1. No category

Etude des effets du Chlorure de Lithium sur la voix WNT
d’Oscarella lobularis (Porifera Homoscleromorpha)
Rapport de stage de 3`eme ann´ee de la licence Sciences de la nature,
de la Terre et de l’environnement, parcours mer.
Pag`es R´emi
´
Institut M´editerran´een de Biodiversit´e et Ecologie
marine et continentale (IMBE, UMR 7263).
Sous la direction de BORCHIELLINI Carole et de ERESKOVSKY Alexander
1
Table des mati`eres
1
R´esum´e
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Introduction
2.1 G´en´eralit´es sur les Porif`eres . . . . . . . . . . .
2.2 Pourquoi e´ tudier les Porif`eres en Eco-Evo-Devo ?
2.3 Phylog´enie des Porif`eres . . . . . . . . . . . . .
2.4 Consid´erations e´ cologique . . . . . . . . . . . .
2.5 But du travail . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Mat´eriels et m´ethodes
3.1 Le mod`ele Oscarella lobularis . . . . . . . . . . .
3.2 Collecte et traitement des e´ chantillons . . . . . . .
3.3 M´ethodes de fixations. . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 Fixation des e´ chantillons a` l’´ethanol . . . .
3.3.2 Fixation des e´ chantillons au glutarald´ehyde
3.3.3 Fixation des e´ chantillons a` la PAF . . . . .
3.4 Immunohistochimie . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Inclusion a` la paraffine . . . . . . . . . . .
3.4.2 Coupe des blocs de paraffine . . . . . . . .
3.4.3 Principe de l’ immunohistochimie . . . . .
3.5 Observations histologiques . . . . . . . . . . . . .
3.5.1 Post-fixation a` l’Osmium et d´eshydratation
3.5.2 Microscopie e´ lectronique a` balayage . . . .
3.6 Microscopie optique . . . . . . . . . . . . . . . .
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4
R´esultats
4.1 Observations morphologiques au microscope a` balayage : effet du traitement au LiCl
4.2 Immunohistochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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5
Discussion Conclusion et perspective
5.1 Ph´enotype observ´e au microscope e´ lectronique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
5.2 Immunohistochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Annexes
6.1 Protocole d’inclusions des e´ chantillons dans la paraffine
6.2 Protocole pour r´ealiser des coupes histologiques . . . . .
6.3 Protocole des immunohistochimies . . . . . . . . . . . .
6.4 Protocole de fixation a` la PAF (paraformaldehyde) . . . .
6.5 Fixation au Glutaraldehyde et post fixation . . . . . . . .
6.6 Point critique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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Table des figures
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Organisation g´en´erale d’un porif`ere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Hypoth`eses e´ volutive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Le microtome . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Principe d’un microscope a e´ pifluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . .
T´emoins eau de mer a` differents temps d’observation . . . . . . . . . . . .
zone de croissance observ´ees sur les individus trait´es . . . . . . . . . . . .
Observation du nombre de flagelle en diminution sur les e´ chantillons trait´es.
Microvillosit´es a la surface des cellules. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Structures cellulaires particuli`eres observ´e a` 10µM 24h . . . . . . . . . . .
Immunohistochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Fonctionnement de la voie Wnt. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Marquage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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R´ecapitulatif des diff´erents traitements. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tableau r´ecapitulatif.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
R´esum´e synth´etique des ph´enotypes observ´es sur les e´ chantillons trait´es au LiCl . .
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Liste des tableaux
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1
R´esum´e
Les e´ ponges occupent une position basale dans l’arbre des m´etazoaires et pr´esentent donc un
int´erˆet tout particulier pour comprendre leur origine et leur e´ volution .
C’est a` ce titre que l’´equipe Eco-Evo-Devo de l’IMBE (Institut M´editerran´een de Biologie et d’Ecologie marine et continentale) a choisi le mod`ele Oscarella lobularis (Porifera, Homoscl´eromorpha).
Durant ce stage, j’ai test´e les effets du LiCl a` diff´erentes concentration sur le d´eveloppement de Oscarella lobularis .
Le LiCl est pr´esent dans les oc´eans a` cause des activit´es anthropiques. Il est donc int´eressant d’un
point de vue e´ cologique d’´etudier ses effets un organisme marin filtreur. Les concentrations de Chlorure de Lithium test´ees au cours de ce stage nous on permis d’observer diff´erents ph´enotypes en
fonction des concentrations test´ees. Ces diff´erents ph´enotypes sont a` reli´e tr`es certainement a` la
d´er´egulation de la voie Wint connu pour eˆ tre activ´ee par le LiCl.
Ces r´esultats restent encore a` confirmer et a` compl´eter et conduisent a` de nouvelles perspectives
d’´etudes notamment afin de comprendre les effets doses d´ependants remarqu´es durant le stage.
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Remerciements
Je souhaite remercier Thierry Tatoni, le directeur de l’Institut M´editerran´een de la Biodiversit´e et
´
d’Ecologie
marine et continentale (IMBE), de m’avoir accueilli dans sa structure.
Un grand merci Carole a Borchiellini et a` Alexander Ereskovsky , mes tuteurs de stage ainsi qu’`a
Emmanuelle Renard mon enseignante lors de mon cursus universitaire qui m’a propos´e un sujet de
stage tr`es int´eressant et enrichissant.
Merci a` Sandrine Chenesseau pour sa pr´esence et son aide dans les diverses manipulations et pour
m’avoir form´e aux inclusions et coupes. Merci a` Laura et Quentin, e´ tudiants en th`ese ainsi que Florian, stagiaire de BTS qui ont pris de leur temps et ont eu la patience de m’expliquer leurs travaux
ainsi que de me conseiller dans le suivi des protocoles exp´erimentaux. Merci a` Lola Berthier, stagiaire
en troisi`eme ann´ee de licence avec qui j’ai travaill´e en binˆome et qui m’a accompagn´e tout au long du
stage.
Je remercie toute l’´equipe de l’IMBE du site marin d’Endoume pour son agr´eable accueil.
