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PONTIFICIA UNVERSIDAD CATÓLICA DE
VALPARAISO
FACULTAD DE CIENCIAS
Modulación funcional de Lipocortina 1 en Oncorhynchus
mykiss: Un potencial marcador de inmunodepresión inducida
por condiciones de estrés
Tesis para optar al Grado de Doctor en Acuicultura
Programa Cooperativo de Doctorado en Acuicultura
Universidad de Chile
Universidad Católica del Norte
P. Universidad Católica de Valparaíso
CLAUDIA PALACIOS JIMÉNEZ
Director de Tesis: Dr. Luis Mercado Vianco
2013
1
TABLA DE CONTENIDOS
Página
I Aprobación………………………………….................................................3
II Agradecimientos…………………….………………………………...........4
III Dedicatoria…………………………………….……………...…………...5
IV Resumen…………………………………………………………………...6
V Abstract……………………………………………………………………..7
VI Contenido……………………………………………………………….....8
Marco Teórico………………………………………......................……....8
Estrés en peces ……………………………………...…………………….8
Eje Hipotálamo- Pituitario Adrenal en la respuesta al estrés……….........14
Lipocortina. Características y funciones en el sistema inmune………......19
Planteamiento del problema………………………………………………29
Hipótesis………………………………………………………...………...30
Objetivos……………………………………………………………...……31
Metodología………………………………………………………………..32
Resultados……………………………………………………………….…45
Discusión…………………………………………………………………...64
Conclusiones………………………………………………………….........72
Proyecciones……………………………………………………………….73
Bibliografía………………………………………………………………...74
Anexos……………………………………………………………………..93
VII Índice de Tablas……………………………………………………….....96
VIII Índice de Figuras………………………………………………………...97
IX
Abreviaturas…………………………………………………………......99
2
APROBACION
Los miembros de esta Comisión informante de Tesis designada para revisar la tesis
Doctoral de CLAUDIA PALACIOS JIMÉNEZ, la han encontrado satisfactoria y
recomiendan que sea aceptada como requisito parcial para obtener el grado de Doctor en
Acuicultura.
Director de tesis:
Dr. Luis Mercado Vianco
___________________________
Comisión Informante:
Dr. Nelson Díaz
___________________________
Dr. Alex Romero
___________________________
Dr. Jaime Romero
___________________________
Dr. Federico Winkler
___________________________
Dr. Gabriel Yany
___________________________
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AGRADECIMIENTOS
Qué difícil es poder agradecer en pocas palabras a tantas personas que han estado en este
camino…
Comenzaré por quien me impulsó a tomarlo, a Fanny, que siempre estuvo presente con sus
consejos y preocupación. Imposible dejar atrás a Luis Mercado, mi director de tesis,
siempre con su apoyo “paternalista”, gracias por todo lo otorgado y en todo momento.
Además siempre agradeceré a mis compañeritos del lab, tanto a los que están como a los
que ya no, Jorge, Edgar, Cricri, Byron, Paula, Bethke, Vero, Hervé, Omar, Claudio y mi
amiga Roxana, con los que compartimos tantos experimentos, arduo trabajo, bromas y
muchos momentos agradables más. Debo decir que los extraño. A todo el grupo de
Genética, que no tan solo tiene excelentes profesionales, sino que además grandes personas
con las que compartí tan amenas celebraciones y por supuesto las exquisitas especialidades
y aún más infinitas bromas, especialmente con Feña, Pato y Sandra. No puedo dejar atrás al
Laboratorio de Péptidos, en el que se trabaja mucho, en el que siempre me sentí como en
casa, en que trabajé mucho, pero muy bien tomando un tinto (café)!. También quiero
agradecer por el apoyo y gran cariño a mi otra colombiana favorita: Cony, quien siempre
está al pendiente no solo de mí, sino que de mi familia.
Y para terminar pero no por eso menos importantes: mi familia. A mis padres por haberme
dado no solo las herramientas académicas para llevar a cabo mis objetivos, sino que
también haberme guiado en formar los pilares más importantes que se tienen en la vida: la
familia y el trabajo. A mis hermanos por su apoyo y ejemplo constante. Mermes los amo
mucho.
A mis dos hombres que Dios ha puesto en mi camino y que lo llenan de luz con su amor:
Cristian con su apoyo y amor incondicional y a mi Pepi, mi niño que con tu sonrisa,
simplemente llenas todo, todo lo gris desaparece.
Finalmente agradecer a CONICYT por el financiamiento de los estudios de doctorado en
Chile, folio: 21090137.
A todos GRACIAS TOTALES!
4
A la luz de mis ojos: José Pedro
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RESUMEN
Los peces son organismos que presentan episodios de estrés ante cambios físicos en el
ambiente, interacciones animales o frente a las prácticas habituales en los cultivos
acuícolas, generando en muchas ocasiones una reducción de la resistencia a patógenos,
provocado por aumento en los niveles de cortisol plasmático, generado por el grado de
estrés del pez. Altos niveles de esta hormona tienen un efecto antiinflamatorio, el que en
vertebrados superiores está mediado por la actividad de lipocortina 1,proteína inhibidora de
la enzima fosfolipasa A2 (PLA2). Ésta actúa sobre el ácido araquidónico para generar
prostaglandinas y leucotrienos, moléculas activadoras de la respuesta inmune. Lipocortina
es una proteína de 37 kDa, dependiente de Ca2+, sintetizada en los leucocitos
polimorfonucleados de vertebrados superiores, y liberada al medio por efecto de los
glucorticoides teniendo una acción tanto autocrina como paracrina. En este trabajo se
plantea que lipocortina, en peces salmonídeos, al igual que en vertebrados superiores,
aumenta su diponiblidad y es capaz de movilizarse en las células inmunitarias en respuesta
a cortisol, el que a su vez se eleva en estados de estrés. Se demostró in vitro mediante
ELISA e inmunocitoquimica, en cultivos primarios de células de riñón cefálico y en la línea
celular RST-11, que la disponiblidad de lipocortina es inducida por cortisol, pero además se
comprobó la habilidad de lipocortina para translocarse desde el citosol hasta la membrana
plasmática. Esta translocación, también ha sido descrita en mamíferos, lipocortina situada
en la membrana plasmática puede actuar como inhibidor de PLA2, pero además posee la
habilidad de atravesar la membrana y actuar sobre el entorno como ligando de (formyl
peptide receptor-like-1), FPLR 1. En ensayos in vivo truchas sometidas a condiciones de
estrés simulado inducido por cortisol, se demostró que existe una correlación entre la
disminución de la expresión a nivel de proteínas de moléculas proinflamatorios y efectores
de respuesta inmune con el incremento de la expresión de lipocortina, destacando como
modelo el tejido branquial. Los resultados permiten demostrar que la presencia de cortisol
en peces estresados, al igual que en mamíferos, induce la expresión lipocortina, generando
6
una disminución de la respuesta inmune. Esto último permite postular a lipocortina como
un potencial marcador de inmunosupresión en peces.
ABSTRACT
Fish are organisms that present stress episodes whenever they are exposed to physical
changes in their environment, animal interactions o in regular practices in aquatic cultures,
in many cases causing a reduction of the resistance to pathogens, due to the increase of
plasma cortisol generated by the stress degree of the fish. High levels of this hormone have
an anti inflammatory effect, which in complex vertebrates is intervened by the activity of
lipocortin 1, protein that inhibits the enzyme phospholipase A2 (PLA2). This acts on the
arachidonic acid to generate prostaglandin leukotriene, molecules that activate de immune
response. Lipocortin is a protein of 37kDa, and depends on Ca2+, synthesized in the
leukocytes polymorphonuclear of complex vertebrates and released to the medium by effect
of the glucocorticoids having an action not only autocrine but also as paracrine. In this
work we state that lipocortin in salmonidean fish, just like in complex vertebrates, increases
its availability and is able to move among immune cells in response to cortisol, which in
turn increases in stressing states. We have an in vitro demonstration through ELISA in
inmunecitochemical, in primary cultures of cells of cephalic kidney and in the cell line
RST- 11, that the availability of lipocortin is induced by cortisol. Furthermore, we proved
the ability of lipocortin to translocate from citosol to the plasma membrane.
This
translocation has also been described in mammals, lipocortin situated in the plasma
membrane can act as an inhibitor of PLA2, but it also possesses the ability to trespass the
membrane and act over the environment as link of (formylpeptide receptor-like 1), FPLR 1.
In trials in vivo, trouts under simulated stress conditions induced by cortisol, we
demonstrated that there is a correlation between the decrease of the expression at a level of
proteins of molecules proinflammatory and effectors of immune response with the increase
of the expression of lipocortin, enhancing as a model the gill tissue. The results allow to
demonstrate that the presence of cortisol en stressed fish, just like in mammals, induces to
the expression of lipocortin, generation a decrease of the immune response. This last thing
allows to postulate lipocortin as a potential indicator of inmunosuppression in fish.
7
CONTENIDO
Marco Teórico
Estrés En Peces
El termino estrés resulta difícil de definir, pero se acepta que corresponde a un
“estado en que el equilibrio homeostático es amenazado y restablecido por complejas
respuestas fisiológicas y de comportamiento como una consecuencia adaptativa del
organismo.
El confinamiento, la alta densidad, manipulación y transporte son inductores del
estrés, los cuales son altamente relevantes en la acuicultura y reciben atención considerable
(Saeij et al., 2003; Binuramesh et al., 2005; Brydges et al., 2009; Ramsay et al.,
2009).Largo tiempo de exposición a un agente estresante tiene generalmente efectos
supresores en el sistema inmune y en la resistencia a enfermedades en los peces.
En cuanto a la respuesta de los peces frente al estrés, estas son comparables a los
de vertebrados terrestres. Sin embargo este grupo lo hace de forma particular, debido a las
condiciones ambientales en la cual se encuentra y a la sensibilidad propia de este grupo por
la gran cantidad de receptores presentes en el tegumento, que les permite percibir tanto
señales mecánicas como químicas. Estas respuestas generalmente involucran todos los
niveles de organización animal. En peces con estrés agudo o crónico generan respuestas a
esta situación, tales como la inhibición del crecimiento, fallas reproductivas y reducción de
la resistencia a patógenos, respuestas cuyo tipo y magnitud dependerán los agentes
estresantes y del estado de desarrollo del animal. (Bonga, 1997; Barton, 2002).
8
Uno de los factores ambientales que causan estrés es el pH. En condiciones
experimentales, la trucha de arroyo Salvelinus fontinalis ha sido expuesta hasta por seis
meses a pH bajo (alrededor de 5), desarrollando condiciones de estrés crónico. En otras
especies también se ha monitoreado los niveles de cortisol detectando altos índices, como
por ejemplo en Oncorhynchus tshawytscha con un peak de 400 ng/ml; salmón chinook 500
ng/ml y en el esturión y paddlefish 13 y 60 ng/ml respectivamente. En salmónidos con
estrés crónico,
los niveles de cortisol suelen volver a sus valores basales debido a
mecanismos regulatorios de la cinética de secreción, remoción del cortisol de la sangre y
del número de receptores presentes en los tejidos blanco (Pickering, 1990).
Las infecciones parasitarias también son causa de estrés en peces. Ha sido
estudiado el efecto de Lepeophtheirus salmonis, sobre el salmón del atlántico (Salmo
salar), demostrándose que los individuos susceptibles a esta infección presentaban mayores
niveles plasmáticos de cortisol post infección, que las muestras control. Esto fue reafirmado
experimentalmente en ensayos con individuos desafiados con el parasito, que presentaron
inmunosupresión post la administración de cortisol. Esto lleva a postular que la ausencia de
estrés existe inmunomodulación, la que se ve afectada cuando aumentan los niveles de
cortisol después de una infección (Figura 1) (Fast et al., 2006).
La alteración de la inmunomodulación por efecto de parásitos se ha evidenciado en
condiciones de infección de S. salar, con L. salmonis , donde aumentaron los niveles de
prostaglandina E2 (PGE2) en secreciones como el mucus, que indujeron una disminución
en la expresión génica de componentes inmunológicos tales como IL-1β, COX-2 y MH
clase I yII. (Fast, 2004; Fast et al., 2004; 2006; 2007).
Esta condición también se da en carpsa, susceptibles a Trypanoplasma borreli,
cuando los niveles de expresión de TNF-α, IL-1β y la oxido nitro sintasa inducible (iNOS)
se ven prácticamente inhibidos cuando existe aumento en los niveles de cortisol (Saeij et
al., 2003).
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Figura 1: Comparación de las medias de los niveles de cortisol (±SEM) entre ejemplares de salmón del
atlántico infectados con L. salmonis(■) y no infectados (♦) a través del tiempo. Tomado de (Fast, 2006).
Otra respuesta al estrés se presenta durante las actividades acuícolas como la
manipulación y el confinamiento. En estas situaciones se ha comprobado que los niveles de
cortisol pueden permanecer elevados durante días o semanas, debido a las funciones
metabólicas de esta hormona permitiendo la movilización de las reservas energéticas
(gluconeogénesis y lipogénesis), probablemente como una adaptación a la situación de
estrés, llevando a una condición de inmuno supresión de los ejemplares (Mommsen et al.,
1999).
Se ha estudiado a nivel génico el efecto del estrés por confinamiento y
disminución de los niveles de agua en los estanques. Estas condiciones
inducen la
expresión de genes que codifican proteínas que se correlacionan con los altos niveles de
estrés detectados, como es el caso de la proteína nuclear 1 (Nupr 1) que se expresa
principalmente en el hígado, donde permanece con altos niveles hasta 21 horas después del
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cese del agente estresante, similar a lo que ocurre con los niveles de cortisol, lo que
representaría una relación entre Nupr1 y cortisol (Momoda et al., 2007).
Dentro de las respuestas adaptativas al estrés que presentan los peces está la
reducción del crecimiento somático, que está regulado por muchos factores hormonales,
como los esteroides participantes de este proceso, los que pueden estar regulados
indirectamente por el cortisol, lo que ha sido reportado en Salmo gairdneri e Ictaulrus
punctatus (Pickering,1990).
A nivel metabólico, durante los periodos de estrés, en los cuales aumenta el
cortisol, también se ven incrementados los niveles plasmáticos de glucosa, porque se
encuentra acrecentada la actividad de la enzima G6Pasa que participa en las vías de
gluconeogenesis y glicolitica. Esto ha sido demostrado en Cyprinus carpio y Oreochromis
mossambicus tras inyecciones de cortisol (Mommsen, 1999, Dziewulska-Szwajkowska et
al., 2003; Sunny et al., 2003).
Otra condición de estrés en salmónidos es la transferencia al agua salada de los
ejemplares pre smolt, donde se produce un aumento en los niveles de cortisol que influye a
nivel metabólico e inmunológico. Aumenta la glucosa plasmática y disminuye el número de
leucocitos circulantes por el efecto inmunosupresor del cortisol. Este efecto en la etapa pre
smolt, estaría regulado por la hormona del crecimiento (GH) la que se encuentra
incrementada por lo que el efecto inmunosupresor del cortisol, no debiese considerarse
como un indicador de estrés en esta etapa y probablemente tampoco en la inmediatamente
posterior a esta (Taylor et al., 2007).
El cortisol es considerado la hormona que permite la adaptación al agua de mar en
los ejemplares pre smolt, ya que aumenta la tolerancia a la salinidad. Esto ha quedado
demostrado en alevines porque los niveles de cortisol aumentan paralelamente con la
habilidad osmoregulatoria de las células clorhídricas de las branquias. En estas células el
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cortisol estimula la actividad Na+ /K+ATPasa, que se ve disminuida cuando se administra
RU 486 un antagonista del cortisol, (Taylor et al., 2007; McCormick., 2001).
Se han realizado estudios para comprender la dinámica del cortisol y sus efectos en
peces en situaciones de estrés. En estos ensayos se ha realizado una estimulación inicial
seguido de una corta exposición a estrés por manipulación en salmón del atlántico (Fast et
al., 2008) y en trucha (Demers & Bayne, 1997).La recuperación de los individuos hasta los
niveles basales también se observan con frecuencia cuando se ha inducido estrés crónico
(Tort et al., 1996; Pérez –Casanov et al., 2008). De forma similar, los peces que son
cultivados parecen adaptarse al confinamiento y muestran una respuesta al estrés más baja
que los peces silvestres (Barnett & Pankhurst, 1998).
El alcance y la dinámica de la respuesta al estrés puede ser fuertemente
influenciada por el estado de desarrollo del animal, la intensidad y duración del estresor,
pudiéndose desarrollar tres tipos de respuestas: primaria, secundaria, y terciaria (Barton,
2004) tabla 1).
La respuesta primaria corresponde a la activación de los núcleos cerebrales,
células adenohipofisiarias, tejido interrenal y cromafín, lo que produce un incremento en
los niveles de catecolaminas y esteroides en el plasma. La respuesta secundaria es
considerada como una respuesta fisiológica producida por las catecolaminas y
corticosteroides, lo que provoca un aumento en el consumo de oxígeno, actividad cardiaca,
hiperglucemia, perturbaciones del equilibrio hidromineral.
La respuesta terciaria se extiende desde el organismo hasta la población, pudiendo
afectar el crecimiento, problemas en la reproducción, perturbaciones en el sistema inmune
y disminución a la tolerancia a nuevas situaciones de estrés. En ocasiones estas situaciones
