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la première partie
de la thèse
Chapitre VI :
Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Ce chapitre sera consacré, dans une première partie, aux résultats préliminaires
obtenus lors de l’enrichissement d’apatites avec des espèces anioniques peroxydées,
comprenant par exemple les ions peroxyde (O22-) ou superoxyde (O2-) afin de leur conférer
une potentielle propriété antibactérienne. La caractérisation physico-chimique de ces
composés sera présentée et des résultats préliminaires d’évaluation microbiologique seront
également évoqués. En deuxième partie de ce chapitre seront exposés les premiers essais
de codopoage des apatites (incorporation de deux agents potentiellement antibactériens
simultanément) ainsi que leurs caractérisations physico-chimiques et microbiologiques
préliminaires.
VI.1. La voie anionique – Cas des peroxydes
VI.1.1. Données bibliographiques
VI.1.1.1. Les composés peroxydés
Ces composés constituent une famille dont la structure contient le groupement
« peroxo », à savoir une liaison covalente entre 2 atomes d’oxygène : -O-O-. On distingue
les composés peroxydés dits « complexes » des composés peroxydés dits « simples ». Les
composés peroxydés complexes sont des composés dont le groupement peroxo est lié par
des liaisons covalentes au reste de la structure, alors que dans les composés peroxydés
simples, le groupement peroxo est lié de manière ionique aux autres éléments de la
structure (généralement des ions métalliques). Il est possible de classifier ces composés
peroxydés simples en 4 catégories selon la nature de l’ion oxygéné qui les compose
(Vol’Nov, 1966) :
-
les peroxydes, caractérisés par la présence de l’ion peroxyde O22-. Les deux
atomes d’oxygène qui composent cet ion ont chacun un rayon de 1,35 Å et la
liaison qui les relie mesure 1,49 Å. Les peroxydes sont diamagnétiques et
généralement non colorés.
-
Les superoxydes, caractérisés par la présence de l’ion superoxyde O2-. Cet ion
peut être représenté comme un ellipsoïde de révolution contenant deux atomes
d’oxygène de rayon 1,28 Å, dont la distance O-O est comprise entre 1,32 et 1,35
Å. Ces composés sont paramagnétiques et présentent une couleur jaune.
-
Les ozonides, caractérisés par la présence de l’ion ozonide O3-. Cette structure
est composée de 3 atomes d’oxygène liés entre eux par des liaisons mesurant
1,19 Å et formant un angle de 100 °. Les ozonides sont paramagnétiques et de
couleur rouge.
386
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
-
Les hydroperoxydes, caractérisés par la présence de l’ion hydroperoxyde HO2-.
Cette dernière catégorie comprend notamment le peroxyde d’hydrogène, H 2O2,
un oxydant et un antiseptique puissant, et l’un des composés peroxydés les plus
simples et les plus utilisés.
Les propriétés caractéristiques des composés peroxydés comprennent la formation
de peroxyde d’hydrogène par réaction en solution avec des acides dilués, la libération d’O 2
par décomposition thermique et la libération d’oxygène par réaction avec l’eau et divers
autres agents chimiques (Vol’Nov, 1966).
Ces caractéristiques et la nature oxydante de ces composés, et notamment du
peroxyde d’hydrogène, sont à l’origine de nombreuses applications dans divers domaines.
On peut par exemple citer leur utilisation pour blanchir certains produits (cellulose de bois,
savon, graisse ou encore fourrure), dans la composition de produits détergents, leur
addition dans l’industrie alimentaire (mise en conserve, fabrication du pain,…) ou
cosmétique, leur participation lors de synthèses organiques ou inorganiques (initiateur de
polymérisation, production de matériaux semi-conducteurs, vulcanisation du
caoutchouc,…), ou bien encore leur utilisation pour la génération d’oxygène ou la
dépollution des effluents (Falcon et al., 1993 ; Vol’Nov, 1966).
De plus, ces ions oxygénés ainsi que le peroxyde d’hydrogène sont également
connus pour avoir des effets antibactériens que nous présenterons dans la section
suivante.
VI.1.1.2. Les composés peroxydés en biologie et microbiologie
L’oxygène gazeux est un élément essentiel pour une grande majorité d’organismes.
Cet oxygène participe à de nombreux processus vitaux au niveau cellulaire comme par
exemple la production d’énergie (sous forme d’adénosine triphosphate, ATP) qui se réalise
par phosphorylation oxydative impliquant notamment la transformation de O2 en H2O via
une enzyme par la réaction O2 + 4e- + 4H+  2 H2O (Lushchak, 2001). De la même
manière, diverses réactions enzymatiques impliquent l’oxygène. Cependant, au cours de
ces réactions, il peut y avoir formation d’espèces oxygénées réactives (nommées ROS,
pour Reactive Oxygen Species), parmi lesquelles on rencontre notamment le radical
hydroxyde (HO.) mais également l’ion superoxyde (O2-), l’ion peroxyde (O22-) ou le peroxyde
d’hydrogène (H2O2) (Lushchak, 2001).
387
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
De par leurs propriétés fortement oxydantes, les ROS présentent une certaines
toxicité pour les cellules (eucaryotes ou bactéries). Les ROS peuvent interagir avec les
protéines en modifiant certains acides aminés (oxydation des groupements thiols de la
cystéine ou de la méthionine, …), attaquer l’ADN (causant des ruptures de chaîne, ce qui
peut engendrer des mutations et la mort cellulaire) ou encore détériorer les lipides
(peroxydation lipidique44) (Farr & Kogoma, 1991 ; Lushchak, 2001 ; Storz et al., 1990).
Comme ces ROS sont générés naturellement et nécessaire à la vie, les cellules ont
développé des stratégies pour les contrôler, que l’on peut diviser en 3 actions (Lushchak,
2001) :
-
Contrôler la génération des ROS
-
Rendre les ROS moins toxiques sous l’action d’enzymes antioxydantes ou de
« quenchers45 »
-
Réparer les éléments endommagés (ADN, protéines,…)
Parmi les enzymes qui luttent contre l’effet des ROS, il est important de mentionner
le rôle des superoxyde dismutases et des peroxydases. Les superoxyde dismutases
(habituellement abrégées SOD) sont des métalloenzymes catalysant la dismutation de l’ion
superoxyde en oxygène et en peroxyde d’hydrogène suivant les réactions :
M (n
1)
M n SOD O2
SOD O2
et
M n SOD O2
M (n
2H
1)
SOD H 2O2
où M est un métal de transition comme Fe, Mn ou Cu.
Les peroxydases sont une classe d’enzymes, appartenant à la famille des
oxydases46, chargées de décomposer un grand nombre d’espèces contenant le
groupement peroxo, du type R-O-O-R’ par la réaction
ROOR' 2 e
2H
ROH R' OH
Au sein de ces peroxydases, on retrouve notamment la catalase dont l’action est
focalisée sur la dismutation du peroxyde d’hydrogène en oxygène et en eau
(2 H2O2  O2 + 2 H2O). A l’instar des superoxyde dismutases, les peroxydases utilisent la
capacité des métaux de transition à exister sous plusieurs états d’oxydation pour exercer
leurs actions antioxydantes.
44
Formation de radicaux sur la chaine carbonée des lipides
Entité moléculaire capable de désactiver un état excité créé dans une entité moléculaire par transfert d'énergie, d'électron ou par un
mécanisme chimique
46
Famille d’enzymes catalysant une réaction d'oxydo-réduction impliquant l’oxygène
45
388
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Ces enzymes antioxydantes sont généralement présentes chez tous les organismes
aérobies (tels que les cellules des mammifères ou les bactéries) et permettent de conserver
un équilibre entre le taux de ROS formées et le taux de ROS détruites. Cependant, si cet
équilibre est perturbé et que le taux de génération des ROS est trop important, les ROS
vont s’accumuler dans la cellule. On parle alors de stress oxydatif. L’accumulation des ROS
peut alors engendrer des lésions importantes dans la cellule (dénaturation de protéines
altération de l’ADN) et causer sa mort.
C’est d’ailleurs un des modes d’action de l’organisme humain pour lutter contre les
infections. En effet, les phagocytes produisent localement des ions superoxyde (O 22-) via
une enzyme spécifique, l’oxidase NADPH phagocytique, afin de lutter contre les bactéries
(Rada & Leto, 2008 ; Shenep et al., 1985). La génération de ROS est également le mode
d’action de certains antibiotiques, tels que les fluoroquinolones (Albesa et al., 2004). C’est
pourquoi il a été reporté dans la littérature l’utilisation de composés peroxydés, et plus
particulièrement du peroxyde d’hydrogène (H2O2), en tant qu’agent antibactérien
(Feuerstein et al., 2006 ; Imlay et al., 1988 ; Müller & Janz, 1993 ; Pedahzur et al., 1995 ;
Shenep et al., 1985). Le peroxyde d’hydrogène n’est pas le plus toxique des ROS, mais sa
stabilité et sa facilité de manipulation (notamment en comparaison avec l’ion O 22- ou des
espèces radicalaires telles que HO.) en font un outil de choix pour ces applications. N’étant
pas chargée, l’entité H2O2 pénètre facilement à l’intérieur des cellules (Sawai et al., 1998 ;
Shenep et al., 1985). De plus, en présence d’ions de métaux de transition (comme Fe ou
Cu), présents dans les milieux biologiques, le peroxyde d’hydrogène peut produire d’autres
espèces oxygénées réactives (Juven & Pierson, 1996), comme le radical hydroxyle HO .,
très toxique et à courte durée de vie, formé par la réaction de Fenton (Fenton, 1894 ; Imlay
et al., 1988) :
Fe2
H2O2
H
Fe3
HO .
H2O
389
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Ainsi, l’introduction directe d’H2O2 à des concentrations millimolaires dans des
cultures bactériennes a montré son efficacité à réduire la croissance de divers microorganismes, parmi lesquels Escherichia coli ou Streptococcus mutans (Feuerstein et al.,
2006 ; Imlay et al., 1988). A titre d’exemple, pour S. mutans, la MIC50 (la concentration
minimale nécessaire à réduire de 50 % une population donnée) en H 2O2 semble comprise
entre 3 et 30 mM (Feuerstein et al., 2006). Cependant, il apparaît également qu’une
surconcentration en H2O2 puisse avoir des effets antagonistes sur l’inhibition bactérienne
conduisant alors à une perte des effets antibactériens (Imlay et al., 1988). Ce phénomène
peut possiblement être expliqué par une série de réactions connues sous le nom du cycle
de Haber-Weiss (équation (1) à (3)) (Haber & Weiss, 1934), impliquant notamment la
réaction de Fenton (équation (1)) :
(1)
Fe 2
H 2 O2
(2)
HO .
H 2 O2
(3)
HO2.
Fe3
Fe3
H
HO2.
O2
HO .
H 2O
H 2O
Fe 2
H
Sur la base de ces réactions, Imlay suggère en effet que lorsque la concentration en H2O2
augmente l’équation (2) sera favorisée faisant alors diminuer la concentration en radicaux
HO. liés à l’effet antibactérien (Imlay et al., 1988). Il semble donc important de maîtriser les
concentrations en H2O2 pour pouvoir en atteindre des propriétés antibactériennes
optimales.
VI.1.1.3. Les apatites peroxydées
L’étude des apatites oxygénées (apatites dont les tunnels contiennent des espèces
oxygénées sous différents états d’oxydation) a depuis longtemps attisé la curiosité
scientifique (Trombe & Montel, 1978). Il a ainsi été montré que, outre les ions OH -, les
tunnels apatitiques (voir section I.2.5.4 du chapitre I) pouvaient accueillir bon nombre de
molécules, telles que H2O2 ou O2 (Rey, 1984) ou d’ions moléculaires parmi lesquels figurent
les ions peroxyde (O22-) et superoxyde (O2-) (Dugas & Rey, 1977).
La synthèse d’apatites contenant des ions O22- et/ou O2- peut se réaliser de diverses
manières comme par exemple par coprécipitation à 80 °C et pH 11,8 dans un milieu
contenant du peroxyde d’hydrogène (Dugas & Rey, 1977), par calcination d’hydroxyapatite
sous atmosphère d’oxygène sec (Trombe, 1971) ou encore par hydrolyse du βTCP en
milieu peroxyde d’hydrogène (Simpson, 1969).
390
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
La détection et la quantification de ces espèces peuvent être réalisées grâce à des
techniques d’analyses complémentaires comme la RPE qui permet notamment de détecter
les ions superoxyde (paramagnétiques), les spectroscopies vibrationnelles (infrarouge ou
Raman), ou bien les dosages chimiques permettant entre autre de quantifier les ions
peroxyde O22- ou le peroxyde d’hydrogène (par exemple par titrage au permanganate de
potassium en solution pour le peroxyde d’hydrogène) (Charlot, 1966).
La présence de ces espèces peroxydées est également à l’origine de certaines
modifications physico-chimiques sur des systèmes de nature apatitique, dont voici les
principales données relevées dans la littérature en comparaison avec l’hydroxyapatite
(Trombe, 1971 ; Rey, 1984 ; Yu et al., 2007 ; Zhao et al., 2000) :
-
Dans la mesure où les ions peroxyde sont localisés dans les tunnels apatitiques
en remplacement des ions OH-, une diminution de l’intensité des bandes
infrarouge caractéristiques des ions OH- aux positions de 630 et 3570 cm-1 est
observée. Cette dernière semble subir également un décalage vers la position
3567 cm-1 avec l’incorporation des ions O22-. Cependant la spectroscopie IR se
révèle inapte à détecter directement des espèces diatomiques symétriques ; les
ions O22-, O2- ou l’oxygène moléculaire (O2) ne peuvent donc être détectés par
FTIR (Rey, 1984).
-
La spectroscopie Raman révèle la présence de bandes supplémentaires, lors de
l’incorporation des ions O22-, aux positions 3600 et 3622 cm-1 (attribuées à la
vibration d’ions OH- encore présents dans le réseau à proximité d’ions O22-) et à
750 cm-1 attribuée à la vibration symétrique de l’ion O22-. La présence d’ions O32et/ou O42- engendre également l’apparition de bandes d’absorption Raman larges
et disymétriques à 450 et 800 cm-1.
-
Les résultats de DRX, et notamment en termes de paramètres de maille, reportés
sur des apatites peroxydées se révèlent dépendants des conditions de
préparation des échantillons. Trombe montre que l’incorporation d’ions peroxyde
dans le réseau apatitique (d’une apatite obtenue par calcination sous O2)
engendre une contraction des paramètres de maille « a » et « c » (Trombe,
1971), alors que Rey observe, pour des apatites non-stœchiométriques formées
par hydrolyse ou coprécipitation, une augmentation significative du paramètre de
maille « a » lorsque des groupements peroxydés, tels que O22-, sont présents
dans le réseau apatitique (Rey, 1984).
391
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
L’enrichissement des apatites en agents antibactériens par la voie anionique
apparaît donc différent de ceux précédemment décrits dans ce travail (effectués par voie
cationique). Les environnements des tunnels apatitiques renferment des sites particuliers
où des espèces variées peuvent être non seulement incorporées mais également
échangées relativement aisément, tout au moins dans certaines conditions expérimentales.
Dans ce chapitre, il nous a paru intéressant, en plus des apatites nanocristallines,
d’étudier l’enrichissement en ions peroxyde dans des apatites présentant un meilleur état
de cristallinité : la comparaison entre ces différents systèmes pouvant en effet permettre, a
priori, d’en apprendre davantage sur l’incorporation de telles espèces peroxydées dans un
réseau apatitique plus ou moins bien cristallisé.
Seront donc présentés dans les sections suivantes deux modes de synthèse
d’apatites :
-
Par l’hydrolyse du βTCP (Ca3(PO4)2), réalisée en présence de peroxyde
d’hydrogène, aboutissant à l’obtention d’apatites relativement bien cristallisées.
Ces apatites sont généralement faiblement sous-stœchiométriques et révèlent la
présence d’ions HPO42- dans leur composition chimique (Rey, 1984).
-
Par la voie de synthèse des apatites nanocristallines (par coprécipitation), comme
nous avons pu la décrire dans les chapitres précédents, mais qui sera réalisée en
présence de peroxyde d’hydrogène.
La caractérisation physico-chimique des composés obtenus par ces méthodes de
synthèse sera également présentée. Enfin, les résultats des premiers tests antibactériens
que nous avons pu réaliser seront exposés en fin de cette première partie de chapitre (la
seconde étant consacrée aux systèmes codopés). Les travaux présentés dans cette partie
du chapitre ont été réalisés en collaboration avec Françoise Bosc, technicienne de
laboratoire.
VI.1.2. Étude de l’hydrolyse du βTCP – Apatites peroxydées bien cristallisées
De nombreux phosphates de calcium présentent la propriété d’évoluer vers la
structure apatitique lorsqu’ils sont placés en solution aqueuse. Tel est le cas par exemple
de la brushite (CaHPO4.2H2O) (Montel, 1958 ; Lerch & Lemp, 1966), du phosphate
octocalcique (OCP, de formule Ca8(PO4)4(HPO4)2.5H2O) (Brown et al., 1962) ou bien
encore des phosphates tricalcique α et β (α et β-TCP de formule Ca3(PO4)2)
(Bredig et al., 1932 ; Monma & Kanazawa, 1976). Des études préliminaires sur l’hydrolyse
du β-TCP en présence de peroxyde d’hydrogène pour synthétiser des apatites oxygénées
ont été reportées dans la littérature (Simpson, 1969 ; Rey, 1984), c’est pourquoi nous avons
choisi d’approfondir cette voie de synthèse. Dans cette section nous présenterons donc la
392
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
synthèse et les résultats obtenus par la voie de l’hydrolyse du βTCP conduisant à la
formation d’apatites relativement bien cristallisées et contenant des espèces oxygénées à
différents degrés d’oxydation.
VI.1.2.1. Synthèse
Dans ce travail, l’hydrolyse du βTCP (β-Ca3(PO4)2) a été réalisée comme suit :
Une masse 20 mg de poudre de βTCP (obtenue par des synthèses préalablement réalisées
au laboratoire) est placée dans un récipient en verre muni d’un système d’obturation auquel
est ajouté un volume 60 mL d’eau désionisée. Le récipient est ensuite fermé et placé à
l’étuve préalablement portée à 100 þC pendant une durée de 24 heures ; après quoi le
milieu est laissé à refroidir puis le composé est filtré sur Büchner et enfin séché par
lyophilisation.
Cette voie de synthèse vise à conduire théoriquement à la formation d’(hydroxy)apatite (ne contenant pas d’espèces oxygénées), qui sera utilisée comme composé de
référence non dopé.
Pour la synthèse d’apatites peroxydées par hydrolyse du βTCP, le protocole suivi est
resté identique au précédent mais l’eau désionisée servant à l’hydrolyse a été remplacée
par une solution de peroxyde d’hydrogène diluée dans l’eau désionisée en différentes
proportions. La solution de peroxyde d’hydrogène initiale utilisée est une solution à 110
volumes (soit 9,82 mol/L de H2O2). Le Tableau VI.78 reporte les concentrations en peroxyde
d’hydrogène testées dans ce travail.
