REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
INSTITUT NATIONAL DE FORMATION SUPERIEURE PARAMEDICALE
CONSTANTINE
Principes généraux de
techniques utilisées en
biochimie
PAR DR H.BOUMECHRA
Année universitaire : 2014-2015
PLAN DU COURS
I.
II.
III.
IV.
V.
INTRODUCTION
ELECTROPHORESE
1. Principe.
2. Appareillage.
3. Protocole.
4. Applications.
METHODES CHROMATOGRAPHIQUES
Définition.
Classification :
A. Selon la nature de la phase stationnaire :
Chromatographie planaire.
Chromatographie sur colonne.
B. Selon la nature de la phase mobile :
1. Chromatographie en phase liquide.
2. Chromatographie en phase gazeuse.
3. Chromatographie supercritique.
C. Selon le mécanisme de séparation :
1. Chromatographie d’adsorption.
2. Chromatographie de partage.
3. Chromatographie d’exclusion.
4. Chromatographie échangeuse d’ions.
5. Chromatographie d’affinité.
METHODES IMMUNOCHIMIQUES
1. Principe.
2. Classification :
A. Techniques d’immunoprécipitation.
B. Techniques d’agglutination.
C. Techniques d’immunomarquage.
CONCLUSION
I. INTRODUCTION
La qualité des résultats rendus par le biologiste dépond de son aptitude à comprendre la signification
physiologique et pathologique des paramètres qu’il étudie, à les interpréter, à les transmettre avec efficacité et si
nécessaire à les discuter avec
vec le clinicien.
Cette même qualité demeure liée à son aptitude à maitriser les gestes analytiques, bien connaitre les bases
physico-chimiques
chimiques et biologiques qui régissent les réactions qu’ils effectuent, de même que le principe des
appareils qu’il est amené à manipuler. Pour chaque appareil, une ou plusieurs techniques sont utilisées.
utilisée Parmi
lesquelles :
Techniques électrophorétiques.
Techniques chromatographiques.
Techniques spectrophotométriques.
Techniques immunochimiques.
Spectrométrie de masse.
Les techniques électrophorétiques et chromatographiques sont les deux principales techniques
tech
utilisées en
biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules.
II. ELECTROPHORESE
Méthode physique de séparation des molécules chargées, fondée sur leur différence de mobilité sous l’effet d’un
champ électrique.
1. Principe
Une particule de charge Q placée dans un champ électrique E, est soumise à une force F qui l’entraine vers
l’électrode de signe opposé : F= Q*E .
Des forces de frottement f dues à la taille, viscosité, vitesse s’opposent à la migration et ce d’autant plus
pl que
la particule est grosse et la vitesse est grande : f = 6*¶*n* r*v
Lorsque les deux forces s’équilibrent, la particule se déplace alors à une vitesse constante : V = Q*E/6*¶*n* r
La charge Q est fonction de phi de la particule et du pH de solvant :
a. pH > phi : charge nette négative (anion) ===˃ migration vers l'anode (+).
b. pH < phi : charge nette positive (cation) ===˃ migration vers la cathode (--).
c. pH = phi : charge nette nulle ===˃ pas de migration.
2. Appareillage
La réalisation de l'électrophorèse nécessite 4 composantes principales:
a. Cuve d'électrophorèse : comporte deux compartiments ou réservoirs munis chacun d’une électrode,
chaque compartiment est rempli d’un liquide (tampon de migration).
b. Support: il relie les deux compartiments, c’est sur lequel les échantillons sont déposés et que les molécules
vont migrer, les différents supports sont : papier, l’acétate de cellulose, la silice, gel d’agarose, gel de
polyacrylamide, gel d’amidon.
c. Générateur de courant continu:: relié aux électrodes de la cuve par des cordons électriques, il crée un
champ électrique qui fait migrer
er les molécules de l’échantillon.
d. Cuve de révélation des produits séparés.
3. Protocole
Les bandes sont imprégnées de tampon de flottation puis par immersion. Le tampon utilisé est le véronal
sodique à pH 8.6 et de force ionique de 0.05mol/l.
La cuve est remplie en ajustant le tampon au même niveau dans les deux compartiments, tout en vérifiant
l’absence de solution sur la cloison de séparation.
Le dépôt se fait à l’aide d’un applicateur, au tiers de l’extrémité cathodique.
La migration se fait sous tension
on de 150 – 250V pendant 20mn.
