1. No category

‫אוניברסיטת תל אביב‬
‫הפקולטה לרפואה ע"ש סאקלר‬
‫החוג לביוכימיה קלינית‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים‬
‫דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חיבור לשם קבלת התואר‬
‫"דוקטור לפילוסופיה "‬
‫מאת‬
‫לוי יוסף‬
‫הוגש לסנאט של אוניברסיטת תל‪-‬אביב‬
‫ספטמבר ‪2005‬‬
‫עבודה זו נעשתה בהדרכת‬
‫פרופ' אלדד מלמד‬
‫וד"ר דניאל אופן‬
‫ברצוני להודות מקרב לב‪,‬‬
‫למנחים ד"ר דני אופן ולפרופ' אלדד מלמד‬
‫על ההדרכה ‪,‬הקניית הידע הרב‪ ,‬והתמיכה לאורך הדרך‬
‫ועל האפשרות להציג עבודה זו בכנסים מקצועיים יוקרתיים ברחבי העולם‬
‫תודה לכל צוות המעבדה בעבר ובהווה‬
‫אינה‪ ,‬אלכס‪ ,‬חנה‪ ,‬חנוך‪ ,‬טלי‪ ,‬יוסי‪ ,‬יעל‪ ,‬מירב‪ ,‬נטע‪,‬יונית‪ ,‬רן ושאר הצוות‪,‬‬
‫שעזרו‪ ,‬ייעצו ועשו את העבודה במעבדה לנעימה במיוחד‬
‫להורי ולסבתי היקרים באהבה ותודה שלא תמיד נאמרה בזמן‪,‬‬
‫על עצותיהם ועידודם ועל תמיכתם במהלך כל למודי‬
‫ואחרונה חביבה‪ ,‬תודה לאשתי טלי‪,‬‬
‫איך אפשר בלעדיה ללא עידודה ואהבתה‪,‬‬
‫איך אפשר בלעדיה ללא עצתה ועזרתה‬
‫לאורם אלך‬
‫סבי‪ ,‬ד"ר יוסף סלמה ז"ל‪ ,‬איש חסד של אמת‬
‫בן דודתי‪ ,‬גד עזרא ז"ל‪ ,‬שנפל על הגנת העם‪ ,‬הארץ והמולדת‬
‫שרה פריד ז"ל‪ ,‬שהייתה לי כסבתא‪ ,‬וראתה עולם בנוי וחרב ובנוי‬
‫"‪...‬כל שהוא נעשה בפעולה טבעית אינו בכלל‬
‫כשפים‪ ,‬אפילו יידע לברוא בריאות יפות שלא‬
‫מזיווג המין‪ ,‬כמו שנודע בספרי הטבע שאין‬
‫הדבר נמנע‪ ,‬רשאים לעשות‪ ,‬שכל שהוא טבעי‪,‬‬
‫אינו בכלל כישוף‪ .‬ודומה לזה אמרו‪ :‬כל שיש בו‬
‫רפואה אינו מדרכי האמורי‪"....‬‬
‫המאירי על הגמרא‪ ,‬סנהדרין סז‪:‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמוי‪ -‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוכן העניינים‬
‫תוכן העניינים‬
‫תקציר‪...........................................................................................‬‬
‫מבוא‪.............................................................................................‬‬
‫‪.1‬‬
‫‪.1.1‬‬
‫‪.1.2‬‬
‫‪.1.3‬‬
‫‪.1.3.1‬‬
‫‪.1.3.2‬‬
‫‪.1.3.3‬‬
‫‪.1.3.4‬‬
‫‪.1.3.5‬‬
‫‪.1.3.6‬‬
‫‪.1.3.7‬‬
‫‪.1.4‬‬
‫‪.1.4.1‬‬
‫‪.1.4.2‬‬
‫‪.1.4.3‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2.1‬‬
‫‪.2.2‬‬
‫‪.2.3‬‬
‫‪.2.4‬‬
‫‪.2.5‬‬
‫‪.3‬‬
‫‪.4‬‬
‫‪.5‬‬
‫‪.5.1‬‬
‫‪.5.1.1‬‬
‫‪.5.2‬‬
‫‪.5.3‬‬
‫‪.5.4‬‬
‫‪.5.5‬‬
‫‪.6‬‬
‫‪.7‬‬
‫‪.8‬‬
‫‪.8.1‬‬
‫‪.8.2‬‬
‫‪.8.2.1‬‬
‫‪.8.3‬‬
‫‪.8.3.1‬‬
‫‪.8.3.1.1‬‬
‫‪.8.3.1.2‬‬
‫‪.8.3.2‬‬
‫‪.8.3.2.1‬‬
‫‪.8.3.2.2‬‬
‫מחלת פרקינסון )‪(Parkinson’s disease‬‬
‫כללי‬
‫פתולוגיה של מחלת פרקינסון‬
‫פתופיזיולוגיה‬
‫גורמים גנטיים‬
‫גורמים סביבתיים‬
‫מעורבות עקה חימצונית במחלה‬
‫מעורבות רעילות המתווכת ע"י גלוטמט‬
‫מעורבות דלקת במחלת פרקינסון‬
‫כשל מיטוכונדריאלי‬
‫כשל בעיבוד חלבונים וסילוקם‬
‫דרכי הטיפול במחלה‬
‫הגישה הסימפטומאטית‬
‫הגישה להגנה על תאי עצב )‪(Neuroprotection‬‬
‫הגישה הכירורגית‬
‫דופאמין‬
‫ייצור )סינתזה( ופירוק דופאמין‬
‫הקולטנים הדופאמינרגים‬
‫טרנספורטרים לדופאמין‬
‫מסלולי דופאמין ייחודיים במוחו של היונק‬
‫גורמים המשפיעים על התפתחותם של תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע‬
‫מתאי גזע לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע עובריים כמקור לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע עובריים‬
‫מקורות לתאי גזע עובריים‬
‫תאי גזע עובריים ממכרסמים כמקור להתמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע עובריים מפרימטים כמקור להתמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע עובריים מביציות שעברו שיבוט או רביית בתולים כמקור להתמיינות לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים‬
‫בעיות בשימוש תאי גזע עובריים להשתלות באדם‬
‫תאי גזע מעובר כמקור לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע מדם חבל טבור אנושי כמקור לתאי עצב‬
‫תאי גזע מבוגר כמקור לתאים דמויי תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע מבוגר‬
‫תאי גזע עצביים במערכת העצבים המרכזית של בוגר‬
‫התמיינות תאי גזע עצביים ממוח הבוגר לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע ממח העצם‬
‫תאים מזנכימלים ממוח העצם )‪(Bone marrow mesenchymal stem cells‬‬
‫התמיינות תאים מזנכימלים ממוח העצם לתאים דמויי תאי‪-‬עצב‬
‫התמיינות תאים מזנכימלים ממוח העצם לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע בוגרים מולטיפוטנטיים )‪Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC‬‬
‫‪ MAPC‬כמקור לתאים דמוי‪-‬עצב דופאמינרגים‬
‫‪ MAPC‬לעומת תאי גזע עובריים‬
‫‪I‬‬
‫עמוד‬
‫א‪-‬ד‬
‫‪1-69‬‬
‫‪1-15‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1-2‬‬
‫‪2-10‬‬
‫‪3-4‬‬
‫‪5-6‬‬
‫‪6-8‬‬
‫‪8‬‬
‫‪8-9‬‬
‫‪9‬‬
‫‪9-10‬‬
‫‪10-15‬‬
‫‪10-12‬‬
‫‪12-13‬‬
‫‪13-15‬‬
‫‪15-23‬‬
‫‪15-16‬‬
‫‪16-17‬‬
‫‪17‬‬
‫‪17-18‬‬
‫‪18-23‬‬
‫‪23-24‬‬
‫‪24-25‬‬
‫‪25-38‬‬
‫‪25-28‬‬
‫‪27-28‬‬
‫‪28-33‬‬
‫‪33-35‬‬
‫‪35-37‬‬
‫‪37-38‬‬
‫‪42-44‬‬
‫‪44-46‬‬
‫‪46-63‬‬
‫‪46-48‬‬
‫‪48-52‬‬
‫‪50-52‬‬
‫‪53-63‬‬
‫‪53-57‬‬
‫‪54-56‬‬
‫‪56-57‬‬
‫‪58-59‬‬
‫‪58-59‬‬
‫‪59‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמוי‪ -‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוכן העניינים‬
‫‪.8.3.3‬‬
‫‪.8.3.3.1‬‬
‫‪.8.3.4‬‬
‫‪.8.3.5‬‬
‫‪.8.3.5.1‬‬
‫‪.9‬‬
‫‪.9.1‬‬
‫‪.9.2‬‬
‫‪.9.3‬‬
‫‪.9.3.1‬‬
‫‪Marrow–isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells‬‬
‫השראת התמיינות תאי ‪ MIAMI‬לתאים דמויי תאי‪-‬עצב‬
‫תאי גזע ‪ Size-Sieved‬ממח עצם אנושי‬
‫התמיינות תאי גזע המטופואטים ממח העצם לתאים דמויי תאי‪-‬עצב‬
‫תאי גזע )‪Side population (SP‬‬
‫שיפור הישרדותם של תאי עצב דופאמינרגים מושתלים‬
‫שיעור הישרדות נמוך של תאי עצב דופאמינרגים מושתלים‬
‫היכן התאים המיועדים להשתלה נפגעים?‬
‫מנגנון ביוכימי הגורם לירידה בהישרדותם של תאים דופאמינרגים מושתלים‬
‫העלאת הישרדותם של תאי עצב דופאמינרגים באמצעות ביטוי ‪BCL-2‬‬
‫מטרות המחקר‪................................................................................‬‬
‫חומרים ושיטות‪...............................................................................‬‬
‫‪.1‬‬
‫‪.1.1‬‬
‫‪.1.2‬‬
‫‪.1.3‬‬
‫‪.1.4‬‬
‫‪.1.5‬‬
‫‪.1.6‬‬
‫‪.1.7‬‬
‫‪.1.8‬‬
‫‪.1.9‬‬
‫‪.1.10‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2.1‬‬
‫‪.2.1.1‬‬
‫‪.2.1.2‬‬
‫‪.2.1.3‬‬
‫‪.2.2‬‬
‫‪.2.2.1‬‬
‫‪.2.2.2‬‬
‫‪.2.3‬‬
‫‪.2.4‬‬
‫‪.2.4.1‬‬
‫‪.2.4.2‬‬
‫‪.2.5‬‬
‫‪.2.5.1‬‬
‫‪.2.5.2‬‬
‫‪.2.6‬‬
‫‪.2.6.1‬‬
‫‪.2.6.2‬‬
‫‪.2.6.2.1‬‬
‫‪.2.6.2.2‬‬
‫‪.2.6.2.3‬‬
‫‪.2.6.2.4‬‬
‫‪.2.6.3‬‬
‫‪.2.7‬‬
‫חומרים‬
‫מצעי גידול‪ ,‬חומרים אנטיביוטים ותוספות לגידול תאים‬
‫תוספות למדיום הגידול עבור התמיינות תאים‬
‫נוגדנים‬
‫צבעים לסימון גרעין‬
‫ערכות )קיטים(‬
‫חומרים אחרים‬
‫ציוד סטרילי לגידול תאים ומבחנות‬
‫מכשור ותוכנות מחשב‬
‫מיקרוסקופים‬
‫שורות תאים‬
‫שיטות‬
‫הפקה וגידול תאים מזנכימליים ממח העצם‬
‫חיות‬
‫בני אדם‬
‫הפקת תאים מזנכימלים והתרבותם‬
‫אפיון תאים מזנכימליים אנושיים ממח העצם‬
‫אפיון באמצעות ‪FACS‬‬
‫מבחן ‪ microtiter plate‬לקליטת ‪Hoechst 33342‬‬
‫מדיום התמיינות של תאים מזנכימלים לתאים דמויי תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבחני חיות תאים‬
‫מבחן ‪ Alamar blue‬עבור ‪ PC12‬ו‪SH-SY5Y-‬‬
‫מבחן ‪Hoechst 33342 / propidium iodide‬‬
‫מבחני חלוקת תאים‬
‫מבחן ‪Thymidine incorporation‬‬
‫מבחן מחזור התא )‪(cell cycle‬‬
‫אנליזה של ביטוי חלבונים‬
‫אימונוציטוכימיה‬
‫‪Western blot‬‬
‫הפקת חלבון ממוח עכבר‬
‫הפקת חלבון מתאים‬
‫קביעת ריכוז חלבון‬
‫הספג אימונולוגי )‪(Western blot‬‬
‫‪Flow-cytometry‬‬
‫מדידת רמת הביטוי הגנטי‬
‫‪II‬‬
‫‪59-60‬‬
‫‪60‬‬
‫‪60‬‬
‫‪61-62‬‬
‫‪62-63‬‬
‫‪66-69‬‬
‫‪66‬‬
‫‪66-67‬‬
‫‪67-69‬‬
‫‪68-69‬‬
‫‪70‬‬
‫‪71-101‬‬
‫‪71-77‬‬
‫‪71‬‬
‫‪71‬‬
‫‪72-73‬‬
‫‪73‬‬
‫‪73-74‬‬
‫‪74-75‬‬
‫‪75‬‬
‫‪75-76‬‬
‫‪76‬‬
‫‪77‬‬
‫‪78-101‬‬
‫‪78-79‬‬
‫‪78‬‬
‫‪78‬‬
‫‪78-79‬‬
‫‪79-80‬‬
‫‪79-80‬‬
‫‪80‬‬
‫‪80-81‬‬
‫‪82‬‬
‫‪82‬‬
‫‪82‬‬
‫‪82-83‬‬
‫‪82‬‬
‫‪83‬‬
‫‪84-85‬‬
‫‪84‬‬
‫‪84-85‬‬
‫‪84‬‬
‫‪84‬‬
‫‪85‬‬
‫‪85‬‬
‫‪85‬‬
‫‪86-95‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמוי‪ -‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוכן העניינים‬
‫‪.2.7.1‬‬
‫‪.2.7.2‬‬
‫‪.2.7.3‬‬
‫‪.2.7.4‬‬
‫‪.2.7.4.1‬‬
‫‪.2.7.4.2‬‬
‫‪.2.7.4.3‬‬
‫‪.2.7.5‬‬
‫‪.2.7.6‬‬
‫‪.2.7.7‬‬
‫‪.2.7.7.1‬‬
‫‪.2.7.7.2‬‬
‫‪.2.8‬‬
‫‪.2.9‬‬
‫‪.2.10‬‬
‫‪.2.11‬‬
‫‪.2.11.1‬‬
‫‪.2.11.2‬‬
‫‪.2.11.3‬‬
‫‪.2.12‬‬
‫‪.1‬‬
‫‪.1.1‬‬
‫‪.1.2‬‬
‫‪.1.3‬‬
‫‪.1.4‬‬
‫‪.1.5‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.3‬‬
‫‪.4‬‬
‫‪.4.1‬‬
‫‪.4.2‬‬
‫‪.5‬‬
‫‪.5.1‬‬
‫‪.5.2‬‬
‫‪.5.3‬‬
‫‪.5.4‬‬
‫‪.5.4.1‬‬
‫‪.5.4.2‬‬
‫‪.5.5‬‬
‫‪.5.6‬‬
‫מיצוי ‪Total cellular RNA‬‬
‫ניקוי ‪ RNA‬בעזרת ‪DNase I‬‬
‫העתקת ‪ mRNA‬ל‪(Reverse transcriptase, RT) cDNA -‬‬
‫אנליזה כמותית של ‪Northern blot - mRNA‬‬
‫הרצת ‪ RNA‬בג'ל והעברתו לממברנה‬
‫הכנה וסימון גלאי ‪(DNA (probe‬‬
‫היברידיזצית ‪RNA‬‬
‫)‪Polymerase Chain Reaction (PCR‬‬
‫שיטה כמותית למדידת ביטוי גנטי בעזרת ‪PCR Real-time‬‬
‫מעקב אחרי גורמי שעתוק )‪(transcription factors‬‬
‫‪protein/DNA array analysis‬‬
‫)‪electrophoretic mobility gel-shift assay (EMSA‬‬
‫‪86‬‬
‫‪86-87‬‬
‫‪87‬‬
‫‪87-90‬‬
‫‪88‬‬
‫‪88-89‬‬
‫‪89-90‬‬
‫‪90-93‬‬
‫‪93-94‬‬
‫‪94-95‬‬
‫‪94-95‬‬
‫‪95‬‬
‫מעקב אחר הפרשת דופאמין באמצאות ‪HPLC‬‬
‫בדיקת רמות סידן תוך תאיות‬
‫מדידות אלקטרופיסיולוגיות )‪(Whole-cell patch clamp recording‬‬
‫‪95-97‬‬
‫‪97‬‬
‫‪97-98‬‬
‫השתלת תאים מזנכימליים בחיות מודל למחלת פרקינסון‬
‫בעלי חיים‬
‫מודל לפרקינסון בחולדות‬
‫מודל לפרקינסון בעכברים‬
‫סטטיסטיקה‬
‫‪98-100‬‬
‫‪98‬‬
‫‪98-99‬‬
‫‪99-100‬‬
‫‪101‬‬
‫תוצאות‪............................................................................................‬‬
‫‪102-153‬‬
‫השראת התמיינותם של תאי גזע ממח העצם‪ ,‬בעכבר טרנסגני המבטא ביתר את הגן ההומני‬
‫ל‪ Bcl-2‬תחת הפרומוטר ‪ ,neuron specific enolase‬לתאים דמויי‪-‬תאי עצב‬
‫הפקת תאי סטרומה ממח עצם של עכבר‬
‫השראת התמיינות תאי מח עצם ממקור עכברי לתאים דמויי תאי עצב‬
‫ביטוי ‪ Bcl-2‬בתאי מח עצם מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב‬
‫ביטוי ‪ Neu-N‬בתאי אב של עכברים טרנסגנים וזן הבר שעברו התמיינות לתאים דמויי‬
‫תאי עצב‬
‫‪ 1.5‬תאים מזנכימלים מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב עמידים לעקה‬
‫שינוי ב‪ cell cycle-‬בעקבות השראת התמיינותם של תאי גזע ממח העצם לתאים דמויי‪-‬‬
‫תאי עצב‬
‫הפקת תאי סטרומה ממח עצם אנושי‬
‫אפיון תאי מח עצם אנושי‬
‫אפיון סמנים ממברנליים באמצעות ‪FACS‬‬
‫קליטה נמוכה של ‪ Hoechst 33342‬ע"י תאים מזנכימליים‬
‫השראת התמיינות של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי לתאים דמויי תאי עצב‬
‫שינוי צורני )מורפולוגי( של תאים מזנכימליים לתאים דמויי תאי עצב‬
‫הפסקת חלוקת תאים מזנכימליים אנושיים בעקבות השראת התמיינות‬
‫תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שנחשפו למדיום התמיינות עצבי מבטאים תעתיקי‬
‫‪ RNA‬ייחודיים לתאי עצב‬
‫שינוי בפרופיל גורמי שעתוק בעקבות השראת התמיינות עצבית‬
‫המצאות גורמי שעתוק עצביים בתאים שלא עברו התמיינות‬
‫השוואה בין תאים שעברו התמיינות לבין תאים שלא עברו התמיינות‬
‫תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שנחשפו למדיום התמיינות עצבי מבטאים חלבונים‬
‫ייחודיים לתאי עצב‬
‫השראת התמיינות ארוכת טווח של תאים מזנכימליים ממקור אנושי לתאים דמויי תאי עצב‬
‫‪102-107‬‬
‫‪III‬‬
‫‪102-103‬‬
‫‪103-104‬‬
‫‪104-106‬‬
‫‪104-106‬‬
‫‪107‬‬
‫‪108-109‬‬
‫‪110‬‬
‫‪110-116‬‬
‫‪110-115‬‬
‫‪115-116‬‬
‫‪117-137‬‬
‫‪117-118‬‬
‫‪118-119‬‬
‫‪119-122‬‬
‫‪123-128‬‬
‫‪124-125‬‬
‫‪125-128‬‬
‫‪129-134‬‬
‫‪134-135‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמוי‪ -‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוכן העניינים‬
‫‪.5.7‬‬
‫‪.6‬‬
‫‪.6.1‬‬
‫‪.6.1.1‬‬
‫‪.6.1.2‬‬
‫‪.6.1.3‬‬
‫‪.6.1.4‬‬
‫‪.6.2‬‬
‫‪.6.3‬‬
‫‪.6.4‬‬
‫‪.6.4.1‬‬
‫‪.6.4.2‬‬
‫‪.6.4.3‬‬
‫‪.7‬‬
‫‪.8‬‬
‫‪.9‬‬
‫‪.9.1‬‬
‫‪.9.2‬‬
‫‪.1‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.2.1‬‬
‫‪.2.1.1‬‬
‫‪.2.1.1.1‬‬
‫‪.2.1.2‬‬
‫‪.2.2‬‬
‫‪.2.3‬‬
‫‪.2.4‬‬
‫‪.3‬‬
‫‪.3.1‬‬
‫‪.3.2‬‬
‫‪.3.3‬‬
‫‪.3.4‬‬
‫‪.4‬‬
‫‪.5‬‬
‫‪.5.1‬‬
‫‪.5.2‬‬
‫‪.5.3‬‬
‫‪.5.4‬‬
‫‪.5.5‬‬
‫‪.6‬‬
‫‪.6.1‬‬
‫‪.6.2‬‬
‫‪.6.2.1‬‬
‫‪.6.2.2‬‬
‫‪.6.2.3‬‬
‫הוספת חומצת שומן רב‪-‬בלתי רוויות למדיום ההתמיינות‬
‫התמיינות תאים מזנכימליים אנושיים לתאים דופאמינרגים‬
‫ביטוי ‪ tyrosine hydroxylase‬בתאים מזנכימליים אנושיים שעברו התמיינות לתאי עצב‬
‫‪Real-time PCR‬‬
‫‪Western Blot‬‬
‫צביעות אימונוציטוכימיות‬
‫‪Flow-cytometry‬‬
‫התבטאות תעתיקי ‪ RNA‬ייחודיים לתאי עצב דופמינרגיים בעקבות חשיפה למדיום‬
‫ההתמיינות‬
‫ביטוי ‪ Vesicular monoamine transporter 2‬בתאים שעברו התמיינות‬
‫חשיפת תאים מזנכימליים למדיום התמיינות דופאמינרגי הביאה ליצירת והפרשת‬
‫דופאמין‬
‫ייצור והפרשת ‪DOPA‬‬
‫ייצור והפרשת ‪DOPAC‬‬
‫ייצור והפרשת דופאמין‬
‫התמיינות תאים מזנכימליים אנושיים לתאים עם סמנים סרוטונרגיים‬
‫תאים מזנכימליים שהתמיינו לתאים דמוי תאי עצב מציגים פרמטרים אלקטרופיסיולוגיים‬
‫המאפיינים תאי עצב‬
‫השפעת השתלת תאים מזנכימליים במודלים למחלת פרקינסון‬
‫השפעת השתלת תאים מזנכימליים במודל למחלת הפרקינסון בחולדות‬
‫השפעת השתלת תאים מזנכימליים במודל למחלת הפרקינסון בעכברים‬
‫‪150-153‬‬
‫‪150-151‬‬
‫‪152-153‬‬
‫דיון‪.................................................................................................‬‬
‫‪154-192‬‬
‫אפיון תאים מזנכימליים ממח עצם‬
‫התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תאי עצב‬
‫תנאים להשראת התמיינות‬
‫שלב ראשון בהתמיינות‬
‫הוספת חומצות שומן רב‪-‬בלתי רוויות‬
‫שלב שני בהתמיינות‬
‫מנגנון פעולה מולקולרי של התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תא עצב‬
‫ביטוי סמנים עצביים בתאים שעברו התמיינות‬
‫השפעת התמיינות על מדדים אלקטרופיסיולוגיים‬
‫התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דופאמינרגים‬
‫ביטוי סמנים דופאמינרגיים בתאים שעברו התמיינות‬
‫הפרשת דופאמין ע"י תאים מזנכימליים שעברו התמיינות‬
‫השפעת השתלת תאים מזנכימליים שעברו התמיינות במודלים למחלת פרקינסון‬
‫התמיינות לתאים סרוטונרגים )‪(serotonergic cells‬‬
‫המצאות סמנים עצביים בתאים מזנכימליים נאיביים‬
‫מנגנונים אפשריים לפלסטיסיות של תאי גזע בוגרים ממח העצם‬
‫קיום תאי גזע פרימיטיביים ברקמה הבוגרת‬
‫קיומם של תאי גזע רבים‪ ,‬שמקורם בשכבות נבט עובריות שונות‬
‫התמיינות ישירה ועקיפה )‪(dedifferentiation‬‬
‫התמיינות "במהופך" )‪(transdifferntiation‬‬
‫איחוי תאים )‪(Fusion‬‬
‫השימוש בתאי גזע למטרות מחקר וריפוי ‪ -‬היבטים אתיים והלכתיים‬
‫פוטנציאל העובר‬
‫השקפות דתיות ואתיות בנוגע לשימוש בתאי גזע עובריים לצורכי מחקר וריפוי רפואי‬
‫השקפות נוצריות‬
‫השקפות מוסלמיות‬
‫השקפות יהודיות‬
‫‪154-157‬‬
‫‪157-167‬‬
‫‪157-161‬‬
‫‪157-159‬‬
‫‪158-159‬‬
‫‪159-160‬‬
‫‪161-163‬‬
‫‪164-165‬‬
‫‪166-167‬‬
‫‪167-173‬‬
‫‪167‬‬
‫‪168-169‬‬
‫‪169-171‬‬
‫‪172-173‬‬
‫‪174-181‬‬
‫‪182-185‬‬
‫‪182‬‬
‫‪182-183‬‬
‫‪183‬‬
‫‪184‬‬
‫‪185‬‬
‫‪186-188‬‬
‫‪186‬‬
‫‪187‬‬
‫‪187‬‬
‫‪187‬‬
‫‪187-188‬‬
‫‪IV‬‬
‫‪136-137‬‬
‫‪138-145‬‬
‫‪138-140‬‬
‫‪138‬‬
‫‪139‬‬
‫‪139‬‬
‫‪140‬‬
‫‪140-142‬‬
‫‪143‬‬
‫‪143-145‬‬
‫‪144‬‬
‫‪144-145‬‬
‫‪145‬‬
‫‪146-147‬‬
‫‪148-149‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמוי‪ -‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוכן העניינים‬
‫השקפת אתיקאנים חילוניים‬
‫‪.6.2.4‬‬
‫‪ .7‬השימוש בתאי גזע למטרות ריפוי ‪ -‬תהליכים פוליטיים‪ ,‬תקשורתיים וחקיקתיים‬
‫‪ .8‬גישות עתידיות‬
‫‪188‬‬
‫‪189-190‬‬
‫‪190-192‬‬
‫רשימת ספרות‪...................................................................................‬‬
‫‪193-240‬‬
‫אישורי ועדות הלסינקי‪........................................................................‬‬
‫‪241-245‬‬
‫‪……………………………………….....…………………… Abstract‬‬
‫‪A-D‬‬
‫‪V‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫רשימת תרשימים ותמונות‬
‫רשימת תרשימים ותמונות‬
‫מספר‬
‫תמונה‬
‫‪1‬‬
‫‪2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫‪5‬‬
‫‪6‬‬
‫‪7‬‬
‫‪8‬‬
‫‪9‬‬
‫‪10‬‬
‫‪11‬‬
‫‪12‬‬
‫‪13‬‬
‫‪14‬‬
‫‪15‬‬
‫‪16‬‬
‫‪17‬‬
‫‪18‬‬
‫‪19‬‬
‫‪20‬‬
‫‪21‬‬
‫‪22‬‬
‫‪23‬‬
‫‪24‬‬
‫‪25‬‬
‫‪26‬‬
‫‪27‬‬
‫‪28‬‬
‫‪29‬‬
‫‪30‬‬
‫‪31‬‬
‫‪32‬‬
‫‪33‬‬
‫‪34‬‬
‫‪35‬‬
‫‪36‬‬
‫‪37‬‬
‫‪38‬‬
‫‪39‬‬
‫‪40‬‬
‫‪41‬‬
‫‪42‬‬
‫עמוד‬
‫שלבים בייצור ובפירוק דופאמין‬
‫תעלות וקולטנים לדופאמין‬
‫התפתחות תאי עצב דופאמינרגים במע"מ בימים ‪ E8‬ו‪ E9 -‬בעכברים‬
‫מועד הופעתם של גנים עצביים דופאמינרגים במוח התיכון בעכבר ותוצאות ‪ knock–out‬של‬
‫גורמי שיעתוק מרכזיים‬
‫גורמי שיעתוק וגדילה המשפעים על התפתחות תאי עצב דופאמינרגים‬
‫הפקת תאי גזע עובריים אנושיים‬
‫השיטות השונות להתמיינות תאי גזע עובריים לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫שיבוט למטרות ריפוי‬
‫סיכום ניסויים קליניים בהשתלת תאים מעוברים לחולי פרקינסון‬
‫תאי גזע עצביים במוח אנושי בוגר‬
‫פוטנציאל ההתמיינות של תאים מזנכימלים ממח העצם‬
‫מנגנונים המעורבים בהישרדותם הנמוכה של תאים דופאמינרגים המושתלים במוח‬
‫תאי סטרומה ממח עצם של עכברים‬
‫בדיקת ‪ Western blot‬עבור החלבון ההומני ‪ BCL-2‬והחלבון העכברי ‪NeuN‬‬
‫התמיינות תאי מח עצם מעכבר טרנסגני בוגר לתאי עצב‬
‫ביטוי של החלבון ההומני ‪ Bcl-2‬בתאי סטרומה ממח עצם של עכברים טרנסגנים שעברו‬
‫התמיינות לתאי עצב‪.‬‬
‫בדיקות אימונוציטוכימיות ל‪ Bcl-2-‬בתאי מוח עצם מעכברים מזן הבר‬
‫‪ Neu-N‬מתבטא בתאי מחוח עצם מעכברים שעברו התמיינות לתאי עצב‪.‬‬
‫עלייה ברמות הביטוי של ‪ Bcl-2‬ו‪ NeuN -‬בתאי מח העצם מעכברים טרנסגים שעברו התמיינות‬
‫לתאי עצב‬
‫תאים מזנכימלים מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב עמידים יותר לעקה מאשר‬
‫תאים מעכברים מזן הבר‬
‫תאי גזע ממח העצם של עכבר טרנסגני ל‪ EGFP-‬מתמיינים לתאים דמויי תאי עצב‬
‫תאי סטרומה ממח עצם אנושי‬
‫אפיון תאי מח עצם‪ ,‬גודל וגרגור‬
‫מעקב אחר הופעת אנטיגנים על פני דופן תאי מח עצם אנושיים‬
‫השוואת הימצאותם של סמנים ייחודיים על פני דופן התאים מייד לאחר הפקת ממח העצם‬
‫)‪ (mononuclear‬לעומת התאים שגדלו שלשה שבועות בתרבית )‪(mesenchymal stem cells‬‬
‫מבחן ‪ microtiter plate‬לקליטת ‪ .Hoechst 33342‬מבחן קליטת הצבע‬
‫‪From fibroblast like cells to neuron-like cells‬‬
‫חלוקה של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי במהלך הדגרתם עם מדיום התמיינות‬
‫‪ PCR‬לסמנים עצביים‬
‫השפעת התמיינות עצבית של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי על רמות ‪.NEGF2‬‬
‫השפעת התמיינות עצבית של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי על רמות ‪ NSE‬ו‪NF-200-‬‬
‫‪ 11‬גורמי שעתוק עצביים בתאים מזנכימלים שלא עברו התמיינות‬
‫שינו ברמות גורמי שעתוק בתאים מזנכימליים בעקבות התמיינות עצבית‬
‫צילום של ‪ protein/DNA array‬ותוצאות ‪ EMSA‬עבור ‪ GAG‬ו‪FKHR-‬‬
‫תאים מזנכימליים אנושיים שעברו התמיינות עצבית מבטאים חלבונים ייחודיים לתאי עצב לא‬
‫בשלים‬
‫תאים מזנכימליים אנושיים שעברו התמיינות עצבית מבטאים חלבונים ייחודיים לתאי עצב‬
‫בשלים‪.‬‬
‫תאים מזנכימליים שעברו התמיינות עצבית מבטאים ‪α-synuclein‬‬
‫מבחן ביטוי חלבונים בעזרת ‪ Western blot‬בתאים מזנכימלים שעברו התמיינות‬
‫זיהוי סמנים עצביים בתאים מזנכימליים שעברו התמיינות בעזרת ‪.FCAS‬‬
‫שינוי מורפולוגי בהתמיינות ארוכת טווח‬
‫תאים מזנכימליים מבטאים סמנים ייחודיים לתאי עצב לאחר ‪ 28‬ימי התמיינות‬
‫הוספת ‪ DHA‬ל"מדיום התמיינות ‪ "I‬הביאה להתפתחות מרובה של "דליות" לאורך שלוחות‬
‫התאים שהתמיינות לתאים דמויי תאי עצב‬
‫‪VI‬‬
‫‪15‬‬
‫‪17‬‬
‫‪19‬‬
‫‪20‬‬
‫‪23‬‬
‫‪26‬‬
‫‪30‬‬
‫‪35‬‬
‫‪43‬‬
‫‪48‬‬
‫‪53‬‬
‫‪68‬‬
‫‪102‬‬
‫‪103‬‬
‫‪104‬‬
‫‪105‬‬
‫‪105‬‬
‫‪106‬‬
‫‪106‬‬
‫‪107‬‬
‫‪109‬‬
‫‪110‬‬
‫‪111‬‬
‫‪112-114‬‬
‫‪115‬‬
‫‪116‬‬
‫‪118‬‬
‫‪119‬‬
‫‪121‬‬
‫‪122‬‬
‫‪122‬‬
‫‪126‬‬
‫‪126‬‬
‫‪128‬‬
‫‪130‬‬
‫‪131‬‬
‫‪132‬‬
‫‪133‬‬
‫‪134‬‬
‫‪135‬‬
‫‪135‬‬
‫‪136‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫רשימת תרשימים ותמונות‬
‫‪43‬‬
‫‪44‬‬
‫‪45‬‬
‫‪46‬‬
‫‪47‬‬
‫‪48‬‬
‫‪49‬‬
‫‪50‬‬
‫‪51‬‬
‫‪52‬‬
‫‪53‬‬
‫‪54‬‬
‫‪55‬‬
‫‪56‬‬
‫‪57‬‬
‫‪58‬‬
‫‪59‬‬
‫‪60‬‬
‫‪61‬‬
‫‪62‬‬
‫‪ DHA‬מעלה את רמות הביטוי של ‪TH‬‬
‫רמות ‪ mRNA‬של ‪ TH‬עולות במהלך התמיינות עצבית‬
‫רמות חלבון ‪ TH‬עולות במהלך התמיינות עצבית‬
‫תאים מזנכימליים מבטאים ‪ TH‬בעקבות התמיינות עצבית‬
‫רמות ביטוי ‪ TH‬עולות בעקבות התמיינות עצבית )‪(FACS‬‬
‫תאים מזנכימליים שעברו התמיינות מבטאים תעתיקים עבור המנגנון של תאים דופאמנירגים‬
‫הימצאות ‪ VMAT2‬בתאים שעברו התמיינות‬
‫עלייה בהפרשת רמות ‪ DOPA‬בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות עצבית‬
‫עלייה בהפרשת רמות ‪ DOPAC‬בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות עצבית‬
‫הפרשת דופאמין בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות עצבית‬
‫תאים מזנכימליים שעברו התמיינות מבטאים סמנים לתאים סרוטונרגיים‬
‫קביעת רצף עבור ‪TPH‬‬
‫עליית ריכוזי סידן תוך תאי בעקבות דפולריזציה בתאים מזמכימליים שעברו התמיינות לתאי‬
‫עצב במשך ‪ 5‬ימים‬
‫מדידת זרם בעקבות הטענת הממברנה של תאים מזנכימליים שעברו התמיינות במשך ‪ 48‬שעות‬
‫אקסטביליות )‪ (excitability‬של ממברנת תאים מזנכימליים שעברו התמיינות במשך ‪ 48‬שעות‬
‫השתלת תאים מזנכימליים לחולדת מודל למחלת פרקינסון‬
‫השתלת תאים מזנכימליים לעכברי מודל למחלת פרקינסון‬
‫חומצות שומן חיוניות לתאי עצב‬
‫מנגנון פעולה מולקולרי )משוער( של התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תא עצב‬
‫מנגנונים אפשריים לפלסטיסיות של תאי גזע בוגרים )דיאגרמה סכמתית(‬
‫‪VII‬‬
‫‪137‬‬
‫‪138‬‬
‫‪139‬‬
‫‪139‬‬
‫‪140‬‬
‫‪142‬‬
‫‪143‬‬
‫‪144‬‬
‫‪145‬‬
‫‪145‬‬
‫‪146‬‬
‫‪147‬‬
‫‪148‬‬
‫‪149‬‬
‫‪149‬‬
‫‪150-151‬‬
‫‪153‬‬
‫‪159‬‬
‫‪163‬‬
‫‪183‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫רשימת טבלאות‬
‫רשימת טבלאות‬
‫עמוד‬
‫טבלה מס'‬
‫‪1‬‬
‫טיפולים נוכחיים לשליטה בסימפטומים של חולי פרקינסון‬
‫‪11‬‬
‫‪2‬‬
‫השתלות תאים בוגרים לא עצביים במחלת פרקינסון‬
‫‪14‬‬
‫‪3‬‬
‫מקורות שונים לתאי גזע באדם‬
‫‪24‬‬
‫‪4‬‬
‫התמיינות בתרבית )‪ (in-vitro‬של תאי גזע עובריים לתאי עצב דופאמנירגיים‬
‫‪39-41‬‬
‫‪5‬‬
‫התמיינות תאי גזע לתאי עצב לאחר השתלתם במודלים של מחלת פרקינסון‬
‫‪64-65‬‬
‫‪6‬‬
‫אנטיגנים על פני דופן התא שנבדקו בתאים שהופקו ממח עצם אנושי‬
‫‪111‬‬
‫‪7‬‬
‫סמנים שנעשה בהם שימוש לעקוב אחר השינויים בביטוי הגנטי והחלבוני‬
‫‪119-120‬‬
‫‪8‬‬
‫גורמי שעתוק שהשתנו במהלך התמיינות עצבית‬
‫‪123-124‬‬
‫‪9‬‬
‫ביטוי של ‪ 39‬גורמי שעתוק ע"י תאים מזנכימליים אנושיים "נאיבים" וע"י ‪127-128‬‬
‫תאים מזנכימליים שהודגרו במדיום התמיינות עצבית למשך ‪ 24-48‬שעות‬
‫‪10‬‬
‫סמנים לתאים דופאמנירגיים‬
‫‪140-141‬‬
‫‪11‬‬
‫אפיון תאים מזנכימליים באמצעות ‪Flow-cytometry‬‬
‫‪155‬‬
‫‪12‬‬
‫סיכום החומרים שנעשה בהם שימוש להתמיינות תאים מזנכימליים לתאי‬
‫עצב דופאמינרגים‬
‫‪161‬‬
‫‪13‬‬
‫סמנים עצביים ודופאמינרגים שאותרו בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות‬
‫‪165‬‬
‫‪14‬‬
‫‪170-171 In-vitro differentiation of adult stem cells to dopaminergic neural‬‬
‫‪lineag‬‬
‫‪15‬‬
‫סיכום של מאמרים שונים המתארים ביטוי של סמנים עצביים ע"י תאים ‪176-177‬‬
‫מזנכימליים‬
‫‪16‬‬
‫התבטאות סמנים עצביים בתאים מזנכימליים נאיביים‬
‫‪178-179‬‬
‫‪17‬‬
‫קוים מנחים לשימוש בתאי גזע למחלת פרקינסון‬
‫‪191‬‬
‫‪VIII‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת קיצורים‬
‫רשימת קיצורים‬
Initials list
‫כללי‬
5HIAA-
5-hydroxyindoleacetic acid
6-OHDA-
6-hydroxydopamine
‫מע"מ‬-
‫מערכת עצבים מרכזית‬
A
AA-
Arachiodonic acid
AADC-
Aromatic L-amino acid decarboxylase
AC-
Adenylate cyclase
AChE-
Acetylcholine esterase
AhR/Arnt-
Aryl hydrocarbon receptor/aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator binding
element
Aldh1 /AHD2-Aldehyde dehydrogenase1
Aldh1a1-
Aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1
APS-
Ammonium persulfate
ATP-
Adenosine triphophate
B
bFGF/FGF2- Basic fibroblast growth factor
BBB-
Blood brain barrier
BDNF-
Brain-derived growth factor
BH4-
Tetrahydrobiopterin
BHA-
Butylated hydroxyanisole
bHLH-
Basic-helix-loop-helix
βME-
β-mercaptoethanol
BMP-
Bone morphogenetic factor
BMPR1B-
BMP receptor 1B
BMSc-
Bone marrow stromal cells
BrdU-
Bromodeoxyuridine
BSA-
Bovine serum albumin
C
cAMP-
Cyclic adenosine monophosphate
CEF-1-
Cardiac enhancer factor-1
CEF-2-
Cardiac enhancer factor-2
IX
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת קיצורים‬
ChAT-
Choline acetyltransferase
CNTF-
Ciliary neurotrophic factor
CNPase-
2'3'-Cyclic Nucleotide 3'-Phosphohydrolase
COMT-
Catechol-O-methyltransferase
CRABP-
Cellular RA-binding proteins
D
D2R-
Dopamine receptor 2
DA-
Dopamine
DAPI-
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride
DAT-
Dopamine transporter
DβH-
Dopamine β-hydroxylase
dbcAMP-
Dibutyryl cyclic AMP
DBS-
Deep brain stimulation
DG-
Dentate gyrus
DHA-
Docosahexaenoic acid
DHBA-
3.4 Dihydroxybenzylamine
DMEM-
Dulbecco's modified eagle medium
DOPAC-
Dihydroxyphenylacetic acid
DMSO-
Dimethyl sulfoxide
DTT-
Dithiothreitol
E
EB-
Embryoid body
EDTA-
Ethyleneediamine
EGF-
Epidermal growth factor
EGFP-
Enhanced green fluorescent protein
EMSA-
Electrophoretic mobility gel-shift assay
En1-
Engrailed1
En2-
Engrailed 2
EPI-
Epinephrine / adrenaline
ES-
Embryonic stem cells
EtBr-
Ethidium bromide
EVI-1-
Ecotropic viral integration site 1
X
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת קיצורים‬
F
FACS-
Fluorescence-activated cell sorting
FBS-
Fetal bovine serum
FCS-
Fetal calf serum
Fe2+-
Ferric iron
FGF8-
Fibroblast growth factor 8
FGF20-
Fibroblast growth factor 20
FITC-
Fluorescein isothiocyanate
FKHR-
Forkhead box O1
FPD-
Familial Parkinson’s disease
G
GABA-
γ-aminobutyric acid
GAD-
Glutamate decarboxylase
GalC-
Galactocerebroside
GAP43-
Growth-associated protein
GAPDH-
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
GAS-
Gamma-interferon activation site
GATA-1-
GATA binding globin transcription factor 1
Gbx2-
Gastrulation brain homeo box 2
GDNF-
Glial-cell-line-derived neurotrophic factor
Gfi-1-
Growth factor independent 1
GFAP-
Glial acidic fibrillary protein
GFP-
Green fluorescence protein
Glu-
Glutamate
GluT-
Glutamate transporter
GMEM-
Glasgow minimum essential media
GS-
Goat serum
GSH-
Gamma-glutamylcysteineyglycine reduced glutathione
GTPCH-
GTP cyclohydrolase I
H
H2O2-
Hydrogen peroxide
HAS-
HIF-1 ancillary sequence
HBS-
HIF-1 binding site
XI
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת קיצורים‬
HBSS-
Hank’s balanced salt solution
HCl-
Hydrochloric acid
HNF-3β-
Hepatocyte nuclear factor 3β
HPLC-
High performance liquid chromatography
HRP-
Horseradish-peroxidase
HS-
Horse serum
HSCs-
Hematopoietic stem cells
HVA-
Homovanillic acid
I
IBMX-
3-isobutyl-1-methyl-xanthine
IL-1, 3, 6-
Interleukin-1 or 3 or 6
IRF-1/2-
Interferon regulatory factor 1/2 binding element
K
KCl-
Potassium Chloride
L
L-DOPA-
L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (Levodopa, DOPA)
LA-
Linoleic acid
LB-
Lewy bodies
LID-
Levodopa induced dyskinesia
LIF-
Leukemia inhibitory factor
Lmx1b-
LIM homeobox transcription factor 1 beta
LnA-
Alpha-linolenic acid
M
MAO-
Monoamine oxidase
MAO-B-
Monoamineoxidase B
MAP2-
Microtubule-associated protein 2
MAPC-
Multipotent adult progenitor cells
MBP-
Myelin basic protein
MDR-
Multidrug resistance protein
MEF-2(2)-
Mocyte enhancer binding factor 2C
MEM-Alpha- Minimum Essential Medium Eagle, Alpha
MHC-
Major histocompatibility complex
MIAMI-
Marrow–isolated adult multilineage inducible
XII
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת קיצורים‬
MPDP++
1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridinium
MPP -
1-methyl-4-phenylpyridinium ion
MPTP-
1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine
mRNA-
Messenger ribonucleic acid
MSCs-
Mesenchymal stem cells
MT-
Movement time
MZF-1-
Myeloid-specific retinoic acid- responsive zinc finger
N
NaCl-
Sodium Chloride
NCAM-
Neural cell adhesion molecule
NE-
Norepinephrine
NEGF2-
Neurite growth-promoting factor 2
Neu5Gc-
N-glycolylneuraminic acid
NeuN-
Neuronal nuclei
Neurog 1/2-
Neurogenin 1/2
NF-H / 200-
Neurofilament heavy (200 kDa)
NF-L / 70-
Neurofilament light (70 kDa)
NF-M / 160- Neurofilament medium (160 kDa)
NF-Y-
Nuclear Y box factor
NG2-
Chondroitin sulfate proteoglycan
NGF-
Nerve growth factor
NICD-
Notch intracellular domain
NIH-
National Institutes of Health
NMDA-
N-methyl-D-aspartate
NOS-
nitric-oxide synthase
NSCs-
Neuronal stem cells
NSE-
Neuron specific enolase
NT-
Neurotransmitter
NT 3 / 4-
Neurotrophin-3/4
NTFs-
Neurotrophic factors
NTRK3-
Neurotrophic tyrosine kinase receptor 3
Nurr1-
Nuclear receptor related-1
NZF-3-
Neural zinc finger factor 3
XIII
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת קיצורים‬
O
Otx2-
Orthodenticle homolog 2
P
Pax 2-
Paired box gene 2
Pax 3-
Paired box gene 3
Pax 5-
Paired box gene 5
Pax 6-
Paired box gene 6
PBS-
Phosphate buffer saline
PD-
Parkinson’s disease
PDGF-
Platelet-derived growth factor
PE-
Phycoerythrin
PerCP-
Peridinin-Chlorophyll-protein
PET-
Positron emission tomography
PI-
Propidium iodide
Pitx3 / Ptx3- Pituitary homeobox 3 (homeobox protein PITX3)
PKA-
Protein kinase A
PMSF-
Phenylmethylsulfonyl fluoride
PS-
Phosphatidylserine
PSN-
Penicillin/streptomycin/nystatin
PTCH-
Patched 1
PUFA-
Polyunsaturated fatty acids
PVDF-
Polyvinylidene difluoride
R
RA-
Retinoic acid
RA-R
Retinoic acid receptor
RXR-
Retinoid X receptor
RNA-
Ribonucleic acid
ROS-
Reactive oxygen species
RRF-
Retrorubral field
RT-
Reverse transcriptase
S
SDIA-
Stromal derived inducing activity, SDIA
SDS-
Sodium dodecyl sulphate
XIV
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת קיצורים‬
SDS-PAGE- Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
Ser-
Serine
Shh-
Sonic hedgehog
SMO-
Smoothened
SNpc-
Substantia nigra pars compacta
SOS-
Sodium octyl sulfate
SP-
Side population
SSDNA-
Salmon sperm DNA
STR-
Striatum
SVZ-
Subventricular zone
T
TaClo-
1-trichloromethyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline
TBS-T-
Tris-buffered saline Tween
TE-
Tris-EDTA
TFs-
Transcription factors
TGF-α or β3- Transforming growth factor-α or β3
TH-
Tyrosine hydroxylase
TNFα -
Tumor necrosis factor-α
TPH-
Tryptophan hydroxylase
Trk A, B(2), C- Tyrosine kinase receptor A, B(2), C
U
Ub-
Ubiquitine
UPDRS-
Unified Parkinson’s disease rating scale
UPS-
Ubiquitin-proteasome system
V
VHL-
von Hippel-Lindau
VM-
Ventral mesencephalic
VMAT2-
Vesicular monoamine transporter 2
VTA-
Ventral tegmental area
W
Wnt1-
Wingless-type MMTV integration site family, member 1
X
XRE-
Xenobiotic response element
XV
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תקציר‬
‫תקציר‬
‫מחלת פרקינסון הינה הפרעה עצבית המאופיינת קלינית על ידי רעד במנוחה‪ ,‬קישיון‪ ,‬חוסר תנועה‪ ,‬קשיי הליכה‬
‫והפרעות ביציבות‪ .‬הסימפטומים מופיעים לאחר שכ‪ 60%-‬מתאי העצב הדופאמינרגים מתנוונים ב‪Substantia -‬‬
‫‪ ,(SNpc) nigra pars compacta‬ודופאמין אינו מגיע לאתר המטרה )סטריאטום( בכמויות מספיקות ובאופן‬
‫מבוקר‪ .‬כיום קיימות בקליניקה מספר גישות טיפוליות למחלה‪ .‬המאפיין טיפולים אלו שהם מתמקדים בעיקר‬
‫בהקלה על הסימפטומים המאפיינים את המחלה אבל אין בכוחם לתקן את הנזק שנגרם לתאים הדופאמינרגים‬
‫ב‪ .SNpc -‬בנוסף‪,‬לא קיימת אפשרות לעצור את התדרדרות המחלה ולשמור על תאי העצב מפני התנוונות‪ .‬הטיפול‬
‫המקובל כיום בחולי פרקינסון הנו טיפול תרופתי הכולל תכשירי ‪ ,L-DOPA‬אגוניסטים לרצפטורים דופאמינרגים‬
‫ומעכבי האנזימים המפרקים דופאמין‪ .‬חולים רבים ‪,‬שבהתחלת המחלה מגיבים לטיפול ‪ ,L-DOPA‬מפסיקים‬
‫להגיב עם התקדמות המחלה‪ .‬מכיוון שהפתולוגיה של מחלת פרקינסון הינה‪ ,‬לכאורה‪ ,‬די ברורה‪ ,‬כלומר‪ ,‬חוסר‬
‫בדופאמין בסטריאטום‪ ,‬מחקרים רבים בשנים האחרונות מתמקדים בהספקת דופאמין ישירות ל"אתר המטרה"‪.‬‬
‫מזה כעשרים שנה נערכים ניסיונות למציאת אלטרנטיבה טיפולית באמצעות השתלה של תאים דופאמינרגים‬
‫לחולי פרקינסון‪ .‬העיקרון המרכזי בשימוש בתאים כאמצעי ריפוי למחלות עצבים ניווניות הוא החלפת תאי העצב‬
‫שנפגעו בתאים ‪ /‬תאי עצב חדשים שיתפסו את מקומם‪ ,‬הן מבחינת אכלוס האזור הפגוע‪ ,‬והן מבחינה פעילות‬
‫תפקודית‪ .‬ניסיונות שנעשו בחולים‪ ,‬מתחילת שנות התשעים‪ ,‬הראו שתאים מזנצפלים )‪(mesencephalic‬‬
‫מעובריים אנושיים בגיל ‪ 6-8‬שבועות‪ ,‬שהושתלו במוחותיהם של חולי פרקינסון‪ ,‬נקלטו‪ ,‬יצרו והפרישו דופאמין‪.‬‬
‫מעקב אחר התאים הראה את יכולת שרידותם אחרי ההשתלה ב‪ 85%-‬של החולים ואף נמצאו תאים מושתלים‬
‫ששרדו לאחר עשר שנים‪ .‬בעקבות ההשתלה ניכר שיפור בסימנים של מחלה‪ ,‬תגובה טובה יותר לטיפול ב‪L--‬‬
‫‪ DOPA‬ואפילו חוסר הזדקקות לתכשירים תרופתיים‪.‬‬
‫אולם‪ ,‬תוארו שני מחקרים כפולי‪-‬סמיות מבוקרים בהם ההטבה בחולים הייתה‪ ,‬אם בכלל‪ ,‬רק בגיל צעיר או‬
‫בחולים בהם חומרת המחלה הייתה קלה‪ .‬יתר על כן‪ ,‬נמצא ש‪ 56%-‬מהחולים פיתחו תופעות לוואי קשות של‬
‫תנועות בלתי רצוניות גם בתקופות שהיו ללא טיפול תרופתי‪ .‬באחד המחקרים אף דווח על סימני דלקת באזור‬
‫ההשתלה‪ ,‬כנראה כתוצאה מתגובה אימונית ואפילו דחייה חלקית של התאים המושתלים‪ .‬דיווחים אלו מטילים‬
‫צל כבד על היעילות שבהשתלת תאים מעובר במוח הבוגר‪ .‬נתונים אלו מתווספים לטענות קשות שהושמעו כבר‬
‫עם תחילת הניסיונות בנוגע להשלכות המוסריות הנובעות מהשימוש בעוברים אנושיים כמקור להשתלת תאים‪.‬‬
‫מחקרים נוספים התמקדו בתאי גזע שמקורם במח עצם‪ .‬מתברר שבמח עצם מצויים בנוסף לתאי המערכת‬
‫ההמטופואטית גם תאי גזע מזנכימליים המהווים מקור להתפתחותם של תאי סחוס‪ ,‬עצם ‪,‬שריר‪ ,‬שומן‪ ,‬גידים‪.‬‬
‫בשנים האחרונות פורסמו עבודות ראשוניות בהן הראו שניתן‪ ,‬בתרבית‪ ,‬להשרות בתאי גזע מזנכימליים התמיינות‬
‫א‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תקציר‬
‫לתאים דמויי תאי עצב )‪ .(neuron-like cells‬יתר על כן‪ ,‬תאים שהושתלו במכרסמים נדדו לאזורים שונים במוח‬
‫והתפתחו לתאים דמויי תאי עצב‪ .‬מאידך‪ ,‬לא תוארו עדיין עבודות המתארות התמיינות תאים מזנכימליים לתאי‬
‫עצב דופאמינרגים מתפקדים‪ .‬יתרונם של תאים אלו בכך שהם במצב התפתחותי מוקדם‪ ,‬השימוש בהם אינו כרוך‬
‫בשאלות אתיות כדוגמת שימוש בתאים ממקור עוברי‪ ,‬השתלתם אינה מלווה בטיפול תרופתי המונע דחיית שתל‬
‫מכיוון שהתאים מופקים מאותו פרט )חולה( שיושתלו אליו בחזרה‪.‬‬
‫מטרת העבודה העיקרית הנה ביצוע השראת התמיינות )‪ (in-vitro‬עצבית דופאמינרגית לתאים מזנכימליים ממח‬
‫עצם אנושי באמצעות גורמי גידול שונים ולבדוק את יעילותם במודלים למחלת פרקינסון במכרסמים‪.‬‬
‫דוגמאות של תאי מח עצם התקבלו מאנשים בריאים‪ ,‬התאים המונונוקלארים הופרדו מהדוגמא באמצעות‬
‫גרדיאנט פיקול ונזרעו בצלחות פלסטיק )‪ .(polystyrene‬לאחר כ‪ 48-‬שעות‪ ,‬מדיום הגידול נשטף ואיתו הוסרו כל‬
‫התאים ההמטופואטים שצפו במדיום הגידול‪ .‬תאי הגזע המזנכימליים שנשארו דבוקים לצלחת הפלסטיק‬
‫אופיינו באמצעות בדיקת אנטיגנים על פני דופן התאים כפי שהודגם באמצעות סורק תאים‪ .‬נמצא שהתאים‬
‫המזנכימליים ביטאו על פני דופן התא את הסמנים האופייניים‪ CD29, CD44, CD90, CD105:‬מאידך‪ ,‬לא היה‬
‫ביטוי של סמנים מהמערכת ההמטופואטית כדוגמת ‪.CD34, CD45‬‬
‫השראת התמיינות עצבית דופאמינרגית בוצעה בשני שלבים עיקריים‪ .‬בשלב הראשון‪ ,‬מדיום ההתמיינות הכיל‪:‬‬
‫גורמי גידול )‪ , epidermal growth factor (EGF), basic fibroblast growth factor (bFGF‬חומצת שומן‬
‫מטיפוס אומגה‪ ,Docosahexaenoic acid 3-‬ותוספת ‪ N2‬החיונית להתפתחות תאי עצב‪ .‬בשלב השני התאים‬
‫נחשפו לחומרים המעלים את רמות ה‪ cAMP-‬התוך תאיים‪ ,‬נוגדי חמצון‪ ,‬חומצה רטינואית‪ ,‬תוספת ‪ ,N2‬וגורמי‬
‫הגידול )‪ .glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF), β-nerve growth factor (βNGF‬התאים‬
‫הציגו לאחר תהליך ההתמינות מורפולוגיה נוירונלית אופינית‪.‬‬
‫השראת התמיינות עצבית דופאמינרגית הביאה לשינויים מורפולוגיים מרשימים – מתצורה של תאים דמויי‬
‫פיברובלסטיים לתצורה תאים דמויי תאי עצב‪ .‬כמו כן נמצא שתהלך השגשוג‪ ,‬האופייני לתאים לא ממוינים‬
‫מפסיק כתוצאה מהדגרתם של התאים המזנכימליים במדיום ההתמיינות‪ .‬התאים שעברו התמיינות הציגו ביטוי‬
‫גנטי ייחודיי לתאי עצב‪ ,‬כגון‪:‬‬
‫‪CD90, glypican-4, necdin, nestin, Neurite growth-promoting factor 2, Neurofilament-Heavy (NF‬‬‫‪200), Neurofilament- Light, Neurofilament-Medium, Neuron specific enolase (NSE), Neurotrophic‬‬
‫‪tyrosine kinase receptor type 2, Patched homolog, Retinoic acid receptor type a, Smoothened‬‬
‫בנוסף‪ ,‬השראת ההתמיינות הביאה לביטוי חלבונים ייחודיים לתאי עצב‪:‬‬
‫ב‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תקציר‬
‫‪Alpha (α)-synuclein, Beta (β)-tubulin III, Glial acidic fibrillary protein, Microtubule-associated‬‬
‫‪protein 2, nestin, NF-200, NSE, Neuronal Nuclei protein, Tryptophan hydroxylase.‬‬
‫יש לציין שמספר סמנים עצביים הופיעו ברמות נמוכות גם בתאים מזנכימליים שלא עברו התמיינות‪.‬‬
‫כמו כן נמצא שהתאים שעברו התמיינות עצבית דופאמינרגית הציגו ביטוי גנטי לגורמי שיעתוק ייחודיים לתאים‬
‫דופאמנירגיים‪ ,‬כגון‪Engrailed 1, Nuclear receptor related 1, Paired-like homeodomain transcription :‬‬
‫‪ .factor 3‬יתרה מכך‪ ,‬התאים הציגו ביטוי גנטי של כל האנזימים האחראיים לייצור ופירוק דופאמין ושל תעלות‬
‫אופייניות לתאים דופאמינרגים‪ ,‬כדוגמת‪:‬‬
‫‪Aromatic L-amino acid decarboxylase, Catechol-o-methyltransferase, Dopamine transporter ,‬‬
‫‪Dopamine receptor D2, Monoamine oxidase B, Tyrosine hydroxylase (TH), Vesicular monoamine‬‬
‫‪transporter 2.‬‬
‫עלייה בביטוי הגנטי של הסמנים השונים נמצאה בהתאמה לעליה בסמנים העצביים ובהתאמה לעלייה ברמות‬
‫‪ ,TH‬אנזים קובע הקצב לייצור דופאמין‪ .‬באנליזה רגישה ב‪ HPLC-‬הצלחנו לזהות‪ ,‬לאחר הדגרת התאים‬
‫המזנכימליים ממקור אנושי במדיום התמיינות‪ L-DOPA ,‬ודופאמין‪.‬‬
‫בנוסף לכך‪ ,‬מצאנו שתאים מזנכימליים ממקור אנושי שעברו התמיינות לתאים דמויי‪-‬תאי עצב מציגים מדדים‬
‫אלקטרופיסיולוגיים המאפיינים תאי עצב‪ .‬רמות הסידן התוך תאיות עולות בעקבות דפולריזציה עם העלאת‬
‫רמות ‪ K+‬החוץ תאיות‪ .‬ייתכן‪ ,‬שרמות הסידן עולות בעקבות הפעלת תעלות סידן תלויות מתח על פני ממברנת‬
‫התאים‪ .‬בנוסף‪ ,‬במצב מנוחה זרם הממברנה הוא אפס‪ ,‬כלומר אין "דליפות" של יונים מהתא‪ .‬מאידך‪ ,‬בשינוי‬
‫מתח הממברנה אזי הזרם עולה‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬מתח המנוחה של הממברנה הנו ‪ ,-70mV‬וכאשר מעלים את הזרם‬
‫המתח עולה עד לנקודת מקסימום אך ללא הצגת פוטנציאל פעולה‪.‬‬
‫במטרה לבחון האם תאי מח עצם שהושרו לתאי עצב יכולים לשפר את הסימנים הקליניים במודל למחלת‬
‫הפרקינסון‪ ,‬השתלו תאים מזנכימליים‪ ,‬ממח העצם של עכבר‪ ,‬שעברו התמיינות עצבית‪ ,‬לעכברים שימשו מודל‬
‫למחלת הפרקינסון‪ .‬לאחר מעקב של כחמישה חודשים נמצא שיפור התנהגותי דרמטי בעכברים המושתלים‬
‫והסיבובים שהושרו באמצעות הנירוטוקסין ‪ 6-OHDA‬נעצרו כמעט לחלוטין‪ .‬יתר על כן‪ ,‬מקצת התאים‬
‫שהושתלו נמצאו באזור ההשתלה וחלקם אף ביטא ‪.TH‬‬
‫לסיכום‪ ,‬עבודה זו מחזקת את הטענה‪ ,‬שתאים ממח עצם אנושי‪ ,‬מסוגלים להתמיין לתאים שמבטאים סמנים של‬
‫תאי עצב דופאמינרגים פעילים‪ .‬במהלך מחקרנו פיתחנו פרוטוקל מקורי להפקה יעילה ומהירה של תאים דמויי‬
‫נוירונים שמגלים תכונות שונות האופיניות לתאים הדופאמינרגיים ואף הוכיחו עצמם בנסיונות במודל חיה‪.‬‬
‫ג‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תקציר‬
‫האפשרות להשתלה אוטולוגית של תאים מזנכימליים ממח העצם שעברו התמיינות עצבית‪-‬דופאמינרגית עדיין‬
‫צריכה הוכחות נוספות‪ ,‬אולם התוצאות שקיבלנו מעודדות את המשך המחקר‪ ,‬מדגישות את היתרונות החשובים‬
‫ופותחות אופקים חדשים ותקווה לטיפול בחולי פרקינסון בעתיד‪.‬‬
‫ד‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫מבוא‬
‫‪ .1‬מחלת פרקינסון )‪(Parkinson’s disease‬‬
‫‪ 1.1‬כללי‬
‫מחלת פרקינסון )‪ (Parkinson’s Disease, PD‬הינה מחלת עצבים ניוונית נפוצה הפוגעת במעל‪ 1% -‬של‬
‫האוכלוסייה הבוגרת מעל גיל ‪ ,65‬ואופיינה לראשונה בשנת ‪ 1817‬ע"י ד"ר ג'ימס פרקינסון‪ ,‬באנגליה‪ ,‬במאמר‬
‫"‪ .(Parkinson, 1817) "Essay on the shaking palsy‬המחלה‬
‫מאופיינת מבחינה התנהגותית ע"י‪:‬‬
‫‪) Bradykinesia‬ירידה ביכולת ליזום תנועות יחד עם ‪- Akinesia‬חוסר תנועה( ‪) Cogwheel rigidity,‬קשיון‬
‫שרירים‪ ,‬מסוג גלגל שיניים(‪) Tremor at rest ,‬רעד במנוחה ‪,‬בתדירות של ‪ ,(4-5 Hz‬תנוחה בלתי תקינה של הגוף‬
‫והפרעות ביציבות )‪ ,(Postural disturbance‬קיפאון )‪ ,(Gate freezing‬תופעות אוטונומיות )כגון הפרעות במערכת‬
‫העיכול(‪ ,‬לעיתים שיטיון )‪ ,(Dementia‬דיכאון וירידה כללית בכושר התפקוד היום יומי ‪activities of daily‬‬
‫‪ .living‬הסיכוי ללקות בשיטיון בחולי פרקינסון מבוגרים הוא פי ‪ 6.6‬מאשר מבוגרים שאינם חולים במחלה זו‪,‬‬
‫כמו כן‪ ,‬קיימת עלייה בתמותה )‪ (mortality‬של חולים אלו פי ‪ 2-5‬לעומת בריאים בקבוצת גיל דומה ) & ‪Lang‬‬
‫‪.(Lozano 1998‬‬
‫‪ 1.2‬פתולוגיה של מחלת פרקינסון‬
‫מחלת פרקינסון מאופיינת על ידי ניוון מתקדם של אוכלוסיות תאי‪-‬עצב סלקטיביות אך הטרוגניות‪ .‬נתיחה‬
‫שלאחר המוות מראה שינויים אנטומיים בעיקר בחלקים של המערכות הלימבית והמוטורית‪ .‬סינדרום זה קיים‬
‫באופן תדיר בחולים עם תהליכי ‪ idiopathic degeneration‬אצלם יש פגיעה‪/‬ניוון בתאי העצב הדופאמינרגים ב‪-‬‬
‫‪ (SNpc) substantia nigra pars compacta‬השולחים שלוחות אקסונליות דרך המסילות הניגרוסטריאטליות ל‪-‬‬
‫‪.(Stacy & Jankovic, 1992) (Caudate + putamen ) (STR) striatum‬‬
‫ניוון תאי עצב דופאמינרגים נמצא גם ב‪ (VTA) ventral tegmental area-‬המקרין אל ה‪entothinal cortex, -‬‬
‫‪ olfactory tubercle, cingulated gyros‬ול‪ .frontal cortex-‬ניוון תאי עצב נוראפינפרינים נמצא ב‪locus -‬‬
‫‪ ceruleus‬המקרין אל עמוד השדרה‪ ,‬צרבלום‪ ,‬מרכז החומר האפור במוח הביניים‪amygdala, substantia ,‬‬
‫‪ ,innuminata‬תלאמוס‪ ,‬הקורטקס הלימבי והנאו‪-‬קורטקס‪ .‬ניוון תאי עצב סרוטונרגים נמצא ב‪raphe nuclei-‬‬
‫המקרינים אל עמוד השידרה‪ ,‬צרבלום‪ substantia nigra, amygdala, STR ,‬וקורטקס‪ .‬ניוון תאי עצב כולינרגים‬
‫נמצא ב‪) substantia innuminata -‬הגרעין הבאזאלי על שם ‪ .(Meynert‬ניוון תאי עצב נמצא גם ב‪dorsal motor -‬‬
‫‪ nucleus of vagus‬וכן ב‪ intermediolateral column-‬וב‪ .amygdala-‬כמו כן‪ ,‬נמצאו נזקים ציטוסקלטאלים‬
‫‪1‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫במערכות המוקרנות על ידי המסלולים הדופמינרגים‪ ,‬כגון במערכות גלוטאמטיות‪ ,‬כולינרגיות‪ ,‬טריפטאמינרגיות‪,‬‬
‫גאבארגיות‪ ,‬נוראדרנרגיות ואדרנרגיות‪ .‬המופע הדומיננטי ביותר הינו איבוד של נוירונים דופאמינרגים ב‪SNpc -‬‬
‫יחד עם הופעתם של גופיפים המכונים )‪ Lewy bodies (LB‬המכילים משקע של חלבונים שונים ) & ‪Braak‬‬
‫‪ .(Braak, 2000‬מקובל‪ ,‬כי הנזק במערכות לא‪-‬דופאמינרגיות הנ"ל תורמות לתופעות הלא‪-‬מוטוריות של המחלה‪.‬‬
‫‪ 80%‬מרמת הדופאמין )‪ (Dopamine, DA‬במוח מצויה בגרעיני הבסיס‪ ,‬ולכן פגיעה באזורים אלה עשויה לגרום‬
‫לדלדול ברמות הדופאמין והתפתחות של הפרעות תנועה קשות המתבטאות במחלת פרקינסון‪ .‬כ‪ 4%-‬מהנוירונים‬
‫הדופאמינרגים מתנוונים בכל עשור כחלק מתהליך ההזדקנות הנורמלי‪ ,‬אך במחלת פרקינסון תהליך התנוונות זה‬
‫מואץ וכאשר כ‪ 80-70%-‬מהנוירונים הדופאמינרגים ב‪ SNpc-‬מתנוונים )באופן נורמלי ישנם כ‪ 425,000 -‬תאים‬
‫ואילו במחלה נשארים פחות מ‪ 100,000 -‬לפני הופעת הסימן הראשון(‪ ,‬מתדלדלת כמות הדופאמין ב‪ STR-‬ומופר‬
‫שיווי המשקל העדין בין הדופאמין ובין נוירוטרנסמיטורים הפעילים באזור‪ ,‬דבר המתבטא בעליה בריכוז אצטיל‬
‫כולין‪ ,‬וגורמת לרוב התסמינים ההתנהגותיים שהוזכרו )‪ .(Lang & Lozano, 1998‬אחד הסמנים המובהקים‬
‫בפתולוגיה של מחלת פרקינסון הנו הימצאותם של משקעים חלבוניים באזורי המוח המתנוונים‪ .‬קביעת‬
‫הדיאגנוזה הסופית של מחלת פרקינסון שסיבתה אינה ידועה )‪ (idiopathic PD‬מתבצעת בנתיחה שלאחר המוות‬
‫ומתבססת על שני הממצאים הבאים‪ :‬האחד‪ ,‬איבוד נוירונים דופאמינרגים‪ ,‬מכילי נוירומלאנין ב‪ ,SNpc-‬והשני‪,‬‬
‫הימצאותם של תלכידים חלבוניים ציטופלאסמטיים בתאים השורדים באזורים אלו‪.‬‬
‫‪ 1.3‬פתופיזיולוגיה‬
‫הגורם הראשוני להתנוונות תאי העצב הדופאמינרגים אינו ברור‪ .‬גורם הסיכון העיקרי להתפתחות המחלה הוא‬
‫גיל מתקדם והיסטוריה משפחתית‪ .‬קיימות מספר תיאוריות המשלבות בין גורמים גנטיים ובין גורמים‬
‫סביבתיים ונתמכות ע"י ממצאי הפתולוגיה‪ .‬על כן מקובל היום להניח כי למחלה אין גורם יחיד אלא כמה גורמים‬
‫)‪ .(Olnaow & Tatton, 1999; Shastry, 2001‬מחקרים רבים שעסקו בהתפתחות מחלת פרקינסון הצביעו על‬
‫כיוונים שונים‪ :‬גורמים גנטיים )מוטציות גנטיות דומיננטיות או רצסיביות שונות(‪ ,‬גורמים סביבתיים )הצטברות‬
‫רעלן עצבי אנדוגני או אקסוגני(‪ ,‬עקה חימצונית )רמה נמוכה של נוגדי חמצון ועלייה של נגזרות חמצן‬
‫ראקטיביות(‪ ,‬אקסיטוטוקסיות )רעילות המתווכת על ידי חומצות אמינו מעוררות(‪ ,‬מנגנונים אימונולוגים שונים‬
‫)עלייה של ציטוקינים וגורמי דלקת(‪ ,‬כשל מיטוכנדריאלי )עיכוב שרשרת הנשימה( ואף כשל בפירוק ופינוי של‬
‫חלבוני התא‪ .‬גורמים אלה עשויים להיות רעילים לתא ולקדם את ניוונו ומותו‪ ,‬על פי רוב‪ ,‬על ידי מוות תאי‬
‫מבוקר‪.‬‬
‫‪2‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ 1.3.1‬גורמים גנטיים‬
‫‪ Idiophatic PD‬מופיעה בצורה לא סדירה )‪ (sporadic‬ומהווה כ‪ 90-95% -‬מכלל מופעי המחלה‪ ,‬לעומת מקרי‬
‫הפרקינסון על רקע משפחתי )‪ ,Familial-PD (FPD‬המהווה כ‪ .5-10% -‬מחקר בחולי פרקינסון בתאומים מונו או‬
‫די‪-‬זיגוטים לא העלה התאמה או שונות בין צמד התאומים כאשר המחלה נרכשה מעל גיל ‪ ,60‬אך מספר המקרים‬
‫עלה בתאומים מונוזיגוטים כאשר המחלה נרכשה מתחת לגיל ‪ .50‬ללמדנו‪ ,‬כי גורמים גנטיים הינם בעלי משקל‬
‫יתר במקרים של רכישה מוקדמת של המחלה )‪.(Tanner et al., 1999‬‬
‫עד היום זוהו מספר מוטציות המקושרות לרכישת פרקינסון על רקע משפחתי )‪:(FPD‬‬
‫ )‪ : α-synuclein (PARK1‬זהו חלבון עצבי הממוקם במעטפת הגרעין ובקצוות הפרה‪-‬סינפטיות ומכאן שמו‬‫)‪ .(Maroteaux et al., 1988) (synapse, nucleus and protein‬תפקידו הפיזיולוגי עדיין אינו ברור‪ ,‬אך יתכן כי‬
‫יש לו תפקיד בוויסות הפלסטיות הסינפטית כפי שעולה ממחקר לימוד שירה בציפורים בתקופת החיזור ‪(George‬‬
‫)‪ ,et al., 1995‬ובוויסות שיחרור דופאמין מתוך ווסיקולות כפי שעולה מעכברים משוללי ‪α-synuclein‬‬
‫)‪ .(Abeliovich et al., 2000‬תפקידו המרכזי של ‪ α-synuclein‬בפאתוגנזה של מחלת פרקינסון מבוסס על שלוש‬
‫עובדות הבאות‪ :‬ראשית‪ ,‬מוטציה בגן זה גורמת להופעת מחלת פרקינסון בצורה דומיננטית‪ .‬שנית‪ ,‬שכיחותו‬
‫הרבה של חלבון זה בתוך גופיפי לואי בניגרה‪ ,‬שהנו הסמן המובהק של מחלת פרקינסון‪ .‬שלישית‪ ,‬ביטוי יתר של גן‬
‫זה בחיות מודל גרמה להופעת תסמינים התנהגותיים‪ ,‬פאתולוגים וביוכימיים האופייניים למחלת פרקינסון‪ .‬כיוון‬
‫שרוב החולים במחלה זו הינם ספורדים משוללי המוטציה‪ ,‬הרי שמוטציה זו אינה נחוצה לפאתוגניות הבסיסית‬
‫של חלבון זה בפרקינסון וכי תכונותיו של ‪ α-synuclein‬בשילוב גורמים אחרים עלולים לקדם את התפתחות‬
‫המחלה‪.‬‬
‫ )‪ :Parkin (PARK2‬זהו חלבון המורכב מ‪ 465-‬חומצות אמינו‪ ,‬קצהו האמיני בעל דמיון ל‪Ubiquitine (Ub) -‬‬‫ובחלקו הקרבוקסילי מצויים שני מתחמים דמויי טבעת‪ .‬בגן ל‪ parkin-‬המצוי על כרומוזום ‪ 6q25-q27‬נמצא‬
‫מגוון רחב של מוטציות‪ .‬ההפרעה העצבית הנגרמת על ידי מוטציות בגן זה מופיעה בצורה אוטוזומלית‪-‬רצסיבית‬
‫ובגיל מוקדם יחסית )‪ 32±12‬שנים( ועל כן היא מכונה ‪ autosomal-recessive juvenile parkinsonism‬והיא‬
‫מאופיינת בהתקדמותה האיטית )‪ .(Kitada et al., 1998‬נמצא כי ‪ parkin‬משמש כאנזים )‪Ub-ligase (E3‬‬