no son superadas, tornándose crónicas en la población (Wendelaar Bonga, 1997; Barton,
2004; Barandica & Tort, 2008). La tabla 1 resume los efectos en peces como respuesta al
estrés (Ellis et al., 2012)
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Endocrina
Molecular
Duracion o gravedad del
estresor supera la capacidad
compensatoria; los efectos
adversos pueden ser
apreciables
3º AGOTAMIENTO
Proceso de la compensación
fisiológica gatillada para lograr
la aclimatacion, costos
bioenergeticos que pueden
reducir la capacidad de
rendimiento
2º RESISTENCIA
Hormoma del crecimiento
Serotonina
Hematotologicas
Inmunologicas
Histo-patologia
FISICA
RESPUESTA SECUNDARIA AL ESTRES
Tamaño de celulas inte
renales, diametro nuclear
RESPUESTA PRIMARIA AL ESTRES
Hidromineral
FISIOLOGICA
RESPUESTA AL ESTRÉS EN PECES
RESPUESTA TERCIARIA AL ESTRES
proteinas de
hematocrito,
fase aguda,
liberacion de c
leucrito, relacion
Cloruro, sodio,
glucosa
morfologia tejido gastrico,
itoquinas, indice
nº
potasio,
plasmatica,
celulas clorhidricas de las
fagocitico, estallido
eritrocitos/leucocit
proteinas y
acido lactico,
branquias, celulas del mucus
respiratorio,
os,nº trombocito,
osmolaridad
colesterol,
de la epidermis
lisozima,pinocitosis
sangre ,tpo de
plasmatica
glicogeni en
y complemento
coagulacion
higado y
hemoglobina
musculo.
Neurotransmisores Bioqimicass
NEUROENDOCRINA
Activacion hormonas de
Catecolaminas
estrés(catecolaminas y
(adrenalina,nor
corticoesteroides); el rol de las
adrenalina);
Receptor
hormonas del estrés es iniciar
ACTH, cortisol,
una serie de mecanismos de
glucocorticoide
hormona
compensacion fisiologica para
estimuladora
que el pez retorne a la
de melanocitos
homeostasis
1º ALARMA
Adaptación general.
Caracteristicas de las etapas
tasa de intercambio de gases
Respuesta escapatoria
consumo de alimento;actividad;
factor de
uso del espacio,uso de refugios,
condicion,indice
agresividad, comportamiento
organosomatico
reproductivo
Color de la piel
biometricas
Comportamiento
crecimiento, varaiacion de
tamaño, incidencia de
enfremedades, mortalidad ,
desempeño reproductivo
Medición de capacidades
Tabla 1. Modelo conceptual de estrés incorpora síndrome de adaptación general, junto con ejemplos de la respuesta primaria, secundaria y terciaria
estrés. Adaptado de Ellis et al, 2012
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Eje Hipotálamo –Pituitario- Adrenal en la Respuesta al Estrés.
Este eje, presente en diferentes organismos desde los seres humanos hasta los más
primitivos. Es un centro de integración que responde a estímulos ambientales e internos.
Aquí se produce un conjunto de procesos de retroalimentación que conducen a interacción
homeostática del sistema neuroendocrino que controla el estrés. En este eje se regulan
diferentes funciones del organismo como la respuesta inmune, metabolismo energético y la
conducta sexual (Stokes, 1991). Los principales componentes de este eje lo constituyen el
núcleo para-ventricular (PVN) del hipotálamo, la glándula pituitaria, ubicada en la base del
cerebro, y la glándula adrenal, que produce el cortisol que es uno de los principales
moderadores inmunológicos (Webster et al., 2002).
La cascada de estimulación comienza con el procesamiento de un estímulo
estresante por parte del hipotálamo, donde se activa el PVN secretando hormona liberadora
de la corticotropina (RHC) al sistema portal y estimulando la liberación de la hormona
adrenocorticopina (ACTH) en la glándula pituitaria anterior. La ACTH estimula la corteza
de la glándula adrenal, induciendo la expresión y liberación de cortisol (Webster et al.,
2002).
En peces los componentes del eje son hipotálamo-glándula pituitaria-células
interrenales (HPI). Estas últimas son un conjunto difuso de células equivalentes a las
células de la corteza adrenal, ubicadas en el riñón cefalico (Barandica, & Tort, 2008;
Barton, 2002). El cortisol secretado por la células interrenales constituye el principal
corticosteroide en peces y cambian
dramáticamente sus concentraciones plasmáticas
durante el estrés (Mommsen, 1999). Los niveles plasmáticos de cortisol libre circulante
dependen de proteínas de transportadoras y de la disponibilidad de los receptores en las
células diana, factores que pueden influir en la respuesta del animal frente al cortisol. Los
14
transportadores son glicoproteínas globulares a las que se une selectivamente (CBG). Estas
proteínas no transportan hormonas sexuales. Las CGB pertenecen a la superfamilia de las
proteínas inhibidoras serin proteasas (SERPINS) (Mommsen et al., 1999).
La síntesis del cortisol es similar a la descrita en mamíferos (Figura 2).
COLESTEROL
P 450 scc
PREGNENOLONA
P 450 c17
17-OH PREGNENOLONA
17-OH
PROGESTERONE
3 β-HSD
P 450 c21
11-DEOXYCORTISOL
P 450 c11
CORTISOL
Figura 2. Biosíntesis de cortisol en peces teleósteos. El área sombreada representa el compartimiento
mitocondrial, mientras que las reacciones que se producen en las zonas no sombreadas corresponden al
compartimiento citosólico. Abreviaturas 3-β HSD, 3- β hidroxiesteroide deshidrogenasa ; P450, las diversas
formas de citocromo 450 (Mommsen et al., 1999).
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Mecanismos de acción del cortisol como represor de la inflamación
El cortisol es un glucocorticoides que se liga al receptor intracelular
glucocorticoideo (GR), impulsando proteínas coactivadoras y actúa sobre diferentes
factores de transcripcionales del DNA, especialmente con NF-Kβ, a través del extremo
amino que adopta la conformación de dos dedos de zinc (McKay, 1999; Cosío et al., 2005).
En trucha se ha encontrado que el GR tiene una longitud de 758 aminoácidos, cantidad
muy similar a la encontrada en humanos, y posee un 90% de homología con la zona de
unión a DNA y un 70% en la zona de unión a la hormona (Mommsen, 1999). En el hígado
de truchas se ha descrito un complejo GR- proteínas de shock térmico (GR-HSP), con un
PM de 319 kDa, que corresponde a la forma inactiva del receptor que mantiene bloqueado
el sitio de unión a los glucocorticoides (Cosío et al., 2005). Esto sería avalado por la
presencia en mamíferos del mismo complejo (PM 330 kDa).
En mamíferos se ha encontrado evidencias que el complejo glucocorticoide-GR es
capaz de regular la expresión de genes que codifican proteínas antiinflamatorias o, en forma
indirecta por mecanismos de transrepresión, en el cual se activan indirectamente genes de
represión, por proteínas que han sido inducidas inicialmente por el complejo (Tabla 2)
(Cosío et al., 2005).
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Incremento de la transcripción genética
Proteínas
Disminución de la transcripción
genética
Enzimas
Lipocortina 1
INOS,COX 2, c PLA2
Antagonista del receptor de la IL-1
IκB-α (inhibidor del NFKB)
Receptores
Receptor de IL-2
Citoquinas
IL-10
Citoquinas
Il-1,IL-2,IL-4,IL-6,IL-8, TNFα
Tabla 2: Efecto de los glucocorticoides sobre la transcripción genética. IL: interlequina. Adaptado de Cosío,
2005.
A través de rt-PCR , en peces tratados con cortisol , se ha demostrado que este
esteroide capaz de regular la expresión de genes que codifican componentes inflamatorios
en la línea celular de macrófagos de trucha RTS-11, luego de ser tratada con cortisol más
citoquinas proinflamatorias recombinantes, como IFN γ, IL-1 β, PAMPs (LPS; poly I: C),
observándose que la co estimulación de cortisol con los agentes proinflamatorios, provoca
de forma general una disminución de la expresión de genes asociados a la respuesta
inflamatoria. La disminución de citoquinas importantes en la iniciación de la respuesta
inmune, como IL-8, es lograda por el cortisol luego de 3 horas de co-incubación, mientras
que la supresión de la sobre regulación de otros genes proinflamatorios, como IL-6 y COX2, se logra a las 6 horas. Por el contrario, el cortisol en combinación con los agentes proinflamatorias tiene un efecto sinérgico sobre la expresión de IL-10, una molécula de efecto
anti-inflamatorio, lo que sugiere que la activación de ciertas funciones de los macrófagos
17
que conducen a la resolución de la inflamación se producen en los macrófagos de peces en
respuesta al tratamiento con cortisol (Castro et al., 2011).
A través del análisis transcripcional de la piel de peces a los cuales se les administró
cortisol e infectados con Lepeophtheirus salmonis, se observó que el tratamiento hormonal
generó más cambios que la presencia de los piojos de mar. El cortisol estimuló la expresión
de genes implicados en el metabolismo de los esteroides, aminoácidos, chaperones, la
respuesta al estrés oxidativo y el metabolismo de eicosanoides y suprime la expresión
genes relacionados con la presentación de antígenos, células B y T, respuestas antivirales e
inflamatorios (Krasnov et al., 2012).
En relación a la contracción de la herida causada por la presencia de piojos de mar,
estos últimos, como el cortisol son capaces de regular gran cantidad de proteínas motoras
que pueden ser importantes en la contracción de la herida. El cortisol también es capaz de
suprimir múltiples genes implicados en la cicatrización de heridas tras la activación por el
parásito, como lo es la sub regulación de colágenos y otras proteínas estructurales. Esto
ocurre de forma paralela con
la inducción de las proteinasas que degradan matriz
extracelular (MMP9 y MMP13) (Fast et al., 2006).
Estos resultados sugieren que el estrés inducido por cortisol no afecta el nivel de
infección con el parásito, pero puede retardar la reparación de la piel. Los cambios
inducidos por el cortisol están en estrecha concordancia con el concepto actual de la
cascada de cicatrización de heridas. Los resultados a nivel transcripcional indican cambios
que concuerdan con la concepción actual que se tiene acerca de la curación de heridas. La
administración de hormonas y de piojos de mar, seguido de los perfiles de expresión génica
destacó los actores involucrados en la reparación de tejidos, muchos de los cuales no han
atraído la atención en biología de los peces hasta ahora. El estrés y los altos niveles de
cortisol cusan que los peces presenten un daño mayor debido a la supresión de respuesta
inmunes y reparación de tejidos. Dada la baja regulación de múltiples funciones inmunes y
los procedimientos empleados en reparación de tejido, el estrés puede aumentar la
vulnerabilidad de los peces a heridas e infecciones (Krasnov et al., 2012).
En individuos de Salmo salar se estudiaron los efectos de niveles crónicamente
altos de cortisol, a través de la aplicación de implantes, sobre la respuesta inmune y la
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susceptibilidad
que presentan los individuos a la infección experimental por el virus
infeccioso de la anemia pancreática (IPNV). Se evaluaron aspectos de la respuesta inmune,
entre ellos interferón gamma (IF-γ) , heat shock protein 90 (HSP-90) y heat shock protein
70 (HSP-70) y receptor glucocorticoideo (GR), los que tienden a sub regular su expresión
por el implante de cortisol. Los niveles de infección fueron mayores en peces que tenían el
implante de cortisol, lo que estaría relacionado con alguna forma que utiliza el virus para
aumentar la replicación o algún mecanismo subyacente que requiere ser mas estudiado.
También se ha descrito la asociación entre cortisol y HSP, ya que los niveles
mayores de cortisol muestran una tendencia a inhibir los niveles de HSP, probablemente a
través de un mecanismo de feed back negativo, al activarse el GR una vez que se desplaza
HSP. Esta activación de GR tendría efectos a nivel genómico, inhibiendo la expresión de
varios genes proinflamtorios. Los antecedentes aportados muestran que los niveles elevados
de cortisol son capaces de deteriorar la respuesta inmune y aumentar la prevalencia de los
individuos de S. salar a IPNV (Gadan et al., 2012).
Lipocortina. Características y funciones en el sistema inmune.
Una de las proteínas antiinflamatorias cuya expresión es aumentada por el cortisol es
lipocortina, que actúa inhibiendo la acción de la enzima fosfolipasa 2 (PLA2) sobre el
ácido araquidónico precursor de prostaglandinas y leucotrienos, potentes mediadores de la
inflamación que son producidos en respuesta a una lesión (Pepinsky et al., 1985; Valdés et
al., 2002). Lipocortina, es capaz de inhibir la acción de PLA2 al unirse a los fosfolípidos
de membrana, necesarios para que esta enzima sea capaz de actuar. Además forma parte de
la superfamilia de las anexinas, lenzimas dependientes de Ca2+ altamente conservada que se
encuentran presentes tanto en el reino animal como vegetal. Tienen un alto grado de
homología, poseen un extremo carboxilo terminal muy conservado mientras que el extremo
amino terminal las diferencia y les da la funcionalidad biológica a cada una de ellas (Jhon
et al., 2004; D´Acquisto et al., 2008; Gerke, 2002).
19
En el caso de lipocortina 1, posee 346 aminoácidos, con un PM de 37 kDa. El
extremo amino terminal posee 44 aminoácidos que incluyen sitios para la proteína kinasa C
(PKC), fosforilación para la tirosina y para la glicosilación, acetilación y proteólisis (Figura
3).
Figura 3: Estructura de lipocortina 1 en humanos y su gen. El extremo amino terminal incluye sitios
identificados para la fosforilación de serina /tirosina, y en cada uno de las cuatro repeticiones se incluyen 17
aminoácidos consenso, cruciales para la unión a Ca 2+.Diferencias en la secuencia aminoterminal en ratas y
humanos se encuentran identificadas (Buckingham et al., 2003)
La expresión de lipocortina se ve incrementada por aumentos en los niveles de
cortisol plasmático, uniéndose el cortisol a su receptor intra citoplasmático específico (RG),
estando la síntesis principalmente relacionada con mecanismos de transactivación que
utilizan la unión a un promotor CCAT (De Coupade et al., 2001).
Las regiones codificantes se encuentran caracterizadas en roedores (ratones y ratas)
en el hombre y en otros organismos, entre ellos peces tales como Salmo salar,
Oncorhynchus mykiss, Osmerus mordax y Ictalurus punctatus.
La expresión de lipocortina también puede ser gatillada por otros componentes
como LPS y citoquinas pro inflamatorias, entre las que se encuentran IL-6 y TNFα, de esta
20
forma los GC actuarían por medio de mecanismos de interferencia directa o indirecta, que
llevan a la producción de lipocortina, siendo complejos los mecanismos de su regulación
(Figura 4) (Solito et al., 1998; Castro-Caldas, 2006).
En el caso particular de IL-6 esta es capaz de regular la liberación y expresión de
lipocortina al actuar sobre su promotor génico, proporcionando un mecanismo protector
para las células durante las primeras etapas de la respuesta inflamatoria. De esta forma,
lipocortina puede ser considerada una proteína de fase aguda (Solito et al., 1998; De
Coupade et al., 2001).
Figura 4: Mecanismo de expresión en hígado en endotexemia experimental. LPS gatilla la liberación de
citoquinas proinflamatorias, incluidas TNF α, IL-6 y IL-1 β que promueven la expresión de lipocortina 1
en el hígado. Los glucocorticoides juegan un rol permisivo. Alta expresión de lipocortina 1, si es liberada
a la circulación, puede ejercer un negativo feedback sobre la liberación de TNF α e IL-1 β. (Tomado de De
Coupade et al., 2000).
Lipocotina se expresa mayormente en las células inmunitarias y corresponde a
alrededor de un 4% de las proteínas citoplasmáticas y su ubicación en la célula va a
depender del tipo celular que se trate (D´ Acquisto, 2008).
En neutrófilos se localiza predominantemente en gránulos de gelatinasa. En
mastocitos se encuentra en y sobre los α gránulos, en macrófagos y otras células encuentra
21
en el citoplasma o también asociado a membrana, citoesqueleto y núcleo (Peers et al.,
1993; Seeman et al., 1997).
La acción de lipocortina puede ser intracelular, autocrina y paracrina. En estos dos
últimos casos, la proteína debe ser externalizada de la célula tras su activación por los GC.
En el caso de los polimorfonucleados (PMN), esta proteína puede ser liberada a
través de los gránulos que estas células presentan. En células que no los poseen deben
ocupar mecanismos diferentes y se ha sugerido que podría realizarse a través del sistema
transportador cassette ABC-A1 (Morris et al., 2002; Chapman et al., 2003; Wein et al.,
2004), siendo otra posibilidad que debido a sus características anfipáticas pueda adoptar
diferentes conformaciones y pasar por poros de membrana (D´ Acquisto, 2008).
Lipocortina, para poder ser secretada por las células, debe recibir una modificación
postraduccional, para lo cual tiene que ser fosforilada en el residuo serina 27 por PKC. Este
residuo es determinante, ya que al ser cambiado por alanina, lipocortina no es capaz de ser
secretada (Buckingham, 2006; D´Acquisto et al., 2008).
El receptor al que se une lipocortina es del tipo Formil –like receptor (FPRL), que
es miembro de la familia de receptores asociados a proteína G y se expresa en células
migratorias y otros tejidos. (Solito et al., 1998; Walther et al., 2000; Castro-Caldas, 2006).
Los efectos de lipocortina son tanto en el sistema inmune innato como adaptativo. Dentro
de las características que presenta en el sistema inmune innato, se encuentra la acción que
ejerce sobre los polimorfonucleados, los que tras ser estimulado, lipocortina es secretada
ligándose a su receptor efectuando una acción autocrina sobre este tipo celular, la que es
terminada en pocos minutos por la unión de la enzima PR3, que se encuentra unida a la
membrana, y que es capaz de clivar lipocortina entre los residuos 29 y 33. Otras proteinasas
como la elastasa, también son capaces de interrumpir la acción de lipocortina de manera
análoga (D´ Acquisto, 2008).
22
Sobre neutrófilos se ha demostrado que lipocortina, al unirse a su receptor, causa la
desensibilización a cambios en las concentraciones de quimioatractantes y la inhibición de
