en LPAs en
comparación a LS [119]. Otros estudios han demostrado variaciones de la MMP2 en relación a cuadros periapicales agudos. MMP-2 no pudo ser detectada en
muestras de exudado apical proveniente de abscesos apicales crónicos, pero sí
en abscesos apicales agudos primarios y secundarios, a diferencia de MMP-9,
que fue detectada en todas las muestras del estudio [114]. También se
detectaron niveles discretos de expresión de MMP-2 en la fase crónica de
formación de la LPA, a diferencia del estadio inicial agudo en un modelo
experimental de periodontitis apical [117]. Por otro lado, se han detectado
niveles aumentados de IL-1α y β en lesiones sintomáticas [163, 164] que
pueden, a su vez, causar aumento de MMPs -2 y -9, los que podrían tener un rol
específico en abscesos apicales agudos [114], patologías asociadas a
destrucción ósea avanzada [114].
En estudios anteriores ha sido reportado que TGF-β, una de las
citoquinas involucradas en el proceso de reparación, fue detectada en GPAs y
79
QRIs [165]. Se ha determinado que la producción de MMP-2 se inhibe por TGFβ, y que no afecta a los niveles de MMP-9 [166]. Al contrario, se ha reportado
que TGF-β sobrerregula el mRNA de MMP-9 de manera significativa [167]. Las
razones por las cuales en el presente estudio no se obtuvieron diferencias
significativas en los niveles de MMP-2 en LPAs versus LS podrían relacionarse
con que la expresión de MMP-2 es constitutiva, y la mayoría de los estímulos
inflamatorios fallan en aumentar sus niveles de expresión ya que su gen
correspondiente, al contrario del gen de MMP-9, carece de sitios de unión para
factores de transcripción inflamatorios [168]. Se han descrito dos elementos
presentes a nivel del promotor del gen que codifica para esta enzima, Sp1 y
AP-2, que mediarían la expresión constitutiva de MMP-2 [169], con sólo una leve
capacidad de ser inducida por factores de crecimiento o citoquinas [170].
Además, se ha demostrado que la función de MMP-2 puede ser intercambiable
con la de otras MMPs, una hipótesis que se sostiene por la observación de que
la expresión de MMP-9 está aumentada de gran manera en ratones knockout
para MMP-2 [171].
La localización tisular de MMPs -9 y -2 ha sido descrita en GPAs y QRIs
en estudios anteriores [110, 115-117, 119]. Leucocitos y fibroblastos residentes
de los tejidos periodontales secretan MMPs, incluyendo MMPs -1, -2, -3, -8, -9 y
-13 [8, 104, 111, 172]. Si bien existen estudios en PAC que han demostrado una
sobreexpresión de mRNA de MMPs -2 y -9 en LPAs [112, 114, 115] y mayores
niveles de actividad de proformas y formas activas de ambas MMPs han sido
descritos en exudado periapical de dientes con diagnóstico clínico de abscesos
80
apicales agudos, con mayores niveles de actividad de MMP-9 en los agudos
versus los crónicos [114], es primera vez que se reportan niveles y actividad de
estas enzimas en LPAs, complementando resultados anteriormente obtenidos
en FGC [116]. Por otro lado, trabajos anteriores describen un aumento
significativo en MMPs -2, -3, -8 y -9 en pulpas inflamadas, producidas tanto por
células residentes como inflamatorias [8, 110, 111]. Además, un grupo de
investigadores reportó que los niveles de MMP-9 aumentaban, mientras que los
de MMP-2 disminuían en pulpas inflamadas en comparación con pulpas
clínicamente sanas [173]. En uno de estos estudios se propone que estas MMPs
tendrían un rol más importante en pulpitis aguda que en LPAs, debido a que
fueron detectadas en mayor cantidad en tejidos con patología aguda que
crónica. Sin embargo, en el mismo estudio se detectaron altos niveles de MMPs,
por lo que se discute que concentraciones elevadas de MMPs no siempre
indican el estado de la destrucción tisular [110]. Al respecto, es fundamental
considerar que la importancia biológica de niveles elevados de MMPs está
determinada en última instancia por la actividad de estas enzimas, producto del
balance entre sus activadores e inhibidores [174].
En el presente estudio se determinó la actividad basal, total y niveles de
MMP-13 en LPAs y LS. No se observaron diferencias significativas en la
actividad total ni en los niveles, pero sí se determinó una mayor actividad basal
en LS que en LPAs. Se ha descrito la expresión de MMP-13 asociada a células
con morfología compatible con macrófagos y plasmocitos [109, 116, 175].
Particularmente en plasmocitos, la MMP-13 se ha asociado con un fenotipo
81
específicamente destructivo, ya que la presencia de esta colagenasa se ha
observado también en numerosas lesiones osteolíticas de diversa naturaleza,
tales como quistes odontogénicos y plasmocitomas malignos [109]. Por otro
lado, MMP-13 se ha detectado fuertemente en LPAs epitelizadas en humanos,
donde pareciera contribuir a la migración de células epiteliales e invasión de
tejido de granulación durante la conversión de un GPA con epitelio a un QRI
[175]. Se ha propuesto además que, entre los mecanismos moleculares de la
expansión de los QRIs, estaría involucrado un desbalance entre MMPs y sus
inhibidores tisulares (TIMPs) [175]. De modo similar, se ha observado la
expresión de MMP-13 en encía de pacientes con periodontitis crónica, donde
podría tener un rol en el crecimiento proliferativo del epitelio dentro del tejido
conectivo [176]. Se sabe que la actividad de MMP-13 en extractos de tejido
gingival de sitios con periodontitis crónica está patológicamente elevada
comparada con el tejido periodontal de dientes sanos [102, 105]. En soporte de
lo anterior, en un estudio realizado en periodontitis crónica progresiva se
encontró aumento de la actividad de la MMP-13 en sitios con progresión en
asociación con niveles de ICTP, marcador de catabolismo óseo [104]. A
diferencia de lo descrito anteriormente, en el presente estudio no se observaron
diferencias significativas en la actividad total de MMP-13, e incluso se obtuvo
mayor actividad basal en LS versus LPAs. Esto podría deberse a diferentes
estados proliferativos del epitelio presente en las lesiones epitelizadas, como fue
planteado por Leonardi y cols. [111], quienes determinaron una mayor expresión
de MMP-13 en LPAs epitelizadas en comparación con lesiones no epitelizadas.
82
A partir de lo anterior se concluyó que la MMP-13 estaría involucrada en la
conversión de un GPA con epitelio a un QRI, propiedad relacionada no sólo con
la migración de células epiteliales, sino que también con la invasión del tejido de
granulación.