‫הספציפי ל‪) α-synuclein-‬בצורתו הגליקוזידית( במערכת היוביקויטין‪-‬פרוטאזום )‪.(Shimura et al., 2000‬‬
‫מקובל כיום‪ ,‬כי מוטציות בגן ‪ parkin‬מייצגות כ‪ 50%-‬ממקרי מחלת פרקינסון בגילאים המוקדמים‪early-"-‬‬
‫‪.(Lucking et al., 2000) "onset‬‬
‫‪3‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ :Ubiquitin carboxy-terminal hydrolase L1‬חלבון זה שייך למערכת היובקויטין‪-‬פרוטאזום ותפקידו לפרק‬‫שרשראות פולי‪-‬יוביקויטין למונומרים‪ .‬חלבון זה שכיח ביותר במוח ומהווה ‪ 1-2%‬מכלל החלבונים המסיסים‪.‬‬
‫מוטציה נדירה בגן זה‪ ,‬המצוי על כרומוזום ‪ ,4p14‬גורמת להחלפת חומצה אמינית איזולואיצין במתיונין בעמדה‬
‫‪ ,(I93M) 93‬ולאיבוד חלקי בפעילות הקטאליטית של הפרוטאז‪ .‬כתוצאה מכך‪ ,‬מציגים נשאי מוטציה זו תסמינים‬
‫קלינים האופייניים למחלת פרקינסון בצורה אוטוזומלית‪-‬דומיננטית )‪ .(Leroy et al., 1998‬ממצאי הפאתולוגיה‬
‫של חולים אלו עדיין אינם ברי‪-‬השגה אך מוטציה אוטוזומלית‪-‬רצסיבית בגן זה בעכברים גרמה לניוון תאי עצב‬
‫סנסורים ומוטורים ולהופעת תלכידים חלבוניים שהם אימונוראקטיבים ל‪.(Saigoh et al., 1999) Ub-‬‬
‫‪ :PARK3‬אתר הממוקם על כרומוזום ‪ 2p13‬וגורם להופעת המחלה בצורה אוטוזומלית‪-‬דומיננטית‪ ,‬בחדירות‬‫של ‪ 40%‬בלבד‪ ,‬הכוללת איבוד תאי עצב ב‪ SNpc-‬ומופע אופייני של ‪ .LB‬החלבון המקודד על ידי אזור זה עדיין‬
‫אינו ידוע )‪.(Gasser et al., 1998‬‬
‫‪ :PARK4‬אתר הממוקם על כרומוזום ‪ 4p16‬גורם להופעת המחלה בגיל מוקדם )סביב שנות השלושים( בצורה‬‫אוטוזומלית‪-‬דומיננטית הכוללת איבוד תאי עצב ב‪ SNpc-‬ומופע אופייני של ‪ .LB‬כמו כן‪ ,‬המחלה מאופיינת‬
‫בהתקדמות מהירה )‪.(Farrer et al., 1999‬‬
‫‪ :PARK6‬לוקוס הממוקם על כרומוזום ‪ 1p35-p36‬גורם להופעת המחלה בגיל מוקדם )סביב שנות הארבעים(‬‫בצורה אוטוזומלית‪ -‬רצסיבית‪ .‬המחלה מאופיינת בהתקדמותה האיטית‪ .‬ממצאים פאתולוגים עדיין אינם ברי‪-‬‬
‫השגה )‪.(Valente et al., 2001‬‬
‫ ‪ :PARK7‬אתר שאופיין על כרומוזום ‪ 1p36‬גורם להופעת המחלה בגיל מוקדם )סביב שנות הארבעים( בצורה‬‫אוטוזומלית‪ -‬רצסיבית‪ .‬המחלה מאופיינת בהתקדמותה האיטית‪.(Van Duijn et al., 2001) .‬‬
‫ ‪ : PARK8‬אתר נוסף שאופיין ממש לא מכבר על כרומוזום ‪ 12p11.2-q13.1‬במשפחה יפנית גדולה נמצא כגורם‬‫להופעת מחלה אוטוזומלית דומיננטית )‪ .(Zimprich et al, 2004‬לאחרונה נמצאה מוטציה אופיינית ב‪PARK8-‬‬
‫בחמש משפחות מאנגליה ומספרד )‪.(Paisan-Ruiz et al., 2004) (Dardarin mutations‬‬
‫‪4‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ 1.3.2‬גורמים סביבתיים‬
‫אחת התיאוריות המקובלות בנוגע לגורם הראשוני של מחלת פרקינסון סוברת כי מות תאי העצב הדופאמינרגים‬
‫במערכת הניגרו‪-‬סטריאטלית מתרחשת עקב כשל מיטוכונדריאלי‪ .‬תיאוריה זו קיבלה סימוכין רבים על ידי גילוים‬
‫של רעלנים יעילים שונים המשמשים עד היום ליצירת מודלים פרקינסונים בפרימטים ובמכרסמים‪ .‬מודלים אלה‬
‫מסייעים במחקר הרפואי הניסויי מכיוון שהם מאפשרים ללמוד על הפתוגנזה והתסמינים של המחלה באדם‪.‬‬
‫• ‪MPTP‬‬
‫רעלן חיצוני בשם ‪ ,(MPTP) 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine‬התגלה באקראי כתוצר לוואי‬
‫במהלך סינתזה של הסם ‪ Mepridine‬ע"י סטודנטים אמריקאים בצפון קליפורניה‪ ,‬ונמצא שהוא גורם להשראת‬
‫תסמינים פרקינסונים במכרסמים ופרימטים )‪.(Langston et al, 1983; Kopin et al, 1987‬‬
‫נמצא כי ‪ MPTP‬חודר את מחסום דם מוח )‪ (Blood brain barrier, BBB‬ונכנס לתאי ‪ Glia‬שם האנזים‬
‫)‪ Monoamineoxidase B (MAO-B‬הופכו ל‪ 1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridinium (MPDP+) -‬ואז‬
‫הופך ספונטנית ל ‪ MPP+ .(Jenner et al, 1992) 1-methyl-4-phenylpyridinium ion (MPP+)-‬יוצא מה‪Glia -‬‬
‫אל התווך הבין תאי ונכנס אקטיבית לתוך תאי העצב דופאמינרגים דרך תעלות ספציפיות לקליטה חוזרת של‬
‫דופאמין ) ‪ MPP+ .(Harik et al, 1987; Jenner et al, 1992‬מסתפח בזיקה גבוהה לפיגמנט נוירומלאנין שהוא‬
‫תוצר חמצון של דופאמין )קווינון( ששקע והסתפח אל ליפידים )ועל כן ההצטברות היא בתאי העצב‬
‫הדופאמינרגים דווקא(‪.‬‬
‫‪ MPP+‬מועבר גם אקטיבית אל תוך המיטוכונדריה עד לריכוז גבוה של מילימולרים ומעכב את קומפלקס ‪I‬‬
‫בשרשרת הנשימה )‪ .(Jenner et al, 1992‬עיכוב שרשרת הנשימה עשוי להוביל ליצירת רדיקלים חופשים‪ :‬כגון מי‬
‫חמצן )‪ (H2O2‬וסופראוקסיד )‪ (Dauer & Przedborski, 2003) (O2-‬דהיינו ליצירת עקה חימצונית‪.‬‬
‫• רוטנון‬
‫בדומה ל‪ ,MPTP-‬גם רוטנון‪ ,‬המצוי בחומרי הדברה‪ ,‬הינו מעכב קומפלקס ‪ I‬בשרשרת הנשימה‬
‫המיטוכונדריאלית‪ .‬חשיפה מערכתית כרונית של חולדות לרוטנון גרמה לנזק סלקטיבי של תאי עצב דופמינרגים‬
‫ב‪ SNpc-‬ולהופעת תלכידי חלבון דמויי ‪ LB‬בתאי העצב ששרדו )‪.(Betarbet et al., 2000‬‬
‫• ציאניד‬
‫אנשים שניסו להתאבד בעזרת ציאניד )‪ ,(NaCN, KCN‬שהינו מעכב קומפלקס ‪ IV‬במיטוכונדריה‪ ,‬פיתחו‬
‫סינדרום פרקינסוניזם חמור)‪.(Rosenberg et al., 1989‬‬
‫‪5‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫• ‪1-trichloromethyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline, TaClo‬‬
‫‪ TaClo‬הינו תוצר דחיסה של החומצה האמינית טריפטאמין )‪ (Ta‬עם קבוצת כלוראל )‪ .(Clo‬מולקולה ליפופילית‬
‫זו חודרת את ה‪ BBB-‬והיא בעלת אנלוגיה סטרוקטוראלית ל‪ TaClo .MPTP-‬הינו מעכב של קומפלקס ‪ I‬וכן של‬
‫)‪ Tyrosine hydroxylase (TH‬וגורם למות תאי עצב דופאמינגים‪ .‬בעוד ש‪ MPTP-‬מגיע ממקור חיצוני הרי ש‪-‬‬
‫‪ TaClo‬יכול להיווצר בצורה אנדוגנית בגוף על ידי החומצה האמינית טריפטאמין ומכלוראל הדראט ממקור‬
‫תרופתי‪ ,‬או על ידי חשיפה סביב )‪.(Riederer et al. 2002‬‬
‫• ‪6-OHDA‬‬
‫מתן מקומי לניגרה של ‪ (6-OHDA) 6-Hydroxydopamine‬שהוא טוקסין פנימי )אינו עובר את ה‪ BBB -‬במתן‬
‫סיסטמתי( הנוצר בהמצאות )‪ Ferric iron (Fe2+‬ו‪ H2O2-‬מדופאמין‪ ,‬גורם להשראת מחלת פרקינסון ‪in‬‬
‫‪.(Jellinger et al, 1995; Offen et al, 1998) vivo/vitro‬‬
‫• רעלנים אחרים‬
‫בדומה ל‪ MPTP-‬ו‪ , 6-OHDA -‬רעלנים חיצוניים אחרים כגון‪ :‬חומרי הדברה וחומרים תעשייתיים אחרים‬
‫יכולים לגרום למחלת פרקינסון )‪.(Smith et al, 1993; Seidler et al, 1996‬‬
‫‪ 1.3.3‬מעורבות עקה חימצונית במחלה‬
‫רדיקל חופשי הוא תרכובת כימית המכילה לפחות אלקטרון אחד לא מזווג‪ .‬נוכחות אלקטרונים בלתי מזווגים‬
‫הופכת את המולקולה לפעילה ובעלת יכולת נטילת אלקטרון ממולקולות אחרות‪ .‬מסיבה זו רדיקלים חופשיים‬
‫פועלים כחומרים מחמצנים‪ .‬באופן יום יומי אנו חשופים כל העת לרדיקלים חופשיים שנוצרים על ידי קרינה‬
‫אלקטרומגנטית מן הסביבה ועל ידי מטבוליזם תאי‪ .‬רדיקלים אלו מכילים נגזרות חמצן ראקטיביות ) ‪Reactive‬‬
‫‪ .(oxygen species, ROS‬רדיקלי החמצן מחמצנים חלבונים‪ ,‬חומצות גרעין ושומני ממברנה ובכך פוגמים‬
‫בתפקודם של אלו במארג התאי‪ .‬רדיקלי חמצן חזקים‪ ,‬כמו רדיקל ההידרוקסיל‪ ,‬עשויים לאתחל תגובת שרשרת‬
‫של חמצון שומנים )‪ .(Lipid peroxidation‬חומצות שומן בלתי רוויות המצויות בכמות גבוהה במוח הינן בעלות‬
‫רגישות לרדיקלים חופשיים משום הקשר הכפול המצוי בהן המאפשר "שליפה" קלה יותר של אטום המימן על ידי‬
‫רדיקלים‪ .‬כתוצאה מכך נוצר רדיקל פחמני שמסוגל להיקשר לחומצות שומן אחרות בממברנה‪ .‬התהליך מביא‬
‫לשינוי בתכונות הממברנה הדרושות לתפקוד נורמלי של התא‪.‬‬
‫עקה חימצונית נוצרת כאשר מופר האיזון בין יצירת רדיקלים חופשיים לבין פירוקם‪ .‬עלייה בייצור של רדיקלים‬
‫חופשיים מצד אחד או שיבוש בסילוקם של אלו מצד שני‪ ,‬יביאו את התא למצב של עקה חימצונית‪.‬‬
‫‪6‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫במחלת פרקינסון נמצאו עדויות לקיומה של סביבה המעודדת יצירתה של עקה חימצונית ולקיומה‪ .‬בדיקות‬
‫שלאחר מוות בניגרה במוחותיהם של חולי פרקינסון הראו עלייה בנזק והתקדמות המחלה מלווה בעלייה‬
‫במטאבוליזם של דופאמין‪ ,‬עלייה בריכוזי ברזל ראקטיבי‪ ,‬והפחתה של נוגד החימצון גלוטטיון ) ‪Floor & Wetzel‬‬
‫‪ .(1998‬להן פירוט של מספר גורמים המוזכרים מעלה העשויים להוביל לעקה חימצונית‪:‬‬
‫• מטבוליזם של דופאמין‬
‫עלייה ביצור רדיקלים חופשיים יכולה להיגרם על ידי עלייה במטאבוליזם של דופאמין‪ .‬במהלך המטבוליזם‬
‫הטבעי של דופאמין על ידי האנזים מונו אמין אוקסידאז )‪ ,(monoamine oxidase, MAO‬נוצרים מי‪-‬חמצן‬
‫)‪ .(H2O2‬בהמשך‪ ,‬יווצר הרדיקל סופר‪-‬אוקסיד )‪ .(·O2-‬בנוכחות ברזל )‪ (Fe3+‬תתרחש תגובת פנטון ‪(Fenton‬‬
‫)‪ reaction‬ובה יווצר הרדיקל הראקטיבי ביותר‪ ,‬רדיקל ההידרוקסיל )·‪ .(OH‬התוצר המחומצן של דופאמין יכול‬
‫גם ליצור נוירומלאנין העלול להיות רעיל לתא‪ .‬ואכן מספר מחקרים‪ ,‬במעבדתנו ובמעבדות נוספות‪ ,‬הראו‬
‫שדופאמין ו‪ L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) -‬רעילים לתרביות תאי עצב וגורמים למוות תאי‬
‫מבוקר )‪.(Offen et al., 1997; Mytilineou et al., 2003‬‬
‫• רמות ברזל גבוהות בניגרה‬
‫ברזל הינה המתכת השכיחה ביותר בגוף האדם בכלל ובמוח בפרט‪ .‬ברזל מסוגל לקבל או לתרום אלקטרון‪ ,‬לקדם‬
‫תגובות חמצון‪/‬חיזור ולשמש כזרז להפיכת רדיקלים חופשיים מתונים לרדיקלים חופשיים פעילים מאוד כגון‬
‫‪ Fe2+‬המעודד יצירת רדיקלים חופשיים ובעיקר יצירת רדיקל ההידרוקסיל מ‪ ,H2O2 -‬שהוא כאמור הרדיקל‬
‫הראקטיבי ביותר )‪ .(Fenton reaction‬בנתיחה שלאחר המוות נמצא כי בחולים קיימת הצטברות ברזל ב‪SNpc-‬‬
‫לעומת קבוצת בקרה‪ ,‬כאשר עיקר ההצטברות היא בצורת ה‪ .(Riederer et al., 1989) Fe3+-‬ברזל נספח ספציפית‬
‫לנוירומלאנין‪ ,‬תוצר החימצון של דופאמין‪ ,‬וכך רמות הברזל עולות במיוחד בתאי העצב הדופאמינרגים ומקדמים‬
‫יצירת ‪ .(Enochs et al., 1994) ROS‬נמצאה עליה בכמות קולטני הלאקטופרין בתאי העצב הניגראלים‪ ,‬שהוא‬
‫אחד הקולטנים דרכם ברזל נכנס לתא‪ ,‬יתכן ודרכו נכנסים עודפי הברזל )‪ .(Faucheux et al., 1995‬למרות‬
‫העלייה ברמות הברזל‪ ,‬לא נמצאה עליה ברמות הפריטין שבו מאוחסן הברזל בצורה אינרטית לתא ‪(Connor et‬‬
‫)‪ .al., 1995‬מכאן‪ ,‬שרמת הברזל הביו‪-‬ראקטיבי בתא הינה גבוהה והדבר מקדם כמובן יצור ‪.ROS‬‬
‫• שינויים ברמות נוגדי חימצון תוך תאיים‬
‫בניגרה של חולי פרקינסון נצפתה עליה של ‪ 33%‬בפעילות של ‪ Superoxide dismutase‬המיטוכונדריאלי )אנזים‬
‫שתפקידו להפוך תפקידו להפוך ‪ O2-‬ל‪ (H2O2-‬ממצא המעיד על ניסיון פיצוי של התא בתגובה לרמת הרדיקלים‬
‫חופשיים הגבוהה )‪ .(Jenner et al, 1992‬כמו כן מחקרים דווחו על ירידה של ‪ 40-50%‬ברמות ‪gamma-‬‬
‫‪7‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫)‪ glutamylcysteineyglycine reduced glutathion (GSH‬ב‪ SNpc-‬של חולי פרקינסון והראו שהירידה ב‪-‬‬
‫‪ GSH‬מקבילה לעליה בחומרת המחלה )‪ .(Sofic et al, 1992‬כמו כן ‪,‬חולי פרקינסון שטופלו ב‪600 mg ) GSH -‬‬
‫פעמיים ביום למשך חודש( הראו שיפור ב‪ 42% -‬מהתסמינים הקלינים‪ ,‬ונמצא שהשפעת החומר נמשכה בין ‪2-4‬‬
‫חודשים גם לאחר גמר הטיפול )‪ .(Sechi et al, 1996‬נתונים ראשוניים אלה מראים שבחולי פרקינסון יש אולי ל‬
‫‪ GSH‬יעילות סימפטומטית‪ ,‬ואולי אף השפעה מטיבה על מניעת התקדמות המחלה‪ .‬בנוסף‪ ,‬מחקרים שבוצעו‬‫במעבדתנו הראו אכן שמתן ‪ GSH‬בריכוז של ‪ 10µM‬לתאי ‪ PC-12‬ללא חשיפה לרעלן הביא לזירוז בחלוקת‬
‫התאים )‪ (150%‬והגן מפני רעילות של דופאמין )‪.(Offen et al, 1996‬‬
‫‪ 1.3.4‬מעורבות רעילות המתווכת ע"י גלוטמט‬
‫ריכוז גבוה של גלוטמט מחוץ לתא העצב מפעיל את הקולטן )‪ ,N-methyl-D-aspartate (NMDA‬הקולטן העיקרי‬
‫של גלוטמט‪ ,‬המתווך כניסה של סידן )‪ (Ca2+‬לתא העצב ומקדם יצירת ‪ ROS‬ומוות תאי‪ .‬ואכן‪ ,‬טיפול‬
‫באנטגוניסטים של ‪ NMDA‬מפחית את הנזק שהושרה על ידי ‪ MPTP‬בתאים דופאמינרגים ב‪ SNpc-‬במודלים של‬
‫חולדות וקופים )‪ .(Fredriksson et al., 1994; Nash et al., 2000‬כמו כן‪ ,‬ירידת פוטנציאל הממברנה עקב הכשל‬
‫האנרגטי‪ ,‬גורמת לעיכוב הרה‪-‬פולריזציה שלאחר עירור גלוטמט‪ .‬עיכוב זה יגרום להארכה או פתיחה לא מתאימה‬
‫של התעלות ולכניסה מוגברת של ‪ Na+‬ו‪ .Ca2+-‬כתוצאה מהריכוז הגבוה של ‪ Ca2+‬חוץ תאי‪ ,‬שהוא פי ‪1000‬‬
‫מריכוזו בציטוזול‪ ,‬שטף של ‪ Ca2+‬ייכנס לתוך התא‪ .‬ריכוז גבוה של ‪ Ca2+‬בתא יגרום ליצירת ‪ ROS‬במטבוליזם‬
‫של פוספוליפאז ‪ A2‬וכן על ידי הפעלה של האנזים ניטריק‪-‬אוקסיד סינטאז )‪(nitric-oxide synthase, NOS‬‬
‫לקבלת רמות ‪ NO‬גבוהות‪ NO .‬מגיב עם הרדיקל סופראוקסיד ליצירת פראוקסי‪-‬ניטריט ורדיקל ההידרוקסיל‬
‫)‪ .(Beckman et al., 1990‬בנוסף לכך‪ ,‬ריכוז גבוה של ‪ Ca2+‬יגרום לשיפעול של פפטידאזות‪ ,‬פוספוליפאזות‬
‫ואנדונוקלאזות‪ ,‬ולעיכול עצמי של התא‪ .‬כמו כן‪ Ca2+ ,‬יכנס אל תוך המיטוכונדריה ויגרום לה נזק בלתי הפיך‬
‫)‪.(Beal et al., 1993‬‬
‫‪ 1.3.5‬מעורבות דלקת במחלת פרקינסון‬
‫גירוי של מערכת החיסון עשוי להיווצר גם כאשר יש משקעים חלבוניים שונים בתוך התא כגון גופיפי לואי‪ .‬דבר‬
‫זה עשוי לגרום להפעלה במערכת המשלים ושפעול תאי מיקרוגליה )תאים הרגישים ביותר לשינויים בסביבתם‬
‫הקרובה( שיפרישו תוצרים רעילים כגון ‪ ,ROS‬גלוטמט‪ ,‬ציטוקינים דלקתיים כמו ‪Tumor necrosis factor-α‬‬
‫)‪ (TNF-α‬ו‪ .interleukin-1 (IL-1) -‬בניגרה של חולי פרקינסון נמצאה עלייה בתאי מיקרוגלייה מאוקטבים‪,‬‬
‫במיוחד באזורים בהם ההתנוונות מירבית )‪ .(McGeer et al., 1993‬בנוסף נמצא שרמות ‪ IL-1β ,TNF-α‬עולות‬
‫‪8‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫בניגרה של חולי פרקינסון פי ‪ .(Olanow & Tatton, 1999) 760-1570%‬רמות ‪ TNF-α‬עולות במיוחד באזורים‬
‫של תאי עצב המכילים נוירומלאנין‪ .‬אקטיבציה של ‪ TNF-α‬מקושרת להשראת מוות תאי מבוקר ע"י‬
‫טראנסלוקציה של ‪ NFκ-B‬אל הגרעין )‪.(Hunot et al., 1997‬‬
‫‪ 1.3.6‬כשל מיטוכונדריאלי‬
‫)‪ Adenosine triphosphate (ATP‬נוצר במיטוכונדריה תוך כדי חיזור מולקולת חמצן בתהליך המכונה שרשרת‬
‫הנשימה או זירחון חימצוני )‪ .(Oxidative Phosphorilation‬תהליך זה הינו גם מקור עיקרי ליצירת רדיקלי חמצן‪.‬‬
‫פגיעה בפעילות התקינה של שרשרת חימצונית זו תביא ליצירת רדיקלים חופשיים ולירידה בכמות ה‪ ATP-‬הזמין‬
‫לתא‪ .‬מצוקת אנרגיה תגרום לעקה ורעילות המתווכת ע"י גלוטמט )‪ ,(excitotoxicity‬לירידה בפוטנציאל‬
‫הממברנה המיטוכונדריאלית ושיחרור מתווכים לציטופלאסמת התא‪ ,‬שיפעילו את מערכת הקספזות )‪(caspases‬‬
‫וישרו מוות תאי מבוקר )‪ .(van Loo et al., 2002‬בנתיחה שלאחר המוות נמצא כי בניגרה של חולי פרקינסון‪,‬‬
‫קיימת ירידה של ‪ 30-40%‬בפעילות קומפלקס ‪ I‬של המיטוכונדריה )‪ .(Schapira et al., 1990‬ממצא זה מקבל‬
‫תמיכה מהממצא של ‪ ,MPTP‬מעכב של קומפלקס ‪ ,I‬שנמצא כמשרן של פרקינסוניזם על ידי הרס התאים‬
‫הדופאמינרגים בניגרה‪ ,‬וכן על ידי הרעלן רוטנון‪ ,‬מעכב ספציפי של קומפלקס ‪ ,I‬ששחרור כרוני בחולדה גרם‬
‫להופעת כשלים מוטורים יחד עם פתולוגיה של ניוון תאי עצב דופאמינרגים והתפתחות של תלכידים חלבוניים‬
‫דמויי‪ LB-‬בניגרה )‪ .(Betarbet et al., 2000‬רקמות בעלות פעילות אירובית גבוהה )כמו מוח‪ ,‬שריר( מכילות ריכוז‬
‫גבוה של מיטוכונדריות‪ .‬לכן‪ ,‬פעילות לא תקינה של מיטוכונדריות תביא לנזק חמור יותר ברקמות אלו‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫כשל מיטוכונדריאלי יגרום לירידה בפוטנציאל הממברנה ועלייה בכניסת יוני סידן‪ .‬הללו יגרמו לפתיחתם של‬
‫פתחים )‪ (pores‬בממברנה של המיטוכונדריה וליציאתם של מתווכים‪ ,‬כגון ‪ ,cytochrome C‬ולהפעלתה של‬
‫קסקדת הקספאזות ולמוות תאי מבוקר‪.‬‬
‫‪ 1.3.7‬כשל בעיבוד חלבונים וסילוקם‬
‫בשנים האחרונות מתגבשת תיאוריה חדשה באטיולוגיה של מחלת הפרקינסון הטוענת כי כשל בעיבוד חלבונים על‬
‫ידי מערכת היוביקוויטין‪-‬פרוטאזום )‪ (ubiquitin-proteasome system, UPS‬וחוסר היכולת לסלק חלבונים אלו‬
‫מהתא‪ ,‬גורם להצטברותם בתא העצב והללו תורמים לניוונו‪ .‬הדבר חשוב במיוחד כאשר מדובר בחלבונים פגומים‬
‫אשר איבדו את כושר פעילותם הייחודי ואף יתכן ורכשו פעילות רעילה‪ .‬הצטברות חלבונים זו יכולה להקשות על‬
‫תפקודו הנורמלי של התא ולהגביר את רגישותו בזמן עקה‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬הצטברותם של חלבונים פגומים מהווה‬
‫גורם רעיל לתא ועלולה להוביל למותו‪ .‬כשל בסילוק חלבונים ממגוון סיבות‪ ,‬כגון פגם‪ ,‬עיכוב או עומס במערכת‬
‫הפרוטאוליטית‪ ,‬ועמידותם של חלבונים לפרוטאוליזה )כגון‪ (amyloid peptides, prion proteins :‬יביאו‬
‫‪9‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫להצטברות חלבונים אלו בתא )‪ .(Halliwell & Jenner, 1998‬יתכן והימצאותם של חלבונים פגומים שניזוקו על‬
‫ידי חשיפתם להתקפה של רדיקלים חופשיים אינה תופעה משנית‪ ,‬אלא מהווה גורם מכריע בפתוגנזה של מות‬
‫התא‪ .‬חוסר היכולת של התאים הדופאמינרגים ב‪ SNpc -‬להתמודד עם החלבונים שניזוקו או עם חלבונים‬
‫מוטנטים יכולה להוביל להצטברותם‪ ,‬שקיעתם‪ ,‬ולהיווצרותם של גופיפי לואי הנחשבים כתסמין מקדים‬
‫לפרקינסון‪ .‬עדיין לא ברור האם לגופיפי לואי תפקיד ראשוני או שניוני בפאתוגנזה של המחלה‪ .‬יותר מכך‪ ,‬עדיין‬
‫לא ברור האם גופיפי לואי מהווים גורם רעיל מדרדר או אולי הנו חלק ממנגנון הגנתי שמבודד חלבונים פגומים‬
‫טוקסיים אל סביבה אינרטית ביולוגית לתא )‪.(Jenner & Olanow, 1998‬‬
‫‪ 1.4‬דרכי הטיפול במחלה‬
‫ישנן ‪ 3‬גישות טיפוליות במחלה‪ :‬גישה סימפטומאטית‪ ,‬גישה הגנתית‪ ,‬וגישה כירורגית‪.‬‬
‫‪ 1.4.1‬הגישה הסימפטומאטית‬
‫הטיפול העיקרי כיום במחלת פרקינסון הוא טיפול סימפטומאטי המתבסס בין השאר על מתן התרופה ‪L-DOPA‬‬
‫שהוא למעשה חומר המוצא של דופאמין החודר דרך מחסום דם‪-‬מוח )בניגוד לדופאמין עצמו(‪ ,‬בתוספת של מעכב‬
‫היקפי של האנזים )‪ aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC‬הקרוי‬
‫‪Carbidopa / benserazide‬‬
‫)‪.(Ogawa, 1994‬‬
‫‪ L-DOPA‬מחלישה את התסמינים הקלינים של מחלת פרקינסון ע"י כך שהיא חודרת למוח ועוברת‬
‫דקרבוקסילציה לדופאמין ובכך ישנה הפעלה של רצפטורים דופאמינרגים בסטריאטום ובניגרה‪ .‬הבעייה היא‬
‫שחלק מהחולים )בערך ‪ (20%‬אינם מגיבים לתרופה‪ ,‬כנראה עקב פולימורפיזם בגנים מסוימים הקשורים‬
‫למטבוליזם של דופאמין )‪ ,(Gilgun-Sherki et al, 2004c‬ואילו ‪ 80-100%‬מהחולים שכן מגיבים מפתחים לאחר‬
‫כ‪ 5 -‬שנות טיפול )תקופה המכונה "ירח הדבש"( תופעות לוואי הכוללות בעיקר שינויים מוטורים ותנועות בלתי‬
‫רצוניות בחלקים שונים של הגוף‪ .Levodopa induced dyskinesia (LID) -‬הירידה ביעילות התרופה נגרמת אולי‬
‫מחוסר סלקטיביות‪/‬ספציפיות למערכת הניגרוסטריאטלית‪ ,‬דבר היכול לגרום ללחץ מטבולי והפעלה של נתיבים‬
‫דופאמינרגים אחרים וכמו כן לגרום לחוסר איזון כימי והפעלת יתר של נוירוטרנסמיטורים אחרים‪ ,‬דבר שעשוי‬
‫להוביל לתופעות לוואי התנהגותיות וקוגניטיביות‪ .‬תופעת ה‪ ,LID-‬כמעט ואינה ניתנת לטיפול‪ ,‬פרט להפחתת‬
‫מינון ‪ L-DOPA‬על חשבון יעילותו הקלינית‪ ,‬אף על פי שמספר מאמרים שפורסמו לאחרונה הראו שתכשירים על‬
‫בסיס חשיש‪/‬מריחואנה );‪ (Sieradzan et al, 2001‬או חומרים נוגדי גלוטמט כגון רילוזול ) ;‪Merims et al, 1999‬‬
‫‪ (2001‬עשויים להיות יעילים בהקלה על תופעות לוואי אלו‪ .‬כמו כן ישנן עדויות מחקריות לכך שמטבוליזם של‬
‫‪ L- DOPA‬מערב יצירת מי חמצן )‪ (H2O2‬ושחרור של חומצות אמינו אקסיטטוריות‪ ,‬כגון גלוטמט ) ‪Maeda et al,‬‬
‫‪10‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫מבוא‬
‫ ובסופו של דבר למותם‬,‫ כתוצאה מכך יכול להיווצר לחץ חמצוני שיכול להביא להחמרת הנזק לתאים‬.(1997
.(Ziv et al, 1997)
‫ טיפולים נוכחיים לשליטה בסימפטומים של חולי פרקינסון‬:1 ‫טבלה‬
Treatment
Mechanism of action
Main indication
Levodopa (+ dopa-decarboxylase
inhibitors such as benserazide or
carbidopa)
Bromocriptine, pergolide,
apomorphine
Cabergoline, lisuride,
pramipexole, ropinirole
Selegiline
Precursor to dopamine
(restores intracerebral
dopamine concentrations)
Activates both D1 and D2
receptor
Agonist at D2 receptors
Single most efficacious treatment
Tolcapone, entacapone
Inhibition of catechol-Omethyl transferase
(prolongs half life of
levodopa)
Block muscarinic
cholinergic receptors
NMDA antagonist
Drug name
Anticholinergics (eg,
trihexyphenidyl)
Amantidine
Monoamine-oxidase-B
inhibitor (increases
dopamine availability)
Management of motor fluctuations
Prevention and management of motor
complications
Early stages of disease; potential
neuroprotective effects (not clinically
proven); management of motor
fluctuations
Management of motor fluctuations
Early stages of disease; may be more
effective for tremor
Early stages of disease; treatment of
levodopa induced dyskinesias
Surgical approach
Thalamotomy
Pallidotomy
Thalamic stimulation
Pallidal or subthalamic
stimulation
Reduces synchronous,
tremor-related neuronal
firing in the ventral
intermediate nucleus
Reduces excessive or
abnormal neuronal activity
in the GPi
Affects tremor-related
neuronal firing in the
ventral intermediate
nucleus
Influences abnormal
neuronal activity in the
subthalamic nucleus or
globus pallidus
Treatment of selected patients with
unilateral tremor
Effects mainly confined to the side of the
body contralateral to the lesion; treatment
of advanced PD; useful for levodopa
induced dyskinesias
Selected patients with unilateral or
bilateral tremor
Effects on all cardinal features; bilateral
treatment safer than bilateral lesions; use
in advanced disease
,L-DOPA ‫ ההעדפה היא לדחות עד כמה שניתן את הטיפול עם‬,‫עקב תופעות הלוואי הרבות המתלוות לטיפול‬
.‫ולהשתמש באגוניסטים דופאמינרגים‬
‫חומרים הגורמים‬/‫( הם תרופות‬Bromocriptine ,Pergolid ,Cabergoline ,Lisuride) ‫אגוניסטים של דופאמין‬
‫ בעיקר בנתיב‬,‫ כאשר כל אחד מהם מפעיל סוג אחר של קולטנים‬,‫להפעלה ישירה של הקולטן לדופאמין‬
11
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫הניגרוסטריאטלי‪ .‬לכל האגוניסטים שפותחו לטיפול במחלת הפרקינסון יש פעילות ראשונית על תת סוגי הקולטן‬
‫‪ ,D2‬שיש להם חשיבות )יחד עם קולטני ‪ (D1‬בנתיב התנועתי‪ ,Basal ganglia-‬וגירוי שלהם משפר‪/‬מחסל את‬
‫ההפרעות התנועתיות בחיות מעבדה ובחולים‪ .‬היתרונות בשימוש באגוניסטים של דופאמין כוללים ירידה בחמצון‬
‫העצמי של דופאמין הנגרם כתוצאה ממתן חיצוני של ‪ ,L-DOPA‬מעורבות מטבולית נמוכה במערכת העצבים‬
‫המרכזית‪ ,‬הגדלת הסלקטיביות והספציפיות ל‪ t-1/2 ,D2-like receptors -‬ארוך יותר לחלק מהאגוניסטים ביחס‬
‫ל‪ L-DOPA-‬ולכן האפקט יהיה ממושך יותר )‪ .(Watts, 1997‬נתונים אלו ועדויות מעבדתיות על‬
‫‪ Neuroprotection‬בחלק מהחומרים )כגון ‪ (Ogawa et al, 1994 -Bromocriptine‬ו‪Maruyama ) Rasagiline -‬‬
‫‪ ,(et al, 2002‬מביאים לירידה בסיכון של תופעות לוואי כגון ‪ Dyskinesia‬ותנודות מוטוריות )סיכום בטבלה ‪.(1‬‬
‫תרופות אחרות שמשמשות לטיפול במחלה כוללות‪ :‬תרופות אנטיכולינרגיות )כגון ‪ ,(Benztropine‬תרופות‬
‫המעכבות את הקולטנים הגלוטמינרגים‪ ,‬בעיקר ‪) ,NMDA‬כגון ‪ ,(Crosby et al, 2003) (amantadine‬תרופות‬
‫המעכבות את אנזימי הפירוק כגון ‪ (Wu et al, 1996) (Selegiline) MAO-B inhibitors‬ותרופות המעכבות את‬
‫האנזים ‪.(Waters, 2000) ( Tolcapone & Entcapone) COMT -‬‬
‫‪ 1.4.2‬הגישה להגנה על תאי עצב )‪(Neuroprotection‬‬
‫בטיפולים אלה מנסים להתערב ולהאט‪/‬לעצור את התקדמות הניוון העצבי‪ ,‬כמו כן מנסים למצוא דרכים להפריע‬
‫למהלך הפתולוגי הבסיסי של המוות בתאים הדופאמינרגים ב‪ .SNpc -‬החומרים המשמשים לטיפול זה כוללים‬
‫בעיקר מספר אגוניסטים דופאמינרגים המשמשים גם בטיפול הסימפטומטי‪ .‬לדוגמא ‪Ogawa et ) Bromocriptine‬‬
‫‪ ,(al, 1994; Watts, 1997‬לוכדי ברזל )‪ (Youdim et al, 1993) (Iron chelators‬ונוגדי חמצון אחרים‪ .‬מחקרים‬
‫בשנים האחרונות הראו שנוגדי חמצון רבים‪ ,‬כגון ויטמין ‪ E‬ו‪ ,C -‬אינם יעילים בהגנה על תאי העצב‬
‫הדופאמינרגים )‪.(Gilgun-Sherki et al, 2001‬‬
‫במחקרים רבים הוכח ש‪ glial-cell-line-derived neurotrophic factor (GDNF)-‬מעלה את שרידותם של תאים‬
‫דופאמינרגים בתרביות תאים )‪ (Lin et al., 1993‬ומשפר את התוצאות הפתולוגיות והתנהגותם של חיות מודל‬
‫למחלת פרקינסון )‪ .(Gash et al., 1998‬בנוסף לתוצאות ראשוניות אלו‪ ,‬במחקרים של קבוצות קטנות של חולי‬
‫פרקינסון נצפה שיפור במצבם הסימפטומטי של החולים‪ ,‬לאחר אינפוזיה רציפה של ‪ GDNF‬ישירות ל‪putamen-‬‬
‫)‪ .(Gill et al., 2003‬בעקבות כל המחקרים הנ"ל ואחרים‪ ,‬במהלך השנים האחרונות בוצעו מחקרים כפולי סמיות‬
‫)במסגרת ‪ (phase II‬בהזלפה ישירה של ‪ GDNF‬ל‪ (http://wwwext.amgen.com) putamen -‬או לחדרי המוח‬
‫‪ .(Nutt et al., 2003) intracerebroventricular‬במחקרים הנ"ל נמצא שאומנם ‪ GDNF‬פעיל ביולוגית ומשפר את‬
‫‪12‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫שרידותם של התאים הדופאמינרגים‪ .‬מאידך‪ ,‬לא נצפה שיפור קליני ארוך טווח בקבוצת החולים שקיבלה ‪GDNF‬‬
‫לעומת קבוצת הביקורת‪ .‬מאמר סקירה בנושא ראה ‪.Levy et al., 2005‬‬
‫חשוב להדגיש שלמעשה אין כיום טיפול הגנתי‪/‬מונע טוב‪ ,‬ולכן קיימת חשיבות גדולה בפיתוח חומרים שיהיו בעלי‬
‫פוטנציאל הגנתי על המוח ותאי העצב‪.‬‬
‫‪ 1.4.3‬הגישה הכירורגית‬
‫גישה זו מתחלקת ל‪ 3 -‬חלקים‪:‬‬
‫‪ (1‬ניתוח להריסת גרעינים ‪ : Ablative surgery-‬ישנם ‪ 3‬אתרי מטרה לטיפול בניתוח זה והם ‪globus pallidus‬‬
‫‪ ,Subthalamic nucleus‬והתאלמוס המוטורי‪ .‬הרס כירורגי של החלק הפנימי של ה‪ globus pallidus -‬קרוי‬
‫‪ – Pallidotomy‬תהליך זה נראה אפקטיבי לרוב הסימנים המוטורים הפרקינסונים‪ .‬הרס כירורגי של חלקים‬
‫בתאלמוס קרוי ‪ – Thallamotomy‬תהליך זה הוא ישן יחסית וממשיך להתבצע כנגד תופעת הרעד )‪(Tremor‬‬
‫במחלה‪ .‬הניתוח ב‪ Subthalamic nucleus-‬הוא חדש וניסיוני‪ .‬הרס גרעינים אלה מבטל פעילות עודפת‪/‬לא‬
‫נורמלית של אותם גרעינים‪ ,‬אך החיסרון בשיטה זו הוא שהיא איננה הפיכה )‪) (Starr et al, 1998‬טבלה ‪.(1‬‬
‫‪ (2‬גירוי חשמלי )ע"י אלקטרודות( של גרעינים ספציפים‪ .Deep brain stimulation (DBS) :‬הגירוי החשמלי‬
‫מבוצע באותם גרעינים בהם מבוצע גם ההרס‪ .‬דיווחים מהשנים האחרונות מאשרים את יעילות השיטה כנגד רעד‬
‫בהשתלת אלקטרודות לטווח הארוך )‪ (Long- term DBS‬בתאלמוס‪ ,‬אך בשאר הגרעינים השיטה היא ניסיונית‬
‫בלבד‪ .‬היתרון בשיטה זו הוא שהיא הפיכה ברגע שהגירוי חשמלי מופסק‪ ,‬וניתן להגיע לתוצאות דומות להרס‬
‫בתדירות גבוהה יחסית )‪ .(>100 Hz‬ההיגיון מאחורי שיטה זו לא פשוט ועשוי לערב הפעלה של תאי עצב ע"י‬
‫דפולריזציה‪ ,‬אבל יכול גם לעכב הפעלת תאי עצב ע"י עיכוב דפולריזציה‪ .‬בכל מקרה יש לבחון את השיטה לטווח‬
‫הארוך על מנת לעקוב אחר תופעות שעשויות להופיע לאחר מספר שנים של טיפול )‪) (Starr et al, 1998‬טבלה ‪.(1‬‬
‫‪ (3‬טיפול שיקומי‪ -‬השתלת תאים ו‪/‬או ריפוי גנטי‪ :‬מכיוון שהפתולוגיה )הבסיסית( של מחלת פרקינסון הנה די‬
‫ברורה‪ ,‬קרי ניוון בנוירונים הדופאמינרגים ב‪ SNpc-‬השולחים שלוחות אקסונליות דרך המסילות‬
‫הניגרוסטריאליות לסטריאטום‪ ,‬כלומר ידוע איזה נוירוטרנסמיטור והיכן חסר במוח – דופאמין בסטריאטום‪,‬‬
‫נעשים מחקרים רבים בשנים האחרונות על מנת לספק דופאמין ישירות ל"אתר המטרה"‪.‬‬
‫בשיטת הריפוי הגנטי המטרה להביא לידי ביטוי גנים אשר ישרו ייצור דופאמין מקומי )בסטריאטום( ע"י תאי‬
‫עצב או תאים אחרים‪ .‬כמו כן‪ ,‬החדרת גנים שונים ל‪ SNpc -‬שימנעו את תהליך ניוון תאי העצב‪ .‬במודלים של‬
‫קופים וחולדות למחלת פרקינסון הזריקו לסטריאטום וירוסים שונים ) ‪adeno-associated virus, adenovirus,‬‬
‫‪ (herpes simplex virus‬הנושאים את הגן ל‪ TH-‬ו‪/‬או את הגן ל‪ AADC-‬ממקור הומני )תמונה ‪ .(1‬הוירוסים הנ"ל‬
‫‪13‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫מסוגלים להדביק תאי עצב שאינם מתחלקים‪ .‬לאחר ההדבקה נראה שיפור קליני במודלים של חיות המעבדה‪,‬‬
‫כמו‪-‬כן הוכח שהגנים באו לידי ביטוי בסטריאטום )‪.(During et al., 1994, 1998; Horellou et al., 1994‬‬
‫בטיפול בהשתלת תאים‪ ,‬המטרה היא אכלוס מחדש של רקמת ‪ SNpc‬או של רקמת המטרה )של התאים‬
‫הדופאמינרגים מ‪ - (SNpc-‬סטריאטום‪ ,‬בתאי עצב דופאמינרגים שיחליפו את אותם תאי עצב שנהרסו‪ .‬זהו ניתוח‬
‫ניסיוני שלא מונהג עדיין כטיפול שגרתי‪ .‬במחקרים רבים בחיות מעבדה כמודל למחלת פרקינסון‪ ,‬השתילו תאים‬
‫בוגרים שאינם ממקור עצבי‪ ,‬כדוגמת‪ :‬מונוציטים )‪ ,(monocytes‬תאי שריר לב )‪ ,(myoblasts‬פיברובלסטים‬
‫)‪ (fibroblasts‬אסטרוציטים )‪ (astrocytes‬ותאים אחרים )טבלה מס' ‪ .(2‬התאים הושתלו ישירות לסטריאטום ל‪-‬‬
‫‪ caudate‬ו‪/‬או ל‪ .putamen-‬בחלק מהמקרים התאים הושתלו כמות שהם ללא הנדסה גנטית ובעבודות רבות‬
‫אחרות התאים הושתלו לאחר שהוכנסו בהם גנים לפקטורי גידול המעלים את שרידותם של תאי העצב )במאחסן(‬
‫מפני מוות‪ ,‬כגון‪ GDNF, brain-derived growth factor (BDNF) :‬או גנים האחראים ליצור דופאמין כגון‪TH, :‬‬
‫‪ .(Yadid et al., 1999; Costantiniet et al., 2000) AADC‬תהליך השתלת תאים אלו נראה לכאורה ישים‬
‫במחשבה ראשונה‪ ,‬אך אליה וקוץ בה ‪ -‬הם אינם תאי עצב‪ .‬לכן‪ ,‬תאים אלו לא נקלטו בצורה טובה במוח‪ ,‬התחלקו‬
‫במוח ללא בקרה‪ ,‬שרידותם הנה יחסית קצרה ולא הייתה אינטראקציה בין תאי עצב במוח לבנם‪.‬‬
‫בניסיונות רבים בחיות מעבדה כמודל למחלת פרקינסון והן בחולי פרקינסון נעשה שימוש נרחב ב‪adrenal -‬‬
‫‪ .(Bohn et al., 1987; Goetz et al., 1989; Freed et al., 1990) medulary cells‬לתאים ממקור האדרנל‬
‫יתרונות רבים לעומת תאים אחרים‪ ,‬הם מכילים את האנזים ‪ TH‬לייצור דופאמין‪ ,‬בעלי יכולת לפתח מורפולוגיה‬
‫ותפקוד חלקי כתאי עצב ונלקחים מהחולה עצמו ולכן ההשתלה היא אוטולוגית ללא סיכון לדחיית שתל‪.‬‬
‫התוצאות היו הטבה קלה למשך כשנתיים‪ ,‬יחד עם תופעות לוואי שונות‪ ,‬דבר שהקטין את התועלת שהופקה‬
‫מההשתלה‪ .‬בניתוחים שלאחר המוות הסתבר שברוב המקרים התאים המושתלים לא שרדו בסטריאטום לאורך‬
‫זמן )‪.(Olanow et al., 1990‬‬
‫טבלה ‪ :2‬השתלות תאים בוגרים לא עצביים במחלת פרקינסון‬
‫‪Representative References‬‬
‫‪Strategies‬‬
‫‪Cell type‬‬
‫‪Perry & Gordon, 1988; Ling & Wong, 1993‬‬
‫‪Eglitis & Mezey, 1997‬‬
‫‪Jiao & Wolff, 1992; Partridge & Davies, 1995‬‬
‫‪G.E/ encapsulated‬‬
‫‪G.E.‬‬
‫‪Primary, G.E‬‬
‫‪Monocytes‬‬
‫‪Bone marrow stem cells‬‬
‫‪Myoblasts‬‬
‫‪Lindner et al., 1995; Fisher et al., 1991‬‬
‫‪Tornatore et al., 1996; Fitoussi et al., 1998‬‬
‫‪G.E/encapsulated‬‬
‫‪Primary, G.E‬‬
‫‪Fibroblasts‬‬
‫‪Astrocytes‬‬
‫‪Bohn et al., 1987; Lindvall et al., 1987; Freed‬‬
‫‪et al., 1990; Goetz et al., 1989‬‬
‫‪14‬‬
‫‪Adrenal medulary cells‬‬
‫‪Primary/‬‬
‫‪encapsulated‬‬
‫‪G.E., Genetically engineered‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫החל משנת ‪ 1987‬החלו בניסיונות להשתיל תאים ממקור עוברי לחולי פרקינסון‪ ,‬ניסויים אלו היו יחסית מוצלחים‬
‫יותר מקודמיהם‪ .‬בשנת ‪ 2001‬דיווחו ‪ Freed‬וחבריו על תוצאות ניסוי כפול סמיות ב‪ 40-‬חולים‪ ,‬שבו הודגמה‬
‫הטבה מסוימת בכשני שלישים מהחולים‪ .‬אולם‪ ,‬בחלק מהחולים שהושתלו בהם תאים עובריים‪ ,‬הופיעו הפרעות‬
‫בתנועה )‪ ,(dyskinesia‬שלא היו קשורות בנטילת תרופות‪ ,‬תופעה שיתכן המצביעה על פעילות יתר של דופאמין‬
‫)‪ .(Freed et al, 2001‬ניסיון דומה בוצע גם לאחרונה עם תוצאות דומות )‪ .(Olanow et al, 2003‬לשיטה זו יש‬
‫יתרון תיאורטי בכך שהתאים הפגועים מוחלפים בתאים חדשים המתפקדים בצורה יעילה‪ ,‬אך בפועל השיטה היא‬
‫ניסיונית ויש לבחון את יעילותה הקלינית לטווח הארוך בחולים‪ .‬שתי הגישות הללו‪ ,‬ריפוי גנטי והשתלת תאים‪,‬‬
‫יכולות להיות גישות מקבילות אחת לרעותה או שזורות זו בזו והן כיום בשלבי ניסוי בסיסי וקליני‪ .‬בעניין השתלת‬
‫תאים ממקורות שונים במחלת פרקינסון ראה הרחבה בפרקים הבאים‪.‬‬
‫הניתוח להריסת גרעינים והגירוי החשמלי מנסים לפצות‪,‬‬
‫א‪.‬‬
‫יותר מאשר לתקן‪ ,‬על הפגם הביוכימי במחלה‪ ,‬ולעומתם‬
‫הטיפול השיקומי מנסה לתקן את הפגם הביוכימי ע"י החלפת‬
‫‪TYROSINE‬‬
‫‪Tetrahydrobiopterin (BH4) + O2‬‬
‫התאים הדופאמינרגים שהתנוונו וקידום הישרדות התאים‬
‫הדופאמינרגים שנותרו‪.‬‬
‫‪Dihydrobiopterin + H2O‬‬
‫‪Tyrosine‬‬
‫‪hydroxylase‬‬
‫המאמצים המרובים של המחקר המדעי‪ ,‬החל מ‪ 1987-‬ועד‬
‫היום‪ ,‬במציאת מקורות לתאי עצב דופאמינרגים והשתלתם‬
‫‪Dihydroxyphenylalanine‬‬
‫)‪(L-DOPA‬‬
‫לחולי פרקינסון נסב סביב השאלות המדעיות הבאות‪(1 :‬‬
‫‪Pyridoxal phosphate‬‬
‫האם תאי העצב הדופאמינרגים שורדים ויוצרים קשרים‬
‫‪CO2‬‬
‫‪Aromatic L-amino‬‬
‫‪acid decarboxylase‬‬
‫במוחו של החולה המושתל? ‪ (2‬האם רקמת המאחסן עוברת‬
‫מיזוג מלא עם התאים המושתלים? ‪ (3‬האם השתל )תאי עצב‬
‫דופאמינרגים( גורם להטבה סימפטומטית בחולה הפרקינסון?‬
‫‪DOPAMINE‬‬
‫ב‪.‬‬
‫‪ .2‬דופאמין‬
‫‪ 2.1‬ייצור )סינתזה( ופירוק דופאמין‬
‫דופאמין )‪ (DA‬הינו נוירוטרנסמיטר ) ‪Neurotransmitter,‬‬
‫‪ (NT‬המעורב בביטוי של פעילות פסיכו מוטורית ומצבים‬
‫פתולוגים שונים המובילים להפרעות תנועה והפרעות במצב‬
‫הרוח‪ .‬אותם מצבים פתולוגים נגרמים עקב עליה‪/‬ירידה‬
‫באקטיביות של המערכת הדופאמינרגית במוח עקב גורמים‬
‫‪15‬‬
‫תמונה ‪ :1‬שלבים בייצור )א( ובפירוק )ב( דופאמין‪.‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫שונים שבחלקם ידועים למדע ובחלקם הגדול לא‪ ,‬ולכן היה צורך ללמוד ולהבין בראש ובראשונה איך והיכן‬
‫דופאמין נוצר‪ ,‬ועל איזה אזורים הוא משפיע‪.‬‬
‫דופאמין משתייך לסדרת חומרים הקרויים קטכולאמינים‪ ,‬והוא מהווה כ‪ 50%-‬מהם במוח‪ .‬ייצור‬
‫הקטכולאמינים בגוף האדם נעשה בקצות העצבים הסימפטטים באזור הפרה הסינפטי ובמדולת האדרנל‪.‬‬
‫הייצור מתבצע בשביל המטבולי הבא‪ :‬בשלב הראשון חומצת האמינו טירוזין הופכת ע"י האנזים ‪tyrosine‬‬
‫)‪) hydroxylase (TH‬שלב קובע קצב( ל‪ L-DOPA -‬פעילותו דורשת נוכחות של קואנזים )‪(BH4‬‬
‫‪ .tetrahydrobiopterin‬בשלב השני מתרחשת דה‪-‬קרבוקסילציה )ע"י האנזים ‪ ,(AADC‬לקבלת דופאמין )תמונה‬
‫‪1‬א(‪ .‬זהו השלב הסופי בתאי העצב הדופאמינרגים במוח‪ .‬לפעילות תקינה של ‪ AADC‬יש צורך בהימצאות של‬
‫‪ pyridoxyl phosphate‬כקואנזים‪ AADC .‬מצוי גם בתאים אחרים כגון בתאי עצב סרוטונרגיים בהם מבצע‬
‫דקרבוקסילציה ל‪ 5-hydroxytryptophan -‬ליצירת סרוטונין‪ .‬בניגוד לתאי עצב אדרנרגים או נוראדרנרגים‪ ,‬תאי‬
‫עצב דופאמינרגים אינם מבטאים את האנזים )‪ ,dopamine β-hydroxylase (DβH‬ההופך דופאמין‬
‫לנוראפינאפרין )‪ .Norepinephrine (NE‬דופאמין עובר פירוק ע"י שני אנזימים עיקריים‪Monoaminoxidase -‬‬
‫)‪ B (MAO-B‬ו‪ Catechol-O-methyltransferase (COMT)-‬לקבלת המטבוליטים ‪Homovanillic acid‬‬
‫)‪ (HVA‬ו‪) Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) -‬תמונה ‪1‬ב(‪ 80% .‬מרמת הדופאמין במוח מצויה בגרעיני‬
‫הבסיס ולכן פגיעה באזורים אלה‪ ,‬עשויה לגרום לדלדול ברמות הדופאמין והתפתחות של הפרעות תנועה קשות‬
‫המתבטאות גם במחלת הפרקינסון‪.‬‬
‫‪ 2.2‬הקולטנים הדופאמינרגים‬
‫לקולטנים הדופאמינרגיים במוח יש חשיבות גדולה בטיפול במחלת פרקינסון והם מחולקים לשתי קבוצות‬
‫עיקריות‪:‬‬
‫‪ - D1-like receptors‬כוללים את הקולטנים‪ D1 :‬ו‪) D5 -‬מקודדים ע"י גנים על כרומוזומים ‪ 4‬ו‪ 5-‬בהתאמה(‪.‬‬
‫הקולטנים מסוג ‪ D1‬נמצאים בעיקר במערכת הלימבית ובגרעיני הבסיס בעוד שהקולטנים מסוג ‪ , D5‬נמצאים‬
‫בעיקר בהיפוקמפוס ובהיפותאלמוס‪ .‬לדופאמין זיקה גבוהה פי ‪ 10‬לקולטנים מסוג ‪ ,D5‬ביחס לקולטנים מסוג‬
‫‪ ,D1‬אבל ריכוזו של האחרון במוח גבוה יותר‪.‬‬
‫‪ -D2-like receptors‬כוללים את הקולטנים‪ D3 ,D2 :‬ו‪) D4-‬מקודדים ע"י כרומוזום ‪ .(11‬הקולטנים מסוג ‪D2‬‬
‫נמצאים בעיקר במערכת הלימבית ובגרעיני הבסיס‪ ,‬בעוד שהקולטנים מסוג ‪ D3‬נמצאים בעיקר במערכת‬
‫הלימבית ובהיפותאלמוס‪ .‬שתי קבוצות הקולטנים מקושרים לחלבוני ‪ ,G‬בעוד ש‪ D1-like receptors -‬גורמים‬
‫‪16‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫להפעלה של האנזים )‪ D2-like receptors ,adenylate cyclase (AC‬גורמים לעיכובו‪ ,‬כמו כן קיימים גם תת‬
‫סוגים של אותם קולטנים )‪.(Gottwald et al., 1997; Seeman & Vantol 1994‬‬
‫‪ 2.3‬טרנספורטרים לדופאמין‬
‫לפעילות תקינה של התאים הדופאמינרגים דרושה קליטה חוזרת של דופאמין מהמרווח הסינפטי‪ .‬בתהליך זה‪,‬‬
‫העצב הפראסינפטי מסלק במהירות את הדופאמין מן המרווח‬
‫הסינפטי באמצעות נשאים מייחודים המצויים בממברנה‬
‫)‪ ,dopamine transporter (DAT‬מולקולות אלה מעבירות את‬
‫מולקולת‬
‫הדופאמין‬
‫מן‬
‫המרווח‬
‫הסינפטי‬
‫היישר‬
‫אל‬
‫הציטופלזמה )‪ DAT .(Chen & Reith 2000‬הנו טרנספורטר‬
‫התלוי בנתרן )‪ (Na+‬וכלור )‪ (Cl-‬החוצה את ממברנת התאים ‪12‬‬
‫פעמים והחלק ‪ N- and C-termini‬נמצאים בתוך הציוטוזול‬
‫)‪.(Giros & Caron 1993‬‬
‫בנוסף ל‪ DAT-‬בתאים הדופאמינרגיים מצוי טרנספורטר‬
‫)‪ .vesicular monoamine transporter (VMAT2‬תפקידו‬
‫של ‪ VMAT-2‬הוא להכניס דופמין ציטופלסמטי‪ ,‬כמו גם‬
‫נוירוטרנסמיטורים אחרים )המופרשים מטרמינלים פרה‪-‬‬
‫סינפטיים(‪ ,‬אל תוך שלפוחיות )ואסיקולות( על מנת לאחסנם‬
‫ולשחררם באופן מבוקר בעת הצורך )‪.(Miller et al., 1999‬‬
‫כאשר טרמינלים נוירונליים עוברים דה‪-‬פולריזציה‪ ,‬סידן נכנס‬
‫תמונה ‪ :2‬תעלות וקולטנים לדופאמין‪,‬‬
‫המספרים מסמלים את סדר הפעילות‬
‫הביוכימית בתאים דופאמינרגים‬
‫לתוכם דרך משאבות סידן תלויות מתח‪ .‬עליה מקומית בסידן‬
‫גורמת לכניסה של שלפוחיות דופאמין לממברנה הנוירונלית ולשחרור הדופאמין לחלל החוץ ממברנלי ) ‪Bannon‬‬
‫‪ .(1998‬הנשא ‪ DAT‬נמצא רק בתאי עצב דופמינרגיים‪ ,‬שם הוא מבטל את הפעילות של דופאמין ע"י ספיגתו‬
‫המהירה בחזרה מן המרווח הסינפטי בחזרה לתא הפראסינפטי )‪(Sian et al., 1999; Perrier & Studer 2003‬‬
‫)תמונה מס' ‪.(2‬‬
‫‪ 2.4‬מסלולי דופאמין ייחודיים במוחו של היונק‬
‫דופאמין נפוץ בחלקי המוח השונים‪ ,‬עם ריכוזים גבוהים במיוחד באזור הסטריאטום ) &‬
‫‪Palkovits‬‬
‫‪ .(Brownstein 1989‬אכן‪ ,‬למרות שדופאמין אחראי על כ‪ 50%-‬מכלל הקטכולמינים במוח‪ ,‬יותר מ‪80%-‬‬
‫‪17‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫מהדופאמין במוח מצוי באזור הגרעינים הבאזליים וריכוזו באזור הסטריאטום גבוה מריכוזו של נוראפינפרין‪.‬‬
‫הבדלים אלה בפיזור היו העדות הראשונה לתפקודו של הדופאמין כנוירוטרנסמיטר‪ .‬טכניקות היסטו‪-‬‬
‫פלואורסנטיות למעקב אחר דופאמין ומיפוי אימונו‪-‬היסטולוגי של ‪ ,TH‬אנזים קובע קצב בייצורו‪ ,‬נוצלו על מנת‬
‫למפות את הנוירונים הדופאמינרגיים ואת מסלולי פיזור האקסונים שלהם לפי הספיגה הטרמינלית באזורי‬
‫המטרה שלהם )‪.(Sian et al., 1999‬‬
‫המחקרים הראשונים במיפוי הימצאותם של קבוצות תאים דופאמינרגים במערכת העצבים המרכזית )מע"מ(‬
‫נעשתה בשיטת היסטופלורסנציה שפותחה ע"י ‪Falck-Hillarp‬‬
‫המבוססת על מעקב אחרי ‪monoamines‬‬
‫פלורוסנטי בעקבות טיפול ב‪ .(Falck et al., 1962) formaldehyde -‬נצפה שתאים דופאמינרגים ממוקמים במוח‬
‫בשלשה אזורים עיקריים‪ :‬א( ‪) diencephalons‬חלק מהמוח הקדמי‪ ,(forebrain ,‬ב( ‪) mesencephalon‬מוח‬
‫התיכון ‪ ,(midbrain‬ג( ‪ olfactory bulb‬וברשתית )‪ .(Dahlström & Fuxe1964) (retina‬רוב התאים‬
‫הדופאמינרגים במע"מ‪ ,75-80% ,‬מצויים באזור "הבטני" )‪ (ventral‬של המוח התיכון ) ‪Wallen & Perlmann‬‬
‫‪ (2003‬בארבעה אזורים‪/‬מסלולים מרכזיים‪,VTA (A10) ,nigrostriatal (A9) ,retrorubral field (RRF) (A8) :‬‬
‫)‪ .(Ershov et al., 2002) tuberoinfundibular system (A12‬כאמור‪ ,‬תאי העצב הדופאמינרגים המצויים ב‪-‬‬
‫‪ SNpc‬שולחים שלוחות ל‪ dorsal striatum-‬קרי ל‪ caudate -‬ול‪ ,putame-‬וכך יוצרים את המסלול ה‪-‬‬
‫‪ nigrostriatal‬המעורב בבקרה על התנועות הרצוניות )‪Arts et al., 1996; Sian et al., 1999; Wurst & Bally-‬‬
‫‪ .(Cuif 2001‬גרעיני התאים ב‪ VTA-‬מקרינים דרך ה‪ median forebrain bundle-‬לאזורים הבאים‬
‫‪ ventromedial striatum‬ול‪ ,subcortical and cortical -‬כך יוצרים את המסלול ה‪ mesolimbocortical -‬המעורב‬
‫בהתנהגות רגשית ובמוטיבציה‪ .‬המסלול ‪ RRF‬מעורב בחיבורם של האזורים ‪ SNpc‬ו‪ .VTA-‬בנוסף לכך‪ ,‬קיימים‬
‫תאי עצב וטרמינלים דופאמינרגים באזורי מוח נוספים‪ ,‬ברטינה ובחוט השדרה‪ .‬איבוד תאי עצב אלו משחק‬
‫תפקיד מפתח במחלת פרקינסון ובמחלות ניוון עצבי אחרות‪ .‬בעזרת למידה על התפתחות תאי עצב‬
‫הדופאמינרגים‪ ,‬ניתן לרכוש תובנות לגבי דרכי הפעולה של מחלת הפרקינסון‪ .‬דרך אחת‪ ,‬שבה ניתן לעשות זאת‪,‬‬
‫היא בעזרת זיהוי של פקטורי שעתוק המבקרים את התמיינותם של תאי גזע לתאים הדופאמינרגים‪.‬‬
‫‪ 2.5‬גורמים המשפיעים על התפתחותם של תאי עצב דופאמינרגים‬
‫ידיעת הגורמים המשפיעים על התפתחותה של המערכת הדופאמינרגית במע"מ והבנתם יכולה להביא לפיתוחם‬
‫של אפיקי טיפול חדשים למחלת פרקינסון‪ .‬היכולת להפוך תאי גזע ממקורות שונים לתאים דופאמינרגים‪ ,‬תלויה‬
‫במידה רבה בזיהויים של פקטורים שונים אשר מבקרים את ההתמיינות של תאי עצב דופאמינרגים‪ .‬המשרנים‬
‫)‪ (organizers‬מעורבים בקביעת רשת תלת ממדית של מידע‪ ,‬המעובד ע"י תאי אב קדמון )‪ (precursor cells‬דרך‬
‫‪18‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫ביטוי או דיכוי קבוצות שונות של גורמי שעתוק‪ .‬ידועים מספר גורמי גידול ובעיקר גורמי שעתוק‪ ,‬שחיוניים‬
‫ליצירתם של תאי עצב דופאמינרגים‪ .‬גורמי שעתוק אלה נקשרים ל‪ DNA-‬ומווסתים את ביטויים של גנים‬
‫ספציפיים‪ .‬חלק מהגורמים משתתפים בהשראת הגידול של כל תאי העצב במע"מ‪ ,‬וחלקם הינם מקומיים יותר‬
‫ויופיעו רק בתאים הדופאמינרגים‪.‬‬
‫התפתחות התאים הדופאמינרגים במוח התיכון )‪ ,(midbrain‬בתקופה העוברית‪ ,‬תלויה באופן הכרחי בביטוי‬
‫)‪ fibroblast growth factor 8 (FGF8‬באזור ה‪ midbrain-hindbrain -‬ו‪ sonic hedgehog (Shh) -‬בפלטת‬
‫הרצפה )‪) (floor plate‬תמונה ‪ .(3‬מחקרים שנעשו על השתלת רקמות עצביות מוקדמות מצביעים על כך ש‪FGF8-‬‬
‫ו‪ Shh-‬יעילים לאינדוקציה חיצונית של תאי עצב דופאמינרגים בציר העצבי ) ;‪Ye et al., 1998; Rosenthal 1998‬‬
‫‪ .( Hynes & Rosenthal, 1999‬יחד עם זאת‪,‬‬
‫פקטורים אלה משפיעים בחלון התפתחותי‬
‫קצר ויש השהיה משמעותית בין היענות ל‪-‬‬
‫‪Shh‬‬
‫וביטוי‬
‫מרקרים‬
‫פוסט‬
‫מיטוטיים‬
‫המאפיינים נוירונים דופאמינרגיים‪ ,‬כגון ‪.TH‬‬
‫גילויים אלה מעידים על כך שקו‪-‬פקטורים‬
‫נוספים הפועלים במורד הזרם )‪(downstream‬‬
‫וביחד‬
‫עם‬
‫‪Shh‬‬
‫ועם‬
‫‪FGF8‬‬
‫דרושים‬
‫לספציפיקציה של תאי עצב דופאמינרגים‬
‫)‪.(Perrier & Studer 2003‬‬
‫חשוב לציין‪ ,‬שמחקרים מדווחים רק על סמן‬
‫אחד‪ ,‬הייחודי לתאי אב קדמון דופאמינרגים‬
‫תמונה ‪ :3‬התפתחות תאי עצב דופאמינרגים במע"מ בימים ‪ E8‬ו‪-‬‬
‫‪ E9‬בעכברים‪fp = floor plate, is = isthmus, F = forebrain, M .‬‬
‫‪(Simon et al., 2003) .= midbrain, H = hindbrain‬‬
‫מתחלקים‪) Aldh1 .‬הנקרא בעבר ‪(AHD2‬‬
‫הוא ‪ ,aldehyde dehydrogenase‬המסוגל לעבד ‪ retinaldehyde‬לחומצה רטינואית )‪(retinoic acid, RA‬‬
‫)‪ ,(Lindahl & Evces, 1984‬מתבטא במוח התיכון הונטרלי כבר ביום ‪ E9.5‬בעובר עכבר )‪.(Wallen et al., 1999‬‬
‫ביטויו תחום לתאים מתחלקים בנוירו‪-‬אפיתל של המוח התיכון הונטרלי‪ ,‬אך הוא ממשיך להתבטא גם לאחר‬
‫הפסקת החלוקה ומאוחר יותר נמצא יחד עם סמנים פוסט‪-‬מיטוטים‪ ,‬הכוללים ‪.(Wallen et al., 2001) TH‬‬
‫ממצאים אלה מעלים את הסברה‪ ,‬שחומצה רטינואית מהווה סיגנל מוקדם נוסף המעורב בהתמיינות‬
‫דופאמינרגית‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬למרות שמחקרים שונים הראו כי רטינואידים מקדמים הבשלה של שורת התאים‬
‫‪19‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫הדופאמינרגית )‪ ,(Castro et al., 2001‬עדיין דרושים נתונים ברורים בדבר מעורבותם בהתפתחות תאים‬
‫דופאמינרגים בגוף החי )‪.(Wallen & Perlmann 2003) (in vivo‬‬
‫למרות שלא ידועים עדיין הפרטים של כל )‪ (cascade‬הגנים המשתתפים בספציפיקציה של המוח התיכון הונטרלי‪,‬‬
‫השחקנים הבאים התגלו כמשפיעים על התהליך )תמונות ‪ 3‬ו‪:(4-‬‬
‫גורמי שעתוק ‪-‬‬
‫‪engrailed (En1 & En2), paired box gene 2 or 5 (Pax2/5), orthodenticle homolog 2 (Otx2), nuclear‬‬
‫‪receptor related-1(Nurr1), LIM homeobox transcription factor 1 beta (Lmx1b), pituitary homeobox‬‬
‫‪3 (Pitx3), Hes, Hnf3α and β‬‬
‫גורמי גדילה ‪-‬‬
‫‪FGF8, Shh, BDNF, GDNF, transforming growth factor-α or β3 (TGF-α or β3), wingless-type‬‬
‫)‪MMTV integration site family member 1 (Wnt1) (Smidt et al., 2003) von Hippel-Lindau (VHL‬‬
‫‪(Yamada et al., 2003).‬‬
‫עדות גנטית‪ ,‬בעכברים‪ ,‬מראה שאיבוד תפקודם של גורמי שעתוק )‪Gastrulation brain homeo box 2 (Gbx2‬‬
‫‪ Pax2, Otx2, Pax5, En1/En2‬או של המולקולה המשתתפת במעבר סיגנלים ‪ ,Wnt1‬גורם להפרעות באזור המוח‬
‫התיכון‪-‬האחורי המשפיע על התפתחות תאי עצב דופאמינרגים ) ‪Rhinn & Brand, 2001; Wurst & Bally-Cuif‬‬
‫‪ .(2001‬בנוסף לכך‪,‬‬
‫חלק מגורמי שעתוק‬
‫מתבטאים‬
‫אלו‬
‫בנוירו‪-‬אפיתל מוקדם‬
‫של‬
‫המוח‬
‫ביטוי‬
‫התיכון‪.‬‬
‫מוקדם‬
‫זה‬
‫משקף את תפקידם‬
‫ביצירתו‬
‫וקביעת‬
‫דפוסו של אזור המוח‬
‫התיכון‪-‬האחורי ולא‬
‫את תפקידם ביצירה‬
‫של זהויות עצביות‬
‫תמונה ‪ :4‬מועד הופעתם של גנים עצביים דופאמינרגים במוח התיכון בעכבר ותוצאות‬
‫‪ knock–out‬של גורמי שיעתוק מרכזיים )‪(Riddle & Pollock 2003‬‬
‫‪20‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫ייחודיות )‪ Rosenthal .(Joyner 1996‬וחבריו ביצעו אנליזה נוספת באזור המשרן של המוח התיכון והציעו מודל‬
‫על פיו ‪ Pax2‬אחראי לאינדוקציה מוקדמת של ‪ FGF8‬ורשת של ‪ Wnt-1, En1/En2, Pax2/Pax5‬ו‪FGF8-‬‬
‫מייצבים ומדגישים את תחום הביטוי של ‪.(Ye et al., 2001) FGF8‬‬
‫גורמי השעתוק שמתבטאים בתאי עצב דופאמינרגים של המוח התיכון כוללים את הפקטורים ‪ ,Nurr1, Lmx1b‬ו‪-‬‬
‫‪ Nurr1 .Pitx3‬שייך למשפחה "יתומה" של רצפטורים גרעיניים )‪Law et al., ) (orphan nuclear receptor family‬‬
‫‪ SNpc .(1992‬עשיר יחסית בפקטור שעתוק זה‪ ,‬שהוכח כחשוב להתפתחותם של התאים הדופאמינרגים‬
‫)‪ .(Zetterstrom et al., 1997; Backman et al., 1999; Le et al., 1999; Wallen et al., 1999‬בנוסף לכך‪,‬‬
‫‪ ,Nurr1‬הקריטי להתפתחות תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬משפעל ישירות את פעילות הפרומוטר של ‪ TH‬באופן התלוי‬
‫בסוג התא‪ ,‬בזמן שהוא אינו משפיע על הפרומוטר של ‪ .(Kim KS. et al., 2003) DβH‬לחזק תוצאות אלה‪,‬‬
‫הפרומוטר של ‪ TH‬בלבד מכיל רצפי מוטיב מרובים ההומולוגים למוטיב הידוע ‪Nurr1-binding motif, NBRE‬‬
‫)‪ .(Kim KS. et al., 2003‬מכוון ש‪ Nurr1-‬מעורב בספציפיקציה פנוטיפית‪ ,‬בגוף החי )‪ ,(in vivo‬של תאי עצב‬
‫דופאמינרגים במוח התיכון ) ‪Zetterstrom et al., 1997; Castillo et al., 1998; Saucedo-Cardenas et al.,‬‬
‫‪ (1998‬ייתכן שביטוי אקסוגני של גורם שעתוק זה יזרז את ההתמיינות הדופאמינרגית‪ .‬בשנים האחרונות‪ ,‬נחקר‬
‫ביטויו של ‪ Nurr1‬בתאי אב קדמון עצביים רקומביננטיים‪ ,‬כגון‪ :‬תאי אב קדמון מהיפוקמפוס בוגר ) ‪Sakurada et‬‬
‫‪ (al., 1999‬ושורת תאים אינסופית )‪ (immortalized‬שמקורה בצרבלום ‪ .(Wagner et al., 1999) C17.2‬מחקרים‬
‫אלה הראו‪ ,‬שביטוי חיצוני של ‪ Nurr1‬גורם לאינדוקציה של ‪ ,TH‬לכאורה ע"י מנגנונים שונים‪ Sakurada .‬וחבריו‬
‫)‪ (1999‬הראו כי ‪ Nurr1‬נקשר ישירות לפרומוטר של הגן ל‪ TH-‬וכך גורם לאינדוקציה של ‪ ,TH‬ללא התמיינות‬
‫דופאמינרגית וללא ביטוי סמנים דופאמינרגים אחרים‪ .‬בסתירה לממצאים אלה‪ Wagner ,‬וחבריו )‪ (1999‬הראו‬
‫ש‪ Nurr1-‬יכול לעודד ביטוי ‪ TH‬בתאי ‪ C17.2‬רק לאחר גידול בתרבית משותפת )‪ (co-culture‬עם אסטרוציטים‬
‫מזנצפליים ונטרליים מסוג ‪ .(ventral mesencephalic type-1 astrocytes) 1‬מכוון שהשתמשו בתאי אב קדמון‬
‫מכוונים חלקית )‪ (partially committed‬בשני המחקרים‪ ,‬ניתן לייחס את ההבדלים בתצפיות אלה למאפיינים‬
‫ספציפיים של התאים האלה‪ .‬לא ברור עדיין כיצד ‪ Nurr1‬מעורב בהתמיינותם של תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬אך‬
‫נראה כי הוא מעורב בויסות ביטוי של ‪ TH, DAT‬ו‪Sakurada et al., 1999; ) tyrosine kinase receptor cRET -‬‬
‫‪.(Sacchetti et al., 2001; Wallen et al., 2001‬‬
‫‪21‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫תאי עצב דופאמינרגים מזנצפלים )‪ (mesencephalic‬הנם תאי עצב היחידים המבטאים את הגן ‪ .Pitx3‬בלעדיות‬
‫כזאת הנה יחידה במינה במוח ורומזת על כך ש‪ Pitx3-‬הוא בעל תפקיד ייחודיי לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫מזנצפלים‪ .‬אלמנטים המגיבים ל‪ Pitx3-‬תוארו בפרומוטר של ‪ .(Cazorla et al., 2000) TH‬יחד עם זאת‪ ,‬אין‬
‫נתונים על רכישה או איבוד של פעילות המסוגלים לתמוך בתפקידו של ‪ Pitx3‬בהתמיינות של תאי עצב‬
‫דופאמינרגים במוח התיכון )‪.(Smidt et al., 1997; Saucedo-Cardenas et al., 1998‬‬
‫‪ Lmx1b‬שייך למשפחה ‪ LIM homeodomain‬ומבקר את יצירת הדפוס הדורסו‪-‬ונטרלי בגפיים המתפתחות‪.‬‬
‫נראה כי ‪ Lmx1b‬הנו חלק מרשת ‪ cross regulatory‬של פקטורים האחראיים לייצוב ולשמירה על ביטוי של‬
‫‪ FGF8‬באזור הגבול של המוח המרכזי והאחורי )‪ .(Adams et al., 2000‬עכברים מוטנטיים‪ ,‬שאינם מבטאים‬
‫‪ (Lmx1b null mutant mice) Lmx1b‬אינם מבטאים ‪ Pitx3‬אך מראים ביטוי התחלתי של ‪ TH‬ו‪ .Nurr1-‬יחד עם‬
‫זאת‪ ,‬תאי ‪ TH‬במוח התיכון של עכברים מוטנטיים ל‪ Lmx1b -‬מתים לפני הלידה )‪.(Smidt et al., 2000‬‬
‫גני ‪ engrailed‬ביונקים‪ En1 ,‬ו‪ ,En2-‬הנם גורמי שעתוק ‪ .homodomain‬בעכבר‪ ,‬שני גני ‪ engrailed‬מתבטאים‬
‫במוח התיכון במהלך יצירת צורה )‪ (morphogenesis‬מוקדמת ביום ‪) E9‬תמונות ‪ 5‬ו‪ (6-‬וחיוניים לשמירה על מבנה‬
‫אזור הגבול של המוח התיכון והאחורי ) ‪Joyner & Martin 1987; Danielian & McMahon, 1996; Joyner,‬‬
‫‪ .( 1996; Wurst & Bally-Cuif, 2001‬דפוסי ביטויים חופפים בחלקם אך תזמונם של שני הגנים שונה‪ .‬הביטוי‬