la adhesión de estas células a los endotelios. Esto se produce, por una parte, disminuyendo
la expresión de L-selectina (Strausbaugh & Rose, 2001) y bloqueando α4β1 integrina, lo
que no permite la unión a Vascular Cell Adhesion Protein (VCAM) y por lo tanto tampoco
la adhesión celular (Solito et al., 2000).
Lipocortina también está envuelta en otros procesos como la apoptosis de este tipo
de PMN, limitando el proceso inflamatorio, lo que fue demostrado tras la administración
de lipocortina in vitro provocando un aumento en caspasa3 y tras esto la activación de una
acelerada apoptosis (Solito et al.,2003). Además, al ser secretada por estas células,
lipocortina media el reconocimiento de las células apoptóticas por parte de los macrófagos
(Sacanell et al., 2007), estimulando su actividad. De esta forma, lipocortina actúa como
modulador de la acción de neutrófilos y macrófagos (Parente & Solito, 2004).
La liberación de lipocortina por parte de los PMN ejerce una acción paracrina ya
que es capaz de actuar sobre los monocitos-macrófagos regulando aspectos como la
liberación de eicosanoides y radicales superoxido (D´Acquisto, 2008; Perretti &
D´Acquisto, 2009) (Figura 5).
23
Figura 5: Movilización de lipocortina en células activadas y su posible modo de acción. En células activadas
lipocortina es capaz de movilizarse a través de tres mecanismos: a) un cassette transportador ABC unido a
ATP, b) a través de la fosforilación en serina -27 antes de ser secretada haca el exterior; c) por fusión de
gránulos que contienen lipocortina con la membrana plasmática, con su siguiente liberación. Lipocortina
puede tener tanto acciones autocrinas, paracrinas y yuxtacrinas, activando su vía señalización a través de su
receptor como se indica en el esquema. (Adaptado de Perretti &D´Acquisto, 2009).
Los mastocitos son un sitio importante de síntesis de lipocortina,
la que se
encuentra en abundante cantidad almacenada en α gránulos y en otros compartimientos
como citoplasma y núcleo (Oliani et al., 2000). El tratamiento con glucorticoides puede
producir la liberación de la proteína, interactuar con su receptor y subregular aspectos
filológicos, como la liberación de histamina y la generación de prostaglandinas D2
(Acquisto et al., 2008).
En el sistema inmune adaptativo la distribución y función de lipocortina es diferente
que en el sistema inmune innato (D´ Acquisto, 2008). Los antecedentes sobre el sistema
inmune adaptativo están dirigidos sobre las células T, las que presentan un receptor (TCR),
el que al ser estimulado provoca la activación de las vía de señalización de las proteínas
24
mitógenas de las kinasas (MAPK), lo que lleva a la transcripción de genes para producir
IL-2, citoquina necesaria para la activación y proliferación de las células T. Producto de la
activación de las células T, lipocortina es liberada y activa su receptor FRLP, el que
produce una fina regulación de la magnitud de la respuesta gatillada por TCR. Es por esto
que cuando existe gran cantidad de lipocortina, TCR se ve estimulado fuertemente lo que
provoca la activación de la vía MAPK, causando la híper activación de las células T,
incrementándose los niveles de transcripción como AP-1 y NFKβ. La situación contraria
ocurre cuando existen bajas cantidades de lipocortina, lo que está asociado a una hipo
respuesta de las células T, a causa de la sub regulación de TCR, provocando reacciones
alérgicas o la promoción de una respuesta humoral protectora (D´ Acquisto, 2008; Perretti
& D´ Acquisto, 2009).
Dentro de los subtipos de células T se encuentran las T-helper (Th) que dependen
de variados estímulos para gatillar su diferenciación, como lo son citoquinas presentes en el
medio ambiente del sitio de inflamación. En el caso de las células Th0 in vitro, pueden
pasar a TH1 en presencia de IL-12 y anti IL-4, mientras que para llegar a Th-2, se necesita
de la presencia de IL-4 y anti interferon γ. En ausencia de estas citoquinas lipocortina puede
participar en la diferenciación de estas células. En presencia de lipocortina, se produce la
diferenciación de Th0 en Th1, mientras que en células deficientes de esta proteína gatilla la
diferenciación en Th2. Ambas situaciones son producto de la modulación de TCR por
FRLP. Esto sugiere que lipocortina juega un rol antiinflamatorio al originar células Th, rol
protectivo crucial para la eliminación de ciertos tipos de patógenos del hospedador (D´
Acquisto et al., 2007).
De acuerdo a los antecedentes, es posible pensar que para lograr los efectos
inmunosupresivos de los glucocorticoides, es necesaria la supresión de lipocortina en las
células T y en el sistema inmune innato la expresión de esta en sus células (ver Tabla 3).
25
Tabla 3 Algunas acciones de Lipocortina en la inmunidad innata y adaptativa. Adaptado de D´Acquisto,
2008.
SISTEMA INMUNE INNATO
IN VITRO
Inhibición de:
 Activación cPLA2
 Producción de eicosanoides
 Generación superoxido
 Fagocitosis
IN VIVO
Inhibición de:
 Trafico y adhesión de PMN
 Liberación y generación de
histamina
 Inflamación aguda (algunos
modelos)
 Inflamación crónica (algunos
modelos)
 Fiebre (algunos pirógenos)
Promoción de:
 Liberación de L-selectina
 Apoptosis PMN
 PMN apoptóticos
 Fagocitosis
SISTEMA INMUNE ADQUIRIDO
IN VITRO
IN VIVO
Inhibición de :
Promoción de :
 Diferenciación de células Th2
 Respuesta inflamatoria dependiente
26
de las células T
Promoción de :
 Proliferación de células T
 Señalización post TCR
 Diferenciación células Th1
Para peces como Salmo salar, Oncorhynchus mykiss, Osmerus mordax y Ictalurus
punctatus se encuentran disponibles las secuencias aminoácidicas de lipocortina, las que
presentan un alto grado de conservación con respecto a mamíferos (figura 6).
Figura 6: ClustalW entre secuencias de estructura primaria entre O. mykiss, S.salar, O. tschawytscha, Mus
musculus y H. sapiens.
27
En salmónidos se ha demostrado que lipocortina se expresa asociada a una
respuesta antiinflamatoria en la línea celular CHSE-214 infectada con el virus de la
necrosis pancreática (IPNV). Este es el primer estudio que identifica a lipococortina en
salmónidos y además asociada a la respuesta inmune, ya que su expresión dentro de la línea
celular infectada permite la permanencia del virus en las células, evitando la apoptosis,
probablemente como un mecanismo que emplea el virus para permanecer en las células
(Hwang et al., 2007) . A raíz de esto se ha identificado la secuencia aminoacídica de
lipocortina en salmónidos y su estructura, la que al igual que en humanos presenta cuatro
dominios repetidos y seis sitios de unión a Ca+2 (Figura 7).
Figura 7: Representación esquemática de lipocortina 1. Se muestran los cuatro dominios repetidos y seis
sitios de unión a calcio (Hwang et al., 2007)
Por otra parte, en individuos infectados por el virus de anemia infecciosa del salmón
(ISAV), que presentan una mortalidad temprana, intermedia y tardía tras la infección, se
examinaron branquias, hígado, corazón y bazo. En ellos, a través de microarreglo y rtPCR, se determinó que los individuos que presentaron mortalidad temprana expresaron
genes que estaban asociados a respuestas innatas antivirales tempranas y estrés celular,
mientras que la expresión de inmunoglobulinas comenzó a activarse en los individuos de
mortalidad intermedia y fue marcada en los individuos de mortalidad tardía. En el hígado
fue posible encontrar las diferencias entre los individuos de mortalidad temprana y tardía,
las que radicaban en la expresión de genes implicados en el metabolismo de los
eicosanoides y en la expresión de chaperonas. Tras el análisis de estas respuestas se
determinó que existen cuatro genes que permiten identificar de forma fenotípica los peces
que presentan mortalidad tardía, temprana y los no infectados con ISAV. Estos genes son:
proteína activadora de la lipooxigenasa 5, citocromo P-450 2K4-1, galectina-9 y annexina-1
28
(lipocortina-1), siendo tres de estos cuatro marcadores participes de la respuesta
inmunitaria. Los individuos más susceptibles se caracterizan por alta replicación viral y una
dramática activación de la respuesta inmune innata, que no proporcionó protección,
mientras que la capacidad de soportar altos niveles de la infección durante períodos
prolongados podría estar asociada con menores respuestas inflamatorias. Por otra parte, la
posterior protección y eliminación viral fue probablemente conferida por la activación de la
inmunidad adaptativa. Estos antecedentes ayudan a comprender los mecanismos
moleculares que permiten la resistencia aguda frente a ISAV (Jǿrgensen et al., 2008).
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La industria de la salmonicultura requiere del uso de parámetros cada vez más
precisos para establecer la condición de bienestar animal de los peces. Se conoce que
durante su cultivo están altamente expuestos a condiciones de estrés provocado por factores
bióticos o abióticos. Fisiológicamente, se produce en un incremento de cortisol plasmático,
lo que deriva en los efectos sistémicos de esta hormona.Uno de ello es la inmunodepresión.
Cuando los peces experimentan pérdida de robustez inmunológica quedan inmediatamente
expuestos a patógenos, mermando indicadores productivos de la calidad de la carne e
incremento su mortalidad.
En acuicultura se requiere de la disponibilidad de indicadores moleculares
evaluables en los peces en cultivo, que informen acerca del grado de inmunodepresión en
29
que se encuentran debido a estrés. Clásicamente se ha utilizado la cuantificación de
cortisol, sumado a la de glucosa plasmática, como indicadores de estrés, lo cual es cierto,
pero no implica una evaluación precisa de inmunodepresión.
Una solución a este problema de precisión en la evaluación de la condición inmune
del pez es la cuantificación de un parámetro molecular derivado de la acción del cortisol
sobre el sistema inmune. En vertebrados superiores se ha identificado el rol funcional de
lipocortina 1 como un potente inhibidor de fosfolipasa A2, que es la principal enzima
generadora de proinflamatorios derivados de ácido araquidónico. Además, lipocortina es
una molécula que puede provocar down regulation de citoquinas proinflamatorias. En
síntesis, lipocortina es un potente intermediario del cortisol para materializar eventos antiinflamatorios. Esta molécula ha sido descrita en peces, y dadas sus características
moleculares debería ejercer los mismos efectos anti-inflamatorios en vertebrados inferiores.
Para proponer lipocortina como marcador de inmunodepresión inducido en condiciones de
estrés, es necesario demostrar su disponibilidad y movilización dependiente de cortisol y
además, comprobar la asociación entre la disminución de parámetros inmunológicos y el
incremento en la producción de lipocortina en respuesta a cortisol.
HIPOTESIS DE TRABAJO
Bajo condiciones de estrés simulado por cortisol en Oncorhynchus mykiss se
incrementa la disponibilidad de Lipocortina 1 modulando la inmunodepresión.
30
OBJETIVOS
Objetivo General
Establecer que en peces inmunodeprimidos por efecto del cortisol existe un
incremento en la disponibilidad y movilización de lipocortina asociado a la caída del valor
de parámetros de respuesta inmune.
Objetivos Específicos
31
Detectar en un modelo de cultivo celular primario de trucha, la disponibilidad y
movilización de lipocortina inducida por cortisol.
Demostrar bajo condición de estrés simulado inducido por cortisol que existe una
disminución en la producción de proinflamatorios y efectores de respuesta inmune.
Comprobar la asociación entre la disminución del valor de los parámetros
inmunológicos y el incremento en la producción de lipocortina en respuesta a cortisol.
METODOLOGÍA
Diseño y síntesis de moléculas epítopes:
A partir de la secuencia de estructura primaria de lipocortina conocida para
Oncorhynchus mykiss (n° acceso GY: 185132667) se realizó la predicción de antigenicidad,
hidrofobicidad
y
flexibilidad
en
la
página
web
http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl.
Para facilitar el reconocimiento tridimensional de las secuencias epítopes se utilizó
la cristalografía de Danio rerio, que en ese momento era la secuencia disponible que poseía
mayor similitud con ANXEXINA A1 de O. mykiss.
32
El diseño de estos péptidos epitopes, apunta a que estos sean antigénicos y que
reconozcan zonas específicas de lipocortina en peces y no parte del segmento altamente
conservado entre la familia de lipocortina, correspondiente al segmento C-terminal.
Síntesis química de secuencias epítopes:
La síntesis química de péptidos epítopes fue realizada en fase sólida (SPPS),
mediante la estrategia de Fmoc (Houghten, 1985). La pureza de los péptidos fue
determinada mediante HPLC y el peso molecular fue comprobado mediante espectrometría
de masas MALDI- TOF.
Inmunización:
Se utilizaron ratones de la cepa CF-1, los que fueron obtenidos en el Instituto de
Salud Pública de Chile. La inmunización fue realizada los días 0, 7, 14 y 21, a través de
inyección intraperitoneal. La administración de los péptidos epítopes para la inmunización
se realizó a través de dos estrategias: la primera administrando en cada inmunización 60 µg
de cada péptido sintético por separado y la segunda consistió en administrarlos a forma de
mezcla, el cual contiene 60 µg de cada uno de los 4 péptido utilizados. En ambas
estrategias se agregó el péptido FIS en una relación 1:1. Este último se utiliza como un
activador de células T helper. La inyección fue preparada con suero salino 0,9% NaCl y
adyuvante completo de Freund (1:6). El día 6 se inyectó una dosis de 2, 6, 10,14Tetramethylpentadecane (Pristane, Sigma) para inducir la formación de tumor (Narváez et
al., 2009).
La obtención de los anticuerpos se realizó el día 30, para lo cual los ratones fueron
anestesiados con pequeñas dosis de cloroformo y se drenó líquido ascítico rico en IgG antipéptido epítope, el que fue centrifugado a 8000 x g durante 20 minutos, rescatándose el
sobrenadante, el que fue alicuotado y congelado a -80°C hasta su utilización.
33
Inmuno reconocimiento de epítopes y cuantificación de IgG:
Para determinar el reconocimiento cualitativo de los péptidos antigénicos, se realizó
un ensayo de dot blot, mientras que para comprobar el reconocimiento específico de la
molécula por parte de los anticuerpos, se realizó un western blot.
Dot blot
En el ensayo de dot blot se utilizó una membrana de nitrocelulosa Thermo ® de
poro 0,22 µm, en la que se sembraron 2, 1 y 0,5 µg de péptido y como control positivo de
IgG, 0,5 µL de líquido ascítico a ensayar. El bloqueo de las membranas se realizó con BSA
5% over nigth (O.N) a temperatura ambiente. Como primer anticuerpo se utilizó líquido
ascítico, el que fue probado en una dilución 1:50 en BSA 1% + Twen- 20 0,2% v/v (PBST0,2%) e incubado por 90 minutos a 37°C. El anticuerpo secundario que se empleó,
corresponde a un anticuerpo de cabra anti ratón unido a HRP (Thermo, 31430) en una
dilución de 1:7000, cuya incubación fue por 60 minutos a 37 °C. Los lavados realizados al
finalizar la incubación con cada anticuerpo fuero hechos 6 x 5 minutos con PBST- 0,05%.
Para el revelado se utilizó como sustrato 3,3'-diaminobencidina (DAB).
Western blot
Los ensayos de western blot fueron realizados con muestras correspondientes a
cultivos primarios de riñón cefálico de O. mykiss y a la línea celular RTS-11. Para ambos
tipos celulares, los controles corresponden a células sin cortisol, mientras que las inducidas
fueron tratadas con 300 ng/ml de cortisol durante 12 horas.
34
Para realizar la electroforesis correspondiente, las muestras fueron tratadas con
Laemli buffer y puestas en SDS-PAGE al 15% el cual fue sometido a 150 volts durante 80
minutos.
Posterior a esto se realizó una transferencia de las proteínas hacia una membrana de
polifluoruro de vinilideno (PVDF) Bio-Rad™ en cámara húmeda utilizando 100 volteos
durante 90 minutos.
Tanto el SDS-PAGE como la transferencia se realizaron utilizando cámaras
electroforéticas y fuente de poder Power PAC HC, ambas Bio-Rad.
El bloqueo de las membranas se realizó con BSA 5% O. N a temperatura ambiente.
Las membranas fueron incubadas utilizando como anticuerpo primario, líquido ascítico en
una concentración de 100 ng/µL, O. N a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario
empleado fue de cabra anti ratón unido a HRP (Thermo, 31430) en una dilución de
1:7000.Los lavados fueron realizados 6 veces por 5 minutos con PBST-0,2%. Para el
revelado se utilizó ECL Western blotting Substrate (Pierce) y el equipo MF-ChemisBIS 20,
Bio Imaging Systems.
Cuantificación de IgG
Este procedimiento se realizó mediante ELISA directo, para lo cual se utilizaron
placas de ELISA NUNC Poli Sorp y una curva de calibrado de IgG comercial de ratón en
diluciones seriadas a partir de 1 ng/ µL. Para la cuantificación de las muestras se realizaron
diluciones seriadas a partir de una dilución inicial de 1:450 de líquido ascítico. Tanto las
muestras como la curva de calibrado fueron preparadas en buffer carbonato 60 mM
NaHCO3 pH 9,6. Una vez sembradas, las muestras y la curva de calibrado con 100 µL por
pocillo y en duplicado para cada caso, fueron adheridas O. N. a 4°C. Posteriormente, los
pocillos fueron lavados 3 veces con PBST- 0,05% en un lavador de microplacas Microplate
Washer MW-12A (Mindray). El bloqueo de los pocillos fue con BSA (suero de albumina
bovino) 1% durante 120 minutos a 37°C, tras lo cual se lavó nuevamente como se describió
35
anteriormente. El anticuerpo utilizado para la detección fue de cabra anti ratón unido a HRP
(Thermo, #31430) en una dilución de 1:7000. Para el revelado se utilizaron 100 µL de 3,3’,
5,5;-TetraMethylBenzidine (TMB, Invitrogen) por pocillo. La reacción fue realizada en
oscuridad y a temperatura ambiente, tras lo cual fue detenida usando 50 µL de HCl 1N. La
intensidad de la reacción fue cuantificada a 450 nm usando un lector de microplacas Versa