Référence
de
l'échantillon
% volumique*
de solution de H2O2
dans le milieu de réaction
c° molaire en H2O2
dans le milieu de réaction
(mol/L)
H0%
0%
0
H5%
5%
0,49
H10%
10%
0,98
H25%
25%
2,46
H50%
50%
4,91
H75%
75%
7,37
* ce pourcentage correspond à la valeur au rapport :
Volume de solution de H 2O2 (à 110 Volume )
Volume de solution total
Tableau VI.78 : Teneurs en peroxyde d’hydrogène testées lors de la synthèse d’apatites peroxydées par hydrolyse
du βTCP (* ce pourcentage correspond à la valeur du rapport : volume H2O2 (à 110 volumes) / volume total de
solution
393
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
VI.1.2.2. Caractérisations physico-chimiques
Des analyses par diffraction des rayons X ont été réalisées sur les échantillons
synthétisés par hydrolyse du βTCP en milieu peroxyde d’hydrogène. Les diagrammes les
plus caractéristiques, en comparaison avec le βTCP utilisé initialement pour la synthèse et
avec l’hydroxyapatite (HAP), sont présentés sur la Figure VI.155.
o
1100
o
1000
Intensité (cps)
900
raies caractéristiques du TCP
raies caractéristiques de l'HAP
o
o
700
o
o
o
o
o
o
800
o
Référence
de
l'échantillon
HAP
o
o
o
o
o
o o
600
500
o
o
o
o
H75%
o
o
o
H25%
400
300
200
H0%
100
TCP
0
25
30
35
40
2 (degré) (
Cu
45
50
)
Figure VI.155 : Diagrammes de diffraction des rayons X d’échantillons synthétisés par la voie de l’hydrolyse du
βTCP avec différentes teneurs en peroxyde d’hydrogène en comparaison avec le βTCP initial et l’hydroxyapatite
394
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Les résultats de diffraction des rayons X indiquent que l’échantillon ayant été synthétisé
en milieu eau désionisée pure (échantillon H0%) ne se compose que de βTCP sans présence
d’hydroxyapatite. Il apparaît donc qu’en absence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu
réactionnel, l’hydrolyse du βTCP en HAP ne se produit pas.
Les échantillons ayant été synthétisés en milieu eau + peroxyde d’hydrogène montrent
qu’à mesure que la teneur en peroxyde d’hydrogène augmente dans le milieu réactionnel, la
phase apatitique se forme et sa proportion augmente progressivement aux dépens de la phase
βTCP (augmentation de l’intensité des raies de l’HAP et diminution de l’intensité de celles du
βTCP). Cependant, parmi les échantillons testés, seul l’échantillon H75% (dont le pourcentage
volumique de solution de H2O2 à 110 volumes dans le milieu réactionnel était de 75 %)
présente uniquement les raies de diffraction de la phase HAP, les autres pourcentages formant
des systèmes biphasés HAP/βTCP. L’incorporation de peroxyde d’hydrogène dans le milieu
favorise donc l’hydrolyse du βTCP mais elle n’est complète que pour des teneurs en peroxyde
d’hydrogène importantes.
Le diffractogramme de l’échantillon H75% montre des raies de diffraction fines
(contrairement aux diagrammes caractéristiques des apatites nanocristallines biomimétiques).
Ainsi, les apatites synthétisées par ce procédé ont un état de cristallinité supérieur aux apatites
nanocristallines que l’on a pu décrire dans les chapitres précédents. Une analyse par
microscopie électronique à balayage (MEB) réalisée sur ces échantillons, dont les
micrographies sont présentées à la Figure VI.156, montre des cristaux de forme aciculaire dont
les dimensions sont comprises entre 0,5 et 2 µm de largeur et allant jusqu’à plusieurs dizaines
de µm de longueur. La différence d’état de cristallinité entre les apatites nanocristallines et ces
échantillons-ci peut donc être expliquée en partie par la taille micrométrique des cristaux des
échantillons obtenus par hydrolyse du βTCP (à 100 þC) alors que les apatites nanocristallines
présentent des cristaux de taille nanométrique.
Figure VI.156 : Micrographies obtenues par microscopie électronique à balayage (MEB) sur l’échantillon H75%
395
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Une analyse par spectroscopie infrarouge a également été réalisée sur le seul
échantillon ayant été obtenu ici présentant une structure apatitique monophasée (échantillon
H75%). Le spectre FTIR de cet échantillon est présenté à la Figure VI.157.
0,12
3428
1,0
0,10
3524
3555
0,08
0,8
3281
0,06
2973
2915
Absorbance
0,04
0,6
0,02
0,00
4000
3500
3000
2500
0,4
887
0,2
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
Figure VI.157 : Spectre FTIR de l’échantillon H75%
Le spectre FTIR de cet échantillon indique la présence des bandes de vibration
caractéristiques des ions phosphate en environnements apatitiques, à 471 cm-1 (ν2(PO4)), à
560/571/605 cm-1 (ν4(PO4)), à 960 cm-1 (ν1(PO4)) et à 1040/1089 cm-1 (ν3(PO4)). La
décomposition spectrale des bandes situées dans le domaine 400-800 cm-1 révèle également
une concentration non-négligeable d’ions HPO42- apatitiques. La présence de la bande FTIR
située à 887 cm-1, attribuée à la vibration de la liaison P-OH des ions HPO42(Eichert et al., 2008), confirme également la présence de ces espèces.
En revanche, la décomposition spectrale montre qu’aucun ion en environnements nonapatitiques, ni même d’ions OH- apatitiques, ne sont détectés par spectroscopie FTIR.
L’absence d’environnements non-apatitiques est due au mode de synthèse (T = 100 °C) qui ne
favorise pas la formation de tels environnements hydratés. L’absence d’ions OH- peut, quant à
elle, être reliée à l’incorporation d’espèces, probablement oxygénées, dans les tunnels
apatitiques en remplacement des ions hydroxyde. L’absence d’ions OH - est également
observée par l’absence de la bande d’absorption caractéristique de ces ions à la position de
3570 cm-1.
396
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
L’encadré de la Figure VI.157 indique en revanche l’apparition de deux bandes aux
positions 3524 et 3555 cm-1 que l’on ne retrouve pas pour l’hydroxyapatite. La littérature ne fait
pas mention de ces bandes à notre connaissance. Peut être ces bandes d’absorption sont-elles
dues à des ions OH- résiduels dont la vibration est perturbée par des espèces oxygénées
localisées à proximité. Enfin, il est également possible d’observer une bande fine à 2973 cm -1,
qui n’a pas, à notre connaissance, été reportée dans la littérature et qui demanderait des
analyses complémentaires pour être attribuée (analyses que nous n’avons pas pu réaliser dans
ce travail faute de temps).
Nous venons de voir que l’hydrolyse du βTCP en apatite n’était possible que pour de très
importantes teneurs en peroxyde d’hydrogène (75 %) dans ces conditions expérimentales. Il ne
semble donc pas possible avec ces paramètres de synthèse ni de faire varier la teneur en ions
oxygénés incorporés à l’apatite, ni de pouvoir obtenir une référence non dopée. Rey indique
que la réaction d’hydrolyse du βTCP est réalisée par des mécanismes complexes où
interviennent 4 étapes principales (Rey, 1984) :
-
1) la dissolution partielle de la phase βTCP
-
2) l’augmentation du rapport Ca/P dans le milieu réactionnel
-
3) la formation de la phase apatitique
-
4) l’évolution de cette phase vers la stœchiométrie
Toutes ces étapes sont fortement influencées par les conditions de synthèse et
dépendent notamment de la température, du pH ou bien du temps de réaction. Nous avons
donc réalisé une série d’expériences visant à obtenir des apatites (non dopées) par hydrolyse
du βTCP en variant les conditions de synthèse en vue d’obtenir, dans un second temps, des
composés enrichis en espèces oxygénées dont il serait possible de faire varier la teneur. Ces
expérimentations font l’objet de la section suivante.
VI.1.2.3. Tentatives d’obtention d’apatite non dopée par hydrolyse du βTCP
Dans cette section, nous nous intéresserons donc à l’influence des conditions de
synthèse sur l’obtention d’une hydrolyse complète du βTCP en apatite.
Les paramètres de synthèse que nous avons fait varier afin de réaliser une hydrolyse
complète du βTCP sont le temps et la température de réaction ainsi que le pH du milieu
réactionnel. Les autres conditions expérimentales (volume de liquide et masse de solide) sont
restées identiques à celles décrites dans la section VI.1.2.1 et les paramètres ayant été
modifiés sont résumés dans le Tableau VI.79.
397
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Référence
de l'échantillon
Temps
de réaction
Température
de réaction
pH
du milieu
H0%
(référence)
1 jour
100 °C
non modifié
H0%a
2 jours
100 °C
non modifié
H0%b
3 jours
100 °C
non modifié
H0%c
6 jours
100 °C
non modifié
H0%d
1 jour
100 °C
acidifié avec 50 µL d'HClO4
H0%e
2 jours
100 °C
acidifié avec 50 µL d'HClO4
H0%f
2 jours
150 °C
non modifié
Tableau VI.79 : Conditions de synthèse ayant été évaluées pour obtenir une hydrolyse complète du βTCP en apatite
Afin d’évaluer si l’hydrolyse du βTCP a eu lieu et si elle a été complète, une analyse par
diffraction des rayons X a été menée sur les échantillons ainsi préparés, dont les résultats sont
présentés sur la Figure VI.158. Les résultats indiquent qu’à 1, 2, 3 ou 6 jours de temps de
réaction à 100 þC, tous les échantillons ne sont composés que de βTCP, comme le montrent
les exemples de diffractogrames (Figure VI.158) des échantillons H0% et H0%c (1 et 6 jours de
réaction respectivement). Ainsi, l’augmentation du temps de réaction, même jusqu’à 6 jours, en
conservant une température de 100 þC, se révèle inefficace pour amorcer l’hydrolyse du βTCP.
Les données de DRX obtenues pour les échantillons dont la réaction a été conduite
après une acidification du milieu réactionnel par ajout de HClO 4 avec un temps de réaction de
24 et 48 heures montrent des diffractogrammes caractéristiques de la phase cristalline βTCP et
aucune raie de diffraction attribuable à la structure apatitique ne peut être détectée. Ces
résultats sont illustrés avec l’exemple de l’échantillon dont le temps de réaction est de 48
heures présenté à la Figure VI.158. Notons toutefois que sur ce diagramme deux raies
additionnelles aux positions en 2 de 26,6 ° et à 30,4 vraisemblablement attribuables à la
présence de monétite (CaHPO4) sont observées. L’acidification du milieu de réaction n’a donc
pas permis non plus d’engendrer l’hydrolyse totale du βTCP en hydroxyapatite dans ces
conditions (100 °C avec 1 ou 2 jours de réaction).
Enfin, concernant l’échantillon dont la synthèse a été réalisée à la température de 150 °C
avec un temps de réaction de 2 jours, la diffraction des rayons X révèle un diffractogramme
composé uniquement des raies de l’apatite sans présence de βTCP résiduel (Figure VI.158). Il
apparaît donc que l’élévation de température à 150 þC, pendant 2 jours de réaction, permette
effectivement une hydrolyse complète du βTCP en apatite.
398
Intensité (cps)
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
1200
1100
1000
900
800
700
600
Référence
de
l'échantillon
HAP
H0f
26,6
30,4
500
400
300
200
100
0
H0e
H0c
H0
TCP
25
30
35
2 (degré) (
40
Cu
45
50
)
Figure VI.158 : Diagrammes de diffraction des rayons X d’échantillons synthétisés par hydrolyse du βTCP à 100 °C avec un temps de réaction de 1 et 6 jours (échantillons H0 et
H0c), à 100 °C avec un temps de réaction de 2 jours et un pH acidifié avec HClO 4 (échantillon H0e) et à 150 °C avec un temps de réaction de 2 jours (échantill H0f) en
comparaison avec le βTCP initial et l’hydroxyapatite
399
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Ainsi, parmi tous les paramètres de synthèse testés ici, seule une élévation de
température à 150 þC (avec un temps de réaction de 2 jours) a permis l’hydrolyse du βTCP en
HAP. Il apparaît donc possible, en partant de ces conditions de synthèse et avec ajout de
peroxyde d’hydrogène dans le milieu de réaction en différentes proportions, d’obtenir des
apatites contenant potentiellement des espèces oxygénées en teneurs variables. Il a été
reporté dans la littérature que le rapport solide/solution avait également une influence sur les
mécanismes d’hydrolyse du βTCP (Rey, 1984). Il aurait été intéressant d’évaluer ces
paramètres mais il n’a cependant pas été possible de mener ces expérimentations durant la
période de ce travail.
De manière parallèle à cette étude sur les apatites dont l’état de cristallinité était
relativement important, une série d’expérimentations a été réalisée en vue d’obtenir des
apatites nanocristallines biomimétiques enrichies en espèces oxygénées. Ces expérimentations
font l’objet du paragraphe suivant.
VI.1.3. Étude de la coprécipitation – Apatites nanocristallines peroxydées
Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons à la synthèse et à la caractérisation
physico-chimique d’apatites nanocristallines en présence de peroxyde d’hydrogène afin de
potentiellement les enrichir en espèces oxygénées et leur conférer d’éventuelles propriétés
antibactériennes.
VI.1.3.1. Synthèse
Pour réaliser ces synthèses d’apatites nanocristallines en présence de peroxyde
d’hydrogène, un protocole similaire à ceux décrits dans les chapitres précédents a été utilisé.
Trois échantillons ont été réalisés pour cette étude dont voici le détail du protocole de
synthèse :
Une solution A d’ions calcium est tout d’abord préparé par dissolution de nitrate de
calcium (Ca(NO3)2.4H2O) à la concentration de 0,3 mol/L dans une solution contenant à la fois
de l’eau désionisée et du peroxyde d’hydrogène en proportion variable. Les concentrations en
peroxyde d’hydrogène testées dans cette étude sont reportées dans le Tableau VI.80. Une
solution B d’ions phosphate est également préparée en dissolvant (NH 4)2HPO4, pour atteindre
une concentration en ions phosphate de 0,6 mol/L, dans une solution d’eau désionisée et de
peroxyde d’hydrogène de concentration en peroxyde d’hydrogène identique à celle de la
solution A. Un volume de la solution A est ensuite rapidement versé dans un volume double de
solution B sous agitation. Le milieu de précipitation est ensuite laissé à maturer pendant 3 jours
à température ambiante avant d’être filtré. Le précipité est ensuite lavé à l’eau désionisée et
lyophilisé pendant 3 jours. La Figure VI.159 schématise ce protocole de synthèse.
400
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Référence
de
l'échantillon
% volumique*
de solution de H2O2
dans le milieu de réaction
c° initiale
en H2O2
(mol/L)
3j-10%H2O2
10%
0,98
3j-25%H2O2
25%
2,46
3j-50%H2O2
50%
4,91
* ce pourcentage correspond à la valeur au rapport :
Volume de solution de H 2O2 (à 110 Volume )
Volume de solution total
Tableau VI.80 : Teneurs initiales en peroxyde d’hydrogène testées pour la synthèse d’apatites nanocristallines en
présence de H2O2
Ca(NO3)2.4H2O + H2O + H2O2
Sol A
Sol B
Co-précipitation
Maturation
3 jours, Tamb
Filtration
Rinçage
Lyophilisation
(NH4)2HPO4 + H2O + H2O2
Figure VI.159 : Représentation schématique du protocole de synthèse d’apatites nanocristallines en présence de
peroxyde d’hydrogène
VI.1.3.2. Caractérisations physico-chimiques
En premier lieu, la diffraction des rayons X a été utilisée pour caractériser les 3
échantillons dont la synthèse est décrite dans la section précédente. Les diagrammes obtenus
sont reportés sur la Figure VI.160.
Tous ces diffractogrammes indiquent que les échantillons synthétisés suivant le
protocole de synthèse des apatites nanocristallines en milieu peroxyde d’hydrogène présentent
une structure apatitique proche de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée sans
peroxyde d’hydrogène. Aucune phase secondaire ne peut être détectée par DRX dans ces
échantillons. Il est également possible d’observer une amélioration de la résolution des
diagrammes de DRX avec l’augmentation de la teneur en peroxyde d’hydrogène ajoutée
401
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
initialement lors de la synthèse, ce qui est particulièrement visible au niveau des raies (202) et
(300)
(312) (Figure VI.160). Les échantillons synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène ont
donc un meilleur état de cristallinité que des échantillons préparés dans les mêmes conditions
en absence de peroxyde d’hydrogène.
80000
(500)
(004)
50000
(312)
(310)
(202)
60000
(400)
(002)
Intensité (u. a.)
70000
40000
Référence
de
l'échantillon
3j-50%H2O2
30000
3j-25%H2O2
20000
3j-10%H2O2
10000
Non dopée
0
20
30
40
50
2 (degré) (
60
Co
70
80
)
Figure VI.160 : Diagrammes de diffraction des rayons X des échantillons synthétisés par coprécipitation à température
ambiante en milieu peroxyde d’hydrogène à différentes teneurs (10%, 25% et 50 % volumique) avec un temps de
maturation de 3 jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée par coprécipitation en milieu eau
désionisée pure à température ambiante et maturée 3 jours
Les analyses par profile fitting réalisées sur les diffractogrammes de ces échantillons,
dont les résultats sont résumés dans le Tableau VI.81, révèlent que l’amélioration de l’état de
cristallinité est principalement due à une augmentation de la valeur de L(310) (modèle de
Scherrer) ou de L(h00) (modèle de Hosemann et Vogel). Ces valeurs augmentent
continuellement avec l’augmentation de la teneur initiale en peroxyde d’hydrogène, passant de
2,6 nm à 7,4 nm entre 0 et 50 % volumique de solution de peroxyde d’hydrogène, soit un
accroissement de près de 185 %. Cependant la longueur moyenne des cristallites (valeurs
L(00l) évaluées ici par les modèles de Scherrer ou de Hosemann et Vogel) ne varie pas
significativement (valeur proche de 16 nm suivant le modèle de Hosemann et Vogel).
402
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Le paramètre de distorsion dans la direction [002], g002, tend à diminuer graduellement
avec l’augmentation de la teneur en peroxyde d’hydrogène : une baisse d’environ 15 % est
observée lorsque la teneur initiale en peroxyde d’hydrogène passe de 10 à 50 %
(Tableau VI.81). Bien que la valeur de g002 soit systématiquement plus grande pour les
échantillons synthétisés en présence de H2O2 que celle déterminée en absence de H2O2, sa
diminution avec l’augmentation de la teneur initiale de H 2O2 peut en partie expliquer
l’amélioration de l’état de cristallinité des composés.