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2
2.1
Introduction
G´en´eralit´es sur les Porif`eres
Les e´ ponges ou Porif`eres, sont des organismes sessiles et filtreurs qui regroupent plus de 8000
esp`eces et partagent le mˆeme plan d’organisation (Figure 1). On en trouve dans tous les oc´eans et a`
toutes les profondeurs mais e´ galement en eaux douces. Les e´ ponges sont des organismes qui ont la
particularit´e de ne poss´eder aucun organe sp´ecialis´e.
L’eau p´en`etre dans l’´eponge au travers de l’exopinacoderme (couche de tissus externe compos´e
d’exopinacocytes) grˆace aux pores inhalants : les ostioles. Puis, elle circule dans des canaux (tapiss´es
d’ endopinacoderme) pour arriver aux chambres choanocytaires o`u elle sera filtr´ee. Les chambres
choanocytaires sont tapiss´ees de cellules, les choanocytes, qui grˆace a` leur collerette de microvillosit´es vont filtrer l’eau de mer en capturant toutes les particules et microorganismes. Les flagelles des
choanocytes jouent le rˆole de pompe et permettent a` l’eau de circuler au travers de l’´eponge [1]. L’eau
est collect´ee par des canaux exhalants et expuls´ee au niveau des oscules qui sont de gros orifices exhalants. Ce type de filtration est appel´e syst`eme aquif`ere. Entre l’endopinacoderme et l’exopinacoderme,
on trouve une couche cellulaire, le m´esohyle, contenant classiquement les cellules non diff´erenci´ees
totipotentes nomm´ee arch´eocytes ainsi que des cellules de type vacuolaire.
La plupart des e´ ponges poss`edent e´ galement un squelette interne fait de petits morceaux de silice ou de calcaire : les spicules qui assurent le maintien de l’´eponge. Les e´ ponges utilisent plusieurs
modes de reproduction sexu´ee ou asexu´ee notamment par bourgeonnement. Lors de la reproduction
sexu´ee les ovocytes d’une e´ ponge sont f´econd´es par des spermatozo¨ıdes. Les cellules qui produisent
la gam´etogen`ese sont g´en´eralement les archeocystes. Si la f´econdation a` lieu dans l’eau, l’´eponge est
dite ovipare et si elle a lieu dans les tissus de la m`ere elle est vivipare. Dans ce cas, une cellule charriante transporte le spermatozo¨ıde apport´e par le courant jusqu’`a l’ovocyte. La larve ainsi form´ee
va pouvoir nager quelques heures avant de se fixer a` un substrat.
Les Porif`eres sont tr`es comp´etitifs grˆace a` leur capacit´e de filtration qui leur donne acc`es a une ressource alimentaire abondante et a` leur mode de reproduction qui leur permet de coloniser de nouveaux
espaces ce qui permet d’expliquer leur r´eussite e´ volutive.
6
F IGURE 1 – Organisation g´en´erale d’un porif`ere
[1]
2.2
Pourquoi e´ tudier les Porif`eres en Eco-Evo-Devo ?
L’Evo-Devo, ou g´en´etique du d´eveloppement compar´e, chez les M´etazoaires est une discipline
qui consiste a` mettre en e´ vidence la conservation des m´ecanismes mol´eculaires du d´eveloppement a`
travers l’´etude de diff´erents organismes mod`eles et de comprendre comment des modifications de ces
m´ecanismes ont pu eˆ tre a` l’origine de modifications des caract´eristiques morpho-anatomiques (plan
d’organisation) des animaux au cours du temps[2]. Plus r´ecemment, il est apparu crucial d’int´egrer a`
ce domaine d’´etude l’aspect e´ cologique (Eco) pour replacer l’´evolution des organismes et du d´eveloppement
dans le contexte de la variation environnementale.
Au cours des derni`eres ann´ees, les e´ ponges ont suscit´e un int´erˆet grandissant. Du fait de leur position phylog´en´etique a` la base de l’arbre des M´etazoaires (Cf partie 2.3), elles constituent un groupe
cl´e pour comprendre les premi`eres e´ tapes de l’´evolution des m´ecanismes d´eveloppementaux et des
plans d’organisation des animaux. De plus, en d´epit de leur apparente simplicit´e morphologique, il a
e´ t´e d´ecouvert chez les e´ ponges la plupart des grandes familles de contrˆole du d´eveloppement identifi´ees chez les Eum´etazoaires [1] [3].
Enfin, les e´ ponges ont un rˆole important dans les e´ cosyst`emes, il est donc n´ecessaire d’´etudier les
e´ ventuelles perturbations de leur reproduction ou de leur d´eveloppement en lien avec une augmentation de la temp´erature ou la pr´esence de polluants afin d’avoir une estimation sur l’´evolution des
e´ cosyst`emes.
7
2.3
Phylog´enie des Porif`eres
Classiquement les porif`eres se subdivisent en trois classes :
- Les Hexactinellida
- Les Demospongiae
- Les Calcispongiae
Ces trois grande classes sont d´efinies sur la base de crit`eres morphologiques principalement la forme
et la nature des spicules. Les hexactinellides, ont un squelette constitu´e de spicules de silice a` sym´etrie
d’ordre six. Les d´emosponges ont un squelette de spicules siliceux dont la sym´etrie est d’ordre un ou
quatre. Les e´ ponges calcaires ont un squelette constitu´e de spicules de calcite a` deux, trois ou quatre
rayons. Ces derni`eres ann´ees, les phylog´enies mol´eculaires ont remis en cause cette classification.
En effet, depuis 2010 [4] [5] il a e´ t´e montr´e grˆace a` des analyses mol´eculaires que le groupe des Homoscleromorpha se distingue des D´emosponges et forme ainsi une quatri`eme grande classe d’´eponges.
C’est au sein de ce groupe des Homoscleromorpha que se trouve notre mod`ele d’´etude, Oscarella lobularis dont nous reparlerons plus en d´etail dans la section mat´eriel et m´ethode .
Cependant les relations de parent´es entre ces quatre classes d’´eponges (Figure 2), ainsi qu’avec
les autres organismes non triploblastiques sont actuellement tr`es controvers´ees[6] [7] [8] [9] [10].