Al analizar la asociación entre los mediadores estudiados en relación con
los parámetros demográficos se obtuvieron correlaciones positivas entre la edad,
la proforma de MMP-9 y la forma activa de MMP-2 en LS. Estos resultados
preliminares sugieren que la presencia o actividad de estas gelatinasas
aumentaría con la edad en sujetos jóvenes. Una limitación de este estudio es la
diferencia de edad encontrada entre el grupo de pacientes con PAC y el grupo
de sujetos sanos. Ésta se debe a que sólo se pueden obtener dientes sanos
totalmente erupcionados debido a indicación de exodoncia por ortodoncia,
tratamiento que se efectúa con mayor frecuencia en sujetos jóvenes, mientras
que la PAC ocurre con mayor frecuencia en adultos. Existe evidencia reciente
que indica que cambios en el balance MMP/TIMP ocurre como resultado del
envejecimiento fisiológico, y que el género podría ser un factor modificador
significativo de este balance [177]. De hecho, se obtuvieron mayores niveles de
las proformas de las MMPs -9 y -2, y de la forma activa de la MMP-2 en el
género femenino en comparación con el masculino en muestras de LS, lo que
podría estar indicando un rol fisiológico género-dependiente de estas MMPs en
LS no descrito anteriormente. Se ha planteado como hipótesis en la literatura
que numerosos factores podrían ser responsables de la diferencia de niveles de
83
MMPs y TIMPs en función al género, que incluirían susceptibilidad a hormonas,
citoquinas y factores de crecimiento [177]. Los mecanismos de remodelación del
tejido conectivo dependientes del género no han sido completamente
dilucidados, y se requieren mayores estudios para su esclarecimiento. Por el
contrario, no se encontraron asociaciones entre niveles y/o actividad de MMPs y
parámetros demográficos en sujetos con PAC. Estos resultados sugieren que el
aumento de la actividad gelatinolítica en las LPAs se debió primariamente a la
presencia del proceso periapical.
En relación al tabaquismo, las diferencias obtenidas en todos los
pacientes no varían al eliminar los valores correspondientes a los pacientes
fumadores, lo que indicaría que esta variable no estaría influenciando la mayor
actividad de estas MMPs a nivel apical. De hecho, se ha descrito en la literatura
que el tabaquismo no estaría asociado con periodontitis apical [178]. Esta falta
de asociación es contraria a lo descrito para otras patologías destructivas orales,
como lo sería la periodontitis crónica, situación en la que diversos estudios
transversales y longitudinales han demostrado que la tasa de pérdida ósea
marginal en esta patología es más avanzada en fumadores que en no
fumadores [179-185].
Finalmente, se estudió la correlación entre la actividad de las MMPs -2 y 9 y el tamaño de la lesión. Se observó una correlación positiva entre el diámetro
de las LPAs con las formas activas de MMPs -9 y -2. Se ha descrito en la
literatura que las MMPs -2 y -9 participan en el proceso de reabsorción ósea en
la remoción de la matriz ósea orgánica. Las MMPs -2 y -9 degradan gelatina,
84
que corresponde al colágeno desnaturalizado [63], producto de la acción previa
de las MMPs con actividad colagenasa (MMPs -1, -8, -13 y -14). El colágeno es
la mayor proteína estructural de todos los tejidos periodontales [186], y las
MMPs colagenolíticas como MMPs -1, -8 y -13 son las únicas proteasas neutras
que tienen la habilidad de iniciar la digestión del colágeno tipo I, el colágeno más
dominante en estos compartimentos tisulares [50]. La MMP-13 es una
colagenasa cuya actividad es crítica para la degradación del colágeno tipo I, el
principal constituyente de la matriz extracelular periodontal apical. A nivel óseo,
esta degradación es requerida para el acceso del osteoclasto al sitio de
reabsorción, situación en la cual también participan las MMPs -2 y -9. Los
productos resultantes de la proteólisis del colágeno intersticial realizado por la
MMP-13, se desnaturan espontáneamente a temperatura ambiente y se
transforman en gelatina, la cual es susceptible a la acción de las MMPs -2 y -9
[68, 139]. Consecuentemente, la MMP-2 podría estar actuando en la
degradación de la MEC, favoreciendo la expansión de la lesión y, junto con
algunas citoquinas, como lo son TNF-α, IL-1α, IL-1β, y el sistema
RANKL/RANK/OPG [187], podría contribuir también a la destrucción ósea [117].
Además, se determinaron correlaciones positivas entre las proformas y formas
activas de MMPs -2 y -9. Al respecto, se ha descrito que MMP-9 es capaz de
activar a proMMP-2, proMMP-13 y su proforma in vitro y, a su vez, MMP-2 activa
a MMP-13 y a su proforma in vitro, generándose una posible cascada de
activación, en la cual también MMP-13 participaría mediante la activación de
proMMP-2, proMMP-9 y de su proforma in vitro, que implicaría un mecanismo de
85
amplificación de la destrucción tisular [56, 107]. De este modo, la asociación
entre las formas activas de MMP-2 y -9 podría reflejar su activación en el FGC
durante la PAC.
El infiltrado inflamatorio perirradicular está compuesto principalmente por
macrófagos, PMNs, células T, B y ocasionalmente plasmocitos [2, 110]. Los
linfocitos TCD4+ pueden inducir reabsorción ósea al secretar citoquinas como
RANKL, un factor clave en la diferenciación y activación osteoclástica [2]. Los
macrófagos son importantes reguladores de la degradación de la MEC,
representando la mayor fuente de citoquinas que reabsorben tejido óseo y
secretando MMPs que incluyen MMPs -2, -9 y -13 [2], y su presencia en PAC es
crucial en relación a respuestas tanto protectoras como a favor del desarrollo de
la lesión y perpetuación de reacciones inflamatorias [7]. Nuestro grupo de
investigación ya demostró la inmunopositividad de estas MMPs en células con
morfología compatible a las descritas [116], y en el presente estudio se
comprueba nuevamente la expresión de estas MMPs en LPAs y no en LS.
La vía de secreción de las MMPs es compleja. Se sabe que es regulada
en diversas etapas (“gates”) y que la transcripción de la mayoría de los genes de
MMPs es regulada por factores de crecimiento endógenos y citoquinas. Los
efectos transcripcionales de los factores de crecimiento y citoquinas están
mediados por diversas vías de señalización muy complejas. Se ha reportado que
IL-1 α y β, y TNF- α son capaces de inducir la producción de MMPs. Diversos
factores de crecimiento y citoquinas aumentan en 20 y 50 veces tanto los niveles
86
de mRNA como de proteínas. La secreción de MMPs también podría tener
correlación con estos niveles de citoquinas en LPAs [11, 39, 188].
Si bien el rol histórico de las MMPs está representado por la degradación
directa de la MEC, durante los últimos años se ha ido descubriendo un amplio
degradoma de sustratos bioactivos susceptibles de proteólisis por estas MMPs,
que incluyen citoquinas, quimioquinas, receptores de factores de crecimiento y
otras MMPs, actuando como moduladores de los procesos inmunoinflamatorios
[11]. Además, podrían incluso actuar de una manera protectora inhibiendo el
desarrollo de la destrucción tisular inducida por bacterias, mediante el
procesamiento de citoquinas y quimioquinas antiinflamatorias, como ha sido
recientemente reportado en periodontitis crónica [189]. En un estudio se
demostró que la inhibición de MMPs altera la inflamación pulpar y periapical,
aumentando la tasa de formación de lesiones óseas periapicales [190].
En síntesis, los resultados de este estudio sostienen que la MMP-9, y
posiblemente la MMP-2, en menor medida, se asocian con la patogenia de la
PAC. Si bien, los niveles elevados de MMP-9 no se reflejaron en el FCG, esto
podría deberse a la presencia de numerosos factores modificadores que
influencian la composición del FGC. La posible influencia de la PAC en la
composición del FCG es un factor que debiera tenerse en cuenta en el análisis
de biomarcadores en el FGC en estudios futuros.
