2 AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer en primer lugar a mis
AGRADECIMIENTOS Quisiera agradecer en primer lugar a mis profesores guías, Prof. Dra. Marcela Hernández, Prof. Dra. Andrea Dezerega y Prof. Dr. Jorge Gamonal, por su paciencia, apoyo y amistad durante el desarrollo de este trabajo, y también del Programa de Magister, sin su ejemplo de amor a la ciencia y generosidad en el aprender nada de esto hubiese sido posible. A mis evaluadores, Prof. Dr. Rolando Vernal, Prof. Dr. Sergio Acosta y Prof. Irene Morales, por sus valiosos aportes y tiempo dedicado a mi trabajo. Quisiera también agradecer a todas las personas que trabajan en el Laboratorio de Biología Periodontal, especialmente a Leslie Henríquez y Jocelyn García, por toda la ayuda que me brindaron. A mis compañeros de Magíster, en especial a Constanza Osorio y Franco Cavalla, por siempre tener una palabra de aliento y un aporte en el desarrollo de esta tesis. Al Departamento de Cirugía, que permitieron la toma de muestras durante el desarrollo de su cátedra, por la paciencia de todos esos alumnos y pacientes que colaboraron en la recolección de muestras. Y finalmente, y no menos importante, a mis amigos y familiares que me ayudaron de alguna manera durante estos años de estudio de postgrado. 2 ÍNDICE AGRADECIMIENTOS 2 ÍNDICE 3 ABREVIACIONES 5 REACTIVOS 8 INTRODUCCIÓN 9 RESUMEN 10 ASPECTOS TEÓRICOS 1. Periodontitis Apical Crónica 2. Fluido Gingival Crevicular 3. Metaloproteinasas de Matriz Extracelular (MMPs) 3.1. Generalidades 3.2. Características Estructurales 3.3. Clasificación 3.4. Regulación de la actividad de MMPs 4. MMPs y PAC 13 13 16 19 19 20 20 27 31 HIPÓTESIS 38 OBJETIVO GENERAL 38 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 38 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Selección de Pacientes 2. Obtención de las muestras 2.1. FGC y elución 2.2. LPAs y homogeneización de tejido lesional 3. Determinación de la concentración de proteínas totales (CPT) 4. Zimografía en gelatina 5. Ensayo fluorescente de actividad de la MMP-‐13 6. ELISA 7. “Immunowestern blot” 8. Análisis estadístico 40 40 41 41 42 43 43 44 45 45 46 RESULTADOS 47 1. Características generales de los pacientes 47 2. Concentración de proteínas totales en FGC proveniente de dientes con PAC y sanos 48 3. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -‐2, -‐9 y -‐13, y niveles de α2-‐ macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos 49 3.1. Formas enzimáticas de las MMPs -‐9, -‐2 y -‐13 en FGC de dientes con PAC y sanos 49 3.2. Niveles totales y actividad de MMPs -‐2 y -‐9 en FGC de dientes con PAC y FGC sano 50 3 3.3. Actividad basal y total de MMP-‐13 en FGC de dientes con PAC y sanos 56 3.4. Niveles de α2-‐ macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos 57 4. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -‐2, -‐9 y -‐13 en tejido correspondiente a LPAs y ligamento periodontal sano. 58 4.1. Formas enzimáticas de las MMPs -‐2, -‐9 y -‐13 en tejido correspondiente a LPAs y LS 58 4.2. Niveles totales y actividad de MMPs -‐2 y -‐9 en tejido correspondiente a LPAs y LS 60 4.3. Actividad basal y total de MMP-‐13 en tejido correspondiente a LPAs y LS 64 5. Asociación de la presencia, niveles y actividad de los mediadores de interés entre muestras de tejido lesional y FGC de los dientes correspondientes. 65 6. Asociación de la presencia y niveles de estos mediadores con antecedentes generales (edad, género) y características clínicas (tabaquismo y diámetro promedio de la lesión) de los sujetos de estudio. 65 6.1. Edad 66 6.2. Género 66 6.3. Tabaquismo 67 6.4. Tamaño de la lesión 69 DISCUSIÓN 71 CONCLUSIONES 88 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 91 ANEXOS Y APÉNDICE 1. Anexo 1: Formulario de Consentimiento Informado 2. Anexo 2: Ficha clínica 104 104 105 4 ABREVIACIONES PAC periodontitis apical crónica PAa periodontitis apical asintomática GPA granuloma periapical QRI quiste radicular inflamatorio LPAs lesiones periapicales PMNs polimorfonucleares neutrófilos MEC matriz extracelular RANK-L ligando del receptor activador del factor Nuclear κB IL interleuquina TNF factor de necrosis tumoral MMPs metaloproteinasas de matriz extracelular IFN interferón GM-CSF factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos G-CSF factor estimulador de colonias granulocitos M-CSF factor estimulador de colonias de macrófagos TGF factor de crecimiento transformante PGs prostaglandinas LTs leucotrienos FGC Fluido Gingival Crevicular α-PI inhibidor de proteinasa α-1 ADAMS metaloproteinasas y disintegrina ADAMTs ADAMs con un motivo trompospondina 5 GFR receptores de factores de crecimiento MT-MMPs MMP transmembrana SDF factor derivado de células estromales MCP proteína quimiotáctica de monocitos α2M α2-macroglobulina PAI inhibidor del activador del plasminógeno IGF factores de crecimiento similares a insulina PDGF factor de crecimiento derivado de plaquetas bFGF factor básico de crecimiento de fibroblastos TIMP inhibidor tisular de metaloproteinasas IGFP proteína de crecimiento transportadora EGF factor de crecimiento epidermal BFGF factor de crecimiento derivado de cerebro APMA acetato 4-aminofenilmercurico SDS dodecil sulfato sódico LRP1 receptor de lipoproteína de baja densidad tipo 1 A2MR receptor α2-macroglobulina PCP proteinasa C-terminal de procolágeno TFPI inhibidor de la vía del factor tisular RECK proteína rica en cisteína con motivos kazal ICTP telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I qPCR PCR en tiempo real LS ligamento sano CPT concentración de proteínas total BSA albúmina sérica de bovino 6 PF producto fluorescente mg milígramo pg picogramo mL mililitro µg microgramo ua unidades arbitrarias kDa kilodalton 7 REACTIVOS Anticuerpos Monoclonal antihumano MMP-2, R&D Systems, Minneapolis, USA Monoclonal antihumano MMP-9, R&D Systems, Minneapolis, USA Monoclonal antihumano MMP-13, R&D Systems, Minneapolis, USA Secundario anti ratón conjugado con peroxidasa, Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, USA Kits Fluorokine E, R&D Systems, Minneapolis, USA ELISA α2-macroglobulina, Immundiagnostik, Bensheim, Alemania Sustrato quimioluminiscente, Femto, Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford, USA Ácido bicinconínico, BCA, Pierce Biotechnology, Rockford, USA Otros Tiras de papel absorbente, PeriopaperTM, ProFlow, Amityville, New York, USA Cocktail inhibidor de proteasas libre de EDTA, Roche Diagnostics GmbH, Basel, Suiza Películas radioautográficas Thermo Scientific CL-XPosure Film, Pierce Biotechnology, USA 8 INTRODUCCIÓN La Periodontitis Apical Crónica (PAC) corresponde a la inflamación y destrucción de los tejidos perirradiculares causada por la infección bacteriana de la pulpa dental. El sello de esta patología es la presencia de una lesión apical (LPA), que resulta de la destrucción de los tejidos apicales duros y blandos. Una diversidad de mediadores inflamatorios han sido descritos como participantes en la patogenia de esta enfermedad. Algunos de ellos han sido estudiados a partir de exudado periapical, biopsias y, de manera más reciente, fluido gingival crevicular (FGC). Entre los mediadores estudiados, se ha descrito la participación de un grupo de enzimas genéticamente distintas pero estructuralmente similares llamadas metaloproteinasas de matriz extracelular (MMPs). Éstas son capaces de degradar todos los componentes de la matriz extracelular (MEC). Entre ellas, las colagenasas y gelatinasas tienen un rol preponderante, al participar directamente en la degradación del colágeno, uno de los principales componentes de los tejidos periodontales. A la fecha no han sido caracterizados los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y -13, y de α2M en el FGC de dientes con PAC y de dientes sanos, en LPAs y LS. 9 RESUMEN La PAC corresponde a la inflamación y destrucción de los tejidos perirradiculares causada por la infección bacteriana de la pulpa dental, que genera una activación de la respuesta inmune. Esta respuesta del hospedero involucra una serie de elementos celulares y mediadores moleculares, entre ellos, las MMPs, enzimas estructuralmente relacionadas, pero genéticamente distintas que degradan componentes de la MEC. Éstos mediadores y sus inhibidores, como α2-macroglobulina (α2m) y TIMPs, han sido estudiados a partir de biopsias de LPAs, exudado periapical y FGC. Éste último presenta ventajas sobre estos métodos tradicionalmente utilizados. Por ende, se plantea que existe un aumento en los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y -13, y niveles reducidos de α2m en dientes con PAC en comparación con controles sin patología periapical, cambios que se ven reflejados en el FGC. El objetivo de este estudio es caracterizar los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y -13, y de α2m en el FGC de dientes con PAC y de dientes sanos, en LPAs y ligamento periodontal sano (LS). Materiales y Métodos: Se seleccionaron pacientes con diagnóstico clínico de PAC e indicación de endodoncia (n=31), a partir de los cuales se obtuvieron muestras de FGC; pacientes con diagnóstico de PAC e indicación de extracción (n=23), a partir de los cuales se obtuvieron muestras de FGC y/o de LPAs correspondientes al mismo diente, y pacientes con indicación de exodoncia de 10 premolares sanos por ortodoncia (n=27), a partir de los cuales se obtuvo LS. Se determinó la concentración de proteínas totales (CPT) en las muestras de FGC. Se midió actividad y niveles totales a todas las muestras mediante zimografía, actividad basal y total de MMP-13 mediante ensayo de actividad “Fluorokine E”, niveles de α2M en FGC mediante ELISA, formas enzimáticas en todas las muestras mediante “immunowestern blot”. Se realizó el análisis estadístico a los resultados obtenidos con el software Stata10. Resultados: Se observó una CPT similar entre muestras de FGC provenientes de dientes con PAC y sanos. Se identificaron las formas enzimáticas de las MMPs -9, -2 y -13 en FGC de dientes con PAC y sanos, y en muestras de homogeneizados, y se corroboró la correspondencia entre las bandas inmunorreactivas identificadas por “immunowestern blot” y zimografía en gelatina, identificadas como MMPs -9 y -2. No se observaron diferencias significativas entre los niveles totales, de proformas, formas activas y razón de activación de MMPs -9 y -2 en FGC mediante zimografía. En FGC de pacientes con PAC se observó correlación negativa entre la forma activa de MMP-9 y la forma activa de MMP-2 mientras que en FGC de sujetos sanos se observó correlación negativa entre la proforma y la forma activa de la MMP-2. No se observaron diferencias significativas en la actividad basal y total de MMP-13 entre FGC de dientes con PAC y sanos. Los niveles de α2m fueron similares para ambos tipos de muestras. Los niveles totales, actividad de la proforma, forma activa de MMP-9 y razón de activación de MMP-2 fueron 11 significativamente mayores en LPAs en comparación con LS, mientras que no hubo diferencias significativas entre los niveles totales, actividad de proforma y forma activa de MMP-2, razón de activación de MMP-9 y actividad basal y total de MMP-13 entre ambos tipos de muestras. No se observó correlación en la actividad tanto de las proformas como de las formas activas de las MMPs en estudio presentes en el FGC con las presentes en las LPAs. En relación a los antecedentes clínicos, se observaron correlaciones positivas entre la edad y proforma de la MMP-9 y forma activa de la MMP-2 en muestras de LS. En LPAs, no se obtuvieron diferencias significativas de los niveles de los mediadores estudiados entre los géneros mientras que, en LS, el género femenino presentó mayores niveles de la proforma de la MMP-9 y de la forma activa de la MMP-2. Los valores obtenidos para los mediadores en estudio no varían entre el grupo completo de pacientes y el grupo de no fumadores. Se obtuvo una correlación positiva entre el diámetro de las LPAs con las formas activas de MMPs -9 y -2. Conclusiones: Las MMPs -9 y -2 tendrían un rol preponderante en la patogenia de la PAC. A pesar de que en el presente trabajo la caracterización de los mediadores en estudio en FGC no ha sido capaz de reflejar los cambios que ocurren en las LPAs, futuros estudios deben considerar la influencia de esta patología en la composición y actividad proteolítica de éste. Un conocimiento más acabado de los mecanismos involucrados en la destrucción del periodonto apical contribuirán al desarrollo de métodos diagnósticos, de tratamiento y herramientas de seguimiento de uso rutinario. 12 ASPECTOS TEÓRICOS 1. Periodontitis Apical Crónica La PAC, o periodontitis apical asintomática (PAa), según la clasificación recientemente propuesta por la Asociación Americana de Endodoncia [1] , corresponde a la inflamación y destrucción de los tejidos perirradiculares causada por la infección bacteriana de la pulpa dental. Es la consecuencia más común de la caries dental no tratada y frecuentemente lleva a la pérdida dentaria. La PAC se define como la inflamación y destrucción del periodonto apical de origen pulpar asociada con un área radiolúcida periapical en ausencia de sintomatología clínica [2, 3]. La PAC se caracteriza por la formación de una lesión osteolítica perirradicular que histológicamente puede corresponder a un granuloma periapical (GPA). Este puede progresar eventualmente hacia el desarrollo de un quiste radicular inflamatorio (QRI), como resultado de la proliferación de los restos epiteliales de Malassez frente al estímulo inflamatorio crónico [4]. Se ha descrito que un porcentaje menor al 20% de las lesiones periapicales corresponden a un QRI [5]. Las LPAs se desarrollan como resultado de la activación de la respuesta inmune frente a la estimulación antigénica continua proveniente de los restos pulpares necróticos en los canales radiculares, producto de la infección bacteriana. Esta respuesta del hospedero involucra una serie de elementos celulares y mediadores moleculares. El infiltrado inflamatorio perirradicular en las 13 LPAs está constituido principalmente por macrófagos, células T y B. También lo conforman en menor medida, polimorfonucleares neutrófilos (PMNs), células plasmáticas y macrófagos [3, 6]. El GPA está formado por células inflamatorias, tejido conjuntivo, cristales de colesterol y cordones de epitelio proliferante derivados de los restos de Malassez; mientras que un QRI corresponde a una cavidad patológica, delimitada por epitelio plano pluriestratificado no queratinizado y una cápsula conjuntiva inflamada. predominantemente en El tejido pequeños extra vasos epitelial de sanguíneos, un QRI linfocitos, consiste células plasmáticas y macrófagos [7]. El GPA y QRI comparten características en común, como la mantención de un infiltrado inflamatorio crónico, usualmente asociado con una mayor tasa de degradación de la MEC y reabsorción ósea [8]. El tejido conectivo capsular está formado por densas fibras colágenas que están firmemente adheridas a la superficie radicular, por lo que la LPA puede ser removida en su totalidad al realizarse la exodoncia del diente [3]. Esta enfermedad generalmente comienza como una inflamación aguda del ligamento periodontal apical y del hueso vecino, causada por productos bacterianos que invaden los tejidos periapicales desde el canal radicular. Este proceso puede acompañarse de síntomas clínicos como dolor y molestias a la presión del diente en cuestión [3]. Luego, los agentes causales, usualmente bacterias, sus antígenos y toxinas presentes en el canal radicular, pueden sobrepasar la capacidad resolutiva de los mecanismos de defensa del organismo y la lesión progresará hacia la cronicidad. En esta etapa, la lesión, 14 dominada en la fase aguda por PMNs, pasa a estar principalmente infiltrada por macrófagos, linfocitos y células plasmáticas. Así, se crea un equilibrio entre los agentes irritantes y los mecanismos de defensa del hospedero, donde éstos últimos no son capaces de destruir ni eliminar completamente los factores patogénicos pero, al formar una barrera circunscrita, previenen efectivamente una invasión posterior [7]. Esta fase suele ser asintomática, y la lesión generada al interior del tejido óseo maxilar se evidencia radiográficamente como una zona radiolúcida [3, 7]. La respuesta inmune del hospedero involucra una serie de elementos celulares y mediadores moleculares. El infiltrado celular perirradicular en PAC está principalmente constituido por macrófagos, células T y B. También lo conforman, en menor medida, células como PMNs, células plasmáticas, y monocitos/macrófagos [3, 6]. Se han descrito diferentes mediadores moleculares presentes en PAC, como citoquinas proinflamatorias (IL-1, -6 y -8, y TNF-α, interferón [IFN] [3], factores estimuladores de colonias [factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos GM-CSF] factor estimulador de colonias granulocitos [G-CSF] y factor estimulador de colonias de macrófagos [M-CSF]), factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) [3], eicosanoides (prostaglandinas (PGs) y leucotrienos (LTs) [9], anticuerpos y moléculas efectoras enzimáticas [3]. Estas últimas participan en la destrucción de la MEC, a través de cuatro vías de degradación: osteoclástica, fagocítica, plasminógeno-dependiente y regulada por metaloenzimas [3]. Los estadios más tempranos de la progresión de la enfermedad apical involucran remodelación y degradación de la MEC, las cuales 15 son esenciales para la migración celular, y para la liberación y activación de factores de crecimiento [10]. Entre los mediadores inflamatorios estudiados en PAC, las MMPs no sólo son capaces de degradar la MEC periodontal, sino que mediante proteólisis controlada pueden modificar la actividad biológica de moléculas bioactivas, actuando como moduladores de los procesos inmunoinflamatorios [11]. 2. Fluido Gingival Crevicular El tratamiento para la PAC es la realización de la endodoncia de la pieza en cuestión, terapia que ofrece una alta tasa de éxito; sin embargo, existen casos en los que el tratamiento fracasa, y dicho fracaso muchas veces se manifiesta en forma tardía con respecto a la rehabilitación del diente. De hecho, para considerar que la terapia fue exitosa, se requiere de un seguimiento radiográfico por un período no inferior a 3 años. Dado que un número considerable de los dientes tratados endodónticamente son restaurados con pernos de anclaje intrarradicular, el acceso a un retratamiento en estos casos es sólo quirúrgico, procedimiento que además de ser invasivo tendrá siempre un pronóstico reservado [12]. Una manera de acceder al estudio molecular de las patologías inflamatorias que comprometen el periodonto de inserción del diente, es mediante la caracterización del FGC, que en la actualidad se ha utilizado ampliamente para el estudio de enfermedades periodontales [13]. Un número considerable de productos bacterianos y derivados del hospedero encontrados 16 en el FGC han sido asociados con el inicio y progresión de la enfermedad periodontal [14]. El FGC es una mezcla compleja de sustancias derivadas del suero, tejido conectivo, epitelio y placa subgingival, incluyendo: leucocitos inflamatorios, electrolitos, pequeñas moléculas orgánicas, proteínas, citoquinas, anticuerpos, bacterias y sus antígenos, y enzimas de origen tanto del hospedero como bacterianas [15-24], que puede obtenerse a partir del surco gingival que rodea el diente en forma rápida y no invasiva, y es accesible en cualquier etapa del tratamiento endodóntico o en forma previa a éste. Con el comienzo de la infección periodontal marginal, el FGC muestra un cambio desde un transudado del plasma a un exudado inflamatorio que deriva del aumento de permeabilidad de las barreras vasculares y epiteliales [25]. Esto a su vez, permite la extravasación de proteínas de alto peso molecular desde la circulación general [26, 27]. Adicionalmente, este fluido contiene componentes derivados de los procesos de remodelación y destrucción de la matriz extracelular de los tejidos circundantes y, por lo tanto, podría representar una fuente importante de moléculas asociadas con el catabolismo óseo [26-28]. Se ha establecido que el FGC surge desde el plexo gingival de vasos sanguíneos del corion gingival, subyacente al epitelio de revestimiento en el espacio dentogingival [29]. El epitelio de revestimiento del surco gingival es permeable a componentes de pequeño peso molecular y el pasaje de fluido intersticial al surco actúa como un posible mecanismo de defensa que podría jugar un importante rol en la homeostasis del entorno crevicular [30]. 