Malgr´e ce cadre phylog´en´etique peu r´esolu, il apparaˆıt que les e´ ponges constituent l’une des lign´ees
les plus basales de l’arbre des M´etazoaires. A ce titre elles sont des mod`eles incontournables dans une
probl´ematique Eco-Evo-Devo. [2]
F IGURE 2 – Hypoth`eses e´ volutive
A : Paraphylie des e´ ponges. B : Monophylie des e´ ponges. d’apr`es[1]
8
2.4
Consid´erations e´ cologique
Depuis le d´ebut de la r´evolution industrielle, les oc´eans ont servit de poubelle a` toutes les industries de la plan`ete. En effet, l’id´ee selon laquelle tout peut eˆ tre dilu´e dans l’oc´ean persiste encore
de nos jours. De tr`es grandes quantit´es de r´esidus industriels se retrouvent donc dans les oc´eans,
comme par exemple du mercure, du titane, du plomb ainsi que diff´erents compos´es radioactifs des
r´esidus p´etroliers. . . L’impact r´eel de tous ces polluants sur la faune et la flore marines est encore tr`es
mal connu et probablement sous estim´e.
On s’int´eresse ici au Chlorure de Lithium (LiCl) qui compose la tr`es grande majorit´e de batteries des appareils e´ lectroniques modernes (ordinateur portable, t´el´ephone portable, lecteur Mp3. . ..)
mais qui est e´ galement utilis´e pour diff´erents alliages en m´etallurgie. De plus, les rejets de Chlorure
de Lithium dans les oc´eans risquent de fortement augmenter dans les prochaines ann´ees en raisons
notamment de l’augmentation du march´e des v´ehicules de type hybride ou e´ lectrique qui utilisent des
batteries au Lithium [11]. Le Chlorure de Lithium en plus d’ˆetre un m´etal lourd et donc polluant,
est connu pour perturber certaines voies de signalisation impliqu´ees dans le d´eveloppement des organismes notamment la voie Wint (Wnt) [12] [13] [7] . Il est donc important de tester les effets de ce
polluant sur les organismes afin de mesurer son impact sur les populations pour a` terme e´ tablir des
normes de protection de l’environnement.
2.5
But du travail
Mon travail a consist´e a` soumettre les e´ ponges adultes a` des concentrations variables en chlorure
de Lithium pendant des temps variables et visualiser les perturbations ph´enotypiques cons´ecutives a`
travers l’observation des e´ chantillons en microscopie a` balayage ou a` transmission. Un autre aspect de
mon travail a consist´e a` localiser la prot´eine beta-cat´enine par immunohistochimie sur les e´ chantillons
trait´es et non trait´es afin de voir si le traitement au LiCl, compte tenu de son action sur la voie Wnt
qui permet la translocation de cette prot´eine dans le noyau, avait une incidence.
9
3
3.1
Mat´eriels et m´ethodes
Le mod`ele Oscarella lobularis
Oscarella lobularis appartient a` la classe des homoscleromorphes. Cette esp`ece poss`ede de nombreuses caract´eristiques qui la distingue des autres porif`eres et la rapproche des eum´etazoaires. Notamment, Oscarella lobularis poss`ede un vrai e´ pith´elium semblable a` celui des eum´etazoaires
ainsi que du collag`ene de type IV [1] [3] [14] .
Une autre particularit´e de cette esp`ece est l’absence de spicules qui servent traditionnellement de soutien aux e´ ponges ce qui la rend plus facile a` utiliser pour les exp´eriences car il n’est pas n´ecessaire
de dissoudre les spicules avant les coupes. Enfin, Oscarella lobularis contrairement a` la majorit´e des
porif`eres ne poss`ede pas d’arch´eocyte (cellule souche) donc ses cellules ont la capacit´e de se rediff´erencier pour donner selon les besoins d’autres types cellulaires.
Oscarella lobularis est une esp`ece end´emique de m´editerran´ee. Elle pousse uniquement sur des
fonds rocheux entre 4 et 35m de profondeur de pr´ef´erence dans un environnement ombrag´e. Elle
est extrˆemement comp´etitive et forme des colonies tr`es importantes. Cette comp´etitivit´e est probablement due aux substances chimiques produites par le m´etabolisme secondaire qui la prot`ege de la
pr´edation. Elle est donc tr`es disponible et facile a` pr´elever ce qui est un avantage. Oscarella lobularis
se reproduit par reproduction asexu´ee et sexu´ee de type ovovivipare. Il a e´ t´e montr´e, concernant la
gam´etogen`ese, que les gam`etes femelles et mˆales sont produits a` partir de la transdiff´erenciation d’un
type cellulaire somatique particulier : les choanocytes.
De plus, l’´equipe d’accueil a acquis depuis de nombreuses ann´ees des donn´ees sur ce mod`ele (cycle de
vie, reproduction, donn´ees morpho-anatomiques, cytologiques, mol´eculaires) ce qui pr´esente e´ galement
un avantage.
3.2
Collecte et traitement des e´ chantillons
Les e´ chantillons d’Oscarella lobularis ont e´ t´e pr´elev´es par le service plong´e de l’institut PYTHEAS dans la baie de Marseille. Par la suite, les individus ont e´ t´e d´ecoup´es en une centaine de
morceaux qui ont e´ t´e plac´es s´epar´ement dans des aquariums avec une a´eration pour une dur´ee de 48h
a` 13˚C afin de les faire r´eg´en´erer avant le d´ebut des traitements.
Apr`es 48h de r´eg´en´eration, les e´ chantillons sont plac´es dans des boˆıtes de P´etri contenant 50 mL
d’une solution de LiCL a` diff´erentes concentrations (10mM, 20mM, 40mM, 60mM et 80mM selon
les individus) et laiss´es au repos a` 13˚C (Tableau 1). Ces traitements ont e´ t´e effectu´es pendant des
laps de temps variables (24, 48 et 72h). Un t´emoin eau de mer a e´ t´e r´ealis´e.
Apr`es 24h, 48h et 72h d’incubation 2 morceaux de chaque individu sont pr´elev´es pour eˆ tre fix´es.
10
TABLE 1 – R´ecapitulatif des diff´erents traitements.
3.3
M´ethodes de fixations.