87
CONCLUSIONES
1. El FGC proveniente de dientes enfermos presentó una CPT similar al de
dientes sanos.
2. Se identificaron las formas enzimáticas de las MMPs -9, -2 y -13 en FGC
de dientes con PAC y sanos, y en muestras de homogeneizados, y se
corroboró
la
correspondencia
entre
las
bandas
inmunorreactivas
identificadas por “immunowestern blot” y zimografía en gelatina,
identificadas como MMPs -9 y -2. No se observaron diferencias
significativas entre los niveles totales, de proformas, formas activas y
razón de activación de MMPs -9 y -2 en FGC mediante zimografía. En
FGC de pacientes con PAC, se obtuvo correlación negativa entre la forma
activa de MMP-9 y la forma activa de MMP-2 mientras que en FGC de
pacientes sanos se obtuvo correlación negativa entre la proforma y la
forma activa de la MMP-2. No se observaron diferencias significativas en
la actividad basal y total de MMP-13 entre FGC de dientes con PAC y
sanos. Los niveles de α2m fueron similares para ambos tipos de
muestras. Los niveles totales, actividad de proforma, forma activa de
MMP-9 y razón de activación de MMP-2 fueron significativamente
mayores en LPAs en comparación con LS, mientras que no hubo
diferencias significativas entre los niveles totales, actividad de proforma y
forma activa de MMP-2, razón de activación de MMP-9 y actividad basal y
88
total de MMP-13 entre ambos tipos de muestras.
3. No se obtuvo correlación en la actividad tanto de las proformas como de
las formas activas de las MMPs en estudio presentes en el FGC con las
presentes en las LPAs.
4. En relación a los antecedentes clínicos, se obtuvieron correlaciones
positivas entre la edad y proforma de la MMP-9 y forma activa de la MMP2 en muestras de LS. En LPAs, no se obtuvieron diferencias significativas
de los niveles de los mediadores estudiados entre géneros mientras que,
en LS, el género femenino presentó mayores niveles de la proforma de la
MMP-9 y de la forma activa de la MMP-2. Los valores obtenidos para los
mediadores en estudio no varían entre el grupo completo de pacientes y
el grupo de no fumadores. Se obtuvo una correlación positiva entre el
diámetro de las LPAs con las formas activas de MMPs -9 y -2.
En la propuesta “existe un aumento en los niveles y actividad de las
metaloproteinasas de matriz extracelular -2, -9 y -13” se comprueba que los
niveles totales, actividad de proforma, forma activa de MMP-9 y razón de
activación de MMP-2 fueron significativamente mayores en LPAs en
comparación con LS, pero no de los demás valores en homogeneizados ni en
FGC, y en relación a “niveles reducidos de α2-macroglobulina en dientes con
periodontitis apical crónica en comparación con dientes controles sin patología
periapical”, se demostró que ambos niveles son similares, por lo que, en
89
conjunto, los resultados expuestos en este trabajo confirman en parte la
hipótesis planteada.
A partir de lo anteriormente descrito, se puede concluir que las MMPs -9 y
-2 tendrían un rol preponderante en la patogenia de la PAC. A pesar de que en
el presente trabajo la caracterización de los mediadores en estudio en FGC no
ha sido capaz de reflejar los cambios que ocurren en las LPAs, futuros estudios
deben considerar la influencia de esta patología en la composición y actividad
proteolítica de éste. Un conocimiento más acabado de los mecanismos
involucrados en la destrucción del periodonto apical contribuirán al desarrollo de
métodos diagnósticos, de tratamiento y herramientas de seguimiento de uso
rutinario. Por ende, el estudio del FGC como fuente de potenciales
biomarcadores de PAC representa un nuevo enfoque que requiere futura
validación. 90
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Glickman, G.N., AAE Consensus Conference on Diagnostic Terminology: background and perspectives. Journal of endodontics, 2009. 35(12): p. 1619-­‐
20. Vernal, R., et al., RANKL in human periapical granuloma: possible involvement in periapical bone destruction. Oral diseases, 2006. 12(3): p. 283-­‐9. Nair, P.N., Pathogenesis of apical periodontitis and the causes of endodontic failures. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists, 2004. 15(6): p. 348-­‐81. Liapatas, S., M. Nakou, and D. Rontogianni, Inflammatory infiltrate of chronic periradicular lesions: an immunohistochemical study. International endodontic journal, 2003. 36(7): p. 464-­‐71. Ramachandran Nair, P.N., G. Pajarola, and H.E. Schroeder, Types and incidence of human periapical lesions obtained with extracted teeth. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 1996. 81(1): p. 93-­‐
102. Matsuo, T., et al., Quantitative analysis of immunocompetent cells in human periapical lesions: correlations with clinical findings of the involved teeth. Journal of endodontics, 1992. 18(10): p. 497-­‐500. Marton, I.J. and C. Kiss, Protective and destructive immune reactions in apical periodontitis. Oral microbiology and immunology, 2000. 15(3): p. 139-­‐50. Wahlgren, J., et al., Matrix metalloproteinase-­‐8 (MMP-­‐8) in pulpal and periapical inflammation and periapical root-­‐canal exudates. International endodontic journal, 2002. 35(11): p. 897-­‐904. Samuelsson, B., Leukotrienes: mediators of immediate hypersensitivity reactions and inflammation. Science, 1983. 220(4597): p. 568-­‐75. Mott, J.D. and Z. Werb, Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Current opinion in cell biology, 2004. 16(5): p. 558-­‐64. Parks, W.C., C.L. Wilson, and Y.S. Lopez-­‐Boado, Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity. Nature reviews. Immunology, 2004. 4(8): p. 617-­‐29. ørstavik, S.h.D., Radiological aspects of apical periodontitis. Endodontic Topics 2002. 1: p. 3–25 Loos, B.G. and S. Tjoa, Host-­‐derived diagnostic markers for periodontitis: do they exist in gingival crevice fluid? Periodontology 2000, 2005. 39: p. 53-­‐72. Embery, G. and R. Waddington, Gingival crevicular fluid: biomarkers of periodontal tissue activity. Advances in dental research, 1994. 8(2): p. 329-­‐36. Cimasoni, G., Crevicular fluid updated. Monographs in oral science, 1983. 12: p. III-­‐VII, 1-­‐152. Golub, L.M., et al., The response of human sulcular leucocytes to a chemotactic challenge. A new in vivo assay. Journal of periodontal research, 1981. 16(2): p. 171-­‐9. 91
17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. Grbic, J.T., et al., Immunoglobulin isotypes in gingival crevicular fluid: possible protective role of IgA. Journal of periodontology, 1995. 66(1): p. 55-­‐61. Gustafsson, A., B. Asman, and K. Bergstrom, Elastase and lactoferrin in gingival crevicular fluid: possible indicators of a granulocyte-­‐associated specific host response. Journal of periodontal research, 1994. 29(4): p. 276-­‐