‫של הגן ‪ En1‬מתחיל בשלב של סומיט )‪ (somite‬אחד בנוירו‪-‬אפיתל אנטריורי‪ ,‬היוצר בשלב יותר מאוחר את אזור‬
‫הצומת של המוח התיכון‪-‬אחורי‪ .‬התבטאותו ‪ En2‬מתחיל באופן דומה בשלב מאוחר יותר של חמישה סומיטים‬
‫)‪ .(Smidt et al., 2003‬הגנים ‪ En1‬ו‪ En2-‬מראים פאזה שנייה של ביטוי המוגבלת ליצירת תאים דופאמינרגים‬
‫מסביבות השלב ה‪ ,E11-‬קצת לאחר אינדוקציה של ‪ .(Wallen & Perlmann 2003) Nurr1‬בזמן שהשמטה בודדת‬
‫של גנים אלה )‪ (single knockouts‬לא גורמת למחסור בתאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬השמטה מעורבת שלהם‬
‫)‪ (compound knockouts‬מביאה לבקרה שלילית )‪ (down regulation‬על ביטוי של ‪ TH‬בשלב העוברי המאוחר‬
‫ולחסר שלו ב‪ .(Simon et al., 2001) E14 -‬לא דווח על דפוסי ביטוי של ‪ Nurr1, Lmx1b‬ו‪ Pitx3-‬בחיות אלה ולא‬
‫ידוע האם האיבוד של ‪ TH‬נובע מבקרה שלילית או ממוות תאי מוגבר‪ .‬קשר מעניין בין גני ‪ En1, En2‬ומחלת‬
‫הפרקינסון הוצע לאחר שנמצא כי הביטוי של ‪ ,α-synuclein‬הקשור גנטית לחלק ממקרי מחלת פרקינסון‪ ,‬מבוקר‬
‫ע"י ‪ En1‬ו‪ .En2-‬היפותזה זו מצביעה על כך‪ ,‬ששונות גנטית בגני ה‪ engrailed-‬יכולה להוות גורם סיכון להופעת‬
‫מחלת הפרקינסון )‪.(Smidt et al., 2003‬‬
‫‪22‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪,Pitx3‬‬
‫‪Aldh1‬‬
‫‪Shh‬‬
‫‪FGF8‬‬
‫תמונה ‪ :5‬גורמי שיעתוק וגדילה המשפעים על התפתחות תאי עצב דופאמינרגים )‪(Huang et al., 2004‬‬
‫לסיכום‪ ,‬בזמן שפעילותו של ‪ Pitx3‬נחקרה רק מעט‪ ,‬גורמי שעתוק ‪ ,En1/En2 ,Lmx1b‬בנוסף ל‪ ,Nurr1-‬נמצאו‬
‫חיוניים להתמיינות תקינה ותחזוקה של הפנוטיפ העצבי הדופאמינרגי‪ .‬הבנת המנגנונים וגל )‪ (cascades‬הסיגנלים‬
‫המבוקרים המשפיעים על ספציפיקציה והמעורבים בהתפתחות של תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬הנם בעלי שייכות‬
‫וחיוניות מן המדרגה הראשונה במחקר של תאי גזע )תמונה ‪ .(5‬אכן‪ ,‬למרות שהבנתנו הנוכחית של הגורמים‬
‫המשפיעים על התפתחות תאי עצב דופאמינרגים היא מוגבלת‪ ,‬ידע חדש כבר הוכח כשימושי בניסיונות להנדס‬
‫תאי עצב דופאמינרגים ‪ .in vitro‬בפרקים הבאים יתוארו ניסויים‪ ,‬שבהם התגלו גורמי שעתוק אלה במהלך‬
‫השראת התמיינות של תאי גזע עובריים או מזנכימלים לתאי עצב דופאמינרגים‪.‬‬
‫‪ .3‬תאי גזע‬
‫תאי גזע )‪ (stem cells‬הינם תאים בעלי יכולת ריבוי‪ ,‬התחדשות‪ ,‬והתמיינות לסוגי תאים אחרים‪ .‬התכונה‬
‫האופיינית הראשונה של תאי גזע הינה היכולת של התרבות עצמית בלתי מוגבלת בתרבית תאים‪ .‬התכונה‬
‫השנייה‪ ,‬יכולת התחדשות סימטרית עצמית‪ .‬התכונה השלישית הינה יכולת התמיינות לשורות שונות של תאים‬
‫לוּריפּוֹטנטיות )‪ .(pluripotency‬בפועל‪ ,‬תכונות אלה‬
‫ֶ‬
‫)לאמור ‪ -‬יצירת תא ָבּשל מתא‪-‬אב כללי(‪ ,‬תכונה זו נקראת ְפּ‬
‫באות לידי ביטוי בחלוקה אסימטרית של תאי גזע שבסופה מתקבל תא גזע נוסף ופרוגניטור לא מתחדש‪ ,‬בעל‬
‫פוטנציאל התמיינות מוגבל יותר‪ .‬תכונות אלו של התאים מקנות להם את הפוטנציאל לשמש הן כמקור בלתי‬
‫נדלה לסוגי תאים שונים לצורכי השתלה והן לחקר שלבי ההתפתחות העוברית הראשונים כפי שיוסבר בהמשך‬
‫הדברים‪ .‬התחום המתפתח של ביולוגית תאי הגזע‪ ,‬ומחקר בשימוש בתאי גזע צבר תנופה ועניין רב בשנים‬
‫האחרונות‪ ,‬בעיקר הודות לתכונותיהם הייחודיות של תאי הגזע‪ ,‬ההופכות אותם לפתרון פוטנציאלי לבעיית‬
‫אספקת הרקמות והשתלת תאים במחלות ניווניות שונות כדוגמת פרקינסון וסוכרת מטיפוס ‪ .1‬כאמור‪ ,‬לתאי גזע‬
‫יש פוטנציאל עצום להתפתח לסוגים שונים של תאים‪ .‬תאים אלה‪ ,‬המתפקדים כמעין מערכת תיקון בגוף‪ ,‬יכולים‬
‫בתיאוריה להתחלק בצורה לא מוגבלת על מנת לחדש את מלאי התאים בגוף במהלך כל חייו‪ .‬בחלוקה של תא גזע‪,‬‬
‫כל תא חדש שנוצר‪ ,‬נשאר תא גזע או הופך לתא אחר בעל תפקוד יותר ספציפי‪ ,‬כגון‪ :‬תא שריר‪ ,‬תא דם או תא‬
‫מוח‪ .‬אבטיפוס של תאי הגזע‪ ,‬הנוצר בשלב הכי מוקדם בהתפתחות העוברית‪ ,‬הוא תא גזע עוברי ) ‪embryonic‬‬
‫‪23‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ .(stem cells‬תאים פלוריפוטנטים )‪ (pluripotent‬אלה ניתן לבודד ממסת התאים הפנימית של הבלסטוציסט‬
‫]תאים טוטיפוטנטים )‪ [(totipotent‬או מתאים קדומים של שורת תאי המין‪ .‬מאוחר יותר בהתפתחות‪ ,‬תאי הגזע‬
‫הייחודיים לרקמה‪ ,‬המהווים חלק מאיבר מסוים והנמצאים תחת תנאים פיזיולוגיים מתמיינים רק לתאים בעלי‬
‫פנוטיפ המתאים לאותה הרקמה‪ .‬שלבים התפתחותיים החוצצים בין תאי גזע עובריים לבין תאי גזע ספציפיים‬
‫לרקמה אינם ידועים‪ .‬מקורות שונים לתאי גזע ראה טבלה מס' ‪ .3‬בשנים האחרונות התפרסמו מחקרים רבים‬
‫המראים את יכולתם המפתיעה של תאי גזע ממקורות שונים )עובריים ובוגרים( להתמיין לרקמות שונות‪,‬‬
‫כדוגמת‪ :‬דם‪ ,‬רקמת שריר‪ ,‬עצם‪ ,‬רקמת חיבור‪ ,‬עצב ואחרים‪ .‬השרייה מכוונת של תאי גזע לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים והשתלתם כטיפול במחלת פרקינסון מהווה אתגר עצום ועדיפות עליונה ניתנת למאמצים למצוא‬
‫את המקור הטוב ביותר לתאים המושתלים‪ .‬אסטרטגיית החלפת תאים תהיה יעילה לטיפול במחלת פרקינסון רק‬
‫אם התאים המושתלים יהיו בעלי יכולות הזהות לתאי עצב דופאמינרגים מקוריים‪ ,‬כגון‪ :‬ייצור‪ ,‬הפרשה מבוקרת‪,‬‬
‫קליטה מחדש ומטבוליזם של הדופאמין‪ .‬בפרקים הבאים אסקור את יכולתם של תאי גזע‪ ,‬עובריים ובוגרים‬
‫ממקור אנושי‪ ,‬להתמיין לתאי עצב דופאמינרגים והפוטנציאל הרפואי הגלום בכך לריפוי מחלת פרקינסון‪.‬‬
‫טבלה ‪ :3‬מקורות שונים לתאי גזע באדם‬
‫‪Restriction‬‬
‫‪Source‬‬
‫‪Cell‬‬
‫‪Pluripotent‬‬
‫‪Pluripotent‬‬
‫)‪Blastocyst (5-7 day embryo‬‬
‫‪6 week embryo‬‬
‫‪Pluripotent or multipotent‬‬
‫‪Pluripotent or multipotent‬‬
‫‪8 week and older embryo‬‬
‫‪Cord blood or placenta‬‬
‫‪Pluripotent or multipotent‬‬
‫‪Pluripotent‬‬
‫‪Infant and adult human‬‬
‫‪Teratocarcinoma (germ cells‬‬
‫)‪tumor‬‬
‫‪Embryonic stem (ES) cells‬‬
‫‪Embryonic germ (GS) cells‬‬
‫)‪(primordial germ cells‬‬
‫‪Fetal tissue stem cells‬‬
‫‪Cord blood stem cells‬‬
‫‪Placental stem cells‬‬
‫‪"Adult" stem cells‬‬
‫)‪Embryonal carcinoma (EC‬‬
‫‪cells‬‬
‫‪ .4‬מתאי גזע לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫ישנן שתי שיטות לשימוש בתאי גזע לצורך השתלות במחלת הפרקינסון‪ .‬בשיטה אחת‪ ,‬התאים עוברים התמיינות‬
‫לתאי עצב דופאמינרגים ‪ , in vitro‬לפני ההשתלה‪ .‬לכן‪ ,‬תאי גזע מהווים פוטנציאלית מקור בלתי נלאה ליצור תאי‬
‫עצב דופאמינרגים‪ .‬ניתן לתקנן את הכנת התאים ולבצע בקרת איכות תוך התחשבות בשרידות וטוהר התאים‪.‬‬
‫בשיטה השנייה‪ ,‬משתילים את תאי גזע או תאי אב קדמון כמות שהם לתוך סטריאטום או ‪ .SNpc‬בעקבות‬
‫החסכים של תאים דופאמינרגים במוח מצד אחד והפרשות גורמי גידול ע"י התאים בסביבת ההשתלה‪ ,‬התאים‬
‫המושתלים מתמיינים לתאי עצב דופאמינרגים ‪ ,in vivo‬לאחר השתלה‪ .‬תאי עצב אלה עשויים לעבור אינטגרציה‬
‫טובה יותר ביחס לתאי עצב דופאמינרגים עובריים )שהופקו מעובר( ובמצב אידיאלי לשקם את המסלול ה‪-‬‬
‫‪ .nigrostriatal‬כדי לאפשר זאת‪ ,‬המנגנונים שמכוונים את תאי הגזע הצעירים להתמיין לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫‪24‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫החסרים‪ ,‬חייבים לפעול גם במוחם של החולים במחלת פרקינסון ‪(Lindvall & Hagell 2002b; Lindvall‬‬
‫)‪.2003‬‬
‫באופן תיאורטי‪ ,‬ניתן לייצר תאי עצב דופאמינרגים מארבעה מקורות שונים של תאי גזע‪ :‬תאי גזע עובריים‬
‫מביצית מופרית‪ ,‬תאי גזע עצביים ממוחו של עובר או של בוגר‪ ,‬תאי גזע בדם חבל טבור ומתאי גזע המצויים‬
‫ברקמות אחרות בבוגר‪ .‬השאלה הקריטית היא‪ ,‬האם תאי העצב המיוצרים הופכים לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫מתפקדים‪ .‬נושא נוסף‪ ,‬שלא נפתר עד כה‪ ,‬הוא‪ ,‬האם תאי עצב הלא דופאמינרגים ותאי גליה )‪ ,(glia‬הנמצאים‬
‫באופן שגרתי בשתלים מזנצפלים )‪ ,(mesencephalic grafts‬שהיו בשימוש בחולי פרקינסון‪ ,‬חשובים להתמיינות‬
‫ולתפקוד של תאי העצב הדופאמינרגים‪ .‬באם התשובה חיובית‪ ,‬אזי יש לדאוג לכך שבמהלך ההתמיינות לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים תהינה גם התמיינות לתאי התמיכה האחרים‪ .‬באם התשובה שלילית‪ ,‬מהלך ההתמיינות צריך‬
‫להוביל לקבל אוכלוסיית תאי עצב דופאמינרגית הומוגנית )‪.(Lindvall & Hagell, 2002b; Lindvall, 2003‬‬
‫מבין כל מתודולוגיות הטיפול במחלת פרקינסון )ראה פרק ‪ ,(1.4‬המהפכה השנייה בהבנת אופציות הטיפול‬
‫במחלת הפרקינסון )הראשונה הייתה הגילוי של ‪ (L-Dopa‬היא השתלת תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬שיטה שפתחה‬
‫אפיק חדש לשיקום המוח‪ .‬במקום שליטה כימית על המערכת המתנוונת‪ ,‬שיטה זו מאפשרת שיקום וחידוש של‬
‫המערכת הדופאמינרגית ע"י השתלת קבוצות תאים חדשים המבצעים את תפקודם השגרתי של התאים שנהרסו‬
‫)‪ .(Isacson 2002‬ביולוגיה של תאי הגזע‪ ,‬הקשורה בהתפתחות המוח ותיקונו‪ ,‬מיושמת ע"י שיטות המשתמשות‬
‫בתאי גזע עובריים או בתאי גזע בוגרים‪ ,‬המסוגלים פוטנציאלית ליצור תאי עצב חדשים‪ ,‬לאחר גידול סלקטיבי‬
‫במערכת תרביות תאים או במוח החי‪ .‬האפשרות ליצור תאי עצב דופאמינרגים חדשים נחקרה בגישות שונות תוך‬
‫שימוש בתאי גזע ממקורות שונים‪.‬‬
‫‪ .5‬תאי גזע עובריים כמקור לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫‪ 5.1‬תאי גזע עובריים‬
‫תחילתו של האדם ובעלי החיים בחיבור בין ביצית נקבית לתא‪-‬זרע זכרי‪ .‬בתום תהליך ההפריה נוצר תא אחד‪,‬‬
‫שממנו ייווצר בהמשך כל האורגניזם החי‪ .‬לאחר ההפריה מתחיל העובר )המורכב בשלב זה מתא אחד בלבד( את‬
‫מסלול ההתפתחות שלו‪ .‬במהלך ההתפתחות עומדות בפני העובר שתי "משימות"‪ :‬הראשונה ‪ -‬הגדלת מספר‬
‫התאים‪ ,‬על‪-‬ידי חלוקות תאים רבות והשנייה ‪ -‬יצירת רקמות ואברים שונים‪ .‬השלב הראשון בהתפתחות‪ ,‬בו‬
‫סטוֹציסט )תמונה ‪.(6‬‬
‫ְ‬
‫נוצרות אוכלוסיות מוגדרות של תאים הוא שלב המכונה ְבּ ַל‬
‫‪25‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫בשלב זה נוצרת אוכלוסיית תאים פנימית ‪(inner cell‬‬
‫‪A.‬‬
‫)‪ mass‬אשר ממנה עתידות להתפתח כל רקמות העובר‬
‫גופו‪ ,‬ואוכלוסייה נוספת של תאים אשר ממנה עתידות‬
‫להתפתח הרקמות החוץ העובריות )כגון החלק העוברי‬
‫השׁליה(‪ ,‬רוב תאי הבלסטוציסט מצויים בשכבה זו‪.‬‬
‫של ִ‬
‫‪B.‬‬
‫התאים המופקים מתוך הבלסטוציסט נקראים תאי‪-‬גזע‬
‫עובריים )‪ ,(embryonic stem cells‬ומספרם ביום ה‪5 -‬‬
‫מההפריה הוא ‪ 30-35‬תאים‪ .‬תאים אלו ייצרו בעתיד את‬
‫כל סוגי התאים והרקמות של האורגניזם‪.‬‬
‫לפני למעלה מעשרים שנה פותחה טכניקה המאפשרת‬
‫להפיק תאים מתוך הבלסטוציסט של עכבר הנקראים‬
‫"תאי גזע עובריים"‪ ,‬תאים שניתן לגדלם בתרבית‬
‫)‪ .(Evans & Kaufman 1981; Martin1981‬לאחר‬
‫הסרתם מהבלסטוציסט‪ ,‬תאים אלה יכולים להתרבות‬
‫"עד אין סוף" במדיום ייחודיי ) ‪Evans & Kaufman‬‬
‫‪ .(1981‬כאמור‪ ,‬תאים אלה מתאפיינים בשלוש תכונות‬
‫עיקריות‪ :‬התרבות עצמית בלתי מוגבלת בתרבית תאים‪,‬‬
‫יכולת התחדשות סימטרית עצמית ויכולת התמיינות‪.‬‬
‫תאי גזע עובריים אנושיים הופקו לראשונה רק בשלהי‬
‫שנת ‪ 1998‬על ידי שתי קבוצות חוקרים במקביל‪ .‬קבוצה‬
‫אחת הפיקה תאי גזע מעוברים ) ‪Shamblott et al.,‬‬
‫‪ ,(1998‬וקבוצה שניה הפיקה תאי גזע מביציות מופרות‬
‫תמונה ‪ :6‬הפקת תאי גזע עובריים אנושיים‬
‫‪ .A‬בלסטוציסט ותאי גזע עובריים שהופקו מתוכו‬
‫)‪ .B .(Cowan 2004‬סכמה מהפקת תאי גזע עובריים‬
‫עד להתמיינותם לתאים בוגרים )‪(Gearrt 2004‬‬
‫חוץ‪-‬רחמיות בשלב התפתחות מוקדם )‪ .(Thomson et al., 1998‬הפקת תאי הגזע העובריים מבני אדם התאפשרה‬
‫רק בשנים האחרונות זאת משתי סיבות עיקריות‪ :‬ראשית‪ ,‬לפני המעֲבר להפקת תאי גזע עובריים מאדם נעשו‬
‫ניסיונות להפיק את התאים מקופים‪ .‬הפקה מוצלחת של תאי גזע עובריים מקופים‪ rhesus ,‬ולאחר מכן מקופי‬
‫‪ marmoset‬וקופי ‪Thomson et al., 1995, 1996; Thomson & Marshall 1998; Suemori et ) cynomolgous‬‬
‫‪ ,(al., 2001‬נתגלתה כקשה יותר מהפקתם מעכברים‪ ,‬דבר שגרם לעיכוב במעבר לשלב הבא‪ ,‬הפקת התאים מבני‬
‫אדם‪ .‬אותן שיטות נוצלו להפקה של תאי גזע עובריים אנושיים זמן קצר לאחר הפקת תאי גזע עובריים מקופים‪.‬‬
‫‪26‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫שנית‪ ,‬המקור להפקת תאי גזע עובריים מבני אדם במרבית המקרים הוא עוברים עודפים המתקבלים בהפריות‬
‫חוץ גופיות )"הפריות מבחנה"(‪ ,‬ולכן הפקת תאי גזע עובריים מבני אדם הייתה תלויה בשיפור טכניקות ההפריה‬
‫החוץ‪-‬גופית ושימור העוברים‪ ,‬ובבעיות אתיות וחוקיות של שימוש בעוברי אדם‪ ,‬ולו בשלבי התפתחותם הממש‬
‫ראשוניים‪ .‬כשנתיים מאוחר יותר‪ ,‬הצליחו לראשונה באמצעות השרייה מכוונת‪ ,‬בתרביות מעבדה‪ ,‬למיין תאי גזע‬
‫עובריים אנושיים לתאים עצב בוגרים )‪) (Reubinoff et al., 2000‬תמונה ‪.(6‬‬
‫‪ 5.1.1‬מקורות לתאי גזע עובריים‬
‫קיימים ארבעה מקורות אפשריים לקבלת תאי‪-‬גזע עובריים‪:‬‬
‫א( ביציות מופרות עודפות‪ :‬בשיטות הפריה חוץ‪-‬גופית מפרים במבחנה ביצית בתא זרע על מנת להשתילו ברחם‬
‫אישה‪ .‬מקובל כיום לשאוב מספר ביציות מהאישה התורמת את הביצית‪ ,‬ולהפרות את כולן‪ .‬בתהליך ההפריה‬
‫החוץ‪-‬גופית מחזירים לרחם אישה רק חלק מהביציות המופרות‪ ,‬בעוד שהאחרות נותרות בהקפאה עמוקה‪ .‬אם‬
‫לא חל הריון בהחזרה הראשונה‪ ,‬ניתן להשתמש בביציות המופרות המוקפאות למחזור הפריה נוסף‪ ,‬מבלי שיהיה‬
‫צורך לשאוב ביציות נוספות מהאישה התורמת‪ .‬אכן‪ ,‬יש שההחזרה הראשונה מצליחה להביא להריון וללידה‪ ,‬ובני‬
‫הזוג אינם מעוניינים עוד בביציות המופרות המוקפאות‪ .‬יתר על כן‪ ,‬יתכנו מצבים שבני הזוג שמהם נוצרו קדם‪-‬‬
‫העוברים אינם יכולים להשתמש בהם עולמית‪ ,‬כגון שהאישה מתה‪ ,‬או עברה כריתת רחם וכיוצ"ב‪ .‬ביציות‬
‫מופרות מוקפאות אלו עומדות‪ ,‬אפוא‪ ,‬להשמדה‪ .‬אשר על כן‪ ,‬ניתן להשתמש בעודפי הביציות המוקפאות מתהליכי‬
‫הפריה חוץ גופית על מנת לבודד את תאי הגזע‪ .‬על פי ההערכה יש כיום כ‪ 100,000 -‬ביציות מופרות מוקפאות‬
‫בארה"ב לבדה‪ ,‬שאין להן כל דורש‪.‬‬
‫ב( ביציות מופרות המיוצרות למטרת הפקת תאי‪-‬גזע‪ :‬מתנדבים יכולים להסכים לתרום ביציות ותאי זרע שמהם‬
‫סטוֹציסט‪ ,‬ואז יפיקו מהם את תאי הגזע‪ .‬מבחינה רפואית יש עדיפות‬
‫ְ‬
‫הבּ ַל‬
‫ייוצרו קדם‪-‬עוברים עד לשלב של ְ‬
‫לשיטה זו‪ ,‬שכן מקור הביציות ותאי הזרע הם מאנשים בריאים מבחינת הפוריות‪ ,‬ולכן גדול הסיכוי להפיק תאי‬
‫גזע תקינים‪ .‬זאת לעומת השימוש בביציות מופרות מוקפאות מאנשים ונשים עם בעיות פוריות‪ ,‬שיתכנו פגמים‬
‫בתאי הגזע שלהם‪.‬‬
‫ג( ביציות מופרות בשיטת שיבוט )‪ :(cloning‬שיבוט‪ ,‬מלשון "שבט"‪ -‬משמעו‪ ,‬יצירה של אורגניזם שלם‪ ,‬הזהה‬
‫מבחינה גנטית כרומוזומלית באופן מוחלט לאחר‪ ,‬אדם או עובר‪ ,‬חי או מת‪ .‬הטכנולוגיה המובילה כיום בשיבוט‬
‫היא טכנולוגיית החלפת הגרעין‪ ,‬היינו הוצאת הגרעין מתא הביצית‪ ,‬והכנסת גרעין של תא בשל )גרעין של תא‬
‫סומטי המכיל כבר את כל ‪ 46‬הכרומוזומים של האדם( לציטופלסמה של הביצית‪ .‬בעבודה זו נדון בשיבוט‬
‫למטרות ריפוי ומחקר רפואי )‪ - (Therapeutic cloning‬בתהליך זה נוצרים עוברים משובטים‪ ,‬לשם שימוש בהם‬
‫למטרה של מחקר או לשם טיפול רפואי אפשרי‪ .‬בתהליך זה‪ ,‬לאחר מספר ימים )‪ (7-5‬ממועד יצירתו של העובר‬
‫סטוֹציסט‪ ,‬ובטרם החלו תאים אלה להתמיין לאיברים שונים בגוף‪ ,‬מוציאים‬
‫ְ‬
‫המשובט‪ ,‬לאחר שהתפתח לכדי ְבּ ַל‬
‫‪27‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫חלק מהתאים המצויים במרכז העובר )‪ (inner cell mass‬ומפיקים מהם את תאי הגזע העובריים‪ .‬לאחרונה‪,‬‬
‫קבוצת חוקרים מדרום קוריאה הצליחו לראשונה‪ ,‬הלכה למעשה‪ ,‬להפיק תאי גזע עובריים מביצית אדם שעברה‬
‫שיבוט )‪ .(Hwang et al., 2004‬לשיטה זו יש יתרון רפואי בכך שניתן להפיק תאים להשתלה שיהיו תוצר זהה‬
‫מבחינה חיסונית לתורם התא הבשל‪ ,‬ובכך תימנע דחית האיבר המושתל שייוצר על ידי תאי הגזע‪.‬‬
‫ד( ביציות מופרות ללא זרע ]הפריית בתולים[ ]‪ :[parthenogenesis‬באמצעות גירוי כימי או חשמלי יתכן שניתן‬
‫לגרום לביצית להתחלק וליצור עובר ללא תוספת תא זרע או תא בשל‪ .‬שיטת רביה כזו מתרחשת בטבע אצל עופות‬
‫וזוחלים מסוימים‪ ,‬אך לא אצל יונקים‪ .‬לפיכך יש צורך בשיטה מלאכותית ליצירה כזו‪ .‬זה לא מכבר‪ ,‬פורסמו שתי‬
‫עבודות בהם הפיקו תאי גזע עובריים מביציות לא מופרות מקופות ‪(nonhuman primate) Macaca fascicularis‬‬
‫)‪ .(Cibelli et al., 2002; Vrana et al., 2003‬יתרה מכך‪ ,‬תאי גזע אלו עברו התמיינות‪ ,in-vitro ,‬לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים )‪.(Cibelli et al., 2002; Vrana et al., 2003‬‬
‫‪ 5.2‬תאי גזע עובריים ממכרסמים כמקור להתמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫בשנים האחרונות היינו עדים למחקרים חדישים המגדירים את הדרישות ‪ in vitro‬להכוונה של תאי גזע עובריים‬
‫לשורות תאים ספציפיות‪ .‬העבודות המתארות התמיינות תאי גזע עובריים אנושיים לשורות תאים בוגרים‪ ,‬בכלל‪,‬‬
‫ולתאי עצב דופאמינרגים בפרט‪ ,‬מבוססות כולן על המחקרים שנעשו מתאי גזע עובריים ממקור עכבר‪ .‬ישנן לפחות‬
‫שלש שיטות בסיסיות לאינדוקציה של תאי עצב מתאי גזע עובריים מעכבר ומאדם )תמונה מס' ‪ .(7‬כאשר מגדלים‬
‫תאי גזע עובריים בתרבית בתנאים מסוימים נוצרים צברי תאים אשר הופכים לאחר מספר ימים לגופיפים דמויי‬
‫שלפוחית הנקראים "גופיפים עובריים" )‪ .(embryoid body, EB‬מבדיקה של התאים המרכיבים את הגופיפים‬
‫ואנדוֹדרם )‪-(Lee et al., 2000‬‬
‫זוֹדרם ֶ‬
‫קטוֹדרם‪ֶ ,‬מ ֶ‬
‫ֶ‬
‫העובריים התברר שמדובר בתאים מכל שלוש שכבות הנבט ‪ֶ -‬א‬
‫שיהוו בהמשך ההתפתחות העוברית את המקור ליצירת כל הרקמות בגוף העובר‪] .‬במאמר מוסגר אציין כי‬
‫מהאנדודרם מתפתחים‪ ,‬בין היתר ‪,‬תאי הכבד והלבלב; מהמזודרם ‪ -‬מערכת הדם‪ ,‬הכליות‪ ,‬הלב‪ ,‬העצמות‬
‫ידרמיס( ובלוטת יותרת הכליה‬
‫והשרירים; מהאקטודרם מתפתחים העצבים‪ ,‬השכבה החיצונית של העור ) ֶא ִפּ ֶ‬
‫)אדרנל([‪ .‬התמיינות לתאי עצב של הצברים האלה ניתן להשיג ע"י חשיפתם לחומצה רטינואית ) ‪Bain et al.,‬‬
‫‪ (1995‬או לחשיפתם לגורמי גידול אחרים כמתואר בהמשך‪ .‬גישה מצליחה נוספת ליצירת תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מתאי גזע עובריים של עכבר מבוססת על הפעילות המכוונת‪ ,‬שמקורה בתאי סטרומה ) ‪stromal derived‬‬
‫‪ ,(inducing activity, SDIA‬של שורות תאי סטרומה כגון ‪ .(Kawasaki et al., 2000) PA-6‬הגישה השלישית‬
‫להתמיינות תאי עצב מתאי גזע עובריים מעכבר מבוססת על מודל "בררת מחדל" להתמיינות תאי עצב ‪(Munoz-‬‬
‫)‪ .Sanjuan & Brivanlou 2002‬גידול של תאי גזע עובריים בצפיפות נמוכה‪ ,‬במדיום מזערי וללא גורמי גידול‬
‫‪28‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫מזינים‪ ,‬סרום או גורמי גדילה‪ ,‬מוביל להתמיינות עצבית ספונטנית של חלק משמעותי מתאי הגזע העובריים‪.‬‬
‫ממצאים אלה מעלים שאלות התפתחותיות מעניינות‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬היעילות הנמוכה יחסית‪ ,‬העדר סמנים‬
‫דופאמינרגים ומחסור בנתונים פונקציונאליים הופכים כעת את המערכת לפחות מתאימה לגישות של הטיפולים‬
‫התאיים )‪.(Perrier & Studer 2003‬‬
‫שתי אסכולות עיקריות תוארו להתמיינותם של תאי עצב דופאמינרגים מתאי גזע עובריים ובכך פותחות את‬
‫הדרך ליצירה לא מוגבלת של תאי עצב דופאמינרגים ‪ .in vitro‬כמו‪-‬כן‪ ,‬תוארו עבודות ששילבו את שתי השיטות‬
‫ביחד‪ .‬מתודה ראשונה המונהגת ע"י ‪ McKay‬וחבריו )‪ (Lee et al., 2000‬תיארה לראשונה התמיינות מלאה של‬
‫תאי גזע עובריים לתאי עצב דופאמינרגים‪ .‬ההתמיינות המורכבת ממספר שלבים‪ :‬שלב ה‪ ,1-‬הרחבה של‬
‫אוכלוסיית תאי גזע עובריים לא ממוינים; שלב ‪ ,2‬יצירה של גופיפים דמויי עובר; שלב ‪ ,3‬שימוש במדיום מוגדר‬
‫לסלקציה של תאי גזע של מערכת העצבים המרכזית; שלב ‪ ,4‬התרבות מהירה של תאים אלה בנוכחות מיטוגן‬
‫)‪ ;basic fibroblast growth factor (bFGF or FGF2) ,(mitogen‬שלב ‪ ,5‬התמיינות לתאים דופאמינרגים ע"י‬
‫הסרת המיטוגן‪ .‬להלן הסבר מפורט של השיטה‪ :‬צברים של תאי גזע עובריים הופרדו לתאים בודדים ונזרעו ל‪4-‬‬
‫ימים בנוכחות סרום‪ .‬טיפול זה יצר גופיפים דמויי עובר‪ ,‬צברים צפים של תאי גזע עובריים המכילים את כל‬
‫שלשת סוגי תאי הנבט‪ .‬גופיפים דמויי עובר נזרעו בהמשך על צלחות דביקות )‪ (adhesive‬לגידול תרביות תאים ל‪-‬‬
‫‪ 24‬שעות בנוכחות סרום והועברו לאחר מכן למדיום נטול סרום ל‪ 6-4-‬ימים‪ ,‬לשם התמיינות לתאי גזע עצביים‪.‬‬
‫תאים אלה הופרדו וגודלו במשך ‪ 6‬ימים בנוכחות ‪ Shh ,FGF8‬ו‪ .bFGF-‬לאחר מכן‪ bFGF ,‬הוסר וחומצה‬
‫אסקורבית )‪ (ascorbic acid‬נוספה ל‪ 6 -15 -‬ימים נוספים‪ .‬תאי העצב שהתקבלו ביטאו סמנים המאפיינים את‬
‫המוח התיכון בעובר‪ ,‬כגון‪ Wnt1 ,Pax5 ,Pax2 :‬ו‪ ,En1-‬כמו גם סמנים של תאי עצב דופאמינרגים‪ TH ,‬ו‪.Nurr1-‬‬
‫יתר מכך‪ ,‬תאי עצב אלו יצרו דופאמין והפרישו אותו למדיום הגידול בעקבות דה‪-‬פולריזציה עם אשלגן‪ .‬תחת‬
‫תנאי גידול הללו‪ 72% ,‬מתאי הגזע העובריים רכשו מורפולוגיה עצבית‪ 34% ,‬מתאי העצב היו דופאמינרגים ו‪11%-‬‬
‫היו סרוטונרגים‪ .‬יש לציין שלא נצפה ולו תא אחד שהיו לו גם סמנים סרוטונרגיים וגם דופאמינרגים‪ ,‬כלומר‬
‫מדובר בהתמיינות מלאה לתאי עצב פונקציונאליים ללא קבלת ייצור כילאים שלא מצוי בטבע )קרי תא המפריש‬
‫גם דופאמין וגם סרוטונין(‪ .‬מאוחר יותר‪ ,‬קבוצה זו שיפרה את אחוז תאי העצב הדופאמינרגים המופקים בתאי‬
‫גזע עובריים )‪ .(Kim et al., 2002‬כמתואר בפרק ‪ Nurr1 ,2.5‬הנו גורם שעתוק בעל חשיבות מרובה בהתמיינותם‬
‫של התאים במוח התיכון‪ ,‬בתקופה העוברית‪ ,‬לתאי עצב דופאמינרגים‪ .‬יתרה מכך‪ Nurr1,‬מעורב בספציפיקציה‬
‫פנוטיפית )‪ (phenotype‬של תאי העצב הדופאמינרגים במוח התיכון ‪Zetterstrom et al., 1997; ) in vivo‬‬
‫‪ ,(Saucedo-Cardenas et al., 1998‬סביר להניח‪ ,‬שביטוי פנימי של גורם שעתוק זה בתאי גזע יזרז התמיינות‬
‫דופאמינרגית‪ McKay .‬וחבריו )‪ (Kim et al., 2002‬הביאו לביטוי יתר של ‪ Nurr1‬בתאי גזע עובריים של עכבר‪,‬‬
‫‪29‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫שלאחר מכן עברו התמיינות לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים בתרבית‪ ,‬כמתואר‪ .‬ביטוי‬
‫יתר של ‪ Nurr1‬העלה משמעותית את‬
‫שעור תאי העצב המבטאים ‪ .TH‬תאי‬
‫‪ TH+‬נצבעו גם לסמן עצבי ‪β-tubulin‬‬
‫‪ (78%) III‬אך לא לסמנים המאפיינים‬
‫את שורות תאי הגליה‪ ,‬דבר המצביע על‬
‫כך‪ ,‬שביטוי הגן של ‪ Nurr1‬מעודד‬
‫באופן ייחודיי את הביטוי של ‪TH‬‬
‫בתאי העצב‪ .‬בנוסף לכך‪ ,‬תרביות של‬
‫תאי גזע המבטאים ביתר ‪ Nurr1‬הראו‬
‫שחרור מוגבר של דופאמין לאחר דה‪-‬‬
‫פולריזציה בהשוואה לתרביות של תאי‬
‫גזע עובריים מזן הבר‪ .‬נוכחותם של‬
‫נוראדרנלין‬
‫ואדרנלין‬
‫לא‬
‫נצפתה‬
‫בתרביות אלה‪ .‬כמו כן‪ ,‬לא נמצא ביטוי‬
‫גני של‬
‫‪dopamine β-hydroxylase‬‬
‫)‪ ,(DβH‬סמן סלקטיבי לתאי עצב‬
‫מתווכי‪-‬אדרנלין‪.‬‬
‫בחולדות‬
‫כמודל‬
‫למחלת פרקינסון שעברו השתלה של‬
‫תמונה ‪ :7‬השיטות השונות להתמיינות תאי גזע עובריים לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים )‪(Sonntag et al., 2005‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬מתאי גזע עובריים מזן הבר שעברו התמיינות‪ ,‬נצפה שיפור מועט בהתנהגות הסיבובית‪.‬‬
‫לעומתם‪ ,‬הקבוצה שעברה השתלה של תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬שהתמיינו מתאי גזע עובריים המבטאים‬
‫ביתר‪ ,Nurr1‬הראתה שינוי ניכר בפרמטר זה‪ ,‬הגורם לסיבובים קונטרלטרליים עקביים‪ .‬התאים המושתלים שרדו‬
‫ושיפרו את סימני המחלה המאפיינים את מחלת הפרקינסון‪ .‬יתר על כן‪ ,‬הקבוצה שעברה השתלה של תאי גזע‬
‫עובריים‪ ,‬המבטאים ביתר‪ ,Nurr1‬הראתה שיפור משמעותי במבחנים ההתנהגותיים‪ ,‬כגון‪ :‬סיבובים לאחר גירוי‬
‫עם אמפטמין‪ ,‬מבחן הושטת גפה )‪ ( paw reaching test‬ומבחן הצילינדר‪ .‬החוקרים לא דיווחו על יצירת טרטומות‬
‫בחיות שעברו השתלה של תאי גזע עובריים עם ביטוי יתר של ‪ .Nurr1‬בנוסף לכך‪ ,‬תאים אלה יצרו סינפסות‬
‫‪30‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫תפקודיות והראו תכונות אלקטרופיזיולוגיות הטיפוסיות לתאי עצב מזנצפליים‪ .‬ברצוני לציין שיחד עם זאת‪ ,‬אין‬
‫נתונים לגבי היכולת של התאים ליצור מחדש עצבוב תפקודי של הסטריאטום ולגבי יעילותם בהשוואה לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים ראשוניים מעובר‪ .‬בנוסף‪ ,‬אין מענה על שאלות רבות בנוגע לבטיחות הטיפול בטווח הרחוק‪ ,‬ביצוע‬
‫שינויים גנטיים מסוג זה בתאי גזע עובריים וקבילותן ביישומים הקליניים‪.‬‬
‫מתודה שנייה להתמיינות תאי עצב דופאמינרגים מתאי גזע עובריים מובלת ע"י ‪ Sasai‬ושותפיו ) ‪Kawasaki et‬‬
‫‪ .( al. 2000, 2002; Morizane et al. 2002‬בניגוד לפרוטוקול הקודם‪ ,‬שיטה זו לא דורשת גידול של התאים‬
‫בסרום‪ ,‬יצירת גופיפים דמויי עובר או סלקציה לתאי גזע עצביים )‪ .(Kawasaki et al. 2000‬במקום זאת‪,‬‬
‫‪ Kawasaki‬וחבריו עשו סינון להתמיינות תאי עצב דופאמינרגים מתאי גזע עובריים לאחר תרבית משותפת )‪co-‬‬
‫‪ (culture‬עם שורות שונות של תאים ומצאו ששורת תאי סטרומה שמקורם במוח העצם‪ ,PA6 ,‬מהווה גורם מזרז‬
‫ובעל השפעה על ההתמיינות העצבית‪ .‬תופעה זו זכתה לכינוי "הפעילות המשרה שמקורה בתאי סטרומה"‬
‫)‪ .(SDIA‬לאחר תרבית משותפת עם תאי ‪ 96% ,PA6‬מהמושבות של תאי גזע עובריים הכילו תאי עצב ממוינים‬
‫המאופיינים ע"י צביעה חיובית ל‪microtubule- ,neural cell adhesion molecule (NCAM) ,β tubulin III-‬‬
‫)‪ ,associated protein 2 (MAP2‬ו‪ .synaptophysin -‬בניגוד לכך‪ ,‬פחות מ‪ 2%-‬מהמושבות הכילו תאים‬
‫שהתמיינו לשורות תאי גליה או לשורות תאים מזודרמליים‪ .‬בין המושבות העצביות‪ 92% ,‬הכילו ‪,‬תאי עצב‬
‫החיוביים ל‪ Pitx3 ,Nurr1 ,TH-‬ושליליים ל‪ ,DβH-‬המפרישים דופאמין‪ .‬ברמה התאית‪ 53% ,‬מהתאים בתרבית‬
‫היו תאי עצב החיוביים ל‪ β-tubulin III -‬ו‪ 30%-‬מהם היו דופאמינרגים‪ .‬בזמן ששורת תאי ‪ PA6‬משרה התמיינות‬
‫עצבית‪ ,‬מדיום מותנה )‪ (conditioned media‬מתאי ‪ PA6‬אינו משרה התמיינות זאת‪ .‬בנוסף‪ ,‬תאי עצב‬
‫דופאמינרגים לאחר השראת התמיינות ע"י ‪ ,SDIA‬משתלבים בסטריאטום העכברי‪ ,‬שטופל לפניכן ב‪6-OHDA-‬‬
‫וממשיכים לבטא ‪ TH‬ו‪ β tubulin II-‬לאחר ההשתלה‪ .‬תאים אלה שורדים בשיעור של כ‪ 20%-‬שבועיים לאחר‬
‫ההשתלה בסטריאטום‪ .‬מבחנים היסטולוגיים של השתלים לא גילו יצירת טרטומות‪ Morizane .‬וחבריו )‪(2002‬‬
‫הצליחו למקסם את יעילות ההשתלות‪ ,‬לאחר חשיפה של תאי גזע עובריים מעכבר ל‪ SDIA-‬במשך מספר משתנה‬
‫של ימים )‪ 14-8‬ימים(‪ .‬היחס הגבוה ביותר בין מספר התאים השורדים‪ ,‬החיוביים ל‪ TH-‬לבין המספר הכולל של‬
‫התאים המושתלים התקבל כאשר תאי גזע עובריים נחשפו ל‪ SDIA-‬במשך ‪ 12‬ימים לפני ההשתלה‪ .‬יחס זה‬
‫מראה‪ ,‬שהשתלה של מושבות תאים לעומת השתלה של תרחיפי תאים‪ ,‬הייתה יעילה יותר לשם קבלת תאי ‪TH+‬‬
‫‪ in vivo‬ולשרידותם במוח המושתל‪.‬‬
‫‪31‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫לשיטת ה‪ SDIA-‬יש מספר יתרונות ביצירת תאי עצב‪ ,‬בהשוואה לשיטות קודמות הכוללות יצירה של גופיפים‬
‫דמויי עובר‪ .‬ראשית‪ ,‬שיטת ה‪ SDIA-‬הנה יחסית פשוטה טכנית‪ ,‬גידול תאי גזע עובריים מתאים בודדים למושבות‬
‫בתרבית שטוחה‪ .‬שנית‪ ,‬התמיינות עצבית של תאי גזע עובריים היא יעילה ומהירה‪ ,β tubulin III :‬סמן עיצבי‬
‫פוסט‪-‬מיטוטי‪ ,‬מופיע ביום ‪ .4 -5‬לבסוף )והכי חשוב(‪ ,‬תאי גזע עובריים הנחשפים ל‪ SDIA-‬מתמיינים לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים של המוח התיכון בתדירות גבוהה ללא צורך בביטוי יתר של גן חיצוני; ‪ 30%‬מתאי העצב הנוצרים‬
‫מתאי גזע עובריים של עכבר‪ ,‬הם דופאמינרגים ומייצרים כמויות משמעותיות של דופאמין‪.‬‬
‫‪ Studer‬וחבריו )‪ (Barberi et al., 2003‬הצליחו לשפר את הטכניקות להתמיינות ‪ in vitro‬של תאי גזע עובריים‬
‫מעכבר לתאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬ע"י אספקה של תנאי תרבית משותפת‪ ,‬קרי התמיינות באמצעות גורמי גידול‬
‫בשיטות השלבים )‪ McKay‬וחבריו( על מצע של ‪ Sasai) SDIA‬וחבריו(‪ .‬שילוב השיטות המאפשר יצירה מהירה‬
‫ויעילה של רוב הפנוטיפים המאפיינים את מערכת העצבים המרכזית‪ .‬גורלם של תאי גזע עובריים מעכבר‬
‫שמקורם בהפריה או העברת‪-‬גרעינים )‪ (nuclear transfer, cloning‬היה מכוון סלקטיבית לתאי גזע עצביים‪,‬‬
‫אסטרוציטים‪ ,‬אוליגודנדרוציטים או תאי עצב בשלים‪ .‬התמיינות ספציפית לתאי עצב המפרישים ‪γ-‬‬
‫)‪ ,aminobutyric acid (GABA‬דופאמין‪ ,‬סרוטונין או תאי עצב מוטוריים הושגה ע"י הגדרת התנאים הנדרשים‬
‫להשראת פנוטיפ של המוח הקדמי‪ ,‬התיכון‪ ,‬האחורי ופנוטיפ של חוט השדרה‪ .‬התנאים‪ ,‬שהשרו התמיינות עצבית‬
‫כללו תרבית משותפת של תאי גזע עובריים עם שורות של תאי סטרומה מזינים )‪ ,(SDIA‬שמקורם במוח העצם‪.‬‬
‫לאחר חמישה ימים של תרבית משותפת של תאי גזע עובריים על גבי שורת תאי סטרומה‪ Shh ,‬ו‪ FGF8-‬נוספו‬
‫למדיום המחליף את הסרום )‪ (serum replacement medium‬ולאחר מכן המדיום הוחלף ל‪ N2-‬עם תוספת של‬
‫‪ Shh‬ו‪ FGF8-‬ובנוכחות ‪) bFGF‬ימים ‪ .(11-8‬ביום ה‪ ,11-‬התמיינות סופית הושרתה ע"י הורדת ‪ FGF8 ,Shh‬ו‪-‬‬
‫‪ bFGF‬והוספה של חומצה אסקורבית ו‪ .BDNF-‬תאים אלה ביטאו ‪ DAT‬ו‪ ,TH-‬בנוסף לגורמי שעתוק‬
‫הספציפיים למוח התיכון‪ Pitx3 ,Lmx1b ,En1 :‬ו‪ .Nurr1-‬בהשוואה לשיטות הקודמות‪ ,‬מערכת זאת הציגה‬
‫שונות נמוכה בקבלת תאי עצב מטווח רחב של תאים‪ ,‬קרי קבלת אוכלוסייה הומוגנית‪ .‬תפקוד עצבי מושלם של‬
‫הנוירונים הדופאמינרגים‪ ,‬שמקורם בתאי גזע עובריים‪ ,‬הוכח ‪ in vitro‬ע"י מיקרוסקופיה אלקטרונית‪ ,‬מדידת‬
‫הפרשת דופאמין למדיום הגידול ופעילות אלקטרופיסיולוגית‪ .‬מחקר זה הראה‪ ,‬שהשתלה של תאי עצב‬
‫דופאמינרגים‪ ,‬המופקים מתאי גזע עובריים‪ ,‬לעכברי מודל למחלת פרקינסון הביאה לידי שרידותם ארוכת טווח‬
‫של התאים המושתלים ולביטויים של סמנים דופאמינרגים ‪ TH ,AADC ,DAT‬ב‪ 70% -‬מן התאים המושתלים‪.‬‬
‫יתרה מכך‪ ,‬השתלתם של תאי עצב הדופאמינרגים‪ ,‬שמקורם בתאי גזע עובריים‪ ,‬הביאה לשיפור קליני מעבר ל‪-‬‬
‫‪ ,70%‬כפי שנמדד במבחן תפקודי המודד התנהגות סיבובית בעקבות גירוי כימי‪ ,‬דבר המדגים את האפליקציות ‪in‬‬
‫‪32‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ vivo‬של תאי גזע עובריים מביציות מופרות או מביציות מופרות בשיטת שיבוט למטרות ריפוי במחלות ניוון עצבי‪.‬‬
‫)פרוט נוסף לגבי התמיינות של תאי גזע עובריים ממכרסמים לתאי עצב דופאמינרגים ראה בטבלאות מס' ‪ 4‬ו‪.(5-‬‬
‫‪ 5.3‬תאי גזע עובריים מפרימטים כמקור להתמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫תאי גזע עובריים המופקים מבלסטוציסטים פרימטים )אדם או קוף( הנם בעלי מספר מאפיינים‪ ,‬כגון‪ :‬אנטיגנים‬
‫הנמצאים על גבי התאים‪ ,‬חוסר תלות ב ‪ leukemia inhibitory factor (LIF)-‬וזמני הכפלת אוכלוסייה ארוכים‪,‬‬
‫השונים מתאים עכבריים )‪ .(Reubinoff et al., 2000; Thomson et al.,1998‬מחקרים שונים תיארו את‬
‫הפוטנציאל של תאי גזע עובריים ממקור אנושי להתמיין לשורות תאים רבות ) ;‪Schuldiner et al., 2000‬‬
‫‪ ,(Odorico et al., 2001‬לתאי נבט עצביים )‪Carpenter et al., 2001; Reubinoff et al., ) (neuronal progenitor‬‬
‫‪ ,(2001; Schuldiner et al., 2001‬תאי נבט המטופואטיים )‪ (Kaufman et al., 2001‬ותאים המפרישים אינסולין‬
‫)‪ .(Assady et al., 2001‬אחת המטרות הברורות של החוקרים היא להשפיע על התמיינותם של תאי גזע עובריים‬
‫אנושיים על מנת לקבל ‪ in vivo‬ו‪/‬או ‪ in vitro‬אוכלוסייה אחידה של פרקורסורים או של תאים‪ ,‬שעברו התמיינות‬
‫מלאה‪ Benvenisty .‬וחבריו הראו לראשונה כי ‪ mRNA‬של סמן המאפיין את תאי העצב‪neurofilament heavy ,‬‬
‫)‪ ,(NF-H‬התבטא בתאי גזע עובריים אנושיים לאחר שטופלו בחומצה רטינואית ולהתפתחות מורפולוגיה רשתית‬
‫מסובכת כדוגמת תאי עצב )‪ ,(Schuldiner et al., 2000‬בדומה לגופיפים דמויי עובר מתאי גזע עובריים ממקור‬
‫עכברי‪ .‬יתר על כן‪ mRNA ,‬של הרצפטור לדופאמין ‪ (dopamine receptor D1) D1‬ושל ‪ ,AADC‬אנזים מפתח‬
‫בייצור דופאמין‪ ,‬באו לידי ביטוי בגופיפים דמויי עובר לאחר הטיפול בחומצה רטינואית‪ ,‬אך לא בתאי גזע‬
‫עובריים נאיביים )‪.(Schuldiner et al., 2001‬‬
‫פרוטוקולים להתמיינות של תאי גזע עובריים מפרימטים לתאי עצב מבוססים על העקרונות‪ ,‬שפותחו להתמיינות‬
‫של תאי גזע עובריים מעכבר‪ .‬פרוטוקולים רב שלביים לתאי גזע עובריים אנושיים‪ ,‬המבוססים על יצירת גופיפים‬
‫דמויי עובר‪ ,‬מביאים להכוונה יעילה לתאי עצב ולאסטרוציטים )‪.(Carpenter et al., 2001; Zhang et al., 2001‬‬
‫כמו‪-‬כן תוארו בספרות תהליכי התמיינות לתאי עצב שמתבססים על הזנה של תאי סטרומה ) ‪ (SDIA‬עבור תאי‬
‫גזע עובריים מפרימטים לא אנושיים )‪ .(nonhuman primate‬בניגוד לגופיפים דמויי עובר או לפרוטוקולים‬
‫המבוססים על התמיינות עצבית כברירת מחדל‪ SDIA ,‬הניע גם את תאי הגזע העובריים מפרימטים להתמיין‬
‫לנוירונים המבטאים ‪ .(Mizuseki et al. 2003) TH‬בנוסף לכך‪ ,‬גם ‪ Kawasaki‬וחבריו )‪ (2002‬דיווחו על ‪SDIA‬‬
‫שהשרה התמיינות עצבית יעילה בתאי גזע עובריים מ‪ ,Macaca fascicularis-‬קוף המשמש בהרבה מקרים‬
‫לניסוים קליניים‪ .‬תאי גזע עובריים מקוף גודלו על תאי ‪ PA6‬למשך שבועיים‪ 25% ,‬מהתאים התמיינו לתאי עצב‬
‫‪33‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫פוסט‪-‬מיטוטיים החיוביים ל‪ 35% .β tubulin III-‬מאותם תאי עצב ביטאו בנוסף את אנזים קובע הקצב לייצור‬
‫דופאמין‪ .TH ,‬יתרה מכך‪,‬תאי גזע עובריים‪ ,‬שטופלו ב‪ ,SDIA-‬הפרישו דופאמין בתגובה לגירוי חזק של אשלגן‬
‫הגורם לדה‪-‬פולריזציה‪ ,‬עדות לכך‪ ,‬שתאים אלה מכילים מספר משמעותי של תאי עצב דופאמינרגים פעילים‪.‬‬
‫אנליזות נוספות בעזרת ‪ RT-PCR‬הראו‪ ,‬תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬שהושרו ע"י ‪ ,SDIA‬ביטאו סמנים ייחודיים של‬
‫תאי עצב במוח התיכון‪ ,‬כגון‪ Nurr1:‬ו‪ ,Lmx1b-‬כאשר תאי גזע עובריים ללא התמיינות לא ביטאו מרקרים אלה‪.‬‬
‫לאחרונה תואר שתאי גזע עובריים מקופים )‪ (Macaca fascicularis‬עברו התמיינות מלאה לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים באמצעות ‪ SDIA‬ובנוכחות של גורמי גדילה הבאים‪BDNF, neurotrophin-3 (NT3), FGF2, :‬‬
‫‪ .(Takagi et al., 2005) FGF20‬התאים שעברו התמיינות ביטאו ‪ mRNA‬של ‪TH, Lmx1b, Nurr1, Pitx3‬‬
‫הייחודיים לתאים דופאמינרגים‪ .‬כמו‪-‬כן‪ 53% ,‬מהתאים ביטאו ‪ ,β-tubulin III‬סמן לתאי עצב בוגרים‪ ,‬ומתוכם‬
‫‪ 25%‬היו חיוביים ל‪ .TH-‬יתרה מכך‪ ,‬לראשונה‪ ,‬הושתלו בין ‪ 300000‬ל‪) 600000-‬לכל צד( תאים שעברו התמיינות‬
‫ל‪ putamen-‬של קופים ב‪ ,MPTP-‬מודל פרימטי למחלת פרקינסון‪ .‬לאחר כ‪ 10 -‬שבועות נצפה שיפור סימפטומאטי‬
‫מובהק בקופים שעברו השתלת תאי עצב דופאמינרגים לעומת קופים שלא עברו השתלה‪ .‬איסוף נתונים לגבי‬
‫תפקודם של תאי גזע עובריים מפרימטים במודלים של מחלת פרקינסון בקופים‪ ,‬הנו ציון דרך עיקרי לקראת‬
‫ניסויים קליניים עתידיים בתאי גזע עובריים הומאניים‪.‬‬
‫בשנה האחרונה‪ ,‬לראשונה‪ ,‬פורסמו מספר מחקרים במקביל המתארים את התמיינותם של תאי גזע עובריים‬
‫אנושיים לתאי עצב דופאמינרגים ‪ in-vitro‬בשיטות שונות ) ;‪Ben-Hur et al., 2004; Buytaert-Hoefen 2004‬‬
‫‪ .(Park et al., 2004; Perrier et al., 2004; Schulz et al., 2004; Zeng et al., 2004; Park et al., 2005‬אופן‬
‫התמיינות התאים הייתה על פי הפרוטוקולים שתוארו בתאים ממקור עכבר וקופים )תמונה ‪ ,(7‬באמצעות גופיים‬
‫עובריים שנחשפו לגורמי גידול בשלבים‪ ,‬או ע"י ‪ SDIA‬בנוכחות גורמי גידול שונים‪ .‬במחקרים השונים התאים‬
‫שעברו התמיינות ‪ in vitro‬ביטאו סמנים ייחודיים לתאי עצב בוגרים כדוגמת ‪ β-tubulin III, NF-H‬וסמנים‬
‫לתאים דופאמינרגים ‪ .TH, AADC,DAT, Nurr1, Lmx1b‬בנוסף‪ ,‬התאים שעברו התמיינות הפרישו דופאמין‬
‫למדיום הגידול והיו בעלי מדדים אלקטרופיזיולוגים כתאי עצב‪ .‬התאים שעברו התמיינות הושתלו לחולדות מודל‬
‫למחלת פרקינסון )טופלו ב‪ (6-OHDA-‬ושרדו כ‪ 12-‬שבועות לאחר ההשתלה ) ‪Ben-Hur et al., 2004; Schulz et‬‬
‫‪ .(al., 2004; Zeng et al. 2004, Park et al., 2005‬למרות שבארבעת המחקרים התאים שעברו השתלה שרדו‬
‫וביטאו ‪ ,TH‬רק במחקר אחד נמצא שיפור קליני התנהגותי מובהק בחולדות‪ ,‬מודל למחלת פרקיניסון‪ ,‬שעברו‬
‫‪34‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫השתלת תאי עצב דופאמינרגים ממקור של תאי גזע עובריים אנושיים )‪) .(Ben-Hur et al., 2004‬פרוט נוסף לגבי‬
‫התמיינותם של תאי גזע עובריים מפרימטים לתאי עצב דופאמינרגים ראה בטבלאות מס' ‪ 4‬ו‪.(5-‬‬
‫‪ 5.4‬תאי גזע עובריים מביציות שעברו שיבוט או רביית בתולים כמקור‬
‫להתמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫השתלה של רקמות ותאים אלוגניים או קסנוגניים מעלה דאגות לגבי‬
‫התגובה החיסונית שתגרור השתלה זו‪ .‬הצורך בדיכוי חיסוני בהשתלה‬
‫עצבית נשאר שנוי במחלוקת עקב הטענה‪ ,‬שהמוח הנו "בעל יתרון חיסוני"‬
‫)‪ .(Perrier & Studer 2003‬יחד עם זאת‪ ,‬הטענה‪ ,‬שהתאים המושתלים‬
‫ממקור לא הומני )‪ (xenografted‬עוברים דחייה מהירה במוח ללא דיכוי‬
‫חיסוני‪ ,‬מבוססת היטב במודלים למחלת פרקינסון )‪.(Barker et al., 2000‬‬
‫העברה גרעינית )שיבוט( )תמונה ‪ (8‬ורביית בתולים )‪ (parthenogenesis‬הם‬
‫תהליכים היכולים לספק מקורות של תאים בעלי התאמה חיסונית‬
‫)‪ (immunecompatible‬להשתלות‪.‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים פונקציונאליים הושגו‪ ,‬לראשונה‪ ,‬מתאי גזע עובריים‬
‫של עכברים‪ ,‬שעברו העברת גרעין מתאי קצה זנב של עכבר בוגר או מתאי‬
‫‪ cumulus‬כפי שתואר ע"י ‪ Wakayama‬וחבריו )‪ .(2001‬גופיפים דמויי עובר‬
‫עברו התמיינות ‪ in vitro‬ליצירת תאי עצב דופאמינרגים על פי פרוטוקול‬
‫מקובל )‪ ,(Lee et al., 2000‬עם שינויים משניים קטנים‪ .‬שורה אחת של תאי‬
‫גזע עובריים הניבה תאי עצב דופאמינרגים בכמות העולה על ‪ 50%‬מכלל‬
‫התאים‪ .‬אופיים הפונקציונאלי של תאי עצב אלה אומת ע"י קביעת שחרור‬
‫הדופאמין ב‪.high performance liquid chromatography (HPLC) -‬‬
‫‪ Barberi‬וחבריו )‪ (2003‬הראו‪ ,‬שתאי עצב דופאמינרגיים שהתמיינו‬
‫בפרוטוקולים רבי שלבים של הוספה והסרת גורמי גידול ) ‪FGF8, Shh,‬‬
‫תמונה ‪ :8‬שיבוט למטרות ריפוי‬
‫)‪(Fischbach 2004‬‬
‫‪ (FGF2, BDNF‬ובאמצעות ‪ SDIA‬ומקורם בתאי גזע עכבריים משובטים‪ ,‬מציגים עדות אלקטרופיזיולוגית‬
‫לקיום סינפסות ולפעילות מלאה של תא עצב פעיל‪ .‬בנוסף‪ ,‬זיהוי אולטרה‪-‬סטרוקטורלי של שלפוחיות )‪(vesicle‬‬
‫טיפוסיות‪ ,‬גדולות ובעלות ליבה צפופה‪ ,‬מסמן על היותם נוירונים דופאמינרגים‪ .‬נצפה שיפור מובהק בתוצאות‬
‫המבחנים ההתנהגותיים בעכברי מודל למחלת פרקינסון )‪ (6-OHDA‬שעברו השתלות תאי עצב הדופאמינרגים‪,‬‬
‫‪35‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫שמקורם בתאי גזע מביציות משובטות‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬הישרדותם ‪ in vivo‬של תאי עצב הדופאמינרגים הייתה גבוהה‬
‫יותר בתאים ממקור ביציות משובטות מאשר בשתלים שמקורם בתאי גזע עובריים רגילים )‪ 80%‬לעומת ‪8 ,40%‬‬
‫שבועות לאחר ההשתלה(‪ .‬התוצאות מדגישות את הפוטנציאל של השיבוט הרפואי )תמונה ‪ (8‬במודלים עכבריים‬
‫של מחלת הפרקינסון‪ .‬ליישומים טיפוליים עתידיים דורשים עבודה רבה בכדי להתאים פרוטוקולים אלה לתאי‬
‫גזע עובריים הומאניים‪.‬‬
‫הצלחת שיכפול הכבשה דולי העלתה על הפרק אפשרות של שיבוט בבני‪-‬אדם‪ .‬אין ספק ששיבוט בבני אדם יאפשר‬
‫התפתחות עצומה במחקר הבסיסי והיישומי של תהליכי החיים‪ ,‬כולל התהוות עוברית )אמבריוגנזיס(‪ ,‬חידוש‬
‫הצמיחה ברקמות פגועות‪ ,‬שימוש באיברים עובריים להשתלה‪ ,‬התהוות שאתות‪ ,‬שליטה בהתרבות תאים‬
‫סרטניים‪ ,‬מנגנונים בהתהוות הפלות טבעיות‪ ,‬ועוד‪ .‬אולם‪ ,‬בה בעת מעלה שיבוט למטרות ריפוי או כדרך התרבות‬
‫בבני‪-‬אדם תהיות וקושיות כבדות משקל‪ ,‬לגבי היבטים חוקיים‪ ,‬חברתיים‪ ,‬דתיים והתפתחותיים‪ .‬בשנת ‪2004‬‬
‫תואר לראשונה‪ ,‬בדרום קוריאה‪ ,‬הפקת שורת תאי גזע אנושיים מביצית משובטת )‪ .(Hwang et al., 2004‬לתאי‬
‫גזע אלו מורפולוגיה טיפוסית לתאי גזע עובריים והם מסוגלים להתמיין ‪ in vitro‬ל"גופיפים עובריים" ) ‪embryoid‬‬
‫‪ .(body‬בנוסף‪ ,‬התאים מסוגלים לפתח טרטומות )‪ ,in-vivo ,(teratoma‬לתאים מכל שלושת שכבות הנבט ‪-‬‬
‫ואנדוֹדרם‪ ,‬בעכברים מדוכאי חיסון‪ .‬לאחר ‪ 70‬חלוקות בתרבית‪ ,‬התאים שמרו על קריוטיפ‬
‫זוֹדרם ֶ‬
‫קטוֹדרם‪ֶ ,‬מ ֶ‬
‫ֶ‬
‫ֶא‬
‫)‪ (karyotyoe‬נורמאלי והיו זהים לחלוטין לגרעין המקורי שנתרם מהתא הסומטי‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬לאחרונה הקבוצה‬
‫הקוראנית דיווחה על הפקת ‪ 11‬שורות תאי גזע עובריים אנושיים שונים מביציות משובטות ע"י גרעין שהופק‬
‫מתאי עור של אנשים בוגרים חולים )סוכרת נעורים‪ ,‬פגיעה בעמוד השדרה ועוד( )‪ .(Hwang et al., 2005‬שילובם‬
‫של תאי גזע עובריים שהופקו מביציות שעברו "העברה גרעינית" למטרות ריפוי‪ ,‬מציג את ישימותם של השלבים‬
‫הראשונים הדרושים לאפליקציה של שיבוט בטיפולי השתלות‪ .‬מחקרים קודמים הראו את הפונקציונליות ‪in‬‬
‫‪ vivo‬של תאי עצב דופאמינרגים המופקים מעוברים משובטים של עגל ) ‪ .( Zawada et al. 1998‬השיבוט המוצע‬
‫לצורך ריפוי וטיפול בבני אדם מתאר את יצירתם של תאי גזע עובריים אוטולוגיים בעזרת העברה גרעינית של תא‬
‫סומטי‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬השימוש בעוברים משובטים כמקורות תאיים מעלה מכשולים אתיים‪ ,‬הבולמים את ניצול‬
‫התאים האלה לטיפול במחלות ניווניות באדם‪.‬‬
‫רביית בתולים )‪ (parthenogenesis‬הוא תהליך‪ ,‬שבו ביצית מתפתחת לעובר בהעדר הפריה עם זרע )ראה פרק‬
‫‪ .(5.1.1‬חוקרים דיווחו על יכולות התמיינות של תאי גזע עובריים מפרימט לא אנושי )‪(Macaca fascicularis‬‬
‫הנוצרים בתהליך רביית בתולים )‪ .(Cibelli et al., 2002; Vrana et al., 2003‬תאי עצב ואסטרוציטים התקבלו‬
‫לאחר התמיינות עצבית של תאי גזע ‪) Cyno-1‬שורת תאי גזע שהופקה מביצית שעברה רביית בתולים(‪.‬‬
‫בפרוטוקול זה ניתן לקבל ‪ 25%‬של תאי עצב )‪ (β tubulin III‬דופאמינרגים )‪ ,(TH‬כפי שנצפה באנליזות‬
‫‪36‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫אימונוהיסטוכימיות‪ .‬תפקודם הפונקציונאלי אומת ע"י אנליזת ‪ ,HPLC‬שהראתה שחרור ‪ in vitro‬של‬
‫נוירוטרנסמיטרים‪ :‬דופאמין וסרוטונין‪ .‬התמיינות ‪ in vitro‬של התאים האלה לתאי עצב דופאמינרגים מוגדרים‬
‫היטב‪ ,‬מעוררת התעניינות רבה‪ ,‬בייחוד בגלל הפוטנציאל שלהם להחליף את תאי העצב הפגועים במחלת‬
‫הפרקינסון‪ .‬מחקרים עתידיים יהיו חייבים לספק הוכחה עקרונית ליישומים של העברה גרעינית ורביית בתולים‬
‫במודלים של מחלת הפרקינסון בחיות‪.‬‬
‫‪ 5.5‬בעיות בשימוש תאי גזע עובריים להשתלות באדם‬
‫אין ספק שהפוטנציאל הגלום בתאי גזע עובריים הוא עצום‪ ,‬ואנו נמצאים בדרך ליישום המחקר בתאים אלה הן‬
‫ברפואה והן בחקר ההתפתחות העוברית באדם‪ .‬אבל "אליה וקוץ בה"‪ ,‬גם לאחר שיהיו בידינו תרביות תאים‬
‫המכילות סוג תאים ספציפי‪ ,‬עדיין יהיה צורך להתגבר על שתי משוכות עיקריות לפני שניתן יהיה להשתילם‬
‫בחולים‪ .‬הסכנה הראשונה היא שבין התאים הרצויים להשתלה "יסתתרו" גם מעט תאי גזע עובריים שלא עברו‬
‫התמיינות‪ ,‬במקרה זה יש חשש רב שאותם תאים יתחילו להתרבות ללא בקרה‪ ,‬שהרי אחת התכונות של תאי גזע‬
‫עובריים היא התרבות עצמית בלתי מוגבלת‪ .‬כתוצאה מכך עלולים להיווצר גידולים‪ ,‬דבר זה אכן מתרחש‬
‫כשמזריקים תאי גזע עובריים לעכבר‪ .‬פתרון אפשרי לבעיה זו הוא להחדיר לתאים )בשיטות של הנדסה גנטית( "גן‬
‫התאבדות" שיגרום למות התאים כאשר הם ייחשפו לחומר שאינו פוגע בתאי הגוף הרגילים‪ .‬דבר זה יאפשר‬
‫השמדה של כל תאי הגזע העובריים )והתאים שנוצרו מהם( במקרה שיתפתח גידול אצל האדם שעבר השתלה של‬
‫תאים כאלה‪.‬‬
‫בעיה קשה נוספת היא בעיית הדחייה החיסונית של התאים המושתלים‪ .‬כיום מתמודדים עם הבעיה של דחיית‬
‫שתלים בדרך של חיפוש תורם הדומה מבחינה גנטית ככל האפשר למושתל‪ ,‬ובעזרת צמצום פעילותה של המערכת‬
‫החיסונית של המושתל‪ .‬כדי להתמודד באופן מוצלח יותר בבעיית הדחייה הוצעו מספר דרכים‪ .‬אחת מהן היא‬
‫"עטיפת" התאים המושתלים בקופסיות )קפסולות( המגינות עליהם מפני מערכת החיסון‪ .‬פתרון זה אפשרי עבור‬
‫תאים שתפקידם להפריש חומרים‪ ,‬כגון תאים מפרישי אינסולין‪ ,‬אך בעיתי בהשתלת תאים למע"מ מכיוון‬
‫שהתאים המושתלים צריכים לבוא באינטראקציה עם התאים בסביבתם ‪ .‬דרך נוספת היא טיפול מקדים במושתל‬
‫שיגרום למערכת החיסון שלו לגלות סבילוּת )‪ (tolerance‬ספציפית כלפי התאים המושתלים‪ .‬העיקרון הוא עיצוב‬
‫מחדש של מערכת החיסון של המושתל‪ ,‬כך שלא תתייחס לתאי התורם כאל תאים זרים‪ .‬לשם כך יש להשתיל‬
‫בשלב הראשון אצל המושתל מח עצם שמקורו בתורם‪ ,‬וכך נוצרת במושתל מערכת חיסון מעורבת‪ .‬הבעיה‬
‫העיקרית כאן היא הצורך בפגיעה רצינית במערכת החיסון המקורית של המושתל‪ ,‬כדי לאפשר את השלב‬
‫המקדים עצמו ‪ -‬השתלת מח עצם‪ .‬דרך נוספת היא יצירת "בנק" של תאים‪ ,‬בנק שיכלול מגוון רחב מאד של תאים‬
‫בעלי סמנים גנטיים שונים‪ ,‬כך שאנשים רבים הזקוקים להשתלה יוכלו למצוא תאים המתאימים להם שלא יגרמו‬
‫לדחייה חיסונית‪.‬‬
‫‪37‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫שלושת הפתרונות הללו מתאימים למניעת דחייה הן בהשתלות "רגילות" והן בהשתלות של תאים שנוצרו מתאי‬
‫גזע עובריים‪ .‬יש גם פתרונות רלוונטיים במיוחד להשתלות של תאים שנוצרו מתאי גזע עובריים‪ .‬אחד הפתרונות‬
‫הוא יצירת תאי גזע עובריים "אוניברסאליים"‪ ,‬שלא יזוהו על‪-‬ידי מערכת החיסון‪ .‬לצורך כך יש למנוע מהתאים ‪-‬‬
‫תוך שימוש בהנדסה גנטית ‪ -‬יצירה של המערכת המעורבת בדחיית רקמות‪.‬‬
‫כיוון אחר של פתרון הוא יצירת תאי גזע עובריים שמקורם במטופל עצמו ‪ -‬מה שמבטיח שלא יהיה תהליך דחייה‬
‫ והשתלתם חזרה לאחר שעברו התמיינות לסוג התאים הנדרש‪ .‬אחד השלבים בפתרון זה הוא שיבוט )‪(cloning‬‬‫של תאים מהמטופל לצורך קבלת בלסטוציסט שממנו יופקו תאי הגזע העובריים‪ .‬בנוסף לכך‪ ,‬כיוון זה מעורר‬
‫בעיות אתיות‪ ,‬הגם שמדובר בסך‪-‬הכול רק ביצירת עובר משובט בשלב מוקדם ביותר של התפתחות‪.‬‬
‫נקודה למחשבה נוספת שתוארה לאחרונה היא הצגת אנטיגן לא אנושי מטיפוס ‪N- ,sialic acid‬‬
‫)‪ ,glycolylneuraminic acid (Neu5Gc‬ע"י תאי גזע עובריים אנושיים )‪ .(Martin et al., 2005‬הצגת האנטיגן‬
‫נובעת משיטת גידול התאים על פני מצע של פיברובלסטים ממקור עכבר ) ‪mitotically inactivated mouse‬‬
‫‪ (embryonic fibroblasts‬ומתרבית תאים המכילה סרום ממקור עגל )‪ .(fetal calf serum, FCS‬לרוב בני אדם‬
‫הבריאים ישנם נוגדנים כנגד ‪ (Tangvoranuntakul et al., 2003) Neu5Gc‬ולכן בחשיפת התאים העובריים‬
‫לסרום ממקור הומני נצפה קישור נוגדן לאנטיגן‪ ,‬הפעלת מערכת המשלים שמביאה לבסוף למוות של תאי הגזע‬
‫העובריים‪ .‬רובם ככולם של שורות תאי גזע עובריים אנושיים שגודלו עד היום במעמדות שונות בעולם גודלו‬
‫באותן שיטות‪ ,‬קרי מצע תאים ממקור עכבר ותרבית תאים המכילה סרום ממקור בעל‪-‬חי‪ .‬היא לכך‪ ,‬יש להפיק‬
‫שורות תאי גזע עובריים אנושיים חדשים על מנת שיוכלו לשמש לטובת ריפוי בבני‪-‬אדם‪ .‬הפתרונות הטכנולוגיים‬
‫האפשריים למנוע מצב של הצגת אנטיגן מן החי הם‪ :‬גידול התאים עם סרום הומני‪ ,‬וחיפוש אחר מצע מלאכותי‬
‫כדוגמת ‪ Matrigel‬או מצע של תאים ממקור אנושי‪ ,‬כלומר לגדל את התאים רק "בסביבה אנושית"‪.‬‬
‫פתרון אחר לבעיות שתוארו הוא ניסיון לפתח טכנולוגיות אחרות מאשר שימוש בתאי גזע עובריים כדוגמת‬
‫השימוש בתאי גזע מבוגר‪ .‬יתרה מכך הפקת תאי גזע מהחולה עצמו‪ ,‬ביצוע התמיינות והשתלת התאים הממוינים‬
‫בחזרה לחולה‪ .‬בשיטה זאת נמנע מבעיות אתיות‪ ,‬דחיית שתל‪ ,‬ואף מיצירת טרטומות‪ .‬בפרקים הבאים אתאר‬
‫טכנולוגיות אלו‪.‬‬
‫‪38‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫מבוא‬
‫( של תאי גזע עובריים לתאי עצב דופאמנירגיים‬in-vitro) ‫ התמיינות בתרבית‬:4 ‫טבלה‬
Population of
cells
Induction of differentiation
Gene
expression
of neuronal
lineage
Protein markers
of neuronal
lineage
Dopaminergic
markers
(protein/RNA)
HPLC for
dopamine
% of
tyrosine
hydroxylase
Others
neurotransmitter
(protein/RNA)
Reference
nestin, Otx1,
Otx2,
Nestin, β-tubulin
III,
TH, dopamine,
Nurr1, Pax2, Pax5,
Wnt1, En1
TH, dopamine,
Nurr1,DAT, Ptx3,
AADC
TH
+
35%
serotonin
Lee S.H. 2000
En1
β-tubulin III, En1,
Pax2, Otx2
+
78%
serotonin
Kim 2002
+
33%
not tested
En1, Nurr1, Ptx3,
DAT, AADC, TH
+
31%
serotonin, GAD67,
GluT
Nishimura
2003
Shim 2004
TH, Nurr1, Ptx3,
dopamine
+
30%
GAD, VAChT,
serotonin
Kawasaki 2000
no tested
Mizuseki 2003
GABA
Ying 2003
Rodent Embryonic stem cells (ESc)
Mouse ESc
Mouse ESc
transfected
with Nurr1
Mouse ESc
Mouse ESc
transfected
with Bcl-XL
Mouse ESc
Mouse ESc
Mouse ESc
adherent
monoculture
Mouse
nuclear
transfer ESc
Mouse ESc or
nuclear
transfer ESc
Five stage protocol. Stage 4:
bFGF, Shh, FGF8; Stage5:
ascorbic acid
By a five stage protocol.
FGF2 following Shh, FGF8
Differentiated using a fivestage in vitro method
Differentiated using a fivestage in vitro method
GMEM, KSR, pyruvate,
glutamine, nonessential
amino acid, ME, co-culture
with bone marrow–derived
stromal cell (PA6),
bone marrow–derived
stromal cell line, (PA6) and
late BMP4 exposure or Shh
FGF2, Shh, FGF8
Pax2, Pax5,
Wnt1
NCAM,
β-tubulin III,
NCAM
TH, En2
no
65%
Sox1
β-tubulin III,
nestin, GFAP,
CNPase
β-tubulin III
TH
no
not tested
TH
+
>50%
serotonin
Wakayam
2001
Nestin, β-tubulin
III
TH, DAT, Ptx3,
Nurr1, Lmx1b, En1
+
50%
Other
neurotransmitters in
different culture
conditions
Barberi 2003
FGF2, Shh, FGF8, ascorbic
acid
5 day: co-culture on stromal
cell line
2 days: SHH, FGF8, SRM
4 days: N2, SHH, FGF8
Nestin, MAP2,
GFAP
Nestin, β-tubulin
III, calbindin,
GFAP
β-tubulin III,
NCAM, nestin,
synaptophysin
Nestin, βtubulin III,
MAP2
39
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫מבוא‬
Mouse ESc
Mouse
ESc
transfected
with
Nurr1
and GFP
bFGF.