17 Una ventaja importantísima que presenta el FGC en relación con el exudado periapical, es que este último impide el uso de irrigantes previo a la toma de la muestra con el fin de evitar la inactivación de los componentes del exudado. Sin embargo, la terapia endodóntica exige el uso de dichos irrigantes desde el primer momento en que se accede a la cámara pulpar y sistema de canales radiculares, ya que uno de los objetivos biológicos de los procedimientos de limpieza y remodelado de la terapia endodóntica consiste en eliminar todo el tejido pulpar, las bacterias y sus toxinas del canal radicular [31], objetivo que debe postergarse en pro de la recolección de la muestra. Adicionalmente el FGC representa un método no invasivo y simple que permite la obtención de muestras en cualquier momento, independientemente del desarrollo del tratamiento, lo que ofrece la posibilidad de realizar un seguimiento longitudinal de la respuesta del hospedero frente al tratamiento realizado. El potencial valor diagnóstico del FGC y su naturaleza dinámica fueron reconocidas medio siglo atrás. En los años 1950s se demostró que un papel filtro colocado en el surco gingival de dientes de animales experimentales podía detectar una tinta que era inyectada en el sistema circulatorio de estos animales [32]. 18 3. Metaloproteinasas de Matriz Extracelular (MMPs) 3.1. Generalidades Las MMPs son una gran familia de endopeptidasas calcio-dependientes estructuralmente relacionadas, pero genéticamente distintas que degradan componentes de la MEC, incluyendo colágenos, elastinas, gelatina, glicoproteínas de la matriz, componentes de las membranas basales, como proteoglicanos, laminina y entactina, y diversas moléculas bioactivas, que incluyen receptores celulares de superficie, citoquinas, quimioquinas, hormonas, defensinas, moléculas de adhesión, factores de crecimiento, ligandos apoptóticos y factores angiogénicos [55-57]. Son secretadas por numerosos tipos celulares inflamatorios y del tejido conectivo, como leucocitos, fibroblastos, osteoblastos, queratinocitos, y células endoteliales, entre otros [58]. A la fecha, se conocen veintiséis MMPs humanas [59, 60]. Se les ha asignado un número a las presentes en vertebrados, además de nombres triviales a algunas de ellas. Estudios recientes han demostrado que el rol de las MMPs no está limitado solamente a los efectos degradativos sobre la MEC, sino que también tienen dirigida su acción sobre diversos sustratos bioactivos, como receptores de factores de crecimiento (GFR), moléculas de adhesión celular, quimioquinas, citoquinas, ligandos apoptóticos y factores angiogénicos [10, 56, 61], lo que las ubicaría como moduladoras dentro de los distintos procesos en que estas moléculas participan [11]. Las MMPs se reconocen actualmente como participantes claves en la regulación de interacciones célula-célula y célulaMEC. Están involucradas en la modificación de la estructura de la matriz, 19 disponibilidad de anticuerpos y la función del sistema de señalización de superficie celular, con consecuentes efectos en la diferenciación celular, proliferación y apoptosis. Juegan roles centrales en procesos fisiológicos, tales como morfogénesis, cicatrización de heridas, reparación tisular y remodelación en respuesta a injuria; mientras que en condiciones patológicas, participan en la progresión de enfermedades como artritis, cáncer, enfermedades cardiovasculares y enfermedades periodontales [62]. 3.2. Características Estructurales La estructura básica de las MMPs está compuesta por un pro-dominio Nterminal, un dominio catalítico, una región bisagra y un dominio tipo hemopexina C-terminal (Figura 1) [63]. Dominio tipo Hemopexina Dominio Fibronectina Dominio Catalítico Región bisagra Cola Citoplasmática TM-I "#!$%! Unión a membrana Sitio Furina ! Pro-dominio Péptido señal Figura 1. Esquema estructural de las MMPs humanas. Se observan los diferentes dominios que componen una MMP humana (Adaptado de Folgueras y cols., 2004). 3.3. Clasificación Basándose en la especificidad sobre el sustrato, similitud de secuencia y organización de los dominios, las MMPs de vertebrados se dividen 20 tradicionalmente en 6 grupos: colagenasas, gelatinasas, estromelisinas, matrilisinas, MMP transmembrana (MT-MMPs) y otras (Tabla 1) [63]. Sin embargo, las MMPs exhiben considerable redundancia respecto de sus sustratos, y por tanto en sus funciones biológicas [64]. Además, a pesar de que la estructura de los dominios catalíticos poseen una estructura altamente similar, existen diferencias con respecto a la especificidad de sustratos, especificidad celular y degradación tisular, unión a membranas y regulación, que hacen de esta familia, una familia de enzimas muy versátil con una multitud de funciones fisiológicas, muchas de ellas aún no completamente entendidas [65]. Otra clasificación más reciente, basada en sus secuencias primarias a partir métodos bioinformáticos, propone seis sub-grupos evolucionarios (A-F): sub-grupo A, MMPs -19, -26 y -28; sub-grupo B, MMPs -11, 21 y -23; sub-grupo C, MMP-17 y -25; sub-grupo D, MMP-1, -3, -8, -10, -12, -13 y -27; sub-grupo E, MMP-14, -15, 16 y -24; sub-grupo F, MMPs -2, -7, -9 y -20 [66]. Se usará en el texto la manera tradicional de clasificarlas. 21 Tabla 1. Clasificación de las MMPs humanas descritas a la fecha (Adaptado de Verma y cols., 2007). Tabla 1. Clasificación de las MMPs • Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 MMP Nº MMP-1 MMP-8 MMP-13 MMP-18 MMP-2 MMP-9 MMP-3 MMP-10 MMP-11 MMP-27 MMP-7 MMP-26 MMP-14 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 MMP-15 MMP-16 MMP-17 MMP-24 MMP-25 MMP-12 MMP-19 MMP-20 MMP-21 MMP-22 MMP-23 MMP-28 MMP-29 Clasificación Colagenasas Gelatinasas Estromelisina Matrilisinas MT-MMP (tipo membrana) Otras enzimas Nombre Colagenasa-1 Colagenasa de neutrófilo Colagenasa-3 Colagenasa-4 Gelatinasa-A Gelatinasa-B Estromelisina-1 Estromelisina-2 Estromelisina-3 Homología a estromelisina-2 (51,6%) Matrilisina (PUMP) Matrilisina-2 MT1-MMP MT2-MMP MT3-MMP MT4-MMP MT5-MMP MT6-MMP Macrófago elastasa RASI-1 Enamelisina MMP identificada en el cromosoma 1 MMP identificada en el cromosoma 1 De cDNA de ovario humano Epilisina Sin nombre MMP-13 La MMP-13 pertenece la familia de las colagenasas, cuyos integrantes son la MMP-1, MMP-8, MMP-13, y MMP-18 (Xenopus). Sus sustratos principales son los colágenos intersticiales fibrilares tipo I, II y III, los que corta en un sitio específico, ¾ desde la región N-terminal, generándose un fragmento ¼ y otro ¾. También puede degradar otras moléculas de MEC, como colágenos tipo IV, IX, X, gelatina, agregan, perlecán, biglicán, tenascina C, fibronectina, fibrilina y 22 microfibrillas ricas en fibrilina [67], y sustratos bioactivos no MEC [63]. Los dominios catalíticos de las colagenasas pueden degradar sustratos no colágenos, pero son incapaces de degradar colágenos nativos fibrilares en la ausencia de sus dominios tipo-hemopexina. La cooperación entre los dos dominios es por tanto fundamental para la expresión de su actividad colagenolítica [68]. La MMP-13 juega un importante rol en el desarrollo y remodelación ósea, en parte por su habilidad de degradar colágeno tipo II, un componente preponderante del cartílago. Esta función se refleja en un perfil de expresión más bien limitado durante el desarrollo y adultez, la cual es restringida al desarrollo de tejido esqueletal. Al contrario de otras colagenasas, MMP-13 tiene una actividad gelatinasa con relativamente alta especificidad, indicando que el rol proteolítico de MMP-13 va más allá del primer paso en la degradación de colágenos triple-hélice [67]. La MMP-13 además tiene propiedades proteolíticas sobre sustratos bioactivos como proTNF-α, factor derivado de células estromales (SDF)-1, proteína quimiotáctica de monocitos (MCP)-3, endostatina, inhibidor del activador del plasminógeno-2 [69] y α2-macroglobulina (α2M). También actúa sobre pro-MMP-9 y pro-MMP-13 transformándolas en sus formas activas [56]. Otras MMPs, como MMP-2 y -14, tienen actividad colagenolítica, pero están clasificadas en otros grupos debido a la composición de sus dominios [70]. La expresión de MMP-13 puede estar influenciada por un amplio espectro de hormonas y citoquinas, como la hormona paratiroidea, indicando el rol 23 importante de MMP-13 en el desarrollo del tejido óseo, factor de crecimiento tipo a insulina (IGF)-I y -II, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF) y el factor de crecimiento transformante (TGF) -β1. Este último puede estimular o bien inhibir la expresión de MMP-13 dependiendo del tipo tisular, IL-1 y -6, TNF-α, entre otros [67]. Además de la ruta de inactivación, vía inhibidores tisulares de metaloproteinasas, MMP-13 puede unirse a receptores específicos en la superficie de osteoblastos y fibroblastos, resultando en la internalización y degradación de la proteasa [71]. • MMP-2 La MMP-2, gelatinasa A, colagenasa tipo IV de 72-kDa, forma parte del grupo de las gelatinasas, al cual también pertenece la MMP-9 (gelatinasa B) [56]. La proenzima de la MMP-2 es activada al formar un complejo con el inhibidor tisular de metaloproteinasas (TIMP)-2, el cual es sustrato de MMP-14 (MMP unida a membrana tipo-I) que remueve el prodominio de proMMP-2 por clivaje proteolítico, con la ayuda de MMP-2 activa libre (Figura 2). Este proceso genera una forma activa de 64-kDa de la enzima [72]. Si la concentración de TIMP-2 es muy alta, tanto la MMP-14 y MMP-2 activa serán inhibidas, y no se llevará a cabo el proceso. Además de esta vía de activación, proMMP-2 también puede ser activada por trombina y proteína C activa [73]. 24 (1) TIMP-2 en baja concentración (2) TIMP-2 en alta concentración Extracelular Extracelular Intracelular Intracelular TIMP-2 MMP-14 Pro-MMP-2 ! Figura 2. Mecanismo de activación de la pro-MMP-2. (1) MMP-14 en la superficie celular actúa como un receptor para TIMP-2. TIMP-2 se une al sitio activo de MMP-14 a través de su dominio aminoterminal. Este complejo binario actúa como un receptor para pro-MMP-2, la que se une a través de su dominio C-terminal al dominio carboxiterminal de TIMP-2. Luego, una molécula libre de MMP-14 puede hidrolizar la pro-MMP-2, generando especies intermedias. Después la proteólisis del propéptido a través de un mecanismo autocatalítico genera la enzima totalmente activa. La activación de MMP-2 en este modelo sólo es posible si las concentraciones de TIMP-2 son bajas, con suficiente TIMP-2 como para generar el complejo trimolecular, pero insuficiente como para saturar todas las MMP-14 necesarias para la proteólisis del propéptido. (2) En altos niveles de TIMP-2, éste se une a las moléculas de MMP-14, inhibiendo su actividad, evitando de esta forma la activación de la MMP-2 (Adaptado de Lafleur y cols., 2003, [74]). La MMP-2 degrada principalmente gelatina, que corresponde a colágeno denaturado [63]. Además degrada colágeno tipo I, II, III con menor afinidad que MMP-13, y colágeno IV, componente fundamental de las membranas basales, lo que le otorga un importante rol durante la metástasis en cáncer [63], además de colágeno V y XI [75, 76]. Sin embargo, debido a que proMMP-2 es reclutada a la superficie celular y activada por MT-MMPs, puede acumularse pericelularmente y expresar actividad colagenolítica de manera razonable. Además, actuaría en 25 forma sinérgica con las colagenasas, al digerir el colágeno que se degrada a la temperatura corporal (37º C) [77]. También degrada elastina y vitronectina [78]. Dentro de las moléculas bioactivas que MMP-2 es capaz de hidrolizar, se encuentran pro-IL-1β, pro-TNF-α, pro-TGF-β, proteína de crecimiento transportadora (IGFP)-3 y -5, SDF-1, inhibidor de proteasa α-1, α2M y MCP-3, quimioquina cuya hidrólisis mediada por MMP-2 le otorga funciones antagónicas a la molécula íntegra [11, 79]. Además, la MMP-2 actúa sobre pro-MMP-1, proMMP-2 y pro-MMP-13, activándolas [56]. • MMP-9 La MMP-9 (gelatinasa B), se expresa como una proenzima de 92-kDa, que puede ser activada a una enzima madura de 83-kDa [80]. De manera contraria a MMP-2, MMP-9 se expresa solamente de manera constitutiva en neutrófilos [81], donde es almacenada en gránulos para ser rápidamente liberada luego de ser estimulada. La expresión en diversos otros tipos celulares es inducible mediante el estímulo inflamatorio [82]. La MMP-9, al igual que la MMP-2, degrada colágeno denaturado, colágeno nativo tipo IV, V y XI, laminina y proteína central del agrecán. A diferencia de MMP-2, MMP-9 no tiene acción colagenolítica frente a colágenos tipo I, II y III [62]. Dentro de las moléculas bioactivas que MMP-9 es capaz de procesar, se encuentran citoquinas y quimioquinas de manera similar a MMP-2, como por ejemplo IL-8, la cual es procesada en su forma truncada más potente, IL-1β y TGF-β [78]. 26 3.4. Regulación de la actividad de MMPs Como para la mayoría de los procesos biológicos, la degradación de la matriz es un evento preciso, atribuido a proteinasas que son producidas y liberadas por demanda de células activadas. [83]. Las MMPs interactúan con diversas moléculas de la superficie celular y pericelulares, que modifican la función de la enzima, así como también el comportamiento celular [84]. Un desbalance en la actividad de las MMPs puede conducir al desarrollo de patologías diversas [85]. El conocimiento acerca de la regulación de la actividad de las MMPs es, por tanto, primordial para la comprensión de diversos procesos fisiológicos, como también de la patogénesis de un gran número de enfermedades [86]. En condiciones fisiológicas las MMPs usualmente se expresan de manera restringida en los tejidos y, por ende, la homeostasis es mantenida [57]. Sin embargo, existen tres mecanismos fundamentales que regulan la expresión y actividad de las MMPs, tanto en condiciones fisiológicas como patológicas: transcripción génica, activación proteolítica e inhibición de la actividad enzimática. Colectivamente estos mecanismos deben confinar la actividad degradativa de las MMPs en aquellos sitios y situaciones en que es biológicamente necesaria [56]. • Transcripción génica A nivel transcripcional, una variedad de citoquinas y factores de crecimiento (ej. TNF-α, factor de crecimiento epidermal (EGF), factor de crecimiento derivado de cerebro (BFGF), IL-1, PDGF, IL-6 y TGF-β) inducen la 27 producción de MMPs, dependiendo de la situación y el tipo celular. También oncogenes, hormonas y diversos agentes químicos como interacciones célulacélula y célula-matriz pueden inducir o inhibir la expresión de MMPs [87]. Estos agentes causan variaciones espaciales y temporales en la expresión de las MMPS [56]. Además, investigaciones recientes indican un importante rol modulador de procesos epigenéticos en la expresión de MMPs [88]. • Activación proteolítica Las MMPs, como muchas enzimas proteolíticas, son sintetizadas como zimógenos inactivos (pre-pro-MMPs). El péptido señal es removido durante su transporte, generándose pro-MMPs. La región del propéptido contiene un residuo Cys que coordina el zinc catalítico cuando la estructura está correctamente plegada y previene la catálisis enzimática [70]. Las MMPs latentes secretadas pueden, por tanto, ser activadas mediante un proceso llamado modelo “switch-cisteína”, que consiste en la disociación del pro-dominio del dominio catalítico mediante la disrupción de la coordinación del zinc por remoción del propéptido [70, 89, 90] por enzimas proteolíticas, tales como proteasas de serina, furina, plasminas, MMPs y otras [57]. El “switch” de cisteína también puede ser modificado por reacciones químicas; ya sea fisiológica, mediante la oxidación de la cisteína por especies reactivas de oxígeno, o de manera artificial por componentes mercuriales como acetato 4-aminofenilmercurico (APMA), surfactantes desnaturantes como sulfato dodecil sódico (SDS). Esta disrupción de la interacción de zinc lleva a una relocalización alostérica del prodominio, generándose formas activas de la 28 enzima con el propéptido aún unido; o bien, a la remoción autoproteolítica del prodominio relocalizado [91]. La activación de las pro-MMPs representa, por tanto, un paso fundamental en la regulación de la actividad de las MMPs [56]. A pesar de que las MMPs contienen un péptido señal que las dirige a través de sus vías de secreción, un número creciente de estudios ha determinado que varias MMPs estarían localizadas también al interior de la célula. Esto explicaría, en parte, la habilidad de algunas MMPs de procesar proteínas intracelulares y, además, demuestra los complejos roles de las MMPs bajo condiciones tanto fisiológicas como patológicas [92, 93]. In vivo, la activación de las MMPs requiere de la participación de otras proteasas para la remoción del propéptido. En muchos casos, estas proteasas activadoras forman parte de una cascada proteolítica que tiene lugar en el espacio pericelular inmediato [94]. Un ejemplo de estas proteasas son las mismas MMPs [87]. Por ejemplo, MT-MMPs, como MMP-14, pueden reclutar proMMP-2 inactiva a la superficie celular y activar la proenzima [70]. In vitro su activación se lleva a cabo por agentes químicos, como agentes tioles, glutatión oxidado, SDS, agentes caotrópicos, y radicales libres del oxígeno; pH bajo y temperaturas elevadas también pueden generar su activación. Estos agentes posiblemente trabajarían en la disrupción de la interacción de la cisteína-Zinc [63]. • Inhibición de la actividad enzimática La actividad de las MMPs también puede ser controlada mediante una serie de inhibidores. Existen inhibidores naturales, dentro de los que se 29 encuentran los dos mayores inhibidores de las MMPs: α2M y los inhibidores tisulares de MMPs (TIMPs) [56]. α2M es una glicoproteína de 725 kDa que consiste en 4 subunidades idénticas de 180 kDa. Actúa como un inhibidor general de proteasas, tanto del hospedero como bacterianas [95], y se encuentra en el plasma y fluidos tisulares. La mayoría de las endopeptidasas, independientemente de su clase, son inhibidas al ser atrapadas dentro de la macroglobulina [95]. El complejo es luego rápidamente eliminado gracias a endocitosis mediada por una proteína relacionada con el receptor de lipoproteína de baja densidad tipo 1 (LRP1), también conocido como receptor α2M (A2MR) [96]. Los TIMPs son pequeñas proteínas de alrededor de 2500 Da que contienen dos dominios. El dominio N-terminal se une al sitio activo del dominio catalítico de las MMPs. Como resultado, el zinc catalítico es quelado por el grupo amino N-terminal del TIMP y por el grupo carbonil del residuo Cys en la proMMP, que libera una molécula de agua unida al zinc e inactiva la enzima [70, 97]. La inhibición de la actividad metaloproteinasa se basa en la unión estequiométrica y no covalente, pero con muy alta afinidad, al sitio activo de la enzima [98]. Los TIMPs estructuralmente comparten dominios amino- y carboxiterminales, tres puentes disulfuro y doce residuos de cisteína altamente conservados [98]. A la fecha, cuatro TIMPs han sido identificados: TIMPs -1, -2, 3 y -4 [70, 99]. Algunos TIMPs tienen capacidades inhibitorias preferenciales para diferentes pro-MMPs. Por ejemplo, TIMP-1 forma un complejo preferentemente con pro-MMP-9, mientras que TIMP-2 y -4 inhiben la activación 30 de pro-MMP-2 por MT1-MMP [91] Otra potencial función bioquímica de los TIMPs ha sido dilucidada, la que incluye un rol de TIMP-2 en la unión con MMP14 en la superficie celular, acción que es crítica para la activación de proMMP-2 [70, 97]. TIMP-1 y -3 posiblemente tienen funciones similares a TIMP-2 [70]. Además de la acción inhibitoria de los TIMPs, la función de las MMPs también puede ser bloqueada por otras proteínas. Se describen dentro de este grupo el potenciador de proteinasa C-terminal de procolágeno (PCP), el dominio NC-1 del colágeno tipo IV y el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI)-2. Finalmente, un inhibidor natural de las MMPs es la proteína rica en cisteína con motivos kazal (RECK) [56]. De manera sintética, las MMPs se inhiben mediante peptidomiméticos, no-peptidomiméticos, tetraciclinas, sus derivados y otros inhibidores exógenos naturales y sintéticos (bisfosfonatos, neovastat, té verde, ácido acetilsalicílico y el potenciador de la proteinasa de procolágeno) [11]. 