Max Microplate Reader.
Purificación de IgG
Los líquidos ascíticos que presentaron un inmuno reconocimiento positivos fueron
sometidos a un enriquecimiento de IgG mediante cromatografía por afinidad con CnBractivated Separopore® (Bio World), según Santana et al., (2012).
Las IgG, obtenidas fueron cuantificadas utilizando una curva de calibrado realizada
con IgG comercial de ratón (Invitrogen, #10400C) mediante ELISA directo como se
describió anteriormente.
Curva de calibración anti epítopes
Para determinar la afinidad de los anticuerpos frente al epitope que deben
reconocer, se realizó una curva de calibración en la cual se pegaron en la placa de ELISA
NUNC Poli Sorp, el o los péptidos epítopes en diluciones seriadas desde 3 ng/ml, O.N a
4°C. Posteriormente los pocillos fueron lavados 3 veces con PBST-0,05% en un lavador de
microplacas. El bloqueo de los pocillos fue con PBSA 1% durante 120 minutos a 37°C, tras
lo cual se lavó nuevamente como se describió anteriormente. Se utilizaron los anticuerpos
de ratón en una concentración de 40 ng/ µL preparado en PBSA 1% e incubados por 90
minutos a 37°C y se lavó 3 veces con PBST-0,05%. La detección del anticuerpo primario
se llevó a cabo con un anticuerpo de cabra anti ratón unido a HRP (Thermo, #31430) en
una dilución de 1:7000, el que fue incubado por 60 minutos a 37 °C. Para el revelado se
36
utilizaron 100 µL de TMB por pocillo. La reacción fue realizada en oscuridad y a
temperatura ambiente, tras lo cual fue detenida usando 50 µL de HCl 1N. La intensidad de
la reacción fue cuantificada a 450 nm usando un lector de micro placas.
Cultivo primario de macrófagos de riñón anterior
Se extrajo el riñón cefálico desde individuos de O. mykiss estabilizados y sanos. Los
riñones fueron dispuestos en medio Leibovitz (L-15, Gibco) suplementado con 5% de
suero fetal bovino (FBS, Hyclone) y 2% de antibióticos (2000 U/ml Penicilina +2000
µg/ml Streptomicina, Hyclone) (L-15+), tras lo cual se obtuvo una suspensión celular, la
que fue separada por un gradiente de Percoll de 34 al 51% según Secombes, (1993). En la
interfase entre las dos densidades de Percoll utilizadas, se encuentra la fracción
correspondiente a macrófagos la que fue recuperada. Tras esto, las células fueron
concentradas mediante centrifugación a 400 g x 5 minutos, posteriormente las células
fueron lavadas con Hanks (Gibco) 1X dos veces. Finalmente el pellet celular obtenido, fue
re suspendido en 1 ml de medio L-15+, tras lo cual se estimó la viabilidad y el número
celular utilizando el método de tinción por exclusión por azul de Tripán y cámara de
Neubauer respectivamente.
Posteriormente se estableció un cultivo primario, para lo cual se ajustó la densidad
celular a 1,5*106 células /ml, depositando 1 ml en placas de cultivo Orange ® de 24
pocillos. Las células fueron
estabilizadas 24 horas en un incubador (Labtech) a
20°C.Transcurrido este tiempo se retiró el medio de cultivo y con ello las células no
adheridas, el que fue reemplazado por medio L-15+ fresco el que fue dejado hasta
completar 5 días de estabilización celular, periodo en el cual las células logran diferenciarse
a macrófagos (MacKenzie et al., 2003).
37
Inducción de lipocortina con cortisol
Una vez estabilizados los macrófagos como se mencionó anteriormente, se les retiró
el medio y fueron estimulados con cortisol (Hidrocortisona, Sigma: H-0888). Para esto el
cortisol fue disuelto en etanol absoluto de grado analítico (Merck) obteniendo una solución
stock de 1mg/ml, la cual fue mezclada con buffer fosfato salino (PBS) en una relación 1:4.
Esta última solución se aplicó en la concentración final a utilizar en cada ensayo. Estos
ensayos fueron realizados en sextuplicado y como control negativo se utilizó etanol
absoluto más PBS en la proporción indicada anteriormente.
Las concentraciones de cortisol utilizadas se realizaron tomando como referencia
300 ng/ml, valor correspondiente al rango fisiológico de cortisol en la sangre en peces in
vivo, según Barton (1991).Considerando este valor se determinó ensayar concentraciones
de 150 y 600 ng/ml. Los tiempos utilizados fueron de 2, 4, 8 y 12 horas de exposición
continua a cortisol. De esta forma fue posible estimar la concentración más apropiada de
cortisol y el tiempo necesario para obtener una mayor expresión de lipocortina.
Posterior a la inducción, el medio de cultivo fue extraído y las células lisadas con
20 mM de Tris–HCl pH 8.0; Triton X-100 0,5% v/v; Dithiothreitol (DTT) 1mM;
phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) 2mM; Cocktail inhibidor de proteasas (SigmaAldrich) 0, 2% v/v, posteriormente el lisado fue centrifugado a 110000g x 60 minutos (Air
Driven ultracetrifuge, Beckman Coulter). Se rescató el sobrenadante y el pellet celular
correspondiente a membrana celulares, el que fue lavado con ethylene glycol tetraacetic
acid (EGTA) 3 mM (Vong et al., 2007) . A las muestras obtenidas se les cuantificó las
proteínas totales obtenidas mediante el método del ácido bicinconínico (BCA, Pierce),
usando BSA como curva de calibrado, para posteriormente detectar lipocortina a través de
ELISA indirecto.
Detección de lipocortina, NKEF, IL8, iNOS y TNF α a través de ELISA indirecto
38
Para determinar la expresión a nivel de proteínas se realizó un ELISA indirecto en
el cual se emplearon 30 ng/µL proteínas totales las que fueron para este tipo de ensayo
puestas en buffer carbonato 60 mM. Se sembraron 100 µL por pocillo, en triplicado en
placas NUNC Poli Sorp, para luego dejar incubando O. N a 4°C. Posteriormente los
pocillos fueron lavados 3 veces con PBST-0,05% en un lavador de microplacas. El bloqueo
de los pocillos fue con PBSA 1% durante 120 minutos a 37°C, tras lo cual se lavó como se
describió anteriormente. Para detectar las moléculas señaladas se utilizaron anticuerpos
policlonales y policlonales mono específicos generados por el Grupo de Marcadores
Inmunológicos del Laboratorio de Genética e Inmunología Molecular de la Pontificia
Universidad Católica de Valparaíso. Todos los anticuerpos se emplearon en una
concentración de 40 ng/ µL, preparado en PBSA 1%, los que fueron incubados por 1 hora a
37°C, tras lo cual se lavó nuevamente. La detección del anticuerpo primario se llevó a cabo
con un anticuerpo de cabra anti ratón unido a HRP (Thermo, 31430) en una dilución de
1:7000, el que fue incubado por 45 minutos a 37°C. Para el revelado se utilizaron 100 µL
TMB de Invitrogen por pocillo. La reacción fue realizada en oscuridad y a temperatura
ambiente, tras lo cual fue detenida usando 50 µL de HCl 1N. La intensidad de la reacción
fue cuantificada a 450 nm usando un lector de microplacas.
Inmuno localización de lipocortina, IL-8 e iNOS: Inmuno histoquímica e
Inmunocitoquímica
La expresión de lipocortina, fué detectada mediante inmunohistoquímica e
inmunocitoquímica. Esta última se realizó tanto en células de riñón cefálico como en la
línea celular monocito-macrófago de O.mykiss RTS-11. La obtención del primer tipo
celular se realizó con el mismo protocolo descrito anteriormente y la mantención de la línea
celular RTS-11 según Gómez et al. (2009). En ambos casos, las células fueron puestas en
39
los pocillos que en el fondo tenían cubreobjetos previamente tratados con polilisina para
aumentar la adhesión celular. Las células fueron inducidas con 150, 300 y 600 ng/ml de
cortisol durante 12 horas, tras lo cual, se retiró el medio y fueron fijadas con metanol:
acetona (1:1) durante 90 segundos. Posteriormente se lavó con PBS 2x5 minutos, para
luego bloquear con PBSA 5% durante 15 minutos a temperatura ambiente.
A través de inmunohistoquímica se evaluaron las moléculas IL-8, iNOS y
lipocortina, para lo cual se utilizaron cortes histológicos de branquias de peces a los cuales
se les inyectó cortisol, PBS y peces que no recibieron tratamiento y que posteriormente se
estimularon con zymosan ex vivo, ensayo que se detalla más adelante (Figura 8). Tras la
fijación de tejidos y realización de cortes histológicos como se explica posteriormente, se
realizó el des parafinado con Neoclear (Merck) y la hidratación de los cortes con etanol
grado analítico (Merck) en concentraciones decrecientes, tras lo cual se realizó el bloqueo
de las muestras con PBSA 5% durante 30 minutos.
En ambas técnicas se emplearon anticuerpos de ratón para detectar las moléculas
del sistema inmune en las diluciones que se indican en la tabla 4. Todos fueron preparados
e incubados en PBSA 1%, O.N a 4°C. Posteriormente se realizaron lavados 1 x 5 minutos
con PBST 0,05% y 2 x 5 minutos con PBS. Se incubó con el anticuerpo secundario de
cabra anti ratón acoplado a fluorescein isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich, #F5262) en
una dilución 1:200 en PBSA 1%, durante 1 hora en oscuridad y a temperatura ambiente. Al
finalizar la incubación se lavó 1x5 con PBST 0,05% y 2 x5 con PBS. Los núcleos de las
células fueron teñidos con 10 µg/ml ioduro de propidio en PBS durante 5 minutos.
Finalmente se lavó 1x5 con PBST 0,05% y 2x5 con PBS. El montaje de las muestras se
realizó con Vecta Shield (Vector Laboratories Inc.). La observación y toma de imágenes de
las muestras se realizó en el microscopio confocal Leica TCS SP5 II Spectral Confocal
Microscope (Leica Microsystems Inc)
40
Tabla 4: Diluciones, tipo de anticuerpo y condición de anticuerpos utilizados para las técnicas de
inmunocitoquímica e inmunohistoquímica.
TIPO DE
MOLECULA
DILUCIÓN
ANTICUERPO
CONDICIÓN
Lipocortina
1:300
Policlonal
Liquido ascítico
Policlonal
Purificado por
monoespecífico
afinidad
Policlonal
Purificado por
monoespecífico
afinidad
iNOS
IL-8
1:100
1:100
Determinación de estallido respiratorio in vitro.
Los macrófagos extraídos de riñón cefálico fueron puestos en placas de 96 pocillos,
cada uno con una concentración de 1*106 células/ml, las que se dejaron adhiriendo por 24
horas a 20°C, posteriormente se les agregó 150, 300 y 600 ng/ml de cortisol, como fue
descrito con anterioridad, durante 1, 2, 4, 8 y 12 horas
Para inducir el estallido respiratorio, a la monocapa de células se les agregó 10
μg/pocillo de Pseudomonas aeruginosa durante 2 horas a 20 °C. Posteriormente se retiró el
medio y se agregó Nitro blue Tetrazolium (NBT), en una concentración de 1mg/ml en L15. La incubación fue realizada por 1 hora a 20 °C (Jørgensen & Robertsen, 1994). Una vez
transcurrido el tiempo de inducción, se extrajo el medio de cultivo y se fijaron las células
con 100 μl/pocillo de metanol 100% por 3 minutos, se lavó dos veces con metanol 70 %.
Producto de la reducción del NBT se produce formazán, el que precipita en las células. Este
41
fue extraído y disuelto, para lo cual
se agregó 120 μl/pocillo de KOH (2M) y 120
μl/pocillo de Dimethyl Sulfoxide (DMSO, Calbiochem) durante 15 minutos. Se utilizó
como blanco KOH y DMSO. La intensidad de reacción fue leída en un lector de
microplacas a 620 nm.
Estrés simulado en individuos de O. mykiss
Para determinar la expresión de lipocortina in vivo y la modificación de otros
parámetros inmunitarios se realizó un ensayo con ejemplares de O. mykiss de
aproximadamente 130-150 gramos. Se utilizaron tres grandes que consistieron en:
individuos a los cuales se les inyectó 30 µg de cortisol/pez; otro PBS y el último que no
recibió ningún tipo de inyección. Todos los grupos, al finalizar las inyecciones, fueron
puestos en estanques de recuperación durante 20 minutos para finalmente ser sacrificados
con una sobre dosis de benzocaína. Esto se realizó en los tres grupos de peces indicados
inicialmente.
Posteriormente se extrajo de los individuos los siguientes órganos: bazo, riñón
cefálico y branquias. Del riñón cefálico se extrajo la población monocito-macrófago,
mientras que de branquias y bazo se obtuvo una suspensión celular tras disgregar los tejidos
al pasarlos a través de un tamiz de 100 µm con la ayuda de un embolo. La suspensión
celular fue mantenida en medio L-15+ a 20°C hasta su estimulación. Paralelamente se
tomó una parte del tejido branquial que también fue estimulada y destinada a inmuno
histoquímica (IHQ).
Tanto las células obtenidas como las secciones de tejido como se mencionó
anteriormente, fueron estimuladas con 100 µg de zymosan durante 4 horas a 20°C. Las
células tras la estimulación, fueron rescatadas y centrifugadas a 2000 rpm x 5 minutos. El
pellet celular obtenido fue lisado con buffer de lisis que contenía 20 mM Tris, 100mM
42
NaCl, 5mM ácido etilen diamino tetra acético (EDTA), 5mM PMSF, 0,05% Tritón X-100 y
0,2% cocktail inhibidor de proteasas.
Por otra parte, las porciones de tejido fueron fijadas en solución de Bouin (ChavesPozo et al., 2008) durante 7 horas, tiempo tras el cual se lavó con etanol 70%, en el que se
mantuvieron hasta la realización de la inclusión en parafina y cortes histológicos de
aproximadamente 7µm en el laboratorio de técnicas histológicas de la Pontificia
Universidad Católica de Valparaíso. Los cortes histológicos fueron destinados a la
realización de inmunohistoquímica.
En la figura 8 se muestra un esquema en el que se resumen las actividades
realizadas en el ensayo.
43
CORTISOL
PBS
DIA 1
SACRIFICIO A
LOS 20
MINUTOS
RIÑÓN
CEFÁLICO
BAZO
BRANQUIA
EXTRACCION TISULAR Y CELULAR
Inducción 4 horas
con 100 µg
Zymosan
ELISA
IHQ
NKEF
Lipocortina
TNF a
IL-8
IL-8
iNOS
Lipocortina
iNOS
Figura 8. Esquema de trabajo para la simulación de condición de estrés, obtención de tejidos, estimulación y
evaluación de moléculas.
44
Análisis de datos
Los datos estadísticos, cálculo de media, desviación estándar y el análisis de una
variable de dos factores (ANOVA) fueron llevados a cabo utilizando Microsoft Excel 2010.
Las diferencias fueron consideradas significativas cuando el valor p de <0.05.
Para la realización del test de Pearson (Pearson´s r), primero se verificó que los
datos se correlacionan según un modelo lineal. Para determinar que r fuera distinto de 0, se
realizó una prueba de ANOVA. El modelo fue considerado significativo con un valor r de
>0.988, correspondiente a un valor p de <0.05.
45
RESULTADOS
Generación de epítopes
El análisis in silico de la secuencia primaria de aminoácidos de lipocortina de O.
mykiss, arrojó 14 péptidos potencialmente antigénicos (anexo 1). Estos fueron analizados
por cristalografía (3D), lo que determinó la elección de los 4 péptidos epítopes con mayor
probabilidad de ser candidatos para la producción de anticuerpos (Figura 9, tabla 5).
>gi|185132667|ref|NP_001117994.1|
annexin
A1a
[Oncorhynchus
mykiss]
MSFIAAFLQQTVYLGLPDDSTLPNQGTVTPDPHFSVDGDVGILDKAIKAKGVDENTIIDVLV
RRSNAQRQQIKATYEKASGKPLETALKSALKGDLEDVVLALLKTPAQYDAQQLKLAMKG
LGTDEDTLVEILASRTNKEIREIKKYKGEYKKELEDDIKSDTGADFRNALLSLCKATRNEDT
MVNQELADSDARALYEAGEKRKGTDCSVFIDILTTRSAPQLRQAFERYSKYSKVDVAKAID
LELKGDIENCLTAVVKCAGSKPAFFAEKLNLAMKGKGTRTNILTRVMVSRSEVDLARIKQE
YKKTFGKTLSQEILDDTKGDYEKILLALCGSD
Figura 9: Secuencia primaria de lipocortina. En diferentes colores se indican los distintos péptidos epítopes
seleccionados.
Tabla 5: Resumen de secuencias epítopes sintetizadas para la generación de anticuerpos policonales contra
lipocortina.
Numero de
péptido
epítope
318
319
321
323
Secuencia
Numero de
aminoácidos
GTVTPDPHFSVDGDVGILDKA
KYKGEYKKELEDDIKSDTGAD
AFERYSKYSKVDVAKAIDLE
EVDLARIKQEYKKTFGKTLS
21
21
20
20
46
Peso
Molecular
(Daltons)
2140.34
2432.63
2332.65
2354.74
Los péptidos epítopes fueron sintetizados químicamente. Su masa molecular fue la
esperada, y en su forma cruda presentaron una pureza adecuada para realizar las
inmunizaciones. En las figuras 10 a 13 se muestran las ubicaciones de los péptidos
epítopes en la estructura simulada de lipocortina 1, su peso molecular y pureza. La
predicción espacial de los epítopes escogidos se realizó en base a la predicción de la
s
estructura 3D de O. mykiss disponible.
A
C
B
Max. 2.9e5 cps.
5
mV
c
p
+Q1: 50 MCA scans from Sample 1 (2771) of PUCV-318.wiff (Turbo Spray)
318..500.DATA
i t y
,
15, 892
1035.70
2.9e5
s
2.5e5
4
t e
n
2.0e5
3
750.70
5.0e4
357.80 374.80
244.80
830.60 890.10
497.90
692.50790.50
979.50
1026.30
935.10
1117.20
1100
s
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
m/z, amu
Mass reconstruction of +Q1: 50 MCA scans from Sample 1 (2771) of PUCV-318.wiff (Turbo Spray)
26, 317
1.0e5 226.80
23, 458
I n
1.5e5
1226.20
1200
1300
1400
1500
1600
1700
2
c
p
Max. 9.3e5 cps.
10, 950
2068.35
i t y
,
9.0e5
1
t e
n
6.0e5
3,083
2051.12
5.0e5
I n
4.0e5
3.0e5
2084.65
1972.00
1499.02
2.0e5
451.35
7,283
s
7.0e5
3,458
8.0e5
0
2136.24
1.0e5
RT [min]
0.0
500
600
700
800
900
1000
1100
1200
1300
Mass, amu
1400
1500
1600
1700
1800
1900
2000
2100
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Figura 10: A: MALDI- TOF para el péptido 318, confirma el peso molecular de 2140 Da. B: pureza revelada
por HPLC. En C, la ubicación de la estructura molecular predice una situación de loop combinada con alfa
hélice.
A
C
B
30
+ Q 1 : 3 0 M C A s c a n s f r o m S a m p le 1 ( 2 7 7 2 ) o f P U C V - 3 1 9 . w if f ( T u r b o S p ra y )
M a x . 9.2 e 5 c p s .
mV
319.050.DATA
I
n
13,075
28
8 1 2.0 0
9 .0 e5
26
8 .0 e5
t
7 .0 e5
e
24
1 21 7 .3 0
6 .0 e5
n
22
5 .0 e5
s
4 .0 e5
i
3 .0 e5
20
80 6 .0 0
t
y
2 .0 e5
,
1 .0 e5
29 2 .9 0
2 7 5.8 0
c
200
34 5 .8 0
7 6 8.1 0
4 8 9 . 9 0 5 4 7 .8 0
3 6 0 .80
30 0
6 93 .3 0
400
500
6 00
7 5 2 .1 0
70 0
81 3 .3 0 8 7 1 .10 93 5 .1 0
1 1 5 2.8 0
1 0 78 .1 0
83 0 .2 0
1 17 3 .2 0
800
p
900
10 0 0
m /z , a m u
M a s s re c o n s t ru c t io n o f + Q 1 : 3 0 M C A s c a n s f ro m S a m p l e 1 ( 2 7 7 2 ) o f P U C V -3 1 9 .w if f ( T u rb o S p r a y )
1100
18
1 2 0 8.8 0
12 5 3 .80 1 2 7 5.7 0 1 34 7 .3 0
1 2 00
1 30 0
14 0 0
15 1 8 .20
1500
1 6 00
17 0 0
M a x . 7.2 e 6 c p s .
s
1 6 21 .9 9
16
14
I
12
7 .0 e6
n
6 .0 e6
10
t
6
i
2 4 32 .5 6
,
2 9 1.7 5
15 4 4 .94
4 9 3.4 7
2 0 1 2.6 0
1 3 8 4.2 8
8 6 3 .4 6
2 14 1 .0 4
2 3 75 .4 8
4 2 2 3.2 7
2 4 8 9 .4 3
c
400
600
80 0
1000
1 2 00
1 40 0
1600
1 8 00
2 00 0
2200
2400
M a ss, a m u
2 60 0
2
3 4 2 1.6 3
0 .0
28 0 0
3000
3 2 00
34 0 0