Référence
de l'échantillon
Scherrer
Hosemann & Vogel
L (002 )
(nm)
L (310 )
(nm)
L (00 l )
(nm)
L (h 00 )
(nm)
Non dopée
22,0 ± 0,1
3,8 ± 0,1
16,2 ± 0,1
2,6 ± 0,1
3j-10%H2O2
20,1 ± 0,2
7,6 ± 0,1
16,5 ± 0,3
5,7 ± 0,2
3j-25%H2O2
19,8 ± 0,1
8,3 ± 0,1
15,8 ± 0,1
6,4 ± 0,1
3j-50%H2O2
20,3 ± 0,3
9,3 ± 0,1
15,9 ± 0,6
7,4 ± 0,3
Référence
de l'échantillon
g(002)
Paramètre
de maille a
(Å)
Paramètre
de maille c
(Å)
V maille
(Å3)
Non dopée
0,0071 ± 0,0001
9,432 ± 0,006
6,870 ± 0,002
529,3 ± 0,8
3j-10%H2O2
0,0100 ± 0,0004
9,464 ± 0,002
6,865± 0,001
532,5 ± 0,2
3j-25%H2O2
0,0095 ± 0,0003
9,469 ± 0,002
6,866 ± 0,002
533,1 ± 0,2
3j-50%H2O2
0,0085 ± 0,0020
9,470 ± 0,002
6,864± 0,001
533,1 ± 0,2
Tableau VI.81 : Résultats issus de profile fitting réalisés sur des diffractogrammes de rayons X ( Cu) d’apatites
nanocristallines synthétisées par coprécipitation à température ambiante en milieu peroxyde d’hydrogène avec un
temps de maturation de 3 jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée en absence de H 2O2 et
maturée 3 jours
Enfin, l’analyse par profile fitting indique une augmentation significative du paramètre de
maille « a », qui passe de 9,432 Å à 9,470 Å, et une diminution en moindre proportion du
paramètre de maille « c », passant de 6,870 Å à 6,864 Å, lorsque la teneur initiale en H2O2
passe de 0 à 50 % respectivement. Cette variation des paramètres de maille engendre une
augmentation du volume de maille cristalline lorsque la synthèse est réalisée en présence de
H2O2 et ce dès 10 % en H2O2 (Tableau VI.81). Le volume de maille augmente rapidement aux
faibles teneurs en H2O2 incorporées lors de la synthèse (jusqu’à une concentration initiale en
solution de 2,46 mol/L) puis se stabilise à une valeur proche de 533 Å 3 (Figure VI.161). Ces
données semblent attester d’une incorporation d’espèces chimiques (probablement des
espèces oxygénées) de grande taille dans le cœur apatitique des nanocristaux (en
comparaison avec celles présentes initialement dans les apatites nanocristallines synthétisées
en absence de peroxyde d’hydrogène) engendrant une dilatation de la maille cristalline. En
403
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
revanche au-delà d’un pourcentage volumique de solution de H2O2 de 25 %, le fait que le
volume de maille n’évolue plus peut signifier que la teneur de ces espèces présentes dans le
cœur apatitique a atteint un maximum et que « l’excédent » s’incorpore préférentiellement dans
les environnements non-apatitiques de surface des nanocristaux ou ne s’incorpore pas. De
plus, ces espèces semblent favoriser une croissance cristalline préférentielle dans une direction
perpendiculaire à l’axe c des cristaux (augmentation de la largeur moyenne des cristallites). La
présence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu de précipitation de ces apatites
nanocristallines semble donc jouer le rôle d’accélérateur de croissance cristalline avec la
particularité d’un accroissement des dimensions réalisé en largeur/épaisseur des cristallites et
non pas en longueur.
533,5
3
Volume de maille (Å )
533,0
532,5
532,0
531,5
531,0
530,5
530,0
529,5
529,0
528,5
0
1
2
3
4
5
Concentration de H2O2 en solution (mol/L)
Figure VI.161 : Évolution du volume de maille cristalline en fonction de la concentration initiale en H 2O2 introduite lors
de la synthèse
La microscopie électronique à balayage a été utilisée pour caractériser ces échantillons
et déceler une éventuelle évolution de la morphologie des particules (agglomérats de
nanocristaux). Les micrographies présentées à la Figure VI.162 ne révèlent aucune différence
sur les particules observées par MEB entre les échantillons d’apatites nanocristallines
synthétisées en présence ou en absence de peroxyde d’hydrogène. Aucune particule de
morphologie différente n’a non plus été observée.
404
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Figure VI.162 : Micrographies MEB d’apatites nanocristallines a) de référence (synthétisé en absence de H 2O2), ou
synthétisées b) avec 10 %, c) avec 25 % et d) avec 50 % volumique de H 2O2 et dont le temps de maturation est de 3
jours
Afin de potentiellement relier les précédents résultats à la teneur en peroxyde dans le
solide, des dosages chimiques ont été réalisés sur ces échantillons. Le titrage du peroxyde
d’hydrogène a été effectué par une méthode colorimétrique utilisant du permanganate de
potassium KMnO4 (Charlot, 1966). Cette méthode fait intervenir le couple oxydo-réducteur :
ions permanganate MnO42- colorés (violet) et ions manganèse Mn2+ incolores selon la réaction :
2 MnO4
5 H 2O2
6H
2 Mn2
5 O2
8 H 2O
Brièvement, pour réaliser ces dosages, les échantillons (sous forme de poudre) d’apatites
nanocristallines synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène sont, dans un premier
temps, dissous en utilisant de l’acide perchlorique concentré (HClO 4). La solution obtenue est
alors titrée par ajout d’une solution de KMnO4 (à 0,02 mol/L) ; le point équivalent est alors
atteint lorsque la coloration violette persiste. Le volume de solution de KMnO4 est mesuré à ce
point afin de calculer la concentration en peroxyde d’hydrogène en solution et de remonter à
leur teneur dans le solide.
405
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Les résultats de ces dosages effectués sur les échantillons 3j-10%H2O2, 3j-10%H2O2 et
3j-10%H2O2 sont reportés dans le Tableau VI.82.
Référence
de l'échantillon
Teneur en H2O2
dans le solide
(mmol/100mg)
3j-10%H2O2
0,014
3j-25%H2O2
0,013
3j-50%H2O2
0,018
Tableau VI.82 : Résultats de dosage du peroxyde d’hydrogène sur les échantillons d’apatites nanocristallines
synthétisés en présence de H2O2
Ces données témoignent tout d’abord de la présence (quantifiable) de peroxyde
d’hydrogène dans la composition des apatites nanocristallines. La teneur en peroxyde
d’hydrogène contenue dans le solide ne varie cependant pas significativement avec
l’augmentation de la concentration en H2O2 introduite dans le milieu de précipitation. Il faut
toutefois noter que la méthode de dosage employée ici ne permet de quantifier que le peroxyde
d’hydrogène (et les ions peroxyde) et non les autres composés peroxydés tels que les ions
superoxyde, ozonide,… Des analyses complémentaires, notamment de RPE (Résonnance
Paramagnétique Electronique), qu’il n’a pas été possible d’effectuer au cours ce travail pas
faute de temps, sont nécessaires pour pouvoir détecter et quantifier ces espèces.
Des analyses de spectroscopie vibrationnelle Raman et infrarouge ont été réalisées sur
ces échantillons d’apatites nanocristallines synthétisées en présence de peroxyde d’hydrogène
afin de potentiellement en apprendre davantage sur les espèces chimiques incorporées aux
nanocristaux.
En spectroscopie infrarouge, les spectres ne révèlent que les bandes caractéristiques
des apatites nanocristallines sans bandes d’absorption additionnelles lorsqu’est ajouté du
peroxyde d’hydrogène au milieu de précipitation (Figure VI.163). Bien que de faible intensité
pour l’échantillon non dopé, la bande relative à l’élongation des ions OH - à 3570 cm-1 n’est plus
détectée pour les composés synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène (Encadré de la
Figure VI.163).
406
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
0,8
0,6
0,4
2,0
0,2
3570
0,0
3700
3600
3500
3400
3300
3200
Absorbance
1,6
1,2
50 % H2O2
0,8
25 % H2O2
0,4
10 % H2O2
0,0
4000
Non dopée
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
Figure VI.163 : Spectres FTIR d’apatites nanocristallines synthétisées par coprécipitation à température ambiante en
milieu peroxyde d’hydrogène à différentes teneurs (10%, 25% et 50 % volumique) avec un temps de maturation de 3
jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée en absence de H 2O2 et maturée 3 jours
Cette observation est soutenue par les résultats de décomposition spectrale réalisée
dans le domaine 400-800 cm-1 qui indique l’absence de bande à 631 cm -1 attribuée aux ions
OH- apatitiques pour tous les échantillons synthétisés en présence de H 2O2 contrairement à
l’échantillon synthétisé sans (voir section II.2.1 du chapitre II). Ce phénomène pourrait être lié à
l’incorporation d’espèces chimiques en sites hydroxyde en remplacement des ions OH -, bien
que de telles espèces ne soient pas détectées par FTIR.
407
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
La décomposition spectrale révèle également une diminution de près de 50 % de la
teneur relative en ions HPO42- non-apatitiques lorsque la synthèse des apatites est réalisée en
présence de peroxyde d’hydrogène. La concentration en H 2O2 initiale n’influence cependant
pas significativement la teneur relative en ions HPO42- non-apatitiques : le rapport des intensités
intégrées des bandes FTIR relatif aux ions HPO42- non-apatitiques est égal à 0,08 ± 0,02 ;
0,11 ± 0,01 et 0,08 ± 0,02 pour les échantillons 3j-10%H2O2, 3j-25%H2O2 et 3j-50%H2O2
respectivement. Il est possible de relier cette observation à l’effet accélérateur de croissance
cristalline du peroxyde d’hydrogène sur les apatites évoqué à la suite des résultats de DRX
décrit précédemment. En effet, au-delà de l’état de cristallinité, c’est peut-être l’état de
maturation qui est amélioré par la présence de peroxyde d’hydrogène, incluant également une
composition chimique plus proche de la stœchiométrie et contenant moins d’environnements
non-apatitiques. La diminution de la proportion d’environnements non-apatitiques pourrait alors
être à l’origine de la diminution de la teneur relative en ions HPO42- non-apatitiques observée
par FTIR.
En spectroscopie Raman, on retrouve les bandes caractéristiques des apatites
nanocristallines mais, à l’inverse des résultats obtenus par FITR, la présence de bandes
d’absorption supplémentaires est également observée, comme le montrent les résultats de la
Figure VI.164. Ces bandes supplémentaires forment 3 massifs distincts :
-
un massif m1 dans la gamme spectrale 750-850 cm-1, constitué de 3 bandes situées à
793, 827 et 845cm-1
-
un massif m2 dans la gamme spectrale 1080-1140 cm-1, constitué de 4 bandes
situées à 1096, 1103, 1114 et 1124cm-1
-
et un massif m3 dans la gamme spectrale 2800-3100 cm-1, constitué de 3 bandes
situées à 2858, 2883 et 2940 cm-1.
Enfin, on peut noter la présence de deux bandes d’absorption larges à 881 et 910 cm -1.
408
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
m1
10000
Intensité (coups)
845
8000
m2
910
881
m3
1096 / 1103
3570
1114
1124
827
793
2858
2883
2940
50 % H2O2
6000
4000
10 % H2O2
2000
Non dopée
0
200
400
600
800
1000 1200
3000
3500
-1
Nombre d'onde (cm )
Figure VI.164 : Spectres Raman d’apatites nanocristallines synthétisées par coprécipitation à température ambiante en milieu peroxyde d’hydrogène à différentes teneurs (10%
et 50 % volumique) avec un temps de maturation de 3 jours en comparaison avec une apatite nanocristalline synthétisée par coprécipitation en milieu eau désionisée pure à
température ambiante et maturée 3 jours (la bande à 960 cm-1 a été tronquée)
409
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Peu d’informations sont disponibles dans la littérature sur la spectroscopie Raman des
apatites peroxydées ou oxygénées. On peut citer les travaux de thèse de Rey (Rey, 1984)
portant sur des apatites synthétisées en milieu peroxyde d’hydrogène (par coprécipitation à la
température de 80 þC ou par hydrolyse du βTCP). Les résultats de ces travaux indiquent que
ces composés apatitiques contiennent divers groupements peroxydés comme des ions
peroxyde O22-, superoxyde O2-, des ions O32- et/ou O42- et des molécules H2O2, localisés dans
les tunnels du réseau. Rey réalisa des analyses par spectroscopie Raman sur ces échantillons
qui révélèrent des bandes d’absorption attribuables à ces espèces oxygénées dont voici
l’attribution donnée par l’auteur :
-
une bande à 450 cm-1 attribuée à des édifices moléculaires oxygénés importants tel
O32- ou O42-
-
une bande large et dissymétrique vers 800 cm -1 attribuée à une vibration O-O de
valence simple
-
une bande fine à 1150 cm-1 attribuée aux ions superoxyde (O2-)
-
une bande intense à 1552 cm-1 attribuée à de l’oxygène moléculaire (O2).
Dans notre étude et d’après les données présentées à la Figure VI.164, la présence des
bandes situées à 450 cm-1 (édifices moléculaires oxygénés importants) et à 1552 cm-1 (O2) n’a
pas été observée sur les spectres Raman des échantillons d’apatites nanocristallines
synthétisées en présence de peroxyde d’hydrogène. En revanche, les bandes du massif m 1
situées entre 750 et 850 cm-1, observées dans ce travail, pourraient correspondre aux bandes
observées par Rey autour de 800 cm-1 attribuées à une vibration O-O de valence simple et/ou
celle observée par Zhao (Zhao et al., 2000) à 750 cm-1 qui a été attribué à la vibration de O22-.
De plus, les bandes du massif m2 comprises dans la gamme spectrale 1080-1140 cm-1
pourraient être reliées à la bande observée à 1150 cm -1 par Rey attribuée à la vibration des ions
superoxyde. La présence d’ions superoxyde peut également être attestée par la couleur
jaunâtre de la poudre des échantillons ayant été synthétisés en présence de peroxyde
d’hydrogène, comparée à la couleur blanche des échantillons synthétisés en absence de H 2O2.
Des analyses complémentaires, notamment par RPE (Résonnance Paramagnétique
Électronique), sont nécessaires pour confirmer la présence de telles espèces dans nos
échantillons.
Restent les bandes du massif m3 situées entre 2800 et 3100 cm-1 qui ne peuvent être
liées à aucune bande décrite dans la littérature à notre connaissance.
A l’inverse de la spectroscopie infrarouge, la spectroscopie Raman permet de détecter la
présence d’ions OH- grâce à la bande d’absorption située à 3570 cm -1 qui est présente à la fois
pour les échantillons synthétisés en présence et en absence de peroxyde d’hydrogène. La
proximité dans le spectre du massif m3 avec cette bande à 3570 cm-1 pourrait en première
approximation faire penser à un déplacement de la bande OH - dû à la modification des
410
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
environnements locaux des ions OH- dans les tunnels avec la présence d’espèces oxygénées.
Cependant, Yu mentionne des bandes d’absorption Raman à 3600 et 3622 cm -1 liées à la
vibration d’ions OH- perturbés par des ions O22- (Yu et al., 2007). Ici de telles bandes n’ont pas
été observées.
Enfin, mentionnons la présence des bandes d’absorption situées à 881 et 910 cm-1, que
l’on distingue clairement pour les échantillons synthétisés en présence de H 2O2. La position de
ces bandes est proche de celle observée pour des apatites nanocristallines synthétisées en
absence de H2O2, que nous avons reporté aux positions de 882 et 916 cm-1 respectivement
(voir section II.1.2.4.2 du chapitre II), cette dernière n’étant qu’un épaulement. La distinction
plus claire de ces deux bandes dans le cas des apatites synthétisées en présence de H 2O2
pourrait n’être due qu’à une amélioration de la résolution des spectres liée à l’amélioration de
l’état de cristallinité observée lorsque la concentration de H2O2 en solution augmente.
Pour conclure, nous venons de voir qu’il était possible de synthétiser des apatites
nanocristallines en présence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu réactionnel sans former
de phases secondaires et ce même à de fort taux de H 2O2 (ici 50 %). La présence de peroxyde
d’hydrogène dans le milieu conduit cependant à des modifications physico-chimiques des
apatites nanocristallines ainsi précipitées. A mesure que le taux de H 2O2 augmente en solution,
les composés ont un état de cristallinité qui s’améliore, ce qui est principalement dû à un
accroissement de leur largeur moyenne. Il a également été observé une dilatation du volume de
maille cristalline, ce qui suggère une incorporation d’espèces oxygénées dans le réseau
apatitique. Bien que des analyses complémentaires, que nous n’avons pu réaliser dans le cadre
de ce travail par faute de temps, soient nécessaires pour confirmer la présence de ces espèces
et les quantifier, la présence de bandes Raman supplémentaires à celles rencontrées pour les
apatites nanocristallines non dopées soutient cette hypothèse.
Dans le dernier paragraphe de cette section, nous nous intéresserons au premier test
antibactérien mené sur des apatites nanocristallines synthétisées en présence de peroxyde
d’hydrogène. Ce test a été réalisé sur une apatite nanocristalline synthétisée en présence d’un
milieu contenant 10 % volumique d’une solution de H2O2 à 110 volumes ayant pour temps de
maturation 1 jour à température ambiante et utilisant Na 2HPO4 comme sel de phosphate de
départ (référencée 1j-10%H2O2-Na). Une étape de pré-équilibrage a été réalisée sur ce
composé par lavage du précipité avec une solution de Na3PO4 à pH = 11 comme décrit
précédemment. Notre choix s’est porté sur ces conditions de synthèse (maturation 1 jour et
utilisation du Na2HPO4) afin d’obtenir des échantillons ayant un état de maturation faible étant
donc potentiellement plus réactifs. Dans la mesure où le sodium semble jouer le rôle d’inhibiteur
de croissance cristalline pour les apatites, il pourrait par ailleurs contrebalancer les effets
« accélérateurs » de maturation du peroxyde d’hydrogène. Une brève série d’analyses par
DRX, spectroscopie FTIR et Raman, dont les résultats sont discutés ci-après, a été réalisée sur
cet échantillon préalablement à son évaluation microbiologique.
411
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
L’analyse par DRX, dont le diagramme est reporté à l’annexe VI.1, ne détecte qu’une
seule phase cristalline : la phase d’apatite nanocristalline.
La spectroscopie infrarouge (dont le spectre est donné à l’annexe VI.2) ne révèle que les
bandes caractéristiques des apatites nanocristallines, à l’instar des résultats obtenus pour les
précédents échantillons. De même, la décomposition spectrale dans le domaine 400-800 cm-1
indique l’absence de bande OH- détectable (à 631 cm-1) et une diminution des ions HPO42- nonapatitiques de près de 35 % lorsque la synthèse est réalisée en présence de peroxyde
d’hydrogène dans ces conditions (en comparaison avec un échantillon synthétisé en absence
de H2O2 maturé 1 jour en utilisant Na2HPO4). Une nouvelle fois, ces résultats peuvent être liés à
un effet « accélérateur » de maturation joué par H2O2 sur ces apatites synthétisées en présence
de sodium générant des composés dont l’état de maturation est plus développé et contenant
moins d’environnements non-apatitiques.
Une analyse par spectroscopie Raman a également été réalisée sur cet échantillon et le
spectre correspondant est reporté à la Figure VI.165 en comparaison avec un échantillon
d’apatite nanocristalline synthétisée en absence de peroxyde d’hydrogène (toujours en utilisant
Na2HPO4 avec 1 jour de maturation à température ambiante). Les données obtenues pour
l’échantillon synthétisé en présence de peroxyde d’hydrogène révèlent une nouvelle fois la
présence des massifs de bandes d’absorption m 1, m2 et m3 dans les fenêtres spectrales 750850 cm-1, 1080-1140 cm-1 et 2800-3100 cm-1 respectivement (qui ont été reportées
précédemment sur la Figure VI.164)). La présence d’ions hydroxyde est également attestée par
la bande située à 3570 cm-1 (alors que le spectre FTIR ne présentait pas de bande détectable
attribuable aux ions OH-). Cependant, une diminution de son intensité peut clairement être
observée en comparaison avec l’échantillon synthétisé sans H 2O2, ce qui peut être attribué à
l’incorporation d’espèces peroxydées en remplacement d’ions OH-. Enfin, un massif m4 de
bandes de faible intensité, dans le domaine 1250-1800 cm-1, peut également être discerné du
spectre Raman de cet échantillon. Si quelques bandes de ce massif semblent être observées
pour l’échantillon synthétisé sans H2O2 (notamment à 1452 et 1637 cm-1), il est possible de
discerner deux bandes d’absorption aux positions 1299 et 1500 cm -1 uniquement présentes sur
le spectre de l’échantillon synthétisé en présence de H2O2. Peut-être est-il possible de relier ces
bandes à celle observée par Rey à 1550 cm -1 qui a été attribuée à de l’oxygène moléculaire
(Rey, 1984). Des analyses complémentaires seraient nécessaires pour attribuer ces bandes
avec plus de précision.