3 days: ascorbic acid, BDNF
IL-1β, GDNF, TGF-β3,
NTN, cAMP
Shh, FGF8, Ascorbic acid
Nestin,
synaptophysin,
GFAP
β-tubulin III,
nestin, GalC,
GFAP,
TH, DAT, D2R,
Nurr1, En1
+
40%
GABA, serotonin
Rolletschek
2001
TH, AADC, DAT,
Nurr1, calretinin,
calbindin, AHD2,
Ptx3
+
62%
ChAT, Glu, GABA,
serotonin
Chung 2002
β-tubulin III,
nestin, NCAM,
MAP2, A2B5,
GFAP,
synaptophysin
NCAM, vimentin,
nestin, β-tubulinIII,
synaptophysin, NFL, NF-M, MAP2,
synaptophysin,
GFAP, O4
NCAM, nestin,
musashi1, βtubulinIII, NF-200,
GFAP, O4
TH
no
3%
GABA, glutamate,
glycine
Carpenter 2001
TH,
no
<1%
Glutamic acid
decarboxylase,
GABA, glutamate,
serotonin,
Reubinoff
2001
TH
no
<1%
GABA, glutamate
Zhang 2001
A2B5, β-tubulin
III, NCAM, Nestin
Pax2/5, En1/2,
Nurr1, Lmx1b, Ptx3,
TH, AADC
TH, En1,
DAT,PTX3
no
<1%
serotonin
Ben-Hur 2004
no
no tested
no tested
BuytaertHoefen 2004
TH
+
20%
GAD
Park 2004
TH, VMAT2,
Lmx1b, En1, Nurr1,
AADC, DAT
+
75%
Primate Embryonic stem cells (ESc)
Human
embryoid
bodies
EGF, FGF2, PDGF, IGF1 (3
days) then NT3, BDNF (1416 days)
Human ES
spheres
RA for 14-21 days (+ PDGF,
bFGF, EGF)
Human
embryoid
bodies
Cultured on
ornithine/laminin substrate in
a medium consisting of
DMEM/F12, N2 supplement,
cAMP, BDNF
DMEM/F12, B27, BDNF,
EGF, bFGF, NT3/4
Human ESc
spheres
(HES1)
Human ESc
(BG01)
Human ESc
(MB03)
Human ESc
(BG01/03)
Nestin, MBP,
GFAP, NSE,
NF-M, Pax6
Pax6
bone marrow–derived
stromal cell (PA6) ± GDNF
± embryonic mesencephalic
astrocytes
N2, FGF2, TGF-α
Med II (serum –free), FGF2,,
B27, GDNF, BDNF
no tested
MAP2, Sox1
GFAP, NF-200,
NF-160
Nestin, β-tubulin
III vimentin, Hu,
synaptophysin
40
Schulz 2004
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫מבוא‬
Human ESc
(BG01)
Cynomolgus
monkey ESc
Cynomolgus
monkey ESc
Cynomolgus
monkey ESc
Macaca
fascicularis
monkey
bone marrow–derived
stromal cell (PA6) with
GMEM, KSR, pyruvate,
glutamine, nonessential
amino acid, ME
bone marrow–derived
stromal cell (PA6)
bone marrow–derived
stromal cell line (PA6), and
late BMP4 exposure or Shh
bone marrow–derived
stromal cell line (PA6), and
late exposure of EGF, FGF2,
FGF20 or B27, BDNF, NT3
FGF2, Shh, FGF8, ascorbic
acid
Sox1, nestin,
MAP2,
β-tubulin III,
nestin, NCAM,
synapsin,
synaptophysin,
TH, AADC,
VMAT2, Nurr1,
Lmx1b,
+
87%
ChAT
Zeng 2004
β-tubulin III,
NCAM, NeuN,
TH, dopamine,
Nurr1, Lmx1b
+
35%
Kawasaki 2002
β-tubulin III
TH
no
5%
Norepinephrine,
DBH, GAD,
serotonin, ChAT,
ChAT
MAP2, Musashi1,
NCAM, nestin, βtubulin III, GFAP,
Pax2, Pax3, Nurr1,
Lmx1b, TH
+
24%
GABA, serotonin,
ChAT, glutamate
Takagi 2005
β-tubulin III
TH
+
25%
no tested
Cibelli 2002
Mizuseki 2003
parthenogenesis
ESc
Acetylcholine esterase (AChE); Aldehyde dehydrogenase 2 (AHD2); L-amino acid decarboxylase (AADC); basic fibroblast growth factor (bFGF,FGF2); brain-derived neurotrophic
factor (BDNF); butylated hydroxyanisole (BHA); choline acetyltransferase (ChAT); chondroitin sulfate proteoglycan (NG2); CNPase (marker of oligodendrocytes);
dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC); 3,4-dihydroxyphenylalanine (l-DOPA); dimethyl sulfoxide (DMSO); dopamine (DA); dopamine β-hydroxylase (DBH); dopamine receptor 2
(D2R); dopamine transporter (DAT); Engrailed 1 (En1); Engrailed 2 (En2); fetal bovine serum (FBS); fetal calf serum (FCS); γ-aminobutyric acid (GABA); galactocerebroside
(GalC); glasgow minimum essential media (GMEM); glial acidic fibrillary protein (GFAP); glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF); glutamate (Glu); glutamate
decarboxylase (GAD); glutamate transporter (GluT); green fluorescence protein (GFP); growth-associated protein (GAP43); high-performance liquid chromatography (HPLC);
insulin-like growth factor –1 (IGF1); interleukin-1 (IL-1β); isobutyl-methylxanthine (IBMX); knockout serum replacement (KSR); LIM homeobox transcription factor 1 beta
(Lmx1b); lithium chloride (LiCl); microtubule-associated protein 2 (MAP2); 2-mercaptoethanol (ME); myelin basic protein (MBP); neural cell adhesion molecule (NCAM); neurite
growth-promoting factor 2 (NEGF2); neurofilament heavy (NF-200); neurofilament medium (NF-160); nerve growth factor (NGF); neuron specific enolase (NSE); neuronal nuclei
(NeuN); neurotrophin-3/4 (NT3/4); neurturin (NTN); nuclear receptor related-1 (Nurr1); phorbol 12-myristate 13-acetate (TPA); pentaxin-related protein (Ptx3); platelet-derived
growth factor (PDGF); receptor interacting protein (RIP); all-trans retinoic acid (RA); serum replacement medium (SRM); sonic hedgehog (Shh); transforming growth factor-α or β3
(TGF-α or β3); tyrosine hydroxylase (TH); vesicular acetylcholine aransporter (VAChT); vesicular monoamine trasporter2 (VMAT2)
41
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ .6‬תאי גזע מעובר כמקור לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫המקור היחיד לתאי גזע שנעשה בו שימוש קליני בחולי פרקינסון‪ ,‬הינם תאי גזע עצביים שהופקו מעוברים שנפלו‬
‫או שהופלו ‪ -‬מדובר בעוברים צעירים בגיל ‪ 6-9‬שבועות הריון‪ ,‬שמהם ניתן להפיק תאי גזע הזהים חלקית‬
‫בתכונותיהם לתאי גזע עובריים‪ .‬תאי הגזע מצויים ברקמה העוברית שתתפתח בעתיד למערכת העצבים המרכזית‪.‬‬
‫אחד היתרונות בהפקת תאי גזע מעובר שניתן להפיק תאי גזע ייחודיים לרקמות מסוימות‪ ,‬אלו תאים שהחלו לא‬
‫מכבר את תהליך ההתמיינות שלהם כגון תאי גזע עצביים )‪ (neuroal stem cells‬שהנם בעלי יכולת להתמיין רק‬
‫לתאים במערכת העצבים המרכזית )תאי עצב ותאי תמיכה(‪ .‬אשר על כן‪ ,‬עובר שנפל או הופל יכול לשמש מקור‬
‫להפקת תאי גזע לשימוש במחלות ניווניות‪.‬‬
‫בשנות ה‪ Bjorklund ,80-‬וחבריו הראו כי השתלה של רקמה עצבית דופאמינרגית‪ ,‬שהופקה מהמוח התיכון‬
‫)‪ (mesencephalon‬הונטרלי בעובר‪ ,‬שיפרה את הסימפטומים הנגרמים ע"י המחסור בדופאמין במודל של מחלת‬
‫הפרקינסון בחולדה‪ ,‬שעברה הזרקה חד צדדית של‪Bjorklund and Stenevi 1979; Brundin et al., ) 6-OHDA‬‬
‫‪ .( 1986, 1988‬בהשראת ממצאים אלה במודלים בחיות‪ Olle Lindvall ,‬וחבריו החלו ב‪ 1987 -‬בניסויים קליניים‪,‬‬
‫של השתלת רקמה ממוח תיכון עוברי לסטריאטום )‪ (caudate& putamen‬של חולי פרקינסון‪ ,‬ומאז כ‪ 350-‬חולים‬
‫עברו השתלות מסוג זה )‪ .(Lindvall et al., 1988; Lindvall & Hagell, 2002a‬הניסויים בוצעו במרכזים‬
‫רפואיים בצפון אמריקה ובאירופה‪ ,‬בקבוצות קטנות של חולים‪ ,‬בניסויים לא מבוקרים קרי ‪.open-label trials‬‬
‫ניסויים קליניים אלה מראים‪ ,‬שהשתלים‪ ,‬שמקורם במוח תיכון עוברי‪ ,‬שורדים ומשפרים סימפטומים מוטוריים‪.‬‬
‫עליה מובהקת בקליטה של ‪ [18F]fluorodopa‬בשתל בסטריאטום נצפתה באמצעות‬
‫‪positron emission‬‬
‫)‪ tomography (PET‬בכ‪ 60 -‬חולי פרקינסון שעברו השתלה ) ;‪Lindvall et al., 1990; Sawle et al., 1992‬‬
‫‪Lindvall et al., 1994; Peschanski et al., 1994; Freeman et al., 1995; Remy et al., 1995; Wenning et‬‬
‫‪al., 1997; Hagell et al., 1999; Hauser et al., 1999; Piccini et al., 1999; Brundin et al., 2000; Mendez‬‬
‫‪ .(et al., 2000; Freed et al., 2001; Olanow et al., 2003‬בחולה אחד‪ ,‬הספיגה של ‪ fluorodopa‬ל‪putamen -‬‬
‫הייתה תקינה לחלוטין )בגדר הנורמה( לאחר ההשתלה‪ ,‬קרי השתל החזיר את המצב כמו לאדם בריא ) ‪Wenning‬‬
‫‪ .(et al., 1997; Piccini et al., 1999‬צביעות היסטופטולוגיות‪ ,‬בחתכי מוח של חולים שנפטרו לאחר ההשתלה‪,‬‬
‫אימתו את תוצאות ה‪ PET-‬שהתאים הדופאמינרגים שרדו ואף עצבבו מחדש את הסטריאטום ) ‪Kordower et‬‬
‫‪ .(al., 1995, 1996, 1998; Freed et al., 2001; Olanow et al., 2003‬בין ‪ 80000‬ל‪ 135000-‬שרדו בכל צד‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫אורך השלוחות העצביות שנוצרו מאתר ההשתלה לתוך ה‪ putamen -‬היה כ‪ 7 -‬מילימטר‪ ,‬ובאמצעות מיקרוסקופ‬
‫אלקטרוני נצפה שנוצרו סינפסות בין השלוחות העצביות החדשות לבין תאי המוח של המאחסן‪ .‬שרידותם של‬
‫‪42‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫התאים המושתלים הינה ארוכת טווח למרות התקדמות המחלה )פרקינסון( והמשך טיפול תרופתי‪ .‬אצל שני‬
‫חולים‪ ,‬שעברו השתלה חד צדדית ב‪ putamen-‬נצפתה קליטה גבוהה ביותר של ‪ fluorodopa‬גם לאחר ‪ 6‬ו‪ 10-‬שנים‬
‫לאחר ההשתלה )‪ .(Wenning et al., 1997; Piccini et al., 1999‬מאידך‪ ,‬בצד המוח שלא בוצעה השתלה נראה‬
‫ירידה מובהקת של קליטה בחזרה‪ ,‬דבר המעיד על המשך תמותה תאי עצב דופאמינרגים עצמאיים‪.‬‬
‫אינטרפרטציה של השיפור הקליני בניסויים הפתוחים )‪ (open-label‬בהשתלת תאים ממקור עוברי העלתה שאלות‬
‫מכיוון שהוכח בעבר אפקט פלצבו בטיפול במחלת פרקינסון ) ‪Shetty et al., 1999; de la Fuente-Fernandez et‬‬
‫‪ .(al., 2002‬בעקבות כך בוצעו שני מחקרים כפולי סמיות‪ ,‬כלומר גם חולה הפרקינסון וגם הרופא המטפל לא ידעו‬
‫האם הושתלו תאים או שרק בוצעה קדיחה בגולגולת‪ .‬תוצאות המחקרים פורסמו ב‪(Freed et al., 2001) 2001-‬‬
‫וב‪ .(Olanow et al., 2003) 2003-‬בניסוי הראשון‬
‫)‪(Denver-Columbia trail) (Freed et al., 2001‬‬
‫השתתפו ‪ 40‬חולי פרקינסון‪ ,‬מתוכם ‪ 20‬עברו‬
‫השתלה‪ .‬לא נצפה שיפור קליני מובהק כעבור שנה‬
‫בכלל החולים המושתלים לעומת אלו שלא עברו‬
‫השתלה‪ .‬מאידך‪ ,‬נצפה שיפור קליני מובהק‬
‫בחולים המושתלים הצעירים )צעירים מגיל ‪ (60‬עד‬
‫לנקודה מסוימת ואח"כ השיפור נעצר )תמונה ‪,12‬‬
‫גרף ירוק(‪ .‬החולים לא קיבלו טיפול תרופתי מדכא‬
‫חיסון‪ ,‬כמות התאים המושתלים הייתה נמוכה‬
‫לעומת הניסויים הגלויים בעבר והתאים הוחזקו‬
‫תמונה ‪ :9‬סיכום ניסויים קליניים בהשתלת תאים‬
‫מעוברים לחולי פרקינסון )‪(Winkler et al., 2005‬‬
‫בתרבית כ‪ 4 -‬שבועות לפני ההשתלה‪ .‬ל‪ 15%-‬מהחולים המושתלים היו תנועות בלתי רצוניות )‪ (dyskinesia‬קשות‬
‫בתקופת ה‪ ."off"-‬בניסוי השני )‪ (Tampa-MountSinai trail) (Olanow et al., 2003‬השתתפו ‪ 34‬חולי פרקינסון‪,‬‬
‫מתוכם ‪ 23‬עברו השתלה‪ .‬גם במחקר הנ"ל לא נצפה שיפור קליני כעבור שנתיים לעומת החולים שלא עברו‬
‫השתלה‪ .‬החולים קיבלו טיפול מדכא חיסון במשך ‪ 6‬חודשים לאחר ההשתלה‪ .‬ב‪ 11 -‬חולים שעברו השתלה‪,‬‬
‫התאים היו מעובר אחד‪ ,‬ואילו ‪ 12‬חולים עברו השתלה מתאים שמקורם מארבעה עוברים‪ .‬מעניין לראות שאותם‬
‫חולים שעברו השתלה מארבעה עוברים היה שיפור קליני בשישה חודשים לאחר ההשתלה ולאחר מכן הוא נסוג‬
‫)תמונה ‪ ,9‬גרף אדום(‪ .‬ל‪ 56%-‬מהחולים המושתלים היו תנועות בלתי רצוניות בתקופת ה‪ ."off"-‬יש לציין שבשני‬
‫המחקרים נצפתה שרידות ארוכת טווח של התאים המושתלים‪ .‬ניתוח שונה של תוצאות המחקרים המבוקרים‬
‫מראה באופן מובהק שיפור קליני בחולים שעברו השתלה לעומת החולים שלא עברו השתלה ) ‪Gordon et al.,‬‬
‫‪43‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ Gordon .(2004‬וחבריו )‪ (2004‬בדקו את מידת ה‪ reaction time-‬ו‪ ,movement time (MT)-‬פרמטרים‬
‫פיסיולוגים אובייקטיבים מדידים שמהווים אינדקס לפעילות מוטורית של חולי פרקינסון )‪.(Wardet al., 1983‬‬
‫נמצא‪ ,‬שיפור מובהק בפרמטרים הנ"ל אצל החולים המושתלים לעומת החולים שלא עברו השתלה‪ .‬בעקבות‬
‫המחקרים נכתבו תלי תלים של מאמרים ומאמרי מערכת הן בעיתונות הרפואית המקצועית והן בעיתונות‬
‫הכללית כדוגמת "‪ "The New-York Times‬ו‪ ."Time"-‬המאמרים דנו בשאלות אתיות והן בשאלות טכניות‬
‫ומקצועיות‪ .‬השאלות האתיות שהועלו‪ ,‬האם אין פגם מוסרי בביצוע ניסויים בעוברים – קרי לקחת תאים‬
‫מעוברים שנפלו עבור "חלקי חילוף" לאדם בוגר‪ ,‬האם קיים עניין חיוני בלבצע מחקר כזה כפול סמיות ובמחצית‬
‫מהחולים לקדוח בגולגולת ללא השתלת תאים? השאלות הרפואיות שהועלו‪ :‬מדוע כאשר נצפה שיפור קליני הוא‬
‫נסוג לאחר תקופה של מספר חודשים? מדוע‪ ,‬בסך‪-‬הכול‪ ,‬לא נצפה שיפור קליני במחקרים הנ"ל לעומת המחקרים‬
‫הפתוחים )תמונה ‪ ?(9‬מדוע קיימת שונות גדולה בתוצאות הקליניות בין המחקרים השונים?האם קיים צורך‬
‫בטיפול מדכא חיסון לפני ההשתלה במע"מ? מדוע אחוז גבוהה מהחולים פיתחו תופעות לוואי קשות של תנועות‬
‫בלתי רצוניות בתקופת ה‪ Freed ?"off"-‬וחבריו )‪ (2001‬הציעו שתופעות הלוואי נבעו מכך "שהשתל הנו יותר מדי‬
‫טוב" – הייתה צמיחה של סיבים עצביים מחוץ לאזור השתל וכתוצאה מכך הייתה הפרשת יתר של דופאמין‬
‫שגרמה לתנועות בלתי רצוניות בתקופת ה‪ ."off"-‬מאידך‪ (2002) Hagell ,‬ביצע הערכה מחודשת של ‪ 14‬חולים‬
‫שעברו השתלות )במחקרים פתוחים( ומצא שאין קשר בין המצאות וחומרת ‪ dyskinesia‬לבין מידת גדילת‬
‫והתפשטות התאים הדופאמינרגים המושתלים‪ .‬יש הטוענים )‪ (Isacson 2003‬שיתכן שרוב התאים בשתל הינם‬
‫ממקור ‪) A10‬תאים בעלי פעילות דופאמינרגית מזולימבית וקורטיקלית( לעומת התאים האידיאלים ‪) A9‬תאים‬
‫דופאמינרגים ייחודיים ל‪.(putamen-‬‬
‫המחקרים הרבים שנעשו בשימוש בתאי גע עצביים ממקור עובר מחלת פרקינסון סיפקו מידע רב לגבי השתלות‬
‫במערכת העצבים המרכזית – אלו סוגי תאים צריך‪ ,‬מהם תאי הגידול‪ ,‬כמה תאים להשתיל‪ ,‬היכן להשתיל‪ ,‬כיצד‬
‫לעקוב אחרי התאים המושתלים ועוד שאלות מדעיות שונות‪ .‬אך בסופו של דבר‪ ,‬אליה וקוץ בה‪ ,‬השימוש בתאים‬
‫ממקור עובר הנו כיום בעיתי ואינו משביע רצון דיו‪ ,‬ולכן חיוני לפתח אלטרנטיבות להשתלת תאים למחלת‬
‫פרקינסון‪.‬‬
‫‪ .7‬תאי גזע מדם חבל טבור אנושי כמקור לתאי עצב‬
‫חבל הטבור אשר משמש בתקופת ההיריון להעברת מזון וחמצן מהאם לתינוק מכיל מאגר גדול של תאי גזע של‬
‫הדם‪ .‬הם משמשים בהשתלת מח עצם לטיפול וריפוי מחלות ממאירות או תורשתיות‪ .‬מחקרים רפואיים‬
‫שהתפרסמו מראים כי תאי הגזע שמקורם בדם חבל הטבור הם בעלי יתרונות קליניים על פני תאי גזע שמקורם‬
‫בגוף של אדם בוגר‪ .‬ההשתלה של תאים שהופקו מדדם חבל טבור בוצעה כמעט בכל סוג של מחלה ממאירה או‬
‫‪44‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫תורשתית‪ .‬השתלת תאי גזע שמקורם בדם חבל טבור בוצעה לראשונה בשנת ‪ 1988‬בצרפת‪ .‬החולה היה ילד שסבל‬
‫מסוג נדיר של אנמיה ובעקבות הטיפול הוא חי עד עצם היום הזה‪ .‬מאז‪ ,‬נעשה שימוש בהשתלת תאי גזע מדם חבל‬
‫טבור לטיפול במגוון של מחלות‪ .‬התאים שהופקו מדם חבל טבור שימשו עד היום לטיפול בלמעלה מ‪ 60-‬סוגי‬
‫מחלות שונות‪ .‬השימוש הנפוץ ביותר הוא במקרים של לוקמיה‪ .‬הסוג השני של מחלות בהן יש צורך בתאים מדם‬
‫חבל טבור הוא המחלות התורשתיות‪ ,‬הכוללות את תאי הדם האדומים‪ ,‬בעיות חיסוניות והפרעות בחילוף‬
‫החומרים בגוף‪ .‬חולים עם בעיות לימפומה‪ ,‬מיאלודיספלסיה ואנמיה טופלו גם הם בהצלחה באמצעות הדם‬
‫הטבורי‪ .‬בנוסף תאי גזע מדם חבל טבור עתידים לשמש לריפוי רקמות גוף ולגידול עצמות‪ ,‬סחוס‪ ,‬תאי כלי דם‪,‬‬
‫תאי לב‪,‬תאי מערכת העצבים המרכזית‪ ,‬תאי כבד ותאים יוצרי אינסולין‪ .‬מרבית שימושים אילו נמצאים עדיין‬
‫בתחום הניסיוני‪ .‬בעבר הושמד חבל הטבור )עם הדם שבתוכו( לאחר הלידה‪ ,‬אולם הרפואה המודרנית מאפשרת‬
‫לנו לאסוף את הדם הנאגר בחבל הטבור לשמור אותו ולהשתמש בו לטיפול וריפוי בעתיד‪ .‬האיסוף מתבצע רק‬
‫לאחר לידת התינוק ומתוך שאיפה שהאיסוף יתבצע לפני לידת השלייה וזאת ע"י ניקוז ואיסוף הדם לתוך שקית‬
‫האיסוף‪ .‬ניתן להשתמש בדם חבל הטבור שהוקפא עד כ‪ 15 -‬שנה‪ .‬במקרה של צורך רפואי ובהתאם להתקדמות‬
‫המדע יתכן ובעתיד הדם ישמר לתקופה ארוכה יותר‪.‬‬
‫‪ Sanchez-Ramos‬וחבריו )‪ (2001‬מצאו לראשונה‪ ,‬שתאים מדם חבל טבור אנושי מסוגלים לעבור התמיינות‬
‫לתאים עם סמנים ומורפולגיה לתאי עצב‪ .‬התאים מדם חבל טבור עברו התמיינות בנוכחות חומצה ריטינואית ו‪-‬‬
‫)‪ nerve growth factor (NGF‬למשך ‪ 4-7‬ימים‪ .‬התאים הממוינים ביטאו סמנים לתאי עצב ‪Musashi1 (6.2%),‬‬
‫‪ β-tubulin III (18.7%),‬ולאסטרוציטים )‪ .glial acidic fibrillary protein (GFAP; 66%‬תאים ממוינים אלו‬
‫עברו השתלה למוחו המתפתח של ולד חולדה בין יומו לחלק הקידמי של )‪Zigova ) subventricular zone (SVZ‬‬
‫‪ .(et al., 2002‬כ‪ 20% -‬מהתאים המושתלים שרדו לאחר ‪ 30‬ימים‪ .‬כ‪ 2%-‬מהתאים המושלים ביטאו ‪GFAP‬‬
‫ומיעוט ‪ .(<0.2%) β-tubulin III‬רוב התאים המושתלים נשארו ב‪ SVZ-‬ומיעוט נדדו ל‪ cortex-‬ול‪corpus -‬‬
‫‪ .callosum‬בהזרקת תאים מדם חבל טבור הומני )‪ (77-95% CD34+‬לווריד הזנב של חולדה כמודל ל‪24) stroke -‬‬
‫שעות לאחר הנזק( נמצא שיפור קליני משמעותי )‪ .(Chen et al., 2001‬מעניין היה לראות שרובם של התאים‬
‫המוזרקים בווריד הזנב נדדו לאזור הפגוע והתמיינו לתאי עצב שנצבעו ל‪NeuN (2%), MAP2 (3%)-‬‬
‫ולאסטרוציטים )‪ .GFAP (6%‬בעבודות רבות מאז נמצא שתאים מדם חבל טבור אנושי יכולים לעבור התמיינות‬
‫לתאים דמויי תאי‪-‬עצב ‪ (Hou et al., 2003; Jeong et al., 2004; Ryu et al., 2004 ) in-vitro‬ואף ‪ in vivo‬בחיות‬
‫מודל ל‪ stroke -‬ול‪.(Garbuzova-Davis et al., 2003; Taguchi et al., 2004) amyotrophic lateral sclerosis-‬‬
‫מאידך‪ ,‬לא תוארה עבודה שתאים התמיינו לתאי עצב דופאמינרגים‪.‬‬
‫‪45‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ .8‬תאי גזע מבוגר כמקור לתאים דמויי תאי עצב דופאמינרגים‬
‫‪ 8.1‬תאי גזע מבוגר‬
‫תאי גזע בודדו מרקמות של אורגניזמים בוגר כגון‪ :‬מוח‪ ,‬עור‪ ,‬מוח העצם ושריר והפוטנציאל ההתפתחותי שלהם‬
‫כנראה רחב יותר מהתחזיות המקוריות )‪ .(Joshi & Enver 2002‬בהשוואה לתאי גזע עובריים‪ ,‬תאי גזע מבוגר‬
‫הייחודיים לרקמה מסוימת‪ ,‬הם בעלי יכולת התחדשות נמוכה יותר ולמרות התמיינותם לשורות תאים רבות‪ ,‬הם‬
‫אינם מולטיפוטנטיים‪ .‬בשנים האחרונות‪ ,‬מספר מחקרים הראו‪ ,‬שתאי גזע הייחודיים לרקמה יכולים להתמיין‬
‫וליצור תאים עם פנוטיפ של רקמות אחרות אחרים‪ ,‬כגון‪ :‬תאי סטרומה ממוח העצם‪ ,‬שניתן למיינם לתאי שלד‬
‫)‪ ,(Ferrari et al., 1998‬תאי שריר הלב )‪ (Makino et al., 1999‬והפטוציטים )‪ ,(Petersen et al., 1999‬תאים‬
‫שאינם חלק מהמגוון הטבעי והרגיל שלהם‪ .‬קיומם של תאי גזע ברקמות בתר‪-‬עובריות עם פוטנציאל לא ידוע‬
‫לשגשוג ולהתמיינות‪ ,‬פותח אפשרויות חדשות לשימוש בתאי גזע עצמיים לטיפול במחלות ניווניות או בחבלות‬
‫שאינן ניתנות לריפוי בדרך אחרת‪ ,‬ללא תופעות לוואי חיסוניות‪ .‬בנוסף ליתרון החיסוני של השימוש בתאי גזע‬
‫עצמיים‪ ,‬ניצול תאים אלה אינו מוגבל ע"י שיקולים אתיים‪.‬‬
‫במהלך התפתחות עוברית‪ ,‬תאי גזע פלוריפוטנטיים הופכים ל‪"-‬תאי גזע מחויבים" )‪,(determined stem cells‬‬
‫שיכולים ליצור רקמות ייחודית )‪ .(Gage 1998‬לכן‪ ,‬תאי גזע עצביים יוצרים באופן טבעי את תאי מערכת העצבים‬
‫ותאי גזע המטופואטים יוצרים את תאי מערכת הדם‪ .‬תאי גזע מחויבים מתמיינים לתאי אב מכוונים ‪committed‬‬
‫)‪ ,(progenitor cells‬השומרים על יכולת מוגבלת להתרבות ולהתמיין‪ .‬בעשור הקודם‪ ,‬החוקרים הפיקו תאים‬
‫מכוונים אלה מרקמות שונות‪ ,‬הכוללות מוח העצם‪ ,‬דם פריפרי‪ ,‬מוח‪ ,‬כבד ודם חבל הטבור‪ ,‬גם מחיות בוגרות וגם‬
‫מבני אדם‪ .‬בזמן שרוב התאים המרכיבים את הרקמות הבוגרות הם תאים ממוינים‪ ,‬המבטאים מגוון פנוטיפים‬
‫ייחודיים והמותאמים לסביבתה של הרקמה‪ ,‬תאי גזע "נחים" מתקיימים מקומית או בסירקולציה סיסטמית‬
‫ומופעלים ע"י גירוי סביבתי להתחדשות פיזיולוגית או פתולוגית של הרקמות )‪.(Asahara et al., 2000‬‬
‫כפי הנראה‪ ,‬היכולת הטיפולית של תאי גזע עובריים היא בעלת יתרונות מסוימים על פני תאי גזע בוגרים‪ .‬ראשית‪,‬‬
‫תאי גזע בוגרים קשים להפקה ולגידול בתרבית‪ .‬בניגוד‪ ,‬תאי גזע עובריים מופקים‪ ,‬כיום‪ ,‬בקלות יחסית‬
‫מבלסטוציסט ומתחלקים בצורה אינסופית בתרבית‪ .‬שנית‪ ,‬תאי גזע עובריים מאפשרים מניפולציה גנטית ע"י‬
‫רקומבינציה הומולוגית לתיקון פגמים גנטיים )‪ .(Rideout et al., 2002‬תאי גזע בוגרים‪ ,‬לעומת זאת‪ ,‬יכולים‬
‫לעבור מניפולציה גנטית רק דרך הכנסה של טרנסגנים רטרווירליים )‪ ,(retroviral transgenes‬המבטאים ביתר‬
‫גנים ברמות שונות ועלולים לגרום ליצירת מוטציות ולסרטן )‪ .(Check 2003‬שלישית‪ ,‬תאי גזע עובריים‪ ,‬מטבעם‪,‬‬
‫מסוגלים להתמיין לכל טיפוסי התאים בעזרת השימוש בתנאי תרבית ספציפיים או מניפולציות גנטיות‪ .‬תאי גזע‬
‫בוגרים‪ ,‬לעומת זאת‪ ,‬יוצרים רושם של תאים בעלי יכולת התמיינות מוגבלת )‪.(Hochedlinger & Jaenisch 2003‬‬
‫‪46‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫מצד שני‪ ,‬לתאי גזע בוגרים יתרונות רבים לעומת תאי גזע עובריים עבור השימוש בריפוי תאי‪ .‬בנוגע להגבלות‬
‫אתיות‪ ,‬לתאי גזע בוגרים יש יתרון משמעותי על תאי גזע עובריים‪ .‬המתנגדים לשימוש בתאי גזע עובריים מציעים‬
‫את האפשרות של תאי גזע בוגרים למימוש התועלת הרפואית ללא בעיות אתיות‪ .‬למרות שהחוקרים יוצרים את‬
‫תאי הגזע העובריים מעוברים לפני ההשרשה ברחם‪ ,‬מדינות שונות‪ ,‬בהשראת ההלכה הקתולית‪ ,‬אסרו על הפקת‬
‫תאי גזע עובריים מעוברים "עודפים" הנוצרים בהפריה חוץ גופית‪ ,‬חוקרים רבים אינם מרגישים בנוח להרוס‬
‫עוברים אנושיים‪ ,‬גם אם אלה לעולם לא יושתלו לרחם‪ .‬בנוסף להגבלות אתיות אלה‪ ,‬יש בעיות טכניות בשימוש‬
‫בתאי גזע עובריים‪ .‬תאים אלה מופקים מעוברים צעירים מאוד ולמרות שקיימות מספר שורות של תאי גזע‬
‫עובריים אנושיים‪ ,‬תאים אלה לא יהיו בעלי תאימות אימונולוגית לרוב החולים המועמדים להשתלת תאים‪ .‬לכן‪,‬‬
‫החוקרים יצטרכו להפיק שורות נוספות רבות של תאי גזע עובריים או לחלופין‪ ,‬להתאים את תאי הגזע העובריים‬
‫לכל חולה ע"י שיבוט למטרות ריפוי‪ .‬בנוסף‪ ,‬תאי גזע עובריים לא ממוינים יוצרים טרטומות ‪ -‬גידולים שפירים‬
‫המכילים ערבוב רקמות מסוגים שונים – לאחר ההשתלה‪ .‬לכן‪ ,‬כל תאי גזע עובריים חייבים לעבור התמיינות‬
‫מוחלטת לתא המטרה בתרבית‪ ,‬לפני ההשתלה )‪ .(Stuar & Morrison 2002‬לאחרונה‪ ,‬פורסמה עבודתם של‬
‫‪ Rubio‬וחבריו )‪ (2005‬המתארת לראשונה התפתחות ספונטאנית של תאי סרטן בתרביות של תאי גזע מזנכימליים‬
‫)ממקור תאי שומן( רק לאחר תרבית ארוכת טווח בת ‪ 4-5‬חודשים‪ .‬כאמור זאת העבודה הראשונה והיחידה שדנה‬
‫בנושא‪ .‬יש לציין שקיימת ביקורת על העבודה הזאת ואף נטען שיש לבדוק את התורם שנתן את התאים אולי יש‬
‫לו מחלות ממאירות )‪ .(Kassem & Burns, 2005‬בנוסף לכך‪ ,‬קל להחזיק תאי גזע בוגרים בתרבית בצורה לא‬
‫ממוינת וניתן לנצלם לצורך השתלות עצמאיות ללא בעיות חיסוניות‪.‬‬
‫כאמור‪ ,‬השתלה אוטולוגית של תאים לטיפול במחלת הפרקינסון הנה בעלת יתרונות רבים‪ .‬גישה זו מונעת תגובה‬
‫חיסונית כנגד השתל ומשפרת את סיכויי ההישרדות של התאים המושתלים‪ .‬בנוסף‪ ,‬היא ממזערת את סיכויי‬
‫העברה של מחלות מדבקות ואינה דורשת טיפול במדכאי מערכת החיסון‪ .‬לבסוף‪ ,‬גישה זו לא מערבת את השימוש‬
‫השנוי במחלוקת ברקמה עוברית או בשורות תאים עובריים‪.‬‬
‫בשנים האחרונות תוארו עבודות רבות המתארות הימצאותם של תאי גזע ברקמות שונות ביונק הבוגר‪ .‬יתרה‬
‫מכך‪ ,‬ברבות מתוך עבודות אלו הוצג שתאי גזע אלו מבטאים סמנים של תאי גזע עצביים כגון ‪ nestin‬ו\או שתאים‬
‫אלו בעלי יכולת להתמיין לתאים עם סמנים לתאי גזע‪ .‬להלן דוגמאות של תאי גזע מרקמות שונות המבטאים את‬
‫הסמן של תאי גזע עיצביים ‪inner ear (Li et al., 2003); pancreatic islets (Zulewski et al., 2001; :nestin‬‬
‫‪Seaberg et al., 2004); hair follicle (Li et al., 2003); small bowel (Suarez-Rodriguez & Belkind‬‬‫)‪ .Gerson, 2004‬בנוסף‪ ,‬התמיינות תאי גזע מרקמות שונות לתאים דמויי תאי עצב תוארה בתאים הבאים‪:‬‬
‫;‪retinal pigment epithelial (Amemiya et al., 2004); skeletal muscle (Romero-Ramos et al., 2002‬‬
‫‪47‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪Vourc'h et al., 2004); skin (Toma et al., 2001; Joannides et al., 2004); adipose-derived stromal cells‬‬
‫‪(Safford et al., 2002, 2004; Ashjian et al., 2003; Kang et al., 2003); myoblasts (Watanabe et al.,‬‬
‫)‪ .2004‬יש לציין שכל התיאורים בעבודות אלו המתארים התמיינות לתאים דמויי תאי עצב הינם ראשוניים‬
‫בלבד‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬באף אחד מהעבודות הנ"ל לא תוארה התמיינות לתאי עצב תפקודיים כגון‪ ,‬תאים דופאמינרגים או‬
‫כולינרגים‪ .‬לכן‪ ,‬בפרקים הבאים יתוארו ‪ 2‬קבוצות עיקריות של תאי גזע מבוגר כמקור לתאי עצב דופאמינרגים‪:‬‬
‫תאי גזע עצביים ממע"מ ותאי גזע ממח העצם‪ .‬בתאי גזע עצביים ממע"מ תואר בספרות בהרחבה התמיינותם‬
‫לתאי עצב דופאמינרגים והשימוש בהם למודלים למחלת פרקינסון‪ .‬בתאי גזע ממח העצם ישנם ממצאים‬
‫ראשונים בלבד שתאים אלו יכולים להוות מקור לתאי עצב דופאמינרגים ועיקר עבודת מחקר זאת עוסקת‬
‫בהשראת התמיינות תאי גזע ממח העצם לתאים דמויי תאי עצב דופאמינרגים‪.‬‬
‫‪ 8.2‬תאי גזע עצביים במערכת העצבים המרכזית של בוגר‬
‫מערכת העצבים המרכזית של יונקים בוגרים מורכבת מארבעה סוגים עיקריים של תאים ממוינים‪ :‬תאי עצב‪,‬‬
‫אסטרוציטים‪,‬‬
‫אוליגודנדרוציטים‬
‫ותאים‬
‫אפנדימלים )‪ .(ependymal cells‬תאי גזע‬
‫עצביים )‪ (neuronal stem cells, NSCs‬הנם‬
‫תאי גזע מולטיפוטנטים מתחדשים‪ ,‬שמקורם‬
‫במערכת העצבים המרכזית‪ ,‬היכולים ליצור‬
‫תאים השייכים לכל שורות התאים של מערכת‬
‫העצבים‪:‬‬
‫‪,‬תאי‬
‫ואסטרוציטים‬
‫עצב‪,‬‬
‫)‪2002‬‬
‫אוליגודנדרוציטים‬
‫‪.(Arenas‬‬
‫ההנחה‬
‫שהייתה מקובלת‪ ,‬שאנו נולדים עם מספר‬
‫מסוים של תאי עצב והמוח אינו מסוגל לייצר‬
‫תמונה ‪ :10‬תאי גזע עצביים במוח אנושי בוגר )‪(Goldman 2005‬‬
‫תאי עצב חדשים ולחדש את עצמו‪ ,‬הופרכה‬
‫)‪ .(Taupin & Gage 2002‬יצירת תאי עצב חדשים )‪ (neurogenesis‬מתרחשת במהלך הבגרות במוחו של יונק‬
‫בוגר ותאי עצב חדשים נוצרים ברציפות בחלק מהאזורים של מערכת העצבים המרכזית הבוגרת ) ‪Corotto et al.,‬‬
‫‪ .(1993; Luskin 1993‬אזור ה‪ SVZ-‬של המוח הקדמי ו‪ dentate gyrus (DG)-‬נחשבים למקורות עיקריים ל‪-‬‬
‫‪ NSCs‬מולטיפוטנטיים )‪) (Taupin & Gage 2002‬תמונה ‪ NSCs .(10‬ב‪ SVZ-‬בוגר יוצרים רצף תאי עם הליבה‬
‫של פקעת ההרחה )‪ (olfactory bulb, OB‬דרך שלוחה הנקראת זרם הנדידה הרוסטרלי ) ‪rostral migratory‬‬
‫‪ .(stream, RMS‬תאים‪ ,‬שמקורם ב‪ SVZ-‬נודדים דרך ‪ RMS‬בכדי להתמקם ב‪ .OB-‬תוצאות המחקרים ‪in vitro‬‬
‫‪48‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫של דגימות מניתוחים אנושיים הראו‪ ,‬שניתן לבודד תאי גזע עצביים מאזורים שונים של המוח האנושי הבוגר‪,‬‬
‫כולל דופן החדר הלטרלי‪ ,‬החומר הלבן הצרברלי וההיפוקמפוס )‪) (Palmer et al., 2001; Roy et al., 2000‬תמונה‬
‫‪ .(10‬קצב יצירת תאי עצב חדשים מושפע מגורמים פנימיים וחיצוניים‪ .‬נקבע ש‪ 10,000-‬נוירונים חדשים נוספו בכל‬
‫יום ל‪ DG-‬של חולדה בוגרת )‪ (Cameron & McKay, 2001‬וקצב יצירת תאי העצב בפקעת ההרחה כפי הנראה‬
‫גבוה במספר רמות‪ .‬בנוסף ליצירת תאי עצב חדשים בפקעת ההרחה וב‪ ,DG-‬הוצע שקיימת יצירה מועטה של תאי‬
‫עצב חדשים גם בחלקים אחרים של ההיפוקמפוס והקורטקס )‪,(Gould et al., 1999; Rietze et al., 2000‬‬
‫למרות שגישה זאת שנויה במחלוקת )‪ .(Kornack & Pakic 2001‬יתר על כן‪ ,‬מחקרים במודלים של שבץ בחיות‬
‫הראו יצירה של תאי עצב חדשים במספר אזורים נוספים בתגובה לפגיעה ) ‪Arvidsson et al., 2002; Nakatomi‬‬
‫‪.(et al., 2002‬‬
‫‪ Lie‬וחבריו )‪ (2002‬הראו ש‪ SNpc-‬של חולדה בוגרת מכילה אוכלוסייה של תאי גזע עצביים המתחלקים בצורה‬
‫פעילה ויוצרים ‪ in situ‬רק תאי גליה בוגרים ולא תאי עצב‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬לאחר הוצאתם של התאים האלה מ‪-‬‬
‫‪ SNpc‬של הבוגר‪ ,‬הם בעלי יכולת לעבור התמיינות ‪ in vitro‬לתאי עצב‪ .‬לאחר השראת התמיינותם ע"י חומצה‬
‫רטינואית‪ FGF2 ,‬ו‪ FGF8-‬התאים התמיינו לתאי עצב )‪ ,(β tubulin III‬אסטרוציטים )‪(GFAP‬‬
‫ואוליגודנדרוציטים‪ .‬בנוסף‪ ,‬נבדקה ההשערה האם מוות של תאי עצב דופאמינרגים ב‪ SNpc-‬יכול להשרות יצירה‬
‫מחודשת של הנוירונים באותו האזור )‪ 6-OHDA .(Lie et al., 2002‬הוזרק ל‪medial forebrain bundle-‬‬
‫השמאלי בחיות‪ ,‬הליך הגורם לאיבוד סלקטיבי של תאי עצב דופאמינרגים ב‪ .SNpc-‬נמצא שתאי גזע עצביים‬
‫חדשים התמיינו )‪ (in-vivo‬לתאי עצב אך ללא סמנים של תאים דופאמינרגים‪ .‬מאידך‪ ,‬במחקר אחר התגלה‬
‫שקיימת תחלופה נמוכה של תאי עצב הדופאמינרגים בעלי השלוחות במוחו של עכבר בוגר ועל עליה ביצירת תאי‬
‫עצב דופאמינרגים חדשים ב‪ SNpc-‬לאחר פגיעה חלקית בתאי העצב הדופאמינרגים באמצעות ‪Zhao et ) MPTP‬‬
‫‪ .(al., 2003‬תוצאות של מחקרים ראשוניים אלו מרמזות על כך שתאי גזע שוכנים ב‪ SNpc-‬של הבוגר ויכולים‬
‫ליצור תאי גזע חדשים כאשר הם נחשפים לסיגנלים סביבתיים מתאימים‪ .‬בנוסף‪ ,‬נמצאה יכולת התניה ונדידת של‬
‫תאים מאזור ‪ SVZ‬ע"י ‪ TGFalpha‬לאזור הסטריאטום )‪ .(Fallon et al., 2000‬חשיפתם של המנגנונים‬
‫המולקולאריים המבקרים את יצירתם של תאי עצב דופאמינרגים חדשים‪ ,‬יכולה לאפשר פיתוח אסטרטגיות‬
‫המאיצות את הייצור שלהם במוח הבוגר ולהציע צורת טיפול יעילה למחלת פרקינסון‪ .‬ללא ספק‪ ,‬מנגנונים אלה‬
‫של תיקון עצמי‪ ,‬הפעילים ב‪ SNpc-‬בבוגר‪ ,‬אינם מספיקים וחייבים להיות יעילים יותר‪ .‬אחד האתגרים‬
‫המחקריים יהיה לזהות את האותות שיכולים להוביל את תאי הגזע ב‪ SNpc-‬להתמיין לשורה הדופאמינרגית‪.‬‬
‫‪49‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫אין בנמצא כיום עדות ישירה ליצירת תאי עצב חדשים בתגובה לפציעה אקוטית‪ ,‬פרט לעובדה‪ ,‬שחולים צעירים‬
‫מחלימים טוב ומהר יותר משבץ איסכמי מאשר חולים מבוגרים‪ ,‬זאת אולי במידת מה הודות לקיום אוכלוסיית‬
‫תאי גזע עצביים פעילה יותר הקיימת בחולים הצעירים לעומת המבוגרים )‪.(Armstrong & Barker, 2001‬‬
‫למרות קיומם של ‪ NSCs‬פנימיים‪ ,‬יכולת ההתחדשות העצמית של המוח הבוגר היא דלה‪ .‬ממצאים אלה ניתן‬
‫להסביר ע"י גורמים מיקרו‪-‬סביבתיים הקיימים ברוב האזורים של מערכת העצבים המרכזית בבוגר ויכולים‬
‫למנוע התמיינותם של ‪ NSCs‬פנימיים לתאי עצב בשלים‪ ,‬או ע"י מספרם המועט של ‪ ,NSCs‬שאינו מאפשר ריפוי‬
‫עצמי אפקטיבי )‪.(Okano, 2002a‬‬
‫‪ 8.2.1‬התמיינות תאי גזע עצביים ממוח הבוגר לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫התמיינותם של תאי גזע עצביים ממוח עוברי לתאי עצב דופאמינרגים ‪ in vivo‬ו‪ in vitro-‬כפי שתוארה במחקרים‬
‫רבים ) ‪Ling et al., 1998; Studer et al., 1998, 2000; Potter et al., 1999; Wagner et al., 1999; Storch et‬‬
‫‪ ,(al., 2001; Yan et ai., 2001‬יכולה להציע שיטות אפקטיביות ללמוד את הבקרה של הפנוטיפ העצבי‬
‫הדופאמינרגי‪ .‬הפלסטיות של התאים האלה מעידה על כך שהם מסוגלים להגיב לאותות המתאימים ויכולים‬
‫להוות כלי אפקטיבי ללמוד את האירועים המקוריים הדרושים ליצירת תאי עצב דופאמינרגים‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬אין‬
‫אני צופה שהשימוש ב‪ NSCs-‬ממוח עוברי יהיה חלק מהטיפול התאי במחלת הפרקינסון‪ ,‬בעיקר בגלל בעיות‬
‫אתיות והקושי לייצר תאים אלה מהעובר‪.‬‬
‫השראת התמיינות‪ ,‬בתרבית או בחיה השלמה‪ ,‬של ‪ NSCs‬לתאי עצב דופאמינרגים נעשתה בשיטות שונות‪ .‬במהלך‬
‫ההתפתחות‪ ,‬ההתמיינות העצבית מושפעת ממגוון מולקולות איתות חוץ תאיות הפועלות באמצעות רצפטורים‬
‫גרעיניים או באמצעות אחד ממגוון רב של גלי איתות‪ ,‬המתווכים ע"י הקולטנים שעל פני התא‪ .‬ביטוי יתר של‬
‫‪ Nurr1‬ב‪ NSCs-‬בוגרים המופקים מהיפוקמפוס או חשיפתם של התאים האלה לחומצה רטינואית או ‪forskolin‬‬
‫היה מספיק בכדי להשרות ביטוי של ‪ .(Sakurada et al., 1999) TH‬בנוסף‪ ,‬בניסוי זה נמצא ש‪ Nurr1-‬נקשר‬
‫לפרומוטר של ‪ TH‬וכך מעודד את ההפעלה של הגן‪ .‬השראת התמיינות‪ ,in-vitro ,‬של ‪ NSCs‬מ‪subependyma-‬‬
‫)של המוח הקדמי של עכבר בוגר( למספר מועט של תאים המבטאים ‪ (0.23%) TH‬התאפשרה הודות חשיפת‬
‫התאים ל‪ FGF2-‬ומדיום מותנה )‪ (condition media‬המופק משורות תאי גליה למשך כשלושה ימים ) & ‪Daadi‬‬
‫‪.(Weiss, 1999‬‬
‫השראת התמיינותם של ‪ NSCs‬לתאים דופאמינרגים תוארה גם במודלים ‪ .in-vivo‬תאי גזע עצביים )מהצרבלום‬
‫של העכבר הנולד( שהושתלו לסטריאטום תקין או פגוע )ע"י ‪ (6-OHDA‬של חולדה‪ ,‬נדדו בתוך הסטריאטום‬
‫וביטאו סמנים המעידים על התמיינות עצבית )‪ NSE ,β-tubulin III‬ו‪ ,in-vivo (NeuN-‬אך לא להתמיינות של‬
‫‪50‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫תאי גליה )‪ .(Yang et al., 2002) (A2B5- ,MBP- ,GFAP-‬יתרה מכך‪ ,‬ב‪ 70%-‬מהמקרים‪ ,‬התאים ביטאו אנזימים‬
‫הקשורים לסינתזת דופאמין בלבד )‪ (TH, AADC‬ולא לנוירוטרנסמיטורים אחרים‪ 5-2 ,‬שבועות לאחר ההשתלה‪.‬‬
‫מאידך‪ ,‬בהשוואת התנהגות מוטורית לפני ואחרי ההשתלה‪ ,‬לא נצפה שיפור עקבי בהתנהגות המוטורית במקרים‬
‫בהם השתלים ביטאו ‪ 4 ,TH‬שבועות לאחר ההשתלה‪ .‬החוקרים הסיקו‪ ,‬שלאחר השתלת התאים הן למוח של‬
‫חולדה בריאה או חולדה שנפגעה ע"י ‪ ,6-OHDA‬המוח הבוגר מכיל איתותים פנימיים המספיקים בכדי לכוון את‬
‫הביטוי הספציפי של התכונות הדופאמינרגיות ב‪ NSCs-‬מולטיפוטנטיים לא בשלים‪ .‬כפי הנראה‪ ,‬איבוד סוגים‬
‫ספציפיים של תאים מאותת למוח לייצר גורמי התמיינות המסוגלים לכוון את תאי הגזע המושתלים לבחור‬
‫בפנוטיפ המתאים‪ .‬אותות טבעיים הזמינים במוח יכולים לכוון את האינטגרציה ואת ההתמיינות למעשה של כל‬
‫ה‪ NSCs-‬המושתלים ובכך להביא להתפתחותם לתאים דמויי נוירונים‪ ,‬המבטאים תכונות דופאמינרגיות‪.‬‬
‫בנוסף למחקרים השונים בהם דווח על השראת ‪ NSCs‬לתאי עצב דופאמינרגים נבדקה האפשרות האם ‪NSCs‬‬
‫מסוגלים להגן על התאים הדופאמינרגים במחלת פרקינסון‪) NSCs .‬ממקור עכברי( מהונדסים לביטוי יתר של‬
‫‪ GDNF‬הושתלו לסטריאטום של עכבר מודל למחלת פרקינסון ‪ .(Akerud et al., 2001) GDNF‬תאים אלו נקלטו‬
‫והשתלבו היטב ברקמה והתמיינו לתאי עצב )‪ ,(Neu-N‬אסטרוציטים )‪ (GFAP‬ואוליגודנדרוציטים )‪,(CNPase‬‬
‫חודש אחד לאחר ההשתלה ויצרו רמות גבוהות ויציבות של ‪ .GDNF‬אימונוהיסטוכימיה כפולה ל‪ TH-‬ו‪GDNF-‬‬
‫הראתה בבירור שהתגובה החיסונית ל‪ GDNF-‬קיימת גם ב‪ ,SNpc-‬עדות לכך‪ ,‬ש‪ GDNF-‬הועבר ביעילות‬
‫"אחורה" )‪ (retrograde manner‬ע"י תאי העצב הדופאמינרגים מהסטריאטום ל‪ SNpc-‬או שתאים שהושתלו‬
‫לסטריאטום נדדו ל‪ NSCs .SNpc-‬המבטאים ‪ GDNF‬הפחיתו את איבוד תאי העצב הדופאמינרגים ב‪,SNpc-‬‬
‫העלו את הרמות של התגובה החיסונית ל‪ TH-‬בסטריאטום והביאו לשיפור במבחנים התנהגותיים ) ‪Akerud et‬‬
‫‪.(al., 2001‬‬
‫‪ Levesque‬ו‪ (2002a,b) Neuman-‬מהמרכז הרפואי ‪ Cedars-Sinai‬בלוס אנג'לס‪ ,‬קליפורניה‪ ,‬דיווחו שתאי גזע‬
‫עצביים המופקים מרקמת החולה עצמו יכולים לשמש כמקור לתאי עצב דופאמינרגים ולסייע בטיפול במחלת‬
‫הפרקינסון‪ .‬המתודולוגיה של החוקרים כללה הפקה של תאי גזע עצביים‪ ,‬ריבוי והשראת התמיינות לתאי עצב‬
‫המפרישים דופאמין‪ ,in-vitro ,‬והחזרה סלקטיבית של התאים לתוך אזורי מטרה שונים במוחו של החולה‪ .‬הם‬
‫החלו לפני מספר שנים בניסוי קליני שלב ‪ II‬שכולל ‪ 12‬חולי פרקינסון‪ .‬באחד המקרים דיווחו על טייס שחלה‬
‫במחלת פרקינסון ועבר השתלה עצמית של תאי עצב דופאמינרגים‪ .‬סריקות המוח ‪ PET‬הראו שדופאמין מיוצר‬
‫ומנוצל‪ .‬כבר לאחר שלשה חודשים נצפתה עליה של ‪ 58%‬בקליטה של דופאמין‪ .‬שישה חודשים לאחר ההשתלה‬
‫‪51‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫נצפתה נסיגה מתמשכת בחסרים המוטוריים‪ .‬שנה לאחר הניתוח‪ ,‬הדרוג הכולל של החולה על פי סקלת ה ‪unified‬‬
‫‪ (UPDRS) PD rating scale‬השתפר ב‪ 83%-‬בהעדר טיפול תרופתי‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬נצפה שיפור קליני‪ ,‬המתמשך‬‫לאורך הזמן‪ .‬שנתיים לאחר סיום התהליך‪ ,‬לחולה לא היו שום סימפטומים של מחלת הפרקינסון ויכול היה‬
‫לחזור ולטוס‪ .‬התגלית העיקרית של המחקר הזה היא שתאי גזע עצביים המופקים מהחולה עצמו יכולים להוות‬
‫מקור לתאי גזע דופאמינרגים‪ .‬אחד החסרונות הבולטים בשיטה שהחולה צריך לעבור פעמיים ניתוחי ראש‪ ,‬על כל‬
‫המשמע מכך‪ .‬פעם ראשונה על מנת להפיק ממוחו תאי גזע עצביים ופעם השנייה השתלת התאים הממוינים‪.‬‬
‫היתרון הראשי של השיטה‪ ,‬שהתהליך המשקם נראה לעת עתה בטוח‪ ,‬יעיל ובעל יכולת לשפר את הסימפטומים‬
‫המוטוריים של חולי פרקינסון‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬הליך זה הנו ניסיוני וראשוני‪ ,‬המחייב מחקרים נוספים לפני יישומו‬
‫כהליך טיפולי המוני‪ .‬הגילוי שמוחו של אדם בוגר מכיל ‪ ,NSCs‬העלה את התקווה שתאי גזע עצביים של החולה‬
‫עצמו יכולים להיות מקור לתאי עצב דופאמינרגים לטיפול במחלות ניוון עצבי כגון מחלת הפרקינסון‪) .‬פרוט נוסף‬
‫לגבי השתלתם של תאי גזע עצביים למודלים למחלת פרקינסון ראה בטבלה ‪ .5‬התמיינות בתרבית – טבלה ‪.(14‬‬
‫‪52‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ 8.3‬תאי גזע ממח העצם‬
‫‪ 8.3.1‬תאים מזנכימלים ממוח העצם )‪(Bone marrow mesenchymal stem cells‬‬
‫השימוש בתאים‪ ,‬שמקורם בחולה‬
‫עצמו יכול לספק אסטרטגיית השתלה‬
‫עצמית המונעת הכנסת חומרים זרים‪,‬‬
‫עוקפת סוגיות אתיות רבות ומורידה‬
‫בצורה משמעותית את הצורך בדיכוי‬
‫חיסוני‪ .‬בשנים אחרונות‪ ,‬תאי גזע‬
‫ממוח העצם‪ ,‬התומכים ביצירת תאי‬
‫הדם השונים‪ ,‬עוררו עניין רב‪ .‬במיקרו‪-‬‬
‫סביבה של מוח העצם ניתן למצוא‬
‫שלוש‬
‫מערכות‬
‫‪endothelial‬‬
‫תאים‬
‫עיקריות‪:‬‬
‫‪hematopoietic,‬‬
‫ו‪-‬‬
‫‪) stroma‬תמונה ‪ .(11‬תאי סטרומה‬
‫ממח עצם ‪(bone marrow stromal‬‬
‫תמונה ‪ :11‬פוטנציאל ההתמיינות של תאים מזנכימלים ממח העצם‬
‫)‪(Kotobuki et al., 2004‬‬
‫)‪ cells, BMSc‬תוארו לראשונה ע"י ‪ (1987 ,1976 ,1970) Friedenstein‬ושותפיו בשנות ה‪ .70-‬הם מצאו שקיימת‬
‫אוכלוסיית תאים קטנה במח העצם דמויי‪-‬פיברובלסטיים בעלת יכולת הידבקות למשטחי הגידול מפלסטיק‪.‬‬
‫אוכלוסיה הטרוגנית זו כוללת תאים שהתחייבו‪ ,‬וכאלה שלא התחייבו להתפתח לקו מסוים של תאים סומאטיים‪.‬‬
‫באופן טבעי‪ BMSc ,‬מספקים את המיקרו‪-‬סביבה לתהליך ההמטופואטי‪ ,‬ע"י תמיכה בהתחלקות‪ ,‬שגשוג‪,‬‬
‫ובהתמיינות של ‪ ,(HSCs) hematopoietic stem cells‬ובנוסף מהווים מקור ל‪mesenchymal stem cells -‬‬
‫)‪ .(MSCs‬רובם של החוקרים כיום אינם מבדילים בין תאי סטרומה לתאים מזכימליים במוח העצם וטוענים‬
‫שמדובר בשמות נרדפים לאותם תאים )‪ .(Prockop 1997‬תאים מזנכימלים‪ ,‬הינם תאי גזע‪ ,‬בעלי יכולת‬
‫התחדשות עצמית סימטרית )‪ ,(self-renewal‬המהווים מקור להתפתחות של תאי רקמות החיבור ובעלי יכולת‬
‫להתמיין בתרבית ובגוף החי לתאי עצם )‪ ,(osteocyte‬סחוס )‪ ,(chondrocyte‬שומן )‪ ,(adipocyte‬שריר ‪(smooth‬‬
‫)‪ ,muscle‬גיד )‪) (tenocte‬תמונה ‪Prockop, 1997; Pittenger et al., 1999; Bianco et al., 2000, 2001; ) (13‬‬
‫‪ .(Colter et al., 2000; Deans & Moseley 2000; Krause 2002‬מחקרים אחרונים מראים שתאי גזע ממח‬
‫העצם יכולים לעבור התמיינות לתאים\רקמה אשר לא ממקור המטופואטי כגון‪ :‬כבד‪ ,‬עור‪ ,‬תאי לב ונוירונים‬
‫‪53‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫)תמונה ‪ .(Herzog et al., 2003; Tao & Ma, 2003) (11‬תאי גזע מזנכימליים הפכו לתאים בעלי פוטנציאל עבור‬
‫תרפיה תאית וגנטית )‪ ,(Van Damme et al., 2002‬לאחר שהתברר שקל יחסית לבודדם מתוך מוח העצם של‬
‫אדם ולגדלם בתרביות מעבדה‪ .‬התאים הנ"ל יוצרים תרבית תאים ראשונית הטרוגנית‪ ,‬שקבוצות מחקר רבות‬
‫מנסות לאפיין סמנים מולקולריים ייחודיים עבור תת אוכלוסיות תאים אלו ) & ‪Pittenger et al., 1999; Bianco‬‬
‫‪ .(Robey, 2000; Colter et al., 2001; Javazon et al., 2001; Joshi & Enver 2002‬נכון להיום לא נמצא סמן‬
‫חד ערכי על פני דופן התאים היכול לאפיין ‪ ,MSCs‬כדוגמת ‪ CD34, CD133‬עבור תאי גזע המטופואטים‪ .‬תאי גזע‬
‫מזנכימליים ממח העצם מאופיינים באמצעות "קסטת" סמנים על פני דופן התא‪ .‬לאחר גידול התאים בתרבית‪,‬‬
‫במשך כשלשה שבועות מיום הפקתם‪ ,‬הסמנים הבאים מתבטאים על‪-‬פני דופן התא ‪CD13, CD29, CD44,‬‬
‫)‪ .CD49, CD51, CD54, CD71, CD73 (SH3), CD90 (Thy-1), CD105 (SH2‬מאידך‪ ,‬התאים אינם‬
‫מבטאים על‪-‬פני דופן התא את הסמנים ‪CD3, CD4, CD6, CD9, CD10, CD11, CD14, CD15, CD21,‬‬
‫‪Pittenger et al., 2004; Kotobuki et al., ) CD25, CD31, CD34, CD45, CD49b, CD95, CD117, CD133‬‬
‫‪.(2004; Pittenger & Bradley, 2004‬‬
‫יתרונם של תאי גזע מזנכימלים לצורכי ריפוי באמצעות השתלת תאים‪:‬‬
‫תאי גזע )אופייניים לרקמת מח העצם( בעלי יכולת התחדשות עצמית‪ ,‬שטרם עברו תהליכי התמיינות מחייבים‪.‬‬
‫קל להפיקם ולגדלם בתרביות מעבדה‪ ,‬ובאמצעות גורמי גידול ייחודיים להביא להתמיינותם לתאי שומן‪ ,‬סחוס‬
‫ועצם‪ .‬כאשר משתילים תאים מזכנימלים שעברו התמיינות‪ ,‬אין חשש לדחיית שתל‪ ,‬מכיוון שאלו תאים ממקור‬
‫עצמי‪ .‬השימוש בתאים אלו לצורכי השתלה אינו מהווה בעיה מוסרית‪ ,‬מכיוון שבניגוד להפקת תאים‬
‫דופאמינרגים מעוברים‪ ,‬התאים מופקים ממוח העצם של אדם בוגר‪ ,‬תהליך שאינו מזיק ומכוונים להחזיר לאותו‬
‫אדם‪.‬‬
‫‪ 8.3.1.1‬התמיינות תאים מזנכימלים ממוח העצם לתאים דמויי תאי‪-‬עצב )‪(neuron-like cells‬‬
‫על פי עדויות רבות שנצברו בשנים האחרונות‪ ,‬ניתן להשרות התמיינות בתרבית של תאים מזנכימליים ממקור‬
‫אדם‪ ,‬חולדה ועכבר לתאים דמויי תאי עצב )‪Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodbury et ) (neuron-like cells‬‬
‫;‪al., 2000, 2002; Deng et al., 2001; Kohyama et al., 2001; Kabos et al., 2002; Jin et al., 2003‬‬
‫‪Joannides et al., 2003; Lee et al., 2003; Levy et al., 2003, 2004, 2005; Locatelli et al., 2003; Munoz‬‬‫;‪Elias et al., 2003; Padovan et al., 2003; Rismanchi et al., 2003; Wislet-Gendebien et al., 2003‬‬
‫& ‪Abouelfetouh et al., 2004; Croft & Przyborski, 2004; Jori et al., 2004; Li et al., 2004; Qian‬‬
‫;‪Saltzman 2004; Suon et al., 2004; Suzuki et al., 2004; Bossolasco ET AL., 2005; Cho et al., 2005‬‬
‫‪54‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪Jori et al., 2005a,b; Kondo et al., 2005; Long et al., 2005; Tao et al., 2005; Wislet-Gendebien et al.,‬‬
‫‪ .(2005‬במחקרים הראשונים הושרתה התמיינות‪ ,‬בתרבית‪ ,‬של ‪ BMSc‬לתאים דמויי תאי עצב ע"י העלאת רמות‬
‫)‪ cyclic adenosine monophosphate (cAMP‬תוך תאיות וזאת באמצעות הוספה אנלוג שלו למדיום הגידול‪,‬‬
‫)‪ dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP‬וחסימת פירוקו ע"י )‪Deng et al., ) isobutylmethylxanthine (IBMX‬‬
‫‪ .(2001‬לחילופין במחקרים אחרים‪ ,‬השראת התמיינות לתאי דמויי תאי עצב‪ ,‬נצפתה לאחר החלפת מדיום הגידול‬
‫למדיום ללא סרום בתוספת ‪butylated hydroxyanisol (BHA), dimethylsufoxide (DMSO), valporic acid,‬‬
‫‪ KCl, hydrocortisone, insulin‬ו‪) forskolin-‬מעכב פירוק ‪ .(Woodbury et al., 2000, 2002) (cAMP‬דרך‬
‫נוספת להשרות התמיינות‪ ,‬בתרבית‪ ,‬של ‪ BMSc‬לתאים דמויי עצב היא באמצעות השימוש במדיום מעושר ייחודי‬
‫לתאי עצב )‪ ,(neural growth medium N5‬בתוספת גורם גידול עצביי ‪ BDNF‬ו‪all-trans-renitoic acid (RA)-‬‬
‫)‪ Kohyama .(Sanchez-Ramos et al., 2000‬וחבריו )‪ (2001‬מתארים התמיינות תאי סטורמה ממח העצם של‬
‫עכברים לתאים דמויי‪-‬עצב בעקבות הוספת ‪] noggin‬חומר המעורב בהתפתחות מע"מ בעובר וגם בבוגר ע"י עיכוב‬
‫)‪ [bone morphogenetic factor (BMP‬או ‪) 5-azacytidine‬חמור הגורם לדמתילציה של ‪ (DNA‬בשילובם של‬
‫גורמי גדילה ייחודיים לתאי עצב ‪ .BDNF, NGF, NT3‬לאחר ההתמיינות‪ ,‬רוב )עד ‪ (80%‬התאים המזנכימלים‪,‬‬
‫מציגים פנוטיפים עצביים ומשנים את צורתם המורפולוגית לתאים הדומים לתאי עצב עם שלוחות ארוכות‬
‫וצרות‪ .‬התאים הממוינים מבטאים סמנים חלבוניים עצביים כגון‪,vimentin, neuron specific enolase (NSE) :‬‬
‫)‪ nestin, β-tubulin III, neurofilament medium (NF-M),neuronal nuclei (NeuN‬וסמנים ציטופלסמטים‬
‫רבים אחרים הייחודיים לתאי עצב‪ .‬בנוסף‪ ,‬התאים ביטאו גם סמנים לאסטרוציטים כדוגמת ‪.GFAP‬‬
‫מחקרים ‪ in-vivo‬הראו שתאים מזנכימלים שמקורם ממח העצם של אדם או מכרסמים המושתלים ישירות‬
‫למע"מ )של מכרסמים( – לסטריאטום או לחדרי המוח‪ ,‬שורדים‪ ,‬נודדים לאזורי המוח השונים וחלקם אף‬
‫מאבדים סמנים של תאים מזנכימלים ומאידך מפתחים סמנים מאפיינים לאסטרוציטים ) ;‪Azizi et al., 1998‬‬
‫)‪ .Kopen et al. 1999‬בנוסף‪ ,‬תאים מזנכימלים ממח עצם שהושתלו לחדרי מוח של עובר חולדה )ביום ‪15.5‬‬
‫להריון( נדדו לאזורים שונים במע"מ ומרוחקים ממקום ההשתלה‪ ,‬שרדו בחיה הבוגרת‪ ,‬התמיינו לתאי עצב‬
‫פעילים ואף יצרו קשרים עצביים עם הרקמה המקורית )‪ .(Munoz-Elias et al., 2004‬תאים מכל אוכלוסיית מח‬
‫עצם של עכברים זכרים שהוזרקו תוך ציפקי או לווריד הזנב של עכבר )נקבה(‪ ,‬נדדו באמצעות זרם הדם למוח ואף‬
‫נמצאו שעברו התמיינות לתאי עצב באזורים שונים במוח )‪.(Brazelton et al., 2000; Mezey et al., 2000‬‬
‫צורתם המורפולוגית של התאים המושתלים השתנתה‪ ,‬גוף תא עם שלוחות עצביות‪ ,‬וביטאו את הכרומוזום ‪Y‬‬
‫‪55‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫וסמנים ייחודיים לתאי עצב כגון ‪ ,NeuN ,NSE‬ו‪ .NF-H-‬יתר על כן‪ Mezey ,‬וחבריו )‪ (2003‬מצאו כרומוזומי ‪Y‬‬
‫במוחן של נשים לאחר ההשתלה של מוח עצם זכרי‪ .‬התאים המושתלים נמצאו במספר אזורים ספציפיים במוח‪,‬‬
‫במיוחד בהיפוקמפוס ובקורטקס הצרברלי‪ .‬יש לציין שהניסיונות של )‪Brazelton (2000) Mezey (2000, 2003‬‬
‫נעשו עם תאים מכל אוכלוסיית התאים ממח העצם ללא הפרדתם לתאים מזנכימליים בלבד‪ .‬יחד עם זאת‪,‬‬
‫חוקרים אחרים טוענים כי לא קיימת התמיינות של תאי מח עצם לתאי עצב בגוף החי )‪ ,(in-vivo‬התופעה כללית‬
‫ויכולה לשקף איחוי )‪ (fusion‬של תאי מח עצם עם תאי עצב או ביטוי ארעי של חלבונים רבים‪ ,‬כולל סמנים‬
‫עצביים ייחודיים )‪.(Holden & Vogel 2002; Lemischka 2002; Wurmser & Gage 2002‬‬
‫‪ Chopp‬וחבריו דיווחו‪ ,‬שלהשתלת תאים מזנכימליים לא ממוינים יש יתרון טיפולי לאחר פגיעה מוחית‬
‫טראומטית )‪ ,(Lu et al., 2001a,b, 2002; Mahmood et al., 2001) (traumatic brain injury‬פגיעה מוחית‬
‫איסכמית )‪ (Chen et al., 2001a,b; Li et al., 2001a, 2002‬או פגיעה בחוט השדרה )‪ ,(Chopp et al., 2000‬ברוב‬
‫המקרים נצפה שיפור קליני בחיות‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬במחקרים אלה של השתלות לאחר פגיעה‪ ,‬לרוב פחות מ‪20%-‬‬
‫מהתאים המושתלים הגיבו חיסונית לאנטיגנים של מערכת העצבים המרכזית‪ ,‬דבר המעלה חששות לגבי גורלם‬
‫של שאר התאים‪.‬‬
‫‪ 8.3.1.2‬התמיינות תאים מזנכימלים ממוח העצם לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫קיימות מספר מוגבל של עבודות בהם השתמשו בתאי גזע מזנכימלים כתאים המפרישים דופאמין לטובת‬
‫השלתה במודלים של מחלת פרקינסון‪ .‬תאים מזנכימלים מחולדה הונדסו גנטית‪ ,‬ע"י טרנסדוקציה סדרתית עם‬
‫שני רטרווירוסים נפרדים‪ TH ,‬אנושי ו‪ ,GTP cyclohydrolase I (GTPCH)-‬אנזים האחראי לייצור ‪ BH4‬שהנו‬
‫קו‪-‬פקטור עבור פעילות תקינה של ‪ .(Schwarz et al., 1999, 2001) TH‬התאים הנ"ל‪ ,‬ייצרו והפרישו בתרבית ‪L-‬‬
‫‪ .DOPA‬בהשתלתם למודל של מחלת הפרקינסון בחולדה‪ ,‬נצפה שיפור התנהגותי‪ .‬אולם‪ ,‬האפקט ההתנהגותי‬
‫המיטבי היה קצר טווח )עד ‪ 7‬ימים(‪ ,‬כפי הנראה בגלל הוצאתם מכלל הפעולה של הגנים הזרים שהוחדרו לתאים‪.‬‬
‫אלא שבניסוים אלה התאים המזנכימלים לא התמיינו לתאים דמויי נוירונים‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬כל הפעילות‬
‫הדופאמינרגית נבעה מהחדרתם של וקטורים חיצוניים‪,‬עובדה המהווה מגבלה בשימוש בתאים אלו לטובת ריפוי‬
‫תאי‪ .‬בעולם המדעי כיום‪ ,‬קיימת העדפה בשימוש בתאי גזע שעברו התמיינות בעקבות שינוי סביבת הגידול )ע"י‬
‫חומרים שונים( מאשר להשתמש בתאים שהם נשאים לגנים שהוחדרו בתוכם )‪.(Salim et al., 2004‬‬
‫מאוחר יותר‪ Woodbury ,‬וחבריו )‪ (2002‬דיווחו על השראת התמיינות של ‪ BMSc‬מחולדה לתאים דמויי תאי‬
‫עצב‪ ,‬מתוכם אוכלוסייה קטנה ביטאה את אנזים קובע הקצב לייצור דופאמין‪ .TH ,‬מאידך‪ Jori ,‬וחבריו )‪(2005a‬‬
‫‪56‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫מצאו )בעזרת ‪ (RT-PCR‬שרמות ‪ TH‬הולכות וקטנות במהלך התמיינות עצבית‪ .‬אף על פי כן‪ ,‬בשתי העבודות‬
‫הנ"ל לא דווח על יצור של סמנים דופאמינרגים אחרים ושל דופאמין‪.‬‬
‫הפוטנציאל הטיפולי של ‪ BMSc‬לטיפול במחלת הפרקינסון הודגם לראשונה ע"י פרסומו של ‪ Li‬וחבריו )‪.(2001b‬‬
‫‪) BMSc‬שלא עברו התמיינות( מעכבר המסומנים ב‪ bromodeoxyuridine (BrdU)-‬הושתלו לסטריאטום של‬
‫המודל למחלת הפרקינסון בעכבר המושרה ע"י ‪ .MPTP‬העכברים‪ ,‬שטופלו ב‪ MPTP-‬והושתלו עם תאים‪ ,‬הראו‬
‫שיפור משמעותי במבחן ה‪ 35 ,rotarod-‬יום לאחר ההשתלה‪ ,‬ביחס לעכברי הביקורת הלא מושתלים‪.‬‬
‫אימונוהיסטוכימיה גילתה תאים המגיבים לנוגדן כנגד ‪ BrdU‬ו‪ 0.8%‬מתוכם ל‪ TH-‬בסטריאטום‪ ,‬של העכברים‬
‫המושתלים‪ ,‬ארבעה שבועות לאחר ההשתלה‪ .‬למרות שתאי ‪ BMSc‬המושתלים לתוך הסטריאטום שורדים‬
‫ומעודדים שיפור תפקודי‪ ,‬מחקר נוסף נדרש בכדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס שיפור זה‪ .‬לא ידוע האם‬
‫התאים המושתלים מעלים את ייצור הדופאמין או האם תהליכים אחרים‪ ,‬כמו הפרשה של גורמים נוירו‪-‬טרופיים‬
‫ע"י תאי מוח העצם‪ ,‬מתווכים את השיפור בתפקוד המוטורי‪.‬‬
‫לאחרונה תוארה השראת התמיינות של תאים ממח העצם של חולדה ואדם לתאים דמוי‪-‬תאי עצב בעקבות‬
‫טרנסדוקציה וביטוי יתר של הגן )‪ notch intracellular domain (NICD‬בשילוב עם הוספת גורמי‪-‬גידול ‪bFGF,‬‬
‫‪ ciliary neurotrophic factor (CNTF), forskolin‬למשך ‪ 7‬ימים )‪ .(Dezawa et al., 2004‬התאים ביטאו סמנים‬
‫לתאי עצב כגון ‪ .MAP2, NF-M, β-tubulinIII‬לאחר השראת התמיינות ארוכה‪ ,‬שכללה ‪ 7‬ימים נוספים בנוכחות‬
‫גורמי גידול אחרים ‪ ,BDNF, NGF‬תאי העצב היו "בשלים" יותר ואף היה להם פוטנציאל פעולה‪ .‬השראת‬
‫התמיינות )‪ (in-vitro‬של תאים מזנכימלים ממקור חולדה ואדם‪ ,‬שעברו טרנסדוקציה של ‪ ,NICD‬לתאים‬
‫דופאמינרגים התרחשה לאחר הוספת ‪ .GDNF‬התאים ביטאו ‪ TH‬וגורמי שעתוק האופייניים לתאי עצב‬
‫דופמינרגיים ‪ .Nurr1, Lmx1b, En1, Pitx3‬יתרה מכך‪ ,‬התאים ממקור חולדה אף הפרישו דופאמין בעקבות דה‪-‬‬
‫פולריזציה‪ .‬לאחר השתלתם של התאים הדופאמינרגים )ממקור חולדה( הממוינים למודל חולדה למחלת‬
‫פרקינסון נצפה שיפור התנהגותי מובהק‪ .‬זאת למעשה העבודה הראשונה בה תוארה התמיינותם של תאי גזע‬
‫מזנכימלים לתאי עצב דופאמנירגיים‪ .‬אך אליה וקוץ בה‪ ,‬הפעילות הדופאמינרגית נצפתה בעיקר בתאים ממקור‬
‫חולדה ונבעה אך ורק בעקבות ביטוי יתר של ‪ ,NICD‬נתון המהווה‪ ,‬כאמור‪ ,‬מגבלה בעתיד לשימוש תאים אלו‬
‫לחולי פרקינסון )‪) .(Salim et al., 2004‬פרוט נוסף לגבי השתלתם של תאי גזע ממח העצם למודלים למחלת‬
‫פרקינסון ראה בטבלה ‪ .5‬התמיינות בתרבית ראה טבלה ‪.(14‬‬
‫‪57‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ 8.3.2‬תאי גזע בוגרים מולטיפוטנטיים )‪Multipotent Adult Progenitor Cells (MAPC‬‬
‫)‪ Multipotent adult progenitor cells (MAPC‬הם תאים נדירים שהופקו מתרביות תאים מזנכימליים ממח‬
‫העצם של אדם וחולדה ויכולים להשתכפל יותר מ‪ 120-‬פעם )‪.(Jiang et al., 2002a,.b; Reyes et al., 2001‬‬
‫‪ MAPC‬מופקים מתאים ממוח העצם שהועברו בקולנה עם נוגדנים כנגד ‪ ,CD45, GlyA‬כך שהתרבית הראשונית‬
‫הנה תאים שנדבקו למשטח הגידול מפלסטיק והפנוטיפ ‪ .CD45-, GlyA-‬לאחר כ‪ 15-‬חלוקות וגידול התאים‬
‫בצלחות המטופלות ב‪ fibronectin-‬ומדיום גידול המכיל ריכוז נמוך של סרום ומעושר ב‪epidermal growth -‬‬
‫)‪ factor (EGF‬ו‪ PDGF-‬הפנוטיפ של ‪ MAPC‬הנו‪CD3-, CD10-, CD13+, CD19-, CD31-, CD34-, CD36-, :‬‬
‫‪CD38- CD44low, CD45-, CD49b+, CD90 (Thy1)low CD117 (cKit)-, major histocompatibility complex‬‬
‫‪ .(MHC) class I and II negative‬המורפולגיה של התאים והפנוטיפ היה זהה גם לאחר ‪ 30‬ו‪ 120-‬חלוקות‪.‬‬
‫‪ MAPC‬בעלי יכולת להתמיין לשורות תאים מזנכימליים‪ ,‬אנדותליום )‪(Reyes et al., 2001; Reyes et al., 2002‬‬
‫ואנדודרם )‪ .(Schwartz et al., 2002‬מחקרים הראו‪ ,‬שניתן לברור ממח העצם של המכרסמים ‪MAPC‬‬
‫המסוגלים להתמיין ‪ in vitro‬לתאים משלשת שכבות הנבט‪ .‬בנוסף הראו‪ ,‬שבדומה לתאי גזע עובריים‪MAPC ,‬‬
‫עכבריים המוזרקים לבלסטוציט‪ ,‬תורמים לרוב‪ ,‬אם לא לכל‪ ,‬שורות התאים הסומטיים כולל מוח ) ‪Keene et al.,‬‬
‫‪ .(2003‬נראה כי בתוך המוח‪ ,‬התרחשה התמיינות ספציפית המתאימה לאזורי המוח השונים ) ‪Keene et al.,‬‬
‫‪.(2003; Zhao et al., 2003‬‬
‫‪ MAPC 8.3.2.1‬כמקור לתאים דמוי‪-‬עצב דופאמינרגים‬
‫‪ Jiang‬וחבריו )‪ (2002a‬תיארו גידול רציף של ‪ MAPC‬ממכרסמים בנוכחות ‪ bFGF‬למשך ‪ 7‬ימים‪ FGF8 ,‬למשך ‪7‬‬
‫ימים‪ BDNF ,‬למשך ‪ 7‬ימים ויצירה של תאים המבטאים סמנים של תאי עצב )‪ (MAP2‬דופאמינרגיים )‪TH (30%‬‬
‫ו‪ .AADC-‬טיפול תאי למחלות ניווניות במוח או לנזק במוח יהיה שימושי במיוחד אם ‪ MAPC‬יוזרקו סיסטמית‬
‫וימצאו את דרכם לאזורים פגועים במערכת העצבים המרכזית ובה הם ירכשו את הפנוטיפ של תא העצב החסר‪.‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬למרות יכולתם של ‪ MAPC‬עכבריים להתמיין לתאים דמויי נוירו‪-‬אקטודרם ‪ ,ex vivo‬לא נראתה‬
‫חדירה משמעותית של ‪ MAPC‬עכבריים למוח לאחר הזרקה וורידית והתאים הבודדים שנמצאו במוח לא הגיבו‬
‫לנוגדנים לסמנים נוירו‪-‬אקטודרמליים )‪ .(Jiang et al., 2002a‬לאחרונה‪ ,‬תואר שבדומה לתאי גזע עובריים‪ ,‬ניתן‬
‫להשרות גם על ‪ MAPC‬עכבריים התמיינות ‪ in vitro‬לתאים בעלי מאפיינים ביוכימיים‪ ,‬אנטומיים‬
‫ואלקטרופיזיולוגיים של תאי עצב במוח התיכון )‪ MAPCs .(Jiang et al., 2003‬עכבריים גודלו ברצף במשך ‪7‬‬
‫ימים עם ‪ FGF8 ,bFGF‬בנוסף ל‪ BDNF ,Shh-‬כך ש‪ 23%-‬מהתאים המבטאים ‪ nestin‬ביטאו גם ‪ Nurr1‬שהופיע‬
‫‪58‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫ביום השביעי‪ RT-PCR .‬כמותי הראה עליה של בין ‪ 1.7‬ו‪ 120-‬רמות בביטוי ‪ mRNA‬של ‪ GABA, TH‬ו‪-‬‬
‫)‪ .tryptophan hydroxylase (TPH‬אנליזה של פנוטיפ חיסוני ביום ה‪ 21-‬להתמיינות הראתה ש‪ 25%-‬מהתאים‬
‫ביטאו סמנים של תאי עצב דופאמינרגיים )‪ AADC‬ו‪ 18% ,(TH-‬של תאי עצב סרוטונרגיים )‪ (TPH‬ו‪ 52%-‬של תאי‬
‫עצב גבארגיים )‪ .(GABA‬אימונוהיסטוכימיה כפולה הראתה ש‪ TPH ,GABA-‬ו‪ TH-‬לעולם לא נמצאו באותם‬
‫התאים )התמיינות בתרבית ראה טבלה ‪.(14‬‬
‫‪ MAPC 8.3.2.2‬לעומת תאי גזע עובריים‬
‫האם ‪ MAPC‬הם אקוויוולנט בוגר של תאי גזע עובריים? דרושים נתונים נוספים בנושא‪ ,‬אך עד כה נראה כי יש‬
‫גם דמיון וגם הבדלים חשובים בין תאים אלה‪ .‬אם כן מהם ‪ ?MAPC‬תאים אלה יכולים להיות תאי גזע‬
‫פלוריפוטנטיים נדירים המתקיימים החל מהשלב העוברי ולתוך החיים הבוגרים‪ .‬על מנת להוכיח זאת‪ ,‬יהיה‬
‫הכרחי לזהות את התאים האלה ‪) in vivo‬בניגוד לזיהוי למפרע ‪ (in vitro‬ע"י סמנים חלבוניים שהם מבטאים‬
‫ולבודד אותם ללא שלב הגידול בתרבית‪ .‬אלטרנטיבית‪ MAPC ,‬עלולים למעשה‪ ,‬לא להתקיים ‪ .in vivo‬תרבית‬
‫ממושכת יכולה לגרות תאים מסוימים ממוח העצם לסגת למצב יותר פרימיטיבי‪ ,‬בדומה לתאי מין קדמוניים ‪-‬‬
‫מהם מיוצרים תאי זרע ותאי ביצית – שיכולים לעבור תכנות מחדש בתרבית ולרכוש מאפיינים של תאי גזע‬
‫עובריים )‪ .(Matsui et al., 1992; Donovan 1994‬אם זהו המצב‪ ,‬יש לנו עוד הרבה ללמוד לגבי תכנותם מחדש‬
‫של התאים בתרבית‪.‬‬
‫‪Marrow–isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells 8.3.3‬‬
‫תאי ‪ MIAMI‬הנם תאים פלוריפוטנטים המופקים מתת אוכלוסיית תאים של תאי סטרומה ממח העצם והגדלים‬
‫בתנאי גידול ייחודיים המקנה להם לבסוף תכונות של תאי גזע )‪ .(D'Ippolito et al., 2004‬כל אוכלוסיית מח‬
‫העצם‪ ,‬ממקור אנושי‪ ,‬גדלה במצע המכיל ‪ fibronectin‬בריכוז נמוך של חמצן )‪(3% O2, 5% CO2, 92% N2‬‬
‫ובריכוז של ‪ 5%‬סרום למשך ‪ 14‬ימים‪ .‬לאחר ‪ 14‬ימים כל התאים הצפים נשתפו ומושבות של תאים קטנים‬
‫שנדבקו למצע בודדו וגודלו על ‪ fibronectin‬בריכוז חמצן נמוך ובנוכחות סרום בריכוז ‪ .2%‬תאי ‪MIAMI‬‬
‫מבטאים רמות גבוהות של ‪CD29, CD49e, CD63, CD81, CD90, CD122, CD164, hepatocyte growth‬‬
‫‪factor receptor (cMet), BMP receptor 1B (BMPR1B), neurotrophic tyrosine kinase receptor 3‬‬
‫)‪ (NTRK3‬ומאידך אינם מבטאים )‪ .CD34, CD36, CD45, CD54, CD56, CD117 (cKit‬יתרה מכך‪ ,‬התאים‬
‫מבטאים סמנים רבים של תאי גזע עובריים כדוגמת ‪ ,Oct-4, Rex-1‬של שלושת שורות הנבט ושומרים על‬
‫הפנוטיפ שלהם גם לאחר ‪ 50‬חלוקות‪ .‬ניתן להשרות התמיינות של תאי ‪ MIAMI‬לתאי שריר‪ ,‬סחוס‪ ,‬שומן‪.‬‬
‫‪59‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ 8.3.3.1‬השראת התמיינות תאי ‪ MIAMI‬לתאים דמויי תאי‪-‬עצב‬
‫השראת התמיינות תאי ‪ MIAMI‬ממקור אנושי לתאים דמויי תאי עצב נעשה בשלשה שלבים ) ‪D'Ippolito et al.,‬‬
‫‪ .(2004‬בשלב הראשון )‪ ,(specification‬גודלו התאים בצפיפות נמוכה ובנוכחות ‪ 20%‬סרום ו‪ bFGF-‬למשך ‪24‬‬
‫שעות‪ ,‬בשלב הנ"ל התאים ביטאו ‪ .nestin‬בשלב השני )‪ ,(commitment‬התאים גודלו ללא סרום עם ‪β-‬‬
‫)‪ mercaptoethanol (βME‬ו‪ NT3-‬למשך ‪ 48‬שעות‪ 50% ,‬מהתאים ביטאו ‪ .β tubulin III‬בשלב השלישי‬
‫)‪ ,(differentiation‬התאים נחשפו ל‪ NT3, NGF, BDNF-‬למשך ‪ 3‬עד ‪ 7‬ימים‪ .‬לאחר השלב השלישי צורתם‬
‫המורפולוגית של התאים השתנתה לתאים בעלי שלוחות ארוכות ודקות כדוגמת תאי עצב‪ .‬בנוסף‪ ,‬התאים בטאו‬
‫)‪ NF-M, NeuN (40%‬ומאידך התאים לא ביטאו ‪ ,nestin‬כלומר הייתה התמיינות לתאים דמויי תאי עצב‬
‫בשלים‪ .‬לאחרונה פורסם תהליך בו בוצעה השראת תאי ‪ MIAMI‬לתאים דמויי תאי עצב המבטאים ‪TH‬‬
‫)‪ ,(Montero-Menei et al., 2004‬התהליך כלל שלב רביעי נוסף בו התאים התמיינו בנוכחות ‪ .Shh, FGF8‬יש‬
‫להדגיש שבניסיונות אלו לא נצפה הפרשת דופאמין מן התאים הממוינים למדיום הגידול‪.‬‬
‫‪ 8.3.4‬תאי גזע ‪ Size-Sieved‬ממח עצם אנושי‬
‫תאי גזע ‪ size-sieved‬הם תאים שבודדו ממח העצם בשיטה דומה לתאים מזנכימלים‪ ,‬בתוספת של סלקציה‬
‫שלילית לתאים קטנים )‪ .(polygonal cells‬תאי גזע ‪ size-sieved‬מתקבלים מזריעת המונונוקלארים שבודדו‬
‫)באמצעות גרדיאנט סוכרי( ממח העצם על פלטות הכוללות פילטר עם נקבוביות בגודל של ‪ 3‬מיקרומטר‪ .‬לאחר כ‪-‬‬
‫‪ 10‬ימים כל התאים הקטנים נפלו ומאידך על הרשת נשארה דבוקה קבוצת תאים מזנכימלית אחידה בצורתה‬
‫המוגדרת כתאי גזע ‪ .(Hung et al., 2002a) size-sieved‬תאי גזע ‪ size-sieved‬מבטאים את הפנוטיפ ‪CD29,‬‬
‫‪ CD44, CD51, CD73, CD90, CD105‬ומאידך אינם מבטאים סמנים המטופואיטים כדוגמת ‪CD7, CD34,‬‬
‫‪ .CD45, CD133‬תאי גזע ‪ size-sieved‬התמיינו )‪ (in-vitro‬לתאים דמויי תאי‪-‬עצב בשני שלבים‪ :‬האחד‪ ,‬בנוכחות‬
‫‪ 10%‬סרום‪ ,βME ,‬וחומצאה רטינואית למשך ‪ 24‬שעות ובשלב השני טיפול ללא סרום למשך ‪ 5‬ימים ) ‪Hung et‬‬
‫‪ .(al., 2002b‬רמות ‪ nestin‬הולכות וקטנות במהלך ההתמיינות‪ .‬מאידך גיסא‪ ,‬רמות ‪NeuN, NSE, β tubulin III‬‬
‫‪ NF-H‬עלו והופיעו בעקבות ההתמיינות )‪ .(Hung et al., 2002b‬בנוסף‪ ,‬קבוצת מחקר אחרת הראתה התמיינותם‬
‫של תאי גזע ‪ size-sieved‬לתאים דמויי תאי עצב בנוכחות ‪ GDNF‬ועליית רמות ‪ cAMP‬תוך תאיות ) ‪Tzeng et‬‬
‫‪.(al., 2004‬‬
‫‪60‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ 8.3.5‬התמיינות תאי גזע המטופואטים ממח העצם לתאים דמויי תאי‪-‬עצב‬
‫מחקרים בשנים האחרונות הראו שתאי גזע המטופואטים )‪ (CD34+, CD45+, CD133+‬מסוגלים להתמיין‬
‫לפנוטיפים לא צפויים כגון‪ :‬שריר שלד )‪ ,(Ferrari et al., 1998; Gussoni et al., 1999‬תאי כבד ) ‪Lagasse et al.,‬‬
‫‪ ,(2000‬תאי שריר הלב )‪ ,(Jackson et al., 2001; Orlic et al., 2001‬כתגובה לנזק ברקמה או כתוצאה מתנאי‬
‫סביבה תומכי התמיינות‪ .‬בנוסף‪ ,‬בעכברים )נקבות( שעברו הזרקת תאים המטופואטים )ממקור זכרי( לצפק‬
‫נמצאו תאים במוח עם כרומוזום ‪ Y‬החיוביים ל‪ ,(0.5-2%) NeuN-‬דבר המרמז על התמיינות ‪ in-vivo‬של התאים‬
‫המושתלים )‪ .(Mezey et al., 2000‬יתרה מכך‪ ,‬בנתיחה שלאחר המוות של נשים חולות במחלות ממאירות שעברו‬
‫השתלת תאי גזע המטופואטים מזכרים‪ ,‬נמצא במוחן )בהיפוקמפוס ובקורטקס( תאים עם כרומוזום ‪ Y‬ועם סמן‬
‫עיצבי‪ ,NeuN ,‬בצביעה כפולה‪ ,‬דבר המעיד‪ ,‬לדעת המחברים‪ ,‬להתמיינות התאים המושתלים לתאי עצב )‪(in-vivo‬‬
‫ולא תהליך איחוי של התא המושתל עם תאים של המאחסן )‪ .(Mezey et al., 2003‬במחקר אחר‪ ,‬הזריקו תאי גזע‬
‫ממח העצם )מעכבר טרנסגני ל‪ (green fluorescence protein, GFP-‬לווריד הזנב של עכבר שעבר הקרנות‬
‫)‪ .(Brazelton et al., 2000‬במוח נמצאו תאים "ירוקים" )‪ (GFP‬שאינם מבטאים ‪) CD45, CD11b‬סמנים לתאים‬
‫המטופואטים( ומבטאים חלבוניים ייחודיים לתאי עצב כדוגמת ‪ ,NuN, NF-H‬רמז נוסף להתמיינות ‪ in-vivo‬של‬
‫תאי גזע המטופואטים לתאי עצב‪.‬‬
‫‪ Hao‬וחבריו )‪ (2003‬הראו התמיינותם )‪ (in-vitro‬של תאי גזע המטופואטים )שהופקו מעובר אנושי(‬
‫לאסטרוציטים לאחר כעשרה ימים במדיום ‪ astrocyte culture condition‬או בתרבית תאים כפולה שהכילה‬
‫אסטרוציטים‪ .‬לאחר כיומיים בתנאי ההתמיינות התאים ביטאו ‪ ,nestin‬סמן לתאי גזע עצביים‪ .‬לאחר כעשרה‬
‫ימים במדיום ההתמיינות התאים לא ביטאו ‪ nestin‬ומאידך ביטאו ‪ GFAP‬ו‪ ,S100-‬סמנים ייחודיים‬
‫לאסטרוציטים‪.‬‬
‫‪ Goolsby‬וחבריו )‪ (2003‬הראו שאחוז נמוך )‪ (1.5%‬של תאי גזע המטופואטים ממח העצם של עכברים בוגרים‬
‫מבטאים גם סמנים ייחודיים לתאי עצב מיד לאחר הפקתם‪ .‬כלומר‪ ,‬תאי גזע המטופאטים מבוגר שבאופן טיפוסי‬
‫נחשבו לתאים ממקור עוברי מזודרמלי מבטאים סמנים עצביים ממקור אקטודרמלי‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬לאחר גידול‬
‫התאים במשך ‪ 56‬ימים בתנאים ייחודיים לתאי גזע המטופואטים‪ ,‬מדיום גידול המכיל ‪) IL-3, 6‬עכברי( ו‪mouse -‬‬
‫‪ 100% ,stem cell factor‬מהתאים ביטאו ‪ CD34‬וגם סמנים של תאי עצב כדוגמת‪HuC, HuD, NF-H, NeuN, :‬‬
‫‪ GAD‬ואף סמן של ‪ .(CNPase) oligodendrocytes‬יש לציין שהתאים לא ביטאו ‪) GFAP‬סמן לאסטרוציטים( ו‪-‬‬
‫‪ .TH‬בנוסף‪ ,‬לאחר ‪ 6‬חודשים במתרבית הגידול‪ ,‬התאים ההמטופואטים הושתלו למוחותיהם )סטריאטום‪,‬‬
‫‪61‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫היפוקמפוס( של ‪ 34‬עכברים בוגרים בריאים‪ .‬לא נצפה שינוי בהתנהגות החיות לאחר ההשתלה וכ‪ 40%-‬מהתאים‬
‫המושתלים שרדו לאחר ‪ 14‬חודשים‪ .‬ממצה מעניין‪ ,‬למרות שלפני ההשתלה ‪ 100%‬מהתאים ביטאו ‪ CD34‬וגם‬
‫סמנים לתאי עצב ו‪ 0%-‬מהתאים ביטאו ‪ ,GFAP‬כשנה לאחר ההשתלה רק ‪ 42%‬מהתאים ביטאו ‪ NF-H‬ו‪-‬‬
‫‪ CNPase 30% ,NeuN‬ואילו ‪ 25%‬ביטאו ‪ .GFAP‬בנוסף‪ ,‬לא נמצאו צביעות כפולות בין הסמנים לתאי עצב )‪NF-‬‬
‫‪ (H, NeuN‬לבין הסמנים של תאי התמיכה )‪.(GFAP, CNPase‬‬
‫לאחרונה דווח שניתן להשרות התמיינות של תאי גזע המטופאטים שהופקו מדם היקפי אנושי‪ ,in-vitro ,‬לתאים‬
‫עם סמנים עצביים )‪ .(Abuljadayel 2003‬תאי הגזע ההמטופאוטים גודלו במדיום התמיינות שהכיל ‪ 20%‬סרום‪,‬‬
‫חומצות אמינו לא חיוניות ו‪ βME -‬למשך כשבוע‪ .‬לאחר ‪ 24‬שעות התאים ביטאו ‪ nestin‬ולאחר כשבוע התאים‬
‫התחילו לבטא סמנים לתאי עצב ואסטרוציטים ‪ .NF-H, neurofilament light (NF-L), MAP2, GFAP‬לאחר‬
‫כשלשה שבועות התאים ביטאו סמנים לתאי עצב או לאסטרוציטים )‪ (GFAP‬ולא נצפו צביעות כפולות‪.‬‬
‫‪ 8.3.5.1‬תאי גזע )‪Side population (SP‬‬
‫תאי מח עצם שנחשפו לצבע פלורוסנטי כחול הנקשר ל‪ DNA-‬של תאים חיים‪ ,Hoeschst 33342 ,‬ונבחנו‬
‫באמצעות )‪ fluorescence-activated cell sorting (FACS‬בשני אורכי גל פליטה )אדום וכחול( בו זמנית מראים‬
‫פרופיל קבוע של ‪ 2‬אוכלוסיות תאים‪ :‬האחת‪ ,‬אוכלוסיית תאים קטנה עם רמה פלורוסנטית נמוכה הנקראת ‪side‬‬
‫)‪ ,population (SP‬והשנייה אוכלוסיית תאים גדולה עם צביעה פלורוסנטית גבוהה הנקראת ‪Goodell ) non-SP‬‬
‫‪ .(et al., 1996, 1997‬תאי ‪ SP‬מכילים כמות גדולה של תעלות )‪ multidrug resistance protein (mdr‬בדופן‬
‫הגרעין ובעקבות כך רמת הצביעה ב‪ Hoeschst 33342-‬נמוכה‪ ,‬מכיוון שתעלות ‪ mdr‬מוציאות את הצבע מחוץ‬
‫לגרעין‪ .‬תאי ‪ SP‬הנם תת אוכלוסיה של תאי גזע המטופואטים ומהווים ‪ 1%‬מאוכלוסיית התאים במח העצם‪.‬‬
‫הפנוטיפ של תאי ‪ SP‬ממח העצם הנו )‪ .Sca-1+, Linneg/low (B220, Gr1, Mac1, CD4, CD5, CD8‬השתלת תאי‬
‫‪ SP‬למוחותיהם של עכברים שעברו ולא עברו נזק מוחי לא הביאה להתמיינותם לתאי עצב )‪Castro et ) (in-vivo‬‬
‫‪ (al., 2002‬וזאת בניגוד לממצאים שתוארו לעיל שהזרקת תאים המטופואטים ממח העצם לדם הפריפרי הביאה‬
‫להתמיינותם לתאים דמויי תאי עצב במע"מ )‪ .(Brazelton et al., 2000; Mezey et al., 2000‬יתכן וההבדל‬
‫בתוצאות הניסויים השונים נובע ממודלים של חיות מעבדה שונים‪.‬‬
‫לסיכום‪ ,‬מחקרים רבים תוארו בספרות להפקת תאי גזע שונים ממח העצם של בוגר; תאים מזנכימלים‪MAPC, ,‬‬
‫‪ ,MIAMI, size-sieved‬תאים המטופואטים ו‪ .SP-‬תאי גזע ממח העצם )אנושיים(‪ ,‬יכולים להיות שימושיים‬
‫לטיפול במחלות רבות‪ .‬עד לזיהוי ‪ in vivo‬של התאים‪ ,‬אם בכלל‪ ,‬מוקדם לעסוק בספקולציות לגבי תפקידם‬
‫‪62‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫בתיקון רקמות פגועות באופן טבעי‪ .‬יתר על כן‪ ,‬למרות ש‪ MAPC-‬ו‪ BMSc-‬אנושיים יכולים להתמיין לסוגיים‬
‫שונים של תאים סומאטיים‪ ,‬בכלל ולתאים דמויי תאי עצב בפרט‪ ,‬נשאר לראות האם תאים אלה מתפקדים‬
‫נורמאלית וניתן להשתמש בהם לטיפול בחיות כמודלים למחלות עצביות ניווניות‪ .‬ניסויים אלה יהיו כעת בעדיפות‬
‫עליונה‪ ,‬עקב האפשרות לבודד ‪ MAPCs‬ו‪ BMSc-‬אנושיים ממח העצם של כל מטופל ולהשתיל את הצאצאים של‬
‫התאים האלו חזרה לחולה ללא חשש מדחייה חיסונית‪ .‬ישנם יתרונות אפשריים רבים לטיפול במחלות עצביות‬
‫ניווניות או בנזקים תוך שימוש בתאים שהתמיינו ‪ .in vitro‬חשוב לקחת בחשבון את הסיכונים הלא ידועים של‬
‫השימוש בתאים ‪ -‬בין אם הם תאי גזע עובריים או ‪ MAPC‬ו‪ BMSc-‬אנושיים ‪ -‬שעברו גידול ממושך בתרביות‪.‬‬
‫בנוסף לכך‪ ,‬למרות שנראה כי ‪ MAPC‬ו‪ BMSc-‬אנושיים הם בעלי כרומוזומים תקינים‪ ,‬חשוב להראות כי‬
‫המסלולים המבקרים את חלוקת התא תקינים‪ .‬אחרת‪ ,‬תועלת קצרת הטווח יכולה להפוך לסיבוכים ארוכי‬
‫הטווח‪ .‬זה מדגיש את החשיבות של המחקר בתחום‪ .‬ברובם של המחקרים תוארו השראת התמיינות לתאים‬
‫דמויי תאי עצב ‪ in-vivo‬או‪/‬ו ‪ .in-vitro‬מנגד‪ ,‬עדיין לא תוארה עבודה בה מתארים את הפוטנציאל הגלום‬
‫בהשראת התמיינות של תאי גזע ממח העצם לתאי עצב דופאמינרגים ‪) in-vitro‬ללא ביטוי יתר של גן חיצוני(‬
‫והשתלתם לחיות מודל למחלת פרקינסון‪.‬‬
‫‪63‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫מבוא‬
‫ התמיינות תאי גזע לתאי עצב לאחר השתלתם במודלים של מחלת פרקינסון‬:5 ‫טבלה‬
Differentiation
Animal model
Dopaminergic and neuronal
markers, (Surviving TH+)
Behavioral test
Behavioral
recovery
Reference
Mouse ESc
With or without RA
TH (14500), NSE, NF-200
no tested
no tested
Deacon 1998
Mouse ESc
Small number of
undifferentiated cells
+
Björklund 2002
By a five stage protocol.