3600
3 8 00
40 0 0
4200
8,017
8 05 .0 0
1 .0 e6
6,183
y
23 0 3 .58
3,075
t
4
2 .0 e6
26,058
8
23,217
s
3 .0 e6
20,583
n
4 .0 e6
16,842
e
5 .0 e6
0
p
RT[min]
s
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Figura 11: A: MALDI- TOF para el péptido 319, confirma el peso molecular de 2432 Da, B: pureza revelada
por HPLC. En C, la ubicación de la estructura molecular predice una situación de loop y alfa hélice.
47
B
C
s
A
Max. 4.3e6 cps.
323..500.DATA
7
963.10
i t y
,
4.3e6
4.0e6
mV
15, 983
c
p
+Q1: 40 MCA scans from Sample 1 (2744) of PUCV-359.wiff (Turbo Spray)
3.5e6
s
6
n
3.0e6
t e
2.5e6
2.0e6
I n
5
1.5e6
1.0e6
469.90 579.90
381.80
679.00
849.10
698.10
954.10
1118.10 1246.30 1283.10
991.60
1100
s
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
m/z, amu
Mass reconstruction of +Q1: 40 MCA scans from Sample 1 (2744) of PUCV-359.wiff (Turbo Spray)
1200
1300
1346.30 1474.30
1400
4
1581.40
1500
1600
1700
c
p
Max. 1.4e7 cps.
3
1925.17
1.2e7
18, 825
i t y
,
1.4e7
s
2
26, 342
341.70
275.80
642.90
23, 508
5.0e5
451.90
211.80
21, 742
n
1.0e7
t e
8.0e6
2.0e6
340.74
0.0
400
450.89
600
871.04 927.07
800
1000
1271.70
1200
1622.05
1400
0
1696.02 1908.19
2060.82
1600
1800
6, 183
2, 958
I n
3850.70
4.0e6
8, 342
1
6.0e6
2000
2200
2262.22
2946.43 3177.24 3394.30 3624.88
2524.27
2400 2600
Mass, amu
2800
3000
3200
3400
3600
4326.68
3800
4000
4200
4581.83
RT [min]
4400
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Figura 12: A: MALDI- TOF para el péptido 321, confirma el peso molecular de 2332 Da, B: pureza revelada
por HPLC. En C, la ubicación de la estructura molecular predice una situación de alfa hélice seguido por un
segmento de loop y alfa hélice.
A
C
s
B
c
28 mV
321.050.DATA
15, 083
Max. 5.4e5 cps.
p
+Q1: 30 MCA scans from Sample 1 (2774) of PUCV-321.wiff (Turbo Spray)
936.10
5.4e5
,
26
i t y
5.0e5
4.5e5
24
s
4.0e5
n
937.00
3.5e5
t e
22
3.0e5
1166.70
2.5e5
I n
20
2.0e5
778.80
18
1.5e5
1.0e5
513.90
499.90
584.90
569.00
286.70300.70
5.0e4 267.70
749.00
730.00
879.00
928.10
735.50 815.50 887.10
1024.10
1100
s
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
m/z, amu
Mass reconstruction of +Q1: 30 MCA scans from Sample 1 (2774) of PUCV-321.wiff (Turbo Spray)
1159.20 1184.20
1200
16
1287.40 1357.30
1300
1400
1500
1600
1700
p
c
12
1870.16
,
1.7e6
14
Max. 1.7e6 cps.
1.6e6
n
2332.42
6
t e
1.0e6
3110.60
8.0e5
2.0e5
0.0
927.09
340.74 384.82
400
599.40
600
855.68
800
1756.04
1081.72
1000
1313.89
1200
1400
1827.26
1852.94 1908.61
1600
1800
Mass, amu
2
2204.23
1625.74
2366.25
2000
2200
2400
5, 208
1543.75
4.0e5
2, 917
1611.73
10, 158
4
I n
6.0e5
26, 067
s
8
1.2e6
23, 233
19, 300
i t y
10
1.4e6
0
2600
2800
RT [min]
3000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
Figura 13: A: MALDI- TOF para el péptido 321, confirma el peso molecular de 2332 Da, B: pureza revelada
por HPLC. En C, la ubicación de la estructura molecular predice una situación de término de alfa hélice
seguido por un segmento de loop y alfa hélice.
Obtención y validación de anticuerpos
Ratones de la cepa CF1 inmunizados con la mezcla de péptidos epítopes sintéticos
(318, 319, 321, 323), fueron capaces de generar un anticuerpo policlonal que presenta un
inmuno reconocimiento positivo frente a todos los epítopes, lo que fue demostrado por
medio de dot blot y ELISA indirecto, a través de una curva de calibración que indica
asociación lineal entre la detección por parte del anticuerpo frente a los diferentes epítopes
48
(Figura 14). La estrategia de inmunización de un mix de péptidos epítopes, permitió
generar un anticuerpo capaz de detectar la molécula completa de lipocortina (Figura 18).
A
Curva de calibración para el anticuerpo
policlonal
U ABS 450 nm
2,5
2
1,5
1
0,5
0
0
1
2
3
4
ng/ul
318
B
i) 2 µg
1µg
319
0,5 µl L.A
321
ii) 2 µg
1µg
323
0,5 µl L.A
Figura 14: Inmunoreconocimiento de péptidos epítopes por el anticuerpo policlonal a partir de líquido
ascítico mediante A: ELISA en el que se muestra el reconocimiento de todos los epítopes por parte del
anticuerpo policlonal B: Reconocimiento del mix de epítopes a través de dot blot .i) Ensayo positivo en el
que se utilizó como primer anticuerpo liquido ascítico en una dilución de 1:50 y como anticuerpo secundario
anti-IgG de ratón en una dilución de 1:7000. ii): control negativo, se sembró el mix de epítopes y solo se
utilizó anticuerpo secundario.
La inmunoespecificidad del anticuerpo para reconocer la molécula de lipocortina,
fue demostrada por western blot, ensayo en el que se reconoce una banda única de 37 kDa
(Figura 15), peso molecular correspondiente a lipocortina en salmónidos que fue detectada
en una muestra de cultivo primario de HKL inducido por cortisol.
Por otra parte, también se probó la inmunización utilizando los péptidos epítopes
por separado. Los anticuerpos obtenidos fueron capaces de funcionar como anti epítopes,
pero no fueron capaces de reconocer la molécula completa en western blot.
49
PM kDa
ST
A
B
75
55
35
25
10
Figura 15: Detección de Lipocortina en cultivo primario de riñón cefálico (HKL).ST: estándar de peso
molecular; A: Proteínas totales de leucocitos de riñón cefálico estimulados con 300 ng/ml de cortisol durante
12 horas en SDS-PAGE 15%; B: Western Blot.
Detección de lipocortina in vitro
Se logró establecer cultivos primarios de leucocitos a partir de riñón cefálico de O.
mykiss (Figura 16A), descrito por Secombes (1993).Como se indicó en la metodología, los
cultivos fueron estabilizados inicialmente por 24 horas para lograr la adhesión celular
(Figura 16B).Luego estas células fueron estabilizadas durante 5 días hasta lograr la
diferenciación correspondiente a macrófagos, lo que en este caso solo fue evaluada a través
de la morfología (Figura 16C).
50
Figura 16: Extracción de leucocitos de riñón anterior de O. mykiss y su cultivo. A: Enriquecimiento en
fracción monocito/macrófago por gradiente de Percoll, indicada en gris. B: Cultivo primario sin estabilizar. C:
Cultivo primario tras 5 días de estabilización, en el cual las células con forma estrellada corresponden a
macrófagos.
La detección de lipocortina fue llevada a cabo a través de ELISA en leucocitos de
riñón cefálico (HKL). La detección se llevó a cabo inicialmente en muestras de células
totales lisadas en las cuales no fue posible realizar una apropiada detección de lipocortina.
No obstante y debido a la característica de unión a membrana plasmática de lipocortina y
afinidad de esta por Ca+2 (Solito et al., 2003; Vong et al., 2007; Perretti & D´Aquisto,
2009) la desunión por quelación de Ca+2, permitió finalmente solubilizar lipocortina y
poder detectarla (Vong et al., 2007).
La expresión de lipocortina a nivel proteico fue detectada mediante ELISA, los
resultados muestran que en HKL, lipocortina puede ser detectada a nivel citosólico y
aumenta de forma significativa con respecto al control en todos los tiempos y
concentraciones de cortisol aplicadas (p<0,01), especialmente tras 12 horas de estimulación
(Figura 17).
A nivel de membrana lipocortina solubilizada (Figura 18) es detectable, y en todos
los casos también es significativamente mayor que en el control. También es importante
destacar que a las 8 horas de exposición a cortisol, la detección realizada a nivel de
51
membrana muestra una relación dosis dependiente, mientras que en el citosol esta es
inversa (Figura 19).
Aumento respecto al control
Detección de lipocortina en citosol de células HKL
3
2
**
*
*
** **
** *
**
1
2 horas
8 horas
12 horas
150 ng/ml
cortisol
300 ng/ml
cortisol
600 ng/ml
cortisol
Tiempos de inducción
Figura 17: Detección de lipocortina en el citosol en cultivo primario de HKL mediante ELISA.
Aumento respecto al control
Detección de lipocortina en membrana de células HKL
3
**
** *
2
*
*
** **
**
150 ng/ml
cortisol
1
2 horas
8 horas
12 horas
Tiempos de inducción
300 ng/ml
cortisol
600 ng/ml
cortisol
Figura 18: Detección de lipocortina en membranas de cultivo primario de HKL mediante ELISA.
52
Aumento respecto al control
2
*
**
**
**
**
*
1
150
300
ng/ml de cortisol
Citosol
600
Membrana
Figura 19: Detección de lipocortina tras 8 horas de exposición al cortisol. En la figura es posible apreciar la
relación dosis dependiente de la detección de lipoccortina en la membrana e inversa en el citosol.
Para validar la detección de lipocortina inducida en HKL, esta fue inmuno detectada
por western blot (Figura 20), revelándose su ubicación en el peso molecular esperado.
Adicionalmente, lo mismo fue comprobado en la línea celular RTS-11.
A
B
C
37 KDa
HKL
37 KDa
RTS-11
Figura 20. Western blot de lisado de células RTS-11 estimuladas con cortisol: línea A: control; línea B:
inducido 10 µl de proteína totales; línea C: inducido 20 µl de proteínas totales.
53
Para demostrar la translocación de lipocortina a la membrana plasmática, se utilizó
como modelo la línea celular RTS-11, en la que se ha demostrado el mismo
comportamiento para la detección de lipocortina inducida por cortisol. Lipocortina fue
detectada mediante inmunofluorescencia en microscopia confocal, luego de 12 horas,
tiempo en el cual
a través de ELISA, se observa a mayor detección de lipocortina
utilizando las distintas concentraciones de cortisol an tes mencionadas. En la figura 21 IA
es posible apreciar en verde el marcaje positivo de lipocortina en el control. Este marcaje
positivo para lipococortina se ve notoriamente incrementado hacia la membrana plasmática
a medida que se incrementó la concentración de cortisol (Figura 21 I B-D). Para cuantificar
este incremento, se determinó la intensidad de inmunofluorecencia (IF) con respecto al
control, lo que permitió determinar un máximo de IF en la condición de 300 ng /ml de
cortisol (Figura 21 II).
Con el fin de determinar la distribución celular de lipocortina en presencia de
cortisol, se hizo un análisis de la distribución de la fluorescencia comparando células RTS11 control e incubadas con 300 ng/ml de cortisol (Figura 21 III). En la imagen se observa
claramente como en los extremos de la célula se incrementa significativamente la
intensidad de la fluorescencia.
54
I
A
II
B
Aumento de de fluorescencia sobre el control
Intensidad IF para RTS-11
3
2
1
A
C
D
B
C
D
Condiciones
III
Distribución de Fluorescencia en células RTS-11
Intensidad Fluorescencia (URF)
300
200
100
1
10
19
28
37
46
55
64
73
82
91
100
109
118
127
136
145
154
163
172
181
190
199
208
217
0
µm
A
C
Figura 21: I. Inmunolocalización de lipocortina en línea celular RTS-11 a través de inmunofluorescencia. A)
Control; B),C) y D), células estimuladas con 150, 300 y 600 ng/ml de cortisol respectivamente durante 12
horas. En verde, inmunoreconocimiento positivo de lipocortina, en rojo tinción de núcleo con ioduro de
propidio. II. Intensidad relativa de inmuno fluorescencia (IF) para cada imagen señalada en I. III.
Distribución de intensidad relativa de la fluorescencia en las células señaladas en azul para A y C.
En HKL fue demostrado que tras la aplicación de cortisol, se produce un aumento
en la detección de lipocortina, pero además se desea demostrar que el tratamiento con
cortisol es capaz de generar inmunodepresión. Para esto, el parámetro inmunológico
evaluado fue la capacidad de macrófagos para generar estrés oxidativo, evaluada a través
del estallido respiratorio. Como resultado se pudo apreciar la disminución del estallido
respiratorio en una relación dependiente del tiempo de exposición a cortisol y no de la
concentración con la cual sean tratadas las células (Figura 22).
55
Estallido respiratorio en HKL
1 hora
2 horas
4 horas
6 horas
8 horas
Disminución respecto al control
0
*
-0,25
*
*
*
* *
* *
*
*
-0,5
150 ng/ml cortisol
300 ng/ml cortisol
600 ng/ml cortisol
Figura 22: Estallido respiratorio en células HKL expuestas a cortisol hasta por 8 horas y concentraciones
crecientes de cortisol.
Respuesta inmunitaria en peces sometidos a estrés simulado
En peces a los cuales se les simularon condiciones de estrés como se indicó en la
metodología, fue posible detectar a través de ELISA lipocortina y otras moléculas de la
respuesta inmune que fueron utilizadas como parámetros inmunológicos. La evaluación de
la respuesta inmunitaria fue llevada a cabo en células de branquias, bazo y leucocitos
provenientes de riñón cefálico.
Las moléculas que se utilizaron para evaluar el sistema inmune de los peces son:
TNF-α, que corresponde a una citoquina que participa en la mediación necesaria para la
liberación de otras citoquinas pro inflamatorias; la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS),
la cual como se mencionó anteriormente tiene un activo rol durante el estallido respiratorio
ya que es capaz de generar óxido nítrico a partir de L-arginina; IL-8, una quimioquina
generada por células fagocíticas como los macrófagos, permitiendo su migración al sitio de
infección (Qiu et al., 2009; Alejo & Tafalla, 2011) y Natural killer enhancing factor
56
(NKEF), perteneciente a la familia de las peroxirredoxinas y que posee una función
antioxidante, aumenta la actividad de las células citotóxicas y participa en la comunicación
de este tipo de células durante la respuesta inmune innata de los peces contra los patógenos
(Bethke et al.,2012).
Los resultados obtenidos a través de ELISA muestran que la expresión a nivel de
proteínas de TNF-α e IL-8, resultó ser significativamente menor en los peces inyectados
con cortisol (Figura 23 y 24) en comparación a los peces inyectados con PBS en todos los
órganos que fueron evaluados. En cuanto a NKEF, la expresión de esta molécula solo fue
significativamente menor en el riñón cefálico de los peces tratados con cortisol comparados
con los peces inyectados con PBS (Figura 25).
U ABS 450 nm
0,4
0,2
*
*
*
0
CORTISOL
PBS
CORTISOL
BR
BZ
PBS
CORTISOL CONTROL
PBS
RC
Figura 23: Detección a través de ELISA de TNFα en leucocitos provenientes de branquias, bazo y riñón
cefálico en peces sometidos a condiciones de estrés simulado.
57
U ABS 450 nm
0,4
0,2
*
*
*
0
CORTISOL
PBS
CORTISOL
BR
PBS
CORTISOL
BZ
PBS
RC
Figura 24: Detección a través de ELISA de IL-8 en leucocitos provenientes de branquias, bazo y riñón
cefálico en peces sometidos a condiciones de estrés simulado.
U ABS 450 nm
0,4
0,2
*
0
CORTISOL
PBS
CORTISOL
BR
BZ
PBS
CORTISOL
PBS
RC
Figura 25: Detección a través de ELISA de NKEF en leucocitos provenientes de branquias, bazo y riñón
cefálico en peces sometidos a condiciones de estrés simulado.
58
La molécula que se ve mayormente modificada en respuesta al cortisol es iNOS,
cuya expresión a nivel de proteínas en grupo de peces que recibieron este tratamiento
prácticamente desaparece, especialmente en el bazo y en riñón cefálico (Figura 26).
U ABS 450 nm
0,2
0,1
*
*
*
0
CORTISOL
PBS
CORTISOL
BZ
PBS
CORTISOL
PBS
RC
Figura 26: Detección a través de ELISA de iNOS en leucocitos provenientes de branquias, bazo y riñón
cefálico en peces sometidos a condiciones de estrés simulado.
Con respecto a lipocortina, ésta se ve aumentada en los peces que recibieron
tratamiento con cortisol y este aumento es significativo en las branquias (Figura 27).
59
U ABS 450 nm
0,8
0,6
*
0,4
0,2
0
CORTISOL
BR
PBS
CORT
PBS
BZ
CORTISOL
PBS
RC
Figura 27: Detección a través de ELISA de lipocortina en leucocitos provenientes de branquias, bazo y riñón
cefálico en peces sometidos a condiciones de estrés simulado.
Los resultados obtenidos a través de ELISA indican que existe una disminución de
la expresión a nivel de proteínas en todos los parámetros inmunológicos evaluados y el
aumento de lipocortina fue significativo en branquias de peces inyectados con cortisol.
Adicionalmente se han estimado las correlaciones entre los niveles de expresión a
nivel de proteínas de las distintas moléculas evaluadas como también su relación con
lipocortina, lo que permite ayudar a comprender la dinámica del sistema inmune innato en
condiciones de estrés. Estos resultados indican que los peces tratados con PBS, la expresión
a nivel de proteínas de IL-8 se correlacionan de forma positiva con los niveles de iNOS y
NKEF y los de esta última molécula con los de iNOS. En cuanto a la relación de estas
moléculas con lipocortina, en este grupo de peces no es significativa (Tabla 6).
60
Tabla 6: correlación entre moléculas inmunitarias en peces inyectados con PBS. En negro se encuentran
marcadas las correlaciones significativas p<0,05.
IL-8
iNOS
NKEF
TNF-α
Lipocortina
IL-8
iNOS
NKEF
TNF-α
Lipocortina
1
0,89
0,99
0,65
-0,06
1
0,88
0,23
-0,52
1
0,66
-0,049
1
0,72
1
En el grupo de peces tratados con cortisol existe una correlación positiva entre el
aumento de IL-8 y el resto de las moléculas evaluadas. La expresión a nivel proteico de
lipocortina en este grupo de peces presenta un aumento y se correlaciona de forma
significativamente inversa con iNOS y NKEF (Tabla 7).
Tabla 7: correlación entre moléculas inmunitarias en peces inyectados con cortisol. En negro se encuentran
marcadas las correlaciones significativas p<0,05.
IL-8
iNOS
NKEF
TNF-α
Lipocortina
IL-8
iNOS
NKEF
1
0,94
0,95
0,87
-0,81
1
0,99
0,64
1
0,67
-0,97
-0,96
TNF-α
Lipocortina
1
-0,43
1
Con el objeto de evaluar la presencia de lipocortina y la modificación de la
expresión a nivel proteínas de moléculas proinflamatorias como iNOS e IL-8, se realizó
inmunolocalización en el tejido branquial. Este tejido fue escogido ya que presentó en
condiciones in vivo los mayores cambios en la evaluación de la respuesta inmune. La
inmunolocalización se realizó en los grupos de peces tratados con PBS, cortisol y un grupo
de peces sin tratamiento.
61
Los resultados obtenidos de la inmunolocalización se muestran en la figura 28,
donde es posible apreciar la detección de las diferentes moléculas en el tejido branquial. En
el caso de la detección de lipocortina, resulta ser mayor en los peces estimulados con
cortisol, y menor en los grupos inyectados con PBS y sin tratamiento. En el grupo de los
peces tratados con cortisol, es posible apreciar el marcaje intenso en el borde de la laminilla