82. Lamster, I.B. and M.J. Novak, Host mediators in gingival crevicular fluid: implications for the pathogenesis of periodontal disease. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists, 1992. 3(1-­‐2): p. 31-­‐60. Lamster, I.B., Evaluation of components of gingival crevicular fluid as diagnostic tests. Annals of periodontology / the American Academy of Periodontology, 1997. 2(1): p. 123-­‐37. Mukherjee, S., The significance of crevicular fluid. The Compendium of continuing education in dentistry, 1985. 6(8): p. 611-­‐2, 614, 616. Nakashima, K., et al., A longitudinal study of various crevicular fluid components as markers of periodontal disease activity. Journal of clinical periodontology, 1996. 23(9): p. 832-­‐8. Rasmussen, L., L. Hanstrom, and U.H. Lerner, Characterization of bone resorbing activity in gingival crevicular fluid from patients with periodontitis. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(1): p. 41-­‐52. Shapiro, L., et al., Sulcular exudate protein levels as an indicator of the clinical inflammatory response. Journal of periodontology, 1980. 51(2): p. 86-­‐7. Oringer, R.J., et al., Effect of locally delivered minocycline microspheres on markers of bone resorption. Journal of periodontology, 2002. 73(8): p. 835-­‐
42. Curtis, M.A., et al., The protein composition of gingival crevicular fluid sampled from male adolescents with no destructive periodontitis: baseline data of a longitudinal study. Journal of periodontal research, 1990. 25(1): p. 6-­‐16. Adonogianaki, E., J. Mooney, and D.F. Kinane, Detection of stable and active periodontitis sites by clinical assessment and gingival crevicular acute-­‐phase protein levels. Journal of periodontal research, 1996. 31(2): p. 135-­‐43. Oringer, R.J., Modulation of the host response in periodontal therapy. Journal of periodontology, 2002. 73(4): p. 460-­‐70. Alfano, M.C., The origin of gingival fluid. Journal of theoretical biology, 1974. 47(1): p. 127-­‐36. Krasse, B., Serendipity or luck: stumbling on gingival crevicular fluid. Journal of dental research, 1996. 75(9): p. 1627-­‐30. Cohen, S., Vías de la Pulpa. 8ª edición ed2002, Madrid: Editorial Elsevier Mosby. Brill, N. and B. Krasse, The Passage of Tissue Fluid into the Clinically Healthy Gingival Pocket. Acta Odontologica Escandinavica, 1958. 16(3): p. 233-­‐245. Uitto, V.J., Gingival crevice fluid-­‐-­‐an introduction. Periodontol 2000, 2003. 31: p. 9-­‐11. 92
34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. Lamster, I.B. and J.K. Ahlo, Analysis of gingival crevicular fluid as applied to the diagnosis of oral and systemic diseases. Annals of the New York Academy of Sciences, 2007. 1098: p. 216-­‐29. Griffiths, G.S., J.M. Wilton, and M.A. Curtis, Contamination of human gingival crevicular fluid by plaque and saliva. Archives of oral biology, 1992. 37(7): p. 559-­‐64. Lamster, I.B., et al., A comparison of 4 methods of data presentation for lysosomal enzyme activity in gingival crevicular fluid. Journal of clinical periodontology, 1988. 15(6): p. 347-­‐52. Ozkavaf, A., et al., Relationship between the quantity of gingival crevicular fluid and clinical periodontal status. Journal of oral science, 2000. 42(4): p. 231-­‐8. Pisano, E., et al., Peptides of human gingival crevicular fluid determined by HPLC-­‐ESI-­‐MS. European journal of oral sciences, 2005. 113(6): p. 462-­‐8. Birkedal-­‐Hansen, H., Role of cytokines and inflammatory mediators in tissue destruction. Journal of periodontal research, 1993. 28(6 Pt 2): p. 500-­‐10. Suomalainen, K., et al., Characteristics of neutral proteases present in inflamed human gingiva. Scandinavian journal of dental research, 1989. 97(4): p. 346-­‐
54. Heath, J.K., et al., Human gingival tissues in culture synthesize three metalloproteinases and a metalloproteinase inhibitor. Journal of periodontal research, 1982. 17(2): p. 183-­‐90. Salonen, J., et al., Proliferating oral epithelial cells in culture are capable of both extracellular and intracellular degradation of interstitial collagen. Matrix, 1991. 11(1): p. 43-­‐55. Sorsa, T., et al., Comparison of interstitial collagenases from human gingiva, sulcular fluid and polymorphonuclear leukocytes. Journal of periodontal research, 1988. 23(6): p. 386-­‐93. DeCarlo, A.A., Jr., et al., Activation and novel processing of matrix metalloproteinases by a thiol-­‐proteinase from the oral anaerobe Porphyromonas gingivalis. Journal of dental research, 1997. 76(6): p. 1260-­‐
70. Sorsa, T., et al., Identification of proteases from periodontopathogenic bacteria as activators of latent human neutrophil and fibroblast-­‐type interstitial collagenases. Infection and immunity, 1992. 60(11): p. 4491-­‐5. Carlsson, J., et al., Degradation of the human proteinase inhibitors alpha-­‐1-­‐
antitrypsin and alpha-­‐2-­‐macroglobulin by Bacteroides gingivalis. Infection and immunity, 1984. 43(2): p. 644-­‐8. Nilsson, T., J. Carlsson, and G. Sundqvist, Inactivation of key factors of the plasma proteinase cascade systems by Bacteroides gingivalis. Infection and immunity, 1985. 50(2): p. 467-­‐71. Sandholm, L., Proteases and their inhibitors in chronic inflammatory periodontal disease. Journal of clinical periodontology, 1986. 13(1): p. 19-­‐26. Pollanen, M.T., J.I. Salonen, and V.J. Uitto, Structure and function of the tooth-­‐
epithelial interface in health and disease. Periodontology 2000, 2003. 31: p. 12-­‐31. 93
50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. Birkedal-­‐Hansen, H., Role of matrix metalloproteinases in human periodontal diseases. Journal of periodontology, 1993. 64(5 Suppl): p. 474-­‐84. Birkedal-­‐Hansen, H., et al., Matrix metalloproteinases: a review. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists, 1993. 4(2): p. 197-­‐250. Michaelis, J., M.C. Vissers, and C.C. Winterbourn, Human neutrophil collagenase cleaves alpha 1-­‐antitrypsin. The Biochemical journal, 1990. 270(3): p. 809-­‐14. Knauper, V., H. Reinke, and H. Tschesche, Inactivation of human plasma alpha 1-­‐proteinase inhibitor by human PMN leucocyte collagenase. FEBS letters, 1990. 263(2): p. 355-­‐7. Sorsa, T., et al., Doxycycline in the protection of serum alpha-­‐1-­‐antitrypsin from human neutrophil collagenase and gelatinase. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1993. 37(3): p. 592-­‐4. Sorsa, T., L. Tjaderhane, and T. Salo, Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral diseases, 2004. 10(6): p. 311-­‐8. Folgueras, A.R., et al., Matrix metalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies. The International journal of developmental biology, 2004. 48(5-­‐6): p. 411-­‐24. Verma, R.P. and C. Hansch, Matrix metalloproteinases (MMPs): chemical-­‐