412
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Intensité (coups)
5000
4000
3000
m2
m1
2000
3570
m4
m3
1452
1637
1299
1500
1000
0
300
600
900
1200
1500
3000
3500
-1
Nombre d'onde (cm )
Figure VI.165 : Spectre Raman de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 10 % volumique de H 2O2 avec un temps de maturation de 1 jour, en utilisant
Na2HPO4 comme sel de phosphate et ayant subie une étape de pré-équilibrage
413
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
En conclusion, nous venons de voir qu’il était possible de synthétiser une apatite
nanocristalline monophasée en présence de peroxyde d’hydrogène avec un état de maturation
relativement faible en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ et un temps de
maturation de 1 jour. C’est donc cet échantillon qui a été évalué dans la section suivante afin
d’explorer sa potentielle activité antibactérienne.
VI.1.4. Évaluation des propriétés antibactériennes
Comme évoqué dans la section précédente, un test visant à déterminer la potentielle
activité antibactérienne d’un échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée par coprécipitation
en présence d’un milieu contenant 10 % volumique d’une solution de peroxyde d’hydrogène à
110 volumes a été réalisé. Cette apatite a été synthétisée par coprécipitation en utilisant
Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ avec un temps de maturation en solution de 1
jour et à température ambiante. Le précipité a subi l’étape de pré-équilibrage par lavage avec
Na3PO4 à pH = 11. Pour réaliser les tests antibactériens suivants, l’échantillon a été mis sous
forme de pastilles d’un diamètre de 13 mm et de masse 150 mg par compression uniaxiale à
température ambiante. La souche bactérienne testée est S. aureus et la méthode utilisée pour
quantifier les bactéries en fin de test était la méthode « agar ». Le protocole expérimental de ce
test est identique à celui décrit dans la section II.4.4 du chapitre II et le test a été dupliqué. Les
résultats de ce test, exprimés en nombre de colonies formées par mL (cfu / mL) et en
comparaison avec un échantillon d’apatite nanocristalline non dopée maturée 1 jour (ne
présentant pas d’activité antibactérienne) sont reportés à la Figure VI.166.
S. aureus
Test 1
Test 2
1,0E+07
1,0E+06
cfu (1/ml)
1,0E+05
Limite de
quantification
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
Non non
dopée
dopée
1j-10%H
10 % H2O2
2O2-Na
Figure VI.166 : Résultats de tests sur plaque d’agar issus des tests microbiologiques sur souche de S. aureus après mise
en contact avec des pastilles d’apatite nanocristalline non dopée ou synthétisée avec 10 % volumique de H 2O2 (en
utilisant Na2HPO4 et maturées pendant 1 jour)
414
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Les résultats de ces tests réalisés indiquent un nombre de colonies bactériennes
formées pour l’échantillon synthétisé avec 10 % de peroxyde d’hydrogène relativement proche
de la référence non dopée. Ce composé ne semble donc pas posséder de propriétés
antibactériennes notables vis-à-vis de S. aureus dans ces conditions. En perspective, des tests
complémentaires sont néanmoins nécessaires pour déterminer si la teneur ou la nature des
espèces oxygénées présentes dans l’échantillon ou leur mécanisme de libération est la cause
de cette non-activité.
VI.1.5. Conclusion
Dans cette première partie du chapitre IV concernant la synthèse d’apatites en présence
de peroxyde d’hydrogène, deux méthodes de synthèse ont été étudiées :
-
L’hydrolyse du βTCP en présence de H2O2 dans le milieu réactionnel. Par cette
méthode, il a été observé que seules les réactions conduites avec des teneurs
élevées en peroxyde d’hydrogène (75 % volumique à 100 þC) ou des températures
élevées de réaction (150 þC) engendraient l’hydrolyse complète du βTCP en apatite.
-
La coprécipitation d’un sel de Ca2+ et d’un sel de phosphate en milieu eau/peroxyde
d’hydrogène à température ambiante. Cette méthode a permis la formation d’apatites
nanocristallines monophasées dont une partie des ions OH- apparaît être remplacée
par des espèces peroxydées. La présence de peroxyde d’hydrogène dans la solution
de précipitation engendre des modifications physico-chimiques notamment à l’origine
de l’amélioration de la résolution des diagrammes de DRX (augmentation de la
largeur moyenne des cristallites) et l’apparition de bandes Raman additionnelles
(probablement due à la présence d’espèces peroxydées dans l’échantillon).
Un test microbiologique préliminaire mené sur un échantillon synthétisé par
coprécipitation en milieu eau/peroxyde d’hydrogène (à 90/10 % volumique) a été réalisé. Les
résultats du test ne révèlent pas d’activité antibactérienne notable dans ces conditions mais des
analyses complémentaires, à la fois physico-chimiques et microbiologiques, seront nécessaires
pour déterminer la nature et la quantité d’espèces peroxydées incorporées aux apatites et
explorer plus en détail leurs potentiels modes d’action.
415
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
VI.2. Étude de codopages
Dans cette seconde partie de ce chapitre VI, nous nous intéresserons aux premiers
essais de synthèse d’apatites nanocristallines codopées. Le codopage, qui dans le cas de cette
étude est un bidopage, correspond ici à l’incorporation simultanée de deux agents
potentiellement antibactériens parmi ceux testés dans les chapitres précédents. Le codopage
peut potentiellement présenter deux avantages :
-
l’association de deux agents actifs peut conduire à un effet (dans notre cas
antibactérien) cumulé des deux agents (addition des effets de l’agent A et des effets
de l’agent B). Dans ce cas, il peut être intéressant de limiter la quantité de l’agent A,
dans le cas par exemple d’une cytotoxicité plus importante de cet agent, et de
compenser son activité avec l’agent B.
-
l’association des deux agents peut éventuellement engendrer une activité supérieure
à celle attendue par l’addition des activités des 2 agents séparés. On parle alors de
synergie. Dans ce cas, des teneurs moindres en agents actifs peuvent être utilisées
lorsque les agents sont associés pour obtenir un effet similaire à ce qu’ils produiraient
si on les considérait individuellement.
Dans cette partie de chapitre, nous décrirons donc les synthèses préliminaires d’apatites
nanocristallines codopées avec diverses combinaisons entre les cations Ag+, Cu2+, ou Zn2+
et/ou les anions peroxydés. Les premières caractérisations physico-chimiques et
microbiologiques réalisées sur ces échantillons seront également présentées.
VI.2.1. Données bibliographiques
L’association de plusieurs ions antibactériens a d’abord été envisagée directement sous
la forme de sels dans des cultures bactériennes afin de déterminer l’activité de la combinaison
de ces ions. C’est ainsi qu’Elzanowska observa une brusque augmentation d’activité
antibactérienne d’une solution de peroxyde d’hydrogène (de concentration comprise entre 1 et
4 mM) avec l’ajout de chlorure de cuivre (CuCl2) en concentration micro-molaire (10 ou 15 µM)
sur des bactéries E. coli, P. aeruginosa et S. lactis (Elzanowska et al., 1995). Comme nous
l’avons évoqué dans le paragraphe précédent, l’action antibactérienne de H 2O2 est en partie
corrélée à la présence simultanée d’ions de métaux de transition tels que le cuivre ou le fer qui
engendrent la formation de radicaux hydroxyde (HO .) via la réaction de Fenton (voir
section VI.1.1.2). L’augmentation de l’activité antibactérienne de H 2O2 par ajout de cuivre ne
paraît donc pas surprenante. Cependant, le cuivre possède également sa propre activité
antibactérienne, comme nous l’avons vu dans le chapitre IV. L’évaluation du potentiel
416
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
antimicrobien individuel du peroxyde d’hydrogène d’un côté et du cuivre de l’autre montre que
l’activité antibactérienne d’un mélange cuivre/H2O2 dépasse la somme des activités des deux
espèces prises séparément (Harrison et al., 2008 ; Pedahzur et al., 1997). Il apparaît donc un
effet synergique lorsque H2O2 et le cuivre sont associés et évalués pour des mélanges
« simples » en solution. Mais cet effet synergique n’a pas seulement été observé entre H 2O2 et
le cuivre, Pedahzur reporta également que l’association H2O2/Zn2+ et H2O2/Ag+ en solution
engendre une activité antibactérienne synergique (Pedahzur et al., 1995 ; Pedahzur et al.,
1997). Ses résultats révèlent que le taux de synergie (différence entre l’activité des deux
espèces associées et la somme des activités individuelles des deux espèces) entre l’ion Ag +
(obtenu à partir du nitrate d’argent) et H2O2 (son étude portait plus spécifiquement sur ces deux
composés) est dépendant de la concentration des deux espèces et plus spécifiquement de
celle du peroxyde d’hydrogène. Plus la concentration en H 2O2 est importante, plus le taux de
synergie est important. L’analyse de bactéries (de la souche E. coli) après mise en contact un
mélange « simple » Ag+/H2O2 indique néanmoins que l’activité antibactérienne de ce couple
n’est pas consécutive à une augmentation que la quantité de ROS (espèces oxygénées
réactives, voir section VI.1.1.2), supplémentaire à ce que génère H2O2 seul. Il semble que ce
soit plutôt des mécanismes liés à des dommages causés aux protéines, bien que les
mécanismes exacts de cette synergie ne soient pas élucidés. Deux mécanismes distincts
peuvent expliquer la synergie entre deux agents antibactériens (Pedahzur et al., 1997) :
-
un mécanisme que l’on peut qualifier de « chimique », par lequel les interactions
chimiques entre les deux agents engendrent la formation d’espèces actives
responsables de l’augmentation de la toxicité.
-
un mécanisme que l’on peut qualifier de « biologique », par lequel la bactérie
accumule les dommages cellulaires causés par l’un des agents, la rendant ainsi plus
susceptible à l’autre agent
Dans le cas de la synergie liée à l’association Ag+/H2O2 en solution, Pedahzur mentionne
plusieurs hypothèses de mécanismes d’action qui pourraient être impliquées (Pedahzur et al.,
1997) :
-
la stabilisation du H2O2 par l’argent, ralentissant ainsi sa décomposition en espèces
non toxiques (comme O2 ou H2O)
-
l’interférence du peroxyde d’hydrogène sur les mécanismes d’évacuation des ions
argent ou de leur détoxification par la cellule
-
l’interférence de l’argent sur l’activité des enzymes impliquées dans la neutralisation
des espèces oxygénées telle que la superoxyde dismutase (voir section VI.1.1.2)
Par ailleurs, la formation d’ions Ag2+ par oxydation des ions monovalents en présence d’H2O2
demeure également une option possible.
417
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Enfin, l’observation d’effets synergiques entre des agents antibactériens n’est pas limitée
à l’association peroxyde d’hydrogène et cation métallique. Des effets similaires ont été décrits
lorsque des cations métalliques sont associés entre eux. Ainsi, les combinaisons Ag+/Cu2+,
Ag+/Zn2+ et Cu2+/Zn2+ (par simples mélanges d’ions en solution) se sont révélées présenter
également une activité antibactérienne synergique (Pedahzur et al., 1997 ; Lin et al., 1996) en
comparaison avec l’activité antibactérienne respective des ions. D’après les travaux de
Pedahzur (Pedahzur et al., 1997), il apparaît de plus que l’association impliquant l’ion Ag+ avec
un autre ion métallique engendre une des synergies les plus importantes parmi les diverses
associations qu’il a étudié à savoir Ag+/Cu2+, Ag+/Zn2+, Ag+/H2O2, Cu2+/H2O2, Zn2+/H2O2 ou
encore Cu2+/Zn2+. Lin émit l’hypothèse que la synergie engendrée par le couple Ag +/Cu2+ serait
due à des modes d’action antibactérienne complémentaires entre ces deux ions (Lin et al.,
1996). En effet, le cuivre a une action plus spécifiquement ciblée sur les membranes et les
parois des bactéries (chapitre IV) alors que l’argent agit principalement sur la dénaturation des
protéines à l’intérieur de la bactérie (chapitre V). Le premier, en détruisant la protection externe
de la cellule, permettrait donc au second de pénétrer plus facilement et d’agir plus efficacement
au sein de la bactérie. Lin observa également que l’effet synergique entre l’ion cuivre et l’ion
argent était corrélé à la concentration en cuivre (Lin et al., 1996). Dans ses conditions
expérimentales (tests réalisés sur L. pneumophilia), la synergie n’apparaissait que lorsque la
concentration en cuivre était de 0,04 ppm (que la concentration en argent soit de 0,02 ou 0,04
ppm) alors que pour une concentration inférieure (ici 0,02 ppm) l’effet antibactérien n’était
qu’additif (que la concentration en argent soit de 0,02 ou 0,04 ppm). Il a par ailleurs été reporté
l’effet inverse, c'est-à-dire que l’ajout de cuivre à une solution d’argent engendrait une
diminution de l’effet antibactérien, probablement en raison de concentrations ou de disponibilité
des ions inadéquates (Ghandour et al., 1988).
Il apparaît donc qu’une synergie, dépendante de la concentration, est possible entre les
différentes espèces que nous avons étudiées dans ce travail (Ag +, Cu2+, Zn2+ et H2O2), du
moins lorsqu’elles sont directement ajoutées sous forme de sels dans les milieux de culture
bactériens. Cependant, peu d’études reportent le codopage de céramiques avec des ions
antibactériens. Il est néanmoins possible d’en citer certaines dont les résultats sont intéressants
dans le cadre de ce travail. Tout d’abord, Bright mentionne l’efficacité d’une zéolithe (aluminosilicate) enrichie soit avec une association Ag+/Zn2+ soit avec Ag+/Cu2+ pour réduire
efficacement le développement d’une souche de S. aureus (Bright et al., 2002). A teneur en
argent constante, il observa que l’ajout supplémentaire d’ions Zn 2+ ou Cu2+ n’engendrait pas de
diminution de l’activité antibactérienne de ce composé mais au contraire l’améliorait. C’est
également ce qu’observa Husheng lorsqu’il compara l’activité antibactérienne d’un matériau
silicique dopé en ions Ag+ et Zn2+ avec un même composé seulement dopé en ions Ag+ sur une
souche d’E. coli ou de S. faecalis (Husheng et al., 2008).
418
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Certains auteurs ont également évoqué le codopage de céramiques phospho-calciques.
Matsumoto indique par exemple la faisabilité de l’enrichissement de phosphate tricalcique β
(βTCP) avec un mélange d’ions Ag+ et Zn2+ ou d’ions Ag+ et Cu2+ pour des applications
antibactériennes, dont la synthèse a été réalisée par voie solide/solide (Matsumoto et al., 2009).
Ses résultats révèlent que l’ajout de zinc ou de cuivre génère un ralentissement de la libération
des ions Ag+ (lié à une stabilisation de la structure cristalline, en comparaison avec un
échantillon de βTCP uniquement enrichi en argent) mais améliore l’activité antibactérienne sur
des souches E. coli ou S. aureus. Il observa également une sensibilité plus grande d’E. coli visà-vis du couple Ag+/Cu2+ que du couple Ag+/Zn2+, alors que la prolifération de S. aureus est
inhibée de manière similaire par les deux couples. Il semble donc que la nature de la souche
bactérienne soit un facteur à prendre en compte pour l’efficacité d’un codopage antibactérien.
Deux auteurs ont, à notre connaissance, reporté le cas d’un codopage de phosphate de
calcium apatitique. L’un a étudié l’association Cu 2+/Zn2+ (Li et al., 2006) et l’autre l’association
Ag+/Cu2+ (Yang et al., 2009). Le premier, Li (Li et al., 2006), réalisa la synthèse de son composé
par coprécipitation d’une phase apatitique non dopée dans un premier temps et vint enrichir le
précipité formé par ajout d’une solution de sulfate de cuivre et de zinc dans le milieu de
précipitation, qu’il laissa maturer pendant 1 jour à une température comprise entre 60 et 70þC.
L’échantillon obtenu des suites de cette synthèse est une apatite monophasée relativement
bien cristallisée dont les cristallites sont de taille nanométrique et contenant 4 % massique
d’ions Cu2+ et 0,75 % massique d’ions Zn2+. Une augmentation des paramètres de maille
cristalline a et c après enrichissement (en Cu2+/Zn2+) fait conclure les auteurs sur une
incorporation des deux ions au sein du réseau apatitique en remplacement des ions Ca 2+. Enfin,
des tests (micro)biologiques révèlent que cette apatite enrichie en cuivre et en zinc présente de
bonnes propriétés antibactériennes sur E. coli sans être cytotoxique. Le second auteur
mentionné précédemment, Yang (Yang et al., 2009), réalisa une synthèse par coprécipitation
directe entre une solution contenant les cations Ca 2+, Ag+ et Cu2+ (réalisée à partir des nitrates)
d’une part et une solution de (NH4)2HPO4 d’autre part à la température de 100 þC pendant
4 heures avant de laisser maturer pendant 24 heures. Bien qu’aucune indication sur la teneur
relative des différentes espèces ne soit donnée dans ce travail, il semble que ces conditions de
synthèse conduisent à la formation d’une phase secondaire d’oxyde d’argent. Les conditions de
synthèse apparaissent donc de première importance pour la synthèse d’apatites codopées. Il
nous a paru pertinent de mentionner ici l’existence de certaines phases cristallines rencontrées
dans la littérature contenant les ions mis en jeu lors la synthèse des apatites nanocristallines
codopées, que nous détaillerons par la suite, phases qui pourraient donc potentiellement se
former lors de la synthèse de nos composés.
419
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Braithwaite reporte la synthèse d’un phosphate de zinc/cuivre, la zincolibethenite, de
formule CuZnPO4OH, de couleur bleu/vert, obtenu par coprécipitation d’une solution de sulfate
de zinc et de cuivre dans une solution de Na3PO4 sous reflux (Braithwaite et al., 2005). Il
mentionne que la formation de ce composé est généralement réalisée à pH = 4, mais que son
obtention à pH = 7 est possible malgré une vitesse de formation faible. Varma (Varma &
Dahiya, 1998) mentionne par ailleurs la formation d’hydroperoxyde de cuivre stable, de formule
générique CuO2H, lorsque du nitrate de cuivre est placé en solution aqueuse avec du peroxyde
d’hydrogène à pH = 5, suivant la réaction bilan :
2 Cu( NO3 ) 2
H 2O2
2 H 2O
2 CuO2 H
4 HNO3
Remarquons que cette réaction conduit à la formation d’acide nitrique, susceptible d’acidifier le
milieu réactionnel. Enfin, notons que dans son ouvrage traitant des espèces peroxydées
(Vol’Nov, 1966), Vol’nov stipule que tous les métaux alcalins (tels que Na) peuvent former des
peroxydes (du type M2O2) bien que ces composés soient généralement obtenus à température
supérieure à 150 °C. Le calcium et le zinc peuvent également former des peroxydes, de formule
CaO2 ou ZnO2.0,5H2O respectivement, lorsqu’ils sont synthétisés en milieu ammoniaqué. En
revanche, l’auteur soutient que le cuivre et l’argent ne peuvent pas former de peroxydes stables
du type CuO2 ou Ag2O2 respectivement.
Au final, il apparaît possible de synthétiser des apatites codopées dont l’activité
antibactérienne pourrait être améliorée en comparaison avec des composés « monodopés ».
Nous présenterons donc dans les sections suivantes les premiers essais de synthèse d’apatites
nanocristallines codopées que nous avons réalisés dans le cadre de ce travail, suivis de leurs
caractérisations physico-chimiques et de l’évaluation microbiologique préliminaire réalisée sur
certains de ces composés.