branquial que no es apreciable en las otras condiciones.
62
I
Inyección PBS
Sin tratamiento
Inyección Cortisol
IL-8
iNOS
Lipocortina
II
Intensidad de
Fluorescencia (UFR)
Intensidad de Fluorescencia en Branquias
100
75
50
Sin tratamiento
25
Inyectado PBS
0
iNOS
IL-8
Lipocortina
Inyectado Cortisol
Figura 28: I Inmunolocalización de lipocortina en tejido branquial a través de inmunofluorescencia. En
verde, inmunoreconocimiento positivo de lipocortina, en rojo tinción de núcleo con ioduro de propidio. A)
Grupo de peces sin tratamiento B) Grupo de peces inyectados con PBS C) Grupo de peces inyectados con
cortisol. II. Gráfico de intensidad de fluorescencia relativa para cada molécula evaluada en el tejido branquial
63
Con respecto a iNOS, es posible observar la diferencia de la expresión de este
efector en la muestra correspondiente al grupo de peces sin tratamiento, la cual resulta ser
comparativamente mayor que lo observado en los grupos de peces inyectados con PBS y
cortisol. En todos los casos el marcaje resulta ser específico en determinadas células, las
que podrían corresponder al tipo monocito- macrófago infiltradas.
En cuanto a la detección de IL-8, ésta es claramente mayor en el tejido branquial del
grupo de peces sin manipular, mientras que en los grupos de peces inyectados con PBS y
con cortisol es menor, pero entre ellos no se aprecia a una diferencia significativa, lo que
podría deberse a la condición propia del pez del cual se tomó el tejido.
Como una forma de llevar a cabo una comparación más acabada de la
inmunodetección de las diferentes moléculas realizada en el tejido branquial, se realizó una
cuantificación de la fluorescencia relativa para cada molécula evaluada en los distintos
grupos de peces, cuyos valores fueron graficados de forma comparativa como se muestra en
la figura 28 III. Es posible apreciar el aumento en la detección de lipocortina en lo peces
tratados con cortisol, mientras disminuye para las moléculas proinflamatoria. Situación
inversa se da con las moléculas proinflamatorias, es decir, estas aumentan en los peces sin
tratamiento y en los peces inyectados con PBS, mientras disminuyen en los peces tratados
con cortisol.
64
DISCUSION
El análisis de antigenicidad y ubicación espacial de los péptidos epítopes en la
predicción de la estructura terciaria de lipocortina disponible para O. mykiss efectivamente
permitió generar anticuerpos capaces de reconocer la molécula de lipocortina. Esto se pudo
deber a su nivel de exposición que presentan los epitopes en la molécula, condición que
favorece el reconocimiento por parte de los anticuerpos. En cuanto a las estrategias
empleadas, el mejor funcionamiento en la inmunización del mix de epítopes probablemente
se debe a la mejora de la relación molar entre epítopes y antígenos. Además, la
combinación de epítopes logra que los anticuerpos generados sean capaces de reconocer
zonas distintas dentro de una misma molécula y de esta forma ser reconocida de forma
completa.
En relación al modelo celular empleado, los cultivos primarios de HKL
provenientes de O. mykiss
en los que se evaluó la disponibilidad y movilización de
lipocortina, es posible confirmar lo señalado por McKenzie et al. (2003), quien obtiene tras
cinco días de estabilización, una única población de células al ser analizadas por citometría
de flujo y que presentan las características morfológicas habituales presentes en
macrófagos.
Tras el establecimiento exitoso de los cultivos primarios, fue necesario evaluar si
este modelo era capaz de responder a cortisol disminuyendo la respuesta inflamatoria. Para
esto se realizó la evaluación de una respuesta inmune clásica, como lo es la respuesta
oxidativa generada por macrófagos, lo que fue evaluado a través del estallido respiratorio,
cuyo resultado mostró que éste disminuye en razón del tiempo de exposición y no de la
concentración de cortisol aplicada.
En mamíferos se ha estudiado la relación de lipocortina con la expresión de
citoquinas antiinflamatorias como IL-10 y con la óxido nítrico sintasa, enzima que participa
en la generación del óxido nítrico (NO), este último importante en el estallido respiratorio.
65
Ferlazo (2003) ha observado un aumento de la liberación de IL-10 y una
disminución de la NO sintasa, lo que se encuentra asociado a un aumento de lipocortina, la
que sería es capaz de disminuir la respuesta inflamatoria (Ferlazo et al., 2003) a través de
este mecanismo. En peces, basándose en los resultados presentados, el estallido respiratorio
se ve afectado de forma importante por la exposición prolongada a cortisol, pero no es
posible establecer una relación directa entre la disminución del estallido respiratorio y la
cantidad de lipocortina detectada, ya que al correlacionarlos, no existe una relación
inversamente proporcional que sea significativa como se esperaría. Por consiguiente, con
este resultado de forma preliminar, no es posible afirmar de forma concluyente una relación
directa entre el aumento de lipocortina y la disminución del estallido respiratorio.
Una vez establecido que el modelo a emplear es capaz de generar
inmunodepresión en HKL, se realizó la detección de lipocortina a través de ELISA. El
análisis de los resultados obtenidos para la detección de lipocortina a nivel proteico, tanto
en el citosol como en la membrana, mostró que en esta última, es mayor a las 12 horas de
estimulación con cortisol. También es importante destacar el aumento de la detección a
nivel de membrana por sobre la detección a nivel citosólico. Esto permite verificar que en
peces, al igual que vertebrados superiores, lipocortina es capaz de unirse a la membrana
plasmática. Esta observación es posible vincularla con los resultados de la detección de
lipocortina tras 8 horas de exposición a cortisol. Estos indican que existe en la membrana
una detección a nivel de proteínas que presenta una relación dosis dependiente de cortisol,
mientras que en el citosol esta es inversamente proporcional, lo que estaría indicando una
posible translocación de lipocortina entre estos compartimientos celulares, proceso que
estaría vinculado con los mecanismos utilizados por lipocortina para ejercer la
inmunosupresión a la que se encuentra vinculada (Solito et al., 1998; Perretti et al., 2000).
Tras esto fue necesario validar la detección de lipocortina. Esto se llevó a cabo a
través de western blot, el que evidencia la presencia de lipocortina en HKL tratadas con
cortisol como en las células control. En ambos casos, lipocortina fue detectada en el peso
molecular esperado para salmónidos (Hwang et al., 2007), el que además concuerda con el
de vertebrados superiores (Perretti & D’Acquisto, 2009). Esto se debe a que en ambos
66
grupos de vertebrados, existe una gran conservación del segmento C-terminal que posee
lipocortina.
Este resultado es posible vincularlo a la cuantificación de lipocortina por ELISA
indirecto, ensayo en el que se evidenció su presencia en muestras control, lo que a través de
western blot se reiteró. Esto indica que es probable que el rol regulador de la respuesta
inmune esté relacionado más bien con la disponibilidad y translocación de lipocortina a la
membrana plasmática que con solo estar presente a nivel proteico en las células que la
expresan. Existen antecedentes en vertebrados superiores acerca de la característica de
lipocortina como una proteína constitutiva (Solito et al., 2006; Perretti & Flower, 2004;
Perretti & D´Aquisto, 2010), cuya disponibilidad se ve aumentada por el cortisol (Oliani et
al., 2002).
Para poder demostrar tanto la presencia, aumento de disponibildad y movilización
de lipocortina, se realizó una inmunofluorescencia en la línea celular RTS-11 la que fue
inducida con cortisol durante 12 horas. En este ensayo es posible comprobar que
lipocortina presenta una condición de molécula constitutiva al igual que en mamíferos
(Solito et al., 2006; Perretti & Flower, 2004; Perretti &D´Aquisto, 2009; Castro-Caldas,
2006). Además, se observó un aumento en el marcaje fluorescente de lipococortina, el que
se ve notoriamente incrementado hacia la membrana plasmática a medida que se aumentó
la concentración de cortisol empleada. Esto estaría indicando una translocación de
lipocortina desde el citosol hasta la membrana plasmática de las células, lo que concuerda
con lo observado en vertebrados superiores, en los cuales existen evidencias acerca de la
capacidad de movilización de lipocortina a la membrana plasmática. En linfocitos de
humanos estimulados con anti CD3/CD28 se demostró un activo desplazamiento no solo de
lipoocortina a la membrana plasmática sino que además, la translocación de su receptor
(FPRL-1) (D´Acquisto, 2009). La movilización de lipocortina desde el citosol hasta la
membrana plasmática en peces, fue demostrado al realizar un análisis de la intensidad de la
fluorescencia a través de la células. Este resultado muestra que existe un aumento
significativo de la fluorescencia hacia los extremos de la célula estimuladas con 300 ng/ml
67
de cortisol durante 12 horas, versus las células sin tratamiento, debido a la mayor
localización de lipocortina en la membrana plasmática.
Los resultados obtenidos a través de inmunofluorescencia, también nos permiten
demostrar que al igual que en mamíferos, lipocortina es una proteína que es capaz de
expresarse en presencia de cortisol, que puede almacenarse en gránulos que pueden
encontrarse tanto en el citoplasma, asociados al núcleo celular o adheridos a la membrana
plasmática. La presencia de estos gránulos asociado a la membrana plasmática y descritos
por Perretti et al. (2000), sugieren que corresponden a un mecanismo involucrado en la
movilización de lipocortina dentro de la célula, llevándola desde el citosol hasta la
membrana celular. Esto último se encuentra vinculado a un proceso de secreción de estos
gránulos, lo que permite a lipocortina ejercer una acción tanto autocrina como paracrina
entre las células vecinas, ejecutando de esta forma los efectos inmunosupresores,
especialmente sobre los componentes celulares del sistema inmune innato, especialmente
monocitos-macrófagos y neutrófilos (Perretti &D´ Acquisto, 2009).
En peces aún no se ha demostrado si al igual que en mamíferos, existen
modificaciones post traduccionales como la fosforilación en el residuo Serina-27, que
resulta ser esencial para la translocación desde el citoplasma hasta la membrana plasmática
para ser secretada (Solito et al., 2006), pero sí que lipocortina es capaz de almacenarse en
gránulos. Los resultados también indican que al igual que en mamíferos lipocortina es
capaz de expresarse en células con capacidad adherente (Perreti et al., 2000) como los son
las células tipo HKL y RTS-11,esto aporta otro antecedente a la similitud entre lo
observado en mamíferos y en peces con respecto a lipocortina durante el desarrollo de esta
tesis.
Una vez comprobado in vitro, que el cortisol es capaz de inducir un aumento en la
disponibilidad de lipocortina y su translocación a nivel, fue necesario comprobar si existe
un aumento en la expresión a nivel de proteínas de lipocortina en peces tratados con
cortisol, condición que podría proyectarse a lo que ocurre en condiciones in vivo. Para esto
68
se realizó un ensayo de estrés simulado, tras el cual se evaluaron diferentes moléculas
proinflamatorias y efectores de la respuesta inmune.
La detección tanto por ELISA como por inmunofluorescencia de todas las
moléculas evaluadas se vieron disminuidas en los peces que recibieron inyección con
cortisol respecto a los que recibieron inyección de PBS, lo que confirma que a nivel
sistémico el cortisol es capaz de causar inmunodepresión.
Dentro de los resultados obtenidos destaca la detección de iNOS, ya es el efector
que mayormente se ve modificado en su expresión en respuesta al cortisol, cuya presencia
en grupo de peces que recibieron este tratamiento prácticamente desaparece. Este resultado
concuerda con lo observado a nivel in vitro, en donde el estallido respiratorio se ve
disminuido por efecto del cortisol.
La expresión de lipocortina a nivel de proteínas, se ve aumentada especialmente en
las branquias de los peces que recibieron tratamiento con cortisol. Este tejido ha
demostrado poseer un activo rol en la respuesta inmunitaria, tanto al evaluar lipocortina
como los otros parámetros inmunológicos ya mencionados. Esto lo convierte en un tejido
apropiado para ser utilizado como un indicador de lo que ocurre con la respuesta inmune
en peces y que además permite complementar la información entregada por los tejidosque
clásicamente son evaluados en la respuesta inmune como lo son el riñón cefálico y el bazo
de peces.
Adicionalmente se han establecido correlaciones entre las distintas moléculas
evaluadas y su relación con lipocortina, lo que permite ayudar a comprender la dinámica
del sistema inmune innato en condiciones de estrés.
Las correlaciones realizadas en el grupo de peces inyectados con PBS son positivas
entre IL-8, NKEF e iNOS.Esto estaría indicando una activación del sistema inmune a través
de la migración de células especialmente fagocíticas gracias el aumento de IL-8,
acompañado por un incremento de la respuesta oxidativa a través de iNOS y NKEF. Esto
último indica la complementación de estas dos moléculas para favorecer la respuesta
69
inmunitaria de tipo oxidativo en peces, y confirma lo observado in vitro por Bethke et al.
(2012).
La detección de lipocortina en el grupo de peces inyectados con PBS no muestra
una relación inversamente proporcional que sea significativa, indicando que un episodio de
estrés puntual, como lo es una inyección, no es suficiente para generar un aumento en los
niveles de cortisol que permitan cambiar la disponibilidad y movilización de lipocortina.
Situación contraria ocurre en los peces inyectados con cortisol, en los que la expresión de
lipocortina se ve aumentada de forma significativa y se correlaciona de forma inversa con
iNOS y NKEF, lo que da cuenta de la participación de lipocortina en la disminución de la
respuesta inmunitaria, especialmente oxidativa al igual que en mamíferos, como indicó
Ferlazo (2003).
El aumento de lipocortina presente en peces inyectados con cortisol, provoca una
disminución general de la expresión de IL-8. Este hallazgo es de gran importancia ya que
IL-8 es una de las principales moléculas activadoras del sistema inmune innato, por lo que
su menor expresión lleva justamente a la disminución de la respuesta inmunológica. Este
antecedente concuerda con lo informado por Castro et al. (2011), al evaluar el efecto del
cortisol sobre la expresión de genes proinflamatorios, entre los que se encuentra IL-8, cuya
expresión se ve disminuida en presencia de cortisol, modulando de esta forma el sistema
inmunológico. En mamíferos, el aumento en la liberación de lipocortina tiene efectos
directos sobre la disminución de la expresión de IL-8 y la consiguiente disminución de
diapédesis y adhesión celular (Perreti, 1998; Gavins et al., 2003; Solito et al., 2006), fases
claves en la respuesta inflamatoria.
Los resultados presentados muestran que efectivamente la expresión a nivel de
proteínas de las moléculas proinflamatorias evaluadas presentan relación entre sí, tanto en
los peces que recibieron inyección de PBS como en los tratados con cortisol, lo que
concuerda con los antecedentes aportados por Chettri et al.(2010) y Castro et al.(2011),en
los que se muestra que a nivel transcripcional es posible detectar un aumento en la
70
expresión de TNF-α e IL-8 tras una inducción con zymosan , y de NKEF, este último
frente a un estímulo viral (Ordás et al., 2011).
Es importante señalar la correlación que tienen entre si la expresión de las
moléculas evaluadas y su aumento en los distintos órganos de función inmune, permite
afirmar , al que en peces al igual que en mamíferos, existe una respuesta inmune innata
coordinada y modulada en la que se ven claramente involucradas las moléculas evaluadas,
las que pueden ser modificadas por la presencia de cortisol, el que es capaz de activar
mecanismos efectores capaces de regular el proceso inflamatorio, como lo es lipocortina.
Por otra parte, los resultados entregados por la inmunolocalización de lipocortina en
el tejido branquial y la modificación de la expresión de moléculas proinflamatorias como
iNOS e IL-8, muestran una mayor expresión de la proteina en los peces inyectados con
cortisol la que disminuye en los peces inyectados con PBS, y mucho menor pero no
inexistente, en los peces sin tratamiento. Esto da cuenta que, al igual que lo observado in
vitro, lipocortina es una proteína constitutiva que aumenta su disponibilidad al incrementar
los niveles de cortisol.
Los resultados de la inmuno localización en las branquias de los distintos grupos de
peces avalan los obtenidos a través de ELISA desarrollado tras el ensayo in vivo, es decir,
el aumento en la expresión a nivel proteico de lipocortina se encuentra relacionado con la
disminución de moléculas claves dentro de la respuesta inmune innata, como lo son iNOS
e IL-8. Estos datos ayudan a complementar los entregados por Gadan et al. (2012), quienes
indican que la respuesta inmunológica se ve modificada por la liberación prolongada de
cortisol, lo cual radica finalmente en el aumento de la susceptibilidad de O. mykiss a IPNV.
Por otra parte, Hwang et al. (2007), ha asociado una función antiapoptótica a lipocortina lo
que hace posible que IPNV pueda replicarse y permanecer en la línea celular CHSE-214.
Esta información, en conjunto con la obtenida en el ensayo in vivo, permiten
considerar que lipocortina como uno de los mecanismos subyacentes a la acción del
cortisol, que al igual que en mamíferos, modifica la respuesta inmune en peces generando,
71
en muchos casos, una condición de inmunodepresión que provoca una
susceptibilidad a enfermedades en los individuos.
72
mayor
CONCLUSIONES