4. MMPs y PAC Un evento clave en el desarrollo y progresión de la PAC es la degradación de la MEC de los tejidos periodontales periapicales, que incluyen hueso alveolar, ligamento periodontal y cemento radicular. Debido a que el componente principal de la MEC de estos tejidos corresponde al colágeno tipo I, las MMPs de las familias de las colagenasas y gelatinasas jugarían un papel fundamental en esta patología, particularmente aquellas producidas en el tejido 31 óseo (MMP-1, -2, -9, -13 y -14) [100, 101]. Se ha descrito un incremento en los niveles y actividad de la MMP-13 en periodontitis crónica, enfermedad que también se caracteriza por la destrucción de tejidos blandos y duros que componen el periodonto [102]. Previamente, se demostró un aumento en la expresión de MMP-13 en tejido gingival y FGC de sujetos con periodontitis crónica [103-105] en asociación con la severidad de los parámetros clínicos y la pérdida de colágeno [33, 106]. Además, se ha reportado un aumento en su actividad en lesiones periodontales destructivas durante la progresión de la enfermedad, conjuntamente con la degradación del tejido periodontal de inserción, incluyendo la reabsorción del hueso alveolar, que se ha visto reflejada en altos niveles de telopéptido carboxiterminal del colágeno tipo I (ICTP). Adicionalmente, se ha descrito una cascada de activación que incluye las MMPs -13, -9 y posiblemente la -2 en el tejido gingival de sujetos con periodontitis crónica y se ha propuesto que esta interacción podría representar un mecanismo de amplificación que podría perpetuar la destrucción de los tejidos periodontales [107]. Por otro lado, se postula que la MMP-13 estaría involucrada en la iniciación de la reabsorción ósea mediante la remoción de la matriz orgánica ósea y generación de fragmentos que podrían activar a los osteoclastos [108]. Así, se considera que la MMP-13 tiene un rol sustancial en la degradación de la matriz periodontal, pero los mecanismos que explican cómo la MMP-13 participa en la hidrólisis de los tejidos blandos y duros aún no se conocen del todo. 32 De modo similar, en PAC se ha demostrado la expresión de las MMPs 13, -2, -9, además de las MMPs -1, -3 y -8 en LPAs, infiltrado inflamatorio asociado a estas lesiones y FGC de dientes afectados [109-119]. Se ha demostrado la presencia de MMP-13 en GPAs con y sin epitelio proliferante mediante inmunohistoquímica. Se observó inmunopositividad en todas las muestras, con una mayor expresión de MMP-13 en lesiones periapicales epitelizadas en comparación con lesiones no epitelizadas. A partir de lo anterior se concluyó que la MMP-13 estaría involucrada en la conversión de un GPA con epitelio a un QRI, propiedad relacionada no sólo con la migración de células epiteliales, sino que también con la invasión del tejido de granulación [111]. En línea con lo anterior, se ha reportado la expresión de MMP-13 en plasmocitos presentes en GPAs, así como también en otras lesiones destructivas óseas, como lo son quistes odontogénicos y plasmocitomas malignos mediante hibridización in situ e inmunohistoquímica. Los autores concluyeron que la expresión de MMP-13 por parte de los plasmocitos tendría un rol particularmente importante en lesiones tanto malignas como benignas asociadas con destrucción ósea [109]. Por otro lado, se demostró inmunopositividad mediante inmunohistoquímica para MMP-9 en el infiltrado inflamatorio y células endoteliales de lesiones apicales con y sin epitelio, y células epiteliales en lesiones con epitelio. Mediante PCR en tiempo real (qPCR), se demostró que ambos tipos de lesiones presentaban mayores niveles de RNAm de MMP-9 comparados con ligamento sano (LS) [112]. En otro estudio se demostró la 33 presencia de MMP-2 en células inflamatorias como linfocitos, plasmocitos y macrófagos en LPAs mediante inmunohistoquímica [110]. Además, en periodontitis apical experimentalmente inducida en modelos animales, MMPs -2 y -9 fueron identificadas mediante inmunohistoquímica, donde se propuso que ambas jugarían un rol tanto en la iniciación como progresión de esta patología [115, 117]. De modo similar, se detectaron formas activas y proformas de MMPs -2 y -9 en muestras de exudado intracanal obtenido de dientes con diagnóstico clínico de absceso periapical, donde se encontraron mayores niveles de actividad de MMP-9 en exudados apicales de abscesos apicales agudos versus crónicos [114]. Otro estudio demostró una mayor expresión génica de MMPs en QRIs y GPAs que en LS y una actividad gelatinolítica más intensa en el infiltrado inflamatorio de GPAs en comparación con QRIs. Además, se demostró la presencia de MMPs -2, -9 y -13 en GPAs y QRIs mediante zimografía in situ e inmunohistoquímica. Entre éstas, las MMPs -9 y -13 se sobrexpresaron en GPAs en comparación con QRIs. La mayor expresión simultánea encontrada para MMP-9 y MMP-13 sugiere una regulación coordinada, posiblemente explicada por la habilidad de MMP-13 de activar a MMP-9 [119]. Además, nuestro grupo de investigación ha demostrado la expresión de MMPs -2, -9 y -13 [120] tanto en GPAs como en QRIs, pero no en LS mediante inmunohistoquímica. Estas MMPs se localizaron fundamentalmente en el infiltrado inflamatorio de estas lesiones. Las MMPs -2 y -9 se detectaron también 34 en el revestimiento epitelial de QRIs [120] [116]. Resultados previos obtenidos por nuestro grupo de trabajo describen la presencia de dos formas moleculares de la MMP-13 en lesiones periapicales, una proforma de 60 kDa y otra forma activa de 48 kDa [121]. Estudios recientes demostraron por primera vez que la composición del FGC cambia en dientes afectados por PAC, demostrando incrementos en la actividad de MMP-9, frecuencia de detección de MMP-2 y mayor concentración de proteínas total (CPT) en comparación a controles sanos [113, 118]. La α2M es un inhibidor que bloquea la actividad de las MMPs en el plasma y fluidos tisulares [122]; sin embargo, no existen estudios previos sobre el rol que pueda presentar este inhibidor en PAC. Estudios en periodontitis crónica han demostrado que la cantidad total de α2M está significativamente aumentada en dientes enfermos versus sanos, los que disminuyen a nivel de sitio y de paciente luego del tratamiento periodontal convencional [123-125]. Se ha planteado como un posible marcador de seguimiento durante el tratamiento de la periodontitis [124]. Se observó que los niveles de α2M transformada es aproximadamente la mitad de la cantidad total del inhibidor. Esto indica que una notable parte del total de α2M forma complejos con proteinasas [124]. Además, en un estudio se reportó la presencia de α2M incluso en el FGC de voluntarios sanos. La concentración aumentaba con la inflamación y disminuía luego del tratamiento. Interesantemente, no se encontró correlación entre los niveles de α2M en el FGC y los plasmáticos, indicando que este inhibidor es producido localmente en la encía, posiblemente por fibroblastos. La producción local de 35 α2M puede estar estimulada por citoquinas inflamatorias, las que también aumentarían la expresión del receptor de α2M en el tejido [126]. Se sabe que α2M, en contraste con otros inhibidores de proteasas, es capaz de unir y disminuir niveles patológicamente elevados de diversas citoquinas y factores de crecimiento y efectivamente remueve proteasas mediante endocitosis a través de receptores [127]. Así, este inhibidor juega un rol importante en la regulación de la respuesta inmune e inflamatoria [128]. La alta concentración de α2M transformada (complejo α2M-proteinasa) en el FGC en comparación con el plasma indicarían que el FGC contiene altas concentraciones de proteasas durante patologías como la periodontitis [124]. En síntesis, existe evidencia de un desbalance en la expresión, niveles y actividad de las MMPs sobre sus inhibidores en la patogenia de la PAC que podría reflejarse en el FGC de los dientes afectados. Sin embargo, estos cambios no se han demostrado en LPAs humanas, como tampoco su asociación con la composición del FGC en dientes afectados. Debido a los antecedentes anteriormente expuestos, se plantea que existe un aumento en los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y -13, y niveles reducidos de α2-macroglobulina en dientes con PAC en comparación con controles sin patología periapical, cambios que se ven reflejados en el FGC. El objetivo de este estudio es caracterizar los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 36 y -13, y de α2M en el fluido gingival crevicular de dientes con PAC y de dientes sanos, en LPAs y LS. 37 HIPÓTESIS Existe un aumento en los niveles y actividad de las metaloproteinasas de matriz extracelular -2, -9 y -13, y niveles reducidos de α2-macroglobulina en dientes con periodontitis apical crónica en comparación con dientes controles sin patología periapical, cambios que se ven reflejados en el fluido gingival crevicular. OBJETIVO GENERAL Determinar niveles, actividad y formas enzimáticas asociadas de las MMPs -2, -9 y -13, y niveles de α2-macroglobulina en lesiones periapicales, ligamento periodontal sano y/o fluido gingival crevicular de dientes con periodontitis apical crónica y controles. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Determinar y comparar niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13, y niveles de α2-macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos. 2. Determinar y comparar niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13, en tejido correspondiente a LPAs y ligamento periodontal sano. 3. Asociar presencia, niveles y actividad de los mediadores de interés entre muestras de tejido lesional y FGC de los dientes correspondientes. 38 4. Asociar la presencia y niveles de estos mediadores con antecedentes generales (edad, género) y características clínicas (tabaquismo y diámetro promedio de la lesión) de los sujetos de estudio. 39 MATERIALES Y MÉTODOS 1. Selección de Pacientes En este estudio se incluyeron 3 grupos de sujetos que se describen a continuación: Se incluyó un primer grupo de pacientes que consultaron en las Clínicas de Cirugía y Diagnóstico de la Facultad de Odontología de la Universidad de Chile con diagnóstico clínico de PAC [1] e indicación de endodoncia, a partir de los cuales se obtuvieron muestras de FGC; un segundo grupo de pacientes con diagnóstico de PAC e indicación de extracción, a partir de los cuales se obtuvieron muestras de FGC y/o de lesiones periapicales (LPAs) correspondientes al mismo diente. Finalmente, se incluyó un tercer grupo compuesto por pacientes con indicación de exodoncia de premolares sanos por ortodoncia, a partir de los cuales se obtuvo ligamento periodontal sano (LS) [1]. Los tres grupos de pacientes fueron seleccionados mediante muestreo no probabilístico de casos consecutivos. El diagnóstico de PAC se realizó en aquellos sujetos que presentaron uno o más dientes con LPAs (compatibles con GPA o QRI) detectadas mediante radiografía periapical (diámetro mayor a 5 mms.) consecutivas a caries, con determinación clínica de pulpa no vital y formación radicular completa. 40 Los criterios de exclusión fueron: } Trauma oclusal } Presencia de enfermedades periodontales marginales, definida por la pérdida de inserción clínica mayor o igual a 2 mms., aumento en la profundidad al sondaje mayor o igual a 3 mms., y sangramiento al sondaje en más de 10% de los sitios examinados. } Tratamiento con antibióticos, corticoides o AINES en los últimos 6 meses anteriores al estudio. } Presencia de enfermedades sistémicas. A todos los sujetos de estudio se les explicó el procedimiento a realizar, y firmaron un Consentimiento Informado aprobado por los Comités de Ética de la Facultad de Odontología de la Universidad de Chile y CONICYT (Anexo 1). Los antecedentes y datos clínicos de los pacientes fueron registrados en una ficha clínica (Anexo 2). 2. Obtención de las muestras 2.1. FGC y elución Para la obtención de FGC, los dientes en cuestión se aislaron con tórulas de algodón, se secaron suavemente y se introdujeron tiras de papel absorbente (PeriopaperTM, ProFlow, Amityville, New York, USA) en el surco hasta ejercer una leve resistencia contra el tejido por un período estandarizado de 30 segundos. Se realizó lo anterior en seis sitios por diente: mesiovestibular, 41 vestibular, distovestibular, mesiopalatino/lingual, palatino/lingual, distopalatino/lingual. Se excluyeron aquellas tiras que se contaminaron con saliva o sangre. Luego, las tiras fueron guardadas en un tubo Eppendorf a -80ºC hasta su procesamiento. El FGC fue eluido utilizando amortiguador de elución Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,2 M, CaCl2 5 mM, Tritón X-100 al 0,01%, con un cocktail inhibidor de proteasas libre de EDTA (Roche Diagnostics GmbH, Basel, Suiza), 40 µl/ tira. Luego se vortexeó 30 segundos y se dejó 30 minutos a 4ºC. Se centrifugó a 9000 x g durante 6 minutos a 4ºC, y se recuperó el sobrenadante. El procedimiento de elución se realizó dos veces, hasta un volumen final de 80 µl/ tira, y luego las muestras fueron almacenadas a -80ºC hasta su posterior análisis. 2.2. LPAs y homogeneización de tejido lesional A partir del grupo de sujetos con diagnóstico clínico de PAC e indicación de exodoncia, se obtuvieron muestras de FGC del diente afectado en forma previa a la extracción dentaria, y/o la lesión post-exodoncia. La obtención de ligamento periodontal en sujetos sanos se realizó mediante curetaje del tejido adherido a la raíz dentaria. Las muestras de tejido fueron homogeneizadas en un radio peso:volumen de 1 mg:10 µl, con un homogeneizador automático (OMNI International, Kennesaw, USA) en amortiguador de elución Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 0,2 M, CaCl2 5 mM, Tritón X-100 al 0,01% con un cocktail inhibidor de proteasas libre de EDTA (Roche Diagnostics GmbH, Basel, Suiza), se centrifugaron a 13000 x g durante 42 6 minutos a 4ºC y se recuperaron los sobrenadantes que fueron mantenidos a -80º hasta su posterior análisis. 3. Determinación de la concentración de proteínas totales (CPT) Se determinó la CPT en homogeneizados tisulares y eluidos de FGC mediante el método del ácido bicinconínico, según indicaciones del fabricante (BCA, Pierce Biotechnology, Rockford, USA). Las concentraciones fueron expresadas como mg/mL obtenidos a partir de una curva estándar usando como estándar albúmina sérica de bovino (BSA). 4. Zimografía en gelatina Se realizó zimografía con el objetivo de medir la actividad y, en forma indirecta, los niveles totales de las MMPs -2 y -9 en muestras de FGC y homogeneizados de LPAs y LS. Alícuotas de las muestras respectivas se cargaron en geles SDS-PAGE al 10% con 1mg/mL de gelatina como sustrato; se lavaron dos veces en Triton X-100 2,5% durante 15 minutos e incubaron en un tampón (20 mM Tris pH 7.4 and 5 mM CaCl2) durante 17 horas a 37ºC. Para visualizar las bandas, los geles se tiñeron con Azul de Coomassie R-250 y destiñeron con solución de ácido acético al 10%. La actividad gelatinolítica correspondiente se detectó como bandas semitransparentes sobre un fondo azul. Se realizó densitometría de las bandas obtenidas mediante el software UNSCAN-IT (Silk Scientific Corporation, Orem, Utah, USA). Los resultados se expresaron en unidades arbitrarias de densidad [129] estandarizadas por 30 segundos de toma de muestra por diente [113, 130] y por CPT en el caso del 43 FGC (ua/µg de proteínas totales [PT]). Las muestras correspondientes a homogeneizados de tejido se estandarizaron por mg de tejido. Los niveles totales de MMPs -2 y -9 se determinaron como la suma del total de proformas y formas activas correspondientes a las MMPs respectivas. La razón de activación para cada una de las MMPs se determinó como el cuociente entre la forma activa y la suma entre la proforma y forma activa de la MMP correspondiente. 5. Ensayo fluorescente de actividad de la MMP-13 Para determinar la actividad e indirectamente los niveles totales de la MMP13, se utilizó el kit comercial “Fluorokine E” (R&D Systems, Minneapolis, USA) que se basa en la captura de la enzima en estudio presente en la muestra por anticuerpos monoclonales precubiertos en una microplaca de 96 pocillos. Tras cargar los pocillos con alícuotas de las muestras o estándar para la MMP-13, se adicionó el sustrato fluorogénico que se encuentra unido a una molécula apagadora la cual se desliga por la acción proteolítica de la enzima activa, permitiendo la emisión de una señal fluorescente proporcional a la cantidad de MMP-13 activa presente en la muestra. Los resultados fueron expresados como nanogramos de producto fluorescente (ng PF) y como ng PF por µg (ng PF/µg) de proteínas totales en FGC, y por mg de tejido (ng PF/mg) en homogeneizados. Para determinar los niveles totales (MMP basal activa más la inactiva) se activó la fracción inactiva de MMP-13 con APMA 0,25 M por 1 hora a 37ºC. El ensayo se realizó según indicaciones del fabricante. 