VI.2.2. Synthèse
Pour réaliser la synthèse d’apatites nanocristallines codopées, le protocole de synthèse
de référence décrit dans le chapitre II (section II.1.1) a été choisi comme base. Pour ces
synthèses, seules la nature du sel de phosphate de départ, la nature et la proportion des ions
présents dans la solution « cationique » ou la présence éventuelle de peroxyde d’hydrogène ont
été des paramètres variables. Voici le protocole de synthèse suivi dans ces expériences :
Une solution « cationique » (solution A) est préparée en dissolvant, en proportion
variable, du nitrate de calcium (Ca(NO3)2.4H2O) avec du nitrate de cuivre (Cu(NO3)2.3H2O)
et/ou du nitrate de zinc (Zn(NO3)2.6H2O) et/ou du nitrate d’argent (AgNO3) dans de l’eau
désionisée pour obtenir une concentration en cations totaux de 0,3 mol/L. Les différentes
combinaisons en cations ainsi que les concentrations de chacun de ces ions sont reportées
dans le Tableau VI.83. Par ailleurs, une solution de phosphate (solution B) est également
420
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
préparée par dissolution de Na2HPO4 ou de (NH4)2HPO4 afin d’obtenir la concentration de
0,6 mol/L en ions phosphate. La nature des sels de phosphate utilisés pour chaque synthèse
est reportée dans le Tableau VI.83. Dans le cas des synthèses réalisées en présence de
peroxyde d’hydrogène, au lieu de dissoudre les différents sels (cationiques et anioniques) des
solutions A et B avec de l’eau désionisée pure, la dissolution a été réalisée avec une solution
H2O/H2O2 (obtenue par dilution d’une solution de H2O2 à 110 volumes) à la fois pour la
solution A et pour la solution B. Les synthèses réalisées dans ces conditions (en présence de
H2O2) sont également indiquées dans le Tableau VI.83.
Un volume de solution A est ensuite versé rapidement dans un volume double de
solution B sous agitation et à température ambiante pendant 5 minutes. Après arrêt de
l’agitation, le milieu de précipitation est laissé à maturer pendant 24 heures à température
ambiante avant d’être filtré sur Büchner. Le précipité est lavé avec une solution de Na 3PO4 à
pH = 11 en premier lieu (étape de pré-équilibrage) puis avec de l’eau désionisée avant d’être
lyophilisé pendant 3 jours. Un schéma du protocole de synthèse suivi ici est représenté à la
Figure VI.167.
Ca(NO3)2.4H2O + Cu(NO3)2.3H2O et/ou Zn(NO3)2.6H2O et/ou AgNO3
dans H2O ou H2O/H2O2
Sol A
Sol B
Co-précipitation
(NH4)2HPO4 ou Na2HPO4
dans H2O ou H2O/H2O2
Maturation
1 jour, Tamb
Filtration
Pré-équilibrage
Rinçage
Lyophilisation
Figure VI.167 : Représentation schématique du protocole de synthèse d’apatites nanocristallines codopées
421
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
c° en Cu2+ c° en Zn2+ c° en Ag+
dans la
dans la
dans la
solution A solution A solution A
(mol/L)
(mol/L)
(mol/L)
Teneur relative
initiale
en cations
(% molaire*)
% volumique**
de solution de H2O2
dans le milieu
de réaction
Nature
du sel de
phosphate
5% Cu2+ / 5% Zn2+
NP
Na2HPO4
+
NP
Na2HPO4
1% Zn2+ / 1% Ag+
NP
Na2HPO4
2+
10%
Na2HPO4
2+
10%
Na2HPO4
1% Ag+
10%
(NH4)2HPO4
Référence
de
l'échantillon
c° en Ca2+
dans la
solution A
(mol/L)
1j-5%Cu/5%Zn
0,265
0,015
0,015
NP
1j-1%Cu/1%Ag
0,289
0,003
NP
0,003
1% Cu
1j-1%Zn/1%Ag
0,289
NP
0,003
0,003
1j-1%Cu/H2O2
0,292
0,003
NP
NP
1% Cu
1j-1%Zn/H2O2
0,292
NP
0,003
NP
1% Zn
1j-1%Ag/H2O2
0,292
NP
NP
0,003
2+
/ 1% Ag
* pourcentage par rapport aux cations totaux contenus dans la solution A (le sodium n'est pas comptabilisé)
** ce pourcentage correspond à la valeur au rapport :
Volume de solution de H 2O2 (à 110 Volume )
Volume de solution total
NP : Non présent
Tableau VI.83 : Nature et concentration initiale des sels et teneur en peroxyde d’hydrogène utilisés pour la synthèse des apatites nanocristallines codopées
422
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
VI.2.3. Caractérisations physico-chimiques
Dans cette section, nous présenterons les caractérisations physico-chimiques
préliminaires réalisées sur les échantillons dont le protocole de synthèse a été décrit dans la
section précédente.
Notons, en premier lieu, quelques observations visuelles particulières réalisées sur ces
échantillons :
-
La poudre de l’échantillon 1j-5%Cu/5%Zn (synthétisé en présence de Cu2+ et Zn2+)
possède une couleur bleue caractéristique de la présence d’ions Cu 2+, identique à
celle observée pour les échantillons « monodopés » avec Cu2+ décrits dans le
chapitre IV. Il semble donc qu’au moins l’élément cuivre soit présent dans cet
échantillon.
-
La poudre de l’échantillon 1j-1%Cu/1%Ag possède quant à elle une couleur
bleue/verte différente de celle de l’échantillon 1j-5%Cu/5%Zn. Il semble qu’en plus de
la couleur bleue liée à la présence d’ions Cu2+, l’on soit en présence d’une autre
espèce colorée, probablement jaune (pour donner du vert au final) ce qui pourrait être
assimilé à la potentielle présence d’Ag3PO4 (de couleur jaune).
-
La poudre de l’échantillon 1j-1%Ag/H2O2 possède une couleur jaune soutenue,
couleur qui est plus intense qu’un échantillon synthétisé uniquement avec du
peroxyde d’hydrogène (sans argent mais dans les mêmes conditions, voir
section VI.1.3) qui possède un couleur jaune pâle. Dans ce cas la couleur jaune
aurait potentiellement deux origines : la présence d’ions superoxyde et d’Ag3PO4.
-
Enfin, lors de la préparation de la solution « cationique » pour la synthèse de
l’échantillon 1j-1%Cu/H2O2, contenant à la fois des cations Ca2+ et Cu2+ et du
peroxyde d’hydrogène, il a été observé une coloration en vert kaki de la solution
(avec l’éventuelle présence d’un précipité) et un dégagement gazeux. Étant en
présence d’espèces oxygénées, il est possible que ce dégagement gazeux ait été
une libération d’O2 issue d’une réaction entre le peroxyde d’hydrogène et le cuivre (le
calcium n’engendrant pas ce genre de phénomène). Or comme nous l’avons évoqué
dans la section VI.2.1, le nitrate de cuivre est connu pour réagir avec le peroxyde
d’hydrogène et former un composé de formule brute CuO 2H (Varma & Dahiya, 1998)
mais la réaction de formation de cette espèce ne génère pas d’O 2. Soit une réaction
différente se produit dans ces conditions, soit le dégagement gazeux est une réaction
secondaire à la formation du CuO2H. Aucune information relative à ce phénomène
n’a été reportée à notre connaissance. Au final, la poudre de l’échantillon
1j-1%Cu/H2O2 est également de couleur vert kaki. Afin d’approfondir ces
observations, une synthèse en présence uniquement d’ions Cu 2+ et de peroxyde
423
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
d’hydrogène a été réalisée. Pour cela, 37,5 mL d’une solution de Cu(NO 3)2.3H2O à
0,4 mol/L ont été préparés dans laquelle ont été versés 12,5 mL d’une solution de
H2O2 à 110 volumes (soit une concentration finale d’ions Cu 2+ de 0,3 mol/L et une
teneur en H2O2 de 25 % volumique). Cette synthèse conduit à la formation d’un
précipité qui a été récupéré après 5 minutes de réaction par filtration. A noter que le
filtrat récupéré avait une couleur bleue caractéristique d’une solution contenant des
ions Cu2+. Le précipité a ensuite été lavé et lyophilisé pendant 3 jours. La poudre
finale possède une couleur marron foncé. Une analyse par DRX (Figure VI.168) et par
MEB (Figure VI.169) ont été réalisées et révèlent un composé cristallisé (relativement
faiblement) présentant une morphologie sous forme d’agglomérats microniques de
feuillets (d’environ 1 µm de longueur). Ces analyses n’ont cependant pas permis de
déterminer la nature de cette phase.
18000
16000
Intensité (u. a.)
14000
12000
10000
8000
6000
4000
2000
0
20
30
40
50
60
2 (degré) (
70
Co
80
90
)
Figure VI.168 : Diagrammes de diffraction des rayons X du produit de réaction entre Cu(NO 3)2.3H2O et H2O2
Figure VI.169 : Micrographies de microscopie électronique à balayage du produit de réaction entre Cu(NO 3)2.3H2O et
H2O2
424
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Pour déterminer l’éventuelle présence de phases secondaires, comme peuvent le
suggérer les observations visuelles, une analyse par diffraction des rayons X a été menée sur
les échantillons dont le protocole de synthèse est décrit dans la section précédente. Les
résultats de ces analyses sont reportés dans les Figure VI.170 et Figure VI.171 en comparaison
avec une apatite nanocristalline non dopée ayant pour temps de maturation 1 jour et
synthétisée en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ. La Figure VI.170 reporte
les diffractogrammes des échantillons codopés avec des cations uniquement (Cu2+ et/ou Zn2+
et/ou Ag+) et la Figure VI.171 reporte ceux codopés en présence de peroxyde d’hydrogène (avec
Cu2+, Zn2+ ou Ag+).
Intensité (u. a.)
20000
15000
10000
1j - 1%Zn/1%Ag
1j - 1%Cu/1%Ag
5000
1j - 5%Cu/5%Zn
Non dopée
0
20
30
40
50
2 (degré) (
60
Co
70
80
)
Figure VI.170 : Diagrammes de diffraction des rayons X des échantillons codopés avec des cations Cu2+ et/ou Zn2+ et/ou
Ag+ synthétisés par coprécipitation à température ambiante avec un temps de maturation de 1 jour en utilisant
Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en comparaison avec une apatite nanocristalline non dopée synthétisée
dans les mêmes conditions
425
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
35000
Intensité (u. a.)
30000
25000
20000
1j - 1%Ag/H2O2
15000
1j - 1%Zn/H2O2
10000
1j - 1%Cu/H2O2
5000
Non dopée
0
20
30
40
50
2 (degré) (
60
Co
70
80
)
Figure VI.171 : Diagrammes de diffraction des rayons X des échantillons codopés en présence de 10 % volumique de
peroxyde d’hydrogène et avec Cu2+ ou Zn2+ ou Ag+ synthétisés par coprécipitation à température ambiante avec un
temps de maturation de 1 jour en utilisant Na 2HPO4 ou (NH4)2HPO4 comme sel de phosphate de départ en comparaison
avec une apatite nanocristalline non dopée synthétisée dans les mêmes conditions (en absence de peroxyde d’hydrogène)
Tous ces diffractogrammes n’indiquent la présence que des raies de diffraction d’une
apatite nanocristalline. Aucune phase secondaire n’a donc pu être détectée par DRX malgré la
couleur de la poudre de certains échantillons (comme les échantillons 1j-1%Cu/1%Ag,
1j-1%Ag/H2O2 ou 1j-1%Cu/H2O2). Ainsi, il est possible que, soit la présence de phases
secondaires amorphes ou en trop faibles teneurs ne peut être détectée par DRX, soit les
changements de couleur observés sur ces échantillons sont dus à des interactions entre les
ions Cu2+ et Ag+ pour l’échantillon 1j-1%Cu/1%Ag (aboutissant à une coloration bleu/vert) ou
entre Ag+ et des espèces peroxydées pour l’échantillon 1%Ag/H 2O2 (aboutissant à une
coloration jaune vive).
426
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Dans le cas de l’échantillon synthétisé en présence d’ions Cu2+ et de peroxyde
d’hydrogène (échantillon 1j-1%Cu/H2O2), la phase cristalline issue de la réaction entre Cu2+ et
H2O2 (Figure VI.168) peut être en trop faible quantité pour être détectée ou celle-ci n’est pas
stable à pH neutre. En effet, les conditions dans lesquelles se forment cette phase cristalline
sont des conditions acides (pH entre 2 et 3), que ce soit dans la solution A (voir section VI.2.2),
préparée lors de la synthèse de ces apatites codopées (contenant les ions Ca 2+, Cu2+, NO3- et
H2O2), ou dans le milieu réactionnel de la synthèse avec Cu(NO 3)2.3H2O et H2O2. Or lors de la
précipitation des apatites nanocristallines, le pH atteint une valeur d’environ 7,2 (milieu
tamponné par l’excès d’ions phosphate). Il est donc possible que la phase cristalline issue de la
réaction entre Cu2+ et H2O2 ne soit pas stable dans ces conditions et que seule l’apatite soit
présente en fin de réaction. Dans ce cas la couleur verte de la poudre de l’échantillon
1j-1%Cu/H2O2 pourrait être due à la fois à la présence d’ions Cu2+ (couleur bleue) et d’ions
superoxyde (couleur jaune).
Si l’on s’intéresse à l’état de cristallinité de ces échantillons, il est possible de remarquer
que la présence simultanée de cuivre et de zinc dans le milieu de précipitation conduit, comme
on pouvait s’y attendre, à des apatites dont l’état de cristallinité est plus faible qu’une apatite
non dopée (diffractogramme moins bien résolu, Figure VI.170). Cette observation n’est pas
surprenante dans la mesure où à la fois le cuivre et le zinc ont été qualifiés d’inhibiteurs de
croissance cristalline (chapitre III et IV). Pour les échantillons ayant été synthétisés en présence
d’ions Ag+ et Cu2+ ou d’ions Ag+ et Zn2+, aucune modification significative de la résolution des
diffractogrammes n’a été observée. Il est possible que les teneurs en cations dopants soient
trop faibles pour engendrer des modifications significatives de l’état de cristallinité. Pour les
échantillons synthétisés en présence de peroxyde d’hydrogène et d’un cation dopant (Cu 2+,
Zn2+ ou Ag+), la résolution des diffractogrammes est systématiquement améliorée en
comparaison avec un échantillon non dopé. Il apparaît donc que l’effet « accélérateur » de
croissance cristalline du peroxyde d’hydrogène soit prépondérant sur l’effet « inhibiteur » des
ions Cu2+ ou Zn2+. La présence d’ions Ag+ (qui, seuls, ne modifient pas l’état de cristallinité des
apatites) ne semble pas altérer cet effet « accélérateur » de croissance cristalline de H2O2.
Afin d’approfondir ces résultats et de confirmer potentiellement certaines des hypothèses
que nous venons de formuler, une analyse par spectroscopie infrarouge a été réalisée sur les
échantillons dont le protocole de synthèse est décrit dans la section précédente. Les spectres
FTIR de ces échantillons, reportés aux annexes VI.3 et VI.4, ne révèlent que les bandes
d’absorption caractéristiques d’une apatite nanocristalline, sans présence de bandes
secondaires. Cette observation soutient l’hypothèse de l’absence de phases secondaires
comme le suggérait la DRX mais ne la confirme pas dans la mesure où les bandes d’absorption
des apatites nanocristallines sont larges et peuvent éventuellement masquer des bandes
secondaires.
427
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Une décomposition spectrale dans le domaine 400-800 cm-1 a été réalisée sur ces
spectres FTIR. Les résultats de cette analyse suggèrent tout d’abord l’absence d’ions OH - dans
tous les échantillons. Ces résultats ne sont pas surprenants étant donné que le
« monodopage » (enrichissement des apatites avec une seule espèce dopante) conduisait aux
mêmes résultats avec ces conditions expérimentales (1 jour de maturation à température
ambiante en utilisant Na2HPO4 comme sel de départ) ou en présence de peroxyde d’hydrogène
(incorporation potentielle d’espèces peroxydées en remplacement des ions OH -). Au niveau des
ions HPO42- non-apatitiques, la décomposition spectrale en révèle une faible teneur relative
(inférieure à la teneur que l’on retrouve dans un échantillon non dopé) pour l’échantillon
synthétisé avec Cu2+ et Zn2+ (échantillon 1j-5%Cu/5%Zn), comme le montre la Figure VI.172.
Ces résultats concordent avec ceux obtenus pour les échantillons monodopés en cuivre ou en
zinc qui révélaient une diminution de la teneur en ions HPO 42- non apatitiques avec
l’augmentation de la teneur en ions Cu2+ ou Zn2+ (voir chapitres III et IV). A ce niveau, le
codopage ne semble donc pas engendrer de conséquences particulières, seul un effet
cumulatif des actions des deux ions peut être observé. Une baisse de la teneur en ions HPO 42non-apatitiques peut également être observée pour les échantillons 1j-1%Cu/1%Ag et
1j-1%Zn/1%Ag en comparaison avec l’échantillon non dopé (Figure VI.172). Cette évolution peut
également être reliée à la présence de Cu2+ ou Zn2+ mais étant en teneur moindre la diminution
n’atteint pas celle de l’échantillon 1j-5%Cu/5%Zn. Enfin, la décomposition spectrale révèle
également une diminution relativement identique de la teneur en ions HPO 42- non-apatitiques
pour chaque échantillon codopé en présence de peroxyde d’hydrogène (Figure VI.172).
L’incorporation seule de peroxyde d’hydrogène dans le milieu de précipitation des apatites
nanocristallines générait une baisse de la teneur en ions HPO 42- non-apatitiques, il est donc
possible que l’évolution observée ici soit en partie due à la présence de H2O2, en addition de
l’effet généré par les cations dopants. Au final, il ne semble pas apparaitre d’évolution
particulière liée au codopage en comparaison avec les monodopages correspondants.
428
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
0,250,250,25
Rapports des aires intégrées
Rapports des aires intégrées
Rapports des aires intégrées
HPO42- non-apatitiques
0,200,200,20
0,150,150,15
0,100,100,10
0,050,050,05
89
9
%
Ag
/H
8
2O
2
2
O
2
78
1j
-1
7
/H
2O
2
67
%
Zn
u/
6
H
56
1j
-1
%
Zn
5
%
C
Ag
%
45
/1
1%
Ag
4
1j
-1
1j
-1
%
C
u/
u/
5%
34
3
1j
-1
Zn
23
2
C
12
%
do
p
1
1j
-5
N
on
1
ée
0,000,000,00
Figure VI.172 : Évolution des quantités relatives en ions HPO42- non-apatitiques relevées par décomposition spectrale
FTIR pour des apatites nanocristallines codopées soit par voie cationique (avec Cu 2+ et/ou Zn2+ et/ou Ag+) soit par
synthèse en présence de H2O2 et avec Cu2+ ou Zn2+ ou Ag+ (les références indiquées sont celles mentionnées dans le
Tableau VI.83)
En perspective de ce travail, il serait intéressant d’évaluer la teneur des différents ions
(Cu , Zn2+ et/ou Ag+) et des espèces oxygénées présentes dans les composés finaux afin de
confirmer le codopage effectif des apatites. Néanmoins nous avons vu dans cette section que la
présence de plusieurs espèces dopantes dans le milieu de réaction des apatites
nanocristallines n’engendrait pas la formation de phases secondaires détectables en DRX ou
2+
en FTIR, et que des modifications chimiques s’apparentant aux effets individuels des différents
ions potentiellement incorporés semblaient se produire (résultats FTIR).
Dans la section suivante, nous présenterons les résultats préliminaires de l’évaluation
antibactérienne de tels échantillons d’apatites nanocristallines codopées.
429
9
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
VI.2.4. Évaluation des propriétés antibactériennes
Dans cette section nous nous intéresserons donc aux tests d’évaluation d’éventuelles
propriétés antibactériennes sur des apatites nanocristallines codopées synthétisées en
présence d’ions Cu2+, Zn2+ et/ou Ag+ et/ou de peroxyde d’hydrogène.