Cortisol induce un incremento en la disponibilidad de Lipocortina 1 en leucocitos
y tejido branquial de Oncorhynchus mykiss

Lipocortina es una molécula que en presencia de cortisol, se moviliza a la
membrana plasmática de leucocitos de trucha arcoíris.

Existe una correlación inversa entre la expresión de moléculas pro inflamatorias y
efectoras de inmunidad con la expresión de lipocortina, principalmente en el
tejido branquial de peces tratados con cortisol.
73
PROYECCIONES

La movilización de Lipocortina a la membrana plasmática, probablemente
permitiría la secreción de esta molécula al medio extra celular incrementando su
disponibilidad y efecto tanto auto como paracrino, asociado a la caída de la
expresión y secreción de moléculas de respuesta inmune.

El tejido branquial podría ser un buen modelo como indicador del potencial
deterioro de la respuesta inmune del pez, cuando se cuantifica una mayor
concentración de lipocortina. Lo anterior podría validarse correlacionándolo con la
caída en la cuantificación de NKEF e iNOS.
74
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93
ANEXOS
Anexo 1:
Gráfico de antigenicidad en secuencia lipocortina de O. mykiss
Secuencia: gi|185132667|ref|NP_001117994.1| annexin A1a [Oncorhynchus mykiss]
94
Tabla determinantes antigénicos en secuencia de lipocortina para O.mykiss
n Posición inicial
Secuencia
Posición Final
1
4
IAAFLQQTVYLGL
16
2
27
TVTPDPHFSVDGDVGILDK
45
3
56
TIIDVLVR
63
4
84
LETALKS
90
5
95
DLEDVVLALLKTPAQYDAQQLKLAM
119
6
128
TLVEILA
134
7
143
EIKKVYK
149
8
169
RNALLSLCK
177
9
208
TDCSVFIDI
216
10
221
SAPQLRQ
227
11
233
SKYSKVDVAKAIDL
246
12
252
IENCLTAVVKCAGSKPAFFAEK
273
13
287
ILTRVMVSRSEVDLARI
303
14
327
YEKILLALC
335
95
Gráfico de hidrobibicidad en secuencia lipocortina de O. mykiss
Gráfico flexibilidad en secuencia lipocortina de O. mykiss
96
INDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1…………………………………………………………………….13
Tabla 2………………………………………………………………….....17
Tabla 3…………………………………………………………………….26
Tabla 4…………………………………………………………………….40
Tabla 5…………………………………………………………………….45
Tabla 6…………………………………………………………………….60
Tabla 7…………………………………………………………………….60
97
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1………………………………………………………………10
Figura 2……………………………………………………………....15
Figura 3……………………………………………………………....20
Figura 4 ……………………………………………………………...21
Figura 5 ……………………………………………………………...24
Figura 6 ……………………………………………………………...27
Figura 7 ……………………………………………………………...27
Figura 8 …………………………………………………………….. 43
Figura 9 ………………………………………………………………45
Figura 10 ……………………………………………………………..46
Figura 11 ……………………………………………………………..46
Figura 12 ……………………………………………………………..47
Figura 13 …………………………………………………………..…47
Figura 14 ……………………………………………………………..48
Figura 15 ……………………………………………………………..49
Figura 16 ……………………………………………………………..50
Figura 17 ……………………………………………………………..51
Figura 18 ……………………………………………………………..51
Figura 19 ……………………………………………………………..52
Figura 20 …………………………………………………………......52
Figura 21 ……………………………………………………………..54
Figura 22 ……………………………………………………………..55
Figura 23 ……………………………………………………………..56
Figura 24 ……………………………………………………………..57
Figura 25 ……………………………………………………………..57
Figura 26 ……………………………………………………………..58
98
Figura 27…………………………………………………………..59
Figura 28 ………………………………………………………….62
99
ABREVIATURAS