44 6. ELISA Para determinar los niveles de α2-macroglobulina en el FGC de dientes con PAC y sanos, se utilizó un kit de ELISA (Immundiagnostik, Bensheim, Alemania), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los niveles de α2-macroglobulina se obtuvieron a partir de una curva estándar. Los resultados fueron expresados en pg, y pg por µg (pg/µg) de proteínas totales. 7. “Immunowestern blot” Para resolver las formas enzimáticas correspondientes a las MMPs -13, -2 y 9, alícuotas de eluidos de FGC y homogeneizados de LPAs y LS se cargaron en geles SDS-PAGE al 10% a 150v. Las proteínas así separadas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Luego, la membrana fue bloqueada con leche descremada al 5% y se incubó con los anticuerpos primarios monoclonales anti MMP-2, anti MMP-9 y anti MMP-13 humanas (R&D Systems, Minneapolis, USA) en dilución 1:250, 1:100 y 1:250 respectivamente. La membrana se lavó y luego se incubó con un anticuerpo secundario anti ratón conjugado con peroxidasa (Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, USA) durante 1 hora. La reacción positiva se identificó mediante el sustrato quimioluminiscente (Femto, Thermo Scientific, Pierce Biotechnology, Rockford, USA), se expuso la membrana a películas radioautográficas (Thermo Scientific CL-XPosure Film, Pierce Biotechnology, USA) y se reveló. 45 8. Análisis estadístico Se utilizó el paquete estadístico Stata10 (Stata, Texas, USA). La distribución de los datos se determinó mediante el test de Shapiro Wilk. Aquellos datos que presentaron distribución normal se analizaron con Test T pareado para la comparación de niveles y actividad de los mediadores en estudio entre FGC de dientes enfermos y sanos contralaterales, y Test T no pareado para comparar niveles y actividad de los mediadores en estudio entre LPA y LS. Los datos que no presentaron distribución normal, se analizaron con test de Wilcoxon y MannWhitney respectivamente, y correlación de Spearman para asociar niveles y actividad de los mediadores en estudio en tejido, fluido y con los parámetros clínicos y demográficos. Los datos cualitativos se analizaron mediante test x2. 46 RESULTADOS 1. Características generales de los pacientes Las características generales y diagnósticos respectivos de los sujetos de estudio se presentan en la Tabla I. De los 81 pacientes seleccionados, 31 fueron diagnosticados clínicamente con PAC e indicación de tratamiento endodóntico, a partir de los cuales se obtuvieron muestras exclusivamente de FGC. El segundo grupo estuvo constituido por 23 pacientes con diagnóstico clínico de PAC e indicación de exodoncia, a partir de los cuales de obtuvieron muestras de tejido de LPAs y/o FGC. Finalmente, el último grupo estuvo compuesto por 27 pacientes con indicación de exodoncia por ortodoncia de premolares sanos, a partir de los cuales se obtuvieron muestras de tejido correspondientes a LS. La distribución de los parámetros analizados no presentó diferencias significativas entre los grupos 2 y 3 (p>0,05), con excepción de la edad. La edad del grupo sano fue significativamente menor que la edad del grupo con PAC y LPA (p<0,001). 47 Tabla I. Características generales de pacientes y controles Diagnóstico PAC (N=31) PAC (N=23) LS (N=27) Muestra FGC Tejido/FGC Tejido Edad (años) Género (Mujeres) Tabaquismo (%) Diámetro promedio (mm) 37,16 ± 13,26 44,74 ± 18,49* 23,24 ± 3,78* 19 9 15 22,5 42,3 25 N.A. 6 (2) N.A. Los valores están expresados como promedios ± DS o mediana (recorrido intercuartil). N.A.: no aplicable. *Tejido PAC v/s tejido LS, p<0,05. 2. Concentración de proteínas totales en FGC proveniente de dientes con PAC y sanos La concentración de proteínas totales se determinó en 21 muestras de FGC de dientes con PAC y dientes contralaterales sanos, respectivamente. Para el grupo con PAC, ésta fue de 0,15 (0,14) mg/mL, y para el grupo sano de 0,15 (0,072) mg/mL. No hubo diferencias significativas entre ambos grupos (p>0,05) (Figura 1). 48 Figura 1. Concentración de proteínas totales en FGC de dientes con PAC y contralaterales sanos. CPT: concentración de proteínas totales; FGC: fluido gingival crevicular (N=42, p=0,88). 3. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13, y niveles de α2-macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos 3.1. Formas enzimáticas de las MMPs -9, -2 y -13 en FGC de dientes con PAC y sanos Se identificaron las formas enzimáticas de las MMPs -9, -2 y -13 en FGC de dientes con PAC y sanos (Figura 2). Además, se corroboró la correspondencia entre las bandas inmunorreactivas identificadas por “immunowestern blot” y zimografía en gelatina, identificadas como MMPs -9 y -2. La proforma de la MMP-9 se identificó como una banda única de ~92 kDa, tanto en FGC de dientes con PAC y sanos, mientras que la forma activa no fue identificada mediante “immunowestern blot” en las muestras estudiadas. Se observaron fragmentos de menor peso molecular a los descritos para la proforma y forma activa de la MMP-9 en ambos tipos de muestra (a). 49 La MMP-2 se identificó como una banda de ~72 kDa correspondiente a la proforma, y una banda de ~64 kDa correspondiente a la forma activa. Ambas bandas fueron identificadas en muestras de FGC de dientes con PAC, mientras que en FGC de dientes sanos, estas bandas fueron levemente apreciables (b). Finalmente, la proMMP-13 se identificó como una banda única de ~60 kDa, y la forma activa como una banda única de ~48 kDa, ambas presentes en FGC de dientes con PAC, a diferencia de muestras de FGC de dientes sanos, donde las bandas fueron levemente apreciables (c). (a) (b) (c) Figura 2. Formas enzimáticas de MMPs -9 (a), -2 (b) y -13 (c) en muestras de FGC de dientes con PAC y controles sanos. Figuras representativas que demuestran las inmunorreactividades correspondientes con la (a) proforma de MMP-9 (proMMP-9) de ~92 kDa, y fragmentos de menor peso molecular (fx), (b) proforma de MMP-2 (proMMP2) de ~72 kDa, MMP-2 activa (aMMP-2) de ~64 kDa. (c) proforma de MMP-13 (proMMP-13) de ~60 kDa, MMP-13 activa (aMMP-13) de ~48 kDa. SPM: Estándar de peso molecular; PAC: FGC de dientes con PAC; C: FGC de dientes sanos. 3.2. Niveles totales y actividad de MMPs -2 y -9 en FGC de dientes con PAC y FGC sano A partir de las 24 muestras de FGC analizadas por cada grupo, se detectaron ambas formas de MMP-9 (proforma y forma activa) en muestras 50 de FGC de dientes con PAC mediante zimografía. Las proformas y formas activas de MMP-2 fueron detectables solamente 12 muestras para FGC con PAC y a 5 para FGC sano (p=0,03). Además, se detectaron bandas gelatinolíticas adicionales de mayor peso molecular diferentes a las proformas y formas activas de las gelatinasas, cercano a 130 kDa (Figura 3). Figura 3. Actividad gelatinolítica en FGC de dientes con PAC y sanos. Figura representativa de la actividad gelatinolítica en FGC de dientes con PAC y sanos. SPM: Estándar de peso molecular; ProMMP-9 y -2: formas zimogénicas de MMPs -9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMPs -9 y -2; PAC: FGC de dientes con PAC; C: FGC de dientes sanos. Los niveles totales de MMPs -9 y -2 para el grupo con PAC y sano se muestran en la Figura 4. Los niveles totales de la MMP-9 para el grupo con PAC correspondieron a 29086,84 (30116,12) ua y para el grupo sano a 39098,65 (32116,45) ua (a), mientras que los niveles totales de la MMP-2 correspondieron a 28237,62 (22931,16) ua y a 2968,50 (2302,50) ua respectivamente (b). No hubo diferencias significativas en los niveles de MMP-9 ni MMP-2 entre FGC de dientes con PAC y sanos (p=0,82 y p=0,47 respectivamente). De igual manera, no hubo diferencias significativas entre los niveles de estas MMPs cuando se estandarizaron por CPT (datos no mostrados). Los niveles totales MMP-9 51 correspondieron a 252796,60 (341364,20) ua/µg PT para el grupo con PAC y 286928,50 (208787,80) ua/µg PT para el grupo sano, mientras que los niveles totales de MMP-2 fueron 14324,70 (3929,92) ua/µg PT para el grupo con PAC y a 24848,47 (152,09) ua/µg PT para el grupo sano (p=0,72 y p=0,18 respectivamente). (a) (b) Figura 4. Niveles totales de MMP-9 (a) y MMP-2 (b) en FGC de dientes con PAC y sanos. (a) ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=48, p=0,82). (b) ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=10, p=0,47). La actividad gelatinolítica de las proformas y formas activas de MMP-9 y -2 se muestran en la Figura 5. No hubo diferencias significativas entre la actividad, tanto de la proforma como la forma activa, de MMP-9 en FGC de dientes con PAC y sanos (p=0,056 y p=0,37 respectivamente) (a). Para el grupo con PAC, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-9 fue de 11758,17 (9160,30) ua y para la forma activa de 14826,86 (38499,05) ua. Para el grupo sano, la actividad gelatinolítica de la proforma correspondió a 13223,75 (9121,53) ua y de la forma activa a 22197,67 (34209,65) ua. De igual manera, no hubo diferencias significativas entre los valores obtenidos cuando se 52 estandarizaron por CPT (datos no mostrados), los cuales correspondieron a 107949,20 ± 51622,70 ua/µg PT para el grupo con PAC, y a 117335,10 ± 47199,46 ua/µg PT para el grupo sano en relación con la proforma de MMP-9; y a 142068,20 (355709,30) ua/µg PT para el grupo con PAC y 142651,0 (156432,30) ua/µg PT para el grupo sano en relación con MMP-9 activa (p=0,18, p=0,66 respectivamente). De modo similar a los resultados obtenidos para MMP-9, no hubo diferencias significativas en la actividad, tanto de la proforma como la forma activa de MMP-2, en FGC de dientes con PAC y sanos (p=0,47 y p=0,14 respectivamente) (b). Para el grupo con PAC, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-2 fue de 8441,50 (4822,56) ua y para la forma activa de 16538,04 (19813,91) ua. Para el grupo sano, la actividad gelatinolítica de la proforma correspondió a 2424,0 (2493,50) ua y de la forma activa a 544,5 (108,50) ua. No fue posible determinar las diferencias presentadas entre ambos grupos estandarizado por CPT, ya que no se detectaron estas formas en las muestras que se destinaron para el ensayo de medición de CPT. 53 (a) (b) Figura 5. Actividad gelatinolítica de la proforma y forma activa de MMP-9 (a) y -2 (b) en FGC de dientes con PAC y sanos. (a) ProMMP-9: forma zimogénica de MMP-9; aMMP-9: forma activa de MMP-9; ua: unidades arbitrarias (pixeles) (n=48, p=0,056, p=0,37 respectivamente). (b) ProMMP-2: forma zimogénica de MMP-2; aMMP-2: forma activa de MMP-2; ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=17, p=0,47, p=0,14 respectivamente). Adicionalmente se determinó la razón de activación de MMPs -9 y -2 en FGC de dientes con PAC y sanos. En relación con MMP-9, ésta correspondió a 0,61 (0,48) ua para el grupo con PAC y a 0,58 (0,25) ua para el grupo sano. En relación con MMP-2, ésta correspondió a 0,61 (0,46) ua para el grupo con PAC y a 0,18 (0,16) ua para el grupo sano. No se observaron diferencias significativas entre ambos grupos en estudio (p=0,22, p=0,53 respectivamente) (Figura 6). De igual manera, no hubo diferencias significativas entre los valores obtenidos cuando se estandarizaron por CPT, los cuales correspondieron a 3.28 (9,81) ua/µg PT para el grupo con PAC, y a 2.22 (16,76) ua/µg PT para el grupo sano (p=0,97). 54 Figura 6. Razón de activación de MMPs -9 y -2 en FGC de dientes con PAC y sanos. actMMP-9: razón de activación de MMP-9; actMMP-2: razón de activación de MMP-2 (N=48, N=10 , p=0.22, p=0.53). Se correlacionaron los valores obtenidos mediante zimografía para las proformas y formas activas de las MMPs -9 y -2 en FGC de dientes con PAC y sanos. En FGC de pacientes con PAC se obtuvo correlación negativa entre la forma activa de MMP-9 y la forma activa de MMP-2 (r=-0,63, p=0,03) (Tabla III), mientras que en FGC de pacientes sanos se obtuvo correlación negativa entre la proforma y la forma activa de la MMP-2 (r=-1,00, p<0,001) (Tabla IV). Tabla III. Matriz de correlación de Spearman entre formas enzimáticas de MMPs -9 y -2 en FGC de pacientes con PAC proMMP-9 aMMP-9 proMMP-2 aMMP-2 (rho) (rho) (rho) (rho) proMMP-9 1 ------aMMP-9 0,18 1 ----proMMP-2 0,17 -0,50 1 --aMMP-2 -0,21 -0,63* 0,50 1 ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2. N=12. *p=0,03. 55 Tabla IV. Matriz de correlación de Spearman entre formas enzimáticas de MMPs -9 y -2 en FGC de pacientes sanos proMMP-9 aMMP-9 proMMP-2 aMMP-2 (rho) (rho) (rho) (rho) proMMP-9 1 ------aMMP-9 0,50 1 ----proMMP-2 0,30 0,60 1 --aMMP-2 -0,30 -0,60 -1,00* 1 ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2. N=5. *p<0,001. 3.3. Actividad basal y total de MMP-13 en FGC de dientes con PAC y sanos Se analizó la actividad basal y total de MMP-13 en FGC de 21 dientes con PAC y 19 sanos. En el grupo con PAC, se observaron niveles detectables en 20 muestras, mientras que en el grupo sano, se observaron niveles detectables en 16 (p>0,05). No se obtuvieron diferencias significativas entre ambos grupos de estudio tanto para la actividad basal como para la total (p=0,71, p=0,14 respectivamente) (Figura 7). En relación con la actividad basal, se obtuvo 21,60 (8,56) ngPF para el grupo con PAC y 20,97 (16,87) ngPF para el grupo sano; en relación con la actividad total (niveles), se obtuvo 17,90 (12,36) ngPF para el grupo con PAC y 18,35 (26,76) ngPF para el grupo sano. De igual manera, no hubo diferencias significativas entre los valores obtenidos cuando se estandarizaron por CPT, los cuales correspondieron a 135,06 (130,65) ng PF/µg PT para el grupo con PAC, y a 132,43 (143,69) ng PF/µg PT para el grupo sano (p=0,97) en relación con la actividad basal de MMP-13, y a 108,89 (115,23) ng PF/µg PT para el grupo con PAC, y a 90,90 (224,82) ng PF/µg PT para el grupo 56 sano en relación con la actividad total de MMP-13 (p=0,97, p=0,31 respectivamente; datos no mostrados). No se pudieron determinar los niveles de MMP-13 en FGC de dientes con PAC y sanos ya que se encontraron bajo el límite de sensibilidad del ensayo realizado. Figura 7. Actividad basal y total de MMP-13 en FGC de dientes con PAC y sanos. (N=40, N=32, p=0,71, p=0,14 respectivamente). 3.4. Niveles de α2- macroglobulina en FGC de dientes con PAC y sanos Se determinaron los niveles de α2- macroglobulina en 20 muestras de FGC de dientes con PAC y 20 muestras de dientes sanos destinadas para este ensayo. No se obtuvieron diferencias significativas entre ambos grupos en estudio (p=0,64) (Figura 8). De igual manera, no hubo diferencias significativas entre los valores obtenidos cuando se estandarizaron por CPT, los cuales 57 correspondieron a 599,66 (567,43) pg/ µg PT para el grupo con PAC, y a 502,32 (458,56) pg/ µg PT para el grupo sano (p=0,78; datos no mostrados). Figura 8. Niveles de α2-macroglobulina en FGC de dientes enfermos y controles (N=40, p=64). 4. Niveles, actividad y formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13 en tejido correspondiente a LPAs y ligamento periodontal sano. 4.1. Formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13 en tejido correspondiente a LPAs y LS Se identificaron las formas enzimáticas de las MMPs -2, -9 y -13 en LPAs y LS (Figura 9). Además, se corroboró la correspondencia entre las bandas inmunorreactivas identificadas por “immunowestern blot” y zimografía en gelatina, identificadas como MMPs -2 y -9. En relación con MMP-9, se identificó como una banda única de ~92 kDa, correspondiente a la proforma tanto en muestras de LPAs como LS. Por otro 58 lado, se identificó una banda tenue de ~84 kDa, en LPAs, que no fue identificada en las muestras de LS. Se observaron fragmentos de menor peso molecular en ambos tipos de muestras (a). La MMP-2 se identificó como una banda única de ~72 kDa correspondiente a la proforma, y una banda de ~64 kDa correspondiente a la forma activa. Ambas bandas fueron identificadas en muestras de LPAs como LS. Además, se observaron fragmentos de menor peso molecular de los descritos en muestras correspondientes a LS (b). Finalmente, la MMP-13 se identificó como una banda única de ~60 kDa, correspondiente a la proforma, y una banda de ~48 kDa, correspondiente a la forma activa, ambas presentes en LPAs y LS. También se observaron fragmentos de menor peso molecular, especialmente en LS (c). (a) (b) (c) Figura 9. Formas enzimáticas de MMPs -9 (a), -2 (b) y -13 (c) en muestras de muestras de tejido correspondiente a LPAs y LS. Figuras representativas que demuestran las inmunorreactividades correspondientes con la (a) proforma de MMP-9 (proMMP-9) de ~92 kDa, MMP-9 activa (aMMP-9) de ~84 kDa y fragmentos de menor peso molecular (fx), (b) proforma de MMP-2 (proMMP-2) de ~72 kDa, MMP-2 activa (aMMP-2) de ~64 kDa y fragmentos de menor peso molecular (fx), (c) proforma de MMP-13 (proMMP-13) de ~60 kDa, MMP-13 activa (aMMP-13) de ~48 kDa y fragmentos de menor peso molecular (fx). SPM: Estándar de peso molecular; LPA: homogeneizado de LPAs; LS: homogeneizado de LS. 59 4.2. Niveles totales y actividad de MMPs -2 y -9 en tejido correspondiente a LPAs y LS Se detectaron las proformas y formas activas de las MMPs -2 y -9 tanto en LPAs como en LS mediante zimografía en gelatina. Tanto las formas enzimáticas de la MMP-2 como MMP-9 se detectaron en todas las muestras analizadas (n=25) (Figura 10). Figura 10. Actividad gelatinolítica en LPAs y LS. Figura representativa de la actividad gelatinolítica en LPAs y LS. SPM: Estándar de peso molecular; ProMMP-9 y -2: formas zimogénicas de MMPs -9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMPs -9 y -2; LPA: homogeneizado de LPAs; LS: homogeneizado de LS. Los niveles totales de MMPs -9 y -2 en LPAs y LS se muestran en la Figura 11. Los niveles totales de la MMP-9 para LPAs correspondieron a 9187,77 (5334,78) ua y para LS a 4635,92 (2652,97) ua (a), mientras que los niveles totales de la MMP-2 para LPAs correspondieron a 24266,30 (29758,23) ua y para LS a 16606,91 (53796,79) ua (b). Los niveles totales de MMP-9 fueron significativamente mayores en LPAs que en LS (p=0,001), mientras que no hubo diferencias significativas entre los niveles totales de MMP-2 en LPAs y LS (p=0,48). 60 (a) (b) Figura 11. Niveles totales de MMPs -9 (a) y MMP-2 en LPAs y LS. (a) ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=50, p=0,001), (b) (N=50, p=0,63). La actividad gelatinolítica de las proformas y formas activas de MMP-9 y 2 se muestran en la Figura 12. Para el grupo de LPAs, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-9 fue de 4493,75 (3693,0) ua y de la forma activa fue de 5392,35 (2417,15) ua. Para el grupo de LS, la actividad gelatinolítica de la proforma correspondió a 3064,63 (2833,37) ua y de la forma activa a 1403,87 (1080,98) ua. Tanto la proforma como la forma activa tuvieron mayor actividad en LPAs en comparación con LS (p=0,03, p<0,001, respectivamente) (a). En relación a la actividad de MMP-2 en tejido correspondiente a LPAs y LS, no hubo diferencias significativas tanto para la proforma como para la forma activa entre ambos grupos en estudio (p=0.75, p=0.51 respectivamente) (b). Para el grupo de LPAs, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-2 fue de 10624,19 (10839,51) ua y de la forma activa fue de 14971,01 (18592,79) ua. Para el grupo de LS, la actividad gelatinolítica de la proforma de MMP-2 correspondió a 6586,27 (25789,58) ua y de la forma activa a 11315,53 (29779,64) ua. 61 (a) (b) Figura 12. Actividad gelatinolítica de la proforma y forma activa de MMP-9 (a) y -2 (b) en LPAs y LS. (a) ProMMP-9: forma zimogénica de MMP-9; aMMP-9: forma activa de MMP-9; ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=50, *p=0,03, #p<0,001). (b) ProMMP-2: forma zimogénica de MMP-2; aMMP-2: forma activa de MMP-2; ua: unidades arbitrarias (pixeles) (N=50, p=0,75, p=0,71). Adicionalmente se determinó la razón de activación de MMPs -9 y -2 en tejido correspondiente a LPAs y LS. En relación con MMP-9, ésta correspondió a 0,59±0,25 y 0,64±0,11 ua, sin diferencias significativas entre ambos grupos en estudio (p=0,21). En relación con MMP-2, la razón de activación para LPAs fue de 0,19 (0,55) ua y 0,20 (0,30) ua respectivamente, siendo significativamente mayor en LPAs que en LS (p=0,003) (Figura 13). 