Concernant les échantillons évalués ici, les teneurs en cations dopants testées ont été
diminuées en comparaison avec les échantillons décrits dans la section précédente
(section VI.2.3), afin de se rapprocher des teneurs qui avait fourni des échantillons monodopés
non ou peu cytotoxiques. Ainsi, en suivant le protocole décrit dans la section VI.2.2, trois
échantillons synthétisés avec des teneurs initiales de 0,1 % molaire pour chaque cation
(pourcentage en cations totaux initialement introduits dans la solution « cationique » A) ont été
préparés avec les couples Cu2+/Zn2+, Cu2+/Ag+ et Zn2+/Ag+ (référencés respectivement 1j0,1%Cu/0,1%Zn, 1j-0,1%Cu/0,1%Ag et 1j-0,1%Zn/0,1%Cu). Des échantillons codopés avec du
peroxyde d’hydrogène et un cation dopant (Cu 2+ ou Zn2+ ou Ag+) ont également été testés ici.
Cependant, étant donné la formation d’un précipité lors de la préparation de la solution
« cationique » contenant Cu2+ et H2O2, une modification du protocole de synthèse a été réalisée
pour tous les échantillons codopés en présence de H 2O2 (avec Cu2+, Zn2+ ou Ag+). En suivant
les étapes de préparations décrites dans la section VI.2.2, le H2O2 n’est ajouté qu’à la solution
« anionique » (la solution « cationique » n’étant préparée qu’avec de l’eau désionisée). La
solution A a donc été préparée avec une concentration en Ca 2+ de 0,3272 mol/L et en cation
dopant (Cu2+, Zn2+ ou Ag+) de 0,0003 mol/L (soit 0,1 % molaire en cation dopant) dans 45 mL
d’eau désionisée. La solution B a été préparée avec 8,6 g de Na 2HPO4 (pour les synthèses
avec Cu2+ et Zn2+) et 8,0 g de (NH4)2HPO4 (pour la synthèse avec Ag+), soit une concentration
en ions phosphate de 0,63 mol/L, avec 90 mL d’eau désionisée et 15 mL d’une solution de
peroxyde d’hydrogène à 110 volumes (soit 10 % volumique de la solution de H2O2 au final
après la coprécipitation). La solution A est ensuite versée dans la solution B et le reste de la
synthèse suit le protocole décrit dans la section VI.2.2 (1 jour de temps de maturation à
température ambiante et avec une étape de pré-équilibrage par lavage avec Na3PO4 à
pH = 11). Ces échantillons ont donc été synthétisés avec 0,1 % molaire de Cu2+ ou Zn2+ ou Ag+
et 10 % volumique de H2O2 (référencés respectivement 1j-0,1%Cu/H2O2, 1j-0,1%Zn/H2O2 et
1j-0,1%Ag/H2O2). Le Tableau VI.84 résume les caractéristiques principales des échantillons
utilisés pour les tests microbiologiques.
430
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Référence
de
l'échantillon
Teneur relative
initiale
en cations
(% molaire*)
% volumique**
de solution de H2O2
dans le milieu
de réaction
Nature
du sel de
phosphate
1j-0,1%Cu/0,1%Zn
0,1% Cu2+ / 0,1% Zn2+
NP
Na2HPO4
1j-0,1%Cu/0,1%Ag
0,1% Cu2+ / 0,1% Ag+
NP
Na2HPO4
1j-0,1%Zn/0,1%Ag
0,1% Zn2+ / 0,1% Ag+
NP
Na2HPO4
1j-0,1%Cu/H2O2
0,1% Cu2+
10%
Na2HPO4
1j-0,1%Zn/H2O2
0,1% Zn2+
10%
Na2HPO4
1j-0,1%Ag/H2O2
0,1% Ag+
10%
(NH4)2HPO4
* pourcentage par rapport aux cations totaux contenus dans la solution A (le sodium n'est pas comptabilisé)
** ce pourcentage correspond à la valeur au rapport :
Volume de solution de H 2O2 (à 110 Volume )
Volume de solution total
NP : Non présent
Tableau VI.84 : Caractéristiques principales des échantillons codopés utilisés pour les tests microbiologiques
Pour ces tests, les échantillons ont été mis sous forme de pastilles d’un diamètre de
13 mm et de masse 150 mg par compression uniaxiale à température ambiante. La souche
bactérienne sélectionnée est S. aureus et la méthode utilisée pour quantifier les bactéries en fin
de test était la méthode « agar ». Le protocole expérimental de ce test est identique à celui
décrit dans la section II.4.4 du chapitre II et le test a été répété deux fois. Les résultats de ce
test, exprimés en nombre de colonies formées par mL (cfu / mL) et en comparaison avec un
échantillon d’apatite nanocristalline non dopée (maturée 1 jour) ne présentant pas d’activité
antibactérienne sont reportés à la Figure VI.173.
431
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
S. aureus
1,0E+07
Test 1
Test 2
1,0E+06
cfu (1/mL)
1,0E+05
Limite de
quantification
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
2
1j
-0
.1
%
Ag
2
/H
2O
2
O
1j-0,1%Ag/H2O2
H
Zn
/
1j
-0
.1
%
u/
H
2O
2
1j-0,1%Cu/H2O2 1j-0,1%Zn/H2O2
C
Zn
/0
.1
%
Ag
1j0,1%Zn/0,1%Ag
1j
-0
.1
%
1j
-0
.1
%
C
u/
0.
1%
Ag
1j0,1%Cu/0,1%Ag
1j
-0
.1
%
1%
Zn
1j0,1%Cu/0,1%Zn
C
u/
0.
.1
%
1j
-0
N
on
do
p
ée
non dopée
Figure VI.173 : Résultats de tests sur plaque d’agar issus de l’évaluation microbiologique sur S. aureus après mise en
contact avec des pastilles d’apatite nanocristalline non dopée ou codopée avec Cu 2+/Zn2+ ou Cu2+/Ag+ ou Zn2+/Ag+ ou
Cu2+/H2O2 ou Zn2+/H2O2 ou Ag+/H2O2 (les références indiquées sont celles mentionnées dans le Tableau VI.84)
Ces résultats révèlent tout d’abord que les tests réalisés sur les échantillons synthétisés
avec Cu/H2O2 ou Zn/H2O2 (échantillons 1j-0,1%Cu/H2O2 et 1j-0,1%Zn/H2O2) n’indiquent pas de
diminution significative de formation de colonies sur la plaque d’agar, en comparaison avec
l’échantillon non dopé qui ne présentait pas d’activité antibactérienne. Ces deux échantillons
(à ces teneurs en ions dopants) ne semblent donc pas posséder de propriétés antibactériennes.
Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus pour les échantillons monodopés puisqu’aux
mêmes teneurs initiales (0,1 % molaire en cuivre ou en zinc ou 10 % volumique de H2O2) sur
des apatites nanocristallines monodopées aucune activité antibactérienne n’avait été observée
(voir section III.3.2 du chapitre III, section IV.4.2 du chapitre IV et section VI.1.4 de ce chapitre).
Il ne semble donc pas y avoir, dans ces conditions de codopage, d’effets synergiques entre le
cuivre et le H2O2 ou entre le zinc et le H2O2.
En revanche, les résultats de la Figure VI.173 indiquent que tous les échantillons
contenant de l’argent (échantillons 1j-0,1%Cu/0,1%Ag, 1j-0,1%Zn/0,1%Ag et 1j-0,1%Ag/H2O2)
conduisent à une diminution significative de la formation de colonies de S. aureus en
comparaison avec l’échantillon non dopé (non antibactérien). Bien que quelques dizaines de
colonies aient été observées lors du test 1 pour les échantillons 1j-0,1%Cu/0,1%Ag et
1j-0,1%Zn/0,1%Ag (80 et 20 colonies formées par mL respectivement), ces données révèlent
que les échantillons synthétisés avec 0,1 % molaire d’Ag+ et une autre espèce dopante (Cu2+,
432
Chapitre VI – Enrichissement en composés peroxydés
et étude de codopages
Zn2+ ou H2O2) possèdent des propriétés antibactériennes significatives. Cependant, l’échantillon
monodopé avec 0,1 % molaire d’ions Ag+ présentait également des propriétés antibactériennes
importantes (voir section V.4.2 du chapitre V) : il sera donc nécessaire d’effectuer des tests
complémentaires, en perspective de ce travail, pour déterminer si l’activité antibactérienne de
formulations impliquant la présence supplémentaire d’ions Cu 2+ ou Zn2+ ou de H2O2 revêt un
caractère synergique et pourrait éventuellement permettre de réduire la quantité d’argent.
Enfin, concernant l’échantillon synthétisé avec Cu 2+ et Zn2+ (échantillon
1j-0,1%Cu/0,1%Zn), les résultats du test 1 (Figure VI.173) indiquent un nombre de colonies de
S. aureus formées significativement inférieur à celui observé pour l’échantillon non dopée
attestant dans ce cas d’une activité antibactérienne de l’échantillon. En revanche, le test 2
(Figure VI.173) révèle un nombre de colonies formées pour l’échantillon 1j-0,1%Cu/0,1%Zn
relativement similaire à celui comptabilisé pour l’échantillon non dopé, se montrant donc ici
inefficace pour lutter contre S. aureus. Il apparaît cependant difficile d’expliquer une telle
variation sans analyses plus approfondies.
VI.2.5. Conclusion
Nous avons vu dans cette seconde partie de chapitre que la synthèse d’apatites
nanocristallines en présence de plusieurs espèces potentiellement antibactériennes (Cu 2+, Zn2+,
Ag+ ou H2O2) apparaissait possible. Les codopages que nous avons testés ne semblent pas
engendrer de modifications physico-chimiques particulières sur la phase apatitique autres que
celles déjà observées individuellement pour chaque espèce dopante. En perspective, des
caractérisations physico-chimiques supplémentaires restent nécessaires pour quantifier chaque
espèce présente et évaluer leurs influences au sein des nanocristaux d’apatite. Des synthèses
additionnelles seront également nécessaires pour déterminer les teneurs maximales de chaque
espèce qu’il est possible d’incorporer aux apatites nanocristallines dans ces conditions de
codopage.
Des analyses complémentaires (d’évaluation de la cytotoxicité ainsi que d’autres tests
microbiologiques pour des teneurs croissantes en agents actifs) seront aussi nécessaires afin
de rechercher les concentrations optimales pour garantir à la fois une activité antibactérienne
effective et une cytotoxicité la plus faible possible. Néanmoins, les échantillons codopés en
présence d’ions Ag+ avec soit les ions Cu2+, Zn2+ ou avec H2O2 s’avèrent être de bons
candidats pour réaliser des biocéramiques à base d’apatites nanocristallines présentant une
activité antibactérienne avec possibilité de réduire éventuellement la teneur en ions Ag +
nécessaire.
433
Conclusion
générale
Conclusion générale
Ces travaux de thèse ont porté sur l’élaboration, la caractérisation physico-chimique, et
l’évaluation (micro-)biologique d’apatites nanocristallines phospho-calciques biomimétiques
enrichies en ions potentiellement antibactériens, parmi Zn 2+, Cu2+, Ag+ ou des espèces
oxygénées de type peroxyde, destinées à fournir à terme des biocéramiques luttant contre les
infections post-opératoires en sites osseux. Tout au long de ce travail, nous nous sommes
attachés à préparer des systèmes apatitiques monophasés, et à déterminer l’effet de tels
dopages sur les caractéristiques physico-chimiques des apatites obtenues.
L’étude des systèmes non dopés a tout d’abord permis d’élaborer la « carte
d’identité » d’apatites nanocristallines biomimétiques de synthèse. Nous pouvons noter que le
faible état de cristallinité que présentent ces composés, au même titre que les apatites
biologiques composant le tissu osseux, est en lien avec les dimensions nanométriques des
cristaux les constituant, et avec un degré de désordre cristallin que nous avons tenté d’évaluer
à partir des données de diffraction des rayons X. La composition chimique globale révèle par
ailleurs la présence de lacunes en sites cationiques (Ca 2+) et en sites « hydroxyde » (OH-) ainsi
que la présence d’ions hydrogénophosphate (HPO 42-) en remplacement de certains ions
phosphate (PO43-). Les techniques de spectroscopies vibrationnelles (FTIR et Raman) ont par
ailleurs été exploitées afin de mettre en évidence, en lien avec des travaux antérieurs, la
présence d’environnements phospho-calciques non-apatitiques en surface des nanocristaux
d’apatite, puis d’en suivre l’évolution des quantités relatives en différentes espèces, apatitiques
et non-apatitiques.
L’analyse de l’influence des paramètres de synthèse a indiqué qu’ils jouent un rôle
majeur sur les caractéristiques physico-chimiques des apatites obtenues. Ainsi, l’augmentation
du temps de maturation en solution ou de la température de maturation engendre une
amélioration de l’état de maturation des apatites, comprenant une amélioration de l’état de
cristallinité, une composition chimique plus proche de la stœchiométrie et des environnements
non-apatitiques moins développés. D’un autre côté, un pH alcalin génère une carbonatation des
échantillons tandis qu’un pH acide engendre la formation de brushite (CaHPO 4.2H2O). La
nature des contre-ions des sels utilisés lors de la synthèse détermine également certaines
caractéristiques des apatites nanocristallines précipitées. Si certains ions comme NH 4+ ou NO3ne semblent pas interagir avec le précipité formé, d’autres comme Na+ peuvent être incorporés
au composé. Dans la mesure où Na+ apparaît être un inhibiteur de croissance cristalline pour
les apatites, sa présence dans le milieu réactionnel ne doit donc pas être sous-estimée.
435
Conclusion générale
Toutes les informations collectées à partir des résultats obtenus en variant les
paramètres de synthèse montrent qu’il est important, lorsque la préparation de matériaux à
base d’apatites nanocristallines est envisagée, de prendre en compte l’influence de chaque
paramètre de synthèse. Mais il s’avère également possible de moduler les caractéristiques
physico-chimiques des apatites nanocristallines en agissant sur ces paramètres pour les
adapter aux conditions d’utilisation envisagées, comme par exemple pour une libération
contrôlée de principes actifs, pour obtenir des vitesses de dégradation in vitro ou in vivo
modulables,… De plus, ces données ont permis d’appréhender plus aisément les phénomènes
observés par la suite lors de l’incorporation des éléments dopants.
L’influence de certains post-traitements sur les caractéristiques physico-chimiques des
apatites nanocristallines non dopées a également été évaluée dans ce travail. Il apparaît
notamment que le mode de stockage de tels composés est un paramètre pouvant s’avérer
capital lorsque l’on envisage l’utilisation ou la commercialisation de ces biocéramiques. Un
stockage à température ambiante peut notamment générer une hydroxylation et une
décarbonatation progressive des échantillons alors qu’une conservation à basse température
(testée ici en congélateur à -18 þC) n’engendre pas d’évolution détectable. Dans ce contexte, il
n’apparaît pas surprenant d’observer des modifications physico-chimiques lors de traitements
thermiques même à des températures ≤ 100 þC). Une dénaturation partielle des
environnements non-apatitiques de surface semble être consécutive à ces traitements en
température. Outre la température, le taux d’humidité environnant se révèle également être un
paramètre particulièrement influant sur les mécanismes d’évolution des apatites. Dans la
mesure où le taux d’humidité régit certains phénomènes de gain ou de perte d’eau au sein des
échantillons, il apparaît vraisemblablement responsable des modifications physico-chimiques
observées dans ces conditions. La remise en suspension dans divers milieux aqueux
d’échantillons d’apatites nanocristallines non dopées et préalablement lyophilisés a été étudiée.
Il s’avère qu’une ré-immersion de tels composés lyophilisés génère non seulement la
réactivation mais également l’accélération des processus de maturation, et ce même en milieu
exempt de calcium ou de phosphate. Une étude sur la mise en forme de tels échantillons a
également été réalisée. Elle révèle qu’un pastillage par compression uniaxiale (par exemple à
80 MPa) à température ambiante est possible, probablement via des interactions se produisant
entre les couches hydratées non apatitiques de surface des nanocristaux d’apatites, sans pour
autant altérer les caractéristiques physico-chimiques des composés. Enfin, deux modes de
stérilisation (en voie sèche à 150 °C ou par plasma de H2O2) ont été testés et évalués pour leur
incidence sur les caractéristiques physico-chimiques des apatites nanocristallines. Ces
analyses montrent qu’il est préférable d’éviter les procédés impliquant des températures
« élevées » (typiquement > 100 °C) même sur des périodes de temps courtes. Dans tous les
cas, il sera préférable d’évaluer l’incidence physico-chimique potentielle de la méthode de
stérilisation sélectionnée.
436
Conclusion générale
Bien que ces composés apparaissent plutôt sensibles aux conditions dans lesquelles ils
sont utilisés (ré-immersion en solution, température,…), ils n’en restent pas moins prometteurs
quant à une utilisation en ingénierie tissulaire de l’os. En effet, les différentes modifications
physico-chimiques observées au cours de ces divers post-traitements sont tout de même
limitées et ne permettent pas de perdre les caractères nanocristallin, non-stœchiométrique,
hydraté et réactif (via une couche hydratée non-apatitique de surface) de telles apatites, dont
les caractéristiques physico-chimiques demeurent comparables à celles du minéral osseux,
contrairement au cas de l’hydroxyapatite stœchiométrique.
Il n’en demeure pas moins que cette étude met en exergue la nécessité de suivre et
contrôler les effets de chaque étape de synthèse ou de post-traitement réalisé sur de tels
composés apatitiques biomimétiques afin d’identifier / maîtriser toute modification physicochimique.
L’évaluation de tous ces paramètres (de synthèse et de post-traitement) réalisée sur les
échantillons d’apatites nanocristallines a permis de servir de base aux études sur les
échantillons dopés et d’appréhender plus aisément l’influence de l’incorporation des ions
dopants sur les caractéristiques physico-chimiques des composés.
L’étude des apatites nanocristallines synthétisées en présence d’ions Zn2+ ou
d’ions Cu2+ a révélé que les deux ions agissaient de manière très similaire sur les mécanismes
de formation et de croissance des nanocristaux. Il s’avère qu’ils jouent un rôle d’inhibiteur de
croissance cristalline pour les apatites, voire d’inhibiteur de maturation suivant les conditions de
synthèse.
Ainsi, l’incorporation de teneurs en ions Zn2+ ou Cu2+ croissantes dans le milieu de
précipitation (pour des synthèses réalisées à température ambiante et à pH = 7,2 tamponné par
un excès d’ions phosphate apporté par (NH4)2HPO4) conduit à la formation d’apatites
nanocristallines enrichies en zinc ou en cuivre dont l’état de maturation diminue, c'est-à-dire
dont l’état de cristallinité baisse (dimensions des cristallites plus petites et désordre cristallin
plus important), la composition chimique s’écarte de la stœchiométrie et les environnements
non-apatitiques de surface des nanocristaux sont plus développés. Dans ces conditions de
synthèse, la teneur maximale en ions (zinc ou cuivre) qu’il est possible d’atteindre pour
conserver un système d’apatites nanocristallines monophasées est de l’ordre de 5 % molaire
(pourcentage par rapport aux cations totaux) mais dépend du temps de maturation en solution.
Au-delà, le zinc favorise la formation de phases secondaires de type NH 4ZnPO4 et le cuivre
favorise la formation de brushite (CaHPO4.2H2O, potentiellement enrichie en cuivre).
437
Conclusion générale
L’augmentation de la température de maturation permet de favoriser la formation
d’apatites nanocristallines monophasées à des teneurs en zinc ou en cuivre supérieures à 5 %
molaire. Cependant, l’influence de la température sur les caractéristiques physico-chimiques
des apatites nanocristallines est importante et de faibles états de maturation ne sont pas
atteignables dans ces conditions.
Dans le cas du cuivre, un pH alcalin (pH = 8) permet également d’obtenir des teneurs en
ions Cu2+ incorporées supérieures, au moins jusqu’à 15 % molaire mais les mécanismes
d’incorporation des ions Cu2+ semblent différents dans ces conditions.