TH (2100), NeuN,
DAT,AACD, AHD2, calertinin,
calbindin, serotonin
TH (no tested), calbindin
Rotation, PET
Mouse ESc transfected with
Nurr1
6-OHDA lesioned
nigrostriatal, rat model for
PD
lesioned the median forbrain
bundle by 6-OHDA, rat
model for PD
lesioned striatum by 6OHDA, rat model for PD
+
Kim 2002
Mouse ESc
Differentiated using a fivestage in vitro method
Differentiated using a fivestage in vitro method
ES colonies were cultured on
PA6 cells (12 days)
ES colonies were cultured on
PA6 cells (12 days)
ES cells were cultured on PA6
cells for 3 weeks
bone marrow–derived stromal
cell line (PA6), and late
exposure of FGF2, FGF20
5 day: co-culture on stromal
cell line
2 days: SHH, FGF8, SRM
4 days: N2, SHH, FGF8 bFGF.
3 days: N2, ascorbic acid,
BDNF
ESc sphere were cultured with
B27, FGF2, EGF
6-OHDA lesioned striatum,
mouse model for PD
lesioned substantia nigra by
6-OHDA, rat model for PD
6-OHDA lesioned striatum,
mouse model for PD
6-OHDA lesioned striatum,
mouse model for PD
6-OHDA lesioned striatum,
mouse model for PD
Cynomolgus monkey with
MPTP-induced PD
TH (no tested)
Rotation, step
test, pawreaching test,
cylinder test
Rotational
+
Nishimura 2003
+
Shim 2004
TH (13000), β-tubulinIII
Rotational,
stepping test
not tested
no tested
Kawasaki 2000
TH , β-tubulinIII
not tested
not tested
Morizane 2002
TH (830)
not tested
not tested
Kawasaki 2002
TH (8000), DAT
Parkinsonian
behavior
+
Takagi 2005
6-OHDA lesioned striatum,
mouse model for PD
TH (23000), DAT, AADC
Rotational
+
Barberi 2003
6-OHDA lesioned
nigrostriatal, rat model for
PD
6-OHDA lesioned
Nestin, musashi1, NCAM,
GFAP, NeuN, NF-200, TH
(390)
TH (few), MAP2, nestin
Rotational
+
Ben-Hur 2004
not tested
not tested
Schulz 2004
Population of cells/source
Embryonic stem cells (ESc)
Mouse ESc transfected with
Bcl-XL
Mouse ESc
Mouse ESc
Cynomolgus monkey ESc
Cynomolgus monkey ESc –
derived neurospheres
Mouse ESc or nuclear transfer
ESc
Human ES spheres (HES1)
Human ESc (BG01/03)
Med II (serum –free), FGF2,,
TH (18,310)
64
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫מבוא‬
B27, GDNF, BDNF
Human ESc (BG01)
nigrostriatal, rat model for
PD
6-OHDA lesioned
nigrostriatal, rat model for
PD
TH (few)
not tested
not tested
Zeng 2004
6-OHDA rat model for PD
TH, GC, L-DOPA
Rotation
+
Schwarz 1999
MPTP mouse model of PD:
cells grafted in striatum 1w
later
MPTP mouse model of PD;
cells grafted intravenous six
weeks before
6-OHDA rat model for PD
TH (52)
Rotarod test
+
Li 2001
TH
Locomotor
activity
+
Park 2001b
TH (46%), DAT
Rotation,
adjusting step,
paw-reaching
+
Dezawa 2004
NSCs engineered to release
GDNF
6-OHDA lesioned striatum,
mouse model for PD
Nestin, Neu-N, GFAP, CNPase,
TH (350)
Rotation
+
Åkerud 2001
Undifferentiated
6-OHDA lesioned striatum,
rat model for PD
Rotation
no
Yang 2002
not relevant
MPTP mouse model of PD
β-tubulinIII, NSE, NeuN, TH,
AADC
TH, Hu, NeuN, nestin, CRMP-4
Not relevant
no relevant
Zhao 2003
Differentiation medium (not
described)
Human PD
not relevant
UPDRS
+
Levesque &
Neuman 2002a,b
bone marrow–derived stromal
cell (PA6) with GMEM, KSR,
pyruvate, glutamine,
nonessential amino acid, ME
Bone marrow stromal cells (BMSc)
Rat BMSc
Mouse BMSc
Vectors construct consisting of
the TH gene and GC gene
Undifferentiated
Mouse BMSc
Vectors construct consisting of
the GDNF gene
Rat BMSc
Vectors construct consisting of
NICD gene, forskolin, bFGF,
CNTF, GDNF
Neural stem cells (NSCs)
c17.2 mouse NSCs
c17.2 mouse NSCs
Evidence for neurogenesis in
the adult mice substantia nigra
Human neural stem cells
65
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫‪ .9‬שיפור הישרדותם של תאי עצב דופאמינרגים מושתלים‬
‫‪ 9.1‬שיעור הישרדות נמוך של תאי עצב דופאמינרגים מושתלים‬
‫כבר בשנת ‪ 1987‬הוצע שרק כ‪ 10%-‬מהתאים הדופאמינרגים שורדים לאחר השתלתם במע"מ בחולדה ) ‪Brundin‬‬
‫‪ .(& Bjorklund 1987‬בנוסף‪ ,‬במחקרים רבים מאז נמצא ששיעור הישרדותם של תאים דופאמינרגים מושתלים‬
‫נע בין ‪ (Sinclair et al., 1999) 1%‬ל‪ .(Rosenblad et al., 1996) 20%-‬למרות שתצפית זו מזוהה עם בעיה‬
‫ביולוגית מעניינת‪ ,‬הישרדותם הנמוכה של התאים הדופאמינירגים המושתלים יכולה להיפתר באופן פרקטי ע"י‬
‫השתלה של מספר גדול יותר של תאים‪ .‬פתרון זה היה קביל כל עוד דובר בניסויים בבעלי חיים כמודל למחלת‬
‫פרקינסון‪ ,‬ברם כאשר התחילו לבצע השתלות של תאי עצב דופאמנירגים )מעוברים( לחולי פרקינסון‪ ,‬הבעיה חזרה‬
‫ביתר שאת )‪ .(Lindvall et al., 1990‬למעשה‪ ,‬כפי שזוהה ע"י ‪ PET‬שהשתמשו ב‪ flurodopa -‬כליגנד‪ ,‬שיפור‬
‫קליני משמעותי נצפה בחולים בהם הייתה קליטה גבוהה יותר של ‪ – flurodopa‬קרי‪ ,‬יותר תאים שרדו ) ‪Hagell et‬‬
‫‪ .(al., 1999‬כמובן‪ ,‬שישנם פקטורים נוספים ה"משחקים" תפקיד חשוב בעוצמת השיפור הקליני לאחר ההשתלה‪,‬‬
‫כגון‪ :‬גיל‪ ,‬משך זמן המחלה‪ ,‬חומרתה‪ ,‬ועוד‪ .‬אף‪-‬על‪-‬פי‪-‬כן‪ ,‬לאור המחקרים הרבים שנעשו בהשתלת תאים בחיות‬
‫מודל למחלת פרקינסון )לסקירה ספרותית ראה ‪ ,(Brundin et al., 1994‬ניתן לקבוע שמידת השיפור הקליני‬
‫בחולים שעברו השתלה תלויה באופן ישיר בפעילותם ובשרידותם של התאים שהושתלו‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬כפי שתואר‬
‫בפרקים הקודמים יש צורך בתאים מ‪ ventral mesencephalic-‬מ‪ 4-‬עד ‪ 8‬עוברים לכל צד של המוח על מנת‬
‫שיהיה שיפור קליני משמעותי‪ .‬הצורך בכל כך הרבה עוברים עבור השתלה באדם אחד היווה גורם מגביל‬
‫במחקרים הקליניים )‪ .(Tabbal et al., 1998‬בהתבסס על כך ששרידותם של תאים דופאמינרגים ממקור אנושי‬
‫שעברו השתלה בחיות )‪ (xenograft‬נע בין ‪ 5%‬ל‪ ,(Brundin et al., 1988; Frodl et al., 1994 ) 10%-‬ומניתוחים‬
‫לאחר המוות בחולי פרקינסון שעברו השתלת תאים‪,‬ממקור עובר )‪ ,(Kordower et al., 1996, 1998‬העלאת‬
‫שרידות של התאים המושתלים תצריך פחות עוברים עבור כל השתלה‪ .‬גם אם מקור התאים המושתלים הנו‬
‫מתאי גזע עובריים או מתאי גזע מבוגר‪ ,‬יש צורך בנפח קטן של תאים מושתלים וזאת על מנת לא לגרום לטראומה‬
‫לרקמה בה משתילים את התאים )מוח המאחסן(‪ .‬בשנים האחרונות ישנן עבודות רבות הדנות בדרכים השונים‬
‫לשיפור שרידות של התאים המושתלים במע"מ )סקירה ספרותית ‪.(Brundin et al., 2000‬‬
‫‪ 9.2‬היכן התאים המיועדים להשתלה נפגעים?‬
‫תאי עצב דופאמינירגים המושתלים בחייה למודל למחלת פרקינסון או לחולי פרקינסון יכולים להיפגע ולמות‬
‫בארבעה שלבים שונים של מהלך ההשתלה‪ .‬בראשונה‪ ,‬קיימת עקה של חוסר חמצן )‪ (hypoxia‬וסוכר‬
‫)‪ (hypoglycemia‬לתאים בשלב הפקתם וזאת בעקבות הוצאתם מסביבת הגידול הטבעית והעברתם לגידול‬
‫‪66‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫בתנאי מעבדה )‪ .(Glozman & Yavin 1997‬בשלב השני‪ ,‬תתכן פגיעה בתאי עצב עצמם‪ ,‬כגון ‪ ,axotomy‬ונזקי‬
‫טראומה אחרים בזמן ניתוח ההשתלה‪ ,‬כמו‪-‬כן‪ ,‬מצב של חוסר חמצן )‪ (hypoxia‬לתאים מרגע קצירתם מתרביות‬
‫הגידול ועד להשתלתם ברקמת המוח )‪ .(Fawcett et al., 1995‬שלב שלישי‪ ,‬בתקופה הקצרה לאחר ההשתלה‪ ,‬קרי‬
‫‪ 1-4‬ימים‪ ,‬הסביבה בה הושתלו התאים )מוח המאחסן( הנה "עוינת" וקשה להשרדות‪ .‬בשלב הנ"ל‪ ,‬התאים של‬
‫המאחסן בסביבת ההשתלה יוצרים עקה חימצונית ומפרישים ‪ glutamate‬בעקבות הנזק למוח ) & ‪Lynch‬‬
‫‪ .(Dawson 1994‬בנוסף‪ ,‬ישנה הפרשת ציטוקינים דלקתיים כתוצאה מהנזק במוח המסוגלים לפגוע בתאים‬
‫המושתלים )‪ .(Ghirnikar et al., 1998‬בשלב רביעי‪ ,‬מתקבל על הדעת שהישרדות נמוכה של התאים המושתלים‬
‫לתקופה ארוכה נובעת‪ ,‬בין היתר‪ ,‬מחוסר של )‪ neurotrophic factors (NTFs‬מתאימים שתפקידם לתמוך‬
‫בתאים בשלבים השונים במהלך הבשלתם והטעמתם בתוך המאחסן החדש )‪.(Engele 1998‬‬
‫‪ 9.3‬מנגנון ביוכימי הגורם לירידה בהישרדותם של תאים דופאמינרגים מושתלים‬
‫שרידותם הנמוכה ותמותה של התאים המושתלים תתכן בשתי תבניות עיקריות‪ :‬מוות מבוקר )‪ (apoptosis‬או‬
‫נמק )‪ ,(necrosis‬אף על פי שקיים גם מצב ביניים )‪) (Pettmann & Henderson 1998‬תמונה מס' ‪ .(12‬מוות‬
‫נקרוטי הוא בד"כ תוצאה של פגיעה פתולוגית קשה הגורמת לאי חזרת פעילות התאים ולמחסור אנרגטי‪ .‬לרוב‪,‬‬
‫תהליך נקרוטי הנו יחסית מהיר‪ ,‬דקות עד שעות‪ ,‬המאופיין בהתנפחות של אברונים תוך תאיים וחדירות של דופן‬
‫התא‪ ,‬המלווה בריאקצית אימונולוגית בסביבת הרקמה )‪ .(Kroemer et al. 1998‬בניגוד לכך‪ ,‬מוות אפופטוטי‬
‫)כולל מוות מתוכנן( הנו תהליך איטי האורך מספר שעות עד ימים‪ ,‬מבוקר‪ ,‬תלוי אנרגיה‪ ,‬תלוי יצירת חלבונים‬
‫ופעילות אנזימתית )כדוגמת קזפזות( )‪ .(Kromer et al., 1998‬מוות אפופטוטי קורה באופן טבעי במהלך‬
‫התפתחות מע"מ עוברי )‪ (Raff et al., 1993‬וגם במהלך נזק למע"מ כדוגמת איסכמיה ובמחלות ניוון עצבי שונות‬
‫)‪ .(Leist & Nicotera 1998‬כאמור‪ ,‬רוב התאים הדופאמינרגים בשתל מתים במהלך הכנתם להשתלה או במהלך‬
‫‪ 1-4‬ימים לאחר השתלתם למוח‪ .‬במחקרים שונים הוכח שחלק נכבד מהתאים מתים מוות מבוקר )‪(apoptotic‬‬
‫)‪ .(Cicchetti et al., 2002; Mahalik et al., 1994; Schierle et al., 1999; Zawada et al., 1998‬יתרה מכך‪,‬‬
‫השימוש במעכב קספזות )‪ Ac-YVAD-cmk (caspase inhibitor‬העלה את שרידותם של תאי עצב דופאמינרגים‬
‫בתרבית‪ ,‬הוריד את פעילות ‪ caspase3‬וקיטוע ‪ DNA‬של תאים דופאמינרגים הנמצאים בתרחיף במבחנה לפני‬
‫השתלה והעלה את שרידותם של התאים המושתלים במוח החולדה ב‪ 350% -‬לעומת הביקורת ) ‪Schierle et al.,‬‬
‫‪ .(1999‬בנוסף‪ ,‬נפח השתל ועיצבוב הסטריאטום גדלו בשתל שעבר טיפול עם מעכב קספזות‪ .‬תוצאות ניסוי זה‬
‫‪67‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫מוכיחות שחלק ממוות של תאים דופאמינרגים מושתלים הנו כתוצאה מאפופטוזיס ושניתן להעלות שרידותם של‬
‫תאים מושתלים באמצעות טיפול מנע נוגד אפופטוזיס‪.‬‬
‫‪ 9.3.1‬העלאת הישרדותם של תאי עצב דופאמינרגים באמצעות ביטוי ‪BCL-2‬‬
‫הגן ‪ bcl-2‬ממוקם על כרומוזום ‪18‬‬
‫ומקודד חלבונים במשקל של ‪.25kDa‬‬
‫אזור ה‪ C terminal-‬של החלבון מורכב‬
‫מ‪21-‬‬
‫חומצות‬
‫אמינו‬
‫הידרופוביות‬
‫החיוניות ומאפשרות את עיגון החלבון‬
‫בממבראנות‪,‬‬
‫בצד‬
‫הציטופלאסמטי‬
‫בדופן החיצונה של המיטוכונדריה‪,‬‬
‫בדופן הגרעין‪ ,‬וב‪-‬‬
‫‪endoplasmic‬‬
‫‪ .reticulum‬חלבונים ממשפחת ‪bcl-2‬‬
‫משחקים תפקיד מרכזי וחשוב בבקרה‬
‫על הפעלה של קספאזות ועל שלמות‬
‫המיטוכונדריה ולכן לחלבונים ממשפחה‬
‫זו תפקיד משמעותי ובולט במהלך‬
‫אפופטוזיס ) ;‪Adams & Cory 1998‬‬
‫‪1998‬‬
‫‪Henderson‬‬
‫&‬
‫‪.(Pettmann‬‬
‫ידועים ‪ 15‬חלבונים מבית משפחת ‪bcl-2‬‬
‫תמונה מס'‪ : 12‬מנגנונים המעורבים בהישרדותם הנמוכה של תאים‬
‫דופאמינרגים המושתלים במוח )‪(Brundin et al., 2000‬‬
‫המחולקים לשלשה תת‪-‬משפחות‪:‬‬
‫‪ :(pro-survival) Bcl-2 subfamily (1‬הנם אנטי‪-‬אפופטוטים‪.Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1 and A1 ,‬‬
‫‪(2‬‬
‫‪ :(pro-apoptotic) Bax subfamily‬תומכי אפופטוזיס‪.Bax, Bak and Bok ,‬‬
‫‪ :(pro-apoptotic) BH3 subfamily (3‬תומכי אפופטוזיס‪.Bad, Bid, Bik, Blk, Hrk, BNIP3 and BimL ,‬‬
‫למעשה‪ ,‬בעכברים טרנסגנים המבטאים ביתר ‪ Bcl-2‬הומני בתאי עצב יש פחות תהליך מוות אפופטוטי כתוצאה‬
‫מ‪ ,(Dubois-Dauphin et al., 1994; Farlie et al., 1995 ) axotomy -‬איסכמיה )‪ ,(Martinou et al., 1994‬רעלן‬
‫עצבי )‪ ,(Yang et al., 1998‬או במחלות ניוון עיצבי ) ‪ .(Offen et al., 1998, 2000‬במחקרים רבים שנעשו‬
‫במעבדתנו נמצא שתרביות תאי עצב דופאמינרגים המבטאים ביתר את הגן ההומני ‪ bcl-2‬הינם מוגנים מפני מוות‬
‫‪68‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מבוא‬
‫אפופטוטי המושרה באמצעות רעלן עצבי )‪ .(Offen et al., 1997; Ziv et al., 1997a-c) (neurotoxins‬כלומר תאי‬
‫עצב דופאמינרגים שיבטאו ביתר את הגן ‪ bcl-2‬הנם באופן תאורטי בעלי יכולת שרידות גבוהה יותר לאחר‬
‫השתלתם למע"מ‪.‬‬
‫‪69‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מטרות המחקר‬
‫מטרות המחקר‬
‫מטרה כללית‪:‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימליים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫מטרות ספציפיות‪:‬‬
‫‪ .1‬הפקת תאי גזע מזנכימלים מרקמת ממח עצם אנושית ועכברית והשראת שגשוגם בתרבית‬
‫‪ .2‬אפיון תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית‬
‫‪ .3‬השראת התמיינות של תאי גזע מזנכמלים אנושיים ועכבריים לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫‪ .4‬אפיון התאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫‪ .5‬השראת יצור ושחרור נוירוטרנסמיטר דופאמין בתאים שעברו התמיינות‬
‫‪ .6‬העלאת הישרדותם של התאים שהתמיינו לתאים דמויי‪-‬תאי עצב‬
‫‪ .7‬השתלה אוטולוגית של תאים ממקור עכברי שעברו התמיינות לתאים דמויי‪-‬עצב דופאמינרגים ובדיקת‬
‫יעילותם הקלינית בעכברים ובחולדות מודל למחלת פרקינסון‬
‫‪70‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
‫חומרים ושיטות‬
‫ חומרים‬.1
‫ חומרים אנטיביוטים ותוספות לגידול תאים‬,‫ מצעי גידול‬1.1
:(http://www.bioind.com) ,‫ ישראל‬,‫ בית העמק‬,‫תעשיות ביולוגיות‬
Raw materials
Catalog No.
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) with
D-Glucose 4500mg/l
Ethyleneediamine (EDTA) 0.05%
Fetal calf serum (FCS)
Goat serum (GS)
Hank’s balanced salt solution (HBSS)
Horse serum (HS)
L-Glutamine 200mM
Minimum Essential Medium Eagle, Alpha
Modification (MEM-alpha)
Nonessential amino acid (X100)
Penicillin 10000 U/ml / streptomycin 10 mg/ml /
nystatin 1250 U/ml (PSN)
Phosphate buffer saline (PBS)
Trypsin (0.25%) EDTA (0.05%) Sol. B
Water- Cell Culture Grade
01-055-1A
03-015-1B
04-001-1A
04-009-1B
02-015-1A
04-004-1A
03-020-1C
11-042-1A
In-activation: 550C/30min
In-activation: 550C/30min
In-activation: 550C/30min
01-340-1B
03-032-1C
02-020-1A
03-052-1A
03-055-1A
‫חומרים מחברות אחרות‬
Raw materials
Manufacturer
Catalog No.
Fetal bovine serum (FBS)
β-mercaptoethanol (βME)
HyClone
Sigma
CH30160.03, Lot No.: CNB0008
M3148
‫ תוספות למדיום הגידול עבור התמיינות תאים‬.1.2
Raw materials
Manufacturer
Catalog No.
3-isobutyl-1-methyl-xanthine (IBMX)
all-trans-retinoic acid (RA)
Ascorbic acid
Bovine Insulin
Butylated hydroxyanisole (BHA)
Dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
Docosahexaenoic acid (DHA)
holo human Transferin
human basic Fibroblast growth factor (bFGF ,FGF-2)
human Epidermal growth factor (EGF)
human Galia-derived neurotrophic factor (GDNF)
human β-Nerve growth factor (NGF)
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
Sigma
R&D systems
R&D systems
R&D systems
R&D systems
I7018
R2625
A0278
I6634
B-1253
D0627
D-5879
D2534
T8158
233-FB
236-EG
212-GD
256-GF
Progesteron
Putrescine
Selenite
Sigma
Sigma
Sigma
P8783
P5780
S5261
71
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
‫ נוגדנים‬1.3
Dye conjugated primary antibodies for FACS analysis
Reactivity
Antibody
Fluorescein isothiocyanate (FITC)
conjugated mouse IgG1, κ
FITC conjugated mouse IgG2b, κ
FITC conjugated mouse IgG2a
FITC conjugated mouse IgG2a
FITC conjugated mouse IgG2κ
monoclonal
FITC conjugated mouse IgM, κ
FITC conjugated mouse IgG1
Phycoerythrin (PE) conjugated
mouse IgG1κ
PE conjugated mouse IgG1
PE conjugated mouse IgG1
PE conjugated mouse IgG1κ
PE conjugated mouse IgG1
PE conjugated mouse IgG1
PE conjugated mouse IgG1
Peridinin-Chlorophyll-Protein
(PerCP) conjugated mouse IgG1, κ
PerCP conjugated mouse IgG1
Alexa488 conjugated
Dilution
Manufacturer
Anti-human CD11b
20µl/106cells
eBioscience a
Anti-human CD20
Anti-human CD34
Anti-human CD45
Anti-human CD105 (SH2)
20µl/106cells
1:10
1:10
1:100
BD Pharmingen™ c
Miltenyi Biotec d
Miltenyi Biotec d
Ancell Corporation e
Anti-human FMC7
Isotype, nonspecific
Anti-human CD5
20µl/106cells
1:10
20µl/106cells
BD Pharmingen™ c
eBioscience
BD Pharmingen™ c
Anti-human CD19
Anti-human CD29 (Integrin β1)
Anti-human CD34
Anti-human CD44
Anti-human CD56
Isotype, nonspecific
Anti-human CD90
1:10
1:25
20µl/106cells
1:10
1:20
1:10
20µl/106cells
eBioscience a
eBioscience a
BD Pharmingen™ c
Cymbus b
BD Biosciences c
eBioscience a
BD Pharmingen™ c
Isotype, nonspecific
Anti mouse
1:10
1:500
BD Pharmingen™ c
Molecular Probes f
Primary Antibodies
Host
Reactivity
Mouse IgG1κ
Actin
Mouse IgG2b
β-tubulin III
1:400
Sigma i
Rabbit
Glial fibrillary acidic
protein (GFAP)
Glial fibrillary acidic
protein (GFAP)
Microtubules
associated protein 2
(MAP2)
Nestin
Nestin (human)
1:80
Sigma i
Rabbit Polyclonal
Mouse IgG1
Mouse IgG1
Rabbit
Dilution
for IC*
Dilution
for WB*
Dilution
for FC*
Chemicon g
1:1000 –
1:1250
1:100
1:50
R&D systems m
Gift from C.A.
Messam, NIH
Sigma i
1:100
Cymbus / Chemicon g
1:20
Mouse IgG1
1:2500
Neurofilament 200
1:200
1:1000
(NF-H)
Mouse IgG2a
Neuron specific
1:100
1:750 enolase (NSE)
1:1000
Mouse IgG1
Neuronal nuclei
1:50
1:1000 (NeuN)
1:2500
Mouse IgG3
Tryptophan
1:200
hydroxylase (TPH)
Rabbit polyclonal
Tyrosine hydroxylase
1:1000 –
1:6000
(TH)
1:3000
Rabbit polyclonal
Tyrosine hydroxylase
1:5000
Rabbit Polyclonal
Vesicular monoamine
1:50
transporter 2 (VMAT2)
*IC= Immunocytochemistry; WB = Western blot; FC = Flow cytometry
72
Dako l
Zymed Lab. j
5-10µg/ml
1:200
Manufacturer
Chemicon g
Sigma i
Chemicon g
Calbiochem n
Chemicon g
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
Secondary Antibodies
Specificity Source Dilution
for IC*
Mouse IgG
Rabbit IgG
Rabbit IgG
Mouse IgG
Mouse IgG
Rabbit IgG
Goat
Goat
Donkey
Goat
Donkey
Goat
Rabbit IgG
Mouse IgG
Swine
Sheep
Mouse IgG
Goat
Dilution
for WB*
1.5mg/ml
1.5mg/ml
1:300
1:50-1:200
1:300
1:1001:800
1:20
1:50
Dilution
for FC*
1:100
1:100
Conjugated
Manufacturer
Biotinylated
Biotinylated
CyTM2
CyTM2
CyTM3
CyTM3
Vector k
Vector k
Jackson ImmunoResearch h
Jackson ImmunoResearch h
Jackson ImmunoResearch h
Jackson ImmunoResearch h
FITC
FITC
DakoCytomation l
Sigma i
Jackson ImmunoResearch h
1:20000
horseradishperoxidase (HRP)
Rabbit IgG Goat
1:25000
horseradishperoxidase (HRP)
*IC= Immunocytochemistry; WB = Western blot; FC = Flow cytometry
Jackson ImmunoResearch h
a
eBioscience, San Diego, CA, http://www.ebioscience.com
Cymbus Biotechnology, Hampshire, UK, http://www.cymbus.co.uk
c
BD Biosciences, San Jose, CA, USA, http://bdbiosciences.com
d
Miltenyi Biotec, Cologne, Germany, http://www.miltenyibiotec.com
e
Ancell Corporation, Bayport, MN, http://www.ancell.com
f
Molecular Probes, Carlsbad, CA, http://www.invitrogen.com
g
Chemicon International, Temecula, CA, http://www.chemicon.com
h
Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, http://www.jacksonimmuno.com
i
Sigma, St. Louis, MO, http://www.sigmaaldrich.com
j
Zymed Lab., South San Francisco, CA, http://www.zymed.com
k
Vector, Burlingame, CA, http://www.vectorlabs.com
l
DakoCytomation, Glostrup, Denmark http://www.dakocytomation.com/
m
R&D systems, Minneapolis, MN, http://www.rndsystems.com/
n
Calbiochem, Darmstadt, Germany, http://www.emdbiosciences.com
b
‫ צבעים לסימון גרעין‬1.4
Dye
Dilution
Source
Hoechst 33342
Propidium iodide (PI)
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)
10 µg/ml
10 µg/ml
10 µg/ml
Sigma
Sigma
Sigma
(‫ ערכות )קיטים‬1.5
Kit
Destined for
Manufacturer
Catalog
No.
BCA protein assay kit
measuring protein
concentration in
biological samples
Protease inhibitor
cocktail tablets
RT-PCR reaction
Pierce
23225
Roch
1836153
Biological
Industries
Roche
20-80050
11 732
668 001
CompleteTM Mini
EZ-First Strand cDNA Synthesis Kit for RTPCR
High Pure PCR Product Purification Kit
IntraStain Kit
Purification of PCR
reaction products
Fixation and
permeabilization Kit for
flow cytometry
73
Dakocytomation
K2311
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
JETsorb DNA Extraction from agarose gels
Liquid DAB Substrate Kit
QAGEN Plasmid Midi Protocol
QIAprep Spine Miniprep Kit
ReadyMix Taq-PCR Reaction kit
SuperScriptTM II Rnase H-RT
SuperSignal West Chemiluminescent Substrate
Takara TaqTM
Vectastain ABC KIT
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System
Extraction from agarose
gels
Immunostaining
Plasmid purification
Plasmid purification
PCR reaction
RT-PCR reaction
Genomed
An Enhanced
chemiluminescent for
HRP detection
PCR reaction
Immunostaining
Purification of PCR
reaction products
Pierce
110150
Zymed Laboratories
QIAGEN
QIAGEN
Sigma
Invitrogen
00-2014
12143
27104
P-4600
18064014
34080
Takara
Vector
Promega
R001A
PK-4001
A9282
‫ חומרים אחרים‬1.6
Material
Manufacturer
32
NEN Life Science Products
Sigma
A-6283
Bio-Rad
161-0140
Difco
214030
Amresco
0710
Serotec
BUF012B
Sigma
A-3678
ICN
194526
Sigma
A-4503
Amresco
0312
Sigma
C-2432
Biological Ind.
01-852-1A
Sigma / RBI
H8502
Promega
V3155
BDH
20296291
Merck
K29643517
Sigma
P-4003
Gadot
8832
Gadot
7266
BioLab
744 96
Sigma
E-1510
R&D systems
1918-FN-02M
Sigma
F-4375
Sigma
F-1268
Zymed
00-8000
Sigma
G-8898
Sigma
G-4505
Amresco
2074A50
BioLab
71802
Sigma
I-9392
Sigma
405-7
Bio 101,Inc
3002-011
Bio 101,Inc
3001-221
BioLab
58693
P-dCTP
Acetic acid Glacial (C2H4O2)
Acrylamide 40%
Agar (BactoTM)
Agarose 1
Alamar blue
Ammonium persulfate (APS)
Ampicillin
Bovine serum albumin (BSA)
Bromophenol blue sodium salt.
Chloroform (CHCl3)
Deionized H2O-DEPC-treated sterile
Dopamine Hydrochloride
DTT, Molecular Grade
Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) acid disodium salt dihydrate
EDTA (Titriplex)
electrophoresis-grade SDS
Ethanol 70%
Ethanol 96%
Ethanol absolute
Ethidium bromide
Fibronectin (human)
Ficoll (HISTOPAQUE-1077) density 1.077 g/ml
Formaldehyde (36.5-38%)
Glycerol vinyl alcohol (GVA) aqueous mounting solution
Glycine (C2H5NO2)
Guanidine HCl
Guanidinium thiocyanate
Hydrochloric acid (HCl)
Isoamyl alcohol- (IAA) (3-Methyl-1Butanol)
Isopropanol
LB- Medium
LB+AGAR
Methanol
74
Catalog No.
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
Mineral oil
MOPS
NaCl -Sodium Chloride
NaF- Sodium floride
NP-40
Organic solvent
Paraformaldehyde
Phenol (water saturated)
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW 70000-150000)
Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20)
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes
Polyvynylpyrrolidone (PVP)
Potassium Chloride (KCl)
Restriction enzymes
Sarcosyl (N-Lauroylsarcosine)
Sodium acetate
Sodium azide 0.1 M Solution
Sodium citrate
Sodium fluoride (NaF)
Sucrose
Super-RX, X-ray film
TEMED (C6H16N2)
Tris-base (Trizma® base)
Tris enzyme grade (Tris Base) NH2C(CH2OH)3
TritonX-100 (octylphenoxy polyethoxyethanol)
TRIZMA PRE-SET CRYSTALS pH7.4
UNI-SEP and UNI-SEPMAXI
Xylene cyanol FF
Sigma
M-5904
Sigma
M-8899
BioLab
19030591
Sigma
S6776
USB
19628
Biolab
Sigam
P-6148
Biological Ind.
01-860-1L
Sigma
P7626
Sigma
P6282
Sigma
P-1379
Bio-Rad
162-0255
Sigma
PVP-40
Sigma
P-4504
New England Biolabs (NEB)
Fermentas (MBI)
Sigma
L-9150
Sigma
S-5889
Sigma / Fluka
08591
Sigma
S-4641
Sigma
S-7920
Sigma
S-5016
Fuji
X0012
Sigma
T-8133
Sigma
T6066
USB
22674
Sigma
T-6878
Sigma
T-4003
NOVAmed
U-02/04/10
Sigma
X-4126
‫כל שאר החומרים יוזכרו במהלך תיאור השיטות‬
‫ ציוד סטרילי לגידול תאים ומבחנות‬1.7
‫ כל הפלטות‬.'‫ טיפים וכו‬,‫ פלאסקים‬,‫פעמיות‬-‫ פיפטות חד‬,‫פעמיות‬-‫ מבחנות חד‬,60-150mm ‫ צלחות‬,6-96 ‫פלטות‬
.polystyrene-‫הצלחות והפלאסקים לגידול התאים עשויים מ‬
Axygen (CA, USA), Corning / Costar (NY, USA), Greiner (Germany), Nunce (Denmark).
.(Nunc #177445) Permanox -‫ באריות העשויים מזכוכית או מ‬16 ‫ או‬8 ‫ של‬slide-chamber-‫נעשה שימוש גם ב‬
:FACS-‫מבחנות ל‬
Polystyrene, round bottom tube (12x75 mm style), FALCON BD Biosciences(CA, USA)
‫ מכשור ותוכנות מחשב‬1.8
Instrumentation
Manufacturer
Autoclave
ABI Prism 7000 sequence detection system
Bright-Line® Hemacytometer
BX52TF normal & fluorescent light source microscope
CELLQuestTM version 3.0 software
Centrifuge 5403 or 5417C or 5810R
Centrifuge
Tuttnauer, USA
Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
Sigma (Z359629)
Olympus, Tokyo, Japan
Becton Dickinson, USA
Eppendurf 5403, Hamburg, Germany
Ohermle Z 360 K
75
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
Centrifuge RC5C plus
Confocal Microscop LSM150
Direct Beta Counter -Matrix 9600
DP50-CU microscope digital camera
Driller
Electrophoresis power supply model 3000Xi
FACSCaliburTM flow cytometer
FILTERMAT 196-PACKARD
FLOUstar BMG LABTECH GmbH (PLATE READER)
Gel box for Electrophoresis
GeneQuant pro RNA/DNA colculator
Glass syringe 10µl
HPLC-ECD
Hybridisation oven
Ice machine
Image-Pro® Plus software
Incubator
IX70-S8F2 normal & fluorescent light source microscope
Laminar hood – Class II
Light table
Light-microscope BH-2
Liquid scintillation analyzer (TRI CARR- 1600TR)
OptiQuant software
PCR set PTC-100TM
pH Meter MP220
Phosphoimager Cyclone
POLARstar Galaxy
Quantity One®
Rotor-GeneTM 3000 Real-time thermal cycler
Rotor-Gene Real-time analysis software
Sequencing ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer
Spectrophotometer Uvikon 860
Streotactic frame
StudioLite™ software
TGradient thermocyclers
UV-crosslinking
VersaDocTM model 1000 Imaging System
ViewfinderLite™ software
WinMDI Version 2.8 software
Sorvall instruments, Newtown, CT, USA
Carl Zeiss
Packard Instruments, Meridien, CT, USA
Olympus, Tokyo, Japan
Dermel 395, Racine WI, USA
BioRad, Japan
Becton Dickinson. USA
Packard, Chicago, IL, USA
Offenburg, Germany
BioRad, Japan
Amersham Biosciences, NJ , USA
Hamilton microliter 700 series
Hybaid
Scotsman AF-10, Italy
Media Cybernetics, Silver Spring, MD
Tuttnauer, USA
Olympus, Tokyo, Japan
Nuaire, Plymouth, MN, USA
X-Ray product Inc., NY,USA
Olympus, Japan
Packard
Olympus, Tokyo, Japan
MJ Research Inc. USA
Mettler Toledo,Switzerland
Packard, Chicago, IL, USA
BMG LabTechnologies, Germany
BioRad, Japan
Corbett Research, Australia
Corbett Research, Australia
Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
Kontron instruments, Switzerland
Stoelting, USA
Olympus, Tokyo, Japan
Biometra GmbH, Germany
Hoefer scientific insruments San Frrancisco
Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA
Olympus, Tokyo, Japan
The Scripps Research Institute, USA
‫ מיקרוסקופים‬1.9
‫ מורפולוגית התאים וצביעות אימונוציטוכימיה ואחרות‬,‫ בקצרה‬.1.8 ‫המיקרוסקופים והתוכנות מצויים בטבלה‬
.‫ מיקרוסקופי אור וגם פלורסנטים‬, IX70-S8F2 -‫ ו‬BX52TF ‫נצפו ע"י מיקרוסקופים של חברת אולימפוס מדגם‬
‫ שמתואמת למיקרוסקופים ובעזרת התוכנה‬DP50-CU ‫התאים צולמו ע"י מצלמה דיגיטאלית מדגם‬
‫ וניתוח התמונות כגון ספירת תאים‬StudioLite™ ‫ עריכת התמונות נעשתה בעזרת התוכנה‬.ViewfinderLite™
.Image-Pro® Plus ‫בוצעה באמצעות התוכנה‬
‫התאים נצפו וצולמו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וכל האביזרים הנלווים של חברת‬,‫ בחלק מהניסויים‬,‫בנוסף‬
.(‫ פקולטה לרפואה‬,‫ )ציוד בין מחלקתי‬Carl Zeiss
76
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 1.10‬שורות תאים‬
‫שורות תאים‬
‫)‪Rat pheochromocytoma cells (PC12), (rat‬‬
‫)‪SH-SY5Y neuroblastoma, (human‬‬
‫אחזקה וגידול שורות התאים‬
‫תאי ‪PC12‬‬
‫תאים אלה גודלו במדיום המכיל‪:‬‬
‫‪Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 10% fetal calf serum (FCS), 5% horse serum, 1%‬‬
‫‪v/v penicillin (10,000U/ml) / streptomycin (10mg/ml) / nystatin (1,250U/ml).‬‬
‫התאים הוחזקו באינקובטור ב‪ ,370C-‬ב‪ 5%CO2-‬ובסביבה לחה‪ .‬המדיום הוחלף פעמיים בשבוע‪ ,‬לפי הצורך‪.‬‬
‫כאשר התאים הגיעו לכיסוי מלא‪ ,‬התאים נותקו בעזרת השרייה למשך ‪ 5-10‬דקות ב‪EDTA 0.05M /PBS -‬‬
‫ביחס ‪ 1:1.6‬בהתאמה‪ .‬התאים סורכזו והורחפו במדיום מלא ונזרעו חזרה בבקבוקי גידול במיהול של ‪.1:5‬‬
‫תאי ‪SH-SY5Y‬‬
‫תאים אלה גודלו במדיום המכיל‪:‬‬
‫‪Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), 10% fetal calf serum (FCS), 1% v/v penicillin‬‬
‫‪(10,000U/ml) / streptomycin (10mg/ml) / nystatin (1,250U/ml).‬‬
‫התאים הוחזקו באינקובטור ב‪ ,370C-‬ב‪ 5%CO2-‬ובסביבה לחה‪ .‬המדיום הוחלף פעמיים בשבוע‪ ,‬לפי הצורך‪.‬‬
‫כאשר התאים הגיעו לכיסוי מלא‪ ,‬ניתקנו את התאים בעזרת השרייה למשך ‪ 5‬דקות ב‪Trypsin:EDTA (1:2000 -‬‬
‫)‪ 0.05%‬ב‪ .370C-‬התאים סורכזו והורחפו במדיום מלא ונזרעו חזרה בבקבוקי גידול במיהול של ‪.1:4‬‬
‫השימוש בשורות תאים ‪ PC12‬וב‪ SH-SY5Y-‬במהלך המחקר נעשה עבור ביקורות חיוביות ושליליות‪.‬‬
‫‪77‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ .2‬שיטות‬
‫‪ 2.1‬הפקה וגידול תאים מזנכימליים ממח העצם‬
‫‪ 2.1.1‬חיות‬
‫תאי גזע ממח העצם הופקו מעכברים ‪ C57/bl‬בוגרים )הרלן‪ ,‬ישראל( או מעכברים הטרוזיגוטים טרנסגנים‬
‫הנושאים את הגן האנושי ‪ bcl2‬תחת הפרומוטר )‪ (promoter‬של ‪ .NSE‬העכברים יוצרו וסופקו למעבדתנו‬
‫באדיבותה של פרופ' ‪ Ora Bernard‬מאוסטרליה )‪ .(Farlie et al., 1995‬הגנוטיפ של העכברים זוהה באמצעות‬
‫ראקציות ‪ PCR‬לקצבות זנבות כמתואר )‪.(Offen et al., 2000‬‬
‫תאי גזע ממח העצם הופקו גם מעכברים טרנסגנים "ירוקים" ‪ B5/EGFP‬המבטאים ביתר את הגן ‪enhanced‬‬
‫)‪.(Hadjantonakis et al., 1998) green fluorescent protein (EGFP‬‬
‫כל העכברים ששימשו לניסויים שוכנו בחדר חיות בעל תנאים קבועים של טמפרטורה )‪ ,(22°C ± 1‬לחות )‪(30%‬‬
‫ומחזור של ‪ 12‬שעות אור‪/‬חושך‪ ,‬כמו כן החיות טופלו בתדירות יומית קבועה וניתנה להם גישה חופשית למזון‬
‫ולמים‪ .‬הפקת התאים ממח העצם נעשתה בהתאם להוראות הטיפול בחיות מעבדה‪ ,‬ותחת פיקוחה ואישורה של‬
‫הוועדה לאישור ניסויים בבע"ח במרכז הרפואי רבין ובאוניברסיטת ת"א‪.‬‬
‫‪ 2.1.2‬בני אדם‬
‫תאי גזע ממח העצם הופקו מ‪ 30-‬מתנדבים בריאים בגילאי ‪ 19‬עד ‪ 76‬משאריות דגימות )מח עצם( שנלקחו מהם‬
‫לבדיקות רפואיות שונות‪ .‬הדגימות נלקחו רק לאחר מילוי טופס הסכמה מדעת‪ .‬האישורים להפקת מח העצם‬
‫נתנו ע"י ועדת הלסינקי המוסדית של בית‪-‬חולים לניאדו בנתניה‪ ,‬ועדת הלסינקי של הפקולטה לרפואה וועדת‬
‫הלסינקי עליונה של אוניברסיטת תל‪-‬אביב ובאישור משרד הבריאות‪.‬‬
‫‪ 2.1.3‬הפקת תאים מזנכימלים והתרבותם‬
‫הקרבת החיות נעשה בשיטת טרנסלוקציה מהירה‪ .‬מהחיות הוצאו בשלמותם עצמות הירך והשוקיים של הגפיים‬
‫האחוריות‪ .‬תחת תנאים סטריליים הוכנסה מחט דקה ‪ 30G‬לתוך העצמות ונשאבה תכולתן‪ .‬מח העצם נשטף עם‬
‫‪ HBSS‬וסרכוז במשך ‪ 20‬דקות בטמפרטורת החדר במהירות ‪ .1000 x g‬המשך גדילתם של התאים ממקור עכבר‬
‫כדומה לתאים ממקור אדם כמבואר בהמשך‪.‬‬
‫הפקת תאים מזנכימלים ממקור אנושי נעשתה משאריות של דגימות מח עצם שנלקחו מעצם הירך או מעצם‬
‫החזה )‪ .(sternum‬כל הטיפול בתאים נעשה תחת תנאים סטריליים‪ .‬דגימת מח העצם עורבבה בנפחים ‪ 1:1‬עם‬
‫‪ .HBSS‬באמצעות פיפטת פסטר הוספה תמיסת ‪ Ficoll‬בצפיפות ‪ 1.077 g/ml‬מתחת לדגימת מח העצם וזאת על‬
‫מנת להפריד את התאים המונונוקלארים‪ .‬הדגימה סורכזה במשך ‪ 30‬דקות בטמפרטורת החדר ב‪.2500 x g -‬‬
‫לחילופין‪ ,‬דגימת מח העצם עם ‪ HBSS‬הוכנסה למבחנה מסחרית מיוחדת )‪ (UNI-SEPMAXI‬וסורכזה במשך ‪20‬‬
‫דקות בטמפרטורת החדר ב‪ .1000 x g -‬לאחר הסרכוז ישנם ארבע פאזות במבחנה‪ .‬בתחתית‪ ,‬מצויים‬
‫אריתרוציטים )‪ ,(erythrocyte‬תאים מתים ופולימורפונוקלארים ) ‪polymorphnuclear leukocytes or‬‬
‫‪ .(granulocytes‬מעליה תמיסת הסוכר‪ ,‬מעל תמיסת הסוכר מצוייה שכבת ביניים‬
‫‪ -‬טבעת התאים‬
‫המונונוקלארים ומעליה סרום עם תאי שומן‪ .‬שכבת הביניים של התאים המונונוקלארים נשאבה בזהירות בעזרת‬
‫פיפטת פסטר‪ ,‬נשטפה עם ‪ HBSS‬וסורכזה במשך ‪ 20‬דקות ב‪ .2000 x g -‬משקע התאים הורחף במדיום הגידול‪,‬‬
‫התאים נזרעו בצלחות או בפלאסקים מפלסטיק עשויים מ‪ polystyrene -‬למשך ‪ 48‬שעות באינקובטור‬
‫)אינקובציה ב‪ 37C° -‬עם ‪ .(5%CO2‬לאחר ‪ 48‬שעות נשפך מדיום הגידול ועמו כל התאים הצפים )ברובם תאים‬
‫‪78‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫המטופואטים(‪ ,‬צלחות הגידול נשטפו פעמיים עם ‪ PBS‬והוחזר מדיום גידול חדש‪ .‬התאים שנדבקו לתחתית‬
‫צלחות הגידול או הפלאסקים הם התאים המזנכימלים ממח העצם‪ .‬התאים הוחזקו באינקובאטור ב‪ ,37°C-‬ב‪-‬‬
‫‪ 5% CO2‬ובסביבה לחה‪ .‬מדיום הגידול הוחלף שלש פעמים בשבוע‪.‬‬
‫פיצול תאים ‪ -‬כאשר התאים הגיעו לכיסוי מלא של צלחת הגידול‪ ,‬הם נותקו בעזרת השרייה למשך ‪ 5-10‬דקות‬
‫ב‪ trypsin:EDTA -‬ב‪ .37°C-‬ניטרול ה ‪ trypsin-‬בוצע ע"י הוספת מדיום גידול )כולל סרום(‪ ,‬התאים סורכזו‬
‫בטמפרטורת החדר למשך ‪ 10‬דקות במהירות ‪ 1000 x g‬והורחפו במדיום מלא ונזרעו חזרה בבקבוקי גידול‬
‫במיהול של ‪ .1:5‬השראת ההתמיינות נעשתה בתאים שגדלו בתרבית במשך חודש ומעלה‪.‬‬
‫הקפאת התאים – ‪ 106‬תאים במבחנות להקפאה ב‪1ml -‬של תמיסה המכילה ‪ ,5%-DMSO ,30%-FCS :‬מדיום‬
‫גידול ‪.65%-‬‬
‫ספירת תאים ‪ -‬ספירת התאים בוצעה ב"תא לספירת תאים" )‪ .(Bright-Line® Hemacytometer‬לתא הוכנס‬
‫‪ 10µl‬של תמיסה עם תאים‪ ,‬מס' התאים למ"ל = ממוצע הספירה לריבוע ‪.104 X‬‬
‫‪Proliferation medium‬‬
‫‪Material‬‬
‫‪Concentration‬‬
‫‪Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) or Minimum essential medium eagle,‬‬
‫)‪alpha modification (MEM-alpha‬‬
‫‪2mM‬‬
‫‪1%‬‬
‫‪L-Glutamine‬‬
‫‪penicillin (10,000U/ml) / streptomycin (10mg/ml) / nystatin‬‬
‫)‪(1,250U/ml‬‬
‫)‪Nonessential amino acid (X100‬‬
‫‪2-mercaptoethanol‬‬
‫)‪Fetal calf serum (FCS) / fetal bovine serum (FBS‬‬
‫)‪Horse serum (HS‬‬
‫‪1%‬‬
‫‪0.001%‬‬
‫‪15%‬‬
‫‪5%‬‬
‫)‪Human epidermal growth factor (EGF‬‬
‫‪10 ng/ml‬‬
‫המדיום הוכן בתנאים מעוקרים וסונן בפילטר של ‪0.22µm‬‬
‫‪ 2.2‬אפיון תאים מזנכימליים אנושיים ממח העצם‬
‫‪ 2.2.1‬אפיון באמצעות ‪FACS‬‬
‫אפיון התאים באמצעות ‪ FACS‬בוצע מייד עם הפקתם ממח העצם‪ 23 ,16 ,‬ו‪ 30 -‬ימים לאחר גדילתם בתרבית‪.‬‬
‫ניתוק התאים מהתרבית‪ ,‬נטרול ה‪ trypsin-‬והסרכוז כפי שתואר‪ .‬הושאר משקע של כחצי מליון תאים למבחנה‬
‫מורחף ב‪ .PBS 50 µl-‬כל העבודה עם נוגדנים המצומדים לצבע פלורסנטי נעשתה בחושך‪.‬‬
‫תמיסות‪- :‬תמיסת שטיפה‪0.1 %sodium azide, 5% FCS in PBS :‬‬
‫תמיסת קיבוע‪10 % Goat serum (GS), 4% paraformaldehyde in PBS :‬‬‫‪-‬תמיסת חירור‪0.1% TritonX-100 in PBS:‬‬
‫צביעה לאנטיגן חוץ תאי‬
‫הוסף נוגדן ראשוני חוץ תאי המצומד לצבע פלורסנטי ביחס המופיע בטבלה )פרק חומרים ‪ .(1.3‬התאים עברו‬
‫הדגרה ובטלטול עדין עם נוגדנים למשך ‪ 45‬דקות בטמפרטורת החדר )או בקרח תלוי בנוגדן(‪ .‬לחילופין‪ ,‬לפני‬
‫הוספת הנוגדן בוצע קיבוע של התאים באמצעות ‪ 100µl‬של ‪ ,reagent A‬מתוך ‪ , Intarstain Kit‬למיליון תאים‬
‫למשך ‪ 30‬דקות בטמפרטורת החדר ובטלטול עדין‪ .‬לאחר מכן התאים נשטפו פעמיים ע"י הוספת ‪ 0.5‬מ"ל‬
‫‪79‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫תמיסת שטיפה למבחנה ‪ ,‬סורכזו והושאר משקע של ‪ .50 µl‬התאים הורחפו ב‪ 0.5 -‬מ"ל ‪ ,PBS‬סוננו ובוצעה‬
‫בדיקה ב ‪.FACS -‬‬
‫צביעה לאנטיגן תוך תאי‬
‫לאחר קצירת התאים והרחפתם ביחס של חצי מליון תאים למבחנה ב‪ ,50µl -‬התאים קובעו ע"י הוספת ‪ 0.5‬מ"ל‬
‫תמיסת קיבוע למבחנה למשך ‪ 5‬דקות בטמפרטורת החדר‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬התאים סורכזו )השארת הפלט ‪.(50µl‬‬
‫חירור מעטפת התא בוצע באמצעות הוספת ‪ 0.5‬מ"ל תמיסת חירור למבחנות והדגרה ל‪ 5-‬דקות בקרח‪ .‬השטיפה‬
‫מתמיסת החרור נעשתה בהוספת ‪ 5‬מ"ל ‪ PBS‬למבחנה וסרכוז )השארת הפלט ‪ .(50µl‬התאים הודגרו עם נוגדן‬
‫ראשוני למשך ‪ 45‬דקות בקרח‪ ,‬בטלטול עדין‪ .‬התאים נשטפו פעמיים בהוספת ‪ 0.5‬מ"ל תמיסת שטיפה וסרכוז‪.‬‬
‫לפני הוספת הנוגדן השניוני בוצע חירור נוסף זהה לחרור הקודם‪ .‬התאים נשטפו עם ‪ 0.5‬מ"ל ‪ PBS‬וסורכזו‬
‫)השארת הפלט ‪ .(50µl‬הוספת נוגדן שניוני )ביחס המופיע בטבלה( לחצי שעה בטמפרטורת החדר בטלטול עדין‪,‬‬
‫לאחר מכן בוצעו ‪ 2‬שטיפות נוספות‪ .‬לחילופין‪ ,‬הקבוע‪ ,‬החרור וההדגרה עם הנוגדנים בוצעו באמצעות ‪IntraStain‬‬
‫‪ Kit‬לפי הוראות היצרן‪ .‬תאים הורחפו ב‪ 0.5 -‬מ"ל ‪ PBS‬ונקראו ב‪.FACS-‬‬
‫תנאי מכשיר ה‪:FACS -‬‬
‫אקסיטציה באמצעות לייזר המספק אור קוהרנטי של ‪ 15mW‬באורך גל ‪ .488nm‬הפלורוסנציה שנפלטת מכל‬
‫פלורוכרום נמדדת על ידי ערוץ פלורוסנציה ייחודי‪ ,‬לפי הצבע המתאים ‪ FL1‬עבור צבע ירוק‪ FL2 ,‬עבור צבע כתום‬
‫אדום ו‪ FL3-‬עבור צבע אדום בקנה מידה לוגריתמית‪ .‬כל בדיקה הייתה בדופליקאט או טריפליקאט‪ .‬בכל בדיקת‬
‫‪ FACS‬נדגמו ‪ 10000‬אירועים‪ .‬מהירות זרימת התמיסה עם התאים הייתה מהירות גבוהה )לעתים בינונית(‪.‬‬
‫‪ 2.2.2‬מבחן ‪ microtiter plate‬לקליטת ‪Hoechst 33342‬‬
‫כמתואר בפרק המבוא בסעיף ‪ ,8.3.5.1‬תאי גזע מבוגר כדוגמת ‪ side population cells‬מכילים כמות גדולה של‬
‫תעלות )‪ multidrug resistance protein (mdr‬בדופן הגרעין ובעקבות כך רמת הצביעה ב‪) Hoechst 33342-‬צבע‬
‫פלורוסנטי כחול הנקשר ל‪ DNA-‬של תאים חיים( נמוכה‪ ,‬מכיוון שתעלות ‪ mdr‬מוציאות את הצבע מחוץ לגרעין‪.‬‬
‫‪ 200-10000‬תאים מזנכימלים ממח עצם אנושי נזרעו בכל בארית של פלטת ‪ .96‬לאחר ‪ 72‬שעות‪ ,‬הוחלף מדיום‬
‫הגידול למדיום זהה עם ‪ 2%‬סרום‪ ,‬והתאים הודגרו עם ‪ 5µg/ml Hoechst 33342 ± 50µM verapamil‬למשך ‪90‬‬
‫דקות ב‪ 4) 37°C-‬באריות לכל ניסוי(‪ .‬הוספת ‪ verapamil‬נעשתה על מנת לחסום את תעלות ‪ mdr‬ובעקבות כך‬
‫לבחון את עוצמת הצביעה )‪ .(Goodell et al., 1996, 1997‬לאחר ‪ 90‬דקות הדגרה עם הצבע‪ ,‬נעשתה שטיפה עם‬
‫‪ PBS‬ובאופן מיידי נמדדו ערכי הפלורסנציה בפלואורמטר )‪ .(FLUOstar, BMG‬הדגימה עורערה באורך גל של‬
‫‪ 355nm‬וקליטת הקרינה פלורסנטית הנפלטת באורך גל של ‪ .460nm‬כביקורת‪ ,‬השתמשנו בתאים ‪SH-SY5Y‬‬
‫‪.neuroblastoma‬‬
‫‪ 2.3‬מדיום התמיינות של תאים מזנכימלים לתאים דמויי תאי עצב דופאמינרגים‬
‫השראת התמיינותם של תאי גזע ממח העצם לתאים דמויי‪-‬תאי עצם דופאמינרגים בוצעה בתאים שגדלו‬
‫בתרביות לפחות במשך חודש ולאחר לפחות ‪ 2‬פיצולים‪ .‬לאחר כיסוי של כ‪ 80%-‬משטח צלחת התרבית ע"י‬
‫התאים‪ ,‬מדיום הגידול נשפך‪ ,‬נעשו ‪ 2‬שטיפות ב‪ PBS -‬והתאים הודגרו למשך ‪ 24-48‬שעות ב"מדיום התמיינות‬
‫שלב ‪ ."I‬לאחר מכן‪ ,‬התרבית נשטפה פעמיים ב‪ PBS -‬והתאים הודגרו למשך ‪ 12-96‬שעות נוספות ב"מדיום‬
‫‪80‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
.‫ ימים‬28 ‫ על מנת להאריך את משך ההתמיינות הוסף "מדיום התמיינות ארוך טווח" למשך‬."II ‫התמיינות שלב‬
."II ‫ ל"מדיום התמיינות שלב‬GDNF ‫ הוסף‬,‫לטובת הפרשת דופאמין‬
N-2 Solution supplement (×100) (Bottenstein, 1985)
Material
Concentration
Water- Cell Culture Grade
Bovine insulin
500 µg/ml
Holo human Transferin or Apo human Transferin
10 mg/ml
Progesteron
0.63 µg/ml
Putrescine
1.611 mg/ml
Selenite
0.52 µg/ml
.‫( בחושך‬-20°C) ‫ נשמרה בהקפאה‬.0.22µm ‫התמיסה הוכנה בתנאים מעוקרים וסוננה בפילטר של‬
Neuron-like cells differentiation medium
Material
Stage 1:
Differentiation
medium I
(24-48 hr)
Stage 2:
Differentiation
medium II
(12-96 hr)
Stage 2:
Differentiation
medium II for
dopamine release
(12-96 hr)
Long stage
differentiation
medium
(28 days)
Concentration
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM; without HEPES)
L-glutamine
2mM
Penicillin (10,000U/ml) / streptomycin (10mg/ml) / nystatin
1%
(1,250U/ml) [SPN]
N-2 supplements( × 100)
1%
Fetal calf serum (FCS) / fetal bovine serum (FBS)
10 %
Docosahexaenoic acid (DHA)
10-40 µM
Human epidermal growth factor (EGF)
10ng/ml
Human basic fibroblast growth factor (bFGF)
10ng/ml
DMEM
L-Glutamine
2mM
SPN
1%
N-2 supplement ( × 100)
1%
dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP)
1 mM
isobutylmethlxanthine (IBMX)
0.5 mM
all-trans-retinoic acid (RA)
1-10 µM
butylated hydroxyanisole (BHA)
200 µM
Ascorbic acid
100-200µM
DMEM
L-Glutamine
2mM
SPN
1%
N-2 supplement ( × 100)
1%
dibutyryl cyclic AMP (dbcAMP)
1 mM
isobutylmethlxanthine (IBMX)
0.5 mM
all-trans-retinoic acid (RA)
1-10 µM
butylated hydroxyanisole (BHA)
200 µM
Ascorbic acid
100-200µM
Human glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF)
10 ng/ml
DMEM
L-glutamine
2 mM
SPN
1%
N-2 supplement (X100)
1%
dbcAMP
1 mM
IBMX
0.5 mM
bFGF
10 ng/ml
GDNF
10 ng/ml
10 ng/ml
human β-nerve growth factor (βNGF);
‫ לפני הוספת פקטורי גידול‬0.22µm ‫המדיום הוכן בתנאים מעוקרים וסונן בפילטר של‬
81
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.4‬מבחני חיות תאים‬
‫‪ 2.4.1‬מבחן ‪ Alamar blue‬עבור ‪ PC12‬ו‪SH-SY5Y-‬‬
‫מבחן זה מתבסס על השינוי הפלורסנטי של חומר הצבע בתגובה למצב החימצון‪-‬חיזור של התא‪ .‬ככל שהתא חי‬
‫וגדל כך סביבתו מחוזרת יותר והדבר גורם לצבע להשתנות מצורתו המחומצנת שאינה פלורסנטית )כחול( אל‬
‫צורתו המחוזרת הפלורסנטית )אדום(‪.‬‬
‫יום לפני ניסוי נזרענו ‪ 5X104/100µl‬תאים לבאר בפלטת ‪ .96‬לפני הניסוי‪ ,‬הוחלף מדיום הגידול במדיום המכיל‬
‫‪ 2%‬סרום וכן הוספנו את הטיפולים המתאימים‪ .‬לאחר הטיפול‪ ,‬הוסף אל המדיום ‪ 10% Alamar blue‬מנפח‬
‫מדיום הניסוי והדגימות הודגרו למשך שלוש שעות ב‪ .37ºC-‬חיות התאים חושבה בהתאמה לעוצמת הפלורסנציה‬
‫הנפלטת באורך גל של ‪ 590nm‬לאחר עירור באורך גל של ‪ 544nm‬במכשיר פלואורומטר )‪.(Floustar BMG‬‬
‫‪ 2.4.2‬מבחן ‪Hoechst 33342 / propidium iodide‬‬
‫תאי גזע מזנכימלים ממח העצם של עכברי זן הבר ועכברים טרנסגנים )‪ bcl2‬הומני( )‪ (~2 x 105 cells/ml‬נזרעו‬
‫בבאריות שטופלו ב‪ poly-L-lysine-‬בפלטת ‪ .96‬התאים טופלו ב‪100 µl -‬של מדיום גידול למשך לילה ולאחר מכן‬
‫בוצעה השראת התמיינות למשך ‪ 24‬שעות כמתואר‪ .‬לאחר ‪ 6‬שעות‪ ,‬הוסף דופמאין בריכוזים הולכים ועולים ‪10-‬‬
‫‪) 500 µM‬שימש בניסוי כרעלן(‪ .‬כל טיפול חזר על עצמו ‪ 4‬פעמים‪ .‬על מנת לבדוק את שרידות התאים לריכוזים‬
‫ההולכים ועלים של דופאמין‪ ,‬התאים הודגרו במשך ‪ 10‬דקות עם ‪10 µg/ml Hoechst 33342 & 10 µg/ml‬‬
‫‪ propidium iodide (PI) diluted in PBS‬בטמפרטורת החדר‪ .‬החומרים הנ"ל נקשרים ל‪ DNA-‬ולכן "צובעים"‬
‫גרעינים של תאים‪ .‬הצבע ‪ Hoechst 33342‬חודר מעטפות של תאים חיים ולכן צובע את גרעין התא בצביעה‬
‫כחולה חלקה‪ .‬מאידך ‪ PI‬חודר רק מעטפות של תאים מתים ולכן הוא צובע את גרעיני התאים המתים‪ ,‬באם‬
‫המוות הנו נקרוטי אזי ישנה צביעה אדומה רציפה של הגרעין‪ ,‬באם מוות אפופטוטי ניתן להבחין בצביעה אדומה‬
‫מקוטעת ודחוסה של הגרעין )‪ .(Lee & Emily Shacter, 1997‬נלקחו תמונות באופן אקראי מ‪ 4-‬אזורים שונים‬
‫לכל באר באמצעות מיקרוסקופ פלורסנטי‪ .‬הצביעה הכחולה והאדומה נספרה באמצעות תוכנת המחשב ‪Image-‬‬
‫‪.Pro® Plus‬‬
‫‪ 2.5‬מבחני חלוקת תאים‬
‫‪ 2.5.1‬מבחן ‪Thymidine incorporation‬‬
‫‪ 1000‬תאי גזע מזנכימליים אנושיים בנפח של ‪ 100µl‬מדיום גידול נזרעו לבאר בפלטות ‪ 96‬למשך לילה‪ .‬למחרת‬
‫מדיום הגידול הוחלף למדיום התמיינות וזאת על מנת לבדוק את מידת שגשוג התאים במהלך ההתמיינות‪ .‬ביום‬
‫הבדיקה התאים הודגרו עם ‪ 1µCi/ml‬של תימידין מסומן רדיואקטיבית )‪ (3H‬ב‪ 37°C-‬למשך ‪ 12-96‬שעות‪.‬‬
‫התאים נקצרו בעזרת ‪ trypsin-EDTA‬והאינקורפורציה הרדיואקטיבית נקבעה בעזרת מכשיר ‪Filtermant 196‬‬
‫‪ Packard‬ומונה סנטילציה נוזלית )‪.(Direct beta counter‬‬
‫‪comment‬‬
‫‪Catalog No.‬‬
‫‪Manufacturer‬‬
‫‪Radioactive‬‬
‫‪32,221-0‬‬
‫‪1850 9679‬‬
‫‪Sigma‬‬
‫‪Whatman‬‬
‫‪Material‬‬
‫‪3‬‬
‫)‪Thymidine-(Methyl- H) – ( 5mCi‬‬
‫‪Glass microfibre filters (156mmX95mm) GF/AVA‬‬
‫‪82‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.5.2‬מבחן מחזור התא )‪(cell cycle‬‬
‫בשיטה זו מודדים את תכולת ה‪ DNA-‬בתאים ע"י הוספת )‪ propidium iodide (PI‬לגרעיני התאים וע"י כך‬
‫מאפיינים את השלב שבו נמצא התא מתוך שלבי מחזור התא )‪ PI .(cell cycle‬אינו חודר ממברנות של תא חי‪,‬‬
‫ולכן מוסיפים אותו לגרעינים שהופקו מהתאים‪ ,‬הוא נקשר ל‪ DNA-‬ומראה באופן איכותי את כמות הדנ"א שיש‬
‫בגרעינים‪ .‬שלב האינטרפאזה )‪ (interphase‬הנו השלב המטבולי של התא ובמשך תקופה קצרה של שלב זה‬
‫מתבצעת סינטזת ה‪ .DNA-‬אפשר לחלק את שלב האינטרפאזה לשלושה שלבי משנה עוקבים‪– G1 phase :‬‬
‫ממועד היווצרות התא )לאחר החלוקה( ועד סינתזת ה‪ – S phase .DNA-‬תקופת סינתזת ה‪– G2 phase .DNA-‬‬
‫לאחר שכפול ה‪ DNA-‬ועד חלוקת הגרעין והתא‪ -M phase .‬לאחר שלב האינרפאזה יש את חלוקת הגרעין‪.‬‬
‫כלומר‪ ,‬מחזור התא כולל שלבים של תא 'רגיל' שבו ‪ 23‬זוגות כרומוזומים )שלב ‪ ,(G1‬התחלת החלוקה שבה‬
‫המספר גדל‪ ,‬וסוף החלוקה שבה ישנם ‪ 46‬זוגות )שלב ‪ .(M,G2‬בהיסטוגרמת מחזור התא באמצעות ‪ FACS‬ניתן‬
‫לראות את השלבים השונים במחזור התא בעקבות צביעת ‪ PI‬של ה‪.DNA-‬‬
‫תמיסות‪ :‬תמיסות וריכוזים לפי ‪Vindelov et al.,1983‬‬
‫‪Citrate buffer pH=7.6: 250mM sucrose, 40mM trisodium citrate.2H2O, 5% DMSO in H2O.‬‬
‫‪1.5mM‬‬
‫‪NP-40(W/V),‬‬
‫‪0.1%‬‬
‫‪citrate,‬‬
‫‪trisodium‬‬
‫‪3.4mM‬‬
‫‪pH=7.6:‬‬
‫‪solution‬‬
‫‪Stock‬‬
‫‪spermintetrahydrochloride, 0.5mM tris-hydroxymethyl-aminomethane in H2O.‬‬
‫‪Solution A: Trypsin 156mg/500ml Stock solution (pH=7.6).‬‬
‫‪Solution B: 250mg Trypsin inhibitor, 50mg ribonuclease in 500ml Stock solution.‬‬
‫‪Solution C: 208mg propidium iodide, 580mg spermintetrahydrochloride in 500ml stock solution‬‬
‫‪(pH=7.6).‬‬
‫מבחן "מחזור התא" בוצע בתאי גזע מזנכימלים מעכבר טרנסגני "ירוק" )‪ (EGFP‬שעברו התמיינות למשך ‪24‬‬
‫שעות וכביקורת נלקחו תאים שלא עברו התמיינות‪ .‬לאחר קצירת והשקעת התאים‪ ,‬הפלט הורחף ב‪ 40µl-‬של‬
‫‪ .citrate buffer‬לאחר מכן‪ ,‬הוספנו ‪ 450µl‬של תמיסה ‪ A‬והדגרנו למשך ‪ 10‬דקות בטמפרטורת החדר‪ .‬לאחר‬
‫ההדגרה‪ ,‬הוספנו ‪ 375µl‬מתמיסה ‪ B‬והדגרנו למשך ‪ 10‬דקות נוספת בטמפרטורת החדר‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬הוספו ‪375µl‬‬
‫מתמיסה ‪ C‬ובוצעה קריאה ב‪) FACS-‬שמירה בקרח ובחושך(‪ .‬הפרמטרים בקריאה ב‪ FACS-‬מכוונים כך‬
‫שהמסנן יהיה בין ‪ 562-588nm‬והניתוח נעשה ע"י ערוץ ‪ FL2‬לינארי‪ .‬ההרצה במהירות איטית )‪ 12‬מיקרוליטר‬
‫לדקה(‪ ,‬מכיוון שנפח הגרעינים קטן ויש חשש לזרימה טורבולנטית‪ .‬לתאים הייתה פלורוסנציה ירוקה מובנית‬
‫ופלורוסנציה אדומה כתוצאה מהצביעה שנעשית במהלך המדידה‪ .‬קיום חפיפה בין אורכי הגל של הפלורוסנציה‬
‫נבדק ותוקן אותה ע"י קומפנסציה מתאימה של הגלאים‪ .‬שאר הפרמטרים מכוונים כך שהשיא הראשון מתקבל‬
‫בסביבות ערוץ ‪.300‬‬
‫‪83‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.6‬אנליזה של ביטוי חלבונים‬
‫‪ 2.6.1‬אימונוציטוכימיה‬
‫עבור ניסויים אימונוציטוכימיים התאים גודלו ב‪ slide chambers-‬או פלטות ‪ 24/48/96‬שטופלו ב‪0.1 mg/ml -‬‬
‫‪ Poly-L-lysine‬או לחילופין ב‪ .10µg/ml human fibronectin-‬לאחר טיפולים רצויים התאים קובעו עם‬
‫‪ 4% paraformaldehyde‬למשך ‪ 30‬דקות ב‪ 4°C-‬ו‪ 20 -‬דקות בטמפרטורת החדר )או לחילופין ‪ 40‬דקות‬
‫בטמפרטורת החדר(‪ 2 ,‬שטיפות ב‪ .PBS-‬חירור מעטפת התא –‪ 0.1% TritonX-100, 10% GS in PBS‬למשך ‪10‬‬
‫דקות ב‪ 4°C-‬ו‪ 10 -‬דקות נוספות בטמפרטורת החדר )או לחלופין ‪30‬דקות בטמפרטורת החדר(‪ 2 ,‬שטיפות ב‪-‬‬
‫‪ .PBS‬הדגרת התאים עם נוגדן ראשוני בתוך ‪ 10%GS / PBS‬במשך ‪ 24‬שעות ב‪) 4C° -‬עבור ‪ TH‬למשך ‪ 48‬שעות(‬
‫על פי המיהולים המפורטים בסעיף ‪) 1.3‬רשימת נוגדנים ראשוניים(‪ 2 .‬שטיפות ב‪ .PBS-‬אינקובציה עם נוגדן שניוני‬
‫בתוך ‪ 10%GS / PBS‬במשך שעה בטמפרטורת החדר על פי המיהולים המפורטים בסעיף ‪) 1.3‬רשימת נוגדנים‬
‫שניוניים(‪ 2 .‬שטיפות ב‪ PBS-‬וצפייה במיקרוסקופ‪.‬‬
‫הנוגדנים השניוניים מצומדים ל‪ biotin-‬או לצבע פלורסנטי‪ .‬כאשר הנוגדנים מצומדים ל‪ biotin-‬נעשה שימוש‬
‫בערכה ‪ Vectastain ABC KIT‬עבור יצרית קומפלקס ‪ ,avidin-biotin‬פיתוח הצבע נעשה ע"י ‪Liquid DAB‬‬
‫‪ Substrate Kit‬על פי פרוטוקול היצרן‪ .‬נעשה שימוש גם בנוגדנים שניונים המצומדים לצבע פלורסנטי כדוגמת‬
‫)‪ CyTM2 (green), CyTM3 (red), FITC (green‬הפולטים אור באורכי שונים‪ .‬במקרים הנ"ל הסלייטים נשמרו‬
‫בחושך‪.‬‬
‫צביעת גרעיני התאים התבצעה ע"י )‪.1mg/ml 4,6- Diamidino-2-Penyl Indole Dihydrochloide (DAPI‬‬
‫התאים הודגרו עם ‪ DAPI‬במשך ‪ 5-7‬דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטיפה פעמיים עם ‪.PBS‬‬
‫‪Western blot 2.6.2‬‬
‫‪ 2.6.2.1‬הפקת חלבון ממוח עכבר‬
‫‪Homogenization buffer: cold 100 mM PBS (pH 7.0) containing 10 µM phenylmethylsulfonyl‬‬
‫‪fluoride (PMSF), 1% Triton-X, CompleteTM- protease inhibitor cocktail tablets.‬‬
‫הקרבת החיות נעשה בשיטת טרנסלוקציה מהירה‪ .‬מוחות הופקו מעכברים ‪ C57/bl‬בוגרים או מעכברים‬
‫הטרוזיגוטים טרנסגנים הנושאים את הגן האנושי ‪ bcl2‬תחת הפרומוטר )‪ (promoter‬של ‪ .NSE‬מוח העכבר הועבר‬
‫מיידית לבופר הומוגנציה בקרח )‪ 5X‬בנפח(‪ .‬ריסוק הרקמה נעשה באמצעות הומוגניזטור טפלון בתוך מבחנת‬
‫זכוכית בצורה ידנית בקרח‪ .‬סירכוז ב‪ 1200 X g -‬למשך ‪ 10‬דקות ב‪ ,40C-‬נוזל עליון נאסף ונשמר ב‪.-700C-‬‬
‫‪ 2.6.2.2‬הפקת חלבון מתאים‬
‫‪Lysis buffer: 105mM Tris base, 5mM EDTA, 140mM NaCl, 10mM sodium fluoride (NaF), 0.5%‬‬
‫‪NP-40, 1µM PMSF‬‬
‫קצירת התאים נעשתה כמתואר בפרק ‪ ,2.1.3‬על מנת להחיש את קצירת התאים נעשה שימוש ב‪.cells scraper-‬‬
‫לאחר שטיפה נוספת ב‪ ,PBS-‬כל מיליון תאים משקע במבחנה הורחפו ב‪ 50µl lysis buffer-‬למשך ‪ 30‬דקות‬
‫בקרח‪ ,‬כל ‪ 5‬דקות נעשה וורטקס במשך ‪ 10‬שניות‪ .‬ליזאת התאים סורכז במהירות ‪ 13000 x g‬במשך ‪ 20‬דקות ב‪-‬‬
‫‪ .4°C‬נוזל עליון נאסף ונשמר ב‪.-700C-‬‬
‫‪84‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.6.2.3‬קביעת ריכוז חלבון‬
‫קביעת ריכוז חלבון בוצעה בעזרת ערכת ‪ ,(Pierce) BCA protein assay kit‬השיטה מבוססת על חיזור יוני‬
‫נחושת על ידי חלבונים בסביבה בסיסית )ראקצית ‪ (Biuret‬וזיהוי קטיון הנחושת המחוזר על ידי התפתחותו של‬
‫צבע סגול כתוצאה מקישור שתי מולקולות )‪ bicinchoninic acid (BCA‬אל קטיון הנחושת המחוזר‪.‬‬
‫לצורך קביעת ריכוז החלבון הוכנה עקומת כיול )‪ (0, 0.25, 1.25, 2.5, 5, 7.5, 10, 15 µg BSA /10µl‬בדופליקט‬
‫בפלטת ‪ 96‬בארות‪ .‬לצורך הבדיקה נלקחו ‪10µl‬מכל דגימת חלבון בדופליקט‪ .‬לכל בארית הוכנסו ‪ 200µl‬של ראגנט‬
‫‪ A‬מהול בריאגנט ‪ B‬ביחס ‪ 1:50‬בהתאמה‪ .‬לאחר הדגרה של ‪ 30‬דקות ב‪ ,370C-‬חושב ריכוז החלבון בהתייחס‬
‫לעוצמת הבליעה באורך גל של ‪ 550nm‬ובהתייחס לעקומת הכיול‪.‬‬
‫‪ 2.6.2.4‬הספג אימונולוגי )‪(Western blot‬‬
‫תמיסות וריכוזים לפי פרוטוקולים ב‪.Sambrook et al., 1989 -‬‬
‫‪Loading buffer: 62.5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% Glycerol, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 5%‬‬
‫‪2-β-mercaptoethanol, 0.0025% bromophenol blue.‬‬
‫‪TBS-T: Tris-buffered saline (10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl) with 0.1% Tween 20.‬‬
‫)‪Blocking solution: 5% nonfat milk in Tris-buffered saline (10 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl‬‬
‫‪with 0.1% Tween 20 (TBS-T).‬‬
‫כמויות )‪ (40-80 µg‬חלבון שוות עברו דנטורציה ב‪) loading buffer-‬מדולל ‪ (1:5‬באמצעות הרתחה במשך ‪ 5‬דקות‪.‬‬
‫החלבון הוטען על ג'ל הרצת חלבונים‪sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-‬‬
‫)‪ PAGE‬בריכוז אקריל‪-‬אמיד של ‪ (NeuN) 8% ,(NSE, nestin) 7.5%‬או ‪ .(bcl-2, TH, TPH) 12.5%‬הדגימות‬
‫הורצו בשדה חשמלי במתקן מיני‪-‬ג'ל )‪ (Bio-Rad‬בקירור‪ ,‬לאחר מכן החלבונים הועברו מג'ל אקריל אמיד‬
‫לממברנת ‪ ,PVDF‬שעברה שיפעול מקדים על ידי השרייה במתנול‪ ,‬בעזרת שדה חשמלי )‪.(2-3h/200-300mA‬‬
‫אתרים פנויים בממברנה נחסמו באמצעות ‪ blocking solution‬במשך שעה בטמפרטורת החדר או במשך לילה ב‪-‬‬
‫‪ 4°C‬בטלטול‪ .‬הממברנה הושרתה עם נוגדן ראשוני )מיהול ראה פרק ‪ (1.3‬ב‪ TBS-T -‬עם ‪ 0.375%‬אבקת חלב‬
‫למשך שעה בטמפרטורת החדר או ב‪ 4°C-‬למשך לילה בטלטול‪ .‬הממברנה נשטפה ב‪ TBS-T0.05%-‬למשך ‪ 10‬דקות‬
‫שלוש פעמים והושרתה בנוגדן שניוני )‪ (HRP‬במיהול ‪ (anti-mouse) 1:20000‬או ‪ (anti-rabbit) 1:25000‬בבופר‬
‫חסימה למשך ‪ 30-45‬דקות בטמפרטורת החדר בטלטול‪ .‬שטיפות כנ"ל‪ .‬החלבונים שהגיבו לנוגדן זוהו באמצעות‬
‫צביעה כימואילומינסנטית בעזרת ‪ SuperSignal kit‬וחשיפה לפילם ופיתוחו למשך מספר דקות‪ .‬צילום הבנדים‬
‫למדיה דיגיטלית בוצע באמצעות התוכנה ‪ VersaDoc® imaging system‬כימות הבנדים התבצעה בתוכנה‬
‫®‪.Quantity One‬‬
‫‪Flow-cytometry 2.6.3‬‬
‫אנליזה של ביטוי חלבוניים תוך תאיים בוצעה גם באמצעות ‪ .FACS‬לשיטת הביצוע ראה פרק ‪.2.2‬‬
‫‪85‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.7‬מדידת רמת הביטוי הגנטי‬
‫‪ 2.7.1‬מיצוי ‪Total cellular RNA‬‬
‫‪ RNA‬בודד מתאים בשיטת ‪Chomczynski ) acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction‬‬
‫‪ .(& Sacchi, 1987‬כל תהליך הפקת ‪ RNA‬בוצע בקרח‪ .‬כל כלי הזכוכית עברו טיפול באוטוקלאב‪ ,‬כל כלי‬
‫הפלסטיק היו מאושרים לעבודה עם ‪ RNA‬ללא חשש להמצאות אנזימים המפרקים ‪.RNA‬‬
‫תמיסות‪:‬‬
‫‪1) Sodium citrate 0.75M pH 7 (treated in autoclave).‬‬
‫‪2) 10% Sarcosyl (N-Lauroylsarcosine) solution (gentle mixing at 65°C for 1 hr).‬‬
‫‪3) Solution D: 4M guanidinium thiocyanate, 25 mM Sodium citrate pH 7, 0.5% Sarcosyl, 0.1‬‬
‫‪M β-mercaptoethanol in ddH2O-DEPC up to 210ml (storage at –200C).‬‬
‫‪4) Sodium acetate 2M, pH 4: 16.42 gr sodium acetate, 40 ml ddH2O-DEPC, 35 ml acetic acid,‬‬
‫‪pH 4 with acetic acid, to 100ml with ddH2O-DEPC (storage at –200C).‬‬
‫הפקה ‪ total RNA‬נעשתה מתאי מח עצם‪ ,‬ממקור אדם‪ ,‬שעברו טיפולים שונים בצלחות בקוטר ‪ .100mm‬ביום‬
‫הניסוי‪ ,‬מדיום התאים נשטף והוסף ‪ 1.5ml‬של ‪ .solution D‬התאים גורדו בעזרת מגב פלסטיק סטרילי והועברו‬
‫למבחנות אפנדורף בנפח של ‪) 2ml‬לאחר ‪ 5‬פיפטציות(‪ .‬הוסף ‪ 80µl‬של )‪ ,sodium acetate 2M (pH 4‬ערבוב‬
‫בוורטקס‪ .‬במטרה להמיס את החלבונים )דנטורציה( הוסף ‪ 800µl‬של )‪ ,phenol (water saturated‬טלטול קצר‬
‫בחוזקה‪ .‬הוסף ‪ 160µl‬של )‪ chloroform-isoamyl alcohol mixture (49:1‬טרי‪ ,‬טלטול בחוזקה למשך דקה‬
‫והדגרה בקרח למשך ‪ 15‬דקות‪ .‬לאחר ההדגרה‪ ,‬סרכוז ב‪ 10000 x g -‬במשך ‪ 20‬דקות ב‪ .4°C-‬הפאזה המימית‬
‫)העליונה( הועברה למבחנת אפנדורף חדשה והוסף נפח שווה של ‪ isopropanol‬קר‪ ,‬ערבוב והדגרה ב‪-20°C -‬‬
‫למשך לילה )ניתן למשך שעה‪ ,‬בעדיפות נמוכה(‪ .‬למחרת סרכוז ב‪ 10000 x g-‬במשך ‪ 20‬דקות ב‪ ,4°C-‬הרחקת‬
‫הנוזל העליון ושטיפת המשקע ב‪ .500µl 75% Ethanol -‬המתנה ‪ 10‬דקות בקרח וסרכוז ב‪ 10000 x g-‬במשך ‪20‬‬
‫דקות נוספות ב‪ .4°C-‬לאחר מכן‪ ,‬סילוק הנוזל העליון ויבוש המבחנה באוויר‪ .‬כאשר לא נשארו שאריות אתנול‬
‫במבחנה‪ ,‬המשקע הורחף ב‪ 25µl -‬של ‪ .ddH2O-DEPC‬ריכוז ‪ RNA‬בדגימה נקבע בספקטופוטומטר‪.‬‬
‫‪ 2.7.2‬ניקוי ‪ RNA‬בעזרת ‪DNase I‬‬
‫הפרוטוקול מבוסס על )‪.Protocol # PT3231-1 (Clontech‬‬
‫הוכנה תערובת שהכילה את המרכיבים המופעים בטבלה‪.‬‬
‫לאחר הדגרה למשך ‪ 30‬דקות ב‪ 37°C -‬התגובה האנזימתית‬
‫הופסקה ע"י הוספת תערובת ‪ .termination mix‬הוסף פנול‬
‫‪Concentration‬‬
‫‪Material‬‬
‫‪Total-RNA‬‬
‫‪0.5 mg/ml‬‬
‫‪10 x DNase I buffer 1:10‬‬
‫‪DNase I‬‬
‫‪0.1 Units/µl‬‬
‫‪ddH2O-DEPC‬‬
‫רווי במים כנפח ה‪ RNA -‬וכלורופורם בנפח של ‪ 60%‬מנפח הפנול‪ .‬לאחר ערבוב בוורטקס‪ ,‬סרכוז התערובת‬
‫במהירות של ‪ 14000 rpm‬למשך ‪ 10‬דקות בטמפרטורה של ‪) 4°C‬להפרדת פאזות(‪ .‬הפאזה המימית )העליונה(‬
‫הועברה למבחנה אחרת והוסף כלורופורם בנפח של ‪ 110%‬מנפח ‪ .RNA‬התערבות עורבבה בוורטוקס וסורכזה‬
‫במהירות ‪ 14000 rpm‬למשך ‪ 10‬דקות בטמפרטורה של ‪ .4°C‬הפאזה המימית הועברה למבחנת אפנדורף של ‪,2ml‬‬
‫והוסף עשירית הנפח סודיום אצטט )‪ (2M‬ו‪ 2.5 -‬נפחים של אתנול ‪ 95%‬וכן ‪ 20µg‬של גליקוגן )במידה ויש פחות מ‪-‬‬
‫‪ .(total RNA 20µg‬התמיסה עורבלה ועברה אינקובציה על קרח במשך ‪ 10‬דקות‪ .‬סרכוז התערבות במהירות של‬
‫‪86‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
,‫ סרכוז חוזר באותם תנאים‬,‫ אתנול‬80% -‫ המשקע נשטף ב‬.4°C ‫ דקות בטמפרטורה של‬15 ‫ למשך‬14000 rpm
.-70°C -‫ בטמפ' ב‬RNA ‫ אחסון ושמירת‬.DEPC -‫המשקע יובש באוויר והומס במים מטופלים ב‬
Material
Manufacturer
Catalog No.