62 Figura 13. Razón de activación de MMPs -9 y -2 en LPAs y LS. ActMMP-2: razón de activación de MMP-2; actMMP-9: razón de activación de MMP-9 (N=50, *p=0,003, p=0,21). Se correlacionaron los valores obtenidos mediante zimografía para las proformas y formas activas de las MMPs -9 y -2, niveles totales de éstas y actividad basal y total de MMP-13 en LPAs y LS. No se obtuvieron correlaciones entre los mediadores estudiados. Cuando se analizaron los valores obtenidos mediante zimografía para las proformas y formas activas de las MMPs -9 y -2, se obtuvieron correlaciones significativas en LS de la MMP-2 con la proforma y forma activa de la MMP-9 (r=0.70, p=0.001; r=-0.58, p=0.001 respectivamente), y entre la forma activa de la MMP-2 con la proforma y forma activa de la MMP-9, y con la proforma de la MMP-2 (r=0.71, p=0.001; r=-0.40, p=0.02; r=0.82, p=0.001 respectivamente). En LPAs se obtuvo correlación entre la proforma y forma activa de la MMP-2 (r=0.72, p=0.001) (Tabla VI). 63 Tabla VI. Matriz de correlación de Spearman entre formas enzimáticas de MMPs -9 y -2 en LPAs y controles proMMP-9 aMMP-9 proMMP-2 aMMP-2 (rho) (rho) (rho) (rho) LPA LS LPA LS LPA LS LPA LS proMMP-9 1 1 ------------aMMP-9 -0,01 -0,36 1 1 --------proMMP-2 0,33 0,70* 0,23 -0,58* 1 1 ----aMMP-2 0,27 0,71* 0,29 -0,40* 0,72* 0,82* 1 1 ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2. N=50. *p<0,05. 4.3. Actividad basal y total de MMP-13 en tejido correspondiente a LPAs y LS En relación con la actividad basal de la MMP-13, se obtuvo 10,38±2,43 ngPF/mg para el grupo de LPAs y 18,60 ± 3,87 ngPF/mg para el grupo sano, en relación con la actividad total se obtuvo 4,73 (3,98) ngPF/mg para el grupo de LPAs y 6,84 (7,54) ngPF/mg para el grupo sano; por tanto se obtuvo una mayor actividad basal en LS que en LPAs (p=0,03). No hubo diferencias significativas en la actividad total de MMP-13 entre ambos grupos en estudio (p=0,53) (Figura 14). No se encontró correlación entre MMP-13 y las demás MMPs (p>0,05). 64 Figura 14. Actividad basal y total de MMP-13 en LPAs y LS. (N=16, *p=0,03, p=0,53). 5. Asociación de la presencia, niveles y actividad de los mediadores de interés entre muestras de tejido lesional y FGC de los dientes correspondientes. No se obtuvo correlación en la actividad tanto de las proformas como de las formas activas de las MMPs en estudio presentes en el FGC con las presentes en las LPAs (p>0.05). 6. Asociación de la presencia y niveles de estos mediadores con antecedentes generales (edad, género) y características clínicas (tabaquismo y diámetro promedio de la lesión) de los sujetos de estudio. Debido a que sólo se identificaron diferencias en LPAs, las asociaciones se determinaron entre los valores obtenidos en este tipo de muestra y antecedentes 65 generales y características clínicas de los sujetos en estudio. Se detallan a continuación las correlaciones obtenidas entre los mediadores en los que se obtuvieron variaciones significativas entre el grupo enfermo y sano. 6.1. Edad La actividad de las proformas y formas activas según edad y estado se presentan en la Tabla VII. Se obtuvieron correlaciones positivas entre la edad y proforma de la MMP-9 (r=0,50, p=0,02) y forma activa de la MMP-2 (r=0,44, p=0,04) en muestras de LS. Tabla VII. Matriz de correlación de Spearman entre edad y formas enzimáticas de MMPs -9 y -2 en LPAs y controles Edad proMMP-9 aMMP-9 ProMMP-2 aMMP-2 (años) (rho) (rho) (rho) (rho) LPA LS LPA LS LPA LS LPA LS LPA LS Edad 1 1 ----------------proMMP-9 0,15 0,50* 1 1 ------------aMMP-9 -0,12 0,23 0,02 -0,34 1 1 --------proMMP-2 0,22 0,26 0,32 0,67* 0,15 -0,67* 1 1 ----aMMP-2 0,29 0,44* 0,26 0,71* 0,24 -0,45 0,67* 0,78* 1 1 ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2. n=23, n=27. *p<0,05. 6.2. Género La actividad de las proformas y formas activas según género y estado se presentan en la Tabla VIII y Tabla IX. En LPAs, no se obtuvieron diferencias significativas de los niveles de los mediadores estudiados entre los géneros femenino y masculino (p>0,05) (Tabla VIII). En cambio, en LS el género 66 femenino presentó mayores niveles de la proforma de la MMP-9 (p=0,01, p=0,05) y de la forma activa de la MMP-2 (p=0,005) (Tabla IX). Tabla VIII. Niveles y actividad de MMPs -2 y -9 en LPAs según género Mediador Inflamatorio proMMP-9 aMMP-9 proMMP-2 aMMP-2 Femenino n Masculino n p 3935,52 (3693,0) 5744.05 (1781,48) 10983,0 (4774,06) 20304,5 (24031,25) 9 9 9 9 4493,75 (4139,47) 4678,91 (2667,65) 11901,5 (13787,9) 11250,98 (18908,54) 14 14 14 14 0,75 0,28 0,80 0,051 Resultados expresados como mediana. ProMMP-9 y -2: formas zimogénicas de MMPs 2 y -9; aMMP-2 y -9: formas activas de MMP-2 y -9; ua: unidades arbitrarias (pixeles). Tabla IX. Niveles y actividad de MMPs -2 y -9 en LS según género Mediador Inflamatorio proMMP-9 aMMP-9 proMMP-2 aMMP-2 Femenino n Masculino n p 3843,95 (3491,54) 941,33 (1112,66) 23451,97 (47890,35) 38965,59 (54610,91) 11 11 11 11 1522,18 (2210,58) 1477,18 (704,26) 5353,06 (3675,53) 9185,95 (4591,61) 11 11 11 11 0,01 0,20 0,05 0,005 Resultados expresados como mediana. ProMMP-9 y-2: formas zimogénicas de MMPs 2 y -9; aMMP-2 y -9: formas activas de MMP-2 y -9; ua: unidades arbitrarias (pixeles). 6.3. Tabaquismo Se determinaron los niveles y actividad de MMPs -2, -9 y -13 en LPAs y LS en pacientes fumadores y no fumadores (Tabla X). Debido a que el grupo de fumadores era pequeño, se eliminaron los valores correspondientes a los fumadores, y se compararon los valores obtenidos en pacientes no fumadores con los del grupo completo (Tabla XI). Se observaron niveles mayores de la 67 proforma y forma activa de MMP-9 (p=0,03, p=0,001 respectivamente) y para la forma activa de MMP-2 (p=0,03), las cuales son mayores en LPAs que en LS. Tabla X. Determinación de niveles y actividad de MMP-2, -9 y -13 en LPAs y LS en pacientes fumadores y no fumadores Mediador LPAs LS N p Inflamatorio proMMP-9 (ua) 4493,75 (3693) 3064,63 (2833,37) 50 0,03 aMMP-9 (ua) 5392,35 (2417,15) 1403,87 (1080,98) 50 0,001 Act MMP-9 (ua) 0,59 ± 0,25 0,64 ± 0,11 50 0,21 MMP-9 (ua) 9187,77 (5334,78) 4635,92 (2652,97) 50 0,001 proMMP-2 (ua) 10624,19 (10839,51) 6586,27 (25789,58) 50 0,75 aMMP-2 (ua) 16147,25 (23966,16) 11506,91 (30556,03) 50 0,51 Act MMP-2 (ua) 0,19 (0,55) 0,20 (0,30) 50 0,003 MMP-2 (ua) 25284,0 (30330,23) 16606,91 (53796,79) 50 0,63 Act. MMP-13 10,38 ± 2,43 18,60 ± 3,87 16 0,03 basal (ngPF/mL) Act. MMP-13 total 4,73 (3,98) 6,84 (7,54) 16 0,53 (ngPF/mL) Resultados expresados como mediana y promedios ± DS. ProMMP-9 y -2: formas zimogénicas de MMPs -9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMPs -9 y -2; ua: unidades arbitrarias (pixeles); Act: Relación entre formas activas v/s enzima total. PF: producto fluorescente. 68 Tabla XI. Determinación de niveles y actividad de MMP-2, -9 y -13 en LPAs y LS en pacientes no fumadores Mediador LPAs LS N p inflamatorio proMMP-9 (ua) 4034,26 (3932,98) 2940,54 (2808,76) 36 0,03 aMMP-9 (ua) 5744,05 (2108,16) 1376,44 (986,56) 36 0,001 Act MMP-9 (ua) 0,64 (0,51) 0,62 (0,15) 36 0,81 MMP-9 (ua) 9787,0 (4731,12) 4315,93 (2680,12) 36 0,001 proMMP-2 (ua) 10828,87 (13787,90) 6189,81 (19628,22) 36 0,83 aMMP-2 (ua) 16483 (28089,80) 11461,59 (30131,32) 36 0,64 Act MMP-2 (ua) 0,53 (0,28) 0,27 (0,38) 36 0,03 MMP-2 (ua) 20287,5 (33112,59) 16067,02 (49605,53) 36 0,74 Act. MMP-13 12,42 ± 5,20 18,60 ± 3,87 10 0,18 basal (ngPF/mL) Act. MMP-13 total 5,57 ± 3,66 6,04 ± 1,49 10 0,45 (ngPF/mL) Resultados expresados como mediana y promedios ± DS. ProMMP-9 y-2: formas zimogénicas de MMPs -2 y -9; aMMP-2 y -9: formas activas de MMP-2 y -9; ua: unidades arbitrarias (pixeles); Act: Relación entre formas activas v/s enzima total. PF: producto fluorescente. 6.4. Tamaño de la lesión Se correlacionaron los valores obtenidos para MMPs -9 y -2 en LPAs y el diámetro de las LPAs respectivas. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla XII. Se obtuvo una correlación positiva entre el diámetro de las LPAs con las formas activas de MMPs -9 y -2 (r=0,52, p=0,03; r=0,48, p=0,04 respectivamente). 69 Tabla XII. Matriz de correlación de Spearman entre formas enzimáticas de MMPs -9, -2 y diámetro de LPAs Diámetro de la LPA proMMP-9 aMMP-9 proMMP-2 aMMP-2 Diámetro de la LPA (rho) 1 proMMP-9 (rho) --- aMMP-9 (rho) --- proMMP-2 (rho) --- aMMP-2 (rho) --- 0,22 0,52* 0,36 0,48* 1 -0,09 0,45 0,44 --1 0,20 0,27 ----1 0,60* ------1 ProMMP-9 y -2: proformas de MMP-9 y -2; aMMP-9 y -2: formas activas de MMP-9 y -2. N=18. *p<0,05. 70 DISCUSIÓN Las LPAs constituyen un mecanismo de respuesta del hospedero frente a la infección bacteriana del sistema de canales radiculares del diente [3]. La patogénesis de esta enfermedad involucra la degradación de diversos componentes de la MEC como resultado de la infección bacteriana [3, 132], siendo la destrucción de tejidos periodontales (normalmente apicales) una característica clave en la PAC [2]. Diversos mediadores inflamatorios, incluyendo las MMPs, han sido propuestos como participantes en la destrucción de los tejidos periodontales durante enfermedades inflamatorias [8, 104, 111]. Las MMPs pertenecientes a las familias de las colagenasas y gelatinasas, tendrían un rol preponderante en el inicio y/o progresión de las LPAs al degradar directamente el colágeno constituyente de los tejidos blandos y duros del periodonto [133-135]. A la fecha, el diagnóstico y estudio de las LPAs se basa principalmente en la biopsia y su estudio anatomopatológico, que sólo se obtienen luego de la exodoncia de la pieza en cuestión en aquellos casos en que no fue posible realizar el tratamiento endodóntico, o bien, mediante cirugía periapical cuando está indicada [136]. También se ha propuesto el análisis de muestras de exudado periapical tomadas a través del canal radicular, pero éstas sólo pueden obtenerse durante el inicio del tratamiento de endodoncia [137]. Dichos métodos son invasivos, y no permiten el monitoreo de la evolución de la lesión una vez finalizado el tratamiento. 71 La caracterización del FGC ha sido ampliamente utilizada en el estudio de marcadores de enfermedades periodontales [13] ya que, entre otras razones, contiene moléculas involucradas en el proceso destructivo y podría representar una fuente de mediadores inflamatorios asociados con actividad osteoclástica [138]. A pesar de lo anterior, existen escasos datos sobre el estudio de MMPs y sus inhibidores en el FGC de dientes con PAC. El presente estudio incorpora nuevo conocimiento sobre el estudio de estos mediadores tanto en el FGC como en LPAs de dientes con esta patología. Los resultados mostraron mayores niveles tanto de la proforma como de la forma activa, niveles totales y razón de activación de MMP-9 en LPAs en comparación con LS. Además, MMPs -9 y -2 fueron reconocidas mediante zimografía en gelatina tanto en muestras de homogeneizados de LPA y LS como de FGC. Por último, fueron reconocidas las formas enzimáticas de MMPs -9, -2 y -13 en muestras de homogeneizados y FGC. Debido a lo anterior, la hipótesis propuesta se aprueba de manera parcial. Este trabajo demuestra por primera vez, mediante “immunowestern blot”, la presencia de las MMPs -2, -9 [116] y -13 en el FGC de dientes con PAC, y corresponden a lo descrito previamente en la literatura en patologías como la periodontitis crónica [33, 80, 102-105]. Adicionalmente, éstas corroboran la identidad de las MMPs -2 y -9 identificadas en el presente estudio y en forma previa por zimografía. La forma activa de la MMP-9 no se identificó mediante “immunowestern blot” en este estudio. Esto podría deberse a que una vez activas, las MMPs son altamente inestables y rápidamente degradadas a 72 fragmentos de bajo PM, y a que esta técnica presenta una sensibilidad menor en relación con la zimografía. Al igual que en el estudio de Belmar y cols. [113], se detectó una banda de mayor peso molecular que las correspondientes para las formas de las colagenasas estudiadas mediante zimografía, con un PM correspondiente a ~130 kDa. Ésta ha sido anteriormente descrita como complejos formados por MMP-9 y lipocalina [139]. En el presente estudio no se demostraron diferencias significativas entre los niveles totales, proforma y la forma activa de la MMP-9 en FGC de dientes con PAC versus sanos, en contraste a lo presentado recientemente por otros investigadores. Belmar y cols. [113] observaron niveles totales de proMMP-9 significativamente elevados en el FCG de dientes con PAC en comparación con dientes sanos, y variaciones similares en la proforma y forma activa, pero sin diferencias significativas. Además, estos autores demostraron una predominancia de detección de la proforma de esta MMP en los dientes con PAC, mientras que en el presente estudio ambas formas no demostraron diferencias entre muestras de PAC y sanos. Por último, en el presente estudio no se demostró una diferencia en el porcentaje de activación para MMP-9 entre FGC de dientes con PAC y sanos. Estos datos se oponen a lo descrito en la literatura para MMP-9 en FGC de dientes con periodontitis crónica, donde se han descrito niveles y actividad significativamente mayores en FGC de pacientes enfermos en comparación con sujetos sanos [103, 129, 139-146]. 73 De modo similar a los resultados obtenidos por Belmar y cols. [113], la MMP-2 no se identificó en todas las muestras estudiadas. Sin embargo, ambas formas de MMP-2 fueron detectadas tanto en enfermos como en sanos. Por otro lado, en ambos estudios las diferencias obtenidas para las proformas y formas activas de MMP-2 no fueron significativas entre el FGC de dientes con PAC y dientes sanos. Estudios previos también han fallado en detectar niveles aumentados de MMP-2 en FGC de muestras de pacientes con periodontitis crónica [147]. Por el contrario, otros investigadores han descrito mayores niveles de MMP-2 en el FGC de pacientes con periodontitis en comparación con sujetos sanos [141-143, 146]. Estos resultados conflictivos pueden ser explicados por las diferentes técnicas experimentales utilizadas. En el presente estudio se presentan por primera vez datos en relación a niveles y actividad basal y total de MMP-13 en FGC de dientes con PAC y sanos, sin embargo, éstos no presentaron diferencias significativas. Estos resultados se contraponen con lo descrito en la literatura para otras enfermedades destructivas del periodonto, como la periodontitis crónica, donde se ha determinado la presencia de MMP-13 en FGC de pacientes enfermos con niveles significativamente mayores en comparación con sujetos sanos [102-105, 130, 135, 148, 149] y actividad patológicamente elevada en extractos de tejido gingival y FGC de sitios con periodontitis crónica comparada con el tejido periodontal y FGC de dientes sanos [102, 105]. Por el contrario, se ha demostrado que la actividad basal de la MMP-13 no varía significativamente en sitios inactivos de pacientes con periodontitis crónica en comparación con 74 sujetos sanos. En cambio, los niveles son significativamente elevados en sitios periodontales activos. La falta de diferencias en los niveles y actividad de las MMPs -2, -9 y 13 encontrados en este estudio podría explicarse de distintas formas: se ha determinado que las MMPs -9 y -13 se expresan de manera diferencial entre QRIs y GPAs [119]. En este estudio no fue posible identificar QRIs y GPAs debido a que estos diagnósticos requieren de la extirpación quirúrgica y subsiguiente estudio histopatológico de cortes seriados de las respectivas lesiones. Otro factor que podría explicar estos resultados corresponde a la diversidad de orígenes de los distintos mediadores presentes en el FGC. A diferencia del análisis de muestras tisulares, tales como las LPAs, donde los mediadores provienen de la propia lesión, los mediadores presentes en el FGC se originan a partir del periodonto periapical, periodonto marginal y de la circulación general. Asimismo, se ha demostrado que los procesos periapicales pueden inducir cambios inflamatorios sistémicos [150], que podrían manifestarse en el FGC a nivel del sujeto, determinando cambios en su composición tanto en dientes afectados como en dientes clínicamente sanos. La determinación de la influencia de estos factores en la composición del FGC requiere el desarrollo de nuevos estudios. Por primera vez se reportan niveles de α2M en FGC de dientes con PAC y sanos. No se observaron diferencias significativas entre los dos grupos en estudio. En concordancia con la literatura se encuentra el hecho de que α2M se detecta en FGC de dientes sanos, como lo describió Junker y cols. [126]. Otros 75 investigadores han reportado que no existen diferencias en los niveles de α2M en FGC de dientes con gingivitis y periodontitis crónica en sacos de moderada profundidad y sacos profundos, situación que no sería similar a la estudiada en el presente trabajo, ya que se comparan tres tipos de sitios con diversos estados inflamatorios, y no incluye un grupo sano [151]. Por otro lado, se han descrito niveles significativamente elevados de α2M en FGC de dientes con periodontitis crónica versus sanos, los que disminuyen luego del tratamiento periodontal convencional [123-125]. A partir de los datos anteriores, se fortalece la idea presentada por Junker y cols. acerca de que la producción local de α2M puede ser estimulada y aumentada por citoquinas inflamatorias, las que también aumentarían la expresión del receptor de α2M en el tejido [126]. Existen 2 formas de a2M in vivo, una total y otra procesada [152, 153]. La conversión total de a2M a especies transformadas se debe a la acción de proteasas presentes en el medio [95, 154]. La determinación de complejos inhibidores de proteasas puede ser usada como una medición de la carga proteolítica en el FGC. En la encía sana, hay un balance entre proteinasas y sus inhibidores [125]. Cualquier aumento en las proteasas, tanto de origen bacteriano como del hospedero, puede reaccionar con a2M y, por lo tanto, aumentar la fracción de complejos a2M-proteinasas [124]. La falta de diferencias entre los niveles de a2M entre el FGC de dientes con PAC y sanos podría indicar que en ambos tipos de muestras existiría una carga proteolítica similar, o bien, podría deberse a la acción de otros factores que modifican la composición del FGC. 76 A diferencia de lo descrito en el estudio realizado por Burgener y cols. [118], la CPT obtenida en FGC de pacientes con PAC no mostró diferencias significativas con la del FGC de sujetos sanos. La diferencia obtenida en el presente