biological functions and (Q)SARs. Bioorganic & medicinal chemistry, 2007. 15(6): p. 2223-­‐68. Ryan, M.E. and L.M. Golub, Modulation of matrix metalloproteinase activities in periodontitis as a treatment strategy. Periodontology 2000, 2000. 24: p. 226-­‐38. Whittaker, M., et al., Design and therapeutic application of matrix metalloproteinase inhibitors. Chemical reviews, 1999. 99(9): p. 2735-­‐76. Overall, C.M. and C. Lopez-­‐Otin, Strategies for MMP inhibition in cancer: innovations for the post-­‐trial era. Nature reviews. Cancer, 2002. 2(9): p. 657-­‐
72. Sakai, A., et al., Profiling the cytokines in gingival crevicular fluid using a cytokine antibody array. Journal of periodontology, 2006. 77(5): p. 856-­‐64. Murphy, G. and H. Nagase, Progress in matrix metalloproteinase research. Molecular aspects of medicine, 2008. 29(5): p. 290-­‐308. Visse, R. and H. Nagase, Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation research, 2003. 92(8): p. 827-­‐39. Roy, R., J. Yang, and M.A. Moses, Matrix metalloproteinases as novel biomarkers and potential therapeutic targets in human cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2009. 27(31): p. 5287-­‐97. Klein, T. and R. Bischoff, Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases. Amino acids, 2011. 41(2): p. 271-­‐90. Huxley-­‐Jones, J., et al., The evolution of the vertebrate metzincins; insights from Ciona intestinalis and Danio rerio. BMC evolutionary biology, 2007. 7: p. 63. 94
67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. Leeman, M.F., S. Curran, and G.I. Murray, The structure, regulation, and function of human matrix metalloproteinase-­‐13. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 2002. 37(3): p. 149-­‐66. Chung, L., et al., Collagenase unwinds triple-­‐helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. The EMBO journal, 2004. 23(15): p. 3020-­‐30. Choi, D.H., et al., Effects of sub-­‐antimicrobial dose doxycycline therapy on crevicular fluid MMP-­‐8, and gingival tissue MMP-­‐9, TIMP-­‐1 and IL-­‐6 levels in chronic periodontitis. Journal of periodontal research, 2004. 39(1): p. 20-­‐6. Nagase, H., R. Visse, and G. Murphy, Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular research, 2006. 69(3): p. 562-­‐
73. Barmina, O.Y., et al., Collagenase-­‐3 binds to a specific receptor and requires the low density lipoprotein receptor-­‐related protein for internalization. The Journal of biological chemistry, 1999. 274(42): p. 30087-­‐93. Deryugina, E.I., et al., MT1-­‐MMP initiates activation of pro-­‐MMP-­‐2 and integrin alphavbeta3 promotes maturation of MMP-­‐2 in breast carcinoma cells. Experimental cell research, 2001. 263(2): p. 209-­‐23. Nguyen, M., J. Arkell, and C.J. Jackson, Activated protein C directly activates human endothelial gelatinase A. The Journal of biological chemistry, 2000. 275(13): p. 9095-­‐8. Lafleur, M.A., M.M. Handsley, and D.R. Edwards, Metalloproteinases and their inhibitors in angiogenesis. Expert reviews in molecular medicine, 2003. 5(23): p. 1-­‐39. Aimes, R.T. and J.P. Quigley, Matrix metalloproteinase-­‐2 is an interstitial collagenase. Inhibitor-­‐free enzyme catalyzes the cleavage of collagen fibrils and soluble native type I collagen generating the specific 3/4-­‐ and 1/4-­‐length fragments. The Journal of biological chemistry, 1995. 270(11): p. 5872-­‐6. Patterson, M.L., et al., Specific collagenolysis by gelatinase A, MMP-­‐2, is determined by the hemopexin domain and not the fibronectin-­‐like domain. FEBS letters, 2001. 503(2-­‐3): p. 158-­‐62. Murphy, G., et al., Purification and characterization of a bone metalloproteinase that degrades gelatin and types IV and V collagen. Biochimica et biophysica acta, 1985. 831(1): p. 49-­‐58. Chakrabarti, S. and K.D. Patel, Matrix metalloproteinase-­‐2 (MMP-­‐2) and MMP-­‐
9 in pulmonary pathology. Experimental lung research, 2005. 31(6): p. 599-­‐
621. McQuibban, G.A., et al., Inflammation dampened by gelatinase A cleavage of monocyte chemoattractant protein-­‐3. Science, 2000. 289(5482): p. 1202-­‐6. Mattu, T.S., et al., O-­‐glycan analysis of natural human neutrophil gelatinase B using a combination of normal phase-­‐HPLC and online tandem mass spectrometry: implications for the domain organization of the enzyme. Biochemistry, 2000. 39(51): p. 15695-­‐704. Devarajan, P., et al., Structure and expression of neutrophil gelatinase cDNA. Identity with type IV collagenase from HT1080 cells. The Journal of biological chemistry, 1992. 267(35): p. 25228-­‐32. 95
82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. Opdenakker, G., et al., Cytokine-­‐mediated regulation of human leukocyte gelatinases and role in arthritis. Lymphokine and cytokine research, 1991. 10(4): p. 317-­‐24. Amalinei, C., et al., Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions. Romanian journal of morphology and embryology = Revue roumaine de morphologie et embryologie, 2010. 51(2): p. 215-­‐28. Murphy, G. and H. Nagase, Localizing matrix metalloproteinase activities in the pericellular environment. The FEBS journal, 2011. 278(1): p. 2-­‐15. Gialeli, C., A.D. Theocharis, and N.K. Karamanos, Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. The FEBS journal, 2011. 278(1): p. 16-­‐27. Hadler-­‐Olsen, E., et al., Regulation of matrix metalloproteinase activity in health and disease. The FEBS journal, 2011. 278(1): p. 28-­‐45. Kerkela, E. and U. Saarialho-­‐Kere, Matrix metalloproteinases in tumor progression: focus on basal and squamous cell skin cancer. Experimental dermatology, 2003. 12(2): p. 109-­‐25. Chernov, A.V., et al., Epigenetic control of the invasion-­‐promoting MT1-­‐
MMP/MMP-­‐2/TIMP-­‐2 axis in cancer cells. The Journal of biological chemistry, 2009. 284(19): p. 12727-­‐34. Nagase, H., Activation mechanisms of matrix metalloproteinases. Biological chemistry, 1997. 378(3-­‐4): p. 151-­‐60. Kennedy, A.M., et al., MMP13 mutation causes spondyloepimetaphyseal dysplasia, Missouri type (SEMD(MO). The Journal of clinical investigation, 2005. 115(10): p. 2832-­‐42. Gomez, D.E., et al., Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. European journal of cell biology, 1997. 74(2): p. 111-­‐22. Starckx, S., et al., A novel rationale for inhibition of gelatinase B in multiple sclerosis: MMP-­‐9 destroys alpha B-­‐crystallin and generates a promiscuous T cell epitope. Journal of neuroimmunology, 2003. 141(1-­‐2): p. 47-­‐57. Descamps, F.J., et al., Gelatinase B/matrix metalloproteinase-­‐9 provokes cataract by cleaving lens betaB1 crystallin. The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2005. 19(1): p. 29-­‐35. Lijnen, H.R., Plasmin and matrix metalloproteinases in vascular remodeling. Thrombosis and haemostasis, 2001. 86(1): p. 324-­‐33. Barrett, A.J. and P.M. Starkey, The interaction of alpha 2-­‐macroglobulin with proteinases. Characteristics and specificity of the reaction, and a hypothesis concerning its molecular mechanism. The Biochemical journal, 1973. 133(4): p. 709-­‐24. Strickland, D.K., et al., Sequence identity between the alpha 2-­‐macroglobulin receptor and low density lipoprotein receptor-­‐related protein suggests that this molecule is a multifunctional receptor. The Journal of biological chemistry, 1990. 265(29): p. 17401-­‐4. 96