Le changement de la nature du contre-ion du sel de phosphate de départ utilisé lors de la
synthèse permet également d’atteindre des teneurs maximales en zinc ou en cuivre plus
importante que 5 % molaire. Ces teneurs sont de 17 et 10 % molaire respectivement pour le
zinc et le cuivre en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ. Il apparaît cependant
que la co-incorporation d’ions sodium et d’ions zinc ou cuivre dans ces conditions engendre des
modifications particulières (abaissement de l’état de cristallinité, diminution des teneurs en ions
OH- et HPO42- ainsi qu’augmentation du rapport « cations / phosphore ») au niveau des
caractéristiques physico-chimiques des apatites.
Différents tests ont également été réalisés pour obtenir des apatites nanocristallines dont
l’enrichissement en cuivre serait effectué préférentiellement en surface des nanocristaux dans
le but de potentiellement libérer les ions cuivre pendant les premiers moments suivant
l’intervention chirurgicale en site osseux tout en limitant la teneur en ions cuivre « étrangers ».
Deux méthodes ont alors été envisagées : une impliquant des échanges ioniques de surface
réalisée par immersion d’un échantillon d’apatite nanocristalline dans une solution contenant
des ions Cu2+ ; une autre pour laquelle les ions cuivre ont été ajoutés en cours de maturation
impliquant ainsi deux étapes successives de croissance des cristaux (la première en absence
de cuivre et la seconde avec). La première méthode, en raison de l’acidité des solutions de
cuivre, a nécessité des conditions expérimentales relativement contraignantes utilisant une
membrane de dialyse pour réguler les cinétiques d’échange entre les différentes espèces. Cette
méthode permet effectivement d’obtenir des échantillons d’apatites nanocristallines enrichies en
cuivre, cependant l’incorporation des ions cuivre ne semble pas être localisée uniquement en
surface des cristaux mais également affecter le cœur apatitique. La même observation peut être
faite pour les échantillons préparés selon la seconde méthode : bien que des teneurs finales en
cuivre importantes puissent être obtenues (15 % molaire) : il semble qu’une partie des ions
cuivre soit localisée dans des environnements plus profonds des nanocristaux (cœur
apatitique).
438
Conclusion générale
Les phénomènes observés pour les synthèses d’apatites nanocristallines réalisées en
présence de cuivre ou de zinc sont différents de ceux observés en présence d’argent. En
présence d’ions Ag+, la formation d’apatites nanocristallines monophasées a été obtenue pour
des teneurs allant jusqu’à 4 % molaire. Au-delà, une phase secondaire d’Ag3PO4 se forme.
Pour atteindre cette valeur de 4 %, la teneur en argent initialement introduite en solution lors de
la synthèse doit être supérieure mais dépend du temps de maturation en solution (plus le temps
de maturation est long, plus il y a d’argent incorporé dans les échantillons ; dans la limite de
4 % molaire dans le composé final). L’incorporation d’argent ne génère pas de modification
significative de l’état de maturation des apatites nanocristallines. En revanche, il est possible
d’observer, en fonction des conditions, une baisse des teneurs en ions OH - qui a été attribuée
au fait que l’ion Ag+ ne possède qu’une seule charge positive (comparée aux deux charges
positives de l’ion Ca2+).
Des conditions acides de synthèse (pH = 6.5) ou la présence d’ions Na + dans le milieu
de réaction (utilisation de Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ) favorisent la formation
d’Ag3PO4 alors que des conditions basiques (pH = 8.5) permettent de conserver un système
composé d’apatite nanocristalline monophasée. La modification du pH de maturation ne semble
pas modifier les mécanismes d’incorporation des ions Ag+ dans le composé.
Des tests préliminaires d’obtention d’apatites nanocristallines en présence de
peroxyde d’hydrogène dans le milieu de précipitation ont également été effectués. Ils révèlent
que l’obtention d’apatites nanocristallines monophasées est possible, même à des
concentrations en H2O2 importantes en solution. La présence de H2O2 dans le milieu
réactionnel engendre cependant une amélioration de l’état de cristallinité de l’apatite,
principalement due à l’élargissement des cristallites dans les directions (hk0). Des espèces
chimiques peroxydées telles que les ions O22-, voire O2-, O32- ou O42-, semblent être présents
dans les échantillons au niveau des tunnels apatitiques en remplacement des ions OH -. Des
systèmes apatitiques bien cristallisés ont également été préparés en milieu eau / peroxyde
d’hydrogène. De tels systèmes ont été synthétisés par hydrolyse du βTCP en présence de H 2O2
dans le milieu réactionnel. Cependant, il s’avère que dans ces conditions, l’hydrolyse complète
du βTCP en apatite ne se produit que pour de fortes teneurs en H2O2 (75 % volumique) ou à
des températures relativement élevées (150 °C).
Enfin, une première série d’expérimentations impliquant l’incorporation simultanée
(codopage) de deux agents ayant des propriétés potentiellement antibactériennes, parmi
Zn2+, Cu2+, Ag+ ou les composés peroxydés, a été menée. Une nouvelle fois, l’obtention
d’apatites nanocristallines monophasées a été possible et les modifications physico-chimiques
engendrées par ces conditions de synthèse semblent résulter de l’effet cumulé de chaque
agent incorporé.
439
Conclusion générale
Divers tests préliminaires de libération d’ions en conditions statiques ou dynamiques
ont été réalisés au cours de ce travail, pour les systèmes enrichis en cuivre ou en argent qui se
sont avérés présenter des effets antibactériens significatifs. Si les quantités d’ions cuivre
apparaissent difficilement détectables à partir des techniques de dosages utilisées, la libération
effective d’ions argent a pu être déterminée à partir de ces tests, révélant des concentrations en
argent libérées, en milieu aqueux « simple », de l’ordre de 1 à 3 % des teneurs initialement
présentes dans le solide. Des tests de libération de tels ions à partir d’apatites dopées
immergées dans des milieux plus complexes (fluides biologiques simulés, milieux de culture
cellulaires…) devront compléter cette étude préliminaire.
Afin d’évaluer l’éventuelle toxicité des biocéramiques synthétisées dans ce travail vis-àvis de cellules ostéogéniques, des tests de cytotoxicité (réalisés en collaboration avec l’institut
Fraunhofer IGB de Stuttgart, Allemagne) et de résorption ostéoclastique (expérimentations
réalisées au cours d’un séjour à l’IGFL de Lyon) ont été menés. La mise en contact de cellules
de type ostéoblaste (cellules de la ligné CAL-72) avec des échantillons d’apatites
nanocristallines n’a pas révélée d’altération du développement cellulaire, nous permettant de
déterminer les limites de cytotoxicité pour les différents systèmes étudiés (typiquement menant
à une teneur en ion cuivre ou argent de l’ordre de 0,5 % molaire par rapport aux cations, le zinc
ne s’étant pas avéré conférer une cytotoxicité détectable aux échantillons). En revanche, il est
important de prendre en compte la potentielle acidification des milieux de culture lorsque des
échantillons d’apatites nanocristallines biomimétiques sont immergés, afin d’éviter d’altérer les
résultats des tests biologiques. Une étude sur le pré-équilibrage des échantillons a donc été
menée dans ce travail de thèse afin de limiter ces phénomènes d’acidification. La méthode
choisie au final consiste à employer, lors de la synthèse des apatites nanocristallines, une
solution basique de Na3PO4 (à pH = 11) au moment de la filtration avant l’étape de rinçage.
Des études préliminaires destinées à évaluer la capacité de cellules ostéoclastes à
résorber différentes matrices minérales phosphocalciques (apatites nanocristallines, HAP et
βTCP) ont également été menées. Les premiers résultats indiquent que l’activité cellulaire de
résorption des ostéoclastes semble être maintenue sur des échantillons d’apatites
nanocristallines, à l’instar des échantillons de βTCP, alors qu’elle n’est pas observée sur des
échantillons d’HAP. Les apatites nanocristallines pourraient donc être utilisées comme
biomatériau résorbable pour des applications osseuses.
Enfin, la capacité des apatites nanocristallines à lutter contre le développement de
micro-organismes fréquemment impliqués lors d’infections nosocomiales en site osseux a été
évaluée (en collaboration avec l’institut Fraunhofer IGB à Stuttgart). Les principales souches
bactériennes étudiées dans ce travail ont été S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, et
S. epidermidis. Une souche de A. denticolens a également été testée, mais plus
ponctuellement.
440
Conclusion générale
Nos résultats révèlent que les apatites nanocristallines phospho-calciques non dopées
ne possèdent pas de propriétés antibactériennes intrinsèques détectables. L’ajout de zinc ne
semble pas non plus permettre à ces apatites de réduire le développement des bactéries, tout
au moins dans les conditions de tests utilisées dans ce travail. En revanche, lorsque du cuivre
ou de l’argent sont incorporés à ces apatites, les tests se montrent plus concluants et une
activité antimicrobienne à pu être observé après mise en contact du matériau avec les
micro-organismes et ce même à de faibles taux en ions dopants (cuivre, argent). Il faut
toutefois noter que les conditions de pré-traitement (pré-équilibrage) des échantillons s’avère
être un facteur à ne pas négliger. Par ailleurs, une variation d’activité antibactérienne a été
notée en fonction de la nature de la souche bactérienne. Cette constatation peut ouvrir des
perspectives pour évoluer vers une médecine plus « à la carte » visant à adapter la composition
du biomatériau implanté (et donc la nature et la dose d’agent ionique antibactérien incorporé)
en fonction du type de chirurgie (orthopédie, maxillo-faciale…), du site d’implantation, des
conditions opératoires, voire du passé infectieux du patient. Au final, les échantillons d’apatites
nanocristallines enrichies en argent semblent en particulier fournir un système antibactérien
« robuste » et efficace pour les applications visées. Les échantillons dopés au cuivre ont
également montré certaines propriétés antimicrobiennes significatives, et des tests
complémentaires seront nécessaires pour identifier plus spécifiquement les modes d’action et
les limitations de l’utilisation de cet ion dans une visée antibactérienne associée à des apatites
nanocristallines.
En recoupant les données obtenues avec les tests de cytotoxicité et les tests
antibactériens, il apparaît qu’une apatite nanocristalline synthétisée avec une teneur en argent
de 0,2 % molaire puisse présenter les propriétés optimales (sur la base de ce travail de thèse)
pour les applications visées résultantes d’un compromis entre une faible toxicité vis-à-vis des
cellules ostéogéniques et une activité antibactérienne notoire en lien avec les infections
nosocomiales en sites osseux post-opératoires.
Ce travail a donc permis de trouver des pistes viables pour la réalisation de biomatériaux
de comblement osseux à caractéristiques antibactériennes intrinsèques, et de comparer les
différentes approches entre elles.
En perspective à court terme des résultats présentés dans ce manuscrit, des tests
in vivo sont sur le point d’être réalisés sur un modèle de rat (calvaria) avec des
échantillons d’apatites nanocristallines enrichies en argent (avec une teneur de 0,2 %), afin en
particulier d’en étudier le potentiel ostéoconducteur.
441
Annexes
Annexes
Annexe II.1 : Spectres FTIR d’apatites nanocristallines à temps de maturation en solution croissant, compris entre 20 min et 20 jours
4,0
3,5
Temps
de
maturation
Absorbance
3,0
2,5
20 jours
2,0
6 jours
3 jours
1,5
1 jour
1,0
15 heures
6 heures
0,5
0,0
4000
20 minutes
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
443
Annexe II.2 : Composition du DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)
Concentration
(mg/L)
Concentration
(mmol/L)
Glycine
30
0,4
L-Arginine hydrochloride
84
0,398
L-Cystine 2 HCl
63
0,201
L-Glutamine
L-Histidine hydrochloride-H2O
580
3,97
42
0,2
L-Isoleucine
105
0,802
L-Leucine
105
0,802
L-Lysine hydrochloride
146
0,798
L-Methionine
30
0,201
L-Phenylalanine
66
0,4
L-Serine
42
0,4
L-Threonine
95
0,798
L-Tryptophan
16
0,0784
L-Tyrosine
72
0,398
L-Valine
94
0,803
Choline chloride
4
0,0286
D-Calcium pantothenate
4
0,00839
Folic Acid
4
0,00907
Niacinamide
4
0,0328
Pyridoxine hydrochloride
4
0,0196
0,4
0,00106
4
0,0119
7,2
0,04
Calcium Chloride (CaCl2.2H2O)
264
1,8
Ferric Nitrate (Fe(NO3)3.9H2O)
0,1
0,000248
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)
200
0,813
Potassium Chloride (KCl)
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)
400
5,33
3700
44,05
6400
110,34
141
0,916
4500
25
15
0,0399
Components
Acides Aminés
Vitamines
Riboflavin
Thiamine hydrochloride
i-Inositol
Sels Inorganiques
Sodium Chloride (NaCl)
Sodium Phosphate monobasic (NaH2PO4.2H2O)
Autres Composés
D-Glucose (Dextrose)
Phenol Red
Reference : Dulbecco, R. and Freeman, G. (1959) Virology 8:396.
Annexes
Annexe II.3 : Protocole de test au rouge neutre (tests de cytotoxicité) en utilisant les kits de coloration Xenometrics
Les tests au rouge neutre sur les cellules ostéogéniques CAL-72 pour l’évaluation de la
cytotoxicité ont été réalisés en utilisant des kits de coloration cellulaire « In cytotox NR » de
marque Xenometrics.
Ces kits se composent de 4 solutions :
-
Solution NR I = solution de lavage
-
Solution NR II = solution de coloration (rouge neutre)
-
Solution NR III = solution de fixation
-
Solution NR IV = solution de solubilisation
Après incubation des cellules pendant 48 heures à 37 °C avec 5 % de CO2 sur plaque de
culture 96 puits, le milieu de culture est enlevé et la coloration des cellules se déroule comme
suit :
- Lavage des cellules avec la solution NR I (200 µL par puits)
- Coloration des cellules avec la solution NR II diluée à 1 :50 (100 µL par puits) pendant
3 heures à 37 °C
- Elimination du surnageant
- Fixation des cellules avec la solution NR III (100 µL par puits) pendant 5 minutes
- Élimination de la solution de fixation
- Ajout de la solution NR IV (200 µL par puits) et obtention d’une suspension colorée
- Analyse de la suspension par spectrophotométrie à 540 nm
445
Annexes
Annexe II.4 : Protocole de préparation et de mise en culture des ostéoclastes
Pour évaluer l’activité ostéoclastique vis-à-vis de différents matériaux phosphocalciques
dont des apatites nanocristallines, une étude préliminaire a été réalisée à l’IGFL (Institut de
Génomique Fonctionnelle de Lyon) dans les locaux de l’ENS de Lyon en collaboration avec des
chercheurs du département de Biologie cellulaire et physiologie osseuse. Pour étudier des
ostéoclastes, la préparation et la culture des cellules doivent être réalisées juste avant le début
des tests en raison de la durée de vie relativement courte de ces cellules (environ 48 heures).
Des cellules précurseurs sont extraites de la moelle osseuse chez la souris puis incuber avec
les facteurs nécessaires (cytokines) à la différenciation/prolifération/fusion des cellules
précurseurs en ostéoclastes. Le protocole d’extraction et de préparation est le suivant :
- Extraire les tibias et les fémurs des deux pattes arrière de la souris (coupe au niveau de
l’articulation de la hanche et du pied, en enlevant un maximum de tissus mous) puis
les conserver dans du PBS (tampon phosphate salin pour Phosphate Buffer Saline)
- Récupérer la moelle osseuse des os extraits à l’aide d’une seringue contenant du milieu
de culture (αMEM + antibiotiques + sérum bovin + albumine)
- Dissocier les cellules de la moelle dans le milieu en aspirant puis expulsant plusieurs
fois (flush) la solution récupérée (moelle + milieu de culture) avec la seringue
- Centrifuger la solution à 1500 tr/min pendant 5 minutes (un culot rouge foncé se forme)
- Écarter le surnageant puis rajouter du milieu culture (+ flush)
- Filtrer la solution sur une grille de 100 µm
- Préparer une solution LSM (pour Lymphocyte Separation Medium) pour servir de milieu
gradient
- Ajouter délicatement la solution contenant la moelle et le milieu de culture au milieu
gradient sans qu’ils se mélangent
- Centrifuger à 2500 tr/min pendant 20 minutes (avec un départ et un ralentissement lent)
- Récupérer l’anneau blanc de globules blancs qui s’est formé
- Mettre les globules blancs dans du milieu de culture
- Centrifuger à 1500 tr/min pendant 5 minutes puis écarter le surnageant
- Ajouter 1 mL de milieu de culture supplémenté des cytokines M-CSF et RANKL
- Compter les cellules (sur grille de Malassez)
- Répartir 3,5.105 cellules par puits dans une boîte de 6 puits
- Mettre à incuber à l’étuve à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 3 à 4 jours (en surveillant
régulièrement l’avancement de la différenciation/prolifération/fusion des cellules)
446
Annexes
Annexe III.1 : Protocole de dosage des ions NH+ par la méthode du phénate
Principe
Les ions ammonium réagissent en milieu basique avec le phénol pour donner un composé bleu,
l’indophénol.
La réaction est catalysée par la présence de nitroprussiate [Fe(CN)5NO]2-.
Le dosage se fait par spectrophotométrie visible à 635nm.
Préparation des réactifs
- Réactif 1 :
Dissoudre environ 5 g de phénol (C6H6O) + 3 mg de nitroprussiate de sodium
(Na2[Fe(CN)5NO]) dans 100 mL d’eau distillée.
Attention cette préparation ne semble pas stable à long terme (plusieurs semaines).
- Réactif 2 :
Dissoudre 5 g de soude (NaOH) dans 250 mL d’eau distillée puis ajouter 1,25 mL
d’hypochlorite de sodium (NaOCl) à 3 N (= environ 14%).
Réalisation de la courbe d’étalonnage
Allumer le spectrophotomètre à la longueur d’onde de 635 nm.
Préparer un bain marie à 40 °C environ.
Préparer une solution mère S0 à 4.10-4 mol/L en ions NH4+ à partir de (NH4)2HPO4 et d’eau
distillée.
Préparer ensuite 5 solutions filles S1, S2, S3, S4 et S5 dans des fioles de 10 mL avec :
-
Pour S1 : Prendre 0,5 mL de la solution S0 + 0,9 mL du réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2.
Compléter à l’eau désionisée. (cS1 = 2.10-5M en NH4+)
-
Pour S2 : Prendre 1 mL de la solution S0 + 0,9 mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2.
Compléter à l’eau désionisée. (cS2 = 4.10-5M en NH4+)
-
Pour S3 : Prendre 2.5 mL de la solution S0 + 0,9 mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2.
Compléter à l’eau désionisée. (cS3 = 1.10-4M en NH4+)
-
Pour S4 : Prendre 4 mL de la solution S0 + 0,9mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2.
Compléter à l’eau désionisée. (cS4 = 1.6.10-4M en NH4+)
-
Pour S5 : Prendre 5 mL de la solution S0 + 0,9 mL de réactif 1 + 0,9 mL de réactif 2.
Compléter à l’eau désionisée. (cS5 = 2.10-4M en NH4+)
Placer les solutions filles au bain marie pendant 30 minutes environ. Puis laisser refroidir.
Mesurer l’absorbance (Abs) de chaque solution fille à la longueur d’onde de 635 nm, et tracer
la droite Abs = f (cþ NH4+) pour obtenir la courbe d’étalonnage.
447
Annexes
Analyse des échantillons
Préparer une solution mère à partir de 100 mg de poudre de l’échantillon (dissout avec 1
mL d’HClO4) dans 100mL.
Prélever 0,5 mL de solution mère + 0,9 mL du réactif 1 + 0,9 mL du réactif 2 pour les mettre
dans une fiole de 10 mL complétée à l’eau distillée.