estudio en comparación con el estudio de Burgener y cols. podría deberse a las diferencias en la técnica metodológica utilizada. Una consideración importante en el análisis de mediadores en el FGC es el método de presentación de los datos. Actualmente existe consenso respecto que la expresión de niveles de biomarcadores específicos en el FGC como la cantidad total por un tiempo estandarizado de colección (30s) es la forma más sensible de reportarlos [155-157]. Estudios previos han evidenciado que, tanto la CPT como el volumen de FGC varían significativamente de acuerdo al estado de inflamación de los tejidos periodontales [105, 130, 135], principalmente como producto de la extravasación desde la circulación y de los procesos de síntesis y destrucción locales [27, 157]. Con respecto a los tejidos periapicales, en este estudio se identificaron las formas enzimáticas correspondientes a las MMPs -2, -9 y -13 en LPAs, en concordancia con aquellas identificadas en el FGC de dientes con PAC y estudios previos efectuados en tejido gingival de periodontitis crónica [80]. Además, se corroboraron bandas obtenidas por zimografía mediante “immunowestern blot” [116]. Por otra parte, en el presente estudio se observaron diferencias significativas entre niveles totales, proforma y forma activa de MMP-9 en LPAs versus LS [116], en conjunto con un aumento de la razón de activación para 77 MMP-9. Estos resultados se encuentran en línea con los obtenidos por Carneiro y cols. [112], los que detectaron una expresión significativamente mayor en lesiones epitelizadas y no epitelizadas en comparación con LS mediante qPCR, sugiriendo que esta MMP podría estar directamente involucrada en la destrucción/remodelación tisular durante el desarrollo de las LPAs. Estos antecedentes, en conjunto, sugieren que el aumento de la actividad MMP-9 en LPAs se debería no sólo a una mayor síntesis de la enzima, sino también al aumento de su activación. Se ha reportado que MMP-9 es una enzima cooperativa que participa en el ciclo de activación-reabsorción y formación durante la remodelación ósea y destrucción patológica de hueso [109]. Asimismo, se ha asociado con la destrucción de tejido periodontal en otras condiciones como periodontitis crónica y periimplantitis [144, 158]. Se ha descrito que la MMP-9 actuaría sobre el reclutamiento de preosteoclastos al tejido óseo y su migración desde la médula ósea para la diferenciación osteoclástica y reabsorción ósea [159]. También MMP-9 juega un importante rol en la migración de células inmunes, como ha sido demostrado por la presencia disminuida de neutrófilos, linfocitos y células dendríticas en lavado broncoalveolar (BALF) de ratones knockout para MMP-9 luego del desafío antigénico [160]. Debido a su habilidad para degradar colágeno en membranas basales vasculares, las gelatinasas están involucradas en neovascularización [161], tanto en condiciones fisiológicas como patológicas [65], proceso central durante la patogénesis de las LPAs. Además, MMP-9 libera la forma biológicamente activa del factor de crecimiento endotelial vascular 78 (VEGF), que juega un importante rol en angiogénesis. Este proceso se complementa por la directa degradación proteolítica de las proteínas de la membrana basal vascular, indicando que MMP-9, incluso de mayor manera que MMP-2, puede jugar un rol crucial en la formación de nuevos vasos sanguíneos [162]. A pesar de presentarse una tendencia a la mayor actividad de MMP-2 en LPAs en comparación con LS, ésta no fue significativa. Por el contrario, un estudio previo determinó una mayor expresión génica de MMP-2 en LPAs en comparación a LS [119]. Otros estudios han demostrado variaciones de la MMP2 en relación a cuadros periapicales agudos. MMP-2 no pudo ser detectada en muestras de exudado apical proveniente de abscesos apicales crónicos, pero sí en abscesos apicales agudos primarios y secundarios, a diferencia de MMP-9, que fue detectada en todas las muestras del estudio [114]. También se detectaron niveles discretos de expresión de MMP-2 en la fase crónica de formación de la LPA, a diferencia del estadio inicial agudo en un modelo experimental de periodontitis apical [117]. Por otro lado, se han detectado niveles aumentados de IL-1α y β en lesiones sintomáticas [163, 164] que pueden, a su vez, causar aumento de MMPs -2 y -9, los que podrían tener un rol específico en abscesos apicales agudos [114], patologías asociadas a destrucción ósea avanzada [114]. En estudios anteriores ha sido reportado que TGF-β, una de las citoquinas involucradas en el proceso de reparación, fue detectada en GPAs y 79 QRIs [165]. Se ha determinado que la producción de MMP-2 se inhibe por TGFβ, y que no afecta a los niveles de MMP-9 [166]. Al contrario, se ha reportado que TGF-β sobrerregula el mRNA de MMP-9 de manera significativa [167]. Las razones por las cuales en el presente estudio no se obtuvieron diferencias significativas en los niveles de MMP-2 en LPAs versus LS podrían relacionarse con que la expresión de MMP-2 es constitutiva, y la mayoría de los estímulos inflamatorios fallan en aumentar sus niveles de expresión ya que su gen correspondiente, al contrario del gen de MMP-9, carece de sitios de unión para factores de transcripción inflamatorios [168]. Se han descrito dos elementos presentes a nivel del promotor del gen que codifica para esta enzima, Sp1 y AP-2, que mediarían la expresión constitutiva de MMP-2 [169], con sólo una leve capacidad de ser inducida por factores de crecimiento o citoquinas [170]. Además, se ha demostrado que la función de MMP-2 puede ser intercambiable con la de otras MMPs, una hipótesis que se sostiene por la observación de que la expresión de MMP-9 está aumentada de gran manera en ratones knockout para MMP-2 [171]. La localización tisular de MMPs -9 y -2 ha sido descrita en GPAs y QRIs en estudios anteriores [110, 115-117, 119]. Leucocitos y fibroblastos residentes de los tejidos periodontales secretan MMPs, incluyendo MMPs -1, -2, -3, -8, -9 y -13 [8, 104, 111, 172]. Si bien existen estudios en PAC que han demostrado una sobreexpresión de mRNA de MMPs -2 y -9 en LPAs [112, 114, 115] y mayores niveles de actividad de proformas y formas activas de ambas MMPs han sido descritos en exudado periapical de dientes con diagnóstico clínico de abscesos 80 apicales agudos, con mayores niveles de actividad de MMP-9 en los agudos versus los crónicos [114], es primera vez que se reportan niveles y actividad de estas enzimas en LPAs, complementando resultados anteriormente obtenidos en FGC [116]. Por otro lado, trabajos anteriores describen un aumento significativo en MMPs -2, -3, -8 y -9 en pulpas inflamadas, producidas tanto por células residentes como inflamatorias [8, 110, 111]. Además, un grupo de investigadores reportó que los niveles de MMP-9 aumentaban, mientras que los de MMP-2 disminuían en pulpas inflamadas en comparación con pulpas clínicamente sanas [173]. En uno de estos estudios se propone que estas MMPs tendrían un rol más importante en pulpitis aguda que en LPAs, debido a que fueron detectadas en mayor cantidad en tejidos con patología aguda que crónica. Sin embargo, en el mismo estudio se detectaron altos niveles de MMPs, por lo que se discute que concentraciones elevadas de MMPs no siempre indican el estado de la destrucción tisular [110]. Al respecto, es fundamental considerar que la importancia biológica de niveles elevados de MMPs está determinada en última instancia por la actividad de estas enzimas, producto del balance entre sus activadores e inhibidores [174]. En el presente estudio se determinó la actividad basal, total y niveles de MMP-13 en LPAs y LS. No se observaron diferencias significativas en la actividad total ni en los niveles, pero sí se determinó una mayor actividad basal en LS que en LPAs. Se ha descrito la expresión de MMP-13 asociada a células con morfología compatible con macrófagos y plasmocitos [109, 116, 175]. Particularmente en plasmocitos, la MMP-13 se ha asociado con un fenotipo 81 específicamente destructivo, ya que la presencia de esta colagenasa se ha observado también en numerosas lesiones osteolíticas de diversa naturaleza, tales como quistes odontogénicos y plasmocitomas malignos [109]. Por otro lado, MMP-13 se ha detectado fuertemente en LPAs epitelizadas en humanos, donde pareciera contribuir a la migración de células epiteliales e invasión de tejido de granulación durante la conversión de un GPA con epitelio a un QRI [175]. Se ha propuesto además que, entre los mecanismos moleculares de la expansión de los QRIs, estaría involucrado un desbalance entre MMPs y sus inhibidores tisulares (TIMPs) [175]. De modo similar, se ha observado la expresión de MMP-13 en encía de pacientes con periodontitis crónica, donde podría tener un rol en el crecimiento proliferativo del epitelio dentro del tejido conectivo [176]. Se sabe que la actividad de MMP-13 en extractos de tejido gingival de sitios con periodontitis crónica está patológicamente elevada comparada con el tejido periodontal de dientes sanos [102, 105]. En soporte de lo anterior, en un estudio realizado en periodontitis crónica progresiva se encontró aumento de la actividad de la MMP-13 en sitios con progresión en asociación con niveles de ICTP, marcador de catabolismo óseo [104]. A diferencia de lo descrito anteriormente, en el presente estudio no se observaron diferencias significativas en la actividad total de MMP-13, e incluso se obtuvo mayor actividad basal en LS versus LPAs. Esto podría deberse a diferentes estados proliferativos del epitelio presente en las lesiones epitelizadas, como fue planteado por Leonardi y cols. [111], quienes determinaron una mayor expresión de MMP-13 en LPAs epitelizadas en comparación con lesiones no epitelizadas. 82 A partir de lo anterior se concluyó que la MMP-13 estaría involucrada en la conversión de un GPA con epitelio a un QRI, propiedad relacionada no sólo con la migración de células epiteliales, sino que también con la invasión del tejido de granulación. Al analizar la asociación entre los mediadores estudiados en relación con los parámetros demográficos se obtuvieron correlaciones positivas entre la edad, la proforma de MMP-9 y la forma activa de MMP-2 en LS. Estos resultados preliminares sugieren que la presencia o actividad de estas gelatinasas aumentaría con la edad en sujetos jóvenes. Una limitación de este estudio es la diferencia de edad encontrada entre el grupo de pacientes con PAC y el grupo de sujetos sanos. Ésta se debe a que sólo se pueden obtener dientes sanos totalmente erupcionados debido a indicación de exodoncia por ortodoncia, tratamiento que se efectúa con mayor frecuencia en sujetos jóvenes, mientras que la PAC ocurre con mayor frecuencia en adultos. Existe evidencia reciente que indica que cambios en el balance MMP/TIMP ocurre como resultado del envejecimiento fisiológico, y que el género podría ser un factor modificador significativo de este balance [177]. De hecho, se obtuvieron mayores niveles de las proformas de las MMPs -9 y -2, y de la forma activa de la MMP-2 en el género femenino en comparación con el masculino en muestras de LS, lo que podría estar indicando un rol fisiológico género-dependiente de estas MMPs en LS no descrito anteriormente. Se ha planteado como hipótesis en la literatura que numerosos factores podrían ser responsables de la diferencia de niveles de 83 MMPs y TIMPs en función al género, que incluirían susceptibilidad a hormonas, citoquinas y factores de crecimiento [177]. Los mecanismos de remodelación del tejido conectivo dependientes del género no han sido completamente dilucidados, y se requieren mayores estudios para su esclarecimiento. Por el contrario, no se encontraron asociaciones entre niveles y/o actividad de MMPs y parámetros demográficos en sujetos con PAC. Estos resultados sugieren que el aumento de la actividad gelatinolítica en las LPAs se debió primariamente a la presencia del proceso periapical. En relación al tabaquismo, las diferencias obtenidas en todos los pacientes no varían al eliminar los valores correspondientes a los pacientes fumadores, lo que indicaría que esta variable no estaría influenciando la mayor actividad de estas MMPs a nivel apical. De hecho, se ha descrito en la literatura que el tabaquismo no estaría asociado con periodontitis apical [178]. Esta falta de asociación es contraria a lo descrito para otras patologías destructivas orales, como lo sería la periodontitis crónica, situación en la que diversos estudios transversales y longitudinales han demostrado que la tasa de pérdida ósea marginal en esta patología es más avanzada en fumadores que en no fumadores [179-185]. Finalmente, se estudió la correlación entre la actividad de las MMPs -2 y 9 y el tamaño de la lesión. Se observó una correlación positiva entre el diámetro de las LPAs con las formas activas de MMPs -9 y -2. Se ha descrito en la literatura que las MMPs -2 y -9 participan en el proceso de reabsorción ósea en la remoción de la matriz ósea orgánica. Las MMPs -2 y -9 degradan gelatina, 84 que corresponde al colágeno desnaturalizado [63], producto de la acción previa de las MMPs con actividad colagenasa (MMPs -1, -8, -13 y -14). El colágeno es la mayor proteína estructural de todos los tejidos periodontales [186], y las MMPs colagenolíticas como MMPs -1, -8 y -13 son las únicas proteasas neutras que tienen la habilidad de iniciar la digestión del colágeno tipo I, el colágeno más dominante en estos compartimentos tisulares [50]. La MMP-13 es una colagenasa cuya actividad es crítica para la degradación del colágeno tipo I, el principal constituyente de la matriz extracelular periodontal apical. A nivel óseo, esta degradación es requerida para el acceso del osteoclasto al sitio de reabsorción, situación en la cual también participan las MMPs -2 y -9. Los productos resultantes de la proteólisis del colágeno intersticial realizado por la MMP-13, se desnaturan espontáneamente a temperatura ambiente y se transforman en gelatina, la cual es susceptible a la acción de las MMPs -2 y -9 [68, 139]. Consecuentemente, la MMP-2 podría estar actuando en la degradación de la MEC, favoreciendo la expansión de la lesión y, junto con algunas citoquinas, como lo son TNF-α, IL-1α, IL-1β, y el sistema RANKL/RANK/OPG [187], podría contribuir también a la destrucción ósea [117]. Además, se determinaron correlaciones positivas entre las proformas y formas activas de MMPs -2 y -9. Al respecto, se ha descrito que MMP-9 es capaz de activar a proMMP-2, proMMP-13 y su proforma in vitro y, a su vez, MMP-2 activa a MMP-13 y a su proforma in vitro, generándose una posible cascada de activación, en la cual también MMP-13 participaría mediante la activación de proMMP-2, proMMP-9 y de su proforma in vitro, que implicaría un mecanismo de 85 amplificación de la destrucción tisular [56, 107]. De este modo, la asociación entre las formas activas de MMP-2 y -9 podría reflejar su activación en el FGC durante la PAC. El infiltrado inflamatorio perirradicular está compuesto principalmente por macrófagos, PMNs, células T, B y ocasionalmente plasmocitos [2, 110]. Los linfocitos TCD4+ pueden inducir reabsorción ósea al secretar citoquinas como RANKL, un factor clave en la diferenciación y activación osteoclástica [2]. Los macrófagos son importantes reguladores de la degradación de la MEC, representando la mayor fuente de citoquinas que reabsorben tejido óseo y secretando MMPs que incluyen MMPs -2, -9 y -13 [2], y su presencia en PAC es crucial en relación a respuestas tanto protectoras como a favor del desarrollo de la lesión y perpetuación de reacciones inflamatorias [7]. Nuestro grupo de investigación ya demostró la inmunopositividad de estas MMPs en células con morfología compatible a las descritas [116], y en el presente estudio se comprueba nuevamente la expresión de estas MMPs en LPAs y no en LS. La vía de secreción de las MMPs es compleja. Se sabe que es regulada en diversas etapas (“gates”) y que la transcripción de la mayoría de los genes de MMPs es regulada por factores de crecimiento endógenos y citoquinas. Los efectos transcripcionales de los factores de crecimiento y citoquinas están mediados por diversas vías de señalización muy complejas. Se ha reportado que IL-1 α y β, y TNF- α son capaces de inducir la producción de MMPs. Diversos factores de crecimiento y citoquinas aumentan en 20 y 50 veces tanto los niveles 86 de mRNA como de proteínas. La secreción de MMPs también podría tener correlación con estos niveles de citoquinas en LPAs [11, 39, 188]. Si bien el rol histórico de las MMPs está representado por la degradación directa de la MEC, durante los últimos años se ha ido descubriendo un amplio degradoma de sustratos bioactivos susceptibles de proteólisis por estas MMPs, que incluyen citoquinas, quimioquinas, receptores de factores de crecimiento y otras MMPs, actuando como moduladores de los procesos inmunoinflamatorios [11]. Además, podrían incluso actuar de una manera protectora inhibiendo el desarrollo de la destrucción tisular inducida por bacterias, mediante el procesamiento de citoquinas y quimioquinas antiinflamatorias, como ha sido recientemente reportado en periodontitis crónica [189]. En un estudio se demostró que la inhibición de MMPs altera la inflamación pulpar y periapical, aumentando la tasa de formación de lesiones óseas periapicales [190]. En síntesis, los resultados de este estudio sostienen que la MMP-9, y posiblemente la MMP-2, en menor medida, se asocian con la patogenia de la PAC. Si bien, los niveles elevados de MMP-9 no se reflejaron en el FCG, esto podría deberse a la presencia de numerosos factores modificadores que influencian la composición del FGC. La posible influencia de la PAC en la composición del FCG es un factor que debiera tenerse en cuenta en el análisis de biomarcadores en el FGC en estudios futuros. 87 CONCLUSIONES 1. El FGC proveniente de dientes enfermos presentó una CPT similar al de dientes sanos. 2. Se identificaron las formas enzimáticas de las MMPs -9, -2 y -13 en FGC de dientes con PAC y sanos, y en muestras de homogeneizados, y se corroboró la correspondencia entre las bandas inmunorreactivas identificadas por “immunowestern blot” y zimografía en gelatina, identificadas como MMPs -9 y -2. No se observaron diferencias significativas entre los niveles totales, de proformas, formas activas y razón de activación de MMPs -9 y -2 en FGC mediante zimografía. En FGC de pacientes con PAC, se obtuvo correlación negativa entre la forma activa de MMP-9 y la forma activa de MMP-2 mientras que en FGC de pacientes sanos se obtuvo correlación negativa entre la proforma y la forma activa de la MMP-2. No se observaron diferencias significativas en la actividad basal y total de MMP-13 entre FGC de dientes con PAC y sanos. Los niveles de α2m fueron similares para ambos tipos de muestras. Los niveles totales, actividad de proforma, forma activa de MMP-9 y razón de activación de MMP-2 fueron significativamente mayores en LPAs en comparación con LS, mientras que no hubo diferencias significativas entre los niveles totales, actividad de proforma y forma activa de MMP-2, razón de activación de MMP-9 y actividad basal y 88 total de MMP-13 entre ambos tipos de muestras. 