97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. Murphy, G., et al., Matrix metalloproteinases in arthritic disease. Arthritis research, 2002. 4 Suppl 3: p. S39-­‐49. Fernandez-­‐Catalan, C., et al., Crystal structure of the complex formed by the membrane type 1-­‐matrix metalloproteinase with the tissue inhibitor of metalloproteinases-­‐2, the soluble progelatinase A receptor. The EMBO journal, 1998. 17(17): p. 5238-­‐48. Stetler-­‐Stevenson, W.G., Tissue inhibitors of metalloproteinases in cell signaling: metalloproteinase-­‐independent biological activities. Science signaling, 2008. 1(27): p. re6. Mansell, J.P., J.F. Tarlton, and A.J. Bailey, Expression of gelatinases within the trabecular bone compartment of ovariectomized and parathyroidectomized adult female rats. Bone, 1997. 20(6): p. 533-­‐8. Greenwald, R.A., et al., In vitro sensitivity of the three mammalian collagenases to tetracycline inhibition: relationship to bone and cartilage degradation. Bone, 1998. 22(1): p. 33-­‐8. Ilgenli, T., et al., Gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase-­‐13 levels and molecular forms in various types of periodontal diseases. Oral diseases, 2006. 12(6): p. 573-­‐9. Kiili, M., et al., Collagenase-­‐2 (MMP-­‐8) and collagenase-­‐3 (MMP-­‐13) in adult periodontitis: molecular forms and levels in gingival crevicular fluid and immunolocalisation in gingival tissue. Journal of clinical periodontology, 2002. 29(3): p. 224-­‐32. Hernandez, M., et al., Matrix metalloproteinase-­‐13 is highly expressed in destructive periodontal disease activity. Journal of periodontology, 2006. 77(11): p. 1863-­‐70. Hernandez, M., et al., MMP-­‐13 and TIMP-­‐1 determinations in progressive chronic periodontitis. Journal of clinical periodontology, 2007. 34(9): p. 729-­‐
35. Ejeil, A.L., et al., Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in healthy and diseased human gingiva. Journal of periodontology, 2003. 74(2): p. 188-­‐95. Hernandez Rios, M., et al., Proteolytic roles of matrix metalloproteinase (MMP)-­‐13 during progression of chronic periodontitis: initial evidence for MMP-­‐13/MMP-­‐9 activation cascade. Journal of clinical periodontology, 2009. 36(12): p. 1011-­‐7. Holliday, L.S., et al., Initiation of osteoclast bone resorption by interstitial collagenase. The Journal of biological chemistry, 1997. 272(35): p. 22053-­‐8. Wahlgren, J., et al., Expression and induction of collagenases (MMP-­‐8 and -­‐13) in plasma cells associated with bone-­‐destructive lesions. The Journal of pathology, 2001. 194(2): p. 217-­‐24. Shin, S.J., et al., Tissue levels of matrix metalloproteinases in pulps and periapical lesions. Journal of endodontics, 2002. 28(4): p. 313-­‐5. Leonardi, R., R. Caltabiano, and C. Loreto, Collagenase-­‐3 (MMP-­‐13) is expressed in periapical lesions: an immunohistochemical study. International endodontic journal, 2005. 38(5): p. 297-­‐301. 97
112. Carneiro, E., et al., Expression analysis of matrix metalloproteinase-­‐9 in epithelialized and nonepithelialized apical periodontitis lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2009. 107(1): p. 127-­‐32. 113. Belmar, M.J., et al., Gelatinolytic activity in gingival crevicular fluid from teeth with periapical lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2008. 105(6): p. 801-­‐6. 114. Buzoglu, H.D., et al., The zymographic evaluation of gelatinase (MMP-­‐2 and -­‐9) levels in acute and chronic periapical abscesses. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2009. 108(5): p. e121-­‐6. 115. Paula-­‐Silva, F.W., L.A. da Silva, and Y.L. Kapila, Matrix metalloproteinase expression in teeth with apical periodontitis is differentially modulated by the modality of root canal treatment. Journal of endodontics, 2010. 36(2): p. 231-­‐
7. 116. Dezerega, A., et al., Pro-­‐oxidant Status and Matrix Metalloproteinases in Apical Lesions and Gingival Crevicular Fluid as Potential Biomarkers for Asymptomatic Apical Periodontitis and endodontic treatment response. Journal of inflammation, 2012. 9(1): p. 8. 117. Corotti, M.V., et al., Immunolocalization of matrix metalloproteinases-­‐2 and -­‐9 during apical periodontitis development. Archives of oral biology, 2009. 54(8): p. 764-­‐71. 118. Burgener, B., et al., Biologic markers for odontogenic periradicular periodontitis. Journal of endodontics, 2010. 36(8): p. 1307-­‐10. 119. de Paula-­‐Silva, F.W., et al., High matrix metalloproteinase activity is a hallmark of periapical granulomas. Journal of endodontics, 2009. 35(9): p. 1234-­‐42. 120. Mundi, V., Expresión de Metaloproteinasas de Matriz Extracelular (MMPs) -­‐2, -­‐
13 y -­‐14 en dientes con Periodontitis Apical Crónica y Tejido Periapical Sano, in Departamento de Odontología Conservadora2009, Universidad de Chile: Santiago. p. 54. 121. González, P.A., Expresión de Metaloproteinasas de Matriz Extracelular-­‐13 (MMP-­‐13) en dientes con Periodontitis Apical Asintomática, in Departamento de Odontología Conservadora y Patología2010, Universidad de Chile: Santiago. p. 35. 122. Nishikawa, M., et al., Effects of TNFalpha and prostaglandin E2 on the expression of MMPs in human periodontal ligament fibroblasts. Journal of periodontal research, 2002. 37(3): p. 167-­‐76. 123. Chen, H.Y., S.W. Cox, and B.M. Eley, Cathepsin B, alpha2-­‐macroglobulin and cystatin levels in gingival crevicular fluid from chronic periodontitis patients. Journal of clinical periodontology, 1998. 25(1): p. 34-­‐41. 124. Knofler, G., et al., Gingival crevicular fluid levels of aspartate aminotransferase and alpha2-­‐macroglobulin before and after topical application of metronidazole or scaling and root planing. Quintessence international, 2008. 39(5): p. 381-­‐9. 98