Diff´erentes m´ethodes de fixation ont e´ t´e utilis´ees en fonction des e´ tudes r´ealis´ees ult´erieurement
sur les e´ chantillons. Trois m´ethodes de fixation ont e´ t´e s´electionn´ees :
- Fixation au Paraformaldehyde (PAF) (annexe 6.4)
- Fixation au Glutaraldehyde (annexe 6.5)
- Fixation a` l’´ethanol
3.3.1
Fixation des e´ chantillons a` l’´ethanol
La fixation a` l’´ethanol est pr´econis´ee pour r´ealiser des protocoles d’immunohistochimie car les
prot´eines sont tr`es bien conserv´ees.
De plus cette fixation permet de conserver les e´ chantillons sur une longue dur´ee.
3.3.2
Fixation des e´ chantillons au glutarald´ehyde
La fixation au Glutarald´ehyde (protocole en annexe 6.5 ) a la particularit´e de conserver les structures cellulaires et permet une observation morphologique fine des e´ chantillons sur coupe au microscope optique, e´ lectronique ou a` balayage.
La conservation a` moyen terme est e´ galement possible dans le Glutarald´ehyde.
3.3.3
Fixation des e´ chantillons a` la PAF
La fixation PAF (protocole en annexe 6.4 ) permet de r´ealiser des hybridations in situ et e´ ventuellement
des immunohistochimies (protocole en annexe 6.3) car elle conserve les macromol´ecules comme
l’ARN ou les prot´eines mais e´ galement les structures cellulaires.
Ces fixations a` la PAF seront utilis´ees par un e´ tudiant en th`ese dans le laboratoire et ne seront pas
exploit´ees dans le cadre de mon travail.
11
3.4
Immunohistochimie
3.4.1
Inclusion a` la paraffine
Afin de r´ealiser des immunohistochimies, les e´ chantillons, fix´es a` l’´ethanol, ont e´ t´e inclus dans
la paraffine (protocole en annexe 6.1). Pour ce faire, plusieurs bains ont e´ t´e effectu´es. Dans un premier temps, on place l’´echantillon dans du N´eo-clear afin de chasser l’´ethanol des tissus. En effet,
la paraffine est hydrophobe et ne peut donc pas se m´elanger avec l’´ethanol, celui-ci doit donc eˆ tre
remplac´e par le N´eo-clear qui est lui aussi hydrophobe, cela va favoriser la p´en´etration de la paraffine
dans les tissus. Apr`es les bains de N´eo-clear les e´ chantillons sont plac´es dans des bains de paraffine
(plac´ee dans une e´ tuve car elle est solide a` temp´erature ambiante) qui va remplacer progressivement
le N´eo-clear. Une fois que la paraffine a envahi les tissus, elle va durcir (hors de l’´etuve) et permettre
la coupe au microtome des e´ chantillons.
3.4.2
Coupe des blocs de paraffine
Une fois les blocs de paraffine refroidis, la coupe des e´ chantillons au Microtome est possible
(Figure 3). Des coupes d’une e´ paisseur de 7 microm`etres ont e´ t´e r´ealis´ees puis e´ tal´ees sur des lames
qui ont e´ t´e pr´ealablement recouvertes d’albumine pour permettre l’adh´esion des coupes a` la lame.
Enfin les lames sont laiss´ees a` s´echer au moins 48h afin de s’assurer que les coupes sont bien fix´ees
(protocole en annexe 6.2).
F IGURE 3 – Le microtome
3.4.3
Principe de l’ immunohistochimie
L’immunohistochimie permet de localiser une prot´eine dans les tissus d’un e´ chantillon (protocole
en annexe 6.3)
12
La premi`ere e´ tape consiste a` retirer la paraffine de la coupe afin de permettre aux diff´erents traitements d’atteindre les tissus. Les lames sont donc plong´ees dans le Neo-Clear afin d’ˆetre d´eparaffine´es
puis dans des bains d’´ethanol pour eˆ tre r´ehydrat´ees.
La seconde e´ tape est l’application de l’anticorps primaire dont le rˆole est de se fixer sur la prot´eine
recherch´ee. Apr`es quelques heures, l’anticorps primaire est rinc´e avec la solution tampon. Enfin, lors
de la troisi`eme e´ tape, on applique un anticorps secondaire anti anticorps primaire coupl´e a` un fluorochrome. Cet anticorps va se fixer plusieurs fois sur l’anticorps primaire et ainsi amplifier le signal
fluorescent pour nous permettre de l’observer grˆace a` un microscope a` e´ pifluorescence (Figure 4). Un
microscope a` e´ pifluorescence fonctionne sur le mˆeme principe qu’un microscope optique a` l’exception qu’il permet e´ galement l’observation de la fluorescence notamment grˆace a` ses nombreux filtres
et lumi`eres disponibles a` diff´erentes longueurs d’ondes.
F IGURE 4 – Principe d’un microscope a e´ pifluorescence
Ces trois e´ tapes sont a` la base de cette m´ethode cependant ici sur Oscarella lobularis, une autre
e´ tape est n´ecessaire car les tissus de notre e´ ponge e´ mettent naturellement de la fluorescence, il est
13
donc obligatoire d’´eteindre cette fluorescence afin de pouvoir observer le marquage. Les coupes
sont donc soumises a` un bain de Sulfate de Cuivre qui permet de r´eduire la fluorescence naturelle.
Au cours de ces manipulations, un marquage de l’ADN au DAPI a e´ galement e´ t´e effectu´e afin de
contrˆoler la qualit´e des tissus. Des t´emoins positifs ( tubuline), n´egatifs (anticorps primaire sans le
secondaire et anticorps secondaire sans le primaire) ont aussi e´ t´e r´ealis´es afin de v´erifier l’efficacit´e
de chaque anticorps.
3.5
Observations histologiques
Que ce soit pour l’observation au microscope a` balayage (MEB) ou au microscope optique, les
e´ chantillons sont pr´epar´es de la mˆeme fac¸on (post-fixation + d´eshydratation).
3.5.1
Post-fixation a` l’Osmium et d´eshydratation
Les e´ chantillons fix´es au glutarald´ehyde sont post-fix´es au tetroxyde d’Osmium (protocole en annexe 5). En effet le glutarald´ehyde seul reste insuffisant et il est n´ecessaire de r´ealiser une seconde
fixation.