10 x DNase I Buffer
DNase I (1u/µl)
10 x Termination Mix
Glycogen for molecular biology (20 mg/ml)
Clontech
Clontech
Clontech
Roche
S1635
S1636
S2078
901393
:(Reverse transcriptase, RT) - cDNA -‫ ל‬mRNA ‫ העתקת‬2.7.3
.‫ לפי פרוטוקול היצרן‬EZ-First Strand cDNA Synthesis Kit ‫ בוצעה באמצעות‬cDNA-‫ ל‬RNA ‫העתקת‬
RNA ‫ של דוגמאות‬1 µg :‫ כמתואר‬reverse transcriptase supper script II ‫ התהליך בוצע ע"י אנזים‬,‫לחילופין‬
‫ של פריימר‬2µM ‫ בתערובת שהכילה‬RT-superscript II ‫ יחידות של האנזים‬100 ‫ ע"י הוספת‬cDNA -‫הועתקו ל‬
‫ ההדגרה בוצעה‬.(RNAguard) RNase ‫ ומעכב‬dNTPs ‫ של‬20µM , 10mM DTT ,‫ בופר‬,oligo (dT)15 ‫אקראי או‬
:‫ע"פ התוכנית הבאה‬
Oligo (dT)15
Stage I: only RNA and primers
Stage II: all the mixture
Random primers (hexamers)
65°C, 5 min
70°C, 10 min
Incubation in ice for several min
42°C, 120 min
25°C, 10 min
42°C, 120 min
95°C, 10 min
70°C, 15 min
95°C, 5 min
Material
Manufacturer Catalog
No.
Final
concentration
Oligo (dT)15
Random primers (hexamer)
First Strand Buffer × 5
0.1M DDT
2.5mM dNTP
RNAguard (RNase inhibitor)
SuperScript™ II Reverse Transcriptase
ddH2O DEPC-treated
Roche
Invitrogen
Invitrogen
Invitrogen
TaKaRa
Amersham
Invitrogen
Biological
Industries
2µΜ
2µΜ
X1
10 mM
20µM
1 unit/µl
5 units/µl
To 20-40 µl
92577022
48190-011
Y00146
Y00147
R001A
27-0815-01
18064-014
01-852-1
Northern blot - mRNA ‫ אנליזה כמותית של‬2.7.4
-‫ תמיסות הוכנו ב‬.(Sambrook, Fritsch and Maniatis, 1989 -‫)תמיסות וריכוזים לפי פרוטוקולים המופיעים ב‬
.‫ וחלקן אף ועברו סטריליזציה באוטוקלאב‬ddH2O
87
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.7.4.1‬הרצת ‪ RNA‬בג'ל והעברתו לממברנה‬
‫תמיסות נדרשות‪:‬‬
‫‪MOPSx20: 400mM MOPS Buffer, 100mM sodium acetate, 20mM EDTA (pH=7.15).‬‬
‫‪100ml Gel RNA: 1gr agarose, 81.6ml H2O-DEPC boil and chilling to 700C then add 5ml MOPSx20,‬‬
‫‪8.3ml 37% formaldehyde, 5ml H2O-DEPC and 10µl 0.5% ethidium bromide (EtBr).‬‬
‫‪RNA sample buffer: 500µl formamide, 170µl 37% formaldehyde, 50µl MOPSx20, 230µl H2O‬‬‫‪DEPC, 50µl bromophenol blue.‬‬
‫‪SSCx20: 3M NaCl, 0.3M sodium citrate.‬‬
‫כמויות ‪ RNA‬שוות )‪ (10µg RNA‬בנפח שווה )השלמה ב‪ (H2O-DEPC -‬עם שליש נפח של‪RNA sample buffer‬‬
‫טרי חוממו ל‪ 65°C -‬למשך ‪ 10‬דקות ולאחר מכן‪ ,‬קירור בקרח במשך ‪ 5‬דקות לפחות‪ .‬הטענת ‪ RNA‬בג'ל והרצה ב‪-‬‬
‫‪ MOPSx1‬במתח נמוך )‪ ,5-10mA ,(<50mV‬במשך ‪ 16-18‬שעות‪ .‬זיהינו ‪ r-RNA‬באור ‪ .(18S, 28S) UV‬ה‪RNA-‬‬
‫הוספג )‪ (blotting‬בממברנת ניטרוצלולוז ‪ :(Stratagene, #420101) Duralon-UVTM‬נעשה שימוש בממברנה‬
‫)הנ"ל( בגודל מתאים לג'ל וכן ניירות ‪ 3MM‬בגודל גדול יותר מהממברנה ונבנה מגדל ניירות ספיגה )‪ 10‬ס"מ גובה‬
‫לפחות( ו‪" -‬גשר" נייר ‪ .3MM‬הממברנה הוטבלה במים ואחר כך הושרתה במשך ‪ 10‬דקות ב‪ SSCx10 -‬בקערה‬
‫ובה ‪ SSCx10‬ועליה זכוכית )גובה נוזל כ‪ 1 -‬ס"מ(‪" .‬גשר" הנייר הורטב ב‪ SSC-‬מצד לצד והונח על הזכוכית‬
‫כשקצותיו עדיין טבולים ב‪ .SSCx10-‬הג'ל הונח על הגשר )ללא בועות אויר(‪ .‬הממברנה הונחה על הג'ל‪ ,‬בועות‬
‫אויר הוצאו והצדדים נאטמו על ידי פאראפילם‪ .‬שני ניירות ‪ 3MM‬הונחו ספוגים ב‪ ,SSCx10-‬עליהם נייר ‪3MM‬‬
‫יבש ועליהם הנחנו את מגדל הניירות‪ .‬על מגדל הניירות הנחנו זכוכית ישרה נוספת שעליה משקולת )‪ 0.5‬ק"ג(‬
‫והמתנו למשך לילה‪.‬‬
‫למחרת‪ ,‬חשפנו את הממברנה‪ ,‬סימנו את הצד של ה‪ RNA-‬ואת שני הבנדים של ה‪ (18S, 28S) ,r-RNA -‬בעיפרון‪.‬‬
‫ה‪ RNA-‬קובע על ידי ‪) 1200mJ per cm2 (crosslinking) UV‬לשמירה‪ :‬איטום בשקית ניילון ואכסון במקרר(‪.‬‬
‫‪ 2.7.4.2‬הכנה וסימון גלאי ‪(probe) DNA‬‬
‫‪TE pH 8: 10mM Tris-HCl pH 8, 1mM EDTA pH 8‬‬
‫לצורך המעקב אחר התבטאות סמנים עצביים בתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שעברו ולא עברו התמיינות‬
‫הוכנו גלאים )‪ (probes‬לגנים ‪ .neurite growth-promoting factor 2 (NEGF2), NSE, NF-200‬הגן‬
‫)‪ glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH‬שימש כ‪ . house keeping gene-‬באמצעות‬
‫ריאקציות ‪ PCR‬עם תחלים )פרימרים( ייחודיים )ראה פרק ‪ (2.7.5‬יוצרו הגלאים‪ .‬התוצר שהמתקבל הורץ בג'ל‬
‫‪ ,DNA‬מתוכו חולץ המקטע בגודל המתאים בעזרת ערכת ‪ JetSorbTM‬והוגבר שוב בראקציית ‪ .PCR‬לאחר‬
‫ההגברה הורץ נפח קטן מהתוצר בג'ל ‪ DNA‬על מנת לוודא את מיקומו המתאים )=גודלו( של הגלאי‪.‬‬
‫)‪Total gene size (bp‬‬
‫)‪Probe size (bp‬‬
‫‪Gene‬‬
‫‪1310‬‬
‫‪785‬‬
‫‪3750‬‬
‫‪2423‬‬
‫‪339‬‬
‫‪359‬‬
‫‪350‬‬
‫‪356‬‬
‫)‪Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH‬‬
‫)‪Neurite growth-promoting factor 2 (NEGF2‬‬
‫)‪Neurofilament heavy (NF-200‬‬
‫)‪Neuron specific enolase (NSE‬‬
‫‪88‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫תנאי מכשיר ‪ PCR‬עבור ייצור והגברת גלאים‪:‬‬
‫הפרדת גדילים‬
‫הפרדת גדילים‬
‫הצמדות פרימרים אל ‪DNA‬‬
‫סינטזת גדיל משלים‬
‫הגברה‬
‫השלמה אופטימאלית של סינטזה אחרונה‬
‫סיום ושמירה‬
‫‪Time & Temperature‬‬
‫‪Step‬‬
‫‪10’- 94°C‬‬
‫‪1’- 94°C‬‬
‫)‪1’- 55°C (GAPDH, NEGF2‬‬
‫)‪1’- 56°C (NF-200, NSE‬‬
‫‪1’- 72°C‬‬
‫‪Go to Step 2 X36‬‬
‫‪8’- 72°C‬‬
‫‪4°C‬‬
‫‪Step 1‬‬
‫‪Step 2‬‬
‫‪Step 3‬‬
‫‪Step 4‬‬
‫‪Step 5‬‬
‫‪Step 6‬‬
‫‪Step 7‬‬
‫סימון הגלאי )‪ (probe‬ע"י ‪:dCTP-32P‬‬
‫‪Catalog No.‬‬
‫‪Quantity‬‬
‫‪Manufacturer‬‬
‫)‪33µl (probe + water‬‬
‫הרתחה למשך ‪ 5‬דקות ואחר כך קירור בקרח למשך ‪ 5‬דקות‬
‫‪5µl‬‬
‫‪New England Biolabs‬‬
‫‪BO210S‬‬
‫‪6µl‬‬
‫‪New England Biolabs‬‬
‫‪N0446S‬‬
‫‪1µl‬‬
‫‪New England Biolabs‬‬
‫‪MO210S‬‬
‫‪5µl‬‬
‫‪HVD Biothec amersham‬‬
‫‪AA0005‬‬
‫‪50µl‬‬
‫הדגרה למשך שעה ב‪ 37°C-‬והפסקת הראקציה על ידי הוספת ‪ 50µl‬של ‪.TE‬‬
‫‪20-25ng probe in H2O-DEPC‬‬
‫‪EcoPol Buffer ×10‬‬
‫)‪0.5mM of dNTP (A,T,G‬‬
‫)‪DNA Polymerase I (Klenow‬‬
‫)‪dCTP-32P (NENTM‬‬
‫‪Total volume:‬‬
‫ניקוי הפרוב על קולונה‪ :‬מבחנת אפנדורף )‪ (1.5 ml‬נוקבה בתחתיתה והוספו מעט כדורוני זכוכית ) ‪425-600‬‬
‫‪ (microns, Sigma, # G-8772‬ומעליהם ספאדקס )‪,(SephadexTM G-50 Fine, Amersham, #17-0042-01‬‬
‫סירכוז ב‪) 2500rpm -‬בתוך מבחנה נוספת( למשך ‪ 1.5‬דקות‪ .‬הטענת ‪ 100µl‬של גלאי מסומן לאחר הראקציה‬
‫וסירכוז כנ"ל עם מבחנה חדשה בתחתית‪ .‬הוספת ‪ 150µl‬של ‪ TE‬וסירכוז בשנית‪ .‬הנוזל המכיל את הפרוב נאסף‬
‫ונלקח ממנו ‪) 2µl‬מהפרוב( למונה ביתא ‪) Packard‬ללא נוזל סנטילציה(‪ ,‬עוצמת הסימון חושבה וסומנה ב‪-‬‬
‫‪.DPM/ml‬‬
‫‪ 2.7.4.3‬היברידיזצית ‪RNA‬‬
‫‪Denhardt's reagent ×100: 5gr Ficoll (type 400), 5gr polyvynylpyrolidone, 5gr BSA, 250ml ddH2O.‬‬
‫‪10% SDS: 100gr electrophoresis-grade SDS, 900gr ddH2O. Heat to 68°C, pH 7.2 with HCl, add‬‬
‫‪ddH2O to 1000ml.‬‬
‫‪Pre-hybridization solution: 6XSSC (0.9M Na), 50mM NaPPi (pH 6.5), 5X Denharts solution, 0.1%‬‬
‫‪), add‬מורתח ומקורר( )‪SDS, 50% Formamide (resin treated), 200ug/ml salmon sperm DNA (SSDNA‬‬
‫‪H2O-DEPC to 15ml.‬‬
‫הממברנה הוכנסה לבקבוק היברידיזציה עם ‪ 15ml‬של תערובת הפרה‪-‬היברידיזציה לאינקובציה של ‪ 30-60‬דקות‬
‫ב‪ 42°C-‬מעלות בתנור הברידיזציה )‪ .(Hybaid‬לאחר הפרה‪-‬היברידיזציה‪ ,‬הפרוב הורתח במשך ‪ 5‬דקות וקורר‬
‫בקרח‪ ,‬תערובת הפרה‪-‬היברידיזציה הוצאה למבחנת ‪ 50ml‬והפרוב הוסף‪ ,‬המבחנה עורבבה והנוזל )עם הפרוב‬
‫המסומן( הוחזר אל בקבוק ההיברידיזציה להמשך היברידיזציה עד למחרת‪.‬‬
‫‪89‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫למחרת‪ ,‬הממברנה נשטפה פעמיים ב‪ 0.1xSSC, 0.1%SDS-‬למשך ‪ 20‬דקות בטמפרטורת החדר‪ .‬לאחר מכן‬
‫הממברנה נשטפה פעמיים ב‪ 0.1xSSC, 0.1%SDS-‬למשך ‪ 30‬דקות ב‪ 65°C-‬תוך כדי טלטול‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬שאריות‬
‫הנוזל הוספגו בנייר ‪ .3MM‬הממברנה נוילנה ונחשפה ל‪ screen-‬למשך הלילה‪ .‬למחרת‪ ,‬פיתחנו וניתחנו את‬
‫התוצאות בפוספואימאג'ר )‪ (Cyclone‬בעזרת תוכנת ‪.OptiQuant‬‬
‫לקראת הברידיזציה נוספת מנקים את הממברנה מהסימון הקודם על ידי השרייה בתערובת רותחת של‬
‫‪ 0.05XSSC, 0.1%SDS, 0.01M EDTA in ddH2O‬למשך ‪ 15‬דקות ולאחר מכן מאכסנים ב‪ 2xSSC-‬בקור עד‬
‫להברידיזציה הבאה‪.‬‬
‫‪Polymerase Chain Reaction (PCR) 2.7.5‬‬
‫ביצוע ראקציות ‪ PCR‬התבצע בנפחים סופיים של ‪ ,10-20µl‬במכשיר‬
‫‪TM‬‬
‫‪ PCR set PTC-100‬או ‪TGradient‬‬
‫‪ .thermocyclers‬תערובת ראקציית ‪ PCR‬החילה את החומרים הבאים‪:‬‬
‫‪Manufacturer Catalog No.‬‬
‫‪R001A‬‬
‫‪R001A‬‬
‫‪TaKaRa‬‬
‫‪TaKaRa‬‬
‫‪R001A‬‬
‫‪TaKaRa‬‬
‫‪Material‬‬
‫‪Concentration‬‬
‫‪PCR Buffer X 10‬‬
‫)‪dNTP Mixture (2.5mM‬‬
‫)‪Upstream primer(10µM‬‬
‫)‪Downstream primer(10µM‬‬
‫)‪rTaq-polymerase (Takara TaqTM‬‬
‫‪cDNA‬‬
‫‪Buffer x1‬‬
‫‪200µM‬‬
‫‪0.5µM‬‬
‫‪0.5µM‬‬
‫‪5 units‬‬
‫)‪1µl (20 µl reaction‬‬
‫)‪0.5µl (10 µl reaction‬‬
‫‪ddH2O-DEPC to 10-20 µl‬‬
‫תנאי מכשיר ‪ PCR‬עבור ייצור והגברת גלאים‪:‬‬
‫הפרדת גדילים‬
‫הפרדת גדילים‬
‫הצמדות פרימרים אל ‪DNA‬‬
‫סינטזת גדיל משלים‬
‫הגברה‬
‫השלמה אופטימאלית של סינטזה אחרונה‬
‫סיום ושמירה‬
‫‪Time & Temperature‬‬
‫‪Step‬‬
‫‪5-10’- 94°C‬‬
‫‪1’- 94°C‬‬
‫‪1’- 54-65°C‬‬
‫‪1’- 72°C‬‬
‫‪Go to Step 2 X36‬‬
‫‪8’- 72°C‬‬
‫‪4°C‬‬
‫‪Step 1‬‬
‫‪Step 2‬‬
‫‪Step 3‬‬
‫‪Step 4‬‬
‫‪Step 5‬‬
‫‪Step 6‬‬
‫‪Step 7‬‬
‫כל הפריימרים שנבחרו הינם באורך של כ‪ 20-‬בסיסים‪ ,‬ונמצאים על אקסונים שונים בגן וזאת על מנת להיות‬
‫בטוחים שהתוצר מקורו מ‪ mRNA-‬ולא מהגן השלם מ‪ .DNA-‬הפריימרים תוכננו על‪-‬פי מאגרי הנתונים הבאים‪:‬‬
‫‪http://bioinfo.weizmann.ac.il/cards/index.html‬‬
‫‪GeneCards™ Weizmann Institute of Science‬‬
‫‪http://www.ncbi.nlm.nih.gov/‬‬
‫‪National Center for Biotechnology Information‬‬
‫‪http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/‬‬
‫)‪The European Bioinformatics Institute (EBI‬‬
‫‪http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/‬‬
‫‪http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi‬‬
‫‪Whitehead Institute for Biomedical Research.‬‬
‫‪90‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
Northern blot-‫ ו‬PCR ‫בטבלה הבא מתוארים רצפי הפריימרים )אנושיים( עבור ראקציות‬
Name of oligo
Sequence
Product NCBI (nucleotide)
size (bp) Ensembl
AADC sense
5’-GGATTCAGGGCTTATCACTGACTACC-3’
AADC
antisense
Aldh1a1 sense
5’-TTCATTCACTTTGTTGGAACCCTTTAGC-3’
Aldh1a1
antisense
CD90 sense
5’- TTCTTAGCCCGCTCAACACT-3’
5’-CTAGTGGACCAGAGCCTTCG-3’
CD90 antisense
5’-GCCCTCACACTTGACCAGTT-3’
COMT sense
5’- TCGACAACAAATGGAGGACA-3’
COMT
antisense
D2DR sense
5’- CAGAGGGGGATTGAAGTGAA-3’
250
5’- TGTTAGCTGATGCCGACTTG -3’
154
312
230
5’-AAGACCATGAGCCGTAGGAA-3’
159
D2DR antisense
5’-GTACAGGACAGGCGGGATGT-3’
DAT sense
5’-GCTCACCCTGGGTATCGACAGCG-3’
DAT antisense
5’-ATAGAACCAGGCCACTCCGATGGC-3’
DβH sense
5’-TCCAAGCTCCCAATATCCAG-3’
DβH antisense
5’-TCGGGTTTCATCTTGGAGTC-3’
En1 sense
5’-TCAAAACTGACTCGCAGCA-3’
En1 antisense
5’-ACTCCGCCTTGAGTCTCTGC-3’
GAPDH sense
5’-CCATGGAGAAGGCTGGGG-3’
GAPDH
antisense
Glypican-4
sense
Glypican-4
antisense
GTPCH 1
sense
GTPCH1
antisense
5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’
MAO B sense
5’- TCGACAACAAATGGAGGACA-3’
MAO B
antisense
Necdin sense
5’- CAGAGGGGGATTGAAGTGAA-3’
253
223
180
Necdin
antisense
194
5’-TGGGAAAGGCAAAAGCAG-3’
5’-CTCTCTGCATAACCAGGAAC-3’
386
TCTCAGATGTCCTAAACGATGCT
CAAGGACTTGCTTGTTAGGAAGA
153
237
5’-ATCTGAGCGACCCTAACTTT-3’
5’-CTTTCACCATGTCTGGAAAC-3’
91
360
NCBI: NM_000790
1083-1108, 1305-1333
ENST00000357936
Exon 9-10, Exon 12-13
NCBI: NM_000689.3
886-905, 1039-1020
ENSG00000165092
Exon 8-9, Exon 9
NCBI: NM_006288
85-104, 396-367
ENSG00000154096
Exon 3, Exon 4
NCBI NM_000754.2
549-569, 780-759
ENSG00000093010
Exon 4, Exon 5
NM_000795 (variant 1)
1231-1251, 1370-1389
NCBI: NM_016574 (variant 2)
1144-1164, 1283-1302
ENSG00000149295
Exon 7, Exon 8
NCBI: NM_001044
1373-1395, 1602-1625
ENST00000270349
Exon 9, Exon 11
NCBI: NM_000787
656-675, 878-859
ENSG00000123454
Exon 3, Exon 4
NCBI: NM_001426
1800-1818, 1979-1960
ENSG00000163064
Exon 1, Exon 2
NCBI: NM_002046
386-403, 561-580
ENSG00000111640
Exon 5, Exon 7
NCBI: NM_001448.
1487-1504, 1853-1872
ENSG00000076716
Exon 7, Exon 9
NCBI: NM_000161.
486-508, 616-638
ENSG00000131979
Exon 1-2, Exon 3
NCBI NM_000898.
720-739, 956-937
ENSG00000069535
Exon 5, Exon 7
NCBI: NM_002487.
106-125, 446-465
ENSG00000182636
Only 1 exon
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
Nestin sense
5’-CCAGAAACTCAAGCACCAC-3’
Nestin antisense
5’-TTTTCCACTCCAGCCATCC-3’
NF-68 sense
5’-AGACCCGACTCAGTTTCAC-3’
NF-68 antisense
5’-ACCTTCACCTCCTTCTTCTT-3’
NF-160 sense
5’- AAGCCACTCAGACCAGAATA-3’
NF-160
antisense
NF-200 sense
5’- GCAGCGATTTCTATATCCAG-3’
NF-200
antisense
NSE sense
5’-TTCTCAGACTTCTCCACCAC-3’
5’-CTCAAGGGAGTCATCAAGGA-3’
NSE antisense
5’-ATTGGCTGTGAACTTGGACC-3’
Nurr1 sense
5’- GGCGAACCCTGACTATCAAA-3’
Nurr1 antisense
5’- ACCCCATTGCAAAAGATGAG-3’
PITX3 sense
5’- AGGAGCTAGAGGCGACCTTC -3’
PITX3
antisense
PTCH sense
5’- AAGCTGCCTTTGCATAGCTC-3’
PTCH
antisense
RA-R sense
5’- CTTTGTCGTGGACCCATTCT-3’
5’-AGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCC-3’
RA-R antisense
5’-CGTCAGCGTGTAGCTCTC-3’
SMO sense
5’- GGGAGGCTACTTCCTCATCC-3’
SMO antisense
5’- GGCAGCTGAAGGTAATGAGC-3’
Trk-2 sense
5’-TAACCTCACTGTGGAGGAAG-3’
Trk-2 antisense
5’-CCCGTTATAGAACCACTGAA-3’
TPH sense
5’- CTGCCATGAACTCTTAGGTC -3’
TPH antisense
5’- CTCATCTTCTCCTTTGCATC -3’
397
350
366
5’-AAAGCACCAAGGACTCACT-3’
349
356
240
175
5’- ACAAACTCCTGGTGCAAACC-3’
207
352
167
352
351
NCBI: X65964.
2524-2542, 2903-2921
ENSG00000132688
Exon 5, Exon 6
NCBI: NM_006158
1192-2011, 1526-1545
ENSG00000104725
Exon 3, Exon 5
NCBI: NM_005382
834-853, 1199-1179
ENSG00000104722
Exon 1, exon 2
NCBI: NM_021076
1007-1025, 1355-1336
ENSG00000100285
Exon 2, Exon 4
NCBI X13120
571-580, 926-907
ENSG00000111674
Exon 7, Exon 9
NCBI NM_006186
1499-1518, 1738-1719
ENSG00000153234
Exon 6, Exon 7
NCBI: NM_005029.3
378-397, 552-533
ENSG00000107859
Exon 3, Exon 4
NCBI: NM_000264
2839-2858, 3045-3026
ENSG00000185920
Exon 16, Exon 17
NCBI: NM_000964
294-319, 645-628
ENSG00000131759
Exon 2, Exon 4
NCBI: NM_005631.
1521-1540, 1697-1678
ENSG00000128602
Exon 6, Exon 8
NCBI: NM_006180
963-982, 1314-1295
ENSG00000148053
Exon 6, exon 8
NCBI: NM_004179.
810-819, 1141-1160
ENSG00000129167
:PCR ‫אנליזת תוצרי‬
Gel DNA loading buffer×6: 0.25% bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol ff, 40% sucrose in
ddH2O. Preservation at 4°C.
TAE buffer X 50: 242gr Tris-base, 100ml EDTA pH 8.0 (0.5M), 57ml glacial acetic acid.
92
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫חומרים ושיטות‬
1-2% ‫ בג'יל אגרוז‬gel DNA loading buffer ‫ שעורבבו עם‬PCR ‫ בוצעו ע"י הטענת תוצרי‬PCR ‫אנליזת תוצרי‬
‫ התוצרים שהתקבלו‬.80-120V-‫ ב‬TAE×1-‫ בנוכחות של אטידיום ברומיד והרצה ב‬12% ‫או ג'יל אקריל אמיד‬
.‫ וצולמו עם מצלמה על פילם פולארויד‬,UV ‫נצפו באור‬
Material
Manufacturer Catalog No.
Acrylamide/bis-Acrylamide 29:1 40%w/v sol. (40%T, 3.3%C)
TEMED- (N,N,N’,N’ Tetramethylethylenediamine)
(C6H16N2) (FW116.2) for molecular biology
1kb DNA Ladder
100bp DNA Ladder
Low DNA mass ladder
Biological Ind.
Sigma
01-874-1A
T-7024
NE BioLab
NE BioLab
Invitrogen
N3232
N3231
10068-013
:Real-time PCR ‫ שיטה כמותית למדידת ביטוי גנטי בעזרת‬2.7.6
NEGF2 ‫ראקציה עבור הגן‬
Rotor-GeneTM 3000 Real-time ‫ במכשיר‬,10µl ‫ התבצע בנפחים סופיים של‬real-time PCR ‫ביצוע ראקציות‬
.(2.7.4.4 ‫ )עבור רצף הפרימריים הספציפיים ראה פרק‬.thermal cycler
Material
Concentration
PCR Buffer X 10
Buffer x1
dNTP Mixture (2.5mM)
200µM
Upstream primer(10µM)
0.5µM
Downstream primer(10µM)
0.5µM
BioThermStar DNA Polymerase
0.1 units/µl
MgCl (25 mM)
1 mM
SYBR Green 1 (X 10000)
X 300
cDNA
1µl
ddH2O-DEPC to 10
Manufacturer Catalog No.
Fisher Biotec
TaKaRa
GC-045-250
R001A
Fisher Biotec
TaKaRa
Fisher Biotec
GC-045-250
R001A
SYBRG1
:‫הראקציה הוכנסה למכשיר ע"פ התוכנית הבאה‬
.‫ דקות‬15 ‫ למשך‬95ºC .I
15 ‫ למשך‬84ºC ,‫ שניות‬10 ‫ למשך‬72ºC ,‫ שניות‬30 ‫ למשך‬55ºC ,‫ שניות‬15 ‫ למשך‬95ºC] ‫ מחזורים של‬40 .II
.[‫שניות‬
.‫ שניות‬60 ‫ למשך‬72ºC .III
.72-99ºC ‫ בוצעה בין הטמפרטורות‬melting ‫ בדיקת נקודת‬.III
‫ ע"י‬GAPDH-‫ כימות הביטוי הגנטי ביחס ל‬.‫ על מנת לנרמל את התוצאות‬GAPDH ‫כמו כן נעשה שימוש בהגברת‬
.Rotor-Gene Real-time analysis software ‫שיטת עקומת הסטנדרט באמצעות התוכנה‬
93
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫ראקציה עבור הגן ‪Tyrosien hydroxylase‬‬
‫ביצוע ראקציות ‪ real-time PCR‬התבצע בנפחים סופיים של ‪ ,20µl‬במכשיר ‪ABI PRISM® 7000 sequence‬‬
‫‪.detection system‬‬
‫‪Manufacturer‬‬
‫‪Catalog No.‬‬
‫‪Concentration‬‬
‫‪Tyrosine hydroxylase‬‬
‫‪X1‬‬
‫‪Applied Biosystems 4304437‬‬
‫‪1µl‬‬
‫‪9µl‬‬
‫‪Applied Biosystems Hs00165941‬‬
‫‪Material‬‬
‫®‬
‫‪TaqMan Universal PCR Master‬‬
‫‪Mix X 2‬‬
‫‪Probes + primers for TH‬‬
‫‪cDNA‬‬
‫‪18S rRNA‬‬
‫‪Applied Biosystems 4304437‬‬
‫‪Applied Biosystems Hs9999‬‬
‫‪N801-0560‬‬
‫‪4311971‬‬
‫‪Master Mix X 2‬‬
‫‪X1‬‬
‫‪Probes + primer for 18S rRNA‬‬
‫‪1µl‬‬
‫‪cDNA‬‬
‫‪1µl‬‬
‫‪ddH2O-DEPC‬‬
‫‪8µl‬‬
‫‪MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate‬‬
‫‪Optical adhesive covers‬‬
‫‪Applied Biosystems‬‬
‫‪Applied Biosystems‬‬
‫הראקציה הוכנסה למכשיר ע"פ התוכנית הבאה‪:‬‬
‫‪ 50ºC .I‬למשך ‪ 2‬דקות‪.‬‬
‫‪ 95ºC .II‬למשך ‪ 10‬דקות‪.‬‬
‫‪ 80 .IV‬מחזורים של ]‪ 95ºC‬למשך ‪ 20‬שניות‪ 61ºC ,‬למשך ‪ 1‬דקות[‪.‬‬
‫כמו כן נעשה שימוש בהגברת ‪ 18S rRNA‬על מנת לנרמל את התוצאות‪ .‬כימות הביטוי הגנטי של ‪ TH‬ביחס ל‪-‬‬
‫‪ 18S rRNA‬ע"י שיטת ‪ ∆∆Ct‬באמצעות התוכנה ‪.Sequence Detection System 1.1 software‬‬
‫‪ 2.7.7‬מעקב אחרי פקטורי שעתוק )‪(transcription factors‬‬
‫‪protein/DNA array analysis 2.7.7.1‬‬
‫על מנת לאפיין את רמות פקטורי השעתוק המשתנים והמעורבים בהתמיינותם של תאים מזכימלים )אנושיים(‬
‫לתאים דמויי תאי‪-‬עצב נעשה שימוש ב‪ .protein/DNA array analysis-‬בוצעו שלשה ‪array hybridizations‬‬
‫בלתי תלויות‪ ,‬מהפקת חלבוני גרעין מתאים שעברו התמיינות במשך ‪ 24‬ו‪ 48-‬שעות והשלישית מתאים שלא עברו‬
‫התמיינות‪ .‬חלבוני הגרעין הופקו באמצעות)‪ ,nuclear extraction kit (AY2002‬והיברידיזציה בוצעה עם‬
‫)‪ TranSignal protein/DAN array (MA1011‬בהתאם להוראות היצרן )‪ .(Panomics‬הופקו חלבוני גרעין והם‬
‫עברו היברדיזציה ויצרו קומפלקס עם רצפים ידועים של ‪ 96‬פקטורי שעתוק‪ .‬ה‪ probes-‬הופרדו מהקומפלקס‬
‫חלבון‪ DNA-‬ועברו היברדיזציה עם ממברנה שהכילה מקטעי ‪ DNA‬חד גדילי מ‪ 96-‬גנים של פקטורי שעתוק‪,‬‬
‫כולל גנים לביקורת )‪ (housekeeping genes‬וגנים לבקרה שלילית‪ .‬רשימת הגנים המלאה נמצאת באתר חברת‬
‫‪ .http://www.panomics.com/PDarray2.cfm ,Panomics‬הסיגנל נוצר ע"י ‪ HRP chemiluminescence‬ונחשף‬
‫לפילם ‪ .X-ray‬עוצמת הסיגנל עובדה באמצעות ‪ VersaDocTM‬והיוותה ממוצע של ‪" 2‬כתמים" )‪ .(spots‬כל‬
‫הפקטורים שהציגו עוצמת חיווי פחותה מ‪ 2 OD/mm2 -‬לא נלקחו בחשבון באנליזה‪ .‬עבור כל פקטור שעתוק‬
‫בוצעה החלוקה בין עוצמת החיווי לפני התמיינות חלקי עוצמת החיווי לאחר ההתמיינות‪ .‬יחס של ‪ 1‬משמעו שאין‬
‫שינוי בביטוי פקטור השעתוק בעקבות ההתמיינות‪ .‬יחס קטן מ‪ 1-‬משמעו עלייה ברמת הפקטור השעתוק בעקבות‬
‫‪94‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫ההתמיינות‪ ,‬יחס גדול מ‪ 1-‬משמעו ירידה בביטוי של פקטור השעתוק‪ .‬היחסים בין ‪ 0.5‬ו‪ 0-‬ויחסים גדולים מ‪2-‬‬
‫הוגדרו כיחסים אמיתיים )ע"פ הוראות החברה היצרנית(‪ .‬יחסים בין ‪ 0.5‬ל‪ 2-‬מוגדרים כיחסים ללא שינוי מובהק‬
‫ולכן לא תוארו‪.‬‬
‫‪electrophoretic mobility gel-shift assay (EMSA) 2.7.7.2‬‬
‫ביצוע )‪ electrophoretic mobility gel-shift assay (EMSA‬נעשה באמצעות‬
‫‪EMSA Gel-Shift Kit‬‬
‫)‪ ,(Panomics‬ע"פ הוראות היצרן‪ .‬כמוסבר בסעיף הקודם הוכן מיצוי חלבונים מגרעינים ו‪ 5µg-‬עורבב עם ‪10ng‬‬
‫של גלאי ‪) biotin-labeled DNA‬עבור ‪ GAG‬או ‪ (FKHR‬או עם ‪ labeled probe 10ng‬ו‪.cold probe 20ng -‬‬
‫התערובת הודגרה ב‪ 17°c-‬למשך ‪ 30‬דקות‪ .‬התכולה הכוללת של הדוגמה עורבבה עם ‪ Loading Dye‬והוטענה ב‪-‬‬
‫‪ .6% polyacrylamide gel‬הריצה בג'ל היתה ב‪ 120-‬וולט בבופר ‪ 0.5×TBE‬למשך כשעה‪ .‬הדוגמאות שרצו בג'ל‬
‫הועברו לממברנת ‪ hyboned N+‬בבופר ‪ 0.5×TBE‬ב‪ 300-‬מיליאמפר במשך ‪ 20‬דקות‪ .‬הדוגמאות שעברו לממברנה‬
‫קובעו באמצעות ‪ .U.V cross-linking‬הממברנה "נחסמה" עם ‪ 1×blocking buffer‬שסופק בקיט והגלאי זוהה‬
‫ע"י ‪) Streptavidin-HRP‬סופק בקיט(‪ .‬לאחר ‪ 3‬שטיפות‪ 1×Detection Buffer ,‬הוסף למשך ‪ 5‬דקות‪ .‬הממברנה‬
‫נחשפה ל‪ X-ray film-‬והאחרון צולם ב‪. Versa Doc imaging system (BIO RAD) -‬‬
‫‪ 2.8‬מעקב אחר הפרשת דופאמין באמצאות ‪:HPLC‬‬
‫תמיסות‪ ,‬ריכוזים ומהלך המחקר על‪-‬פי ‪.Studer et al., 1998; Kim et al., 2002‬‬
‫איסוף הדגימות‬
‫מדיום מתרביות תאים )חופשי מסרום( נאסף לתוך מבחנות עם‬
‫‪sodium metabisulfite (Na2S2O5, Sigma,‬‬
‫‪ (2mg/ml) (S1516‬לבדיקה האם קטכולאמינים מופרשים מהתאים במהלך גידול‪/‬התמיינות של תאים‪ .‬נבדקו‬
‫רמות באזאליות של קטכולאמינים ע"י השריית התאים ב‪ HBSS-‬למשך ‪ 35‬דקות‪ ,‬ב‪ .37ºC-‬בנוסף‪ ,‬נמדדה מידת‬
‫הפרשת קטכולאמינים בעקבות דה‪-‬פולריזציה וזאת לאחר המדידה הבזאלית‪ .‬כתוצאה מהשריית התאים עם‬
‫‪.56mM KCl in HBSS‬‬
‫תמיסות סטנדרט‪:‬‬
‫כל הכימיקלים לעבודה ב‪ high performance liquid chromatography (HPLC)-‬היו ברמת ניקיון גבוהה‬
‫)‪.(HPLC-grade‬‬
‫‪Catalog No.‬‬
‫‪Manufacturer‬‬
‫‪Material‬‬
‫‪CF-8010‬‬
‫‪858781‬‬
‫‬‫‪cx-8169‬‬
‫‪ALT95100‬‬
‫‪Bio.Sy. Inc.‬‬
‫‪Sigma‬‬
‫‪Merck‬‬
‫‪Costar‬‬
‫‪Alltech‬‬
‫‪AAO Acid Washed Alumina‬‬
‫)‪3.4 Dihydroxybenzylamine (DHBA‬‬
‫)‪Perchloric acid (70-72%) 6.9M (1.68gr/ml‬‬
‫‪Spin-X HPLC 0.22µm nylon filter‬‬
‫‪Conical Maxi vials reaction‬‬
‫‪preparation‬‬
‫‪pg/ml‬‬
‫‪concentration‬‬
‫‪Material‬‬
‫‪15mg/in 100ml 0.1M HClO4‬‬
‫‪4.5mg/in 100ml 0.1M HClO4‬‬
‫‪10mg/in 100ml 0.1M HClO4‬‬
‫‪12.3mg/in 100ml 0.1M HClO4‬‬
‫‪6750‬‬
‫‪2375‬‬
‫‪10000‬‬
‫‪10000‬‬
‫‪7.5mg/%‬‬
‫‪2.5mg/%‬‬
‫‪10mg/%‬‬
‫‪10mg/%‬‬
‫‪Stock 1 - Standards‬‬
‫)‪Norepinephrine (NE‬‬
‫)‪Epinephrine (EPI‬‬
‫)‪L-3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA‬‬
‫)‪Dopamine (DA‬‬
‫‪95‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪16mg/in 100ml 0.1M HClO4‬‬
‫)‪Dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC‬‬
‫‪10mg/%‬‬
‫‪10000‬‬
‫)‪3.4 Dihydroxybenzylamine (DHBA‬‬
‫‪10mg/%‬‬
‫‪10000‬‬
‫‪Stock 2‬‬
‫)‪Standards 1:1000 [100µl Stock 1 /in 100ml 0.1M HClO4 ](-20ºC‬‬
‫)‪Work Stock – Standards 1:10000 (1:10 of Stock 2‬‬
‫ריכוז קטכולאמינים בדגימות עם אלומינה‬
‫לתוך בקבוקון ריאקציה בנפח ‪ 10ml‬הוסף )‪ .3ml Tris buffer pH 8.6, 20µl DHBA (stock 2‬המבחנות‬
‫עורבבו ע"י הפיכתן )‪ 10‬פעמים(‪ .‬הוספת ‪ 6‬מ"ל דגימה נבדקת‪ ,‬ערבוב ע"י הפיכה )‪ 10‬פעמים(‪ .‬בשלב הבא‪ ,‬הוספה‬
‫לבקבוק ‪ 50‬מ"ג אלומינה‪ .‬ערבוב קלות ע"י הפיכה )‪ 20‬פעמים(‪ ,‬טלטול הבקבוקונים )במתקן טלטול( במשך ‪10‬‬
‫דקות‪) ,‬ספיחה של קטכולאמינים ע"י אלומינה‪ ,‬בסביבה בסיסית(‪ .‬ניקוי האלומינה התבצע ע"י הוצאת נוזל עליון‬
‫מבקבוקון עם וואקום ושטיפה עם מים מזוקקים שלוש פעמים‪ .‬בין השטיפות המבחנות עורבבו ע"י היפוך )‪30‬‬
‫פעמים(‪ .‬לאחר שטיפה אחרונה המים המזוקקים הוצאו בואקום‪ ,‬האלומינה הועברה למבחנה קולטת עם‬
‫מיקרופילטר סינון ‪ 0.22µm‬בעזרת פיפטת פסטר מזכוכית‪ .‬הדגימות סורכזו למשך ‪ 10‬דקות‪.4ºC ,3000×g ,‬‬
‫החלפת המבחנה הקולטת‪ ,‬הוספה על המיקרופילטר )‪) 200µl perchloric acid (0.1M, HClO4‬סביבה חומצית‬
‫עבור שחרור קטכולאמינים מאלומינה שספוחה על הפילטר(‪ .‬ערבוב ע"י וורטקס כ‪ 20-‬שניות‪ .‬השהיית הדגימות‬
‫‪ 5‬דקות ב‪ 4ºC -‬וסרכוז ‪ 10‬דקות‪ .4ºC ,3000×g ,‬המיצוי המתקבל מוכן להזרקה ל‪) HPLC -‬איחסון‪ -70°C :‬עד‬
‫הבדיקה(‪.‬‬
‫מדידת רמת קטכולאמינים‬
‫מדידת רמות קטכולאמינים באמצעות מכשיר ‪ HPLC‬עם גלאי אלקטרוכימי ‪ ,LC-4‬משאבה בלחץ גבוה‪LC-‬‬
‫‪ 10AT‬נעשתה במעבדה לקטכולאמינים במרכז רפואי רבין‪.‬‬
‫‪100µl‬דגימה הוזרקה לקולונה ‪ (125x4.6mm) C18‬מתוצרת ‪ .Hichrom‬תנאי הזרקה היו כדלקמן‪ :‬שפיעה‬
‫)‪ (flow‬של ‪ ,1.2ml/min‬פוטונציאל חמצון של אלקטרודה ‪ .+0.7V‬הפאזה הנעה מורכבת מבופר‬
‫מונוכלורואצטאט ‪ ,0.15M pH 2.9‬המכיל ‪ 2mM EDTA‬לספיחת מתכות ו‪Sodium octyl sulfate (SOS)-‬‬
‫כיון מזווג‪ ,‬בריכוז משתנה בהתאם לצורך )‪ SOS‬משנה את הניידות של האנליטים המופרדים(‪.‬‬
‫המערכת כוילה בעזרת תערובת סטנדרטים לפני תחילת העבודה היומית‪ .‬תמיסת תערובת הכיול של‬
‫קטכולאמינים הכילה בכל הזרקה ‪ 50µl‬של‪.Dopamine ,Dopa ,Dopac ,DHBA , Epi ,NE :‬‬
‫אחוז הניצולת )‪ (recovery‬חושב על פי סטנדרט פנימי ‪.DHBA‬‬
‫אחוז ‪: recovery‬‬
‫‪]DHBA × 100‬קריאתמכשיר [‬
‫‪= %rec‬‬
‫]‪DHBA[2500‬‬
‫חישוב ריכוז מטבוליטים ‪:‬‬
‫‪ × 100‬קריאתמכשיר‬
‫‪= ρg / ml‬‬
‫‪%rec [ DHBA ] × 60‬‬
‫‪96‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.9‬בדיקת רמות סידן תוך תאיות‬
‫‪Fura-2/Acetoxymethyl ester (Fura-2/AM) stock solution: 50µg – Fura-2/AM (Biotium Cat # 50033‬‬‫‪1), 50µl – DMSO. The solution was kept in -200C with no exposure to light‬‬
‫‪Pluronic F-127 stock solution: 40µg – pluronic F-127 (Biotium Cat # p-6867), 200µl – DMSO. The‬‬
‫‪solution was incubated at 400C for 20 minutes and kept at room temperature‬‬
‫תאים מזנכימליים ממח עצם ממקור אנושי גודלו על סלייטים מזכוכית שטופלה ב‪ .poly-D-lysine-‬התאים עברו‬
‫התמיינות במשך ‪ 48‬שעות – ‪ 5‬ימים‪ .‬התאים שעברו התמיינות הודגרו עם ‪ -Fura-2/AM‬נגזרת ‪acetoxymethyl‬‬
‫‪ ester‬מ‪ Fura-2 -‬המאפשרת חדירת ‪ Fura-2‬לתוך התאים‪ .‬בתוך התאים דמויי‪-‬תאי עצב ‪ esterases‬מבקיעים את‬
‫‪ AM‬ו‪ ,Fura-2-‬הטעון במטען שלילי‪ ,‬מסוגל לחדור לתאים‪.‬‬
‫על מנת להעמיס על התאים ‪ 2µl of Fura-2/AM and 2µl of Pluronic F-127 ,Fura-2‬עורבבו ביחד עם ‪400µl‬‬
‫של מדיום הגידול‪ .‬נעשה שימוש ב‪ Pluronic acid -‬בגלל המסיסות הנמוכה יחסית של ‪ AM ester‬במים‬
‫)‪ ,Pluronic F-127‬דטרגנט‪ ,‬משמש כחומר מפזר המקל על ההמסה(‪ .‬התערובת עורבבה בוורטקס ‪ 30‬שניות‬
‫ונשפכה למדיום הגידול לתרבית התאים כך שמתקבל ריכוז סופי של ‪ .2µM Fura-2/AM‬התאים הודגרו במשך‬
‫‪ 30-45‬דקות ב‪ Fura-2/AM -‬לפני שנבדקו בהם רמות הסידן‪.‬‬
‫זכוכית כיסוי הונחה על התאים והם נשטפו עם תמיסה חיצונית למשך ‪ 5‬דקות על מנת לפנות את כל ‪Fura-‬‬
‫‪ 2/AM‬המצוי במדיום‪ .‬על מנת לבחון העלאת רמות סידן תוך תאיות בוצעה דפולריסציה באמצעות הוספת‬
‫‪ 56Mm KCl‬לתמיסת התאים‪ .‬האקסיטציה הפלורוסנטית נעשה ע"י ‪monochromator (T.I.L.L. Photonics,‬‬
‫)‪ Planegg, Germany‬במיקרוסקופ ‪ IX-50‬של חברת אולימפוס בהגדלת אוביקטיב ‪x40‬‬
‫;‪(UAPO/340‬‬
‫)‪ .Olympus, Tokyo‬הצבע הפלורוסנטי עבר ערעור ב‪ 350/380 nm -‬ושטח הארה הוקטן וכוון רק לקוטר התא‪.‬‬
‫האור שנפלט זוהה דרך )‪ .500-nm long-pass filter (T.I.L.L. Photonics‬רמות הסידן התוך תאיות חושבו לפי‬
‫עוצמת הפלורוסנציה לאחר כיול‪.‬‬
‫מדידת רמות הסידן התוך תאיות בוצעו ע"י ד"ר אורי אשרי מהפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל‪-‬אביב‪.‬‬
‫‪ 2.10‬מדידות אלקטרופיסיולוגיות )‪(Whole-cell patch clamp recording‬‬
‫‪Extracellular recording solution (1 Liter):‬‬
‫‪140ml – NaCl (1M) – 140mM‬‬
‫‪2.4ml – KCl (1M) – 2.4mM‬‬
‫‪10ml – HEPES (1M) – 10mM‬‬
‫‪1.802gr – Glucose – 10mM‬‬
‫‪4ml – CaCl2 (1M) – 4mM‬‬
‫‪4ml – MgCl2 (1M) – 4mM‬‬
‫‪ddH2O was added to complete the volume‬‬
‫‪The pH level was adjusted to 7.2-7.4. The osmolarity was adjusted to 300-310mOsm. The solution‬‬
‫‪was filtrated using a 0.2µ filter (corning – filtrap 500ml Cat # 430769) and kept in 4C until use‬‬
‫‪97‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪Intracellular recording solution (5ml):‬‬
‫‪KCl stock: 153mM KCl, 20mM HEPES. pH adjusted to 7.4 (KOH).‬‬
‫‪ATP/GTP stock: 20mM - ATP-Mg, 3mM – GTP-Na2, 20mM – HEPES.‬‬
‫– ‪Intracellular recording solution: 3.9ml – KCl stock, 0.5ml – ATP/GTP stock, 0.5ml‬‬
‫‪phosphocreatin stock, 50µl – EGTA (100mM).‬‬
‫‪The pH level was adjusted to 7.2-7.3. The osmolarity was adjusted to 270-280mOsm. The solution‬‬
‫‪was filtrated using a 0.2µ filter (corning – filtrap 500ml Cat # 430769) and kept in –200C until use.‬‬
‫המבחנים האלקטרופיסיולוגיים בוצעו בתאים מזנכימליים ממח עצם ממקור אנושי שגודלו על סלייטים מזכוכית‬
‫שטופלה ב‪ .poly-D-lysine-‬התאים עברו התמיינות במשך ‪ 48‬שעות – ‪ 5‬ימים‪.‬‬
‫הקלטה שגרתית של תא שלם בוצעה ב‪ 30°C -‬עם ‪ Sylgard-coated 3-5 M pipettes‬מחברת ;‪(Kimax-51‬‬
‫)‪ .Kimble/Kontes, Vineland, NJ‬נעשה שימוש ב‪ EPC-9 patch-clamp amplifier-‬ביחד עם תוכנת ‪Pulse‬‬
‫)‪.(HEKA Electronics, Lambrecht, Germany‬‬
‫על מנת לבדוק זרמים‪ ,‬התאים הוחזקו ב‪ -80mV -‬למשך ‪ 100msec‬וניתנו פולסים להעלאת המתח שיגרמו לזרם‬
‫לעלול‪.‬‬
‫על מנת לבדוק את מתח הממברנה‪ ,‬התאים הוחזקו ב‪ current clamp mode of the EPC -‬וזרמים קטנים ניתנו‬
‫בתדירויות הולכות ועולות עד לקבלת ‪.spike-like‬‬
‫מדידות אלקטרופיסיולוגיות בוצעו ע"י ד"ר אורי אשרי מהפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל‪-‬אביב‪.‬‬
‫‪ 2.11‬השתלת תאים מזנכימליים בחיות מודל למחלת פרקינסון‬
‫‪ 2.11.1‬בעלי חיים‬
‫כל התהליכים הכירורגים בוצעו בהתאם להוראות הטיפול בחיות מעבדה‪ ,‬ותחת פיקוחה ואישורה של הוועדה‬
‫לאישור ניסויים בבע"ח במרכז הרפואי רבין ובאוניברסיטת ת"א‪.‬‬
‫כל החיות )עכברים וחולדות( ששימשו לניסויים שוכנו בחדר חיות בעל תנאים קבועים של טמפרטורה )‪,(22±1°C‬‬
‫לחות )‪ (30%‬ומחזור של ‪ 12‬שעות אור‪/‬חושך‪ ,‬כמו כן טופלו החיות בתדירות יומית קבועה וניתנה להם גישה‬
‫חופשית למזון ולמים‪.‬‬
‫‪ 2.11.2‬מודל לפרקינסון בחולדות‬
‫העבודה בוצעה בשיתוף פעולה עם ד"ר טובר‪-‬ספינוזה זולמה במעבדתנו‪.‬‬
‫השראת מודל למחלת פרקינסון בחולדות‬
‫החולדות ששימשו למחקר זה היו חולדות ממין זכר מזן ‪) Sparague-Dawley-SD‬הרלן‪ ,‬ישראל( במשקל של‬
‫‪ 200-400‬גרם‪ .‬החולדה הורדמה ע"י הזרקת )‪ Chloral hydrate (Fluka‬לתוך חלל הצפק במינון של ‪350 mg/kg‬‬
‫וקובעה למכשיר סטראוטקטי )‪ .(Stoelting Company‬לאחר מכן הוזרק‪ ,‬בעזרת מזרק המילטון‪ ,‬חד צדדית לתוך‬
‫הניגרה הימנית ‪ 12µg‬של ‪) 6OHDA‬מומסים ב‪ 0.9% Saline 6µl-‬המכילים ‪ (Ascorbic acid 0.2µg/µl‬בקצב‬
‫של ‪ 1µl‬בדקה )‪) (Jellinger et al., 1995; Perese et al.,1989‬ע"פ הקורדינטות‪ 4.8 :‬מ"מ אחורית ל‪Bregma-‬‬
‫‪ 1.8,‬מ"מ צידית לקו האמצע ו‪ 8.1 -‬מ"מ לכיוון הגחון מתחת לדורה( )‪ ,(Paxinos, 1986‬המחט הושארה במיקומה‬
‫‪98‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫למשך ‪ 3-5‬דקות מתום ההזרקה ואח"כ הוצאה באטיות‪ .‬שבועיים לאחר מכן הוזרקו החולדות ב‪Amphetamine-‬‬
‫)במינון של ‪ ,(I.p, 5mg/kg‬על מנת להעריך את מידת ניוון הנוירונים הדופאמינרגים שתתבטא התנהגותית בסיבוב‬
‫איפסילטרלי למקום ההזרקה‪ .‬הסיבובים נספרו והיוו מדד להשראת מחלת פרקינסון וחומרתו היחסית )לבד או‬
‫ביחד עם נוכחות תאים מושתלים( )‪ .(Henry et al., 1998‬הערכת חומרת המחלה )הנזק לתאים הדופאמינרגים(‬
‫בחולדות התבצעה בעזרת שיטת ה‪ ,Rotometry -‬בה נספר בעזרת ‪ Rotameter‬ממוחשב ) ‪San Diego‬‬
‫‪ (Instruments‬מספר הסיבובים האיפסילטרלי )בכלי עגול למשך שעתיים( לאחר הזרקת ‪Amphetamine‬‬
‫)‪ .(Perese, 1989‬מעקב אחר החולדות‪ ,‬הראה שהחולדות הסתובבו בממוצע לפחות ‪ 3‬סיבובים נגד כיוון השעון‬
‫לדקה לאחר כשעה‪ .‬כעבור שעתיים החולדות חדלו להסתובב‪ .‬רק חולדות שהסתובבו )כ ‪ 80%‬מהחיות המוזרקות(‬
‫נבחרו להמשך המחקר‪.‬‬
‫השתלת תאים מזנכימליים לניגרה של חולדות מודל למחלת פרקינסון‬
‫תאים מזנכימליים ממח עצם של עכבר טרנסגני ‪ B5/EGFP‬בוגר עברו התמיינות עצבית במשך ‪ 48‬שעות לפני‬
‫ההשתלה )כמפורט בסעיף ‪ .(2.3‬העכברים הורדמו ע"י הזרקת ‪ I.P.‬של ‪ Chloral hydrate‬במינון ‪350 mg/kg‬‬
‫וקובעו למכשיר סטראוטקטי‪ .‬כ‪ 0.5x105-‬תאים )ב‪ (10µl saline-‬שעברו התמיינות עצבית הוזרקו לניגרה‬
‫הימנית והשמאלית )ל‪ 11-‬חולדות( באמצעות בעזרת מזרק המילטון על לפי הקורדינטות הבאות‪anterior 1 :‬‬
‫‪ dorsoventral 4.5 mm, mm, lateral 3 mm‬ביחס לברגמה‪ .‬ההזרקה נעשתה בקצב של ‪ 1µl‬לדקה ‪ .‬המחט‬
‫נשארה בתוך הניגרה כ‪ 3-‬דקות נוספות כדי למנוע ‪ reflux‬של תאים‪ .‬קבוצת הביקורת )‪ (n=9‬הוזרקה לניגרה‬
‫בסליין בלבד‪ .‬החולדות טופלו ב‪ (10 mg/kg subcutaneously) cyclosporine-‬על מנת למנוע את דחיית התאים‬
‫המושתלים מעכבר‪.‬‬
‫זיהוי התאים המושתלים במוחות החולדה שעברו לזייה‬
‫כעבור ‪ 45‬ימים‪ ,‬המוחות מהחולדות המושתלות הוצאו לאחר פרפוזיה עם פורמלדהיד ‪ 4%‬ונשמרו למשך ‪48‬‬
‫שעות בפורמלדהיה ‪ 4%‬בקור‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬המוחות הועברו לתמיסת סוכרוז ‪ 30%‬למשך ‪ 4-3‬ימים ולבסוף טבילה‬
‫במתילבוטן מקורר על קרח יבש והקפאה ל‪ -80Cº-‬עד לחיתוך המוחות‪ .‬המוחות נפרסו בקריאוסטט לעובי של‬
‫‪ . 10µm‬החתכים נבדקו בצביעה אימונוהיסטוכימית לנוכחות ‪ EGFP‬עבור התאים המושתלים ו‪ TH-‬לזיהוי‬
‫תאים דופאמינרגיים ולהערכת הנזק שנגרם ע"י הלזיה‪ .‬לצורך כך‪ ,‬המשטחים יובשו באוויר וקובעו ע"י אצטון‬
‫קפוא למשך ‪ 20‬דקות‪ ,‬לאחר שטיפה ב‪ PBS-‬בוצעה חסימה ע"י ‪.10% goat serum / 0.2% Triton-X in PBS‬‬
‫הזיהוי התבצע עם נוגדן שניוני מצומד ל‪ .Cy2 or Cy3-‬בנוסף‪ ,‬הרקמה נצבעה לצביעה גרעינית באמצעות ‪.DAPI‬‬
‫‪ 2.11.3‬מודל לפרקינסון בעכברים‬
‫העבודה בוצעה בשיתוף פעולה עם ברהום יעל ממעבדתנו‪ .‬העבודה נמצאת בימים אלו בעיצומה ולכן מספר‬
‫העכברים שבוצע בהם ניסוי הנו כעת נמוך‪.‬‬
‫השראת מודל למחלת פרקינסון בעכברים‬
‫העכברים ששימשו למחקר זה היו עכברים ממין זכר מזן ‪) c57/bl‬הרלן‪ ,‬ישראל( במשקל ‪ ~30‬גרם‪ .‬העכברים‬
‫הורדמו ע"י הזרקת ‪ chloral hydrate‬לתוך חלל הצפק במינון של ‪ 350 mg/kg‬וקובעו למכשיר סטראוטקטי‪.‬‬
‫לאחר מכן הוזרק‪ ,‬בעזרת מזרק המילטון‪ ,‬חד צדדית לתוך הניגרה הימנית ‪ 4µg‬של ‪) 6OHDA‬מומסים ב‪2µl-‬‬
‫‪ 0.9% saline‬המכילים ‪ (0.01% ascorbic acid‬בקצב של ‪ 1µl‬בדקה )ע"פ הקורדינטות‪anterior 1.1 mm, :‬‬
‫‪ lateral 2.3 mm, dorsa-ventral 4.2 mm‬ביחס לברגמה(‪ ,‬המחט הושארה במיקומה למשך ‪ 3-5‬דקות מתום‬
‫‪99‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫ההזרקה ואח"כ הוצאה באטיות‪ .‬שבועיים לאחר מכן הוזרקו העכברים ב‪) Amphetamine-‬במינון של ‪10 mg/kg‬‬
‫‪ ,(I.p,‬על מנת להעריך את מידת ניוון הנוירונים הדופאמינרגים שתתבטא התנהגותית בסיבוב איפסילטרלי למקום‬
‫ההזרקה‪ .‬הסיבובים נספרו והיוו מדד להשראת מחלת פרקינסון וחומרתו היחסית )לבד או ביחד עם נוכחות‬
‫תאים מושתלים(‪ .‬הערכת חומרת המחלה )הנזק לתאים הדופאמינרגים( בעכברים התבצעה בעזרת שיטת ה‪-‬‬
‫‪ ,Rotometry‬בה נספר באופן ידני מספר הסיבובים האיפסילטרלי )בכלי עגול למשך ‪ 30‬דקות( לאחר הזרקת‬
‫‪ .Amphetamine‬רק עכברים שהסתובבו )כ ‪ 80%‬מהחיות המוזרקות( נבחרו להמשך המחקר‪.‬‬
‫השתלת תאים מזנכימליים לסטריאטום של עכברים מודל למחלת פרקינסון‬
‫לאחר ‪ 3‬שבועות ממועד הזרקת ‪ ,6-OHDA‬תאים מזנכימליים ממח עצם של עכבר טרנסגני ל‪ B5/EGFP-‬בוגר‪,‬‬
‫עברו התמיינות עצבית במשך ‪ 48‬שעות לפני ההשתלה )כמפורט בסעיף ‪ .(2.3‬העכברים הורדמו ע"י הזרקת ‪I.P.‬‬
‫של ‪ chloral hydrate‬במינון ‪ 350 mg/kg‬וקובעו למכשיר סטראוטקטי‪ .‬כ‪ 2x105-‬תאים )ב‪ (2µl saline-‬שעברו‬
‫התמיינות עצבית הוזרקו לניגרה הימנית והשמאלית )ל‪ 4-‬חולדות( באמצעות בעזרת מזרק המילטון על לפי‬
‫הקורדינטות הבאות‪ dorsoventral 4.2 mm, anterior 1.1 mm, lateral 2.3 mm :‬ביחס לברגמה‪ .‬ההזרקה‬
‫נעשתה בקצב של ‪ 1µl‬לדקה ‪ .‬המחט נשארה בתוך הסטריאטום כ‪ 3-‬דקות נוספות כדי למנוע ‪ reflux‬של תאים‪.‬‬
‫קבוצת הביקורת )‪ (n=3‬הוזרקה לניגרה בסליין בלבד‪.‬‬
‫זיהוי התאים המושתלים במוחות העכברים שעברו לזייה‬
‫השיטה לחיתוך להוצאת המוחות וצביעות אימונוהיסטוכימיות מבוססות על פי ‪ .(2000) Jackson-Lewis‬עבור ‪15‬‬
‫שבועות‪ ,‬המוחות מהעכברים המושתלים הוצאו לאחר פרפוזיה עם פורמלדהיד ‪ 4%‬ונשמרו למשך ‪ 48‬שעות‬
‫בפורמלדהיה ‪ 4%‬בקור‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬המוחות הועברו לתמיסת סוכרוז ‪ 30%‬למשך ‪ 4-3‬ימים ולבסוף טבילה‬
‫במתילבוטן מקורר על קרח יבש והקפאה ל‪ -80Cº-‬עד לחיתוך המוחות‪ .‬המוחות נפרסו בקריאוסטט לעובי של ‪-‬‬
‫‪ . 10-30µm‬החתכים נבדקו בצביעה אימונוהיסטוכימית לנוכחות ‪ EGFP‬עבור התאים המושתלים ו‪ TH-‬לזיהוי‬
‫תאים דופאמינרגיים ולהערכת הנזק שנגרם ע"י הלזיה‪ .‬לצורך כך‪ ,‬המשטחים יובשו באוויר וקובעו ע"י אצטון‬
‫קפוא למשך ‪ 20‬דקות‪ ,‬לאחר שטיפה ב‪ PBS-‬בוצעה חסימה ע"י ‪.10% goat serum / 0.2% Triton-X in PBS‬‬
‫הזיהוי התבצע עם נוגדנים ראשוניים כנגד ‪ EGFP‬או ‪ TH‬ושניוניים מצומדים ל‪ Cy2-‬או ‪ AMCA‬בהתאמה‪.‬‬
‫‪100‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪ 2.12‬סטטיסטיקה‬
‫ערכי התוצאות המופיעות בעבודה זו מבוטאים על ידי הממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן )‪ .(SEM‬ההבדלים הסטטיסטיים‬
‫בין הקבוצות חושבו בעזרת תוכנת ‪Statistical Package for the Social Sciences (SPSS., SPSS inc.,‬‬
‫‪ (Chicago, Illinois‬גרסה ‪ ,10‬ועל‪-‬ידי תוכנת ‪.Microsoft® Excel 2002‬‬
‫משמעות סטטיסטית של ההבדלים בין קבוצות הניסוי חושבה ע"פ הפרמטרים הבאים‪:‬‬
‫• בכל ניסוי בו היו רק שתי קבוצות‪ ,‬ללא התייחסות למשך הניסוי‪ ,‬בוצע מבחן ‪ (student T-test) T‬בעל‬
‫התפלגות דו‪-‬זנבית‪.‬‬
‫• מבחני קורלציה בין רמות הגנים או החלבון לבין משך זמן ההתמיינות בוצעו באמצעות ‪Pearson‬‬
‫‪ correlation‬בעל התפלגות חד‪-‬זנבית או דו‪-‬זנבית )בהתאם לניסוי(‪.‬‬
‫• לבחינת השיפור הקליני בניסויי מודל למחלת פרקינסון עם התייחסות למשך הניסוי‪ ,‬בוצע מבחן ניתוח‬
‫שונות חד כיווני )‪ (One-way ANOVA‬ולאחריו מבחן טוקי )‪(Tukey’s‬‬
‫• בכל ניסוי בו היו שתי קבוצות‪ ,‬עם התייחסות למשך הניסוי‪ ,‬בוצע מבחן ניתוח שונות )‪ (ANOVA‬עם‬
‫תצפיות חוזרות‪.‬‬
‫מובהקות סטטיסטית נקבעה כאשר ערכי ‪ p‬קטנים מ‪.0.05-‬‬
‫‪101‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫תוצאות‬
‫‪ .1‬השראת התמיינותם של תאי גזע ממח העצם‪ ,‬בעכבר טרנסגני המבטא ביתר את הגן ההומני‬
‫ל ‪ Bcl-2‬תחת הפרומוטר ‪ ,neuron specific enolase‬לתאים דמויי‪-‬תאי עצב‬
‫בשלב הראשון של המחקר נבחנה השראת התמיינות תאי סטרומה ממח העצם של עכבר לתאים דמויי תאי עצב‪.‬‬
‫נעשה שימוש בעכברים טרנסגנים בהם הגן ההומני ‪ bcl-2‬הנו תחת הפרומוטר ל‪ .NSE-‬השימוש בפרומוטר ‪NSE‬‬
‫גורם לכך שהביטוי ביתר של הגן ‪ bcl-2‬יהיה בתאי עצב בלבד ולא ברקמות אחרות‪ .‬לכן‪ ,‬תאי מח העצם לפני‬
‫השראת התמיינותם הנם תאי גזע מזנכימלים אשר אינם אמורים לבטא ביתר את הגן ההומני ‪ .bcl-2‬ביטוי ביתר‬
‫של החלבון ההומני ‪ Bcl-2‬בתאי מח העצם לאחר השראת התמיינות לתאי עצב מהווה סמן כי אכן תאים אלה‬
‫שעוברים התמיינות מסוגלים להפעיל פרומוטר אופייני לתאי מערכת העצבים‪ ,NSE ,‬שהוחדר לתאים‪ .‬כבקורת‪,‬‬
‫נבדקה לפני ואחרי השראת ההתמיינות‪ ,‬נוכחות סמן אחר‪ NeuN, neural nuclei protein ,‬חלבון ייחודי לתאי‬
‫עצב המבוטא בגרעיני התאים‪.‬‬
‫‪ 1.1‬הפקת תאי סטרומה ממח עצם של עכבר‬
‫תאי מח עצם שהופקו מעכברי זן הבר ומעכברים טרנסגנים נזרעו על צלחות פלסטיק במדיום‪ .‬לאחר יומיים של‬
‫גידול באינקובאטור‪ ,‬מדיום הגידול עם התאים שצפים בו נשפך‪ ,‬והתאים שנדבקו )תאי סטרומה ממח עצם( גודלו‬
‫במדיום גידול טרי‪ .‬בצלחת הגידול נותרה אוכלוסיה הטרוגנית )מבחינה מורפולוגית( של תאים‪ ,‬תאים עגולים‬
‫וקטנים ומאידך תאים ארוכים מאורכים ושטוחים )תמונה מס' ‪ .(13‬לאחר כשלושה‪-‬ארבעה שבועות‪ ,‬התאים נראו‬
‫לרוב כאוכלוסיה הומוגנית )תמונה מס' ‪ ,(13‬עם תאים אלו נעשו כל הניסויים‪ .‬המשכנו לגדל את התאים‪ ,‬תוך כדי‬
‫החלפת מדיום פעמיים בשבוע‪ ,‬עד לארבעה ‪ -‬חמישה חודשים לאחר ההפקה‪.‬‬
‫‪B‬‬
‫‪A‬‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪Bcl-2‬‬
‫‪WT‬‬
‫‪30 µm‬‬
‫תמונה ‪ :13‬תאי סטרומה ממח עצם של עכברים‪ :‬טרנסגנים )‪ (A,B‬ושל‬
‫עכברי זן הבר )‪ (C,D‬לאחר ‪ 3‬שבועות מההפקה‬
‫‪102‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫בעזרת אנליזה של ‪ Western blots‬נמצא כי החלבון ‪ Bcl-2‬מתבטא רק במוחותיהם של העכברים הטרנסגנים‬
‫ואינו מתבטא בעכברים מזן הבר‪ ,‬דבר המעיד על פעילותו של הפרומוטר של ‪ NSE‬בעכברים הטרנסגנים‪ .‬בנוסף‬
‫אין ביטוי של ‪ Bcl-2‬בתאי מח עצם של העכברים הטרנסגנים ולא של העכברים מזן הבר‪ .‬ביטוי של ‪) Neu-N‬סמן‬
‫לתאי עצב( בא לביטוי במוחותיהם של העכברים הטרנסגנים וגם העכברים מזן הבר‪ ,‬ולא בא לביטוי בתאי מח‬
‫העצם של העכברים הטרנסגנים וזן הבר )תמונה ‪.(14‬‬
‫‪Bone marrow‬‬
‫‪stem cells‬‬
‫‪Bcl-2‬‬
‫‪WT‬‬
‫‪Mouse brain‬‬
‫‪Bcl-2‬‬
‫‪WT‬‬
‫‪Mouse NeuN‬‬
‫‪46-48 kDa‬‬
‫‪Human Bcl-2‬‬
‫‪29 kDa‬‬
‫תמונה ‪ :14‬בדיקת ‪ Western blot‬עבור החלבון ההומני ‪ BCL-2‬והחלבון העכברי ‪ NeuN‬ביטוי של ‪ Bcl-2‬ו‪-‬‬
‫‪ NeuN‬בתמצית חלבונים ממוחות ומתאי מוח עצם של עכברים טרנסגנים ומזן הבר‪.‬‬
‫‪ 1.2‬השראת התמיינות תאי מח עצם ממקור עכברי לתאים דמויי תאי עצב‬
‫כחודש לאחר הפקת התאים ממוח העצם התבצעה השראת ההתמיינות לתאים דמויי תאי עצב‪ .‬מצע הגידול‬
‫הוחלף למצע התמיינות שלב ‪ I‬למשך ‪ 48‬שעות‪ .‬לאחר מכן הוחלף למצע התמיינות שלב ‪ .II‬כ‪ 5-‬ו‪ 7-‬שעות לאחר‬
‫תחילת השראת ההתמיינות‪ ,‬ניתן להבחין בתחילתם של שינוי צורתם המורפולוגית בתאי מח העצם‪ ,‬מתאים‬
‫עגולים וקטנים לתאים עם צורה אופיינית לתאי עצב‪ ,‬קרי‪ :‬גוף התא כדורי‪ ,‬והתפתחות שלוחות‪ .‬עם הארכת משך‬
‫זמן ההתמיינות צורתם המורפולוגית של תאי מח העצם הולכת ומשתנה ודומה מורפולוגית לתאי עצב )תמונה‬
‫מס' ‪.(15‬יתרה מכך‪ ,‬נוצרו מגעים בין שלוחות התאים שעברו התמיינות )תמונות ‪ .(15 C,F‬כמו‪-‬כן‪ ,‬לאחר ‪ 24‬שעות‬
‫במדיום התמיינות שלב ‪ II‬רובם של התאים חי כפי שנצפה בצביעת גרעינים עם ‪ .Hoechest / PI‬לאחר ‪ 72‬שעות‬
‫במדיום התמיינות שלב ‪ II‬כ‪ 70%-‬מהתאים שינו את צורתם המורפולוגית לצורת תאים דמויי תאי עצב‪.‬‬
‫‪103‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪7 hr‬‬
‫‪24 hr‬‬
‫‪C‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪30 µm‬‬
‫‪X 300‬‬
‫‪E‬‬
‫‪F‬‬
‫‪24 hr‬‬
‫‪48 hr‬‬
‫‪D‬‬
‫‪48 hr‬‬
‫תמונה מס' ‪ :15‬התמיינות תאי מח עצם מעכבר טרנסגני בוגר לתאי עצב‪ .‬תאי מח עצם מעכבר טרנסגני גודלו‬
‫במדיום גידול כארבעה שבועות )‪ .(A‬מדיום הגידול הוחלף במדיום התמיינות שלב ‪ I‬למשך ‪ 48‬שעות והאחרון‬
‫הוחלף למדיום התמיינות שלב ‪ II‬למשך ‪ 7‬שעות )‪ ,(B‬למשך ‪ 24‬שעות )‪ (C‬ולמשך ‪ 48‬שעות )‪ .(E‬התאים שעברו‬
‫התמיינות למשך ‪ 24‬שעות הודגרו עם ‪ ,Hoechest 33342 / PI‬ניתן להבחין בתאים החיים )כחולים( ובתא מת‬
‫)אדום( ) ‪ ,(F‬גרעיני התאים הצבועים בתמונה‪ F‬מסומנים בחץ בתמונה ‪.C‬‬
‫‪ 1.3‬ביטוי ‪ Bcl-2‬בתאי מח עצם מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב‬
‫באמצעות צביעות אימונוציטוכימיות נמצא שתאי סטרומה ממח העצם של עכברים טרנסגנים אינם מבטאים את‬
‫החלבון ההומני ‪ Bcl-2‬לפני השראת התמיינות‪ .‬אך לאחר השראת ההתמיינות‪ ,‬במקביל להתפתחות שינויים‬
‫מורפולוגים‪ ,‬התאים מבטאים‪) Bcl-2‬תמונה ‪ .(16‬תוצאה זאת מעידה על הפעלתו של הפרומוטר ‪ NSE‬כתוצאה‬
‫מההתמיינות‪ .‬מאידך‪ ,‬החלבון ההומני ‪ Bcl-2‬לא בא לידי ביטוי בתאי מח עצם‪ ,‬מעכברים של זן הבר‪ ,‬שעברו‬
‫התמיינות לתאי עצב למרות שצורתם המורפולוגית השתנתה )תמונה ‪.(17‬‬
‫‪ 1.4‬ביטוי ‪ Neu-N‬בתאי אב של עכברים טרנסגנים וזן הבר שעברו התמיינות לתאים דמויי תאי עצב‬
‫לפני השראת התמיינות של תאי גזע ממח לתאים דמויי תאי עצב‪ ,‬תאים מעכבר טרנסגני והן מזו הבר אינם‬
‫מבטאים ‪ ,Neu-N‬כלומר לתאים אין סמן של תאי עצב‪ .‬מאידך‪ ,‬לאחר השראת ההתמיינות‪,‬במקביל להתפתחות‬
‫שינויים מורפולוגים‪ ,‬חלקם של התאים מבטאים ‪ Neu-N‬הן בתאים מעכברים טרנסגנים והן בזן הבר )תמונה‬
‫‪ .(18‬באמצעות ‪ Western blot‬נמצאה עלייה משמעותית )‪ (Pearson correlation‬בביטוי ‪ Bcl-2‬הומני ) ‪r=0.924,‬‬
‫‪ (p=0.038‬ו‪(r=0.973, p=0.27) NeuN-‬בתאי מח עצם מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות למשך ‪ 24-72‬שעות‬
‫)תמונה ‪ .(19‬מעניין לראות שתאים שלא עברו התמיינות ביטאו רמות נמוכות של ‪ Bcl-2‬הומני ו‪ ,NeuN-‬דבר‬
‫המעיד על הפוטנציאל של תאים מזנכימליים ממח העצם להתמיין בתרבית לתאי עצב )בניסוי הנ"ל נעשה שימוש‬
‫בתאים מזנכימליים שעברו מעל ‪ 6‬פיצולים קרי כחודשיים בתרבית לאחר הפקה מהחיה(‪.‬‬
‫‪104‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪30 µm‬‬
‫‪C‬‬
‫‪A‬‬
‫‪6h‬‬
‫‪control‬‬
‫‪D‬‬
‫‪B‬‬
‫‪48 h‬‬
‫‪II Ab only, 48h‬‬
‫תמונה ‪ :16‬ביטוי של החלבון ההומני ‪ Bcl-2‬בתאי סטרומה ממח עצם של עכברים טרנסגנים שעברו התמיינות‬
‫לתאי עצב‪ .‬לפני השראת ההתמיינות לא נצבעים ל‪ .(A) Bcl-2-‬תאי אב שעברו התמיינות עם חשיפה לנוגדן‬
‫השניוני בלבד )ביקורת שלילית()‪ .(B‬כ‪ 6 -‬שעות לאחר השראת ההתמיינות‪ ,‬תאי מוח העצם נצבעים ל‪ Bcl-2-‬כמו‪-‬‬
‫כן ניתן לזהות תמונה מורפולוגית אופיינית של תאי עצב‪ :‬גוף התא כדורי‪ ,‬ולתא שלוחות מאורכות )‪ .(C‬צביעה ל‪-‬‬
‫‪ Bcl-2‬ותמונה מורפולוגית דומה נצפתה גם אחרי ‪ 48‬שעות )‪.(D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪6h‬‬
‫‪E‬‬
‫‪B‬‬
‫‪A‬‬
‫‪6h‬‬
‫)‪Control (0 h‬‬
‫‪D‬‬
‫‪48 h, II Ab only‬‬
‫‪50 µm‬‬
‫‪48 h‬‬
‫תמונה ‪ :17‬בדיקות אימונוציטוכימיות ל‪ Bcl-2-‬בתאי מוח עצם מעכברים מזן הבר‪ :‬תאי האב מעכבר זן הבר‬
‫לפני השראת ההתמיינות לא נצבעים ל ‪ 6.(A) Bcl-2‬שעות לאחר השראת התמיינות התאים לא נצבעים ל‪Bcl-2 -‬‬
‫למרות שצורתם המורפולוגית של חלק מן התאים השתנתה )‪ 48 .(B,C‬שעות לאחר השראת התמיינות התאים לא‬
‫נצבעים ל‪ .(D) Bcl-2 -‬תאי אב שעברו התמיינות עם חשיפה לנוגדן השניוני בלבד )ביקורת שלילית( )‪.(E‬‬
‫‪105‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫תמונה ‪ Neu-N :18‬מתבטא בתאי מחוח עצם מעכברים שעברו התמיינות לתאי עצב‪ .‬תאי מח עצם מעכבר‬
‫טרנסגני )‪ (A‬ומזן הבר )‪ (C‬שלא עברו התמיינות לתאי עצב לא נצבעים ל‪ .NeuN -‬לאחר כ‪ 6-‬שעות של התמיינות‬
‫צורתם המורפולוגית של חלקם מהתאים השתנתה כמו‪-‬כן בצביעה אימונוציטוכימית התאים שעברו התמיינות‬
‫נצבעו ל‪ ,NeuN-‬הן התאים מעכבר טרנסגני )‪ (B‬והן התאים מזן הבר )‪.(D‬‬
‫‪WT‬‬
‫‪brain‬‬
‫‪mouse NeuN‬‬
‫‪Tg-mice bone marrow differentiated cells:‬‬
‫‪72h‬‬
‫‪48h‬‬
‫‪24h‬‬
‫‪0‬‬
‫‪A‬‬
‫‪Tg‬‬
‫‪brain‬‬
‫‪66 kDa‬‬
‫‪human Bcl-2‬‬
‫‪29 kDa‬‬
‫‪43 kDa‬‬
‫‪Actin‬‬
‫‪5‬‬
‫‪4‬‬
‫‪Bcl-2‬‬
‫‪Neu-N‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫)‪Protein / Actin (A.U.‬‬
‫‪B‬‬
‫‪0‬‬
‫‪80‬‬
‫‪60‬‬
‫‪20‬‬
‫‪40‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫תמונה ‪ :19‬עלייה ברמות הביטוי של ‪ Bcl-2‬ו‪ NeuN -‬בתאי מח העצם מעכברים טרנסגים שעברו התמיינות‬
‫לתאי עצב‪ :A .‬תמונת ג'ל אלקטרופורסיס של תמציות חלבונים ממוחות עכברים טרנסגניים וזן הבר וכן‬
‫מתמציות חלבונים )מעכברים טרנסגנים( של תאים בשלבי ההתמיינות‪ :B .‬כימות תוצאות הג'ל בהשוואה לביטוי‬
‫חלבון האקטין‪ .‬יחידות ציר ‪ Y‬הינן היחסים בין רמת הביטוי של ‪ Bcl-2‬או ‪ NeuN‬לבין ‪.actin‬‬
‫‪106‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ 1.5‬תאים מזנכימלים מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב עמידים לעקה‬
‫מכיוון שהתאים המזנכימלים מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב מבטאים ביתר את הגן האנטי‬
‫אפופטוטי‪ bcl-2 ,‬הומני‪ ,‬נבדק האם תאים אלו עמידים מפני רעילות של ‪ .dopamine‬לאחר כ‪ 6-‬שעות התמיינות‬
‫של תאים מעכבר טרנסגני ומזן הבר‪ ,‬הוסף ‪ dopamine‬בריכוזים הולכים ועולים ‪ 10-500µM‬למשך ‪ 18‬שעות‬
‫נוספות‪ .‬בדיקת שרידותם של התאים נעשתה ע"י צביעה כפולה בעזרת ‪ Hoechst 33342‬ו‪propidium iodide -‬‬
‫)‪ .(PI‬נמצא שתאים מזנכימלים שמקורם מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב עמידים יותר )באופן‬
‫מובהק( מפני עקה שנגרמת ע"י ‪ dopamine‬לעומת התאים מזן הבר‪ .‬כלומר החלבון ההומני ‪ Bcl-2‬שבא לידי‬
‫ביטוי בתאים מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות הציל את התאים מפני מוות שנגרם ע"י ‪) dopamine‬תמונה‬
‫‪ .(20‬דיון מורחב בתוצאות ובמשמעותן ניתן למצוא במאמר‪.Levy et al. J Mol Neurosci. 21:121-132 :‬‬
‫תמונה מס' ‪ :20‬תאים מזנכימלים מעכברים טרנסגנים שעברו התמיינות לתאי עצב עמידים יותר לעקה מאשר‬
‫תאים מעכברים מזן הבר‪ :A .‬חשיפת תאים מזנכימלים שעברו התמיינות לתאי עצב ל‪200 µM dopamine -‬‬
‫למשך ‪ 18‬שעות‪ .‬התאים נצבעו צביעה כפולה עם ‪) Hoechst 33342‬צבע כחול‪ ,‬תא חי( ועם ‪propidium iodide‬‬
‫)צבע אדום‪ ,‬תא מת(‪ :B .‬היחס בין התאים המתים )צביעה אדומה‪ (PI ,‬לכלל התאים בתרבית‪ ,‬התוצאות מוצגות‬
‫כממוצע ‪ ±‬שגיאת תקן‪.‬‬
‫‪107‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .2‬שינוי ב‪ cell cycle-‬בעקבות השראת התמיינותם של תאי גזע ממח העצם לתאים דמויי‪-‬תאי‬
‫עצב‬
‫תאי גזע ממח העצם הופקו מעכברים טרנסגנים "ירוקים" ‪ B5/EGFP‬המבטאים ביתר את הגן ‪enhanced green‬‬
‫)‪ ,(Hadjantonakis et al., 1998) fluorescent protein (EGFP‬נזרעו בצלחות פלסטיק במדיום גידול )ראה פרק‬
‫שיטות וחומרים(‪ .‬לאחר ‪ 48‬שעות של גידול התאים באינקובאטור‪ ,‬מדיום הגידול נשפך ואיתו כל התאים הצפים‬
‫שלא נדבקו לקרקעית הפלסטיק של צלחת הגידול‪ .‬כ‪ 1%-‬מהתאים נדבקו לצלחות הפלסתיק והמשיכו לגדול‬
‫במדיום הגידול‪ .‬כפי שניתן להתרשם מתמונה ‪ ,(A) 21‬לאחר כשלושה‪-‬ארבעה שבועות בצלחת הגידול‪ ,‬נותרה‬
‫אוכלוסיה הטרוגנית של תאים חלקם עגולים ואחרים מאורכים ושטוחים‪ .‬התאים נראים במיקרוסקופ פלורסנטי‬
‫בצבע ירוק )תמונה ‪ –(21B‬ניסיונות ההתמיינות נעשו בתאים אלו‪ .‬חשיפתם של התאים המזנכימליים ממח עצם‬
‫של עכבר טרנסגני ל‪ EGFP-‬ל"מדיום התמיינות שלב ‪ ,"I‬למשך ‪ 24-48‬שעות ולאחריו ל"מדיום התמיינות ‪"II‬‬
‫)ראה פרק שיטות וחומרים(‪ ,‬גרמה לתאים לשינוי מובהק מבחינה מורפולוגית ולהדמות לתאי עצב )תמונה ‪.(21C‬‬
‫תכולת ה‪ DNA-‬נמדדה עבור מבחן "מחזור התא" )‪ 24 (cell cycle‬שעות לאחר השראת ההתמיינות‪ .‬ניתן לראות‬
‫)תמונה ‪ (21D‬כי התקבלו שני שיאים כשהשמאלי )‪ (G0/G1‬גבוה יותר בצורה משמעותית מן הימני )‪.(G2/M‬‬
‫נמצא כי בשלב ‪ G0/G1‬היו יותר תאים ממוינים )‪ (80%‬מלא ממוינים )‪ (56.6%‬ובשלב ‪ G2/M‬היו יותר תאים לא‬
‫ממוינים )‪ (28%‬מממוינים )‪ ,(13.6%‬ההבדלים בין קבוצת התאים שעברה התמיינות לבין הקבוצה שלא עברה‬
‫התמיינות היו מובהקים‪ .‬כלומר‪ ,‬ניתן להסיק שמדיום ההתמיינות גרם לתאים להפסיק להתחלק‪ ,‬מציאות‬
‫האופיינית לתאי עצב‪ .‬יש לציין שאחרי ‪ 24‬שעות של התמיינות אוכלוסיית התאים הטרוגנית )תמונה ‪ ,(21C‬חלק‬
‫מהתאים התמיינו וחלק נמצא עדיין בשלבים שונים של ההתמיינות ולכן במבחן "מחזור התא" נמצא שרק‪80%-‬‬
‫מהתאים הם בשלב ‪) G0/G1‬ולא אחוז גבוהה יותר(‪ .‬באזור ראשית הצירים ניתן לראות כי יש מעט אירועים של‬
‫שברי תאים‪ ,‬אפופטוזיס וכדומה כלומר ככלל התאים היו שלמים וחיים‪.‬‬
‫‪108‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪Undifferentiated‬‬
‫‪Undifferentiated‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪C‬‬
‫‪D‬‬
‫‪Red – undifferentiation‬‬
‫‪Black- differentiation‬‬
‫‪G0/G1‬‬
‫‪G2/M‬‬
‫‪Differentiation‬‬
‫תמונה מס' ‪ :21‬תאי גזע ממח העצם של עכבר טרנסגני ל‪ EGFP-‬מתמיינים לתאים דמויי תאי עצב‪ (A .‬תאי גזע‬
‫שלשה שבועות לאחר ההפקה )מיקרוסקופ אור(‪ (B .‬תאי גזע שלשה שבועות לאחר ההפקה )מיקקוסקופ‬
‫פלורסנטי(‪ (C .‬תאי גזע לאחר השראת התמיינות לתאי עצב עם "מדיום התמיינות ‪ "II‬למשך ‪ 24‬שעות )‪(D (X150‬‬
‫בחינת "מחזור התא" באמצעות ‪ FACS‬בתאים שעברו או שלא עברו התמיינות‪.‬‬
‫‪109‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .3‬הפקת תאי סטרומה ממח עצם אנושי‬
‫תאי מח עצם שהופקו מאנשים בריאים הופרדו על גבי גרדיאנט סוכרי )על מנת להרחיק את תאי הדם‬
‫ופולימורפונוקלארים( ונזרעו על צלחות פלסטיק במדיום גידול )ראה פרק שיטות וחומרים(‪ .‬לאחר ‪ 48‬שעות של‬
‫גידול התאים באינקובאטור‪ ,‬מדיום הגידול נשפך ואיתו כל התאים הצפים שלא נדבקו לקרקעית הפלסטיק של‬
‫צלחת הגידול‪ .‬כ‪ 1%-‬מהתאים נדבקו לצלחות הפלסטיק והמשיכו לגדול במדיום הגידול‪ .‬אלו התאים‬
‫המזנכימליים ממח העצם‪ .‬כפי שניתן להתרשם מתמונה ‪ ,(A-C) 22‬בצלחת הגידול נותרה אוכלוסיה הטרוגנית של‬
‫תאים דמויי פיברובלסטיים שרובם מאורכים ושטוחים וחלקם צרים או מפושטים‪ .‬בנוסף‪ ,‬נמצא מיעוט תאים‬
‫עגולים וקטנים )תמונה ‪ .(22A‬אומנם לאחר כשלושה‪-‬ארבעה שבועות‪ ,‬התאים נראים לרוב כאוכלוסיה הומוגנית‬
‫של תאים דמוי פיברובלסטים )תמונה ‪ – [fibroblast-like adherent cells] (22D‬ניסיונות ההתמיינות נעשו‬
‫בתאים אלו‪ .‬התאים גודלו ב"מדיום גידול"‪ ,‬תוך כדי החלפת מדיום פעמיים ‪ -‬שלש בשבוע‪ ,‬עד לחמישה חודשים‬
‫וכ‪ 20-‬פיצולים לאחר הפקתם ממח העצם‪.‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫תמונה מס' ‪ : 22‬תאי סטרומה ממח עצם אנושי‪ .‬שבועיים בתרבית גידול‬
‫)‪) (A,B,C‬הגדלה ‪ .(×200‬לאחר שישה פיצולים )‪) (D‬הגדלה ‪ . (×100‬החצים‬
‫מסמנים את צורות התאים השונות‪.‬‬
‫‪ .4‬אפיון תאי מח עצם אנושי‬
‫‪ 4.1‬אפיון סמנים ממברנליים באמצעות ‪FACS‬‬
‫אנטיגנים על פני דופן התאים שהופקו ממח עצם אנושי נבדקו עם נוגדנים המצומדים לחומרים פלורוסנטים‬
‫באמצעות סורק תאים )‪ (FACS‬מייד לאחר הפקתם‪ ,‬וכשלושה שבועות )מיום ההפקה( לאחר גדילתם במדיום‬
‫גידול בתרבית‪ .‬כאמור במבוא‪ ,‬מאחר ולא ידוע כיום על סמן ייחודי חד ערכי לתאים מזנכימליים ממח העצם‪,‬‬
‫נעשה שימוש במגוון נוגדנים כנגד אנטיגנים בדופן התא שתוארו בספרות כמופעים על תאי גזע מזנכימליים ממח‬
‫‪110‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
‫ מובא סיכום של האנטיגנים שנבדקו‬6 ‫ בטבלה‬.‫ לעומת סמנים אחרים שלא דווח על הופעתם בתאים אלו‬,‫עצם‬
2-3 ‫ מציין נוכחות או העדר נוכחות של סמן על פני דופן התא( )התוצאות המובאות הינן ממוצעים של‬-/+)
.(‫בדיקות שונות‬
‫ אנטיגנים על פני דופן התא שנבדקו בתאים שהופקו ממח עצם אנושי‬: 6 ‫טבלה‬
Antigen
Presence in
hematopoietic
cells
CD5
+
CD11b
+
CD19
CD20
CD29
(integrin
1β)
+
+
CD34
+
Presence in a
specific cells
Presence in
bone
marrow
stromal
cells
Mature T
lymphocytes
Granulocytes,
monocytes/macrophages
B cells
B lymphocytes
Leukocytes
+
CD44
(Pgp1)
+
CD45
+
CD56 NCAM
-
CD90
(Thy1)
+/-
CD105
(SH2)
-
Berland 2002
unchecked
0%
-
Woodbury 2000
unchecked
0%
-
Shur 2002
Tedder 1994
Meirelles 2003;
Schwartz 2003;
Xu 2004
Meirelles 2003;
Schwartz 2003;
Xu 2004
Colter 2001;
Meirelles 2003;
Schwartz 2003;
Xu 2004
Meirelles 2003;
Schwartz 2003;
Xu 2004
8.8 %
unchecked
1.4%
0%
53%
99%
unchecked
1.9%
94
89%
47.5%
1%
-
Leukocytes,
erythrocytes
+
Leukocytes
(leukocyte common
antige)
NK cells
bone marrow
progenitor cells,
brain tissues
Endothelial cells,
in vitro activated
macrophages
Percent that was found in
this study (average)
Immediately
After 3
after
weeks in
extraction
cell
culture
-
+
Hematopoietic
precursors
References
-+
Meirelles 2003
unchecked
25%
+
Woodbury 2000;
Schwartz 2003;
Pittenger 2004
unchecked
77%
+
Colter 2001; Xu
2004
3.5%
99%
‫ שגדלו בתרבית‬,‫אפיון האנטיגנים על פני דופן תאי מח עצם‬
‫ בוצע על האוכלוסייה‬,‫במדיום הגידול במשך שלשה שבועות‬
‫העיקרית אשר מוגדרת ומאופיינת מבחינת גודל וגרגור התאים‬
R1
‫ לא בוצע אפיון של אנטיגנים על אוכלוסייה‬.(23 ‫ תמונה‬R1 ‫)אזור‬
.(23 ‫ מבחינת גודל וגרגור )תמונה‬R1 ‫שמחוץ לתחום של‬
‫ תאי מח עצם שגדלו‬.‫ גודל וגרגור‬,‫ אפיון תאי מח עצם‬:23 ‫תמונה‬
‫ כל‬.(‫בתרבית במשך שלשה שבועות במדיום גידול )כמובא בשיטות‬
‫הניסיונות של אפיון אנטיגנים על פני דופן התאים בוצעו על אוכלוסיית‬
.FACS ‫ בוצע באמצעות מכשיר‬.R1
111
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫אפיון האנטיגנים על פני דופן התאים מיד לאחר הפקתם ממח העצם אנושי )קרי‪ ,‬תאים מונונוקלארים שהופקו‬
‫בעזרת גרדיאנט סוכרי‪ ,‬ראה שיטות( מצביע על כך‪ ,‬שכמחצית התאים )‪ (47.5%‬מבטאים סמן לתאים‬
‫המטופואטיים ‪) CD45‬דוגמא לתוצאה בתמונה ‪ ,(24‬מאידך‪ ,‬לאחר כשלושה שבועות בתרבית‪ ,‬הסמנים של‬
‫התאים ההמטופואטיים כדוגמת ‪) CD5, CD11b, CD19, CD20 CD34, CD45‬תמונה ‪ (24‬נעלמו כמעט‬
‫לחלוטין‪ .‬כלומר ישנו שינוי מהותי באוכלוסיית התאים‪ .‬השינוי נובע מאופן הפקת התאים המזנכימלים וגידולם‬
‫בתרבית‪ .‬לאחר ‪ 24-48‬השעות הראשונות מזריעת התאים‪ ,‬לאחר ההפקה ממח העצם‪ ,‬כל התאים הצפים במדיום‬
‫הגידול הורחקו – וברובם מדובר בתאים המטופואטים‪ ,‬ונשארו לגידול רק התאים הדבוקים למצע הפלסתיק‪.‬‬
‫תאים אלו עברו העשרה בתרבית הגידול כך שבסופו של תהליך בוצעה סלקציה שלילית לתאים ההמטופואטים‪.‬‬
‫תמונה ‪ :24‬מעקב אחר הופעת אנטיגנים על פני דופן תאי מח עצם אנושיים‪ .‬מעקב אחרי ‪ CDs‬ספציפיים בתאים‬
‫ממח עצם מייד לאחר הפקתם ולאחר ‪ 3‬שבועות גדילה בתרבית‪ .‬נעשה שימוש בנוגדים ראשוניים המצומדים‬
‫לפלורופואר )‪ FITC‬או ‪ ,(PE‬או בנוגדים שניוניים המצומדים ל‪ FITC-‬או ‪) PE‬צבע האותיות בטבלה מסמל את‬
‫צבע הפלורופואר‪ ,‬ירוק או אדום(‪ .‬האנליזה בוצעה באמצעות ‪ .FACS‬האחוזים מייצגים את מספר התאים‬
‫המבטאים את הסמן מעבר לצביעה עם נוגדן לא ספציפי בעל אותו איזוטייפ‪ .‬בעמודה שמאלית מתואר אפיון של‬
‫סמנים אנטיגנים מייד לאחר הפקת התאים ממח העצם אנושי בגרדיאנט פיקול‪ .‬בעמודה ימנית מתוארים אותם‬
‫אנטיגנים שנבדקו בתאים אחרי שלושה שבועות בתרבית‪] .‬התמונה מתפרסת על פני ‪ 3‬עמודים‪. [112-114 ,‬‬
‫‪Human bone marrow stromal cells after 3‬‬
‫‪weeks in cell culture‬‬
‫‪Mononuclear cells immediately after‬‬
‫‪extraction from human bone marrow‬‬
‫‪Antigen‬‬
‫‪Hollow histograms‬‬
‫‪demonstrate‬‬
‫‪background‬‬
‫‪fluorescence‬‬
‫‪Unchecked‬‬
‫‪CD5‬‬
‫‪Hollow histograms‬‬
‫‪demonstrate‬‬
‫‪background‬‬
‫‪fluorescence‬‬
‫‪Unchecked‬‬
‫‪CD11b‬‬
‫‪4.9%‬‬
‫‪CD19‬‬
‫‪M1‬‬
‫‪112‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
Antigen
Mononuclear cells immediately after
extraction from human bone marrow
Human bone marrow stromal cells after 3
weeks in cell culture
Hollow histograms
demonstrate
background
fluorescence
CD20
Unchecked
98.1%
62.2%
CD29
CD34
M1
M1
Unchecked
89%
M1
93.75%
CD44
53.5%
M1
CD45
25.2%
M1
CD56
Unchecked
113
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪Human bone marrow stromal cells after 3‬‬
‫‪weeks in cell culture‬‬
‫‪Mononuclear cells immediately after‬‬
‫‪extraction from human bone marrow‬‬
‫‪Antigen‬‬
‫‪Unchecked‬‬
‫‪CD90‬‬
‫‪77%‬‬
‫‪92.2%‬‬
‫‪M1‬‬
‫‪8%‬‬
‫‪M1‬‬
‫‪CD105‬‬
‫)‪(CD29‬‬
‫)‪(CD29‬‬
‫‪89%‬‬
‫‪42.6%‬‬
‫‪10.49%‬‬
‫‪CD45_ /‬‬
‫‪CD29+‬‬
‫‪35.85%‬‬
‫‪11.06%‬‬
‫)‪(CD45‬‬
‫)‪(CD29‬‬
‫)‪(CD105‬‬
‫‪3.5%‬‬
‫)‪(CD29‬‬
‫‪96%‬‬
‫)‪(CD45‬‬
‫‪CD29+ /‬‬
‫‪CD105+‬‬
‫)‪(CD105‬‬
‫בנוסף לכך‪ ,‬לאחר שלושה שבועות בתרבית תאים‪ ,‬אחוז גבוה של התאים שגדלו דבוקים למצע הפלסטיק‬
‫מבטאים סמנים )על פני דופן התא( הידועים כאנטיגנים אופייניים לתאי גזע מזנכימליים כגון‪CD29 (99%), :‬‬
‫)‪ .CD44 (89%), CD90 (77%), CD105 (99%‬בצביעה כפולה של תאי מח עצם מייד לאחר הפקתם ל‪CD45-‬‬
‫)סמן לתאים המטופואטיים( ו‪) CD29-‬סמן אשר מאפיין גם אוכלוסיית תאי סטרומה(‪ ,‬ניתן לראות כי מתוך כ‪-‬‬