ACTH: hormona adrenocorticopina

BCA: ácido bicinconínico

BSA: Suero de albumina bovino

CBG: glicoproteínas globulares

CHSE-214: línea celular derivada de embrión de Oncorhynchus
tshawytscha

COX-2: Ciclooxigenasa 2

DAB: 3,3'-diaminobencidina

DMSO: Dimethyl Sulfoxido

DTT: Dithiothreitol

E2 (PGE2): Prostaglandina 2

EDTA: ácido etilendiaminotetraacético

ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

FITC: fluorescein isothiocyanate

FPRL: Formil –like receptor

GH: hormona del crecimiento

GR: receptor intracelular glucocorticoideo

HKL: Leucocitos de riñón cefálico

HPI: eje son hipotálamo-glándula pituitaria-células interrenales

HPLC: Cromatografía liquida de alta resolución

HRP: Peroxidasa de rábano

HSP: proteínas de shock térmico

IF: Inmunofluorecencia

IFN γ: interferón gamma

Ig: Inmunoglobulina

IHQ: inmuno histoquímica

IL: Interleuquina
100

iNOS: oxido nitro sintasa inducible

IPNV: virus infeccioso de la anemia pancreática

ISAV: virus de anemia infecciosa del salmón

kDa: Kilo Dalton

LPS: Lipopolisacárido

MALDI-TOF:
Matrix-Assisted
Laser
Desorption/Ionization-Time-Of-
Flight

MAPK: proteínas mitógenas de las kinasas

MHC: complejo mayor de Histocompatibilidad

NF-Kβ: factor nuclear potenciador de las cadenas kappa de las células B
activadas

NO: óxido nítrico

Nupr 1: proteína nuclear 1

PAMPs: Patrones moleculares asociados a patógenos

PBS: Buffer fosfato salino

PBSA: Buffer fosfato salino+ BSA

PBST: Buffer fosfato salino+ Tween -20

PKC: proteína kinasa C

PLA2: fosfolipasa 2

PM: Peso molecular

PMN: polimorfonucleados

PMSF: phenylmethanesulfonylfluoride

Poli I:C : ácido Polyinosinico:polycytidylico

PVDF: Polifluoruro de vinilideno

PVN: Núcleo parventricular

RHC: hormona liberadora de la corticotropina

RTS-11: Línea celular proveniente de bazo de trucha

SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SERPINS: superfamilia de las proteínas inhibidoras de las serin proteasa
101

SPPS: síntesis química de péptidos en fase sólida

TCR: receptor de las células T

TMB: 3,3’, 5,5;-TetraMethylBenzidine

TNF-α: Factor de necrosis tumoral α
102