Les e´ chantillons sont rinc´es a` l’eau de mer filtr´ee a` plusieurs reprises pour retirer toute trace du
glutarald´ehyde. Puis, ils sont soumis a` un bain d’Osmium durant 2h qui joue le rˆole de fixateur et de
colorant (rend les tissus opaques aux e´ lectrons). L’Osmium est extrˆemement toxique et doit eˆ tre utilis´e
avec pr´ecaution. Par la suite les e´ chantillons sont d´eshydrat´es par des bains d’´ethanol de concentrations croissantes.
3.5.2
Microscopie e´ lectronique a` balayage
La microscopie e´ lectronique a` balayage utilise le principe des interactions e´ lectron/mati`ere et
permet de produire des images de la surface d’un e´ chantillon. Le faisceau d’´electron balaie la surface
de l’´echantillon a` analyser qui r´ee´ met certaines particules.
Ces particules sont analys´ees par diff´erents d´etecteurs qui permettent de reconstruire une image en
trois dimensions. Avant de pouvoir observer au MEB des e´ tapes de pr´eparation de l’´echantillon sont
n´ecessaires : le point critique et la m´etallisation.
Point critique : Apr`es la post-fixation a` l’Osmium, cette e´ tape permet de d´eshydrater totalement
les tissus sans modifier la morphologie de l’´echantillon (protocole en annexe 6.6). On place les
e´ chantillons dans de petits paniers poreux dans le r´eceptacle de la machine a` point critique pr´ealablement
rempli d’´ethanol 100˚. On refroidit les e´ chantillons a` 5˚C-10˚C grˆace a` du C02 liquide et on augmente
la pression de la chambres a` 50 bars ce qui permet au CO2 de rester liquide.
Grˆace a` une s´erie de manipulation, l’´ethanol est progressivement remplac´e par du CO2 liquide. Quand
tout l’´ethanol est supprim´e des tissus, on fait chuter la pression pour permettre au CO2 de repasser
a` l’´etat gazeux. Enfin, on augmente la temp´erature afin de faire disparaˆıtre toute trace d’humidit´e
r´esiduelle. A la fin de la manipulation les e´ chantillons sont secs et prˆets a` eˆ tre m´etallis´es.
14
M´etallisation : Cette derni`ere e´ tape consiste a` placer les e´ chantillons des supports m´etalliques recouverts de scotch double face conducteur. Une fois les e´ chantillons fix´es au support, ils sont plac´es
dans le m´etaliseur qui recouvre les e´ chantillons d’une mol´ecule de m´etal (or, platine. . .) qui va permettre aux e´ lectrons de r´ee´ mettre des particules.
3.6
Microscopie optique
Apr`es la post-fixation a` l’Osmium, les e´ chantillons sont recoup´es en plus petits morceaux sous la
loupe binoculaire pour faciliter leurs inclusions dans l’araldite afin de r´ealiser des coupes semi-fines
(250nm) et ultrafines (80nm) pour l’observation au microscope optique. En effet, les inclusions en
paraffine ne permettent pas, du fait de sa faible duret´e, de faire des coupes assez fines pour une observation de qualit´e, on utilise alors des r´esines e´ poxy comme l’araldide.
Pour r´ealiser ce type de coupe, on utilise un ultra microtome e´ quip´e d’un couteau diamant.
Une fois les coupes effectu´ees et e´ tal´ees sur les lames, on les place quelques instants sur une plaque
chauffante afin de permettre a` l’eau de s’´evaporer puis, on proc`ede a` une coloration avec du bleu de
tolu`ene. Enfin, on d´epose quelques gouttes d’araldite sur la lame avant de la recouvrir d’une lamelle
et l’on place le tout a` l’´etuve a` 37˚C pendant 24h pour permettre la polym´erisation.
15
4
R´esultats
Tout ce qui a e´ t´e effectu´e durant ce stage a e´ t´e regroup´e dans un tableau (Tableau 2) afin de clarifier
quels e´ chantillons ont e´ t´e utilis´es, comment ils ont e´ t´e fix´es et dans quel but.
TABLE 2 – Tableau r´ecapitulatif..
NR= non r´ealis´e
16
4.1
Observations morphologiques au microscope a` balayage : effet du traitement au LiCl
Nous avons observ´e sur les e´ chantillons trait´es au LiCl un certain nombre de modifications par
rapport aux individus t´emoins (r´esum´ees dans le tableau 3).
TABLE 3 – R´esum´e synth´etique des ph´enotypes observ´es sur les e´ chantillons trait´es au LiCl
(++) Tr`es fort ; (+) fort ; 0 absence ou non observ´e ; (-) faible ; (–) tr`es faible.
Les observations au microscope a` balayage e´ lectronique ont e´ t´e effectu´ees sur neufs e´ chantillons
dont 3 e´ chantillons t´emoins (voir Tableau 2). Ces observations sur individus entiers m’ont permis
d’observer la morphologie externe (exopinacoderme, pr´esence d’ostioles..). Les e´ chantillons t´emoins
montrent tous une activit´e cellulaire normale avec des zones de croissance peu nombreuses, des ostioles et un exopinacoderme flagell´e (Figure 5). La pr´esence d’un nombre important de flagelles est le
signe d’une faible activit´e cellulaire car juste avant la mitose les cellules de l’exopinacoderme perdent
leurs flagelles. Les zones de croissance sont e´ galement un signe de forte activit´e cellulaire.
17
F IGURE 5 – T´emoins eau de mer a` differents temps d’observation
FL : flagelle ; ZC : Zones de Croissance ; EX : Exopinacoderme ; Os : Ostiole.
Les zones de croissance (ou protub´erances, Figure 6) sont plus nombreuses et observables d`es 24h
de traitement au LiCl 10µM (ces zones de croissances n’ont pas pu eˆ tre d´etect´ees sur l’´echantillon
trait´e pendant 72h car notre e´ chantillon e´ tait tr`es endommag´e). Ces zones de croissances sont en nette
augmentation apr`es 24h et 48h de traitement au LiCl 60µM.
18
F IGURE 6 – zone de croissance observ´ees sur les individus trait´es
ZC : Zones de croissance.
D`es 24h de traitement a` 10µM l’activit´e cellulaire semble plus importante car le nombre de flagelle (Figure 7) est en diminution par rapport aux t´emoins. Ce ph´enotype se confirme sur tous les
e´ chantillons trait´es et semble s’accentuer a` 24h de traitement a` 60µM.