‫‪ 50-60%‬תאים חיוביים ל‪ ,CD29 -‬כ‪ 80%-‬מתוכם חיוביים גם ל‪ .CD45-‬מאידך‪ ,‬לאחר שלשה שבועות בתרבית‬
‫‪ 89%‬מהתאים הם ‪ CD29+ / CD45-‬ו‪ 96%-‬מהתאים הם ‪.CD29- / CD105+‬‬
‫‪114‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫מצרף התוצאות של אפיון האנטיגנים על פני דופן התאים מצביע על כך שלאחר שלושה שבועות בתרבית הועשרו‬
‫התאים המבטאים סמנים לתאים מזנכימליים )‪ ,(CD29, CD44, CD90, CD105‬ולעומתם ירד משמעותית‬
‫מספר התאים המבטאים סמנים לתאים המטופואטיים )‪.(CD5, CD11b, CD19, CD20, CD34, CD45‬‬
‫לסיכום גרפי של השינויים בהופעת האנטיגנים ראה תמונה ‪.25‬‬
‫∗∗∗‬
‫∗∗∗‬
‫‪p=0.09‬‬
‫‪98.69‬‬
‫∗∗∗‬
‫‪99.2‬‬
‫‪93.75‬‬
‫∗∗‬
‫‪88.84‬‬
‫‪96.15‬‬
‫‪100‬‬
‫‪88.63‬‬
‫‪Mononuclear cells‬‬
‫‪90‬‬
‫‪76.56‬‬
‫‪80‬‬
‫‪Mesenchymal stem cells‬‬
‫‪52.81‬‬
‫∗∗∗‬
‫‪% positive cells‬‬
‫‪70‬‬
‫‪60‬‬
‫‪47.53‬‬
‫‪50‬‬
‫‪40‬‬
‫‪30‬‬
‫∗‬
‫‪20‬‬
‫‪8.84‬‬
‫‪1.41‬‬
‫‪8.66‬‬
‫‪3.51‬‬
‫‪1.88‬‬
‫‪1.01‬‬
‫‪10‬‬
‫‪3.51‬‬
‫‪0‬‬
‫‪19‬‬
‫‪45‬‬
‫‪34‬‬
‫‪5‬‬
‫‪D‬‬
‫‪D‬‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪+/‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪D‬‬
‫‪D‬‬
‫‪10‬‬
‫‪90‬‬
‫‪44‬‬
‫‪D‬‬
‫‪D‬‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪10‬‬
‫‪29‬‬
‫‪5+‬‬
‫‬‫‪45‬‬
‫‪D‬‬
‫‪+/‬‬
‫‪C‬‬
‫‪29‬‬
‫‪29‬‬
‫‪D‬‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫תמונה ‪ :25‬השוואת הימצאותם של סמנים ייחודיים על פני דופן התאים מייד לאחר הפקת ממח העצם‬
‫)‪ (mononuclear‬לעומת התאים שגדלו שלשה שבועות בתרבית )‪ .(mesenchymal stem cells‬האנליזה בוצעה‬
‫באמצעות ‪) FACS‬ראה תמונות ‪.(23 ,22‬התוצאות המוצגות כממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן )‪∗ p=0.051, ∗∗ .(n=3‬‬
‫‪.p<0.01, ∗∗∗ p<0.0005‬‬
‫‪ 4.2‬קליטה נמוכה של ‪ Hoechst 33342‬ע"י תאים מזנכימליים‬
‫כמתואר בפרק המבוא בסעיף ‪ ,8.3.5.1‬תאי גזע מבוגר כדוגמת ‪ side population cells‬מכילים כמות גדולה של‬
‫תעלות )‪ multidrug resistance protein (mdr‬בדופן הגרעין ובעקבות כך רמת הצביעה ב‪) Hoechst 33342-‬צבע‬
‫פלורוסנטי כחול הנקשר ל‪ DNA-‬של תאים חיים( נמוכה‪ ,‬מכיוון שתעלות ‪ mdr‬מוציאות את הצבע מחוץ לגרעין‪.‬‬
‫על מנת לאפיין את התאים שעבדו עימם ‪ 200-10000‬תאים מזנכימלים ממח עצם אנושי נזרעו בכל בארית של‬
‫פלטת ‪ .96‬לאחר ‪ 72‬שעות‪ ,‬הוחלף מדיום הגידול למדיום זהה עם ‪ 2%‬סרום‪ ,‬והתאים הודגרו עם ‪5µg/ml‬‬
‫‪ Hoechst 33342 ± 50µM verapamil‬למשך ‪ 90‬דקות ב‪ .37°C-‬כביקורת‪ ,‬השתמשנו בתאים ‪SH-SY5Y‬‬
‫‪ .neuroblastoma‬השוואה בין תאי גז ממח העצם לבין נוירובלסטומה )שאינם תאי גזע( הראתה עוצמת‬
‫‪115‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫פלורסנציה גבוהה יותר באופן מובהק בנוירובלסטומה )‪ (p≤0.0012 at 2000-10000 cells per well‬ושהעוצמה‬
‫הולכת וגדלה ככל שיש יותר תאים )תמונה ‪ .(26‬בנוסף‪ ,‬בשני סוגי התאים קיימת קורלציה ליניארית בין מספר‬
‫התאים לעוצמת הצבע‪ ,‬לתאים ממח העצם ‪ ,p=0.013 r=0.974‬עבור נוירובלסטומה ‪ .p=0.016 r=0.976‬כמו‪-‬כן‪,‬‬
‫כאשר הוסף ‪ verapamil‬עוצמת הצבע עלתה בתאים ממח העצם )בדומה לתאי גזע מטיפוס ‪ (SP‬אך ההבדל בין‬
‫‪ Hoechst‬לבין ‪ Hoechst + verapamil‬לא נראה באופן שווה בכל ריכוזי התאים‪ .‬מאידך בנוירובלסטומה לא ניכר‬
‫שינוי‪ .‬כלומר‪ ,‬ניסוי צביעת ‪ Hoechst 33342‬הנו כלי נוסף לאפיין את תאי הגזע שהופקו ממח עצם אנושי‪.‬‬
‫‪7000‬‬
‫‪Bone marrow‬‬
‫‪p<0.11‬‬
‫‪Hoechst only‬‬
‫‪Hoechst+Verapamil‬‬
‫‪5000‬‬
‫‪4000‬‬
‫‪p<0.036‬‬
‫‪3000‬‬
‫‪p<0.11‬‬
‫‪p<0.001‬‬
‫‪2000‬‬
‫‪1000‬‬
‫)‪Intensity of dye (A.U‬‬
‫‪6000‬‬
‫‪0‬‬
‫‪10000‬‬
‫‪4000‬‬
‫‪6000‬‬
‫‪No. Of Cells‬‬
‫‪2000‬‬
‫‪50000‬‬
‫‪Neuroblastoma‬‬
‫‪35000‬‬
‫‪30000‬‬
‫‪25000‬‬
‫‪20000‬‬
‫‪15000‬‬
‫‪10000‬‬
‫)‪Intensity of dye (A.U‬‬
‫‪Hoechst only‬‬
‫‪Hoechst+Verapamil‬‬
‫‪45000‬‬
‫‪40000‬‬
‫‪5000‬‬
‫‪0‬‬
‫‪10000‬‬
‫‪4000‬‬
‫‪6000‬‬
‫‪No. Of Cells‬‬
‫‪2000‬‬
‫תמונה ‪ :26‬מבחן ‪ microtiter plate‬לקליטת ‪ .Hoechst 33342‬מבחן קליטת הצבע‬
‫בוצע בתאים מזנכימליים ממח העצם ובנוירובלסטומה )תאים שאינם תאי גזע(‪.‬‬
‫יחידות ציר ‪ Y‬הינן עוצמת הצבע ביחידות אקראיות‪ .‬התוצאות מוצגות כממוצע‬
‫‪±‬שגיאת התקן‪.‬‬
‫‪116‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .5‬השראת התמיינות של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי לתאים דמויי תאי עצב‬
‫‪ 5.1‬שינוי צורני )מורפולוגי( של תאים מזנכימליים לתאים דמויי תאי עצב‬
‫מהלך התרבותם של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי והתמיינותם לתאים דמויי תאי עצב נעשה בשלושה‬
‫שלבים עיקריים‪ .differentiation stage II (3 differentiation stage I (2 proliferation stage (1 :‬השלבים‬
‫מוכתבים ע"י מדיום הגידול בו התאים שוהים )סעיפים ‪ 2.1‬ו‪ 2.3-‬בפרק חומרים ושיטות(‪ .‬חשיפתם של התאים‬
‫המזנכימליים ממח עצם אנושי ל"מדיום התמיינות שלב ‪ ,"I‬הכולל גורמי גידול כדוגמת ‪ ,bFGF‬למשך ‪24-48‬‬
‫שעות ולאחריו ל"מדיום התמיינות ‪ "II‬או ל"מדיום התמיינות ארוך טווח"‪ ,‬הכוללים העלאת רמות ‪ cAMP‬תוך‬
‫תאי‪ ,‬תוספת של נוגדי חמצון‪ ,‬חומצה רטינואית‪ N-2 supplement ,‬ופקטורים נוירוטרופיים שונים )ראה פרק‬
‫שיטות וחומרים(‪ ,‬גרמה לתאים לשינוי מובהק מבחינה מורפולוגית ולהדמות לתאי עצב )תמונה ‪ .(27‬גוף התא‬
‫התכווץ‪ ,‬כלומר התכנסות הציטופלסמה לכיוון גרעין התא )כשעה וחצי לאחר הוספת ‪,‬מדיום התמיינות ‪("II‬‬
‫)תמונה ‪ .(27B‬במהלך ‪ 2-4‬שעות לאחר מכן‪ ,‬גוף התא נהיה עגול )‪ (spherical‬יותר )תמונה ‪ ,(27D-E‬התאים נהיים‬
‫ביפולרים )‪ (bipolar‬או מולטיפולרים )‪ (multipolar‬ופיתחו שלוחות ארוכות ודקות )תמונה ‪ (27D-H‬ולעיתים אף‬
‫מתפצלות )תמונה ‪ .(27C-D‬יתרה מכך‪ ,‬לאחר כ‪ 24-‬שעות נצפו רשתות של השלוחות הנ"ל בין התאים )תמונה‬
‫‪ .(27F‬בנוסף‪ ,‬בחלק מהשלוחות התפתחות "דליות" )‪) (varicosities‬תמונה תמונה ‪ ,(27G‬תופעה אופיינית לתאי‬
‫עצב‪ .‬שינוי המורפולוגיה מ‪ fibroblast like cells-‬ל‪ neuron-like cells-‬נצפתה בכ‪ 80%-‬של התאים כעבור ‪48‬‬
‫שעות מהחלפת "מדיום התמיינות ‪ "I‬ל"מדיום התמיינות ‪ ,"II‬מאידך לאחר ‪ 96‬שעות רוב התאים לא שרדו‪.‬‬
‫בעקבות כך‪ ,‬כל המבחנים הביוכימים והמולקולאריים בוצעו עד ‪ 96‬שעות ממועד הוספת "מדיום התמיינות ‪."II‬‬
‫‪117‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪Undifferentiated‬‬
‫‪B‬‬
‫‪C‬‬
‫‪3 hr‬‬
‫‪15 hr‬‬
‫‪E‬‬
‫‪F‬‬
‫‪48 hr‬‬
‫‪D‬‬
‫‪24 hr‬‬
‫‪48 hr‬‬
‫‪I‬‬
‫‪72 hr‬‬
‫‪A‬‬
‫‪G‬‬
‫‪H‬‬
‫‪48 hr‬‬
‫‪48 hr‬‬
‫תמונה ‪ .From fibroblast like cells to neuron-like cells :27‬השראת התמיינות עצבית לתאים מזנכימליים‬
‫ממח עצם אנושי‪ .‬התאים טופלו ב"מדיום התמיינות ‪ "I‬למשך ‪ 24-48‬שעות ולאחריו ב"במדיום התמיינות ‪"II‬‬
‫לפרקי זמן שונים‪ (A .‬תאים מזנכימליים ללא התמיינות‪ (B .‬התכנסות הציטופלסמה לכיוון גרעין התא לאחר ‪3‬‬
‫שעות‪ (C-D .‬התפצלות שלוחות‪ (E .‬אוכלוסיית תאים הטרוגנית לאחר ‪ 48‬שעות ב"מדיום התמיינות ‪(F ."II‬‬
‫התפתחות רשת בין תאית )בדומה לרשת עצבית(‪ (G .‬התפתחות "דליות" )‪ (H .(varicosities‬שלבי התמיינות‬
‫שונים‪ 72 (I .‬שעות לאחר הוספת "מדיום התמיינות ‪ ."II‬צולם במיקרוסקופ ‪ ,phase-contrast‬הגדלה ‪.X 100-200‬‬
‫‪ 5.2‬הפסקת חלוקת תאים מזנכימליים אנושיים בעקבות השראת התמיינות‬
‫באופן טבעי תאי עצב ממוינים ובוגרים אינם ממשיכים להתחלק‪ .‬במטרה לבדוק האם תאים מזנכימליים ממח‬
‫עצם אנושי שעברו התמיינות עצבית ממשיכים להתחלק בצורה האופיינית לתאים לא ממוינים‪ ,‬או מאידך אינם‬
‫מתחלקים‪ ,‬הם הודגרו בנוכחות ‪ .3H - Thymidine‬כפי שניתן להתרשם בתמונה ‪ ,28‬רמת השגשוג של התאים‪,‬‬
‫כפי שנלמדת מכמות ‪ DNA‬המסומן בטימידין רדיואקטיבי‪ ,‬יורדת בצורה דרמטית תוך ‪ 40‬שעות של הדגרה‬
‫ב"מדיום התמיינות ‪ "I‬לכדי ‪ 40%‬לעומת הביקורת וב"מדיום התמיינות ‪ "II‬ל‪ .0% -‬נמצא שתהליך השגשוג‪,‬‬
‫האופייני לתאים לא ממוינים פוחת באופן מובהק כתוצאה מהדגרת של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי‬
‫‪118‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫ב"מדיום התמיינות ‪ "I‬ומפסיק לאחר הדגרה ב"מדיום התמיינות ‪ ."II‬כלומר "מדיום התמיינות ‪" "I‬מכין את‬
‫הקרקע" להתמיינות עצבית בשלה יותר ל"מדיום התמיינות ‪.II‬‬
‫‪Differentiation medium I‬‬
‫‪Differentiation medium II‬‬
‫‪100‬‬
‫‪60‬‬
‫‪40‬‬
‫‪20‬‬
‫‪Thymidine incorporation‬‬
‫)‪average (% of control‬‬
‫‪80‬‬
‫‪0‬‬
‫‪45‬‬
‫‪40‬‬
‫‪35‬‬
‫‪30‬‬
‫‪25‬‬
‫‪20‬‬
‫‪15‬‬
‫‪10‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪Time (hours in differentiation medium II‬‬
‫תמונה ‪ :28‬חלוקה של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי במהלך הדגרתם עם מדיום התמיינות‪ .‬התאים‬
‫הודגרו עם מדיום התמיינות ‪ I‬בלבד או לחילופין עם מדיום התמיינות ‪) II‬לאחר הדגרה במדיום התמיינות‪(I‬‬
‫לפרקי זמן שונים‪ .‬התוצאות מוצגות כממוצע ‪±‬שגיאת התקן‪) .‬מבחן ‪.(thymidine incorporation‬‬
‫‪ 5.3‬תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שנחשפו למדיום התמיינות עצבי מבטאים תעתיקי ‪ RNA‬ייחודיים‬
‫לתאי עצב‬
‫במטרה לעקוב אחר השינויים בביטוי הגנטי בתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שעברו התמיינות לתאים דמויי‬
‫תאי עצב‪ ,‬הופק ‪) total RNA‬בשיטת ‪ (guanidine isothiocyanate‬מהתאים בזמנים שונים )‪ 3-96‬שעות( במהלך‬
‫ההתמיינות‪ .‬בוצעה אנליזה איכותית וסמי‪-‬כמותית באמצעות ‪ RT-PCR‬וכמותית באמצעות ‪real-time PCR‬‬
‫‪ .Northern blot‬הפריימרים שהיוו בסיס לכל התהליכים הנ"ל נבחרו בקפידה משני אקסונים שונים על מנת‬
‫לוודא שהתוצאות משקפות נאמנה את רמות ה‪) RNA-‬ראה טבלה בסעיף ‪ 2.7.4.4‬בפרק חומרים ושיטות(‪.‬‬
‫בנוסף‪ ,‬בוצעה אנליזה ל‪ RNA-‬שהופק מלימפוציטים )ממקור אנושי( עבור ביקורת שלילית לתהליך‪ .‬כ‪house -‬‬
‫‪ keeping gene‬נעשה שימוש ב‪.GAPDH-‬‬
‫טבלה מס' ‪ :7‬סמנים שנעשה בהם שימוש לעקוב אחר השינויים בביטוי הגנטי והחלבוני‬
‫*‪Cellular Function‬‬
‫‪May be involved in the regulation of dopamine release and‬‬
‫‪transport. Soluble protein, normally localized primarily at‬‬
‫‪the presynaptic region of axons. Induces fibrillization of‬‬
‫‪microtubule-associated protein tau. Reduces neuronal‬‬
‫‪responsiveness to various apoptotic stimuli‬‬
‫‪Tubulin is the major constituent of microtubules. It binds‬‬
‫‪119‬‬
‫‪Human gene‬‬
‫‪Alpha (α)-synuclein‬‬
‫‪Beta (β)-tubulin III‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
CD90 (Thy-1 membrane
glycoprotein precursor)
Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH)
Glial acidic fibrillary protein
(GFAP)
Glypican 4 (GPC4)
Microtubule-associated protein 2
(MAP2)
Necdin
Nestin
Neurite growth-promoting factor 2
(NEGF2)
Neurofilament heavy (NF-200)
Neurofilament light (NF-68)
Neurofilament medium (NF-160)
Neuron specific enolase (NSE)
Neuronal Nuclei (NeuN)
Retinoic acid receptor type α (RA-R)
Tyrosine kinase receptor (Trk-2)
two moles of GTP, one at an exchangeable site on the beta
chain and one at a nonexchangeable site on the alpha-chain
May play a role in cell-cell or cell-ligand interactions
during synaptogenesis and other events in the brain
GAPDH plays an important role in glycolysis and
gluconeogenesis by reversibly catalysing the oxidation and
phosphorylation of D-glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3diphospho- glycerate
GFAP, a class-III intermediate filament, is a cell-specific
marker that, during the development of the central nervous
system, distinguishes astrocytes from other glial cells
Cell surface proteoglycan may be involved in the
development of CNS
The exact function of MAP2 is unknown but MAPs may
stabilize the microtubules against depolymerization. They
also seem to have a stiffening effect on microtubules
Nuclear protein growth suppressor that facilitates the entry
of the cell into cell cycle arrest. Postmitotic neuron-specific
growth suppressor (Yoshikawa 2000)
Intermediate filament protein a predominant marker used to
describe stem and progenitor cells in the mammalian CNS
Extracellular matrix-associated protein that enhances
axonal growth in perinatal cerebral neurons
200kDa filaments slowly transported within the axons
towards the synaptic terminals
68kDa Intermediate filaments (IFs) with characteristic
10nm diameter are a distinct class of heterogenous protein
subunits apparent by both immunological and biochemical
criteria. The neurofilaments are one of the five major
groups of intermediate filaments and are found
predominantly in cells or tissues of neuronal origin.
sequential order of expression in the vertebrate
development with NF-L and NF-M appearing initially as
neuritis differentiate
160kDa filaments slowly transported within axons towards
the synaptic terminals
Isozyme of the glycolytic enzyme enolase is expressed in
all neuronal cell types
Vertebrate
neuron-specific
nuclear
protein,
the
immunohistochemical staining is primarily in the nucleus of
neurons with lighter staining in the cytoplasm.
Developmentally, immunoreactivity is first observed
shortly after neurons have become postmitotic, no staining
has been observed in proliferative zones
Receptor for retinoic acid
Receptor for brain-derived neurotrophic factor (BDNF),
neurotrophin-3 and neurotrophin-4/5 but not nerve growth factor
(NGF). Involved in the development and/or maintenance of the
nervous system. This is a tyrosine-protein kinase receptor
‫*פעילות החלבונים נלקחה מעבודות רבות בספרות הרפואית‬
120
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫בביצוע ‪ RT-PCR‬ל‪ RNA-‬שהופק מתאים מזנכימליים )ממח עצם אנושי( שהתמיינו לתאי עצב נמצא ש‪necdin, -‬‬
‫‪ NF-200‬באים לידי ביטוי החל מ‪ 6-‬שעות ו‪ NF-70-‬כ‪ 12-‬שעות לאחר הוספת "מדיום התמיינות ‪) "II‬תמונה ‪.(29‬‬
‫בשאר הגנים הייחודיים לתאי עצב שנבחנו ) ‪ (glypican-4, nestin, NF-160, NSE, RA-R, Trk-2‬נמצאה‬
‫נכוחות ‪ RNA‬בתאים מזנכימליים שעברו התמיינות‪ ,‬ואף בתאים שלא עברו התמיינות )תמונה מס' ‪ .(29‬בנוסף‪,‬‬
‫ברוב הגנים ניתן להבחין שעוצמת החיווי גדלה לאחר ההתמיינות לעומת עוצמת הבנד בתאים ללא התמיינות‪.‬‬
‫‪ RNA‬של ‪ ,CD90‬שהנו בין היתר גם סמן ייחודיי לתאים מזנכימליים‪ ,‬מתבטא גם בתאים שלא עברו התמיינות‬
‫אך אינו מתבטא בלימפוציטים )תמונה מס' ‪ .(29‬כל הגנים לא באו לידי ביטוי בלימפוציטים )ביקורת שלילית(‬
‫למעט ‪ RA-R‬ו‪.(house keeping gene) GAPDH-‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪lymph‬‬
‫‪52‬‬
‫‪27‬‬
‫‪6‬‬
‫‪12‬‬
‫‪3‬‬
‫‪0‬‬
‫‪12‬‬
‫‪0‬‬
‫‪CD90‬‬
‫‪Gylpican-4‬‬
‫‪Necdin‬‬
‫‪Nestin‬‬
‫‪NF-200‬‬
‫‪NF-160‬‬
‫‪NSE‬‬
‫‪RA-R‬‬
‫‪GAPDH‬‬
‫‪lymph‬‬
‫‪72‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪NF-68‬‬
‫‪Trk-2‬‬
‫תמונה ‪ PCR :29‬לסמנים עצביים‪ .‬הפקת ‪ RNA‬נעשתה מתאים מזנכימליים )ממקור אנושי(‬
‫שעברו התמיינות עצבית במשך ‪ 3-72‬שעות‪ ,‬מתאים שלא עברו התמיינות )‪ 0‬שעות(‬
‫ומלימפוציטים )ביקורת שלילית(‪ .‬ביצוע ראקציות ‪ PCR‬לסמנים עצביים שונים נעשה עם‬
‫פרימרים מ‪ 2-‬אקסונים שונים‪.‬‬
‫באנליזה כמותית של ‪ (real-time PCR, Northern blot) RNA‬שהופק מתאים מזנכימליים שעברו התמיינות‬
‫לתאי עצב עד ‪ 72‬שעות נמצא שרמות ‪ NEGF2‬עלו עד פי ‪ 7‬לעומת תאים שלא עברו התמיינות )תמונה ‪ (30‬וקיימת‬
‫קורלציה בין העלייה ברמות הביטוי לבין משך זמן ההתמיינות ]עבור ‪ ,p=0.023 r=0.884 Northern blot‬עבור‬
‫‪ .[p=0.058 r=0.942 real-time PCR‬כמו‪-‬כן באמצעות ‪ Northern blot‬נמצא שרמות ‪ RNA‬של ‪ NF-200‬עלו פי‬
‫‪121‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪) (p=0.031 r=0.939) 10‬תמונה ‪ (31‬ורמות ‪ NSE‬עלו פי ‪ (p=0.051, r=0.803) 3‬במהלך התמיינות התאים לתאים‬
‫דמויי תאי עצב )תמונה ‪.(31‬‬
‫‪Quantitation data for Cycling NEGF2‬‬
‫‪Standard Curve NEGF2‬‬
‫‪Standard Curve GAPDH‬‬
‫‪Northern blot NEGF2‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪72‬‬
‫‪27‬‬
‫‪48‬‬
‫‪12‬‬
‫‪Quantitation data for Cycling GAPDH‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.79 kb‬‬
‫‪1.4‬‬
‫‪0.8‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪p=0.023 r=0.884‬‬
‫‪Real-tim e PCR‬‬
‫‪8‬‬
‫‪6‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪p=0.058 r=0.942‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪70‬‬
‫‪80‬‬
‫‪60‬‬
‫‪10‬‬
‫‪20‬‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫‪50‬‬
‫‪Hours of diffrentiation‬‬
‫‪NEGF2 cDNA /‬‬
‫)‪GAPDH cDNA(A.U.‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪NEGF2 mRNA /‬‬
‫)‪GAPDH mRNA(A.U.‬‬
‫‪Northern blot‬‬
‫‪1.2‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪40‬‬
‫‪50‬‬
‫‪30‬‬
‫‪20‬‬
‫‪0‬‬
‫‪10‬‬
‫‪Hours of diffrentiation‬‬
‫תמונה ‪ :30‬השפעת התמיינות עצבית של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי על רמות ‪ .NEGF2‬אנליזה‬
‫כמותית של שינויים בביטוי הגנטי של ‪ NEGF2‬באמצעות ‪ Northern blot‬ו‪ .real time PCR-‬כימות התוצאות‬
‫בוצע בהשוואה לביטוי ‪ .GAPDH‬התוצאות מוצגות כממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן‪ ,‬ומבחן קורלציה ‪.Pearson‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪p=0.031 r=0.939‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪50‬‬
‫‪40‬‬
‫‪20‬‬
‫‪30‬‬
‫‪Hours of diffrentiation‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪NF-200 mRNA /‬‬
‫)‪GAPDH mRNA (A.U.‬‬
‫‪NF-200‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪80‬‬
‫‪NSE‬‬
‫‪2.0‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪p=0.051 r=0.803‬‬
‫‪0.0‬‬
‫‪70‬‬
‫‪60‬‬
‫‪20‬‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫‪50‬‬
‫‪Hours of diffrentiation‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫תמונה ‪ :31‬השפעת התמיינות עצבית של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי על רמות ‪ NSE‬ו‪ .NF-200-‬אנליזה‬
‫כמותית של שינויים בביטוי הגנטי של ‪ NSE‬ו‪ NF-200-‬באמצעות ‪ .Northern blot‬כימות התוצאות בוצע‬
‫בהשוואה לביטוי ‪ .GAPDH‬יחידות ציר ‪ Y‬הינן היחסים של יחידות אקראיות‪ .‬התוצאות מוצגות כממוצע ‪±‬‬
‫שגיאת התקן‪ ,‬ומבחן קורלציה ‪.Pearson‬‬
‫‪122‬‬
‫‪NSE mRNA /‬‬
‫)‪GAPDH mRNA (A.U.‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪2.5‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
‫ שינוי בפרופיל גורמי שעתוק בעקבות השראת התמיינות עצבית‬5.4
‫( בעקבות התמיינותם‬transcription factors, TFs) ‫על מנת לאפיין את השינוי ברמות הביטוי של גורמי השעתוק‬
‫ בוצעו‬.protein/DNA array analysis-‫עצב נעשה שימוש ב‬-‫של תאים מזנכימליים )אנושיים( לתאים דמויי תאי‬
‫ שעות‬48-‫ ו‬24 ‫ מהפקת חלבוני גרעין מתאים שעברו התמיינות במשך‬,‫ בלתי תלויות‬array hybridizations ‫שלשה‬
‫ הופקו חלבוני גרעין ועברו היברדיזציה ויצרו קומפלקס עם רצפים‬.‫והשלישית מתאים שלא עברו התמיינות‬
‫ לא נלקחו בחשבון‬2 OD/mm2 -‫ כל הפקטורים שהציגו עוצמת חיווי פחותה מ‬.‫ גורמי שעתוק‬96 ‫ידועים של‬
.‫באנליזה‬
‫ גורמי שעתוק שהשתנו במהלך התמיינות עצבית‬:8 ‫טבלה‬
Transcription factor
Cellular Function
Aryl hydrocarbon
receptor/aryl
hydrocarbon receptor
nuclear translocator
binding element
(AhR/Arnt)
Cardiac enhancer
factor-1 (CEF-1)
Cardiac enhancer
factor-2 (CEF2)
DR-2
Members of a family of transcription factors that contain an N-terminal Qin 2004
basic-helix-loop-helix (bHLH). AhR expressed in a subset of neurons,
and demonstrates that animals lacking AhR function have specific
defects in neuronal differentiation, as evidenced by changes in gene
expression, aberrant cell migration, axon branching, or supernumerary
neuronal processes
CEF-1 and CEF-2 are two nuclear protein binding site on the enhancer Parmacek
of slow/cardiac troponin C gene. Mutation of either the CEF-1 or CEF-2 1992
binding site abolished the activity of the gene in cardiac myocytes
Ecotropic viral
integration site 1
(EVI-1)
Human forkhead box
O1 (FKHR)
GAG (Amyloid
precursor protein
regulatory element)
Gamma-interferon
activation site (GAS)
GATA binding globin
transcription factor 1
(GATA-1)
Growth factor
independent 1 (Gfi-1)
References
DR-2 is a retinoic acid response element that located in the promoter of
HOXB1 gene. mRNA expression of HOXB1 in different regions,
including neuronal tissues, is controlled by retinoic acid directly throw
the DR-2 regulatory element
Evi-1 is expressed at high levels in several embryonic tissues. It is a
transcription factor involved in organogenesis and morphogenesis as well
as cellular proliferation and differentiation. Overexpression of EVI-1
leads to neural differentiation of P19 cells and blocks further
differentiation into astrocytes by RA treatment
FKHR is a DNA binding transcription factor that redistributes from the
nucleus to the cytoplasm by insulin-induced phosphorilation. FKHR is
also known to acts as a DNA binding-independent cofactor of nuclear
receptor including estrogen, retinoid and thyroid hormone receptors
GAG is a DNA element located on the promoter of the rat amyloid
precursor protein (APP) gene. APP is expressed preferentially in the
brain and has been implicated in neurite outgrowth and neuroprotection
GAS elements are short stretch of DNA, originally defined as a
transcriptional induction of genes in response to IFN γ. GAF is a dimmer
of Stat1 that bind to GAS in response to interferon-gamma treatment.
The mammalian transcription factor GATA-1 is required for normal
erythroid and megakaryocytic development. GATA-1 contains two zinc
fingers, and is known to bind recognition elements in the control regions
of genes expressed in these lineages.
It is a zinc finger that functions as a transcriptional repressor. Several
promoters genes encoding cytokines, regulators of cellular proliferation
and differentiation such as IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IFN-α, IFN-γ, CSF-1,
TNF-β, TNF-α, c-erbB2, c-myc, N-myc, c-N-ras and Histone H1A
contains sequence that has high homology to the Gfi-1 consensus
123
Huang 2002
Perkins
1991;
Kim 1998;
Kazama
1999
Schmoll
2000;
Schuur
2001
Hoffman
1995
Decker
1991
Newton
2001;
Ghirlando
2003
ZweidlerMckay
1996;
Duan 2003
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
HIF-1 binding site
(HBS) and its
downstream HIF-1
ancillary sequence
(HAS), combined.
Hepatocyte nuclear
factor 3β (HNF-3β)
Interferon regulatory
factor 1/2 binding
element (IRF-1/2)
Mocyte enhancer
binding factor 2C
(MEF-2(2))
Myeloid-specific
retinoic acidresponsive zinc finger
(MZF1)
Nuclear Y box factor
(NF-Y)
Neural zinc finger
factor 3 (NZF-3)
Paired box gene 3
(Pax-3)
Paired box gene 6
(Pax6)
Skn (Octamerbinding site in
epidermis, POU
domain factor)
Xenobiotic response
element (XRE)
sequence. Furthermore, it is known that Math5 expression requires for
activation of transcription network of retinal ganglion cells
differentiation. Gfi-1 is one of those transcription factors
HBS (HIF-1 binding site) and HAS (HIF-1 ancillary sequence) are both Kimura
hypoxia response elements located in the promoter or henhancer of 2001
hypoxia-inducible genes include vascular endothelial growth factor
(VEGF), erythropoietin and glycolytic enzyme genes
A winged-helix DNA-binding motif. Transcription activator for a number
of liver genes such as AFP, albumin, tyrosine aminotransferase, PEPCK,
etc. Interacts with the cis-acting regulatory regions of these genes
IRF1 and IRF2 have the same DNA binding specify. IRF1 is a positive
regulator of interferon-beta and IFN-induced genes, while IRF-2 can
block the activity of IRF-1. IRF-1 and IRF-2 have a constitutive
expression that induced when cells are exposed to virus or interferons.
The constitutive expression of IRF-1 and IRF-2 suggests other, nonimmunity-related functions in the cells. The ratio between the two
transcription factors plays an important role in cell growth and
differentiation.
MEF-2(2) is restricted to skeletal muscle, spleen and brain. It has a strict
tissue-specific pattern and in the brain its expression is limited to a subset
of cerebro-cortical neurons. This gene is induced late during myogenic
differentiation, and in post-mitotic survival of neurons
MZF1 is a transcription factor belonging to the Kruppel family of zinc
finger proteins. His expression is seen in totipotentbone marrow
progenitor cells and early myeloid progenitors and precursors. MZF1 is
not detected in fully differentiated blood cells.
the activation of the neuronal promoter of the AADC gene requires a
direct interaction between the ubiquitous NF-Y factor and a cell-specific
POU-domain protein
It's expression is highly restricted to the brain, present in PC-12 cell line
but not present in non-neuronal cell lines, and is located to the nucleus.
NZF-3 confers repression on the basal activity of promoters containing
the consensus binding elements. Similar to other members of this family,
NZF-3 is expressed primarily in the nervous system.
Pax-3 is a transcription factor required for the development of embryonic
neural tube, neural crest and somatic derivatives
PAX6 is expressed in the developing nervous system, has a restricted
pattern of expression in the CNS that includes the cerebral cortex, it is
also expressed in much of the ventral neural tube during development
Pax-6 plays multiple roles in forebrain patterning, including boundary
formation, regional patterning, neuron specification and axon guidance
It has a regulatory role in keratinocyte proliferation and differentiation. In
vitro studies have demonstrated that Skn-1a binds to and transactivates
the promoter regions of keratinocyte genes involving in epidermal
differentiation such as human K10 and SPRR-2A
Possible involvement in mechanisms underlying proliferation,
differentiation and/or maturation of particular neurons in cerebellum
Lantz 1995
Sims 1993;
Harada
1994
Martin
1993;
McDermott
1993
Hromas
1996
Dugast
2001
Yee 1998
Goulding
1991
Mastick
1997;
Zhou 2000
Andersen
1997
Kuramoto
2003
‫ המצאות גורמי שעתוק עצביים בתאים שלא עברו התמיינות‬5.4.1
‫ מתוכם יש מעורבות‬11-‫ ל‬.(‫ גורמי שעתוק נמצאו פעילים בתאים מזנכימליים ממקור אנושי )ללא התמיינות‬39
.(‫ ביטוי גנטי והם מבוטאים במערכת העצבים המרכזית‬,‫ התמיינות‬,‫בתאי עצב )בעלי תפקיד ידוע בפעילות עצבית‬
124
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ 11‬גורמי הגידול עם מעורבות עצבית הם ‪AhR/ARNT, EVI-1, FKHRhu, GAG, HNF-3β, MEF-2(2), NF-‬‬
‫‪ Y, Pax-3, Pax-6, NZF-3, and XRE‬ומתייחסים אליהם כ‪) "neural transcription factors"-‬תמונה ‪32‬‬
‫וטבלה ‪ .(8‬יתכן והימצאותם של גורמי שעתוק אלו )עם מעורבות עצבית( בתאים מזנכימליים היא זאת‬
‫המאפשרת התמיינות לתאי עצב‪ .‬לאחר ‪ 24‬שעות של התמיינות התאים הראו עלייה ברמות ‪ NZF-3‬וירידה‬
‫משמעותית ברמות ‪) GAG, EV-1, FKHRhu, HNF-3B and XRE‬טבלה ‪ (9‬שאר רמות גורמי השעתוק לא‬
‫השתנות בין התאים‪ .‬מאידך‪ ,‬לאחר ‪ 48‬שעות של התמיינות עצבית רמות ‪ GAG, EVI-1 and FKHRhu‬עלו‬
‫במידה נכרת מצד שני רמות ‪ NF-Y, Pax-3, Pax-6, NZF-3, MEF-2(2) and AhR/ARNT‬ירדו במידה‬
‫משמעותית בעקבות ההתמיינות‪ ,‬לא נצפה שינוי מובהק ברמות ‪) HNF-3β or XRE‬טבלה ‪ .(9‬מעניין במיוחד‬
‫לראות ש‪ Pax3-‬מתבטא בתאים מזנכימליים לא ממוינים ורמתו יורדת לאחר ההתמיינות‪ Reeves .‬וחבריו )‪(1998‬‬
‫הראו שפעילות וקישורו של ‪ Pax3‬ל‪ DNA-‬יורדת במהלך התמיינות תאי עצב וצמודה לשינוי מורפולגי עצבי‪.‬‬
‫התוצאות המוצגות במחקר זה תואמות את המימצאים הנ"ל – קרי ירידה של רמות ‪ Pax3‬עם השינוי המורפולוגי‬
‫שחל בתאים המזנכימליים במהלך ההתמיינות העצבית‪.‬‬
‫‪ 5.4.2‬השוואה בין תאים שעברו התמיינות לבין תאים שלא עברו התמיינות‬
‫תמונה ‪ 33‬מסכמת את גורמי השעתוק העיקריים אשר השתנו באופן מובהק בעקבות ההתמיינות‪ .‬פקטור השעתוק‬
‫אשר נצפה בו השינוי הגדול ביותר בין שתי סוגי התאים הנו ‪ (44 X) DR2‬והשינוי הקטן ביותר נצפה ב‪X) MZF1 -‬‬
‫‪ .(2.4‬בתאים שעברו התמיינות נמדד חיווי )סיגנל( חזק של גורמי השעתוק הבאים‪GAG, Gfi-1, EVI-1, :‬‬
‫‪) human FKHR, HAS, CEF-1, GAS, HBS, DR-2, CEF2‬טבלה ‪ (8‬מאידך בתאים שלא עברו התמיינות‬
‫רמות גורמי שעתוק אלו היו נמוכים )תמונה ‪ .(33‬רמות גורמי השעתוק ‪MZF1, Pax3, MEF-2(2), Skn, IRF-‬‬
‫‪ 1/2‬היו גבוהים בתאים שלא עברו התמיינות וירדו בתאים שעברו התמיינות )תמונה ‪ 33‬וטבלה ‪ .(9‬תוצאות אלו‬
‫מקנות פרופיל מידע ראשוני על השינויים בגורמי הגידול בעקבות ההתמיינות‪.‬‬
‫על מנת לאושש את התוצאות של ‪ protein/DNA array‬בוצע מבחן ‪ EMSA‬לשני גורמי שעתוק ‪ GAG‬ו‪.FKHR-‬‬
‫כאשר נעשה שימוש בגלאי ל‪ GAG-‬לא נצפה סיגנל בתאים שלא עברו התמיינות לעומת זאת זוהה ציון חזק לאחר‬
‫‪ 48‬שעות התמיינות )תמונה מס' ‪ .(34‬אותן תוצאות נמצאו בביטוי של ‪ ,FKHR‬סיגנל חלש מאוד בתאים שלא עברו‬
‫התמיינות וסיגנל חזק בתאים שעברו התמיינות במשך ‪ 48‬שעות )תמונה ‪ .(34‬תוצאה אלו הינן בקורלציה ישירה‬
‫לתוצאות שנמצאו ב‪ .protein/DNA array-‬וניתן לומר שתוצאות מבחן ה‪ EMSA-‬תומכות ב‪protein/DNA -‬‬
‫‪.Arrays‬‬
‫‪125‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪4‬‬
‫‪3.5‬‬
‫‪2.5‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪Average OD/mm2‬‬
‫‪3‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Pa‬‬
‫‪x6‬‬
‫‪N‬‬
‫‪ZF‬‬
‫‪-3‬‬
‫‪/A‬‬
‫‪hR‬‬
‫‪N‬‬
‫‪EV‬‬
‫‪I- 1‬‬
‫‪rn‬‬
‫‪t‬‬
‫‪E‬‬
‫‪XR‬‬
‫‪3b‬‬
‫‪F-‬‬
‫‪F‬‬‫‪Y‬‬
‫‪N‬‬
‫‪G‬‬
‫‪A‬‬
‫‪H‬‬
‫‪Pa‬‬
‫‪x3‬‬
‫‪M‬‬
‫‪EF‬‬
‫‪-2‬‬
‫‪(2‬‬
‫)‬
‫‪G‬‬
‫‪A‬‬
‫‪hu‬‬
‫‪R‬‬
‫‪H‬‬
‫‪FK‬‬
‫תמונה ‪ 11 :32‬גורמי שעתוק עצביים בתאים מזנכימלים שלא עברו התמיינות‪ .‬גורמי השעתוק זוהו באמצעות‬
‫‪.protein/DNA array analysis‬‬
‫‪14‬‬
‫‪12‬‬
‫‪10‬‬
‫‪48 h diffrentiation‬‬
‫‪6‬‬
‫‪AVE OD mm2‬‬
‫‪undifferentiated‬‬
‫‪8‬‬
‫‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‪IRF‬‬‫‪1/2‬‬
‫‪Skn‬‬
‫‪GATA‬‬
‫‪MEF‬‬‫‪CEF2 MZF1 Pax3‬‬
‫‪-1‬‬
‫)‪2(2‬‬
‫‪0.64 3.234 2.332 2.328 2.164 2.091‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪1.931‬‬
‫‪HBS DR-2‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪FKH‬‬
‫‪HAS CEF1 GAS‬‬
‫‪R hu‬‬
‫‪0‬‬
‫‪GAG Gfi-1 EVI-1‬‬
‫‪2.451 3.526 1.07 3.524 0.505 1.533 0.691 0.504‬‬
‫‪6.335 5.575 4.609 4.407 4.047 3.537 1.361 0.627 0.192 0.329‬‬
‫‪7.7‬‬
‫‪undifferentiated‬‬
‫‪48 h diffrentiation 13.02 12.17 9.89 9.064‬‬
‫‪TF's‬‬
‫תמונה ‪ :33‬שינו ברמות גורמי שעתוק בתאים מזנכימליים בעקבות התמיינות עצבית‪ .‬גורמי השעתוק זוהו‬
‫באמצעות ‪ protein/DNA array analysis‬בתאים שלא עברו התמיינות ובתאים לאחר ‪ 48‬שעות התמיינות‪ .‬כל‬
‫תוצאה הנה ממוצע של דופליקאט‪.‬‬
‫‪126‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
‫ גורמי שעתוק ע"י תאים מזנכימליים אנושיים "נאיבים" וע"י תאים מזנכימליים‬39 ‫ ביטוי של‬:9 ‫טבלה‬
a
‫ שעות‬24-48 ‫שהודגרו במדיום התמיינות עצבית למשך‬
Expression
by hMSCsb
Transcription factor name
24h neuronal
differentiation
FOXO4 member of the forkhead family (AFXH)
1.35
3.19 fold increase
Aryl hydrocarbon receptor/aryl hydrocarbon receptor
1.09
nuclear translocator binding element (AhR/Arnt)
Cardiac enhancer factor-1 (CEF-1)
1.53
Cardiac enhancer factor-2 (CEF2)
0.64
2.55 fold increase
Cholesteryl ester transfer protein (CETP/CRE)
1.86
Ecotropic viral integration site 1 (EVI-1)
1.07
Decrease to 0
Human forkhead box O1 (FKHR)
3.52
3.29 fold decrease
Mouse forkhead box O1 (FKHR)
2.02
Fork head Related Activator-2 (Freac-2)
3.42
GAG (Amyloid precursor protein regulatory element)
2.45
Decrease to 0
Gamma-interferon activation site (GAS)
0.69
Decrease to 0
GATA binding globin transcription factor 1 (GATA-1)
1.93
GATA binding globin transcription factor 2 (GATA-2)
1.56
GATA binding globin transcription factor 4 (GATA-4)
2.08
Growth factor independent 1 (Gfi-1)
3.53
Decrease to 0
HIF-1 binding site (HBS) and its downstream HIF-1
3.24
ancillary sequence (HAS), combined.
HIF-1 binding site/rat, as human xbp-1 (HBS/xbp-1)
3.16
Hepatocyte nuclear factor 3β (HNF-3β)
1.56
2.43 fold decrease
Interferon regulatory factor 1/2 binding element (IRF-1/2)
2.09
Interferon-a stimulated response element (ISRE-1)
1.96
Pyruvate kinase L gene binding element III (L-III BP)
0.73
Muscle-specific enhancer factor-2 (MEF-2)
2.33
Muscle-specific enhancer factor 3 (MEF-3)
1.78
6.58 fold decrease
MSP-1 (Sequence identical to SAA, the SP1 binding site
1.63
excluded)
Myeloid-specific retinoic acid- responsive zinc finger
3.23
(MZF1)
Nuclear Y box factor (NF-Y)
1.60
Neural zinc finger factor 3 (NZF-3)
0.81
Poly(ADP-ribose) synthetase/polymerase (PARP)
1.15
2.22 fold increase
Paired box gene 3 (Pax-3)
2.33
Paired box gene 4 (Pax-4)
1.79
Paired box gene 6 (Pax6)
0.92
Paired box gene 8 (Pax-8)
1.20
4.85 fold decrease
Ras-responsive transcription element (RREB-1)
0.85
Ras-responsive transcription element (RREB-2)
2.71
Related to serum response factor, C4 (RSRFC4)
3.75
SAA (Amyloid precursor protein regulatory element
containing potential binding site for SP1, AP4, USF and
0.66
2.64 fold decrease
AP1)
Skn (Octamer-binding site in epidermis, POU domain factor)
2.16
Xenobiotic response element (XRE)
1.28
5.52 fold decrease
ZIC (One of four DNA binding domains on the BZLF1 gene
0.82
promoter)
a
2
Measurments represent ODu*mm . Changes in expression levels are relative to
undifferentiated MSCs.
127
48h neuronal
differentiation
2.90 fold decrease
decrease to 0
4.14 fold increase
5.53 fold increase
9.24 fold increase
2.57 fold increase
5.31 fold increase
8.07 fold increase
2.10 fold increase
3.45 fold increase
4.18 fold decrease
12.11 fold decrease
9.72 fold decrease
4.96 fold decrease
2.37 fold decrease
2.14 fold- decrease
3.72 fold decrease
9.16 fold decrease
3.72 fold decrease
5.46 fold decrease
2.20 fold decrease
-
6.57 fold decrease
-
expression in
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
b
human mesenchymal stem cells (hMSCs)
TRANSFAC the tramscription factor database: http://www.gene-regulation.com/pub/databases.html
Additional information about the array genes can be found at http://panomics.multipath.net/PDarray2.cfm
A
Undifferentiated
DR-2
GAG
Differentiated (24h)
B
DR-2
GAG
C
Differentiated (48h)
EMSA
D
DR-2
GAG
48h diff
24h diff
undiff
48h diff
undiff
24h diff
GAG
FKHR
‫ גורמי השעתוק זוהו‬.FKHR-‫ ו‬GAG ‫ עבור‬EMSA ‫ ותוצאות‬protein/DNA array ‫ צילום של‬:34 ‫תמונה‬
.‫ שעות התמיינות‬48-‫ ו‬24 ‫ בתאים שלא עברו התמיינות ובתאים לאחר‬protein/DNA array analysis ‫באמצעות‬
‫ עבור גורמי השעתוק‬EMSA ‫( תוצאות‬D .GAG-‫ ו‬DR2 ‫ צילום של סרט הפיתוח וסימון הסיגנלים של‬A-C
.FKHR-‫ ו‬GAG
128
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ 5.5‬תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שנחשפו למדיום התמיינות עצבי מבטאים חלבונים ייחודיים לתאי עצב‬
‫על מנת לבדוק האם תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שעברו התמיינות עצבית מבטאים חלבונים ייחודיים‬
‫לתאי עצב נעשה שימוש בתאים שגדלו בתרבית במשך כחודשיים‪ .‬התאים הודגרו ב"מדיום התמיינות ‪ "I‬למשך‬
‫‪ 24-48‬שעות ולאחריו ב"מדיום התמיינות ‪ "II‬לפרקי זמן שונים )עד ‪ 5‬ימים(‪ .‬מעקב אחר סמנים מולקולאריים‬
‫לתאי עצב המופיעים בתאים לפני ולאחר החשיפה למדיום ההתמיינות נעשה בשיטות הבאות‪ :‬צביעות‬
‫אימונוציטוכימיות )נוגדנים ראשוניים ונוגדנים שניוניים פלורסנטים( ובעזרת הספג אימונולוגי )‪(Western blot‬‬
‫)לזיהוי איכותי וכמותי של החלבונים שבוטאו )פרוט על החלבונים ראה בטבלה ‪ .(7‬יש לציין שישנה חוסר התאמה‬
‫מסוימת בין התוצאות בהספג אימולוגי‪ ,‬בהם גם בתאים שלא עברו התמיינות נצפה ‪ nestin, NSE‬ברמות‬
‫נמוכות‪ ,‬לעומת צביעות אימוניות שבהם לא נצפתה צביעה‪ .‬יתכן והשוני נובע מעצם שיטת הבדיקה שהספג‬
‫אימונולוגי הנו רגיש יותר לעומת צביעה אימונית‪ .‬לאחר ‪ 48‬שעות של התמיינות התאים מבטאים ‪) nestin‬סמן‬
‫לתאי גזע עיצביים( )תמונה ‪ (35B‬ומאידך תאים שלא עברו התמיינות לא נצבעו ל‪) nestin-‬תמונה ‪ .(35A‬בנוסף‪,‬‬
‫לאחר התמיינות התאים מבטאים ‪) GFAP‬תמונה ‪ (35D‬שהנו גם סמן לתאי עצב עצביים לעומת תאים שלא עברו‬
‫התמיינות )תמונה ‪ .(35C‬יש לציין שעד לאחרונה ‪ GFAP‬היווה סמן קלאסי לאסטרוציטים אבל במחקרים רבים‬
‫הוכח שהוא סמן הנמצא בתאי גזע עצביים ) ‪Doetsch et al., 1999; Kawaguchi et al., 2001; Bonaguidi et‬‬
‫‪ .(al., 2004; Garcia et al., 2004‬בהתבוננות במיקרוסקופ קונפוקלי בתא אחד‪ ,‬נמצאה צביעה אופיינית ל ‪β-‬‬
‫‪ tubulin III‬בה ניתן להבחין בשלד תא המתחיל מנקודת מרכז וזאת לאחר ‪ 5‬ימי התמיינות )תמונה ‪ (35F‬לעומת‬
‫חוסר צביעה בתאים שלא עברו התמיינות )תמונה ‪ .(35F‬בעבודות מדעיות רבות ‪ β-tubulin III‬מוגדר כסמן של‬
‫תאי עצב לא בשלים )‪.(Tondreau et al., 2004; Li et al., 2005) (immature‬‬
‫בנוסף לסמנים של תאי עצב לא בשלים התאים שעברו התמיינות נצבעו לסמנים של תאי עצב בשלים ‪MAP2,‬‬
‫‪) Neu-N, NSE, NF-200, α-synuclein,‬תמונה ‪ .(36‬מאידך‪ ,‬התאים שלא עברו התמיינות לא נצבעו לסמנים‬
‫הנ"ל )תמונה ‪ .(36‬התצפית שבה תאי מח עצם שעברו התמיינות מבטאים סמנים של תאי עצב לא בשלים וגם‬
‫סמנים של תאי עצב בשלים אינה חדשה ומצויה בספרות )‪ .(Sanchez-Ramos et al., 2000‬לאחר ‪ 12‬שעות של‬
‫התמיינות ישנה התחלה של צביעה טיפוסית ל‪) Neu-N-‬תמונה ‪ ,(36C‬שהנו סמן ספציפי לגרעינים בבעלי חוליות‬
‫)‪ ,(Mullen et al., 1992‬כנגד חוסר צביעה בתאים שלא עברו התמיינות )תמונה ‪ .(36A-B‬כמו‪-‬כן‪ ,‬לאחר ‪ 24‬שעות‬
‫ב"מדיום התמיינות ‪ "II‬התאים החלו להיצבע ל‪) NF-200-‬תמונה ‪ (36F‬לעומת תאים שלא עברו התמיינות‬
‫)תמונה ‪ .(36D-E‬בנוסף‪ ,‬לאחר ‪ 48‬שעות של התמיינות ישנה צביעה מאסיבית ל‪) NSE-‬תמונה ‪ (36I‬לעומת תאים‬
‫‪129‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫שלא עברו התמיינות )תמונה ‪ .(36G-H‬אחד הסמנים לתאי עצב בשלים הנו ‪ MAP2‬המרכיב את שלד תא העצב‬
‫)‪ .(Tondreau et al., 2004; Li et al., 2005‬נמצא שאחרי ‪ 48‬שעות של התמיינות התאים מבטאים ‪MAP2‬‬
‫)תמונה ‪ (33L-M‬לעומת תאים שלא עברו התמיינות )תמונה ‪ .(36J-K‬ניתן להבחין בתמונה שקיימות עוצמות‬
‫צביעה שונות בתאים )תמונה ‪ (36L‬ויש אף תאים שאינם צבועים – כלומר תהליך הבשלת התאים מתאי גזע‬
‫מזנכימליים לתאים דמויי תאי‪-‬עצב אינו מסונכרן בכל התאים במהלך ההתמיינות‪.‬‬
‫‪ α-synuclein‬הנו חלבון בעל חשיבות מרובה בתאי עצב בכלל ובתאי עצב דופאמינרגים בפרט‪ .‬ל‪α-synuclein-‬‬
‫חשיבות לפלסטיות של הסינפסות ומעורב בהתחדשות של אקסונים )‪ .(Maries et al., 2003‬יתרה מכך‪ ,‬ל‪α--‬‬
‫‪ synuclein‬חשיבות מרובה לתיפקודו התקין של תא דופאמינרגי ומעורב ברגולציה של ייצור אחסון והפרשת‬
‫דופאמין בצד הפרסינפטי )‪ α-synuclein .(Abeliovich et al., 2000; Maries et al., 2003‬נמצא בתאים‬
‫מזנכימליים שעברו התמיינות לאחר ‪ 48‬שעות )תמונה‪ ,(37C‬כמו‪-‬כן ניתן להבחין "בדליות" )‪(varicosities‬‬
‫האופייניות לתאי עצב )תמונות ‪ .(37C-D‬יתרה מכך‪ ,‬נצפתה צביעה כפולה ל‪ β-tubullin III-‬ול‪α-synuclein-‬‬
‫)תמונות ‪ .(37C-E‬תאים שלא עברו התמיינות לא נצבעו ל‪) α-synuclein-‬תמונה ‪.(37A-B‬‬
‫‪B‬‬
‫‪Nestin, 48h‬‬
‫‪A‬‬
‫‪Nestin‬‬
‫‪C‬‬
‫‪D‬‬
‫‪GFAP‬‬
‫‪GFAP, 48h‬‬
‫‪F‬‬
‫)‪β-Tubulin III (5 days‬‬
‫‪E‬‬
‫‪β-Tubulin III‬‬
‫‪130‬‬
‫תמונה ‪ :35‬תאים מזנכימליים‬
‫אנושיים שעברו התמיינות עצבית‬
‫מבטאים חלבונים ייחודיים לתאי עצב‬
‫לא בשלים‪.‬‬
‫צביעות אימונוציטוכימיות כנגד‬
‫אנטיגנים ייחודיים לתאי גזע עצבים‬
‫בתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי‬
‫שעברו ולא עברו התמיינות עצבית‬
‫במשך ‪ 48‬שעות עד ‪ 5‬ימים‪-A, C .‬‬
‫חוסר צביעה ל‪ nestin-‬ו‪GFAP-‬‬
‫)בהתאמה( בתאים שלא עברו‬
‫התמיינות‪ ,B, D .‬צביעה ל‪ nestin-‬ו‪-‬‬
‫‪) GFAP‬בהתאמה( לאחר ‪ 48‬שעות‬
‫התמיינות )‪ -E .(x200‬חוסר צביעה ל‪-‬‬
‫‪ β-tubulin III‬בתאים שלא עברו‬
‫התמיינות‪ -F .‬צביעה ל‪β-tubulin -‬‬
‫‪III‬בתאים שעברו התמיינות לאחר ‪5‬‬
‫ימים‪ ,‬התמונה צולמה באמצעות‬
‫מיקרוסקופ קונפוקלי )‪.(x400‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫‪C‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪B‬‬
‫‪Neu-N , DAPI‬‬
‫‪Neu-N, 12hr‬‬
‫‪F‬‬
‫‪NF-200, 24h‬‬
‫‪Neu-N‬‬
‫‪E‬‬
‫‪NF-200, DAPI‬‬
‫‪I‬‬
‫‪NSE, 48h‬‬
‫‪A‬‬
‫‪D‬‬
‫‪NF-200‬‬
‫‪H‬‬
‫‪NSE, DAPI‬‬
‫‪G‬‬
‫‪NSE‬‬
‫‪J‬‬
‫‪K‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪MAP2‬‬
‫‪DAPI‬‬
‫‪L‬‬
‫‪M‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫‪DAPI‬‬
‫‪MAP2, 48h‬‬
‫תמונה ‪ :36‬תאים מזנכימליים אנושיים שעברו התמיינות עצבית מבטאים חלבונים ייחודיים לתאי עצב בשלים‪.‬‬
‫צביעות אימונוציטוכימיות כנגד אנטיגנים ספציפיים לתאי עצב בתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שעברו ולא‬
‫עברו התמיינות עצבית במשך ‪ 12-48‬שעות‪ A, B, D, E, G, H, J, K .‬תאים שלא עברו התמיינות והודגרו עם נוגדן‬
‫ייחודיי לתאי עצב‪ C, F, I, L, M .‬תאים שעברו התמיינות‪ .‬תמונות ‪ B, H, K, M‬צולמו באור נראה‪ ,‬צבע התכלת‬
‫שחלקו מסומן בחיצים הנו סימון גרעיני באמצעות ‪.(x200) DAPI‬‬
‫‪131‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪α-Synuclein‬‬
‫‪DAPI‬‬
‫‪D‬‬
‫‪E‬‬
‫‪Merge β-Tubulin III‬‬
‫‪and α-Synuclein‬‬
‫)‪β-Tubulin III (48 hr‬‬
‫‪C‬‬
‫)‪α-Synuclein (48 hr‬‬
‫תמונה ‪ :37‬תאים מזנכימליים שעברו התמיינות עצבית מבטאים ‪ (A .α-synuclein‬תאים שלא עברו התמיינות‬
‫אינם מבטאים ‪ (B ,α-synuclein‬צביעה גרעינית בעזרת ‪ DAPI‬של התאים בתמונה ‪ (C-E .A‬צביעה כפולה ל‪α--‬‬
‫‪ synuclein‬ו‪.(x300) β-tubulin III-‬‬
‫בעזרת ‪ Western Blot‬נמצא שרמות ‪ nestin‬בתחילה עלו ואחרי כ‪ 30 -‬שעות החלו לרדת‪ ,‬דבר המעיד על המצאות‬
‫תת‪-‬אוכלוסייה של תאים דמויי תאי עצב שסיימו להתמיין )תמונה ‪ .(38‬רמות ביטוי ‪ NSE‬עלו ) ‪Pearsone:‬‬
‫‪ (p=0.04, r=0.978‬מעל פי ‪ 2‬במהלך ‪ 50‬שעות‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬רמות ביטוי ‪ NeuN‬הלכו ועלו ) ‪Pearsone: p=0.03,‬‬
‫‪ (r=0.956‬מעל פי ‪ 15‬במהלך התמיינותם של התאים לתאי עצב )תמונה ‪ .(38‬כמו‪-‬כן רמות ‪ NF-200‬עלו עם‬
‫התקדמות ההתמיינות )תוצאות לא מוצגות(‪.‬‬
‫בנוסף לצביעות האימונוציטוכימיות והספג אימונולוגי בחנו את השינויים ברמות החלבון בתאים מזנכימליים‬
‫שעברו התמיינות באמצעות ‪ .FACS‬רמת הביטוי החלבוני של ‪ GFAP‬עלתה ב‪ 61%-‬בתאים שעברו התמיינות‬
‫עצבית לעומת התאים הנאיבים‪ .‬כאמור‪ GFAP ,‬הנו חלבון המצוי גם בתאי גזע עצביים‪ .‬עוצמת הביטוי של‬
‫החלבונים‬
‫‪ NF-200‬עלתה ב‪ 20.8±7.8% -‬ושל ‪ NSE‬ב‪) 14.9±3.2% -‬ממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן( בתאים‬
‫מזנכימליים שעברו התמיינות עצבית לעומת תאים שלא עברו התמיינות‪ .‬דוגמאות לתוצאות ה‪ FACS-‬ניתן‬
‫לראות בתמונה ‪ .39‬צריך לומר‪ ,‬שגם בשיטה הנ"ל בדומה לשיטות האחרות נמצא שהתאים שלא עברו התמיינות‬
‫ביטאו רמה נמוכה של אנטיגנים עצביים‪.‬‬
‫‪132‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪Nestin‬‬
‫‪0.7‬‬
‫‪0.5‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0‬‬
‫‪30h‬‬
‫‪3h‬‬
‫‪30‬‬
‫‪10‬‬
‫‪15‬‬
‫‪20‬‬
‫‪25‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪230 kDa‬‬
‫‪0.1‬‬
‫)‪Ratio Nestin / Actin (A.U.‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0‬‬
‫‪35‬‬
‫‪0‬‬
‫‪5‬‬
‫‪NSE‬‬
‫‪1.2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0.8‬‬
‫‪0.6‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪30h‬‬
‫‪50h‬‬
‫‪24h‬‬
‫‪0‬‬
‫‪4h‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪45 kDa‬‬
‫)‪Ratio NSE/ACTIN (A.U.‬‬
‫‪1.4‬‬
‫‪0‬‬
‫‪60‬‬
‫‪50‬‬
‫‪10‬‬
‫‪20‬‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0.25‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0.15‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪30h‬‬
‫‪22h‬‬
‫‪18h‬‬
‫‪5.5h‬‬
‫‪3h‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.05‬‬
‫‪48 kDa‬‬
‫)‪Ratio Neu-N / Actin (A.U.‬‬
‫‪Neu-N‬‬
‫‪0‬‬
‫‪35‬‬
‫‪30‬‬
‫‪10‬‬
‫‪15‬‬
‫‪20‬‬
‫‪25‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪5‬‬
‫‪0‬‬
‫תמונה ‪ :38‬מבחן ביטוי חלבונים בעזרת ‪ Western blot‬בתאים מזנכימלים שעברו התמיינות‪ .‬הופק חלבון‬
‫מתאים מזנכימליים ממקור אנושי שעברו התמיינות עצבית במשך פרקי זמן שונים‪ .‬התוצאות מוצגות בגרפים‬
‫ככימות היחס בין עוצמת הבנד של החלבון המבוקש לבין עוצמת הבנד של ‪ actin‬אשר שימש כ‪house keeping -‬‬
‫‪ protein‬ביחס לזמן ההתמיינות‪ .‬יחידות ציר ‪ Y‬הינן היחסים של יחידות אקראיות‪.(n=1) .‬‬
‫‪133‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪NSE‬‬
‫‪Undifferentiated‬‬
‫‪NF200‬‬
‫‪Undifferentiated‬‬
‫‪GFAP‬‬
‫‪Undifferentiated‬‬
‫‪M1‬‬
‫‪FL1-H‬‬
‫‪Neuronal induced cells‬‬
‫‪Neuronal induced cells‬‬
‫‪Neuronal induced cells‬‬
‫‪M1‬‬
‫תמונה ‪ :39‬זיהוי סמנים עצביים בתאים מזנכימליים שעברו התמיינות בעזרת ‪ .FCAS‬תאים מזנכימליים‬
‫ממקור אנושי שעברו התמיינות עצבית במשך ‪ 48‬שעות ותאים שלא עברו התמיינות הודגרו בנוגדן ראשוני כנגד‬
‫‪ GFAF, NF-200, NSE‬אנושי‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬הוספו נוגדנים שניוניים מצומדים ל‪ Cy3, PE, FITC-‬בהתאמה‪.‬‬
‫הגרפים השחורים )כולל הסגול ב‪ (NSE-‬הינם הביקורות‪ ,‬קרי נוגדן שניוני בלבד או ‪ .isotype‬הגרפים הצבעוניים‬
‫מייצגים תאים שהודגרו עם נוגדן ראשוני ושניוני‪ .‬האנליזה בוצעה על ‪ 10000‬אירועים‪.‬‬
‫‪ 5.6‬השראת התמיינות ארוכת טווח של תאים מזנכימליים ממקור אנושי לתאים דמויי תאי עצב‬
‫כאמור בפרקים ‪ 5.1‬ו‪ 5.4-‬בעקבות השראת התמיינות עצבית בתאים מזנכימליים אנושיים התאים משנים את‬
‫צורתם המורפולוגית ומבטאים חלבונים הייחודיים לתאי עצב‪ .‬אך אליה וקוץ בה‪ ,‬התאים שורדים את מהלך‬
‫ההתמיינות העצבית עד ‪ 4-5‬יממות מהוספת "מדיום התמיינות ‪ ."II‬יש לציין שתוצאות דומות בעניין הישרדותם‬
‫של התאים מופיעות בספרות ברוב המאמרים המתארים התמיינותם של תאים מזנכימליים לתאים דמויי תאי‬
‫עצב )ראה פרק ‪ 8.3‬במבוא(‪ .‬על מנת להאריך את הישרדות התאים במהלך ההתמיינות בוצעו שינויים ב‪"-‬מדיום‬
‫התמיינות ‪ ."II‬הוצאו מהמדיום ‪ butylated hydroxyanisole‬וגם ‪ all-trans-retinoic acid‬ומאידך הוספו שלשת‬
‫גורמי גידול ‪ .bFGF, GDNF, NGF‬לאחר ‪ 28‬ימים ב‪"-‬מדיום התמיינות ארוך טווח" נראה שכ‪ 30%-‬מהתאים‬
‫שינו את צורתם המורפולוגית לתאים דמויי תאי עצב – התכנסות התא‪ ,‬יצירת שלחות כולל התפצלויות ואף‬
‫"דליות" שאופייניות לתאי עצב )תמונה ‪ .(40‬יתרה מכך‪ ,‬לאחר ‪ 28‬ימים‪ ,‬התאים הממוינים מבטאים ‪nestin, β-‬‬
‫‪) tubulin III, MAP2‬תמונה ‪ .(41‬מעניין לראות שגם לאחר תקופת התמיינות כזאת ארוכה התאים הממוינים‬
‫עדיין מבטאים ‪ nestin‬שמהווה סמן לתאי גזע עצביים ולאי בשלות התאים‪ .‬מאידך‪ ,‬התאים גם מבטאים ‪MAP2‬‬
‫‪134‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫)סמן לתאי עצב בשלים( וגם ‪) β-tubulin III‬סמן לתאי גזע לא בשלים(‪ .‬בתאים שלא עברו התמיינות לא נמצא‬
‫צביעה אימונוציטוכימית לאנטיגנים הנ"ל )תמונה ‪ .(41‬מנתונים אלו ניתן להסיק שתהליך ההתמיינות העובר על‬
‫התאים אינו אחיד ומקבלים אוכלוסיה מעורבת של תאים דמויי תאי עצב‪ ,‬חלקם תאים בשלים וחלקם תאים‬
‫הנמצאים בשלב שונה על פני "סולם" ההתמיינות‪.‬‬
‫‪26 days‬‬
‫‪28 days‬‬
‫תמונה ‪ :40‬שינוי מורפולוגי בהתמיינות ארוכת טווח‪ .‬תאים מזנכימליים ממקור אנושי עברו התמיינות‬
‫עצבית "במדיום התמיינות ארוכת טווח"‪ .‬לאחר ‪ 26-28‬ימים כ‪ 30%-‬מהתאים עברו שינוי צורני‪ .‬בחץ‬
‫השחור מסומנים התאים שעברו שינוי צורני לתאים דמויי‪-‬תאי עצב‪ .‬בחצים הלבנים מסומנים תאים‬
‫שלא עברו שינוי צורני )‪.(x300‬‬
‫‪MAP2‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪β-Tubulin III‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪Nestin‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪DAPI‬‬
‫‪Light‬‬
‫תמונה ‪ :41‬תאים מזנכימליים מבטאים סמנים ייחודיים לתאי עצב לאחר ‪ 28‬ימי התמיינות‪ .‬תאים מזנכימליים‬
‫ממקור אנושי הודגרו "במדיום התמיינות ארוכת טווח" למשך ‪ 28‬ימים‪ .‬צביעות אימונוציטוכימיות ל‪nestin, -‬‬
‫‪ MAP2, β-tubulinIII‬בוצעו בתאים שעברו התמיינות ובתאים נאיבים‪ .‬לכל צביעה נלקחו ‪ 3‬תמונות שונות של‬
‫אותה מסגרת‪ :‬תמונה פלורוסנטית עבור האנטיגן הספציפי‪ ,‬תמונה של צביעה ב‪ DAPI-‬על מנת לראות שיש‬
‫במסגרת תאים‪ ,‬תמונה באור נראה )‪.(x300‬‬
‫‪135‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ 5.7‬הוספת חומצת שומן רב‪-‬בלתי רוויות למדיום ההתמיינות‬
‫אחד המאפיינים העיקריים של תאי עצב הנו האחוז הגבוה של חומצות שומן רב‪-‬בלתי רוויות ‪polyunsaturated‬‬
‫)‪ fatty acids (PUFA‬בדופן התא‪ .‬תכונה זאת אינה אופיינית לתאים מרקמות אחרות כולל תאים ממוח העצם‪.‬‬
‫ה‪ PUFA-‬העיקריים במערכת העצבים המרכזית הם )‪ docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3‬ו‪arachidonic -‬‬
‫)‪) acid (AA, 20:4 n-6‬הרחבה בנושא ראה בדיון(‪ .‬במהלך ההתפתחות העוברית‪ ,‬המוח משתמש בכמויות גדולות‬
‫יחסית של ‪ PUFA‬לטובת ביוסינטזה של דופן תאי העצב המתפשטים ויוצרי השלוחות העצביות ) ‪Innis & de La‬‬
‫‪ .(Presa‬על מנת לבדוק את השפעת ‪ DHA‬על מהלך ההתמיינות העצבית של התאים המזנכימליים הוסף ‪35 µM‬‬
‫‪" DHA‬למדיום התמיינות ‪ "I‬שזהו השלב של הכנת התאים לתהליך ההתמיינות‪ .‬מבחינה מורפולוגית נראה‬
‫שהתאים שטופלו ב‪ DHA-‬עברו התמיינות מושלמת יותר לתאי עצב מכיוון שהתפתחו הרבה "דליות"‬
‫)‪ (varicosities‬לאורך השלוחות שנוצרו )תמונה ‪ .(42‬אין ספק שהתפתחותן של "הדליות" לאורך השלוחות הדקות‬
‫תלויה גם בהרכב חומצות השומן שמרכיבות את דופן התא‪ .‬כאמור‪ ,‬אחד המאפיינים של שלוחות תאי עצב היא‬
‫הימצאותם של "דליות" לאורך האקסון‪.‬‬
‫תמונה ‪ :42‬הוספת ‪ DHA‬ל"מדיום התמיינות ‪ "I‬הביאה להתפתחות מרובה של "דליות" לאורך שלוחות‬
‫התאים שהתמיינות לתאים דמויי תאי עצב‪ .‬תאים מזנכימליים ממקור אנושי הודגרו למשך ‪ 24-48‬שעות עם ‪35‬‬
‫‪ µM DHA‬במדיום התמיינות ‪ .I‬לאחר‪-‬מכן התאים הודגרו במדיום התמיינות ‪ II‬למשך ‪ 48-72‬שעות‪ .‬החצים‬
‫הלבנים מסמנים את ה"דליות" שהתפתחו לאורך השלוחות שנוצרו בעקבות ההתמיינות‪.(x200) .‬‬
‫בניסיונות נוספים שבוצעו במעבדתו ע"י אינה קאן ובשיתוף פעולה עם ד"ר פנינה גרין נמצא שהריכוז המיטבי של‬
‫‪ DHA‬שיש להוסיף ל‪"-‬מדיום התמיינות ‪ "I‬הנו ‪ 30‬מיקרומולאר‪ .‬בבדיקת ריכוז חומצות שומן בדופן התאים‬
‫הממוינים נמצא שרמות ‪ (33.08%) PUFA‬עלו באופן מובהק בקבוצה שטופלה ב‪ DHA-‬ב"מדיום התמיינות ‪"I‬‬
‫לעומת הקבוצה שלא טופלה )‪ (24.2%‬והיחס בין הרכב חומצות השומן השתנה‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬בבדיקת ריכוז חומצות‬
‫שומן בדופן התאים הממוינים נמצא שרמות ‪ (25.71%) PUFA‬כמעט ולא השתנו בתאים שטופלו ב‪DHA-‬‬
‫‪136‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫ב"מדיום התמיינות ‪ "II‬לעומת הקבוצה שלא טופלה )‪ .(24.44%‬כלומר קיים יתרון להוסיף את ‪ DHA‬בייחוד‬
‫"במדיום התמיינות ‪ "I‬שבו התאים "מתכוננים" לקראת ההתמיינות העצבית‪ .‬בנוסף‪ ,‬אינה קאן מצאה שהוספת‬
‫‪ DHA‬לתאים מזנכימליים ממקור עכבר שעברו התמיינות עצבית מביאה לביטוי גבוהה יותר של ‪ TH‬לעומת‬
‫תאים שלא טופלו בחומצת שומן )תמונה ‪.(43‬‬
‫תמונה ‪ DHA :43‬מעלה את רמות הביטוי של ‪ .TH‬צביעה אימונוציטוכימית לתאים מזנכימליים ממקור עכברי‬
‫שעברו התמיינות עצבית‪ .‬צביעה אדומה עבור ‪ TH‬וצביעה כחולה עבור ‪ ,DAPI‬קרי צביעה גרעינית‪ .‬תמונות ‪A, B,‬‬
‫‪ C‬התמיינות ללא ‪ ,DHA‬אזורים שונים מאותה בארית‪ D, E, F .‬הוספת ‪ 30µM DHA‬ל"מדיום התמיינות ‪."I‬‬
‫)‪.(x150‬‬
‫‪137‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .6‬התמיינות תאים מזנכימליים אנושיים לתאים דופאמינרגים‬
‫‪ 6.1‬ביטוי ‪ tyrosine hydroxylase‬בתאים מזנכימליים אנושיים שעברו התמיינות לתאי עצב‬
‫השלב הבא שנבדק ‪ -‬האם התאים שעברו התמיינות עצבית מסוגלים לייצר דופאמין כנוירוטרנסמיטור‪ ,‬קרי‬
‫התמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‪ .‬כמתואר בהרחבה בפרק ‪ 2‬במבוא‪ tyrosine hydroxylase (TH) ,‬הנו אנזים‬
‫קובע הקצב בייצור דופאמין בתאים הדופאמינרגיים‪ ,‬כלומר ללא נוכחות ‪ TH‬לא ייווצר דופאמין‪ .‬המצאות ‪TH‬‬
‫נבדקה בשיטות שונות בתאים מזנכימליים ממקור אנושי שהודגרו "במדיום התמיינות ‪ "II‬לפרקי זמן שונים‪.‬‬
‫‪Real-time PCR 6.1.1‬‬
‫בדיקה כמותית של ‪ RNA‬עבור ‪ TH‬נעשה באמצעות ‪ real-time PCR‬של חברת ‪ .Applied Biosystems‬תאים‬
‫מזנכימליים ממקור אנושי עברו התמיינות לתאים דמויי תאי עצב במשך ‪ 12-48‬שעות‪ .‬תהליך ה‪real-time PCR-‬‬
‫בוצע באמצעות שימוש בפרימרים מכוילים של חברת ‪ Celera‬עבור ‪ TH‬ו‪ 18S ribosomal RNA -‬שמשמש כ‪-‬‬
‫‪ .house keeping gene‬נמצא שרמות ‪) mRNA‬נמדד ‪ (cDNA‬של ‪ TH‬עולות באופן מובהק )‪ (p=0.002‬במהלך‬
‫התמיינותם של התאים המזנכימליים לתאי עצב )תמונה ‪ (44‬לעומת תאים לא ממוינים בהם הרמות הן אפסיות‪.‬‬
‫כמו‪-‬כן‪ ,‬באופן כללי רמות תעתיקי ‪ mRNA‬של ‪ TH‬הינן נמוכות לעומת ‪ 18S‬וזאת ניתן להבחין על‪-‬פי הסבב‬
‫)‪ (cycle‬שבו ‪ TH‬מתחיל לעלול לעומת ‪.18S‬‬
‫‪Delta Rn vs. Cycle‬‬
‫‪600‬‬
‫‪p=0.0085‬‬
‫‪500‬‬
‫‪p=0.048‬‬
‫^‪2‬‬
‫‪p=0.010‬‬
‫‪200‬‬
‫‪18 S‬‬
‫‪100‬‬
‫‪0‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪12‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Cycle number‬‬
‫‪hours of differentiation‬‬
‫תמונה ‪ :44‬רמות ‪ mRNA‬של ‪ TH‬עולות במהלך התמיינות עצבית‪ .‬תאים מזנכימליים אנושיים עברו התמיינות‬
‫עצבית במשך ‪ 12-48‬שעות‪ .‬הופק ‪ RNA‬ועבר ‪ reverse transcriptase‬ל‪ .cDNA-‬בוצע ‪ real-time PCR‬על ה‪-‬‬
‫‪ cDNA‬עבור ‪ .TH‬התמונה השמאלית מראה באופן גרפי את התהליך‪ .‬הגרף הימני מכמת את התוצאות בשיטת‬
‫‪ ∆∆Ct‬לעומת תאים שלא עברו התמיינות‪ .‬התוצאות מוצגות כממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן‪ .‬המבחן הסטטיסטי בוצע‬
‫יחסית לתאים שלא עברו התמיינות‪.‬‬
‫‪138‬‬
‫‪Delta Rn‬‬
‫‪300‬‬
‫)‪-(∆∆ Ct‬‬
‫‪400‬‬
‫‪Tyrosine‬‬
‫‪hydroxylase‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪Western Blot 6.1.2‬‬
‫באנליזה כמותית של רמות החלבון ‪ TH‬בתאים מזנכימליים אנושיים ממח עצם שעברו התמיינות עצבית נמצא‬
‫שרמות האנזים הולכות ועולות )‪ (r=0.979, p=0.004‬ככל שמשך זמן ההתמיינות מתארך )תמונה ‪ .(45‬בנוסף‪,‬‬
‫נראה שגם תאים שלא עברו התמיינות מבטאים ‪ TH‬ברמות נמוכות )תמונה ‪ .(45‬לכן לאור תוצאות אלו‬
‫והתוצאות של ‪) real-time PCR‬בהם כמעט ולא נמצאו תעתיקי ‪ mRNA‬בתאים שלא עברו התמיינות( ניתן‬
‫להסיק ש‪ mRNA-‬של ‪ TH‬עובר תרגום לחלבון מהר מאוד ושהוא לא יציב בתאים מזנכימליים שלא עברו‬
‫התמיינות‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫תמונה ‪ :45‬רמות חלבון ‪ TH‬עולות במהלך‬
‫התמיינות עצבית‪ .‬תאים מזנכימליים‬
‫אנושיים עברו התמיינות עצבית במשך ‪24-72‬‬
‫שעות‪ .‬הגרף הנו כימות תוצאות ‪Western‬‬
‫‪ .blot‬בציר ‪ Y‬מוצגות רמות ‪ TH‬מתוקנות‬
‫לרמות ‪.actin‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪100‬‬
‫‪60‬‬
‫‪80‬‬
‫‪40‬‬
‫‪20‬‬
‫‪relative quantity of TH protein‬‬
‫)‪(TH/actin‬‬
‫‪4‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪ 6.1.3‬צביעות אימונוציטוכימיות‬
‫באמצעות צביעות אימונוציטוכימיות נמצא ביטוי של האנזים ‪ TH‬החל מ‪ 6-‬שעות לאחר תחילת ההתמיינות‬
‫)תמונה ‪.(46‬‬
‫‪6h‬‬
‫‪48h‬‬
‫‪Undifferentiated‬‬
‫‪34h‬‬
‫‪12h‬‬
‫תמונה ‪ :46‬תאים מזנכימליים מבטאים ‪ TH‬בעקבות התמיינות עצבית‪ .‬צביעות‬
‫אימונוציטוכימיות עבור ‪ TH‬לתאים מזנכימליים ממקור אנושי שעברו התמיינות‬
‫עצבית במשך ‪ 6-48‬שעות‪.(x200) .‬‬
‫‪139‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪Flow-cytometry 6.1.4‬‬
‫באנליזה ב‪ FACS-‬נמצא שרמות החלבון‬
‫‪ TH‬עולות בכ‪ 20%-‬לאחר השריית התמיינות עצבית בתאים‬
‫מזנכימליים ממקור אנושי )תמונה ‪ .(47‬יש לציין שבכל ארבעת הניסיונות השונים במעקב לאחר רמות ‪ TH‬קיימת‬
‫מגמה ברורה של עלייה ברמות ‪ TH‬בתאים מזנכימליים שעברו התמיינות לעומת תאים שלא עברו התמיינות‪ .‬נכון‬
‫הדבר‪ ,‬שמקבלים תוצאות שונות מבחינת הכימות המספרי בין הניסויים השונים ויתכן שההסבר לכך היא‬
‫הרגישות השונה של כל סוג בדיקה‪ ,‬אבל למסקנה ניתן ברור לקבוע שרמות ‪ TH‬עולות בעקבות ההתמיינות‬
‫העצבית‪.‬‬
‫‪Neuronal induced cells‬‬
‫‪MSCs‬‬
‫תמונה ‪ :47‬רמות ביטוי ‪ TH‬עולות בעקבות התמיינות עצבית‪ .‬תאים מזנכימליים‬
‫ממקור אנושי עברו התמיינות עצבית במשך ‪ 48‬שעות‪ .‬אנליזה להמצאות ‪ TH‬בוצעה‬
‫באמצעות ‪ .FACS‬הגרף השמאלי – תאים שלא עברו התמיינות‪ .‬הגרף הימני –‬
‫תאים שעברו התמיינות‪ .‬העקומה הסגולה – ‪ ,Isotype‬העקומה הירוקה – בדיקה‬
‫עם נוגדן ראשוני ושניוני‪.‬‬
‫‪ 6.2‬התבטאות תעתיקי ‪ RNA‬ייחודיים לתאי עצב דופמינרגיים בעקבות חשיפה למדיום ההתמיינות‬
‫במטרה לעקוב אחר השינויים בביטוי הגנטי בתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שעברו התמיינות עצבית‪,‬‬
‫ולבדוק האם קיים ביטוי לכל ה‪ "machinery"-‬של המערכת הדופאמינרגית‪ ,‬הופק ‪ total RNA‬מתאים שעברו‬
‫הדגרה במדיום התמיינות ‪ II‬לזמנים שונים )‪ 0-72‬שעות(‪ .‬בוצעה אנליזה איכותית וסמי‪-‬כמותית באמצעות ‪RT-‬‬
‫‪ .PCR‬תיאור פעילות החלבונים מופיעה בטבלה ‪.10‬‬
‫טבלה ‪ :10‬סמנים לתאים דופאמנירגיים‬
‫‪Cellular Function‬‬
‫‪Human gene‬‬
‫‪Aldh1, an aldehyde dehydrogenase capable of metabolizing‬‬
‫‪retinaldehyde into retinoic acid. Its expression is confined to‬‬
‫‪proliferating cells of the ventral midbrain neuroepithelium, but it‬‬
‫‪continues to be expressed even after cessation of proliferation‬‬
‫‪and is later colocalized with postmitotic markers including TH‬‬
‫‪marker specific for the proliferating DA progenitor.‬‬
‫‪Catalyzes the transfer of a methyl group from S‬‬‫‪adenosylmethionine‬‬
‫‪to‬‬
‫‪catecholamines,‬‬
‫‪including‬‬
‫‪the‬‬
‫‪Aldehyde dehydrogenase 1 family,‬‬
‫)‪member A1 (Aldh1a‬‬
‫‪140‬‬
‫)‪Catechol-O-methyltransferase (COMT‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
D2 Dopamine receptor (D2DR)
Dopa decarboxylase (AADC)
Dopamine transporter (DAT)
Dopamine β-hydroxylase (DβH)
(not dopaminergic marker)
Engrailed1 (En1)
GTP cyclohydrolase I (GTPCH)
Monoamineoxidase B (MAO-B)
Nuclear receptor related-1 (Nurr1)
Pituitary homeobox 3 (PITX3)
Patched 1 (PTCH)
Smoothened (SMO)
Vesicular monoamine transporter 2
(VMAT2)
neurotransmitters dopamine. This O-methylation results in one of
the major degradative pathways of the catecholamine
transmitters.