3. No se obtuvo correlación en la actividad tanto de las proformas como de las formas activas de las MMPs en estudio presentes en el FGC con las presentes en las LPAs. 4. En relación a los antecedentes clínicos, se obtuvieron correlaciones positivas entre la edad y proforma de la MMP-9 y forma activa de la MMP2 en muestras de LS. En LPAs, no se obtuvieron diferencias significativas de los niveles de los mediadores estudiados entre géneros mientras que, en LS, el género femenino presentó mayores niveles de la proforma de la MMP-9 y de la forma activa de la MMP-2. Los valores obtenidos para los mediadores en estudio no varían entre el grupo completo de pacientes y el grupo de no fumadores. Se obtuvo una correlación positiva entre el diámetro de las LPAs con las formas activas de MMPs -9 y -2. En la propuesta “existe un aumento en los niveles y actividad de las metaloproteinasas de matriz extracelular -2, -9 y -13” se comprueba que los niveles totales, actividad de proforma, forma activa de MMP-9 y razón de activación de MMP-2 fueron significativamente mayores en LPAs en comparación con LS, pero no de los demás valores en homogeneizados ni en FGC, y en relación a “niveles reducidos de α2-macroglobulina en dientes con periodontitis apical crónica en comparación con dientes controles sin patología periapical”, se demostró que ambos niveles son similares, por lo que, en 89 conjunto, los resultados expuestos en este trabajo confirman en parte la hipótesis planteada. A partir de lo anteriormente descrito, se puede concluir que las MMPs -9 y -2 tendrían un rol preponderante en la patogenia de la PAC. A pesar de que en el presente trabajo la caracterización de los mediadores en estudio en FGC no ha sido capaz de reflejar los cambios que ocurren en las LPAs, futuros estudios deben considerar la influencia de esta patología en la composición y actividad proteolítica de éste. Un conocimiento más acabado de los mecanismos involucrados en la destrucción del periodonto apical contribuirán al desarrollo de métodos diagnósticos, de tratamiento y herramientas de seguimiento de uso rutinario. Por ende, el estudio del FGC como fuente de potenciales biomarcadores de PAC representa un nuevo enfoque que requiere futura validación. 90 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Glickman, G.N., AAE Consensus Conference on Diagnostic Terminology: background and perspectives. Journal of endodontics, 2009. 35(12): p. 1619-‐ 20. Vernal, R., et al., RANKL in human periapical granuloma: possible involvement in periapical bone destruction. Oral diseases, 2006. 12(3): p. 283-‐9. Nair, P.N., Pathogenesis of apical periodontitis and the causes of endodontic failures. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists, 2004. 15(6): p. 348-‐81. Liapatas, S., M. Nakou, and D. Rontogianni, Inflammatory infiltrate of chronic periradicular lesions: an immunohistochemical study. International endodontic journal, 2003. 36(7): p. 464-‐71. Ramachandran Nair, P.N., G. Pajarola, and H.E. Schroeder, Types and incidence of human periapical lesions obtained with extracted teeth. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 1996. 81(1): p. 93-‐ 102. Matsuo, T., et al., Quantitative analysis of immunocompetent cells in human periapical lesions: correlations with clinical findings of the involved teeth. Journal of endodontics, 1992. 18(10): p. 497-‐500. Marton, I.J. and C. Kiss, Protective and destructive immune reactions in apical periodontitis. Oral microbiology and immunology, 2000. 15(3): p. 139-‐50. Wahlgren, J., et al., Matrix metalloproteinase-‐8 (MMP-‐8) in pulpal and periapical inflammation and periapical root-‐canal exudates. International endodontic journal, 2002. 35(11): p. 897-‐904. Samuelsson, B., Leukotrienes: mediators of immediate hypersensitivity reactions and inflammation. Science, 1983. 220(4597): p. 568-‐75. Mott, J.D. and Z. Werb, Regulation of matrix biology by matrix metalloproteinases. Current opinion in cell biology, 2004. 16(5): p. 558-‐64. Parks, W.C., C.L. Wilson, and Y.S. Lopez-‐Boado, Matrix metalloproteinases as modulators of inflammation and innate immunity. Nature reviews. Immunology, 2004. 4(8): p. 617-‐29. ørstavik, S.h.D., Radiological aspects of apical periodontitis. Endodontic Topics 2002. 1: p. 3–25 Loos, B.G. and S. Tjoa, Host-‐derived diagnostic markers for periodontitis: do they exist in gingival crevice fluid? Periodontology 2000, 2005. 39: p. 53-‐72. Embery, G. and R. Waddington, Gingival crevicular fluid: biomarkers of periodontal tissue activity. Advances in dental research, 1994. 8(2): p. 329-‐36. Cimasoni, G., Crevicular fluid updated. Monographs in oral science, 1983. 12: p. III-‐VII, 1-‐152. Golub, L.M., et al., The response of human sulcular leucocytes to a chemotactic challenge. A new in vivo assay. Journal of periodontal research, 1981. 16(2): p. 171-‐9. 91 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. Grbic, J.T., et al., Immunoglobulin isotypes in gingival crevicular fluid: possible protective role of IgA. Journal of periodontology, 1995. 66(1): p. 55-‐61. Gustafsson, A., B. Asman, and K. Bergstrom, Elastase and lactoferrin in gingival crevicular fluid: possible indicators of a granulocyte-‐associated specific host response. Journal of periodontal research, 1994. 29(4): p. 276-‐ 82. Lamster, I.B. and M.J. Novak, Host mediators in gingival crevicular fluid: implications for the pathogenesis of periodontal disease. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists, 1992. 3(1-‐2): p. 31-‐60. Lamster, I.B., Evaluation of components of gingival crevicular fluid as diagnostic tests. Annals of periodontology / the American Academy of Periodontology, 1997. 2(1): p. 123-‐37. Mukherjee, S., The significance of crevicular fluid. The Compendium of continuing education in dentistry, 1985. 6(8): p. 611-‐2, 614, 616. Nakashima, K., et al., A longitudinal study of various crevicular fluid components as markers of periodontal disease activity. Journal of clinical periodontology, 1996. 23(9): p. 832-‐8. Rasmussen, L., L. Hanstrom, and U.H. Lerner, Characterization of bone resorbing activity in gingival crevicular fluid from patients with periodontitis. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(1): p. 41-‐52. Shapiro, L., et al., Sulcular exudate protein levels as an indicator of the clinical inflammatory response. Journal of periodontology, 1980. 51(2): p. 86-‐7. Oringer, R.J., et al., Effect of locally delivered minocycline microspheres on markers of bone resorption. Journal of periodontology, 2002. 73(8): p. 835-‐ 42. Curtis, M.A., et al., The protein composition of gingival crevicular fluid sampled from male adolescents with no destructive periodontitis: baseline data of a longitudinal study. Journal of periodontal research, 1990. 25(1): p. 6-‐16. Adonogianaki, E., J. Mooney, and D.F. Kinane, Detection of stable and active periodontitis sites by clinical assessment and gingival crevicular acute-‐phase protein levels. Journal of periodontal research, 1996. 31(2): p. 135-‐43. Oringer, R.J., Modulation of the host response in periodontal therapy. Journal of periodontology, 2002. 73(4): p. 460-‐70. Alfano, M.C., The origin of gingival fluid. Journal of theoretical biology, 1974. 47(1): p. 127-‐36. Krasse, B., Serendipity or luck: stumbling on gingival crevicular fluid. Journal of dental research, 1996. 75(9): p. 1627-‐30. Cohen, S., Vías de la Pulpa. 8ª edición ed2002, Madrid: Editorial Elsevier Mosby. Brill, N. and B. Krasse, The Passage of Tissue Fluid into the Clinically Healthy Gingival Pocket. Acta Odontologica Escandinavica, 1958. 16(3): p. 233-‐245. Uitto, V.J., Gingival crevice fluid-‐-‐an introduction. Periodontol 2000, 2003. 31: p. 9-‐11. 92 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. Lamster, I.B. and J.K. Ahlo, Analysis of gingival crevicular fluid as applied to the diagnosis of oral and systemic diseases. Annals of the New York Academy of Sciences, 2007. 1098: p. 216-‐29. Griffiths, G.S., J.M. Wilton, and M.A. Curtis, Contamination of human gingival crevicular fluid by plaque and saliva. Archives of oral biology, 1992. 37(7): p. 559-‐64. Lamster, I.B., et al., A comparison of 4 methods of data presentation for lysosomal enzyme activity in gingival crevicular fluid. Journal of clinical periodontology, 1988. 15(6): p. 347-‐52. Ozkavaf, A., et al., Relationship between the quantity of gingival crevicular fluid and clinical periodontal status. Journal of oral science, 2000. 42(4): p. 231-‐8. Pisano, E., et al., Peptides of human gingival crevicular fluid determined by HPLC-‐ESI-‐MS. European journal of oral sciences, 2005. 113(6): p. 462-‐8. Birkedal-‐Hansen, H., Role of cytokines and inflammatory mediators in tissue destruction. Journal of periodontal research, 1993. 28(6 Pt 2): p. 500-‐10. Suomalainen, K., et al., Characteristics of neutral proteases present in inflamed human gingiva. Scandinavian journal of dental research, 1989. 97(4): p. 346-‐ 54. Heath, J.K., et al., Human gingival tissues in culture synthesize three metalloproteinases and a metalloproteinase inhibitor. Journal of periodontal research, 1982. 17(2): p. 183-‐90. Salonen, J., et al., Proliferating oral epithelial cells in culture are capable of both extracellular and intracellular degradation of interstitial collagen. Matrix, 1991. 11(1): p. 43-‐55. Sorsa, T., et al., Comparison of interstitial collagenases from human gingiva, sulcular fluid and polymorphonuclear leukocytes. Journal of periodontal research, 1988. 23(6): p. 386-‐93. DeCarlo, A.A., Jr., et al., Activation and novel processing of matrix metalloproteinases by a thiol-‐proteinase from the oral anaerobe Porphyromonas gingivalis. Journal of dental research, 1997. 76(6): p. 1260-‐ 70. Sorsa, T., et al., Identification of proteases from periodontopathogenic bacteria as activators of latent human neutrophil and fibroblast-‐type interstitial collagenases. Infection and immunity, 1992. 60(11): p. 4491-‐5. Carlsson, J., et al., Degradation of the human proteinase inhibitors alpha-‐1-‐ antitrypsin and alpha-‐2-‐macroglobulin by Bacteroides gingivalis. Infection and immunity, 1984. 43(2): p. 644-‐8. Nilsson, T., J. Carlsson, and G. Sundqvist, Inactivation of key factors of the plasma proteinase cascade systems by Bacteroides gingivalis. Infection and immunity, 1985. 50(2): p. 467-‐71. Sandholm, L., Proteases and their inhibitors in chronic inflammatory periodontal disease. Journal of clinical periodontology, 1986. 13(1): p. 19-‐26. Pollanen, M.T., J.I. Salonen, and V.J. Uitto, Structure and function of the tooth-‐ epithelial interface in health and disease. Periodontology 2000, 2003. 31: p. 12-‐31. 93 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. Birkedal-‐Hansen, H., Role of matrix metalloproteinases in human periodontal diseases. Journal of periodontology, 1993. 64(5 Suppl): p. 474-‐84. Birkedal-‐Hansen, H., et al., Matrix metalloproteinases: a review. Critical reviews in oral biology and medicine : an official publication of the American Association of Oral Biologists, 1993. 4(2): p. 197-‐250. Michaelis, J., M.C. Vissers, and C.C. Winterbourn, Human neutrophil collagenase cleaves alpha 1-‐antitrypsin. The Biochemical journal, 1990. 270(3): p. 809-‐14. Knauper, V., H. Reinke, and H. Tschesche, Inactivation of human plasma alpha 1-‐proteinase inhibitor by human PMN leucocyte collagenase. FEBS letters, 1990. 263(2): p. 355-‐7. Sorsa, T., et al., Doxycycline in the protection of serum alpha-‐1-‐antitrypsin from human neutrophil collagenase and gelatinase. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1993. 37(3): p. 592-‐4. Sorsa, T., L. Tjaderhane, and T. Salo, Matrix metalloproteinases (MMPs) in oral diseases. Oral diseases, 2004. 10(6): p. 311-‐8. Folgueras, A.R., et al., Matrix metalloproteinases in cancer: from new functions to improved inhibition strategies. The International journal of developmental biology, 2004. 48(5-‐6): p. 411-‐24. Verma, R.P. and C. Hansch, Matrix metalloproteinases (MMPs): chemical-‐ biological functions and (Q)SARs. Bioorganic & medicinal chemistry, 2007. 15(6): p. 2223-‐68. Ryan, M.E. and L.M. Golub, Modulation of matrix metalloproteinase activities in periodontitis as a treatment strategy. Periodontology 2000, 2000. 24: p. 226-‐38. Whittaker, M., et al., Design and therapeutic application of matrix metalloproteinase inhibitors. Chemical reviews, 1999. 99(9): p. 2735-‐76. Overall, C.M. and C. Lopez-‐Otin, Strategies for MMP inhibition in cancer: innovations for the post-‐trial era. Nature reviews. Cancer, 2002. 2(9): p. 657-‐ 72. Sakai, A., et al., Profiling the cytokines in gingival crevicular fluid using a cytokine antibody array. Journal of periodontology, 2006. 77(5): p. 856-‐64. Murphy, G. and H. Nagase, Progress in matrix metalloproteinase research. Molecular aspects of medicine, 2008. 29(5): p. 290-‐308. Visse, R. and H. Nagase, Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circulation research, 2003. 92(8): p. 827-‐39. Roy, R., J. Yang, and M.A. Moses, Matrix metalloproteinases as novel biomarkers and potential therapeutic targets in human cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 2009. 27(31): p. 5287-‐97. Klein, T. and R. Bischoff, Physiology and pathophysiology of matrix metalloproteases. Amino acids, 2011. 41(2): p. 271-‐90. Huxley-‐Jones, J., et al., The evolution of the vertebrate metzincins; insights from Ciona intestinalis and Danio rerio. BMC evolutionary biology, 2007. 7: p. 63. 94 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. Leeman, M.F., S. Curran, and G.I. Murray, The structure, regulation, and function of human matrix metalloproteinase-‐13. Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 2002. 37(3): p. 149-‐66. Chung, L., et al., Collagenase unwinds triple-‐helical collagen prior to peptide bond hydrolysis. The EMBO journal, 2004. 23(15): p. 3020-‐30. Choi, D.H., et al., Effects of sub-‐antimicrobial dose doxycycline therapy on crevicular fluid MMP-‐8, and gingival tissue MMP-‐9, TIMP-‐1 and IL-‐6 levels in chronic periodontitis. Journal of periodontal research, 2004. 39(1): p. 20-‐6. Nagase, H., R. Visse, and G. Murphy, Structure and function of matrix metalloproteinases and TIMPs. Cardiovascular research, 2006. 69(3): p. 562-‐ 73. Barmina, O.Y., et al., Collagenase-‐3 binds to a specific receptor and requires the low density lipoprotein receptor-‐related protein for internalization. The Journal of biological chemistry, 1999. 274(42): p. 30087-‐93. Deryugina, E.I., et al., MT1-‐MMP initiates activation of pro-‐MMP-‐2 and integrin alphavbeta3 promotes maturation of MMP-‐2 in breast carcinoma cells. Experimental cell research, 2001. 263(2): p. 209-‐23. Nguyen, M., J. Arkell, and C.J. Jackson, Activated protein C directly activates human endothelial gelatinase A. The Journal of biological chemistry, 2000. 275(13): p. 9095-‐8. Lafleur, M.A., M.M. Handsley, and D.R. Edwards, Metalloproteinases and their inhibitors in angiogenesis. Expert reviews in molecular medicine, 2003. 5(23): p. 1-‐39. Aimes, R.T. and J.P. Quigley, Matrix metalloproteinase-‐2 is an interstitial collagenase. Inhibitor-‐free enzyme catalyzes the cleavage of collagen fibrils and soluble native type I collagen generating the specific 3/4-‐ and 1/4-‐length fragments. The Journal of biological chemistry, 1995. 270(11): p. 5872-‐6. Patterson, M.L., et al., Specific collagenolysis by gelatinase A, MMP-‐2, is determined by the hemopexin domain and not the fibronectin-‐like domain. FEBS letters, 2001. 503(2-‐3): p. 158-‐62. Murphy, G., et al., Purification and characterization of a bone metalloproteinase that degrades gelatin and types IV and V collagen. Biochimica et biophysica acta, 1985. 831(1): p. 49-‐58. Chakrabarti, S. and K.D. Patel, Matrix metalloproteinase-‐2 (MMP-‐2) and MMP-‐ 9 in pulmonary pathology. Experimental lung research, 2005. 31(6): p. 599-‐ 621. McQuibban, G.A., et al., Inflammation dampened by gelatinase A cleavage of monocyte chemoattractant protein-‐3. Science, 2000. 289(5482): p. 1202-‐6. Mattu, T.S., et al., O-‐glycan analysis of natural human neutrophil gelatinase B using a combination of normal phase-‐HPLC and online tandem mass spectrometry: implications for the domain organization of the enzyme. Biochemistry, 2000. 39(51): p. 15695-‐704. Devarajan, P., et al., Structure and expression of neutrophil gelatinase cDNA. Identity with type IV collagenase from HT1080 cells. The Journal of biological chemistry, 1992. 267(35): p. 25228-‐32. 95 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90. 91. 92. 93. 94. 95. 96. Opdenakker, G., et al., Cytokine-‐mediated regulation of human leukocyte gelatinases and role in arthritis. Lymphokine and cytokine research, 1991. 10(4): p. 317-‐24. Amalinei, C., et al., Matrix metalloproteinases involvement in pathologic conditions. Romanian journal of morphology and embryology = Revue roumaine de morphologie et embryologie, 2010. 51(2): p. 215-‐28. Murphy, G. and H. Nagase, Localizing matrix metalloproteinase activities in the pericellular environment. The FEBS journal, 2011. 278(1): p. 2-‐15. Gialeli, C., A.D. Theocharis, and N.K. Karamanos, Roles of matrix metalloproteinases in cancer progression and their pharmacological targeting. The FEBS journal, 2011. 278(1): p. 16-‐27. Hadler-‐Olsen, E., et al., Regulation of matrix metalloproteinase activity in health and disease. The FEBS journal, 2011. 278(1): p. 28-‐45. Kerkela, E. and U. Saarialho-‐Kere, Matrix metalloproteinases in tumor progression: focus on basal and squamous cell skin cancer. Experimental dermatology, 2003. 12(2): p. 109-‐25. Chernov, A.V., et al., Epigenetic control of the invasion-‐promoting MT1-‐ MMP/MMP-‐2/TIMP-‐2 axis in cancer cells. The Journal of biological chemistry, 2009. 284(19): p. 12727-‐34. Nagase, H., Activation mechanisms of matrix metalloproteinases. Biological chemistry, 1997. 378(3-‐4): p. 151-‐60. Kennedy, A.M., et al., MMP13 mutation causes spondyloepimetaphyseal dysplasia, Missouri type (SEMD(MO). The Journal of clinical investigation, 2005. 115(10): p. 2832-‐42. Gomez, D.E., et al., Tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, regulation and biological functions. European journal of cell biology, 1997. 74(2): p. 111-‐22. Starckx, S., et al., A novel rationale for inhibition of gelatinase B in multiple sclerosis: MMP-‐9 destroys alpha B-‐crystallin and generates a promiscuous T cell epitope. Journal of neuroimmunology, 2003. 141(1-‐2): p. 47-‐57. Descamps, F.J., et al., Gelatinase B/matrix metalloproteinase-‐9 provokes cataract by cleaving lens betaB1 crystallin. The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2005. 19(1): p. 29-‐35. Lijnen, H.R., Plasmin and matrix metalloproteinases in vascular remodeling. Thrombosis and haemostasis, 2001. 86(1): p. 324-‐33. Barrett, A.J. and P.M. Starkey, The interaction of alpha 2-‐macroglobulin with proteinases. Characteristics and specificity of the reaction, and a hypothesis concerning its molecular mechanism. The Biochemical journal, 1973. 133(4): p. 709-‐24. Strickland, D.K., et al., Sequence identity between the alpha 2-‐macroglobulin receptor and low density lipoprotein receptor-‐related protein suggests that this molecule is a multifunctional receptor. The Journal of biological chemistry, 1990. 