125. Condacci, I., G. Cimasoni, and C. Ahmad-­‐Zadeh, Alpha 2-­‐macroglobulin in sulci from healthy and inflamed human gingivae. Infection and immunity, 1982. 36(1): p. 66-­‐71. 126. Junker, A., Analyse von alpha2-­‐makroglobulin (α2-­‐M) in gesunder gingiva und bei parodontitis. Dtsch Zahnarzti Z, 2000. 127. Birkenmeier, G., Targeting the proteinase inhibitor and immune modulatory function of human α2-­‐macroglobulin. Mod. Asp. Immunobiol., 2001. 2(1): p. 5. 128. Binder, R.J., D.K. Han, and P.K. Srivastava, CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nature immunology, 2000. 1(2): p. 151-­‐5. 129. Marcaccini, A.M., et al., Gingival crevicular fluid levels of MMP-­‐8, MMP-­‐9, TIMP-­‐
2, and MPO decrease after periodontal therapy. Journal of clinical periodontology, 2010. 37(2): p. 180-­‐90. 130. Golub, L.M., et al., A matrix metalloproteinase inhibitor reduces bone-­‐type collagen degradation fragments and specific collagenases in gingival crevicular fluid during adult periodontitis. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society ... [et al.], 1997. 46(8): p. 310-­‐9. 131. Brenchley, R., et al., The TriTryp phosphatome: analysis of the protein phosphatase catalytic domains. BMC genomics, 2007. 8: p. 434. 132. Nair, P.N., Pathogenesis of apical periodontitis and the causes of endodontic failures. Crit Rev Oral Biol Med, 2004. 15(6): p. 348-­‐81. 133. Hill, P.A., et al., The effects of selective inhibitors of matrix metalloproteinases (MMPs) on bone resorption and the identification of MMPs and TIMP-­‐1 in isolated osteoclasts. J Cell Sci, 1994. 107 ( Pt 11): p. 3055-­‐64. 134. Hill, P.A., et al., Inhibition of bone resorption in vitro by selective inhibitors of gelatinase and collagenase. Biochem J, 1995. 308 ( Pt 1): p. 167-­‐75. 135. Golub, L.M., et al., Tetracyclines inhibit connective tissue breakdown by multiple non-­‐antimicrobial mechanisms. Advances in dental research, 1998. 12(2): p. 12-­‐26. 136. Radics, T., et al., Interleukin-­‐6 and granulocyte-­‐macrophage colony-­‐stimulating factor in apical periodontitis: correlation with clinical and histologic findings of the involved teeth. Oral microbiology and immunology, 2003. 18(1): p. 9-­‐13. 137. Shimauchi, H., et al., Development of a quantitative sampling method for periapical exudates from human root canals. Journal of endodontics, 1996. 22(11): p. 612-­‐5. 138. McCauley, L.K. and R.M. Nohutcu, Mediators of periodontal osseous destruction and remodeling: principles and implications for diagnosis and therapy. Journal of periodontology, 2002. 73(11): p. 1377-­‐91. 139. Pozo, P., et al., Longitudinal analysis of metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and clinical parameters in gingival crevicular fluid from periodontitis-­‐affected patients. Journal of periodontal research, 2005. 40(3): p. 199-­‐207. 140. Beklen, A., et al., Gingival tissue and crevicular fluid co-­‐operation in adult periodontitis. Journal of dental research, 2006. 85(1): p. 59-­‐63. 141. Bildt, M.M., et al., Collagenolytic fragments and active gelatinase complexes in periodontitis. Journal of periodontology, 2008. 79(9): p. 1704-­‐11. 99
142. Soell, M., R. Elkaim, and H. Tenenbaum, Cathepsin C, matrix metalloproteinases, and their tissue inhibitors in gingiva and gingival crevicular fluid from periodontitis-­‐affected patients. Journal of dental research, 2002. 81(3): p. 174-­‐8. 143. Sorsa, T., et al., Effects of tetracyclines on neutrophil, gingival, and salivary collagenases. A functional and western-­‐blot assessment with special reference to their cellular sources in periodontal diseases. Annals of the New York Academy of Sciences, 1994. 732: p. 112-­‐31. 144. Ingman, T., et al., Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gingival crevicular fluid and saliva of periodontitis patients. Journal of clinical periodontology, 1996. 23(12): p. 1127-­‐32. 145. Soder, B., et al., Levels of matrix metalloproteinases-­‐8 and -­‐9 with simultaneous presence of periodontal pathogens in gingival crevicular fluid as well as matrix metalloproteinase-­‐9 and cholesterol in blood. Journal of periodontal research, 2006. 41(5): p. 411-­‐7. 146. Grayson, R., et al., Activation of human matrix metalloproteinase 2 by gingival crevicular fluid and Porphyromonas gingivalis. Journal of clinical periodontology, 2003. 30(6): p. 542-­‐50. 147. Goncalves, L.D., et al., Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in inflamed gingival biopsies. Journal of periodontal research, 2008. 43(5): p. 570-­‐7. 148. Biyikoglu, B., et al., Gingival crevicular fluid MMP-­‐8 and -­‐13 and TIMP-­‐1 levels in patients with rheumatoid arthritis and inflammatory periodontal disease. Journal of periodontology, 2009. 80(8): p. 1307-­‐14. 149. Tuter, G., et al., Effects of scaling and root planing and subantimicrobial dose doxycycline on gingival crevicular fluid levels of matrix metalloproteinase-­‐8, -­‐
13 and serum levels of HsCRP in patients with chronic periodontitis. Journal of periodontology, 2010. 81(8): p. 1132-­‐9. 150. Minczykowski, A., et al., Hydrogen peroxide and superoxide anion production by polymorphonuclear neutrophils in patients with chronic periapical granuloma, before and after surgical treatment. Clinical oral investigations, 2001. 5(1): p. 6-­‐10. 151. Figueredo, C.M., et al., Increased interleukin-­‐1beta concentration in gingival crevicular fluid as a characteristic of periodontitis. Journal of periodontology, 1999. 70(12): p. 1457-­‐63. 152. Sottrup-­‐Jensen, L., Alpha-­‐macroglobulins: structure, shape, and mechanism of proteinase complex formation. The Journal of biological chemistry, 1989. 264(20): p. 11539-­‐42. 153. Birkenmeier, G. and T. Stigbrand, Production of conformation-­‐specific monoclonal antibodies against alpha 2 macroglobulin and their use for quantitation of total and transformed alpha 2 macroglobulin in human blood. Journal of immunological methods, 1993. 162(1): p. 59-­‐67. 154. Gustafsson, A., B. Asman, and K. Bergstrom, Altered relation between granulocyte elastase and alpha-­‐2-­‐macroglobulin in gingival crevicular fluid 100