Placer, ensuite, l’échantillon à analyser au bain-marie pendant 30 minutes environ puis laisser
refroidir.
Mesurer l’absorbance des échantillons et les comparer à la droite d’étalonnage pour trouver
leurs concentrations en NH4+.
Annexe III.2 : Micrographies MEB des échantillons a) 3j-67%Zn et b) 3j-100%Zn (synthétisés avec (NH4)2HPO4 avec 3
jours de maturation et en présence de 67 et 100 % molaire de zinc)
a)
10 µm
Phase NH4ZnPO4
Phase φ1
10 µm
b)
20 µm
2 µm
448
Annexes
Annexe III.3 : Spectres FTIR des échantillons synthétisés avec (NH4)2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence de teneurs initiales en zinc croissantes et à des temps
de maturation de a) 20 minutes, b) 3 jours et c) 20 jours
1,6
a)
Maturation 20 minutes
Absorbance
1,4
1,2
Référence
de
l'échantillon
1,0
0j-100%Zn
0,8
0j-67%Zn
0,6
0j-10%Zn
0,4
0j-5%Zn
0,2
0j-1%Zn
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
-1
1000
500
Nombre d'onde (cm )
449
Annexes
1,8
b)
Maturation 3 jours
1,6
Absorbance
1,4
Référence
de
l'échantillon
1,2
1,0
3j-100%Zn
0,8
0,6
3j-67%Zn
0,4
3j-10%Zn
0,2
3j-5%Zn
0,0
4000
3j-1%Zn
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
450
Annexes
1,8
c)
Maturation 20 jours
1,6
Référence
de
l'échantillon
Absorbance
1,4
1,2
20j-67%Zn
1,0
0,8
20j-10%Zn
0,6
0,4
20j-5%Zn
0,2
20j-1%Zn
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
451
Annexes
Annexe III.4 : Spectres FTIR des échantillons synthétisés avec Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence de teneurs initiales en zinc croissantes et à des temps de
maturation de a) 1 jour, b) 3 jours et c) 20 jours
2,8
a)
Maturation 1 jour
2,4
Référence
de
l'échantillon
Absorbance
2,0
1j-20%Zn-Na
1,6
1j-15%Zn-Na
1,2
1j-10%Zn-Na
1j-5%Zn-Na
0,8
1j-1%Zn-Na
0,4
0,0
4000
Non dopée
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
452
Annexes
4,0
b)
Maturation 3 jours
Référence
de
l'échantillon
3,5
Absorbance
3,0
3j-100%Zn-Na
2,5
3j-67%Zn-Na
3j-50%Zn-Na
2,0
3j-25%Zn-Na
1,5
3j-17%Zn-Na
1,0
3j-10%Zn-Na
3j-5%Zn-Na
0,5
3j-1%Zn-Na
Non dopée
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
453
Annexes
2,0
c)
Maturation 20 jours
1,8
Référence
de
l'échantillon
Absorbance
1,6
1,4
20j-17%Zn-Na
1,2
1,0
20j-10%Zn-Na
0,8
0,6
20j-5%Zn-Na
0,4
20j-1%Zn-Na
0,2
0,0
4000
Non dopée
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
454
Annexes
Annexe III.5 : Spectres FTIR des échantillons synthétisés avec Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence d’une teneur initiale en zinc de 5% et à des temps de
maturation croissant
2,0
Synthétisées avec 5 % molaire de zinc
1,8
Absorbance
1,6
Référence
de
l'échantillon
1,4
1,2
20j-5%Zn-Na
1,0
6j-5%Zn-Na
0,8
3j-5%Zn-Na
0,6
0,4
1j-5%Zn-Na
0,2
0,0
4000
0j-5%Zn-Na
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
455
Annexes
Annexe III.6 : Spectres Raman des échantillons synthétisés avec Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en présence de teneurs initiales en zinc de 0, 5 et 10 % molaire et à
des temps de maturation de a) 3 jours et b) 20 jours
Intensité (coups)
2500
a)
Maturation 3 jours
2000
1500
Référence
de
l'échantillon
1000
3j-10%Zn-Na
500
3j-5%Zn-Na
Non dopée
0
500
1000
1500
3000 3600
-1
Nombre d'onde (cm )
456
Annexes
Intensité (coups)
2500
b)
Maturation 20 jours
2000
1500
Référence
de
l'échantillon
1000
20j-10%Zn-Na
500
20j-5%Zn-Na
Non dopée
0
500
1000
1500
3000 3600
-1
Nombre d'onde (cm )
457
Annexes
Annexe IV.1 : Spectres FTIR des apatites nanocristallines synthétisées en présence de 5 % molaire en cuivre, en utilisant Na 2HPO4 (à température ambiante et pH = 7,2) et avec
des temps de maturation croissant compris entre 20 minutes et 20 jours
Teneur initiale en cuivre de 5 % molaire
Synthèse avec Na2HPO4
2,0
1,8
1,4
Référence
de
l'échantillon
1,2
20j-5%Cu-Na
1,0
6j-5%Cu-Na
0,8
3j-5%Cu-Na
Absorbance
1,6
0,6
1j-5%Cu-Na
0,4
0j-5%Cu-Na
0,2
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
458
Annexes
Annexe IV.2 : Diagrammes DRX de l’hydroxysulfate de cuivre (Cu4(OH)6SO4, Brochantite) et de l’hydroxynitrate de cuivre (Cu4(OH)6(NO3)2, Gerhardtite)
12000
Cu4(OH)6(NO3)2
Gerhardtite, monoclinique, P21/m
Intensité (u. a.)
10000
8000
6000
4000
Cu4(OH)6SO4
Brochantite, monoclinique, P21/c
2000
0
10
20
30
40
50
60
2 (degré) (
Co
70
80
90
)
459
Annexes
Annexe IV.3 : Spectres FTIR de l’hydroxysulfate de cuivre (Cu4(OH)6SO4, Brochantite) et de l’hydroxynitrate de cuivre (Cu4(OH)6(NO3)2, Gerhardtite)
1,6
Cu4(OH)6(NO3)2
1,4
Absorbance
1,2
1,0
0,8
0,6
Cu4(OH)6SO4
0,4
0,2
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
460
Annexes
Annexe V.1: Protocole de dosage des ions Ag+ par une méthode spectrophotométrique utilisant des kits de dosage de
marque HACH
Les kits de réactif (DR2010 de marque HACH) se composent de 3 réactifs distincts
conditionnés dans des sachets pré-dosés :
-
Le réactif 1 (poudre) contenant notamment de l’acide citrique et du borate de
potassium
-
Le réactif 2 (liquide) contenant notamment du 1-méthyl-2-pyrrolidinone
-
Le réactif 3 (poudre) contenant du thiosulfate de sodium
Ces kits permettent de doser des concentrations en argent comprises entre 0,02 et
0,70 mg/L (soit entre 0,2.10-6 et 6,5.10-6 mol/L) et peuvent être utilisés en présence de divers
ions tels que les ions calcium, cuivre, zinc, nickel, aluminium, cadmium, chlorure, fer,
manganèse, magnésium,…
Le volume minimum de solution à doser doit être de 50 mL et son pH compris entre 9
et 10. Il est possible d’ajuster le pH avec une solution de soude (NaOH) ou éventuellement
avec de l’acide nitrique (HNO3). Attention, il ne faut pas utiliser de pHmètre directement dans la
solution à doser pour éviter d’éventuelles pollutions.
La longueur d’onde utilisée pour le spectrophotomètre est de 560 nm.
Le protocole de dosage est le suivant :
Dans un premier temps préparer des solutions étalons à partir de nitrate d’argent à des
concentrations en Ag+ de 0,25.10-6, 0,5.10-6, 1.10-6 et 5.10-6 mol/L dans de l’eau ultrapure dont
le pH a été amené à une valeur entre 9 et 10 avec une solution de NaOH 0,01 mol/L (avec un
volume minimum de 50 mL). Faire de même avec une solution exempte d’ions Ag+. Vérifier le
pH final des solutions et l’ajuster si nécessaire (prendre en compte la dilution).
Préparer la solution contenant les ions Ag+ à quantifier et vérifier /ajuster le pH (volume
minimum 50 mL).
Dans un bécher bien sec, verser le contenu d’une capsule de réactif 1 (en évitant d’en
répandre sur les parois) puis verser le contenu d’une capsule de réactif 2 de sorte à mouiller
toute la poudre du réactif 1 avec le réactif 2. Ajouter à cela 50 mL de solution à doser
(solutions étalons ou solution inconnue) à l’aide d’une pipette ou d’une balance (le volume ou la
masse de solution doivent être déterminés exactement). Agiter et vérifier que tout le réactif 1 est
bien dissout de manière homogène. La solution se colore et possède une couleur comprise
entre l’orange et le violet suivant la teneur en Ag+.
461
Annexes
Dans un second bécher, prélever 25 mL de la solution précédemment préparée (celle
contenant les réactifs 1 et 2 et la solution à doser) puis y ajouter le contenu d’un sachet de
réactif 3. La solution se décolore (elle conserve néanmoins une couleur proche du jaune).
Conserver les 25 mL restants de la solution à doser (contenant les réactifs 1 et 2 et la solution
à doser). Attendre 2 minutes.
Utiliser cette dernière solution (contenant le réactif 3) pour réaliser le « blanc » (absorbance =
0) de l’échantillon (attention il faut faire ce blanc pour chaque solution à doser) au
spectrophotomètre à la longueur d’onde de 560 nm. Mesurer ensuite l’absorbance des 25 mL
de la solution à doser (contenant les réactifs 1 et 2 et la solution à doser).
A partir des valeurs obtenues avec les solutions étalons réaliser une droite d’étalonnage
(Absorbance = f(concentration en Ag+)) qui servira à déterminer la concentration en argent des
solutions inconnues.
462
Annexes
Annexe V.2: Spectre FTIR de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 5 % molaire d’argent avec un temps de maturation en solution de 20 minutes et à
pH = 8 (par ajut d’NH4OH 1M)
Absorbance
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
463
Annexes
Annexe V.3 : Spectres XPS (+ semi-quantification des différents éléments) des échantillons d’Ag 3PO4 synthétisés avec a)
NaH2PO4.2H2O, b) Na2HPO4.12H2O ou c) Na3PO4.12H2O et d) comparatif de ces spectres avec celui de l’argent
métallique
a)
Ag3PO4 synthétisé avec NaH2PO4.2H2O
Élément
Position du pic
(eV)
Largeur à
mi-hauteur
(eV)
% atomique
de l'élément
P (2p)
132,89
2,20
13,20
C (1s)
284,65
1,53
21,32
Ag (3d5/2)
367,94
1,20
26,10
O (1s)
530,65
1,61
38,38
b)
Ag3PO4 synthétisé avec Na2HPO4.12H2O
Élément
Position du pic
(eV)
Largeur à
mi-hauteur
(eV)
% atomique
de l'élément
12,96
P (2p)
132,91
2,28
Cl (2p)
198,41
1,08
0,84
C (1s)
284,77
1,63
18,64
Ag (3d5/2)
367,94
1,14
27,78
O (1s)
530,68
1,51
39,78
464
Annexes
c)
Ag3PO4 synthétisé avec Na3PO4.12H2O
Élément
Position du pic
(eV)
Largeur à
mi-hauteur
(eV)
% atomique
de l'élément
P (2p)
132,68
1,91
12,76
C (1s)
284,69
1,44
17,46
Ag (3d5/2)
367,92
1,27
35,37
O (1s)
530,51
1,31
34,40
d)
Échantillon d’Ag0
(métallique)
Échantillon d’Ag3PO4
synthétisé avec Na3PO4.12H2O
Échantillons d’Ag3PO4
synthétisés
avec Na2HPO4.12H2O (spectre bleu)
ou avec NaH2PO4.2H2O (spectre vert)
465
Annexes
Annexe VI.1 : Diagramme DRX de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 10 % volumique de H2O2 avec un temps de maturation de 1 jour, en
utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate et ayant subie une étape de pré-équilibrage
Synthétisée avec 10 % volumique de H 2O2
12000
avec un temps de maturation de 1 jour
en utilisant Na2HPO4
Intensité (u. a.)
10000
8000
6000
4000
2000
0
20
30
40
50
2 (degré) (
60
Co
70
80
)
466
Annexes
Absorbance
Annexe VI.2 : Spectre FTIR de l’échantillon d’apatite nanocristalline synthétisée en présence de 10 % volumique de H2O2 avec un temps de maturation de 1 jour, en utilisant
Na2HPO4 comme sel de phosphate et ayant subie une étape de pré-équilibrage
1,4
Synthétisée avec 10 % volumique de H 2O2
1,2
avec un temps de maturation de 1 jour
en utilisant Na2HPO4
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
467
Annexes
Annexe VI.3 : Spectres FTIR des échantillons des échantillons codopés avec des cations Cu 2+ et/ou Zn2+ et/ou Ag+ synthétisés par coprécipitation à température ambiante avec un
temps de maturation de 1 jour en utilisant Na2HPO4 comme sel de phosphate de départ en comparaison avec une apatite nanocristalline non dopée synthétisée dans les mêmes
conditions.
2,4
Codopage par des cations
2,2
2,0
Absorbance
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
1j-1%Ag/H2O2
0,8
0,6
1j-1%Zn/H2O2
0,4
1j-1%Cu/H2O2
0,2
0,0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Nombre d'onde (cm )
468
Annexes
Annexe VI.4 : Spectres FTIR des échantillons codopés en présence de 10 % volumique de peroxyde d’hydrogène et avec Cu 2+ ou Zn2+ ou Ag+ synthétisés par coprécipitation à
température ambiante avec un temps de maturation de 1 jour en utilisant Na 2HPO4 ou (NH4)2HPO4 hosphate de départ en comparaison avec une apatite nanocristalline non
dopée synthétisée dans les mêmes conditions (en absence de peroxyde d’hydrogène).
1,6
Codopage H2O2/cation
1,4
Absorbance
1,2
1,0
0,8
1j-1%Zn/1%Ag
0,6
1j-1%Cu/1%Ag
0,4
0,2
0,0
4000
1j-5%Cu/5%Zn
3500
3000
2500
2000
1500
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Résumé
Les infections nosocomiales post-opératoires en sites osseux posent un problème majeur de santé publique.
L’utilisation de biocéramiques bioactives et résorbables qui présenteraient des propriétés antibactériennes apparaît
comme une des solutions les plus prometteuses pour lutter contre l’invasion de micro-organismes au niveau du site
opératoire. Les apatites nanocristallines biomimétiques se révèlent être des candidats de choix pour ces applications en
raison de leur similitude avec le minéral osseux et de leur forte réactivité de surface. Cependant, elles ne possèdent pas
de propriétés antibactériennes intrinsèques, ce qui peut potentiellement être amené par un dopage ionique approprié.
Dans ce contexte, ce travail traite de la synthèse et de la caractérisation physico-chimique d’apatites
biomimétiques enrichies avec des cations zinc (Zn2+), cuivre (Cu2+) ou argent (Ag+) ou avec des anions oxygénés de type
peroxydes qui présenteraient ces facultés antimicrobiennes ; puis sur l’évaluation préliminaire de leurs propriétés
(micro)biologiques.
Dans un premier temps, l’étude de systèmes apatitiques non dopés a indiqué qu’à l’instar du minéral osseux les apatites
nanocristallines présentaient des cristaux de dimensions nanométriques dont la composition chimique s’éloignait de la
stœchiométrie et exposant des environnements ioniques non-apatitiques hydratés en surface des nanocristaux.
L’influence des paramètres de synthèse a été évaluée et révèle que le temps de maturation, la température, le pH et la
nature des sels de phosphate impactent significativement les caractéristiques physico-chimiques de ces composés. Nous
montrons également que les conditions de post-traitement (ré-immersion, traitement thermique, mise en forme) peuvent
aussi modifier significativement les caractéristiques finales des biocéramiques.
Dans un second temps, ce travail a révélé que l’enrichissement d’apatites nanocristallines avec des ions Zn2+, Cu2+, Ag+
ou des espèces oxygénées était possible – avec des taux de dopage limites qui ont été évalués – mais générait des
modifications physico-chimiques notables en particulier en termes d’état de cristallinité et de teneur en environnements
chimiques non-apatitiques. Le zinc et le cuivre engendrent des effets similaires et semblent agir en tant qu’inhibiteur de
croissance cristalline. L’argent, bien que monovalent, ne modifie pas significativement les processus de formation et de
croissance des nanocristaux d’apatites. En revanche, la présence de peroxyde d’hydrogène dans le milieu réactionnel
conduit à la formation d’apatite dont l’état de cristallinité est augmenté.
Le choix de paramètres de synthèse adéquats, influençant notablement les mécanismes d’incorporation des ions, s’est
avéré déterminant pour l’obtention d’apatites nanocristallines monophasées et dopées.
Des tests biologiques préliminaires ont été réalisés pour évaluer la cytotoxicité de ces composés et le
comportement de cellules ostéogéniques (de types ostéoblastes et ostéoclastes). L’évaluation d’éventuelles propriétés
antibactériennes a également fait l’objet de ce travail, dans le cadre d’une collaboration internationale. Parmi les
formulations présentant des propriétés antibactériennes mesurées, les apatites biomimétiques enrichies en argent
apparaissent au vu de ce travail comme les candidats les plus prometteurs pour conférer l’effet antibactérien nécessaire
aux applications visées.
Abstract
Hospital acquired infections in osseous sites are a major issue of public health. The use of bioactive and
resorbable bioceramics that present antibacterial properties appears as one of the most promising solution against microorganisms invasion of the surgical site. Biomimetic nanocrystalline apatites belong to the choice candidates for those
applications thanks to their similarities with the bone mineral and their high surface reactivity. Nevertheless, they don’t
possess intrinsic antibacterial capacity, property that can be reached by a suitable ionic enrichment.
In this context, this work deals with the synthesis and the physico-chemical characterization of such biomimetic
nanocrystalline apatites doped with zinc (Zn2+), copper (Cu2+) or silver (Ag+) cations or with oxygenated anions like
peroxides that would present antibacterial activity; then their (micro-)biological properties have also been studied.
As a first part, study of apatitic non-doped systems shows that, as well as bone mineral, nanocrystalline apatites exhibit
nano-sized crystals which chemical composition depart from stoichiometry and possess hydrated non-apatitic
environments on their surface. The influence of synthesis parameters has been studied and reveals that maturation time
in solution, temperature, pH or the nature of starting phosphate salts impact significantly the physico-chemical
characteristics of those compounds. We also point out that post-treatment conditions (re-immersion, thermal treatment,
forming) can significantly modify final characteristics of those bioceramics.
As a second part, this work reveals that nanocrystalline apatites enrichment with Zn2+, Cu2+, Ag+ or oxygenated species
seem to be possible – with maximal doping rates that were evaluated – but generate significant physico-chemical
modifications, especially in terms of crystallinity state or non-apatitic chemical environments content. Zinc and copper act
on a similar way on apatite compound and exhibit a crystal growth inhibitory role. Silver, even with a single positive
charge, don’t modify significantly the formation and the growth mechanisms of apatites nanocrystals. On the opposite,
hydrogen peroxide presence in the synthesis media generates the formation of apatites which crystallinity state is
improved.
All of those results suggest that synthesis parameters are determining to obtain doped nanocrystalline apatites and that
they influence notably the incorporation mechanisms of ions.
Finally, preliminary biological tests have been realized in order to evaluate the cytotoxicity and the behavior of
osteogenic cells (osteoblast and osteoclast type) in contact with those compounds. The evaluation of potential
antibacterial properties is also discussed in this work as part of an international collaboration. Among formulations that
exhibit measured antibacterial activity, silver doped biomimetic apatites appear as the most promising candidates to
confer antibacterialness necessary for the envisaged applications.