F IGURE 7 – Observation du nombre de flagelle en diminution sur les e´ chantillons trait´es.
LiCl 60µM a` 24h.
On remarque e´ galement la pr´esence d’un petit nombre d’ostioles en formation a` partir de 48h
de traitement a` 10µM . Ces nouveaux ostioles sont observables e´ galement a` 72h sans pour autant
19
eˆ tre en augmentation. Par contre lorsque les e´ chantillons sont trait´es avec 60µM de LiCl, le nombre
d’ostioles augmente de mani`ere importante a` 24h de traitement et s’accentue a` 48h. Ce ph´enotype
ne s’observe pas a` 72h de traitement a` 40µM. Les photos disponibles illustrent mal cette observation
elles ne seront donc pas pr´esent´ees ici.
A partir de 48h de traitement a` 10µM, le nombre de microvilosit´e a` la surface cellulaire est plus
important (ph´enotype non observ´e a` 72h). Ce ph´enotype se confirme et s’accentue a` 24 et 48h de
traitement a` 60µM (Figure 8).
F IGURE 8 – Microvillosit´es a la surface des cellules.
MIC : Microvillosit´es.LiCl 40µM a` 48h.
20
Enfin, on remarque l’apparition d’un agencement tr`es particulier des cellules a` partir de 24h de
traitement a` 10µM et en augmentation apr`es 48h. Les cellules de l’exopinacoderme s’agencent les
unes au dessous des autres pour former de longs filaments cellulaires (Figure 9). Ce ph´enotype est
e´ galement observable sur les e´ chantillons trait´es a` des concentrations en LiCl plus fortes mais la
fr´equence de ces agencements ne semble pas eˆ tre dose-d´ependante.
F IGURE 9 – Structures cellulaires particuli`eres observ´e a` 10µM 24h
21
4.2
Immunohistochimie
Des immunohistochimies ont e´ t´e r´ealis´ees au cours de ce stage sur 1 t´emoin (10 lames) et 3
e´ chantillons trait´es (10 lames /´echantillon) (voir tableau 2) pour tenter de localiser la β -cat´enine sur
des coupes de tissus pr´ealablement inclus dans la paraffine. Pour la premi`ere immunohistochimie
(Figure 10), un e´ chantillon t´emoin eau de mer a e´ t´e s´electionn´e. Les contrˆoles positifs, n´egatifs et
avec le DAPI permettent de valider la technique puisque les observations attestent que les lames sont
de bonne qualit´e et le marquage coh´erent avec nos attentes (Figure 10A, B et D). Un marquage de la
β -cat´enine dans les chambres choanocytaires a pu eˆ tre observ´e (Figure 10C).
F IGURE 10 – Immunohistochimie
A : t´emoin tubuline. Le signal est tr`es marqu´e au niveau des flagelles qui sont tr`es riche en
tubuline.B : t´emoin n´egatif sans Ac, aucun marquage n’est visible. C : e´ chantillon t´emoin eau de mer
avec anti-corps sp´ecifique contre la β -cat´enine chez la souris. D : e´ chantillon t´emoin eau de mer
marqu´e au DAPI pour contrˆoler l’´etat des tissus.
Les t´emoins positifs et n´egatifs r´ealis´es sur les trois e´ chantillons trait´es au LiCl (40µM 48h, 20µM et
40µM 72h) sont conformes aux r´esultats attendus : marquage ubiquitaire pour le t´emoin positif tubuline et aucun marquage pour les t´emoins n´egatifs. En ce qui concerne l’expression de la β -cat´enine
aucun marquage n’a pu eˆ tre observ´e.
22
5
5.1
Discussion Conclusion et perspective
Ph´enotype observ´e au microscope e´ lectronique
Bien que les observations effectu´ees dans le cadre de mon travail doivent eˆ tre r´eit´er´ees sur d’autres
e´ chantillons a` des temps et des concentrations de LiCl plus complets et sur plus de coupes afin de
confirmer les r´esultats, ces premi`eres donn´ees montrent que les e´ chantillons trait´es pr´esentent des
perturbations par rapport aux e´ chantillons contrˆoles. En effet il semble que l’activit´e cellulaire y soit
plus importante comme en atteste les zones de croissance ou protub´erances observ´ees ainsi que la
diminution du nombre de flagelle. On observe e´ galement un nombre de microvillosit´e a` la surface
des cellules plus important ainsi qu’une organisation des cellules les unes par rapport aux autres qui
laissent sugg´erer un d´eplacement cellulaire et/ou une r´eorganisation cellulaire. Le nombre d’ostioles
augmente. Bien que cette augmentation n’ai pas fait l’objet de statistiques, ce ph´enotype est tr`es clair
lors des observations au microscope et a` relier tr`es probablement, de mˆeme que les autres ph´enotypes
observables, avec l’action du LiCl sur la voie de signalisation Wnt. Lorsque la prot´eine WNT se fixe
sur son r´ecepteur Frizzled (Fz) la β -cat´enine s’accumule dans le noyau (Figure 11) Le LiCl inhibe
la GSK3 et permet l’activation de cette voie et l’accumulation de β -cat´enine dans le noyau. La voie
de signalisation Wnt via la β -cat´enine est impliqu´ee dans de nombreux processus d´eveloppementaux
notamment :
-Permettre les changements morphocytologiques et les mouvements cellulaires, ce qui est en accord
avec le fait qu’elle agit sur le cytosquelette.
-Etre a` l’origine d’activations g´en´etiques par son interaction avec le facteur de transcription TCF (T
Cell Factor).
23
F IGURE 11 – Fonctionnement de la voie Wnt.
A. En absence de stimulation des r´ecepteurs FZD par un ligand WNT, la β -cat´enine est phosphoryl´ee, dans un complexe de destruction dont font partie l’axine et la prot´eine APC, par les
kinases GSK3et CK¡1. Cette phosphorylation la conduit vers son ubiquitine-ligase, TRCP, et vers le
prot´easome. B. En pr´esence d’un ligand WNT sur le r´ecepteur FZD, la prot´eine DSL est recrut´ee, ce
qui permet la phosphorylation du cor´ecepteur LRP5/6 par la CK¡1et la GSK3, et le recrutement de
l’axine a` la membrane. Le complexe de destruction est dissoci´e et la β -cat´enine non phosphoryl´ee
peut entrer dans le noyau o`u elle s’associe a` un ensemble de mol´ecules impliqu´ees dans la r´epression
de la transcription, en particulier les facteurs TCF/LEF. La lev´ee de la r´epression permet la
transcription de nombreux g`enes de prolif´e- ration cellulaire.