Après migration, les bandes sont fixées par l’acide trichloracétique puis colorées par une solution de :
1. Protéines : rouge ponceau, bleu de Coomassie ou amido Schwartz.
2. Lipoprotéines : noir soudan ou rouge Ciba.
3. Glycoprotéines : réactif de shiff après oxydation de la partie glucidique par l’acide périodique.
Le fond des bandes est décoloré à l’aide d’une solution d’acide acétique à 5% puis transparisé et déshydraté par le
méthanol.
Analyse des fractions par un densitomètre mesurant l’absorption de chaque fraction.
4. Applications
séparation des macromolécules ionisables : acides nucléiques, protéines, acides aminés, polyosides ….etc.
Déterminer le nombre de sous-unités
unités d'une protéine et de déterminer leur masse respective.
Evaluer
aluer le degré de purification d'une protéine.
Séquençage de l'ADN.
III. METHODES CHROMATOGRAPHIQUES
DEFINITION
Méthodes de séparation qui permettent de séparer, d’identifier et de quantifier les constituants d’un
mélange plus ou moins complexe.
Basées sur la distribution ou la partition d’un ou plusieurs solutés entre deux phases différentes :
1. Stationnaire : fixe, peut être solide ou liquide.
2. Mobile : appelée ‟éluant”, se déplace sur ou à travers la phase stationnaire entrainant le mélange à
séparer avec elle et qui peut être un liquide ou un gaz.
CLASSIFICATION
Techniques très variées qui peuvent être classées selon trois modalités :
- Nature de la phase stationnaire.
tationnaire.
- Nature de la phase mobile.
- Mécanisme de séparation.
A. Selon la nature de la phase stationnaire
En fonction du conditionnement de la phase stationnaire, on distingue :
Chromatographie planaire
La phase stationnaire est étalée ou immobilisée dans une surface plane.
Technique qualitative ou la phase mobile se déplace à travers la phase stationnaire par capillarité ou sous
l’effet de la gravité.
Les vitesses de migration dépendent de la nature des solutés et celle de la phase mobile.
Après migration, chaque tache correspond à un constituant et l’identification se fait par comparaison avec
un témoin.
Chromatographie sur colonne
La phase stationnaire est contenue dans une colonne (tube) cylindrique en verre ou en métal.
La phase mobile, gaz ou liquide, y progresse par gravité ou sous l’action de différence de pression.
Le mélange à analyser est introduit dans le sens de migration de la phase mobile en tête de la colonne et
réapparait par la suite à l’autre extrémité de la colonne. La séparation se fait sous forme de bandes tout
au long de la colonne.
B. Selon la nature de la phase mobile
1. Chromatographie en phase liquide:: la phase mobile est soit un solvant organique, un mélange de solvants, un
tampon ou encore un mélange eau--solvants.
2. Chromatographie en phase gazeuse:
gazeuse: la phase mobile est un gaz appelé: gaz vecteur. Les gaz vecteur les plus
utilisés sont : l’hélium, les autres sont l’hydrogène, l’azote ou l’argon.
l’
3. Chromatographie supercritique: la phase mobile est un fluide "supercritique" qui correspond à un état très
particulier que l'on peut assimiler à un liquide compressible de très faible viscosité. Il est obtenu en
comprimant à basse température et à très
très haute pression un gaz (dioxyde de carbone, protoxyde d’azote et
l’éthane).
C. Selon le mécanisme de séparation
Il existe cinq grands mécanismes de chromatographie. Ils se distinguent par la nature des interactions entre les
différentes phases et les molécules du mélange à chromatographier :
1. Chromatographie d’adsorption
Utilise une phase stationnaire solide sur laquelle vont s’adsorber les molécules à séparer par des liaisons
hydrophobes ou des forces de VAN DER WAALS dont l’intensité dépend de la nature de la molécule.
Les adsorbants les plus utilisés sont : silice,, alumine, cellulose, polyacrylamide, amidon….
Utilisée dans la séparation des médicaments, stéroïdes,, pigments, acides aminés, oses.
2. Chromatographie de partage
basée sur le partage des solutéss entre deux phases
phase non miscibles, de polarité différente, et dont l’une est
mobile et l’autre fixée sur un support.
En fonction de la polarité de la phase stationnaire, on distingue deux types :
a. Chromatographie de partage en phase normale :
La phase stationnaire est polaire,
polaire de nature hydrophile, avec des groupements organiques polaires greffés
sur la silice:(amine,
:(amine, nitrile, dialcool ou diol).
La phase mobile est un solvant apolaire,
apolaire de nature lipophile : benzène, cyclohexane, chloroforme, l'éther
isopropylique...etc.
Le soluté le moins polaire est élué en premier.
S’applique aux solutés polaires.
b. Chromatographie de partage en phase inverse
La phase stationnaire est apolaire, formée de silice greffée
greff d’alkyle : C₁₈ et C₈.