155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167. 168. 169. from sites with periodontal destruction. Journal of clinical periodontology, 1994. 21(1): p. 17-­‐21. Lamster, I.B., R.L. Oshrain, and J.M. Gordon, Enzyme activity in human gingival crevicular fluid: considerations in data reporting based on analysis of individual crevicular sites. Journal of clinical periodontology, 1986. 13(8): p. 799-­‐804. Hanioka, T., et al., Relationship of the substance P to indicators of host response in human gingival crevicular fluid. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(4): p. 262-­‐6. Biyikoglu, B., et al., Evaluation of t-­‐PA, PAI-­‐2, IL-­‐1beta and PGE(2) in gingival crevicular fluid of rheumatoid arthritis patients with periodontal disease. Journal of clinical periodontology, 2006. 33(9): p. 605-­‐11. Puente, X.S., et al., Human and mouse proteases: a comparative genomic approach. Nature reviews. Genetics, 2003. 4(7): p. 544-­‐58. Yu, X., P. Collin-­‐Osdoby, and P. Osdoby, SDF-­‐1 increases recruitment of osteoclast precursors by upregulation of matrix metalloproteinase-­‐9 activity. Connective tissue research, 2003. 44 Suppl 1: p. 79-­‐84. Lemjabbar, H., et al., Contribution of 92 kDa gelatinase/type IV collagenase in bronchial inflammation during status asthmaticus. American journal of respiratory and critical care medicine, 1999. 159(4 Pt 1): p. 1298-­‐307. Nguyen, M., J. Arkell, and C.J. Jackson, Human endothelial gelatinases and angiogenesis. The international journal of biochemistry & cell biology, 2001. 33(10): p. 960-­‐70. Bergers, G., et al., Matrix metalloproteinase-­‐9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nature cell biology, 2000. 2(10): p. 737-­‐44. Matsuo, T., et al., Interleukin-­‐1 alpha and interleukin-­‐1 beta periapical exudates of infected root canals: correlations with the clinical findings of the involved teeth. Journal of endodontics, 1994. 20(9): p. 432-­‐5. Lim, G.C., et al., Interleukin 1-­‐beta in symptomatic and asymptomatic human periradicular lesions. Journal of endodontics, 1994. 20(5): p. 225-­‐7. Danin, J., et al., Tumor necrosis factor-­‐alpha and transforming growth factor-­‐
beta1 in chronic periapical lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2000. 90(4): p. 514-­‐7. Chang, Y.C., S.F. Yang, and Y.S. Hsieh, Regulation of matrix metalloproteinase-­‐2 production by cytokines and pharmacological agents in human pulp cell cultures. Journal of endodontics, 2001. 27(11): p. 679-­‐82. Palosaari, H., et al., Expression profile of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of MMPs in mature human odontoblasts and pulp tissue. European journal of oral sciences, 2003. 111(2): p. 117-­‐27. Templeton, N.S. and W.G. Stetler-­‐Stevenson, Identification of a basal promoter for the human Mr 72,000 type IV collagenase gene and enhanced expression in a highly metastatic cell line. Cancer research, 1991. 51(22): p. 6190-­‐3. Qin, H., Y. Sun, and E.N. Benveniste, The transcription factors Sp1, Sp3, and AP-­‐
2 are required for constitutive matrix metalloproteinase-­‐2 gene expression in 101
170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. astroglioma cells. The Journal of biological chemistry, 1999. 274(41): p. 29130-­‐7. Chakraborti, S., et al., Regulation of matrix metalloproteinases: an overview. Molecular and cellular biochemistry, 2003. 253(1-­‐2): p. 269-­‐85. Esparza, J., et al., MMP-­‐2 null mice exhibit an early onset and severe experimental autoimmune encephalomyelitis due to an increase in MMP-­‐9 expression and activity. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2004. 18(14): p. 1682-­‐91. Bai, X.C., et al., Reactive oxygen species stimulates receptor activator of NF-­‐
kappaB ligand expression in osteoblast. The Journal of biological chemistry, 2005. 280(17): p. 17497-­‐506. Gusman, H., R.B. Santana, and M. Zehnder, Matrix metalloproteinase levels and gelatinolytic activity in clinically healthy and inflamed human dental pulps. European journal of oral sciences, 2002. 110(5): p. 353-­‐7. Sorsa, T., et al., MMP activation in diagnostics of periodontitis and systemic inflammation. Journal of clinical periodontology, 2011. 38(9): p. 817-­‐9. Leonardi, R., et al., Immunolocalization of CD44 adhesion molecules in human periradicular lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2000. 89(4): p. 480-­‐5. Uitto, V.J., et al., Collagenase-­‐3 (matrix metalloproteinase-­‐13) expression is induced in oral mucosal epithelium during chronic inflammation. The American journal of pathology, 1998. 152(6): p. 1489-­‐99. Isaza-­‐Guzman, D.M., et al., Salivary levels of matrix metalloproteinase (MMP)-­‐9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)-­‐1: a pilot study about the relationship with periodontal status and MMP-­‐9(-­‐1562C/T) gene promoter polymorphism. Archives of oral biology, 2011. 56(4): p. 401-­‐11. Bergstrom, J., J. Babcan, and S. Eliasson, Tobacco smoking and dental periapical condition. European journal of oral sciences, 2004. 112(2): p. 115-­‐
20. Bergstrom, J., S. Eliasson, and J. Dock, Exposure to tobacco smoking and periodontal health. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(1): p. 61-­‐8. Bergstrom, J., S. Eliasson, and J. Dock, A 10-­‐year prospective study of tobacco smoking and periodontal health. Journal of periodontology, 2000. 71(8): p. 1338-­‐47. Feldman, R.S., J.E. Alman, and H.H. Chauncey, Periodontal disease indexes and tobacco smoking in healthy aging men. Gerodontics, 1987. 3(1): p. 43-­‐6. Krall, E.A., A.J. Garvey, and R.I. Garcia, Alveolar bone loss and tooth loss in male cigar and pipe smokers. Journal of the American Dental Association, 1999. 130(1): p. 57-­‐64. Machtei, E.E., et al., Longitudinal study of prognostic factors in established periodontitis patients. Journal of clinical periodontology, 1997. 24(2): p. 102-­‐
9. Norderyd, O., A. Hugoson, and G. Grusovin, Risk of severe periodontal disease in a Swedish adult population. A longitudinal study. Journal of clinical periodontology, 1999. 26(9): p. 608-­‐15. 102
185. Payne, J.B., et al., The association of cigarette smoking with alveolar bone loss in postmenopausal females. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(9): p. 658-­‐64. 186. Listgarten, M.A., et al., Periodontal tissues and their counterparts around endosseous implants [corrected and republished with original paging, article orginally printed in Clin Oral Implants Res 1991 Jan-­‐Mar;2(1):1-­‐19]. Clinical oral implants research, 1991. 2(3): p. 1-­‐19. 187. Kawashima, N., et al., Kinetics of RANKL, RANK and OPG expressions in experimentally induced rat periapical lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2007. 103(5): p. 707-­‐11. 188. Salo, T., et al., Transforming growth factor-­‐beta 1 up-­‐regulates type IV collagenase expression in cultured human keratinocytes. The Journal of biological chemistry, 1991. 266(18): p. 11436-­‐41. 189. Kuula, H., et al., Local and systemic responses in matrix metalloproteinase 8-­‐
deficient mice during Porphyromonas gingivalis-­‐induced periodontitis. Infection and immunity, 2009. 77(2): p. 850-­‐9. 190. Tjaderhane, L., et al., The effect of chemical inhibition of matrix metalloproteinases on the size of experimentally induced apical periodontitis. International endodontic journal, 2007. 40(4): p. 282-­‐9. 103
ANEXOS Y APÉNDICE
1. Anexo 1: Formulario de Consentimiento Informado
104
2. Anexo 2: Ficha clínica
105