5.2
Immunohistochimie
Sur les quatre immunohistochimies r´ealis´ees durant le stage, seule une, la premi`ere, a montr´e
un marquage net en ce qui concerne la β -cat´enine . Les trois suivantes n’ont montr´e aucun signe
de fluorescence. Cependant, les diff´erents contrˆoles positifs et n´egatifs ont tous donn´e les r´esultats
attendus validant ainsi la technique utilis´ee. L’anticorps primaire utilis´e pour marquer les prot´eines
β -cat´enine est sp´ecifique aux Eum´etazoaires et, apr`es avoir effectu´e des recherches, il est apparu que
les prot´eines de β -cat´enine divergent assez fortement chez les Poriferes. Il est donc peu probable que
l’anticorps parvienne a` se fixer sur la β -cat´enine de notre e´ ponge. Aux vues de ces recherches les
r´esultats n´egatifs obtenus lors des manipulations effectu´ees sur les e´ chantillons trait´es ne sont donc
pas surprenants.
Concernent les r´esultats de la premi`ere manipulation sur l’´echantillon t´emoin montrant une expression
de la β -cat´enine au niveau des chambre choanocytaires, il est probable qu’une erreur de manipulation
au moment de l’application des anticorps soit a` l’origine de ce marquage. En effet, lors des manipulations, une autre e´ tudiante r´ealisait le mˆeme type de travail en parall`ele dans le but de marquer une
24
autre prot´eine (NICD actif) chez Oscarella lobularis.
Le marquage obtenu pour la β -cat´enine est tr`es proche de celui obtenu par cette e´ tudiante (Figure
12). Dans le cas du NICD actif, le marquage a e´ t´e confirm´e plusieurs fois et de plus est en ad´equation
avec des r´esultats d´ej`a obtenus dans l’´equipe. On peut donc en conclure que lors de la premi`ere manipulation une erreur a eu lieu avec les anticorps.
F IGURE 12 – Marquage
A : Marquage contre la β -cat´enine. B : Marquage contre NICD actif ; On observe une tr`es grande
similitude entre les marquages.
Afin de pouvoir r´ealiser a` l’avenir des immunohistochimies sur la β -cat´enine, deux solutions sont
envisageables, il faudrait acheter des anticorps d’un taxon plus proche des Porif`eres. Cette solution
serait la moins ch`ere pour le laboratoire, mais le risque que les s´equences soient toujours trop divergentes reste pr´esent. Une autre solution consisterait a` faire d´evelopper un anticorps sp´ecifique a` ce qui
e´ liminerait le risque que les s´equences soient divergentes. Cependant, le budget requis pour ce type
de d´eveloppement est tr`es e´ lev´e.
25
6
6.1
Annexes
Protocole d’inclusions des e´ chantillons dans la paraffine
Apr`es fixation des e´ chantillons dans l’´ethanol, les e´ chantillons des Eppendorf sont mis successivement dans des bains permettant le passage d’un produit a` un autre :
R
R est un remplac
-2 bains de Neoclearpendant
30 min. Le Neoclear
¸ ant du Xyl`ene, il est donc
n´ecessaire de le manipuler sous Sorbonne.
R
-1 bain Neoclear/Paraffine
pendant 40min. Ce bain se r´ealise dans une e´ tuve a` 60˚C pour que la
paraffine conserve sa forme liquide.
-1 bain de paraffine pendant 2h.
-1 bain de paraffine pendant 30min.
Apr`es les bains, les e´ chantillons sont prˆets a` eˆ tre inclus. Il faut donc prendre un moule, couler une
premi`ere couche de paraffine, d´eposer l’´echantillon puis poser une cassette avant de couler une seconde couche de paraffine sur la cassette. La cassette va servir de support pour couper nos e´ chantillons
au microtome.
L’utilisation de la Paraffine doit eˆ tre rapide car celle-ci se solidifie rapidement a` temp´erature ambiante.
6.2
Protocole pour r´ealiser des coupes histologiques
Une fois la paraffine solidifi´ee, il faut d´emouler les e´ chantillons puis couper la paraffine autour de
l’´echantillon pour faire un trap`eze.
-On pose la cassette sur le microtome
-On r`egle l’´epaisseur des coupes (ici 7µm)
-On installe le couteau qui doit former un angle de 30˚ avec l’objet
-On pr´epare la lame, on d´egraisse la lame avec de l’´ethanol puis on d´epose une goutte d’albumine que
l’on e´ tale avant de d´eposer de l’eau distill´ee sur la lame.
-En manœuvrant le microtome, on obtient un ruban de coupes s´eri´ees.
-Le ruban est ensuite e´ tal´e sur la lame a` l’aide d’un pinceau puis la lame d´epos´ee sur une plaque
chauffante qui va d´eplier les coupes.
-Les lames sont mises a` s´echer pendant 48h (minimum) pour que le ruban se fixe a` la lame. Les lames
peuvent eˆ tre mises a` s´echer a` l’air libre ou a` l’´etuve 37˚C.
6.3
Protocole des immunohistochimies
Etape de d´eparaffinage :
R Il est important de contrˆ
-2 fois 15-20min dans un bain de Neoclear.
oler visuellement l’´etat du
d´eparaffinage, perceptible par l’opacit´e des coupes.
Etape de r´ehydratation :
- 1 bain de 5min dans de l’´ethanol 95˚
26
-1 bain de 3min dans de l’´ethanol 75˚
-1 bain de 3min dans de l’´ethanol 50˚
-Ajout progressif d’eau distill´ee
R 0.3% Triton et du PEM qui sert de diluant
-Mettre 130µl de block solution (1% Blocking reagent,
et de tampon) par lame et poser la contre lame durant 30min dans une chambre humide afin que les
anticorps primaires se fixent sur les s´equences cibles).