265(29): p. 17401-‐4. 96 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109. 110. 111. Murphy, G., et al., Matrix metalloproteinases in arthritic disease. Arthritis research, 2002. 4 Suppl 3: p. S39-‐49. Fernandez-‐Catalan, C., et al., Crystal structure of the complex formed by the membrane type 1-‐matrix metalloproteinase with the tissue inhibitor of metalloproteinases-‐2, the soluble progelatinase A receptor. The EMBO journal, 1998. 17(17): p. 5238-‐48. Stetler-‐Stevenson, W.G., Tissue inhibitors of metalloproteinases in cell signaling: metalloproteinase-‐independent biological activities. Science signaling, 2008. 1(27): p. re6. Mansell, J.P., J.F. Tarlton, and A.J. Bailey, Expression of gelatinases within the trabecular bone compartment of ovariectomized and parathyroidectomized adult female rats. Bone, 1997. 20(6): p. 533-‐8. Greenwald, R.A., et al., In vitro sensitivity of the three mammalian collagenases to tetracycline inhibition: relationship to bone and cartilage degradation. Bone, 1998. 22(1): p. 33-‐8. Ilgenli, T., et al., Gingival crevicular fluid matrix metalloproteinase-‐13 levels and molecular forms in various types of periodontal diseases. Oral diseases, 2006. 12(6): p. 573-‐9. Kiili, M., et al., Collagenase-‐2 (MMP-‐8) and collagenase-‐3 (MMP-‐13) in adult periodontitis: molecular forms and levels in gingival crevicular fluid and immunolocalisation in gingival tissue. Journal of clinical periodontology, 2002. 29(3): p. 224-‐32. Hernandez, M., et al., Matrix metalloproteinase-‐13 is highly expressed in destructive periodontal disease activity. Journal of periodontology, 2006. 77(11): p. 1863-‐70. Hernandez, M., et al., MMP-‐13 and TIMP-‐1 determinations in progressive chronic periodontitis. Journal of clinical periodontology, 2007. 34(9): p. 729-‐ 35. Ejeil, A.L., et al., Expression of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in healthy and diseased human gingiva. Journal of periodontology, 2003. 74(2): p. 188-‐95. Hernandez Rios, M., et al., Proteolytic roles of matrix metalloproteinase (MMP)-‐13 during progression of chronic periodontitis: initial evidence for MMP-‐13/MMP-‐9 activation cascade. Journal of clinical periodontology, 2009. 36(12): p. 1011-‐7. Holliday, L.S., et al., Initiation of osteoclast bone resorption by interstitial collagenase. The Journal of biological chemistry, 1997. 272(35): p. 22053-‐8. Wahlgren, J., et al., Expression and induction of collagenases (MMP-‐8 and -‐13) in plasma cells associated with bone-‐destructive lesions. The Journal of pathology, 2001. 194(2): p. 217-‐24. Shin, S.J., et al., Tissue levels of matrix metalloproteinases in pulps and periapical lesions. Journal of endodontics, 2002. 28(4): p. 313-‐5. Leonardi, R., R. Caltabiano, and C. Loreto, Collagenase-‐3 (MMP-‐13) is expressed in periapical lesions: an immunohistochemical study. International endodontic journal, 2005. 38(5): p. 297-‐301. 97 112. Carneiro, E., et al., Expression analysis of matrix metalloproteinase-‐9 in epithelialized and nonepithelialized apical periodontitis lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2009. 107(1): p. 127-‐32. 113. Belmar, M.J., et al., Gelatinolytic activity in gingival crevicular fluid from teeth with periapical lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2008. 105(6): p. 801-‐6. 114. Buzoglu, H.D., et al., The zymographic evaluation of gelatinase (MMP-‐2 and -‐9) levels in acute and chronic periapical abscesses. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2009. 108(5): p. e121-‐6. 115. Paula-‐Silva, F.W., L.A. da Silva, and Y.L. Kapila, Matrix metalloproteinase expression in teeth with apical periodontitis is differentially modulated by the modality of root canal treatment. Journal of endodontics, 2010. 36(2): p. 231-‐ 7. 116. Dezerega, A., et al., Pro-‐oxidant Status and Matrix Metalloproteinases in Apical Lesions and Gingival Crevicular Fluid as Potential Biomarkers for Asymptomatic Apical Periodontitis and endodontic treatment response. Journal of inflammation, 2012. 9(1): p. 8. 117. Corotti, M.V., et al., Immunolocalization of matrix metalloproteinases-‐2 and -‐9 during apical periodontitis development. Archives of oral biology, 2009. 54(8): p. 764-‐71. 118. Burgener, B., et al., Biologic markers for odontogenic periradicular periodontitis. Journal of endodontics, 2010. 36(8): p. 1307-‐10. 119. de Paula-‐Silva, F.W., et al., High matrix metalloproteinase activity is a hallmark of periapical granulomas. Journal of endodontics, 2009. 35(9): p. 1234-‐42. 120. Mundi, V., Expresión de Metaloproteinasas de Matriz Extracelular (MMPs) -‐2, -‐ 13 y -‐14 en dientes con Periodontitis Apical Crónica y Tejido Periapical Sano, in Departamento de Odontología Conservadora2009, Universidad de Chile: Santiago. p. 54. 121. González, P.A., Expresión de Metaloproteinasas de Matriz Extracelular-‐13 (MMP-‐13) en dientes con Periodontitis Apical Asintomática, in Departamento de Odontología Conservadora y Patología2010, Universidad de Chile: Santiago. p. 35. 122. Nishikawa, M., et al., Effects of TNFalpha and prostaglandin E2 on the expression of MMPs in human periodontal ligament fibroblasts. Journal of periodontal research, 2002. 37(3): p. 167-‐76. 123. Chen, H.Y., S.W. Cox, and B.M. Eley, Cathepsin B, alpha2-‐macroglobulin and cystatin levels in gingival crevicular fluid from chronic periodontitis patients. Journal of clinical periodontology, 1998. 25(1): p. 34-‐41. 124. Knofler, G., et al., Gingival crevicular fluid levels of aspartate aminotransferase and alpha2-‐macroglobulin before and after topical application of metronidazole or scaling and root planing. Quintessence international, 2008. 39(5): p. 381-‐9. 98 125. Condacci, I., G. Cimasoni, and C. Ahmad-‐Zadeh, Alpha 2-‐macroglobulin in sulci from healthy and inflamed human gingivae. Infection and immunity, 1982. 36(1): p. 66-‐71. 126. Junker, A., Analyse von alpha2-‐makroglobulin (α2-‐M) in gesunder gingiva und bei parodontitis. Dtsch Zahnarzti Z, 2000. 127. Birkenmeier, G., Targeting the proteinase inhibitor and immune modulatory function of human α2-‐macroglobulin. Mod. Asp. Immunobiol., 2001. 2(1): p. 5. 128. Binder, R.J., D.K. Han, and P.K. Srivastava, CD91: a receptor for heat shock protein gp96. Nature immunology, 2000. 1(2): p. 151-‐5. 129. Marcaccini, A.M., et al., Gingival crevicular fluid levels of MMP-‐8, MMP-‐9, TIMP-‐ 2, and MPO decrease after periodontal therapy. Journal of clinical periodontology, 2010. 37(2): p. 180-‐90. 130. Golub, L.M., et al., A matrix metalloproteinase inhibitor reduces bone-‐type collagen degradation fragments and specific collagenases in gingival crevicular fluid during adult periodontitis. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society ... [et al.], 1997. 46(8): p. 310-‐9. 131. Brenchley, R., et al., The TriTryp phosphatome: analysis of the protein phosphatase catalytic domains. BMC genomics, 2007. 8: p. 434. 132. Nair, P.N., Pathogenesis of apical periodontitis and the causes of endodontic failures. Crit Rev Oral Biol Med, 2004. 15(6): p. 348-‐81. 133. Hill, P.A., et al., The effects of selective inhibitors of matrix metalloproteinases (MMPs) on bone resorption and the identification of MMPs and TIMP-‐1 in isolated osteoclasts. J Cell Sci, 1994. 107 ( Pt 11): p. 3055-‐64. 134. Hill, P.A., et al., Inhibition of bone resorption in vitro by selective inhibitors of gelatinase and collagenase. Biochem J, 1995. 308 ( Pt 1): p. 167-‐75. 135. Golub, L.M., et al., Tetracyclines inhibit connective tissue breakdown by multiple non-‐antimicrobial mechanisms. Advances in dental research, 1998. 12(2): p. 12-‐26. 136. Radics, T., et al., Interleukin-‐6 and granulocyte-‐macrophage colony-‐stimulating factor in apical periodontitis: correlation with clinical and histologic findings of the involved teeth. Oral microbiology and immunology, 2003. 18(1): p. 9-‐13. 137. Shimauchi, H., et al., Development of a quantitative sampling method for periapical exudates from human root canals. Journal of endodontics, 1996. 22(11): p. 612-‐5. 138. McCauley, L.K. and R.M. Nohutcu, Mediators of periodontal osseous destruction and remodeling: principles and implications for diagnosis and therapy. Journal of periodontology, 2002. 73(11): p. 1377-‐91. 139. Pozo, P., et al., Longitudinal analysis of metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases and clinical parameters in gingival crevicular fluid from periodontitis-‐affected patients. Journal of periodontal research, 2005. 40(3): p. 199-‐207. 140. Beklen, A., et al., Gingival tissue and crevicular fluid co-‐operation in adult periodontitis. Journal of dental research, 2006. 85(1): p. 59-‐63. 141. Bildt, M.M., et al., Collagenolytic fragments and active gelatinase complexes in periodontitis. Journal of periodontology, 2008. 79(9): p. 1704-‐11. 99 142. Soell, M., R. Elkaim, and H. Tenenbaum, Cathepsin C, matrix metalloproteinases, and their tissue inhibitors in gingiva and gingival crevicular fluid from periodontitis-‐affected patients. Journal of dental research, 2002. 81(3): p. 174-‐8. 143. Sorsa, T., et al., Effects of tetracyclines on neutrophil, gingival, and salivary collagenases. A functional and western-‐blot assessment with special reference to their cellular sources in periodontal diseases. Annals of the New York Academy of Sciences, 1994. 732: p. 112-‐31. 144. Ingman, T., et al., Matrix metalloproteinases and their inhibitors in gingival crevicular fluid and saliva of periodontitis patients. Journal of clinical periodontology, 1996. 23(12): p. 1127-‐32. 145. Soder, B., et al., Levels of matrix metalloproteinases-‐8 and -‐9 with simultaneous presence of periodontal pathogens in gingival crevicular fluid as well as matrix metalloproteinase-‐9 and cholesterol in blood. Journal of periodontal research, 2006. 41(5): p. 411-‐7. 146. Grayson, R., et al., Activation of human matrix metalloproteinase 2 by gingival crevicular fluid and Porphyromonas gingivalis. Journal of clinical periodontology, 2003. 30(6): p. 542-‐50. 147. Goncalves, L.D., et al., Expression of metalloproteinases and their tissue inhibitors in inflamed gingival biopsies. Journal of periodontal research, 2008. 43(5): p. 570-‐7. 148. Biyikoglu, B., et al., Gingival crevicular fluid MMP-‐8 and -‐13 and TIMP-‐1 levels in patients with rheumatoid arthritis and inflammatory periodontal disease. Journal of periodontology, 2009. 80(8): p. 1307-‐14. 149. Tuter, G., et al., Effects of scaling and root planing and subantimicrobial dose doxycycline on gingival crevicular fluid levels of matrix metalloproteinase-‐8, -‐ 13 and serum levels of HsCRP in patients with chronic periodontitis. Journal of periodontology, 2010. 81(8): p. 1132-‐9. 150. Minczykowski, A., et al., Hydrogen peroxide and superoxide anion production by polymorphonuclear neutrophils in patients with chronic periapical granuloma, before and after surgical treatment. Clinical oral investigations, 2001. 5(1): p. 6-‐10. 151. Figueredo, C.M., et al., Increased interleukin-‐1beta concentration in gingival crevicular fluid as a characteristic of periodontitis. Journal of periodontology, 1999. 70(12): p. 1457-‐63. 152. Sottrup-‐Jensen, L., Alpha-‐macroglobulins: structure, shape, and mechanism of proteinase complex formation. The Journal of biological chemistry, 1989. 264(20): p. 11539-‐42. 153. Birkenmeier, G. and T. Stigbrand, Production of conformation-‐specific monoclonal antibodies against alpha 2 macroglobulin and their use for quantitation of total and transformed alpha 2 macroglobulin in human blood. Journal of immunological methods, 1993. 162(1): p. 59-‐67. 154. Gustafsson, A., B. Asman, and K. Bergstrom, Altered relation between granulocyte elastase and alpha-‐2-‐macroglobulin in gingival crevicular fluid 100 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166. 167. 168. 169. from sites with periodontal destruction. Journal of clinical periodontology, 1994. 21(1): p. 17-‐21. Lamster, I.B., R.L. Oshrain, and J.M. Gordon, Enzyme activity in human gingival crevicular fluid: considerations in data reporting based on analysis of individual crevicular sites. Journal of clinical periodontology, 1986. 13(8): p. 799-‐804. Hanioka, T., et al., Relationship of the substance P to indicators of host response in human gingival crevicular fluid. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(4): p. 262-‐6. Biyikoglu, B., et al., Evaluation of t-‐PA, PAI-‐2, IL-‐1beta and PGE(2) in gingival crevicular fluid of rheumatoid arthritis patients with periodontal disease. Journal of clinical periodontology, 2006. 33(9): p. 605-‐11. Puente, X.S., et al., Human and mouse proteases: a comparative genomic approach. Nature reviews. Genetics, 2003. 4(7): p. 544-‐58. Yu, X., P. Collin-‐Osdoby, and P. Osdoby, SDF-‐1 increases recruitment of osteoclast precursors by upregulation of matrix metalloproteinase-‐9 activity. Connective tissue research, 2003. 44 Suppl 1: p. 79-‐84. Lemjabbar, H., et al., Contribution of 92 kDa gelatinase/type IV collagenase in bronchial inflammation during status asthmaticus. American journal of respiratory and critical care medicine, 1999. 159(4 Pt 1): p. 1298-‐307. Nguyen, M., J. Arkell, and C.J. Jackson, Human endothelial gelatinases and angiogenesis. The international journal of biochemistry & cell biology, 2001. 33(10): p. 960-‐70. Bergers, G., et al., Matrix metalloproteinase-‐9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis. Nature cell biology, 2000. 2(10): p. 737-‐44. Matsuo, T., et al., Interleukin-‐1 alpha and interleukin-‐1 beta periapical exudates of infected root canals: correlations with the clinical findings of the involved teeth. Journal of endodontics, 1994. 20(9): p. 432-‐5. Lim, G.C., et al., Interleukin 1-‐beta in symptomatic and asymptomatic human periradicular lesions. Journal of endodontics, 1994. 20(5): p. 225-‐7. Danin, J., et al., Tumor necrosis factor-‐alpha and transforming growth factor-‐ beta1 in chronic periapical lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2000. 90(4): p. 514-‐7. Chang, Y.C., S.F. Yang, and Y.S. Hsieh, Regulation of matrix metalloproteinase-‐2 production by cytokines and pharmacological agents in human pulp cell cultures. Journal of endodontics, 2001. 27(11): p. 679-‐82. Palosaari, H., et al., Expression profile of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of MMPs in mature human odontoblasts and pulp tissue. European journal of oral sciences, 2003. 111(2): p. 117-‐27. Templeton, N.S. and W.G. Stetler-‐Stevenson, Identification of a basal promoter for the human Mr 72,000 type IV collagenase gene and enhanced expression in a highly metastatic cell line. Cancer research, 1991. 51(22): p. 6190-‐3. Qin, H., Y. Sun, and E.N. Benveniste, The transcription factors Sp1, Sp3, and AP-‐ 2 are required for constitutive matrix metalloproteinase-‐2 gene expression in 101 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. astroglioma cells. The Journal of biological chemistry, 1999. 274(41): p. 29130-‐7. Chakraborti, S., et al., Regulation of matrix metalloproteinases: an overview. Molecular and cellular biochemistry, 2003. 253(1-‐2): p. 269-‐85. Esparza, J., et al., MMP-‐2 null mice exhibit an early onset and severe experimental autoimmune encephalomyelitis due to an increase in MMP-‐9 expression and activity. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, 2004. 18(14): p. 1682-‐91. Bai, X.C., et al., Reactive oxygen species stimulates receptor activator of NF-‐ kappaB ligand expression in osteoblast. The Journal of biological chemistry, 2005. 280(17): p. 17497-‐506. Gusman, H., R.B. Santana, and M. Zehnder, Matrix metalloproteinase levels and gelatinolytic activity in clinically healthy and inflamed human dental pulps. European journal of oral sciences, 2002. 110(5): p. 353-‐7. Sorsa, T., et al., MMP activation in diagnostics of periodontitis and systemic inflammation. Journal of clinical periodontology, 2011. 38(9): p. 817-‐9. Leonardi, R., et al., Immunolocalization of CD44 adhesion molecules in human periradicular lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2000. 89(4): p. 480-‐5. Uitto, V.J., et al., Collagenase-‐3 (matrix metalloproteinase-‐13) expression is induced in oral mucosal epithelium during chronic inflammation. The American journal of pathology, 1998. 152(6): p. 1489-‐99. Isaza-‐Guzman, D.M., et al., Salivary levels of matrix metalloproteinase (MMP)-‐9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)-‐1: a pilot study about the relationship with periodontal status and MMP-‐9(-‐1562C/T) gene promoter polymorphism. Archives of oral biology, 2011. 56(4): p. 401-‐11. Bergstrom, J., J. Babcan, and S. Eliasson, Tobacco smoking and dental periapical condition. European journal of oral sciences, 2004. 112(2): p. 115-‐ 20. Bergstrom, J., S. Eliasson, and J. Dock, Exposure to tobacco smoking and periodontal health. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(1): p. 61-‐8. Bergstrom, J., S. Eliasson, and J. Dock, A 10-‐year prospective study of tobacco smoking and periodontal health. Journal of periodontology, 2000. 71(8): p. 1338-‐47. Feldman, R.S., J.E. Alman, and H.H. Chauncey, Periodontal disease indexes and tobacco smoking in healthy aging men. Gerodontics, 1987. 3(1): p. 43-‐6. Krall, E.A., A.J. Garvey, and R.I. Garcia, Alveolar bone loss and tooth loss in male cigar and pipe smokers. Journal of the American Dental Association, 1999. 130(1): p. 57-‐64. Machtei, E.E., et al., Longitudinal study of prognostic factors in established periodontitis patients. Journal of clinical periodontology, 1997. 24(2): p. 102-‐ 9. Norderyd, O., A. Hugoson, and G. Grusovin, Risk of severe periodontal disease in a Swedish adult population. A longitudinal study. Journal of clinical periodontology, 1999. 26(9): p. 608-‐15. 102 185. Payne, J.B., et al., The association of cigarette smoking with alveolar bone loss in postmenopausal females. Journal of clinical periodontology, 2000. 27(9): p. 658-‐64. 186. Listgarten, M.A., et al., Periodontal tissues and their counterparts around endosseous implants [corrected and republished with original paging, article orginally printed in Clin Oral Implants Res 1991 Jan-‐Mar;2(1):1-‐19]. Clinical oral implants research, 1991. 2(3): p. 1-‐19. 187. Kawashima, N., et al., Kinetics of RANKL, RANK and OPG expressions in experimentally induced rat periapical lesions. Oral surgery, oral medicine, oral pathology, oral radiology, and endodontics, 2007. 103(5): p. 707-‐11. 188. Salo, T., et al., Transforming growth factor-‐beta 1 up-‐regulates type IV collagenase expression in cultured human keratinocytes. The Journal of biological chemistry, 1991. 266(18): p. 11436-‐41. 189. Kuula, H., et al., Local and systemic responses in matrix metalloproteinase 8-‐ deficient mice during Porphyromonas gingivalis-‐induced periodontitis. Infection and immunity, 2009. 77(2): p. 850-‐9. 190. Tjaderhane, L., et al., The effect of chemical inhibition of matrix metalloproteinases on the size of experimentally induced apical periodontitis. International endodontic journal, 2007. 40(4): p. 282-‐9. 103 ANEXOS Y APÉNDICE 1. Anexo 1: Formulario de Consentimiento Informado 104 2. Anexo 2: Ficha clínica 105
© Copyright 2024