1. No category

1
Licence de Biochimie UE Enzymologie et Purification des Protéines
Travaux Dirigés 2012-2013
Ioan Lascu
TD 1. Effet du pH sur l’activité enzymatique
1, On a fait de mesures de vitesse initiale de la phosphatase
alkaline, à différents pH. Les résultats sont présentés dans la figure
ci-dessous:
Exprimer la vitesse initiale en fonction de la concentration en
substrat et du pH. Avavt de commencer le manipulations d'algèbre,
notez que l'activité enzymatique est nulle à pH acide et par
1
Vmax/Km
0,8
0,6
pKa = 6,6
Le schéma à analyser:
0,4
0,2
0
3
4
5
6
7
8
9
10
11
pH
regression non-linéaire (comme vous avez fait en TP) on trouve un
pKa de 6,6. Quelle est la signification physique de ce pKa? On a
pris soin de vérifier que le substrat n'est ni protoné ni deprotoné
dans la gamme de pH étudiée.
2, Vous allez établir l’équation de Michaelis pour la réaction
catalysée par la ribonucléase A, avec les hypothèses habituelles.
Le graphique de Vmax/Km en fonction du pH est le suivant:
2a. Pourquoi ne prend-t-on pas on considération les équilibres E + S
<=> ES et EH2 + S <=> EH2S ?
2
2b. Quelle sera l’expression de Km, Vmax et surtout Vmax/Km en
fonction de la concentration des ions d’hydrogène (ou du pH, selon
votre préférence) ? Pourquoi « surtout »?
TD-2 Structure et propriétés catalytiques de la
glucose isomérase (sujet d'examen à l'Université
de Paris-6)
2c. Vous faites l'hypothèse (raisonnable) que les deux pHa sont
ceux des histidines 12 et 119. L'His12 a le pKa1 ou le pKa2?
Le fructose a un goût plus sucré que le glucose. Pour remplacer le
saccharose dont l'industrie alimentaire fait une grande consommation,
on cherche à dégrader l'amidon (polymère végétal abondant et bon
marché) en un mélange de monosaccharides contenant le plus
possible de fructose. A la dernière étape de cette dégradation intervient
un enzyme, la glucose isomérase (Gl appelée aussi xylose isomérase,
car le xylose est son meilleur substrat), qui catalyse la réaction
D-glucose
D-fructose
Cette enzyme est un tétramère formé de quatre sous-unités identiques
de masse molaire 45000, chacune. L'activité enzymatique de la Gl
n'est mesurable qu'en présence de cations divalents comme le Mg2+ ou
le Mn2+.
1. La Gl a une structure très similaire à celle de la TIM (triose phosphate
isomérase). Comparer les réactions catalysées par les deux réactions.
Conclusion?
2. Fixation du Mg 2+ à la Gl. On mesure la quantité de Mg2+ lié à la
Gl , pour une concentration en Gl de 1,8 mg/ml (Tableau /). Quelle est
la concentration molaire de Gl ? Combien la Gl a-t-elle de sites de
fixation pour Mg2+ et ces sites sont-ils indépendants ? Quelle est la
constante de dissociation Ka du complexe Gl-Mg2+
3
Les résultats expérimentaux du 2°) sont-ils en acco rd avec ce qu'on
attend du modèle du 3°) en supposant que A = Mg 2+ et S = glucose
? Quelles sont alors les valeurs de KA et de Ks.
6. Fixation du
Mg 2+ à la Gl en présence de sorbitol.
Le sorbitol, qui est le produit de réduction du glucose en hexaalcool, est un inhibiteur compétitif de la Gl. On mesure la fixation
du Mg 2 + comme dans le 1°) mais en présence de sorbitol.
D'après le modèle du 3°), peut-on prévoir (de préfé rence sans
calculs) comment la présence du sorbitol modifiera la constante
Ka observée pour la dissociation du Mg2+ ?
3. Cinétique de la GT à l'état stationnaire. On mesure la
vitesse initiale, en nmol/min/ml, d'isomérisation du glucose par
la Gl pour une concentration de Gl de 9 ug/ml, en présence de 1
mM ou de 5 mM de Mg2+ (Tableau II). Quel est le paramètre de la
réaction enzymatique de la Gl sensible à la présence de Mg2+ ?
Quelle est la constante catalytique kcat (en s1) de la Gl ?
4. Un mécanisme d'activation . On considère le modèle suivant
où E est un enzyme, A un activateur, S le substrat, et P le produit.
L'étape de fixation de A est rapide devant la transformation de S en
P:
Exprimer la vitesse initiale v de la réaction en fonction des
constantes de dissociation KA et des constantes de vitesse et des
concentrations totales [A]t et [S]t en activateur et substrat (on
supposera [A]t et [S]t» [E]t). Déterminer Vmax, Km et Vmax/Km
en fonction des constantes du modèle.
5. Application de ce modèle simple à l'activation de la Gl
par les ions Mg 2 +
7. La structure cristallographique suggère le mécanisme décrit cidessous (page suivante), avec le xylose comme substrat et le Mn2+
comme ion activateur. Ou serait localisé le groupement hydroxymethyl
dans de glucose? Discuter le rôle de l'histidine 101 dans la catalyse (dans
quelle étape et par quel mécanisme). De quelle forme du glucose est le
sorbitol un analogue? Avec quel autre acide aminé faut-il remplacer
l'histidine pour conserver les liaisons d'hydrogène, mais pas ses
propriétés acido-basiques?
FlG 1. (page suivante). Une illustration schématique du mécanisme catalytique
proposé de la xylose isomérase. L'isomérisation du xylose implique trois étapes
principales ; ouverture de l’anneau du substrat, isomérisation par l'intermédiaire
transfert d'ion hydrure, et fermeture de l’anneau du produit.
4
5