-Enlever la block solution et ajouter 130µl d’anticorps primaires aux dilutions suivantes : Bcat 1/1000 ;
Tub 1/200 ; Nicd Nt 1/200 ; Nicd Ct 1/200.
-Incubation deux heures ou une nuit dans la chambre humide a` 4˚C
-Lavages successifs dans la block solution 4x300µl
-Ajout de 130µl d’anticorps secondaires dilu´es au 1/1000 dans du PEM (100mM de pipes, 1mM
EGTA, 0.1mM MgSO4) Il est important a` partir de cet instant, de limiter les expositions a` la lumi`ere.
-Incuber pendant 30min en chambre humide et dans le noir.
-Laver 5 fois dans du PEM.
-Marquage 15min avec 100µl de DAPI a` 5µg/ml.
-Rinc¸age avec du PEM puis de l’eau distill´ee.
-Laisser une heure dans du CuSO4 fraichement pr´epar´e a` 50mM dans de l’ac´etate d’ammonium en
chambre humide. Le CuSO4 e´ teint l’autofluorescence.
-Rincage a` l’eau puis lavage au PEM.
R (contient du glyc´
-Montage entre lame et lamelle avec 2-3 gouttes de citifluor
erol et un agent limitant la d´egradation du signal).
6.4
Protocole de fixation a` la PAF (paraformaldehyde)
D´ebarrasser les e´ ponges du maximum de substrat.
Faire des rinc¸ages a` l’eau de mer filtr´ee. Fixation PAF 4% eau de mer filtr´ee (EMF) pour une nuit a`
4˚C. Pour la d´eshydratation, faire des bains de 15min.
-2 bains dans de l’eau de mer filtr´ee.
-1 bain dans le PBS 25 EMF
-1 bain dans le PBS 50 EMF
-1 bain dans le PBS 75 EMF
-2 bains dans le PBS 100
-1 bain dans le MeOH 25 PBS
-1 bain dans le MeOH 50 PBS
-1 bain dans le MeOH 75 PBS
-3 bains dans le MeOH 100
-Stocker a` -20˚C.
27
6.5
Fixation au Glutaraldehyde et post fixation
On place les e´ chantillons dans une solution deGlutaraldehyde 25% 1V ; 0,2M Cacodylate 4V ; Eau
de mer filtr´ee 5V pendant 2h minimum au frigo ( possibilit´e de conserver longtemps a` cette e´ tape).
-Rincer 3X10mn dans EMF
-2h dans Osmium 2%
-3X10mn dans eau distill´e
-2X10mn dans ETOH 30%
-1Omn dans ETOH 5O%
- 2X10mn dans ETOH 95%
- 3X20mn dans ETOH 100%
Pour inclusion araldyte :
-LMR 2X20mn
-50%LMR/50% araldyte 1h
- 100% araldyte 1h
-100% araldyte 1h
Pr´eparation des moules pour inclusions
Positionnement des e´ chantillons dans les moules sous la loupe binoculaire avec aspiration.
Mise a` l’´etuve des moules pour 24h afin de polym´eriser et durcir.
6.6
Point critique
Pr´eparation de l’´echantillon :
Dans les petits paniers en t´eflon blancs que l’on met sur une boite de P´etri, on met de l’EtOH 100˚
tout autour (`a cause de la porosit´e des paniers). Mettre l’´echantillon dans le panier, puis une toute
petite e´ tiquette afin de r´ef´erencer l’´echantillon, fermer avec le capuchon et mettre le(s) panier(s) dans
un pilulier rempli d’EtOH 100˚.
Appareil :
Fermer Gas out (devant) (en tournant vers la droite).
Appuyer sur le bouton vert Mains afin d’allumer l’appareil.
Ouvrir la bouteille de CO2.
Mettre le ou les panier(s) contenant les e´ chantillons dans la chambre en m´etal gris, recouvert par de
l’alcool absolu ou de l’ac´etone jusqu’au trait. Refermer.
Precool (`a gauche de l’appareil) jusqu’`a ce que la temp´erature descende a` 5˚C. Ne pas ouvrir trop fort.
Attendre que la temp´erature descende progressivement.
Remplir avec gas in (devant) jusqu’`a atteindre 50 bars.
28
Appuyer sur le bouton orange Stirrer.
Ouvrir Gas out, surveiller que l’´echantillon baigne.
Arrˆeter Gas out, remplir avec CO2 par Gas In pour maintenir la pression a` 50 bars.
Recommencer Gas out – Gas in jusqu’`a ce qu’il ne sorte plus d’alcool en maintenant t˚ aux environs
de 5 a` 10˚C par precool. Laisser 5 minutes chaque fois pour avoir un bon m´elange avant de rouvrir
Gas out pour faire sortir l’alcool.
Quand il ne sort plus d’alcool, remplir la chambre a` moiti´e avec Gas in.
Fermer Gas in, Gas out, bouteille, on e´ teint le bouton Stirrer.
Appuyer sur Heating (bouton bleu), temp´erature r´egl´ee a` 40˚C (→ 36˚, point critique vers 31˚).
Attendre 20 a` 30 minutes pour qu’il n’y ait plus de liquide dans la chambre.
Ouvrir Gas out doucement pour laisser e´ chapper le CO2 gazeux en 5 a` 15 minutes.
On sort les paniers et on les met dans un pilulier propre et sec que l’on ferme herm´etiquement.
29
R´ef´erences
[1] Fierro-Constain L Schenkelaars Q Ereskovsky AV Vacelet J Borchiellini C Renard E, Gazave E.
Porifera (version 2,0). Encyclopedia of Life Sciences, 2013.
[2] Wills MA Jenner RA. The choice of model organisms in evo–devo. Nat Rev, 2007.
[3] Borchiellini C Ereskovsky AV, Renard E. Cellular and molecular processes leading to embryo
formation in sponges : evidences for high conservation of processes throughout animal evolution. Developmental Genes and Evolution, 2013.
[4] Renard E Vacelet J Rocher C Ereskovsky AV Lavrov DV Borchiellini C Gazave E, Lap´ebie P.
Molecular phylogeny restores the supra-generic subdivision of homoscleromorph sponges (porifera, homoscleromorpha). PLoS One, 2010.
[5] Alexander V. Ereskovsky Jean Vacelet Emmanuelle Renard Paco Ca´rdenas Carole Borchiellini
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