L’élution est assurée par une phase mobile constituée des solvants organiques miscibles à l’eau :
acétonitrile, méthanol.
Utilisée dans la séparation des peptides, protéines, caroténoïdes et flavonoïdes.
3. Chromatographie d’exclusion
Appelée chromatographie ‟de
de filtration de gel”
gel ou ‟de perméation sur gel”.
La phase stationnaire est formée d’un polymère qui donne un gel poreux dont le degré de réticulation
conditionne la taille des pores destinés à retenir les solutés en fonction de leur taille.
Les gels les plus utilisés sont : gel de dextran, de silice et de polystyrène.
Permet la détermination approximative du poids moléculaire des molécules.
Utilisée dans la séparation et la caractérisation des molécules à poids moléculaire
moléculaire élevé : protéines, ADN,
particules virales et polymères synthétiques.
4. Chromatographie échangeuse d’ions
La phase stationnaire est formée d’un support solide sur lequel sont greffés des groupements fonctionnels
ionisés, ayant la propriété d’échanger certains de ces ions avec des ions du mélange à séparer.
Utilisée dans l’analyse des fluides biologiques et la séparation des acides aminés, catécholamines, acides
nucléiques, médicaments et métabolites urinaires.
On distingue deux types :
a. Chromatographie échangeuse des cations : dont la phase stationnaire est greffée avec des
groupements acides : acide sulfonique, acide carboxylique.
b. Chromatographie échangeuse des anions : dont la phase stationnaire est greffée avec des bases :
NH⁺₄,
⁺₄, Amines primaires, secondaires
sec
ou tertiaires.
5. Chromatographie d’affinité
Basée sur l’interaction spécifique et réversible entre deux molécules, l’une étant la macromolécule à
séparer, l’autre un ligand immobilisé sur un gel inerte, chélates métalliques ou sur des colorants chimiques.
les interactions mises en jeu sont essentiellement des liaisons hydrogènes, interactions hydrophobes voir
des liaisons ioniques.
Elle se déroule en trois étapes :
1. Liaison de ligand sur le support par covalence.
2. Adsorption spécifique de la molécule
molécu à séparer sur le ligand et élimination des contaminants.
contaminants
3. Désorption spécifique de la molécule.
IV. METHODES IMMUNOCHIMIQUES
1. Principe
Techniques basées sur la combinaison des anticorps(Ac) et des antigènes (Ag) correspondants.
L’interaction entre les épitopes d’Ag et les paratopes d’Ac aboutit à la formation de complexe immun
Ag-Ac
Ac par une liaison spécifique réversible de haute affinité et qui fait intervenir 4 types de liaisons non
covalentes : hydrogènes, hydrophobes, électrostatiques et celles de VAN DER WAALS.
2. Classification
On distingue trois types :
a. Techniques
chniques d’immunoprécipitation.
b. Techniques d’agglutination.
c. Techniques d’immuno--marquage.
A. Techniques d’immunoprécipitation
Basées sur la formation d’un réseau Ag-Ac
Ag
dans la zone d’équivalence.
Elles se produisent en milieu liquide ou solide.
B. Techniques d’agglutination
Basées sur la formation de complexe immun entre l’Ag et son Ac spécifique.
L’Ag est porté par un support particulaire : bactéries, hématies, latex, polystyrène.
Nombreuses applications dont :
- Détection et titration des FR.
- Détermination
ination de groupement sanguin.
- Test de COOMBS DIRECT : Rh faible.
- Test de COOMBS indirect : recherche d’Ac anti GR.
C. Techniques d’immuno-marquage
marquage
Permettent d’étudier les immunocomplexes non précipitants, non agglutinants : détection des Ag
présents en des très faibles concentrations.
Nécessitent l’utilisation d’un marquage : soit de l’Ag, soit de l’Ac.
Le choix de marqueur dépend des buts recherchés et des limites de systèmes expérimentaux.
Les
es marqueurs les plus utilisés sont : fluorescéine, rhodamine, enzymes, Iode 125, tritium ….etc.
V. CONCLUSION
L’évolution de l’appareillage en biochimie rend nécessaire que le biologiste ait des connaissances de base
pour comprendre les principes de son fonctionnement, de réaliser son choix entre les différents principes et
de satisfaire en terme de qualité et de quantité les demandes de cliniciens.
L’électrophorèse et la chromatographie restent les techniques les plus utilisées pour la séparation,
identification,
entification, purification et dosage des substrats.
Les techniques immunochimiques, également largement utilisées en biochimie, sont des techniques très
sensibles et très performantes dans le dosage des substrats en des très faibles concentrations.
concentrations