The D2 dopamine receptor is a G protein-coupled receptor
located on presynaptic and postsynaptic dopaminergic neurons
that is centrally involved in reward-mediating mesocorticolimbic
pathways
Enzyme implicated in 2 metabolic pathways, synthesizing 2
important neurotransmitters, dopamine and serotonin. Following
the hydroxylation of tyrosine to form L-DOPA, catalyzed by TH,
ADDC decarboxylates L-DOPA to form dopamine
Acts to take released dopamine back up into presynaptic
terminals
Catalyzes the oxidative hydroxylation of dopamine to
norepinephrine. It is almost exclusively located in the adrenal
medulla and the synaptic vesicles of postganglionic sympathetic
neurons and also into the CNS.
En1 may function early in organizing the preblastoderm and later
in neurogenesis. En1 encodes a homeodomain-containing protein
that can function as a transcription factor
Catalyzes the conversion of GTP to D-erythro-7,8dihydroneopterin triphosphate, the first and rate-limiting step in
tetrahydrobiopterin (BH4) biosynthesis. BH4 is an essential
cofactor for tyrosine hydroxylases
A mitochondrial enzyme involved in the degradation of biogenic
amines. The primary type found in the brain of man and other
primates, preferentially degrades phenylethylamine and
benzylamine
Nurr1 have a role in the differentiation of midbrain precursor
cells into dopamine neurons
Pitx3, a homeodomain-containing transcription factor, is
exclusively expressed in midbrain dopaminergic neurons from
embryonic day 11 (E11).
Shh acts through the PTCH-SMO receptor complex to trigger the
activation of an intricate signal-transduction pathway
Acts to accumulate cytosolic monoamines into synaptic vesicles,
using the proton gradient maintained across the synaptic
vesicular membrane. Its proper function is essential to the correct
activity of the monoaminergic systems
Nurr1, ‫נמצא שהתאים שעברו התמיינות מבטאים גורמי שעתוק ייחודיים וחיוניים לתאים דופאמינרגים כדוגמת‬
,‫ התבטאו בתאים שעברו התמיינות וגם בתאים שלא עברו התמיינות‬En1-‫ ו‬Nurr1 .(48 ‫ )תמונה‬PITX3, En1
‫ נמצא בתאים שלא עברו התמיינות ורמתו הולכת ופוחתת ככל שההתמיינות מתקדמת )גורמי שעתוק‬PITX3
‫ הייחודי לתאי אב קדמון דופאמינרגים מתחלקים המעבד‬,Aldh1a1 .(‫ במבוא‬2.5 ‫ ראה פרק‬,‫דופאמינרגים‬
‫ מתבטא רק בתאים שעברו התמיינות ברמות‬,(Lindahl & Evces, 1984) ‫ לחומצה רטינואית‬retinaldehyde
‫( באות לידי‬Ruiz I Altaba et al., 2002) Shh ‫יחידות לרצפטור עבור‬-‫ שתי תת‬PTCH-‫ ו‬SMO .(48 ‫שונות )תמונה‬
,‫ במבוא‬2 ‫ כמתואר בפרק‬.(48 ‫ביטוי בתאים מזנכימליים נאיבים ובתאים שעברו התמיינות רמתן עולה )תמונה‬
TH ‫ בשלב הראשון חומצת האמינו טירוזין הופכת ע"י האנזים‬:‫ייצור דופאמין מתבצע בשביל המטבולי הבא‬
141
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫)שלב קובע קצב( ל‪ L-DOPA -‬פעילותו הדורשת נוכחות של קואנזים ‪ .(BH4) tetrahydrobiopterin‬נמצא‬
‫שבעקבות ההתמיינות רמת ‪) GTP cyclohydrolase I‬אנזים קובע קצב ליצירת ‪ (BH4‬הולכת ועולה עם‬
‫התקדמות ההתמיינות )תמונה ‪ .(48‬בשלב השני ליצירת דופאמין מתרחשת דה‪-‬קרבוקסילציה )ע"י האנזים‬
‫‪ (AADC‬המצוי בתאים המזנכימליים שעברו התמיינות )תמונה ‪ .(48‬כמו‪-‬כן‪ ,‬נמצא שאנזימי הפירוק של דופאמין‬
‫באים לידי ביטוי‪ ,‬בעוד ש‪ MAO-B-‬מתבטא רק בתאים שעברו התמיינות‪ COMT ,‬מתבטא גם בתאים שלא עברו‬
‫התמיינות )תמונה ‪ .(48‬יתרה מכך‪ ,‬הרצפטורים ‪ DAT‬ו‪ D2DR-‬מתבטאים רק בתאים שעברו התמיינות‪ ,‬ורמתם‬
‫הולכת ומתגברת ככל שמהלך ההתמיינות מתקדם )תמונה ‪ .(48‬בנוסף‪ ,‬לא נמצאה נוכחות ‪ DβH‬בתאים‬
‫המזנכימליים שעברו התמיינות עצבית דופאמינרגית )תמונה ‪ .(48‬וזאת בהתאם לידוע בספרות שבניגוד לתאי‬
‫עצב אדרנרגים או נוראדרנרגים‪ ,‬תאי עצב דופאמינרגים אינם מבטאים את האנזים ‪ ,DβH‬ההופך דופאמין‬
‫לנוראפינאפרין )ראה הרחבה בפרק ‪ 2.1‬במבוא(‪.‬‬
‫‪72‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪12‬‬
‫‪Hours 0‬‬
‫‪Nurr 1‬‬
‫‪PITX3‬‬
‫‪En1‬‬
‫‪Dopaminergic‬‬
‫‪transcription‬‬
‫‪factors‬‬
‫‪Aldh1a1‬‬
‫‪SMO‬‬
‫‪PTCH‬‬
‫‪Shh‬‬
‫‪receptors‬‬
‫)‪Dopa decarboxylase (AADC‬‬
‫‪GTP cyclohydrolase I‬‬
‫‪MAO B‬‬
‫‪COMT‬‬
‫‪Dopaminergic‬‬
‫‪machinery‬‬
‫‪enzymes‬‬
‫)‪Dopamine transporter (DAT‬‬
‫)‪D2 Dopamine receptor (D2DR‬‬
‫)‪Dopamine β-hydroxylase (DβH‬‬
‫‪GAPDH‬‬
‫תמונה ‪ :48‬תאים מזנכימליים שעברו התמיינות מבטאים תעתיקים עבור המנגנון של תאים דופאמנירגים‪.‬‬
‫תאים מזנכימליים ממקור אנושי עברו התמיינות במשך ‪ 12-72‬שעות‪ .‬הופק ‪ RNA‬ועבר ‪ reverse transcriptase‬ל‪-‬‬
‫‪ .cDNA‬בוצע ‪ PCR‬על ה‪ cDNA-‬של חלבוני המנגנון המצוי בתאים דופאמינרגים )למעט ‪.(COMT‬‬
‫‪142‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ 6.3‬ביטוי ‪ Vesicular monoamine transporter 2‬בתאים שעברו התמיינות‬
‫בתאים הדופאמינרגיים מצויה תעלה ‪ VMAT2‬שתפקידה להכניס דופאמין ציטופלסמטי אל תוך שלפוחיות‬
‫)ואסיקולות( על מנת לאחסנם ולשחררם באופן מבוקר בעת הצורך )‪) (Miller et al., 1999‬הרחבה בפרק ‪2.3‬‬
‫במבוא(‪ .‬באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי נראתה צביעה ל‪ VMAT2-‬בתאים מזנכימליים ממקור אנושי שעברו‬
‫התמיינות עצבית )תמונה ‪ .(49‬יש לשים לב שהצביעה אינה "נמרחת" בתא אלא מופיעה כמגורענת‪ ,‬עדות לכך‬
‫שמדובר כנראה בצביעה של שלפוחיות‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬בהגדלה של האזור הקרוב לדופן התא נראה שהאזור לכאורה‬
‫עשיר בואסיקולות )תמונה ‪ .(49‬אומנם‪ ,‬לא סביר שבתא דופאמנירגי תהיה פריסה של ואסיקולות בכל‬
‫הציטופלסמה‪ ,‬כמופיע בתמונה ‪ ,49‬אך יתכן מכיוון שמדובר בתא דופאמינרגי לא בשל )עדיין בתהליכי התמיינות(‬
‫לפי שעה אין סידור של הואסיקולות באופן מעודף ליד דופן התא‪.‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫תמונה ‪ :49‬הימצאות ‪ VMAT2‬בתאים שעברו התמיינות‪ .‬צביעה אימונוציטוכימית ל‪ VMAT2-‬בתאים‬
‫מזנכימליים ממקור אנושי שעברו התמיינות עצבית במשך ‪ .5‬תאים שלא עברו התמיינות )תמונה שמאלית( לא‬
‫"נצבעו"‪ .‬תאים שעברו התמיינות "נצבעו" )תמונה ימנית(‪ .‬הגדלה של אזור דופן התא )תמונה תחתונה(‪ .‬צולם‬
‫במיקרוסקופ קונפוקלי‪.(x400) .‬‬
‫‪ 6.4‬חשיפת תאים מזנכימליים למדיום התמיינות דופאמינרגי הביאה ליצירת והפרשת דופאמין‬
‫על מנת להעריך‪ ,‬האם תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שעברו הדגרה ב"מדיום התמיינות ‪ "II‬מייצרים‬
‫ומפרישים דופאמין או מטבוליטים שלו‪ ,‬נבדקו רמות קטכולאמינים המצטברים במהלך גידול ‪ /‬התמיינות של‬
‫תאים‪ .‬הפרשה בסיסית )במצב מנוחה( של קטכולאמינים נבדקו בעקבות השראת התאים ב‪ HBSS-‬למשך ‪35‬‬
‫דקות‪ .‬רמות הפרשה של קטכולאמינים כתוצאה מדה‪-‬פולריזציה‪ ,‬נבדקו לאחר הדגרת התאים ב‪HBSS with -‬‬
‫‪143‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .56mM KCl‬הבדיקה התבצעה במכשיר ‪ HPLC‬באמצעות גלאי אלקטרוכימי‪ .‬יש לציין‪ ,‬שבבדיקות לא נמצאו‬
‫עקבות לחומרים אדרנרגים ונואדרנרגים(‪.‬‬
‫‪ 6.4.1‬ייצור והפרשת ‪DOPA‬‬
‫בעקבות הדגרה של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי ב"מדיום התמיינות ‪ ,"II‬רמות הפרשה בסיסית של‬
‫‪ DOPA‬שנמצאו במדיום הלכו ועלו )‪ (r=0.904, p=0.017‬ככל שמשך זמן ההתמיינות התארך )תמונה ‪ .(50‬לאחר‬
‫‪ 12‬שעות במדיום התמיינות רמת ההפרשה הבסיסית של ‪ DOPA‬למדיום היו ‪ 122 pg/ml per 105 cells‬והגיעו ל‪-‬‬
‫‪ 307 pg/ml per 105 cells‬לאחר ‪ 72‬שעות התמיינות )תמונה ‪ .(50‬בנוסף‪ ,‬לאחר דפולריזציה עם ‪ 56mM KCl‬ניתן‬
‫לומר שלא נצפתה הפרשת ‪) DOPA‬תמונה ‪ ,(50‬וזאת בעקבות ש‪ DOPA-‬אינו נאגר בתוך בועיות )וסיקולות(‬
‫כדוגמת דופאמין‪.‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫‪DOPA‬‬
‫‪A‬‬
‫‪350‬‬
‫‪300‬‬
‫‪250‬‬
‫‪200‬‬
‫‪150‬‬
‫‪100‬‬
‫‪50‬‬
‫)‪DOPA pg/ml (105 hBMSc‬‬
‫‪Basal‬‬
‫‪56mM KCl‬‬
‫‪Non-differentiated‬‬
‫‪Standard‬‬
‫‪B‬‬
‫‪C‬‬
‫‪0‬‬
‫‪72‬‬
‫‪24‬‬
‫‪48‬‬
‫‪0‬‬
‫‪12‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫תמונה ‪ :50‬עלייה בהפרשת רמות ‪ DOPA‬בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות עצבית‪ .‬מדידת הפרשת ‪DOPA‬‬
‫בתאים מזנכימליים ממקור אנושי שנחשפו למדיום התמיינות לפרקי זמן שונים‪ 3 (A-C .‬כרומטוגרמות‪ ,‬ב‪ A-‬ניתן‬
‫להבחין בפיק של ‪ DOPA‬בדוגמה מתאים שעברו התמיינות‪ (B ,‬לא קיים פיק של ‪ DOPA‬בתאים שלא עברו‬
‫התמיינות‪ (C ,‬פיק של ‪ DOPA‬בתמיסת סטנדארט‪ .‬גרף כחול מייצג הפרשה באזלית של ‪ ,DOPA‬גרף אדום‬
‫הפרשת ‪ DOPA‬לאחר דפולריזציה‪) .‬אנליזה באמצעות ‪.(HPLC‬‬
‫‪ 6.4.2‬ייצור והפרשת ‪DOPAC‬‬
‫בנוסף ל‪ DOPA-‬נבדקו רמות )‪ ,3,4-dihdroxyphenylacetic acid (DOPAC‬תוצר פירוק של דופאמין‪ .‬תאים‬
‫מזנכימליים ממקור אנושי הודגרו ב"מדיום התמיינות ‪ "II‬לפרקי זמן שונים‪ .‬נמצאו רמות הולכות ועולות של‬
‫‪144‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫הפרשה בסיסית של ‪ DOPAC‬עם התקדמות משך התמיינות התאים )תמונה ‪ .(r=0.964, p=0.085) (51‬לא נמצאו‬
‫רמות ‪ DOPAC‬בעקבות דפולריזציה עם ‪.56mM KCl‬‬
‫‪120‬‬
‫‪80‬‬
‫‪60‬‬
‫‪40‬‬
‫‪20‬‬
‫‪6‬‬
‫תמונה ‪ :51‬עלייה בהפרשת רמות ‪DOPAC‬‬
‫בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות‬
‫עצבית‪ .‬מדידת הפרשת ‪ DOPAC‬בתאים‬
‫מזנכימליים ממקור אנושי שנחשפו למדיום‬
‫התמיינות לפרקי זמן שונים‪ .‬הגרף מייצג‬
‫הפרשה באזלית של ‪) .DOPAC‬אנליזה‬
‫באמצעות ‪) .(HPLC‬התוצאות מוצגות‬
‫כממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן(‬
‫)‪DOPAC ng/ml (10 cells‬‬
‫‪100‬‬
‫‪0‬‬
‫‪20‬‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪50‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪ 6.4.3‬ייצור והפרשת דופאמין‬
‫במטרה לבדוק האם תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי מייצרים ומפרישים דופאמין‪ ,‬התאים נחשפו לפרקי זמן‬
‫שונים ל"מדיום התמיינות ‪ "II‬שהוסף לו ‪") GDNF‬מדיום התמיינות להפרשת דופאמין"(‪ .‬כפי שניתן להתרשם‬
‫מתמונה ‪ ,52‬תאים שלא עברו התמיינות לא הפרישו דופאמין‪ .‬מאידך‪ ,‬לאחר ‪ 24‬שעות של התמיינות התאים‬
‫הפרישו ‪ 186 pg/ml‬דופאמין כהפרשה בסיסית ו‪ 65 pg/ml-‬לאחר דפולריזציה )תוצאות עבור ‪ 2x105‬תאים(‪ .‬יש‬
‫לציין שלא נצפתה הפרשת דופאמין אלא רק לאחר הוספת ‪ GDNF‬ל"מדיום התמיינות ‪."II‬‬
‫‪Basal‬‬
‫‪150‬‬
‫‪56mM KCl‬‬
‫‪120‬‬
‫‪90‬‬
‫‪60‬‬
‫‪30‬‬
‫)‪Dopamine pg /ml (2x105 cells‬‬
‫‪180‬‬
‫‪hBMSc‬‬
‫‪Differentiated‬‬
‫‪for 24h,‬‬
‫‪treated with‬‬
‫‪56mM of KCl‬‬
‫‪for 35 min‬‬
‫‪release 1 nM‬‬
‫‪DA‬‬
‫‪A‬‬
‫‪B‬‬
‫‪Standards‬‬
‫‪DA‬‬
‫‪0‬‬
‫‪24‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫תמונה ‪ :52‬הפרשת דופאמין בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות עצבית‪ .‬מדידת הפרשת דופאמין בתאים‬
‫מזנכימליים ממקור אנושי שנחשפו למדיום התמיינות בתוספת ‪ GDNF‬לפרקי זמן שונים‪ .‬העמודה הכחולה‬
‫מייצגת הפרשה באזלית של דופאמין והעמודה האדומה מייצגת הפרשת דופאמין לאחר דפולריזציה‪) .‬אנליזה‬
‫באמצעות ‪.(n=1) (HPLC‬‬
‫‪145‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .7‬התמיינות תאים מזנכימליים אנושיים לתאים עם סמנים סרוטונרגיים‬
‫בניסיונות אלו נבדק האם התאים המזנכימליים ממקור אנושי שעוברים התמיינות לתאים דמויי תאי עצב‬
‫דופאמינרגים מבטאים סמנים של ניורוטרסמיטורים אחרים‪ .‬נמצא שהתאים שעברו התמיינות מבטאים ‪mRNA‬‬
‫של )‪ ,tryptophan hydroxylase (TPH‬אנזים קובע הקצב ליצירת סרוטונין )תמונה ‪ .(53A‬בנוסף‪ ,‬באמצעות‬
‫‪ Western blot‬נראה שככל שמשך ההתמיינות הייתה ארוכה יותר כך עלו )‪ (r=0.944, p=0.016‬רמות חלבון ‪TPH‬‬
‫עלו )תמונה ‪ .(53B‬כמו כן‪ ,‬תאים שלא עברו התמיינות לא ביטאו ‪) TPH‬תמונה ‪ .(53‬באנליזה ב‪ HPLC-‬נמצא‬
‫שהתאים שעברו התמיינות מפרישים רמות נמוכות )‪ 5-hydroxyindoleacetic acid (5HIAA‬שהנו תוצר פירוק‬
‫של סרוטונין )תמונה ‪ ,(53C‬מאידך‪ ,‬לא נמצא ב‪ HPLC-‬הפרשה של סרוטונין‪ .‬יש לציין שבכל הניסיונות לא נמצא‬
‫‪4‬‬
‫‪A) Western blot‬‬
‫תמונה ‪ :53‬תאים מזנכימליים שעברו‬
‫התמיינות מבטאים סמנים לתאים‬
‫סרוטונרגיים‪ .‬תאים מזנכימליים ממקור‬
‫אנושי לאחר השראת התמיינות עצבית‬
‫לפרקי זמן שונים‪ (A .‬הופק חלבון וביצוע‬
‫מבחן ‪ Western blot‬עבור ‪.TPH‬‬
‫התוצאות המוצגות הן היחס בין עוצמת‬
‫הבנד של ‪ TPH‬לבין אקטין‪.‬‬
‫‪ PCR (B‬עבור ‪ ,TPH‬נמצאו בנדים רק‬
‫בתאים שעברו התמיינות‪.‬‬
‫‪ (C‬ב‪ HPLC-‬נמצא ‪ ,5HIAA‬תוצר‬
‫הפירוק של סרוטונין‪) .‬ממוצע ‪ ±‬שגיאת‬
‫התקן(‪.‬‬
‫‪3‬‬
‫‪2‬‬
‫‪1‬‬
‫‪0‬‬
‫‪100‬‬
‫‪60‬‬
‫‪80‬‬
‫‪20‬‬
‫‪40‬‬
‫)‪Ratio TPH / Actin (A.U.‬‬
‫סימון בתאים שלא עברו התמיינות‪.‬‬
‫‪0‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫)‪B) RT-PCR (cDNA analysis‬‬
‫‪Hours of differentiation‬‬
‫‪48‬‬
‫‪24‬‬
‫‪6‬‬
‫‪0‬‬
‫‪3‬‬
‫‪C) HPLC‬‬
‫‪40‬‬
‫‪20‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫‪20‬‬
‫‪30‬‬
‫‪40‬‬
‫‪hours of differentiation‬‬
‫‪50‬‬
‫‪146‬‬
‫‪10‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪5HIA A (ng /m l‬‬
‫‪30‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
.‫ הבנד הופק מתוך הג'ל ונשלח לקביעת רצף‬,TPH ‫ של‬mRNA-‫ שהתקבל מקורו ב‬PCR-‫על מנת לוודא שתוצר ה‬
‫ )תמונה‬TPH ‫ של‬mRNA -‫ נמצא שתוצר קביעת הרצף זהה כמעט לחלוטין ל‬NCBI Blast ‫על פי בדיקה בתוכנת‬
.(54
Blast 2 Sequences results
PubMed
Entrez
BLAST
OMIM
Taxonomy
Structure
BLAST 2 SEQUENCES RESULTS VERSION BLASTN 2.2.5 [Nov-16-2002]
Homo sapiens tryptophan hydroxylase 1
Length
Sequence 1 gi|4759247|ref|NM_004179.1| (tryptophan 5-monooxygenase) (TPH1),
1335
mRNA
Length
Sequence 2 Result of sequencer
351
Score = 375 bits (195), Expect = e-101
Identities = 265/295 (89%), Gaps = 2/295 (0%)
Strand = Plus / Minus
Score = 375 bits (195), Expect = e-101
Identities = 265/295 (89%), Gaps = 2/295 (0%)
Strand = Plus / Minus
TPH cDNA: 810
Subject:
337
TPH cDNA: 870
Subject:
277
TPH cDNA: 930
Subject:
217
TPH cDNA: 990
Subject:
157
ctgccatgaactcttaggtcatgtcccgcttttggctgaacctagttttgcccaattctc 869
||||||||||||||||||||| ||||| || ||||||||||| |||||||| ||||||||
ctgccatgaactcttaggtcacgtccctctcttggctgaacccagttttgctcaattctc 278
ccaagaaattggcttggcttctcttggcgcttcagaggaggctgttcaaaaactggcaac 929
||||||||||||| ||||||||||||| |||||||||||| | ||||| |||||||||||
ccaagaaattggcctggcttctcttggagcttcagaggagacggttcagaaactggcaac 218
gtgctactttttcactgtggagtttggtctatgtaaacaagatggacagctaagagtctt 989
||||||||| ||||||||||||||||| || || || |||||||| ||||| ||||||||
gtgctacttcttcactgtggagtttggactgtgcaagcaagatgggcagctgagagtctt 158
tggtgctggcttactttcttctatcagtgaactcaaacatgcactttctggacatgccaa 1049
|||||| ||| | |||||||| |||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||
tggtgccggcctgctttcttccatcagtgagctcagacatgcactttctggacatgccaa 98
TPH cDNA: 1050 agtaaagcc-ctttgat-cccaagattacctgcaaacaggaatgtcttatcacaa 1102
|| ||||| ||||||| |||||| || ||||||||||||||||||| |||||||
Subject: 97
ggttaagccgctttgatacccaaggttgcctgcaaacaggaatgtctcatcacaa 43
‫ מתאים מזנכימליים אנושיים שעברו‬cDNA ‫ עבור‬PCR ‫ קביעת רצף לתוצר‬.TPH ‫ קביעת רצף עבור‬:54 ‫תמונה‬
NCBI, ‫ ממאגר‬TPH ‫ של‬cDNA-‫ לתוצר קביעת הרצף ול‬BLAST ‫ בוצעה אנליזת‬.‫התמיינות עצבית‬
.‫ הנו תוצר קביעת הרצף‬Subject-‫ ה‬.NM_004179.1
147
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .8‬תאים מזנכימליים שהתמיינו לתאים דמוי תאי עצב מציגים פרמטרים אלקטרופיסיולוגיים‬
‫המאפיינים תאי עצב‬
‫כל הניסויים האלקטרופיסיולוגיים בוצעו בשיתוף עם ד"ר אורי אשרי מהפקולטה למדעי החיים באוניברסיטת‬
‫תל‪-‬אביב‪.‬‬
‫כידוע תא עצב הנו תא שמסוגל להעביר אותות עצביים‪,‬ומאופיין בפעילות חשמלית המתרחשת בקרום התא‪.‬‬
‫פעילות חשמלית זאת מהווה את האמצעי להעברת מידע בתוך מערכת העצבים‪ ,‬ולאורך האקסונים של תאי‬
‫העצב‪ .‬קרום התא במצב של מנוחה טעון )מקוטב( הודות לריכוזים השונים של יונים בתוך התא ומחוצה לו‪.‬‬
‫כאשר נוצר אות עצבי‪ ,‬מתפשט גל של דפולריזציה‪ ,‬ויונים זורמים דרך הקרום‪ .‬אותות עצביים נוספים יכולים‬
‫לעבור רק אחרי שהתא עובר רפולריזציה‪.‬‬
‫תאים מזנכימליים ממקור אנושי עברו התמיינות עצבית במשך ‪ 48‬שעות עד ‪ 5‬ימים ונבדקו בהם מדדים‬
‫אלקטרופיסיולוגיים המאפיינים תאי עצב‪ .‬באופן טכני הצלחנו לבצע מבחנים אלקטרופיסיולוגיים רק בתאים‬
‫מזנכימליים שעברו התמיינות לתאי עצב‪ ,‬מאידך תאים שלא עברו התמיינות והנם תאים שטוחים‪ ,‬לא ניתן לבצע‬
‫בהם ניסיונות אלקטופיסיולוגיים‪.‬‬
‫ריכוזי הסידן במצב מנוחה בתוך התאים שעברו התמיינות היו נמוכים כ‪ ,40 nM -‬כלומר רמת סידן פיזיולוגית‬
‫המעידה על חיות התאים‪ .‬לאחר דפולוריזציה ע"י ‪ KCl‬הייתה עליה מהירה של רמות הסידן התוך תאי עד לרמות‬
‫של ‪) 1.3 µM‬תמונה ‪ .(55‬עליה מהירה של סידן תוך תאי כתוצאה מדפולריציה ע"י ‪ KCl‬יכולה לנבוע בעיקר‬
‫כתוצאה מהפעלת תעלות סידן תלויות מתח על פני ממברנת התא וכך סידן מחוץ לתא נכנס לתא‪ ,‬או לעיתים‬
‫כתוצאה משחרור סידן תוך תאי‪.‬‬
‫‪1.5‬‬
‫‪Cell 3, 1300 nM‬‬
‫‪Cell 4, 630 nM‬‬
‫‪Cell 2, 770 nM‬‬
‫‪Cell 5, 660 nM‬‬
‫‪Cell 1, 590 nM‬‬
‫‪0.5‬‬
‫)‪Calcium (µM‬‬
‫‪1.0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪1000‬‬
‫‪600‬‬
‫‪800‬‬
‫‪400‬‬
‫)‪time (sec‬‬
‫תמונה ‪ :55‬עליית ריכוזי סידן תוך תאי בעקבות דפולריזציה בתאים מזמכימליים שעברו התמיינות לתאי עצב‬
‫במשך ‪ 5‬ימים‪ .‬דפולריזציה ע"י ‪ 70mM KCl‬ובדיקת ריכוזי הסידן בחמישה תאים שונים‪.‬‬
‫‪148‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫פוטנציאל המנוחה של התאים שעברו התמיינות לתאי עצב הנו ‪ ,- 70 mV‬פוטנציאל מנוחה האופייני לתאי עצב‪.‬‬
‫כאשר מעלים את מתח הממברנה אזי ניתן למדוד זרם וכאשר מפסיקים לטעון את הממברנה אזי הזרם חוזר‬
‫להיות אפס‪ ,‬קרי הממברנה שלמה ומתפקדת היטב )תמונה ‪ .(56‬כמו‪-‬כן‪ ,‬ככל שהמתח שהוטען גבוה יותר אזי גם‬
‫‪800‬‬
‫‪A‬‬
‫הזרם שנמדד בממברנה גבוה יותר ממשנהו‪.‬‬
‫‪600‬‬
‫‪200‬‬
‫‪0‬‬
‫‪-200‬‬
‫‪-400‬‬
‫)‪Current (pA‬‬
‫‪400‬‬
‫‪-600‬‬
‫‪-800‬‬
‫‪0.30‬‬
‫‪0.25‬‬
‫‪0.20‬‬
‫‪0.10‬‬
‫‪0.15‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0.05‬‬
‫)‪time (sec‬‬
‫‪B‬‬
‫‪+10mV‬‬
‫‪-10mV‬‬
‫‪-70mV‬‬
‫תמונה ‪ :56‬מדידת זרם בעקבות הטענת הממברנה של תאים מזנכימליים שעברו התמיינות במשך ‪ 48‬שעות‪(A .‬‬
‫גרף המייצג זרם העובר בממברנה בעקבות הטענת מתח‪ (B .‬מתח ממברנה במצב מנוחה הוא ‪ -70mV‬כאשר‬
‫מעלים את המתח ל ‪) -10mV-‬גרף כחול( עד ‪) 10mV‬גרף אדום( אזי גם הזרם עולה‪.‬‬
‫טעינת ממברנת התאים מזנכימליים ממקור אנושי שעברו התמיינות במשך ‪ 48‬שעות‪ ,‬הביאה לעליית מתח‬
‫הממברנה שנמדד ע"י ‪) patch-clamp‬תמונה ‪ .(57‬ככל שהממברנה נטענה בזרם גבוה יותר אזי עליית המתח הנה‬
‫גבוהה יותר‪ .‬בעליית זרם לנקודת סף הביאה את הממברנה להתפרצות קטנה ביותר של מתח‪ ,‬קרי תחילתו של‬
‫פוטנציאל פעולה )מסומן בחץ אדום בתמונה ‪ .(57‬כל הממצאים האלקטרופיסיולוגיים שנמצאו בתאים הממוינים‬
‫הינם אופייניים לתאי עצב )אך לא ייחודיים(‪.‬‬
‫‪50mV‬‬
‫‪Resting‬‬
‫‪membrane -70mV‬‬
‫‪potential‬‬
‫‪0.4‬‬
‫‪0.3‬‬
‫‪0.1‬‬
‫‪0.2‬‬
‫‪0‬‬
‫)‪time (sec‬‬
‫‪I‬‬
‫תמונה ‪ :57‬אקסטביליות )‪ (excitability‬של ממברנת תאים מזנכימליים שעברו התמיינות במשך ‪ 48‬שעות‪.‬‬
‫המדידות המוצגות נעשו בתא אחד‪ ,‬מעלים זרם )מסומן ב‪ (I-‬וכתוצאה מכך מתח הממברנה עולה‪.‬‬
‫‪149‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ .9‬השפעת השתלת תאים מזנכימליים במודלים למחלת פרקינסון‬
‫בעקבות התוצאות הראשוניות שהוצגו בעבודה זו ובמקביל למחקר שתואר עד כה של התמיינות תאים‬
‫מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים בתרביות‪ ,‬נבחן במעבדתנו פוטנציאל ההגנה של תאים‬
‫מזנכימליים בהשתלה ‪ in-vivo‬במודלים מקובלים של מחלת פרקינסון במכרסמים‪ .‬העבודה בחולדות בוצעה ע"י‬
‫ד"ר טובר‪-‬ספינוזה זולמה והעבודה בעכברים בוצעה ע"י ברהום יעל‪) .‬מכיוון שהעבודה בחיות לא בוצעה על ידי לא‬
‫תואר בפרק שיטות וחומרים מהלך העבודה(‪.‬‬
‫‪ 9.1‬השפעת השתלת תאים מזנכימליים במודל למחלת הפרקינסון בחולדות‬
‫במטרה לבחון את השיפור האפשרי ‪ in-vivo‬באמצעות השתלת תאים‪ ,‬נעשה שימוש במודל פרקינסוני בחולדות‬
‫שעברו לזייה חד צידית )בצד ימין( עם ‪ 6-OHDA‬לתוך הניגרה‪ .‬קבוצת הביקורת )‪ (n=9‬הוזרקה בסליין לניגרה‬
‫כשלשה שבועות לאחר ביצוע הלזייה עם ‪ .6-OHDA‬קבוצת הניסוי )‪ (n=11‬הוזרקה לניגרה השמאלית והימנית‪,‬‬
‫כשלשה שבועות לאחר ביצוע הלזייה‪ ,‬ב‪ 0.5x106-‬תאים מזנכימליים ממח העצם של עכברים טרנסגנים ל‪EGFP-‬‬
‫שעברו התמיינות עצבית במשך ‪ 48‬שעות )ראה פרק ‪ 2‬בתוצאות(‪ .‬לאחר ההשתלה ומדי שבועיים במשך ‪ 45‬יום נערך‬
‫מעקב קליני בעזרת מבחן הסיבובים ]הסיבובים האיפסילטרליים שהושרו ע"י אמפטמין)‪ .[(5 mg/kg, s.c‬נמצא‬
‫שהשתלת התאים לניגרה הפחיתה באופן משמעותי )‪ (p=0.004‬את מספר הסיבובים האיפסילטרליים שהושרו ע"י‬
‫אמפטמין )תמונה מס' ‪ (58A‬והביאה לשיפור קליני משמעותי‪ .‬השיפור נראה כבר כעבור שבועיים ואילו לאחר ‪45‬‬
‫יום נראתה ירידה של למעלה מ‪ 80%-‬במספר הסיבובים בשעה )מ‪ 300-‬ל‪ 50-‬סיבובים לשעה(‪ .‬כעבור ‪ 45‬יום החיות‬
‫הוקרבו ותאי הגזע המושתלים זוהו בעזרת מיקרוסקופ פלורסנטי‪ .‬בדיקה היסטולוגית של אזורי ההזרקה מראה‬
‫שתאי הגזע המושתלים שרדו במח החולדה למשך ארבעים וחמישה ימים הן בצד הפגוע והן בצד הבריא )תמונה‬
‫‪ .(58B-C‬יש לציין שבצד הפגוע שרדו יותר תאים מאשר הצד הבריא‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬תאים שעברו השתלה לניגרה‬
‫מבטאים ‪ ,TH‬סמן לתא דופאמינרגי )תמונה ‪ .(58F-I‬בנוסף‪ ,‬נראו תאים פלורסנטים ירוקים בסטריאטום )תמונה‬
‫‪ ,(58D-E‬כלומר הייתה נדידת תאים מאתר ההשתלה בניגרה עד לסטריאטום‪ .‬תוצאות דומות לאלו‪ ,‬קרי השתלת‬
‫תאים לניגרה המביאה לשיפור קליני‪ ,‬הוצגו לאחרונה בניסויים בבני אדם בהם השתילו תאים ממקור עובר‬
‫ישירות לניגרה ונצפה שיפור מובהק בסימפטומים עם פחות תופעות לוואי לעומת השתלה לסטריאטום )‪Sanchez-‬‬
‫‪.(Pernaute et al., 2005‬‬
‫תמונה ‪ :58‬השתלת תאים מזנכימליים לחולדת מודל למחלת פרקינסון‪ .‬תאים מזנכימליים ממח העצם של עכבר‬
‫טרנסגני ל‪ EGFP-‬עברו התמיינות עצבית למשך ‪ 48‬שעות‪ 0.5x106 .‬תאים הושתלו בניגרה ב‪ 2 -‬הצדדים בחולדה‪.‬‬
‫‪ (A‬שיפור קליני בחולדות שעברו השתלה )ממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן(‪ .‬תאים "ירוקים" בניגרה בצד ‪ (B‬שמאל ‪(C‬‬
‫וימין ובסטריאטום בצד ‪ (D‬שמאל ‪ (E‬ובצד ימין לאחר ‪ 45‬ימים מההשתלה‪ (F.‬צביעת ‪ DAPI‬בניגרה‪ (G ,‬החצים‬
‫מסמנים תאים מושתלים בצביעה ירוקה‪ (H ,‬החצים מסמנים צביעה ל‪ (I ,TH-‬תמונות ‪ G‬ו‪ H-‬חופפות‪.‬‬
‫‪150‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫תוצאות‬
Rotations (% of pretransplantation)
A
Transplantation cells
Saline
120
100
84.4
80
p=0.3
60
52.6
p=0.03
40
30.4
p=0.0036
20
8.1
p=0.00094
0
0
5
10
15
20
25
30
35
Days post transplantation
40
Substania Nigra
B
C
Striatum
E
D
Left hemisphere
Right hemisphere
F
H
G
I
151
45
50
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪ 9.2‬השפעת השתלת תאים מזנכימליים במודל למחלת הפרקינסון בעכברים‬
‫במטרה לבחון את השיפור האפשרי ‪ in-vivo‬באמצעות השתלת תאים אוטולוגית‪ ,‬נעשה שימוש במודל פרקינסוני‬
‫בעכברים שעברו לזייה חד צידית )בצד ימין( עם ‪ 6-OHDA‬לתוך הסטריאטום‪ .‬קבוצת הביקורת )‪ (n=3‬הוזרקה‬
‫בסליין לסטריאטום כשלשה שבועות לאחר ביצוע הלזייה עם ‪ .6-OHDA‬קבוצת הניסוי )‪ (n=4‬הוזרקה‬
‫לסטריאטום הימני כשלשה שבועות לאחר ביצוע הלזייה‪ ,‬ב‪ 1-1.5x105-‬תאים מזנכימליים ממח העצם של עכברים‬
‫טרנסגנים ל‪ EGFP-‬שעברו התמיינות עצבית במשך ‪ 48‬שעות )ראה פרק ‪ 2‬בתוצאות(‪] .‬בימים אלו המחקר נמצא‬
‫בעיצומו ולכן מוצגות תוצאות עם מספר פריטים נמוך[‪ .‬לאחר ההשתלה ומדי שבועיים במשך ‪ 14‬שבועות נערך‬
‫מעקב קליני בעזרת מבחן הסיבובים )הסיבובים האיפסילטרליים שהושרו ע"י אמפטמין(‪ .‬נמצא שהשתלת התאים‬
‫לסטריאטום הפחיתה באופן משמעותי )‪ (p=0.004‬את מספר הסיבובים האיפסילטרליים שהושרו ע"י אמפטמין‬
‫)תמונה מס' ‪ (59A‬והביאה לשיפור קליני משמעותי‪ .‬השיפור נראה כבר כעבור כשלשה שבועות ואילו לאחר ‪15‬‬
‫שבועות נראתה ירידה של למעלה מ‪ 80%-‬במספר הסיבובים בשעה‪ .‬כעבור ‪ 15‬יום החיות הוקרבו ותאי הגזע‬
‫המושתלים זוהו בעזרת מיקרוסקופ פלורסנטי‪ .‬כפי שניתן להתרשם מתמונות ‪ 59B-D‬התאים המושתלים שרדו‬
‫באתר ההשתלה במשך ‪ 15‬שבועות‪ .‬בנוסף‪ ,‬כ‪ 10%-‬מהתאים המושתלים מבטאים ‪ .TH‬כמו –כן נמצאו תאים‬
‫שנדדו לניגרה‪ ,‬אך תאים אלו אינם נצבעים ל‪) TH-‬תמונה ‪ .(59E-G‬מכיוון שמצד אחד ישנו שיפור ניכר‬
‫בסימפטומים הקליניים ומאידך רק כ‪ 10%-‬מהתאים המושתלים נצבעו ל‪ ,TH-‬יתכן שהתאים המושתלים מהווים‬
‫בעיקר תאי תמיכה באזור ההשתלה ואף מפרישים חומרים ניורוטרפיים כגון ‪) GDNF‬כמו שנמצא בימים אלו‬
‫במעבדתנו שתאים מזנכימליים מייצרים ‪.(GDNF‬‬
‫תוצאות אלו במודלים במכרסמים למחלת פרקינסון מוכיחות שלתאי גזע מזנכימליים ממח עצם בוגר קימת‬
‫יכולת לשרוד במוח ואף להביא לשיפור קליני‪ .‬מחקרים אלו תומכים באפשרות של השתלה עצמית של תאי גזע‬
‫ממח עצם כטיפול במחלת פרקינסון‪.‬‬
‫‪152‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫תוצאות‬
‫‪A‬‬
‫‪Transplantation‬‬
‫‪p=0.01‬‬
‫‪p=0.0000065‬‬
‫‪p=0.06‬‬
‫‪14‬‬
‫‪10‬‬
‫‪12‬‬
‫‪8‬‬
‫‪4‬‬
‫‪6‬‬
‫‪2‬‬
‫‪rotations/30 min‬‬
‫‪Cells‬‬
‫‪Saline‬‬
‫‪450‬‬
‫‪400‬‬
‫‪350‬‬
‫‪300‬‬
‫‪250‬‬
‫‪200‬‬
‫‪150‬‬
‫‪100‬‬
‫‪50‬‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫‪weeks after transplantation‬‬
‫‪D‬‬
‫‪C‬‬
‫‪B‬‬
‫‪TH‬‬
‫‪EGFP‬‬
‫‪F‬‬
‫‪E‬‬
‫‪TH‬‬
‫‪EGFP‬‬
‫‪Striatum‬‬
‫‪Merge‬‬
‫‪G‬‬
‫‪Nigra‬‬
‫‪Merge‬‬
‫תמונה ‪ :59‬השתלת תאים מזנכימליים לעכברי מודל למחלת פרקינסון‪ .‬תאים מזנכימליים ממח העצם של עכבר‬
‫טרנסגני ל‪ EGFP-‬עברו התמיינות עצבית למשך ‪ 48‬שעות‪ 1-1.5x105 .‬תאים הושתלו בסטריאטום בצד שעבר‬
‫לזייה‪ (A .‬שיפור קליני בעכברים שעברו השתלה )ממוצע ‪ ±‬שגיאת התקן(‪ ,‬מבחן סטטיסטי יחסית לעכברים שלא‬
‫עברו השתלת תאים ‪ (B .‬תאים "ירוקים" בסטריאטום בצד ימין ‪ (C‬וצביעה ל‪) TH -‬בכחול באמצעות נוגדן שניוני‬
‫המצומד ל‪ (D AMCA-‬תמונות ‪ B‬ו‪ C-‬חופפות‪ (E .‬תאים "ירוקים" בניגרה בצד ימין‪ (F ,‬צביעה ל‪ (G ,TH-‬תמונות‬
‫‪ E‬ו‪ F-‬חופפות‪.‬‬
‫‪153‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫דיון‬
‫בשנים האחרונות גבר העניין בתאי גזע מזנכימליים ממח העצם של אדם בוגר בעקבות יכולתם לחידוש עצמי‬
‫)‪ ,(self-renew‬פוליפרציה והתמיינות לסוגי תאים שונים‪ .‬לאחר השראת התמיינות ספציפית‪ ,in-vitro ,‬יש לתאים‬
‫פוטנציאל להתמיין לרקמות מזודרמליות )תאי שומן‪ ,‬סחוס ועצם( אנדודרמליות )תאי אנדוטל( ואף‬
‫אקטודרמליות )תאים דמויי תאי עצב(‪ .‬בשימושם עבור השתלה עצמית לא קיימת בעיה אתית‪ ,‬הם ניתנים‬
‫לשמירה קלה‪ ,‬ואינם גורמים לתגובה אימונולוגית או לממאירות‪ .‬אף על פי שממצאים ניסיוניים בהתמיינות‬
‫תאים ממח העצם לתאי עצב הינם חדשניים‪ ,‬הרעיון של תאים ממח העצם כמקור לתאים ברקמת המוח )‪,(CNS‬‬
‫עתיק יומין ‪ .‬עוד בספר “‪Morse, 1938 in Song & ) ”The Yellow Emperors Book of Chinese Medicine‬‬
‫‪ (Sanchez-Ramos, 2003‬מוזכר המוח כ‪ ."sea of marrow" -‬לפי רעיון זה אנרגיה חיונית )‪ (Chi‬הנוצרת‬
‫בבלוטות המין‪ ,‬זורמת דרך מח העצם ונשפכת אל תוך ”‪ – “sea of marrow‬המוח‪ .‬למדענים במערב השקפה‬
‫פילוסופית זו הצטיירה כזרה בדומה לעדויות שתאים ממח העצם של ייצור בוגר יכולים לעבור מטמורפוזה לתאי‬
‫עצב במערכת העצבים המרכזית )‪.(Song & Sanchez-Ramos, 2003‬‬
‫למרות שידוע כיום שמחלת הפרקינסון איננה מחלה של חוסר תאים דופאמינרגים בלבד ) ‪Lang & Obeso,‬‬
‫‪ ,(2004‬השתלה עצמית )אוטולוגית( למערכת העצבים המרכזית של תאים מזנכימליים ממח העצם של בוגר‪,‬‬
‫שעברו התמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬קרי לאחר בשלותם כתאי עצב דופאמינרגים ייחודיים ‪ in vitro‬ו‪/‬או‬
‫יכולתם להתפתח לתאי עצב דופאמינרגים ‪ ,in vivo‬שמגיבים לגירויים‪ ,‬ומפרישים דופאמין בקצב ובריכוז‬
‫המתאימים‪ ,‬יכולה להוות בעתיד בשורה לחולים‪ .‬במחקר זה הוצג לראשונה שניתן להשרות התמיינות עצבית‬
‫דופאמינרגית ‪ ex-vivo‬לתאים מזנכימליים ממקור אנושי ללא החדרת גנים חיצוניים המתבטאים ביתר‪ .‬יתרה‬
‫מכך‪ ,‬בניסויים ראשוניים בחיות מודל למחלת פרקינסון נצפה שיפור קליני בחיות שעברו השתלת תאים דמויי‬
‫תאי עצב ממקור מזנכימלי‪ .‬לאור זאת תאים אלו יכולים להיות שימושיים בעתיד באסטרטגיות שונות לטיפול‬
‫במחלות של מערכת העצבים המרכזית בכלל ומחלת פרקינסון בפרט‪.‬‬
‫‪ .1‬אפיון תאים מזנכימליים ממח עצם‬
‫הפקת תאים מזנכימליים ממח העצם באמצעות הדבקות למצע פלסטיק תוארה לראשונה ע"י ‪Friedenstein‬‬
‫וחבריו )‪ .(1968‬כמתואר בעבודות רבות גם אנו במחקרנו הפקנו תאים מזנכימליים ממח עצם של עכברים ואנשים‬
‫בוגרים על מצע פלסטיק )‪ .(polystyrene‬התאים שנדבקו למצע הפלסטיק עברו פוליפרציה מהירה והכפילו את‬
‫עצמם כל יומיים – שלשה ימים‪ .‬כשבוע לאחר ההפקה ניתן היה לזהות אוכלוסיית תאים הטרוגנית מבחינת מבנה‬
‫מורפולוגי ‪ -‬תאים גדולים וקטנים‪ ,‬ארוכים וצרים ואף שטוחים‪ .‬לאחר כ‪ 2-3-‬פיצולים התאים נראים‪ ,‬לרוב‪,‬‬
‫‪154‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫דיון‬
‫ ישנן עדויות שתאים אחרי מספר פיצולים רב מאבדים חלק‬.‫כאוכלוסיה הומוגנית של תאים דמוי פיברובלסטים‬
‫ לכן רוב הניסויים נעשו עם תאים "צעירים" עד כחודשיים‬,(Colter et al., 2001) ‫מה"מולטיפוטנטיות" שלהם‬
.‫מיום הפקתם‬
‫( מאחר ולא ידוע כיום על פנוטיפ אנטיגני ייחודי לתאים מזנכימליים במח העצם ואין‬8.3.1 ‫כאמור במבוא )בפרק‬
‫ נמדדים קסטת סמנים על פני דופן התא המשמשים את החוקרים לזיהוי כללי‬,‫סמן חד ערכי לאפיון תאים אלה‬
Pittenger et al., 1999; Shur et ) (11 ‫של אוכלוסיית תאים זו בשונה מאוכלוסיית תאים ההמטופואטית )טבלה‬
.(al., 2002; Vogel et al., 2003; Croft & Przyborski, 2004; Tondreau et al., 2004
Flow-cytometry ‫ אפיון תאים מזנכימליים באמצעות‬:11 ‫טבלה‬
Integrins - Positive
α1
CD49a
α2
CD49b
α3
CD49c
aα
CD49e
αv
CD51
β1
CD29
β3
CD61
β4
CD104
Cytokine receptor- positive
IL-1R
CD121a
IL-3Rα
CD123
IL-4R
CDw124
IL-6R
CD126
IL-7R
CDw127
Factor Receptor - Positive
INFγR
CDw119
TNFIR
CD120a
TNFIIR
CD120b
TGFβIIR
bFGFR
PDGFR
CD140a
Transferin
CD71
Matrix receptor - Positive
ICAM1
CD54
ICAM2
CD102
VCAM1
CD106
L-Selectin
CD62L
LFA3
CD58
ALCAM
CD166
Hyaluronate
CD44
Endoglin
CD105 (SH2)
Other Positive
CD9
5'-nucleotidase precursor CD73 (SH3)
Thy-1
CD90
Integrins - Negative
α4
CD49d
αL
CD11a
Cβ2
CD18
Cytokine receptor- Negative
IL-2R
CD25
Factor Receptor - Negative
EGFR-3
Hematopoietic Markers - Negative
T4
CD4
Mo2
CD14
CD31
CD34
CD45 (leukocyte antigen)
Matrix receptor - Negative
ICAM3
CD50
E-Selectin
CD62E
P-Selectin
CD62P
PECAM1
CD31
vW Factor
Cadherin5
LewisX
CD15
155
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫סמנים אלו כוללים‪ :‬אינטגרינים‪ ,‬קולטנים לציטוקינים‪ ,‬קולטנים לגורמי גידול‪ ,‬קולטנים למטריקס ואחרים‬
‫שחלקם האחד מופיע בתאים מזנכימליים ממח עצם וחלקם האחר אינו מתבטא בתאים אלו )טבלה ‪ .(11‬בנוסף‪,‬‬
‫התאים המזנכימליים אינם מבטאים סמנים המטופואיטיים כדוגמת ‪ CD4, CD14, CD45, CD34‬הנמצאים על‬
‫פני דופן התא ) ;‪Pittenger et al., 1999; Shur et al., 2002; Vogel et al., 2003; Croft & Przyborski, 2004‬‬
‫‪ .(Tondreau et al., 2004‬למרות שכל אנטיגן בנפרד אינו מבוטא באופן בלעדי בתאים מזנכימליים ממח העצם‪,‬‬
‫כלל הסמנים יחד עם פרמטרים נוספים‪ ,‬משמשים לאפיון פרופיל של תאים אלה‪.‬‬
‫רמת הסמנים לתאים מהמערכת ההמטופואטיים )‪ (CD19, CD34, CD45‬הייתה אפסית באוכלוסיית התאים‬
‫שהפקנו ממח עצם )טבלה ‪ ,6‬תמונה ‪ .(24‬כמו כן‪ ,‬נמצא שהתאים אינם מבטאים על פני הממברנה את האנטיגנים‪:‬‬
‫‪ CD5, CD11b, CD20‬הייחודיים ללימפוציטים )טבלה ‪ ,6‬תמונה ‪ .(24‬נתונים אלה דומים לנתונים שהתקבלו‬
‫במחקרים קודמים בהם אפיינו תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי ) ;‪Pittenger et al., 1999; Lee et al., 2004‬‬
‫‪ ,(Tondreau et al., 2004‬ומצביעים על כך שמספר התאים המזנכימליים בתרבית הועשרו על חשבון תאים‬
‫ההמטופואטיים‪.‬‬
‫אינטגרינים הם מולקולות של הידבקות תאים הקיימות בכל תאי האדם שתפקידם בעיקר בהכרה והתקשרות‬
‫בינתאית ובנוסף לשמש כ"מערכת הבלמים" של התא בזרם הדם הנקשרים אל חלבוני עיגון תואמים להם‪.‬‬
‫אינטגרין פעיל הינו גילקופרוטאין המעוגן בדופן התא ובנוי בעיקר מ‪ 2-‬מתת‪-‬יחידות שונות ‪ α‬ו‪ .β -‬רמת הביטוי‬
‫של האינטגרין ‪ (CD29) β1‬שנמצאה במחקרנו הנה ‪ 99%‬בתאים מזנכימליים לאחר ‪ 3‬שבועות מיום הפקתם ממח‬
‫העצם וזאת בדומה לעבודות אחרות בספרות )‪ .(Lee et al., 2004‬בנוסף נמצא ש‪ ,CD105 (SH2)-‬השייך‬
‫למשפחת ה‪ ,matrix receptor-‬הופיע ב‪ 99% -‬מהתאים המזנכימליים‪ ,‬וזאת כמופיע במחקרים שונים ) ‪Pittenger‬‬
‫‪ .(et al., 1999; Lee et al., 2004‬יתרה מכך‪ CD105 (SH2) ,‬הנו סמן שהימצאותו על פני דופן התאים הכרחית‬
‫על מנת שנוכל להגדיר את התאים כתאי גזע מזנכימליים אנושיים ) ‪ .(Pittenger et al., 1999‬יתכן שעצם השימוש‬
‫בצלחות ‪ polystyrene‬לתרביות תאים גורמת לסלקציה חיובית לתאים המזנכימליים המשתמשים ב‪CD29, -‬‬
‫‪ CD105‬על מנת להיאחז בפלסטיק ובעקבות כך רמת ביטוי הסמנים כה נרחב‪.‬‬
‫באוכלוסיית התאים המזנכימליים ממח עצם אנושי שעימה עבדנו רמות האנטיגן ‪CD44-hyaluronic acid‬‬
‫‪ receptor‬הינו ‪ .89%‬אנטיגן זה‪ ,‬ממשפחת ה‪ ,matrix-receptor-‬הוא מהראשונים המתבטא בתאים מזנכימליים‬
‫הנדבקים למצע פלסטיק‪ .‬בעבודות שונות דווח שרמת הביטוי של ‪ CD44‬בתאים מזנכימליים ממח העצם הנה ‪85-‬‬
‫‪.( Shur et al., 2002; Lee et al., 2004) 92%‬‬
‫‪156‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫אחד הסמנים המובהקים לתאים מזנכימליים ממח העצם הנו )‪Pittenger et al., 1999; Vogel ) CD90 (Thy-1‬‬
‫‪ .(et al., 2003; Croft & Przyborski, 2004; Tondreau et al., 2004‬נמצא ש‪ 77%-‬מהתאים שגידלנו ביטאו‬
‫‪ .CD90‬כדאי לשים לב ש‪ CD90-‬נמצא אף בתאי גזע עצביים שהופקו מסטריאטום )‪ (Li et al., 2005) (99%‬ו‪-‬‬
‫‪ (Vogel et al., 2003) cerebral cortex‬של עובר אנושי‪ .‬בנוסף‪ 25% ,‬מהתאים ביטאו )‪ CD56 (NCAM‬הידוע‬
‫בספרות כמופיע בתאי גזע עצביים )‪ .(Schwartz et al., 2003; Vogel 2003‬כלומר‪ CD90 ,‬ו‪ CD56-‬יכולים‬
‫להוות סמנים משותפים הן לתאים מזנכימליים והן לתאי גזע עצביים‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬יתכן שאלו סמנים המעידים על‬
‫כך שלתאים המזנכימליים שגידלנו בתרבית פוטנציאל להתמיין לתאי עצב )ראה הרחבת הנושא בהמשך(‪.‬‬
‫‪ .2‬התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תאי עצב‬
‫‪ 2.1‬תנאים להשראת התמיינות‬
‫בחמש השנים האחרונות תוארו עבודות רבות המתארות שיטות שונות ומגוונות להשראת התמיינותם של תאים‬
‫מזנכימליים ממח עצם )אנושי ומחיות( לתאים דמויי תאי עצב )‪ – (neuron-like cells‬שינוי צורני וביטוי סמנים‬
‫של תאי עצב )ראה הרחבה במבוא פרק ‪ .(8.3.1.1‬כל העבודות הראו הופעת רמות שונות של סמנים עצביים‬
‫שהודגמו בעזרת שיטות מגוונות כדוגמת אימונופלורוסנציה‪ ,Real-time PCR , RT-PCR ,Western blot ,‬ואף‬
‫השתלתם במודלים שונים לפגיעה במערכת העצבים המרכזית במכרסמים‪ .‬שני המחקרים הראשונים של השראת‬
‫התמיינות ‪ in-vitro‬פורסמו בשלהי שנת ‪ (Sanchez-Ramos et al., 2000; Woodburyet al., 2000) 2000‬עם‬
‫התחלת עבודת הדוקטוראט הנוכחית‪.‬‬
‫הרכב מדיום ההתמיינות שנעשה בו שימוש בעבודה זו בא לענות על השאלות מהם התנאים‪/‬חומרים‬
‫האופטימאליים על מנת להשרות התמיינות עצבית לתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי ‪ ,ex-vivo‬במטרה לבטא‬
‫סמנים של תאי עצב דופמינרגיים רבים ככל האפשר‪ ,‬ברמות הגבוהות ביותר‪ ,‬ואף להיות פעילים כתאים‬
‫דופאמינרגים‪ .‬המדיום בו הדגרנו את תאים הורכב ממספר חומרים אשר נמצאו כחיוניים למטרה זו‪.‬‬
‫ההתמיינות העצבית הדופאמינרגית בוצעה בשני שלבים עיקריים וזאת בעקבות עבודות ההתמיינות של תאי גזע‬
‫עובריים לתאי עצב דופאמינרגים שבוצעו במספר שלבים ) ‪Lee et al., 2000; Kim et al., 2002; Sonntag et al.,‬‬
‫‪.(2005‬‬
‫‪ 2.1.1‬שלב ראשון בהתמיינות‬
‫התאים המזנכימליים הודגרו ב"מדיום התמיינות ‪ "I‬למשך ‪ 24-48‬שעות על מנת "להכין" את התמיינותם לתאי‬
‫עצב ולכוון את התפתחותם לתאים המבטאים ‪) nestin‬חלבון פילמנטי המאפיין תאי גזע המתפתחים במערכת‬
‫העצבים המרכזית(‪ .‬רמות הסרום הופחתו מ‪ 15%-‬במדיום הגידול ל‪ 10%-‬וזאת על מנת להגיע בהדרגה ל"מדיום‬
‫‪157‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫התמיינות ‪ "II‬שאינו מכיל סרום וכך לא לגרום לעקה לתאים בעקבות הפסקת הסרום בבת‪-‬אחת‪ .‬בנוסף‪ ,‬בעבודות‬
‫רבות נמצא שסרום מפריע להתמיינות תאי גזע לתאי עצב ולהתפתחות תאים המבטאים ‪Sanchez-) nestin‬‬
‫‪ .(Ramos et al., 2000; Woodburyet al., 2000; Wislet-Gendebien et al., 2003; and many others‬הבסיס‬
‫העיקרי של המדיום הנו הוספת ‪ 2‬גורמי גידול‪ EGF ,‬ו‪ (Reynolds et al., 1992) EGF .bFGF-‬ו‪Gritti et ) bFGF-‬‬
‫‪ (al., 1996; Ray et al., 1993‬ממריצים את התהוות רקמת העצבים בתרביות תאי עצב או כאשר מזריקים אותם‬
‫‪ ,(Kuhn et al., 1997; Wagner et al., 1999) in-vivo‬ובנוסף מציגים פעילות משלימה אחד של השני‬
‫בהתפתחותם של תאי העצב )‪ .(Kuhan et al., 1997‬יתרה מכך‪ bFGF ,‬דווח ]ברוב העבודות של התמיינות תאי‬
‫גזע עובריים לתאי עצב דופאמינרגים[ כפקטור המעורב בהתפתחותם של תאים דופאמינרגים ויוצר סלקציה ל‪-‬‬
‫‪ ,neuroectodermal cells‬והוצאתו מהמדיום לאחר ‪ 24-48‬שעות מעכבת את התפתחותם של התאים ל‪-‬‬
‫‪ .(Lee et al., 2000; Kim et al., 2002) mesodermal cells‬לאחרונה דווח ש‪ EGF-‬ו‪ bFGF-‬תורמים לעליה‬
‫בביטוי של סמנים עצביים וכן חשובים לשרידותם של תאים דמויי תאי עצב שהתפתחו מתאים מזנכימליים ) ‪Jin‬‬
‫‪ .(et al., 2003; Bossolasco et al., 2005; Tao et al., 2005‬פרוט נוסף מצוי בטבלה ‪.12‬‬
‫גורם משמעותי נוסף הוא השימוש במדיום ‪ .N2‬מדיום זה מורכב מחמישה מרכיבים אשר ביחד ידועים כמשרים‬
‫סביבה אופטימלית להתפתחות תאי עצב )הרכב המדיום מופיע בסעיף ‪ 2.3‬בפרק שיטות חומרים( ) ‪Bottenstein,‬‬
‫‪.(1985‬‬
‫אחד המרכיבים הייחודים שהוספו ל"מדיום התמיינות ‪ "I‬הנו חומצת שומן רב בלתי רוויה‪) ,‬יש לציין שלא נמצאו‬
‫עבודות בספרות אשר הוסיפו מרכיבים אלו בהתמיינות תאי גזע לתאי עצב(‪.‬‬
‫‪ 2.1.1.1‬הוספת חומצות שומן רב‪-‬בלתי רוויות‬
‫אחד המאפיינים העיקריים של תאי עצב הנו האחוז הגבוה של חומצות שומן רב‪-‬בלתי רוויות ‪polyunsaturated‬‬
‫‪ (fatty acids (PUFA‬בדופן )ממברנה( התא‪ .‬תכונה זאת אינה אופיינית לתאים מרקמות אחרות כולל תאים‬
‫ממוח העצם‪ .‬ה‪ PUFA-‬העיקריים במערכת העצבים המרכזית הם )‪ docosahexaenoic acid (DHA, 22:6 n-3‬ו‪-‬‬
‫)‪ .arachidonic acid (AA, 20:4 n-6‬במהלך ההתפתחות העוברית‪ ,‬המוח משתמש בכמויות גדולות יחסית של‬
‫‪ PUFA‬לטובת ביוסינטזה של דופן תאי העצב המתפשטים ויוצרי השלוחות העצביות ) ‪Innis & de La Presa‬‬
‫‪ .(Owens 2001‬לכן הספקה זמינה‪ ,‬מספיקה ומתמדת של ‪ DHA‬למוח העוברי הנה קריטית להתפתחות תקינה‬
‫של מע"מ ולתפקודו העתידי‪ DHA .‬ו‪ AA-‬מסונטזים באמצעות ‪ elongation-desaturation‬מחומצות שומן‬
‫‪158‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫חיוניות לגוף ‪ alpha-linolenic acid (LnA), 18:3 n-3‬ו‪ linoleic acid (LA), 18:2 n-6 -‬המסופקות באמצעות‬
‫הדיאטה )‪ .(Budowski 1988‬תאי העצב במע"מ הנם יוצאים מן הכלל ואינם מסוגלים לייצר ‪ DHA‬מ‪LA, -‬‬
‫‪ ,LnA‬לכן ייצור ‪ DHA‬לתאי עצב נעשה ע"י תאי אנדוטל בכלי הדם במוח ואסטרוציטים )‪ .(Moore 2001‬כאמור‪,‬‬
‫המוח מכיל את אחד הריכוזים הגבוהים ביותר של ‪ DHA‬לעומת רקמות אחרות )‪ DHA .(Salem 1986‬הנו‬
‫מווסת בולט בייצור )‪ ,phosphatidylserine (PS‬אחד ה‪ anionic phospholipids-‬החשובים והעיקריים בדופן‬
‫התאים )‪ .(Green & Yavin 1995; Garcia et al., 1998‬תרביות תאי עצב מצאה ל‪ DHA-‬פעילות‬
‫אנטיאפופטוטית )‪ ,(antiapoptotic‬יתכן שפעילות זו נובעת מכך ש‪ DHA-‬גורם להצטברות ‪ PS‬החיוני ביותר‬
‫לבניית ממברנות ) ‪ . (& Kim 2002Kim et al., 2000; Akbar‬בנוסף‪ ,‬נמצא ש‪ DHA-‬מצוי בעיקר באזור‬
‫הסינפסות )‪ ,(Sun et al., 1988‬ומעורב ב‪-‬‬
‫‪signal‬‬
‫‪transduction‬‬
‫המתווך‬
‫ע"י‬
‫פוספוליפידים בסינפסות )‪(Jones et al., 1997‬‬
‫ובעל חשיבות מרובה בתאי עצב דופאמינרגים‬
‫) ‪Chalon et al., 1998; Zimmer et al.,‬‬
‫‪ .(2000, 2002‬כמו‪-‬כן‪ ,‬גם ל‪ AA-‬ישנה‬
‫חשיבות מרובה בתהליכים שונים בתאי עצב‬
‫וגם ב‪ ,signal transduction -‬נמצא שדיאטת‬
‫דלת ‪) n-6 PUFA‬המלווה בד"כ עם עלייה‬
‫בחומצות‬
‫שומן‬
‫‪(n-3‬‬
‫גורמת‬
‫לפעילות‬
‫תמונה ‪ :60‬חומצות שומן חיוניות לתאי עצב‬
‫דופאמינרגית‬
‫בלתי‬
‫תקינה‬
‫בסטריאטום‬
‫)‪ .(Chalon et al., 1998‬לפיכך‪ ,‬קיימת חשיבות מרובה בהוספת ‪ DHA‬במהלך התמיינות לתאי עצב דופאמינרגים‪.‬‬
‫‪ 2.1.2‬שלב שני בהתמיינות‬
‫תאים מזנכימליים הודגרו ב"מדיום התמיינות ‪ "II‬לפרקי זמן שונים עד ‪ 96‬שעות‪ ,‬או לחילופין ב"מדיום‬
‫התמיינות ארוכת טווח" עד ‪ 28‬ימים וזאת על מנת להשרות סמנים עצביים ודופאמינרגים‪".‬מדיום התמיינות ‪"II‬‬
‫מאופיין בשלשה סוגי מרכיבים‪ (1 :‬העלאת רמות ‪ cAMP‬תוך תאיות‪ (2 ,‬הוספת חומצה רטינואית‪ (3 ,‬הוספת נוגדי‬
‫חמצון‪.‬‬
‫‪159‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫כאמור‪ ,‬ב"מדיום התמיינות ‪ "II‬אחוז הסרום הורד לאפס )‪ (Wislet-Gendebien et al., 2003‬והוספה תמיסת‬
‫‪ .N2‬בנוסף‪ ,‬הוספו ‪) dbcAMP‬אנלוג של ‪ (cAMP‬ו‪) IBMX-‬מעכב אנזים ‪ (phosphodiesterase‬על מנת להעלות‬
‫את רמות ה‪ cAMP-‬התוך תאי‪ .‬במחקרים אחרים תוארה הוספת ‪(adenylate cyclase activator) forskolin‬‬
‫לרוב ללא תוספת של ‪ IBMX‬או ‪ dbcAMP‬על מנת להעלות את רמות ה‪ cAMP-‬התוך תאי ) ‪Woodbury et al.,‬‬
‫‪ .(2000; Munoz-Elias et al., 2003; Qian & Saltzman 2004‬בעבודות שונות תואר ש‪ dbcAMP-‬העלה את‬
‫שרידות של תאי עצב דופאמינרגים בתרבית )‪ (Branton et al., 1998‬ואף העלה את רמות ‪ TH‬ב‪ventral -‬‬
‫‪) mesencephalic progenitors‬שהופקו מעכברים( שעברו התמיינות לתאי עצב דופאמינרגים )‪.(Pei et al., 2003‬‬
‫יתרה מכך‪ ,‬בעבודות רבות נמצא שהעלאת רמות תוך תאיות של ‪ cAMP‬גורמת להתפתחות שלוחות וסמנים‬
‫עצביים בתאים מזנכימליים ) ;‪Deng et al., 2001; Kabos et al., 2002; Munoz-Elias et al., 2003‬‬
‫‪Rismanchi et al., 2003; Qian & Saltzman 2004; Suon et al., 2004; Jori et al., 2005a,b; Long et al.,‬‬
‫‪.(2005‬‬
‫חומר נוסף הנמצא במדיום התמיינות הוא ‪ ,BHA‬הידוע כאנטיאוקסידנט‪ ,‬וכנראה תורם להישרדותם של תאי‬
‫הגזע במהלך התמיינותם‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬נמצא ש‪ BHA-‬מונע אפופטוזיס כתוצאה מעקה חמצונית בתאי עצב‬
‫קורטיקלים בעובר ומסכל עקה חמצונית בתרביות תאי עצב ראשוניות ) ‪Ratan et al., 1994; Katsuki et al.,‬‬
‫‪ .(1995‬יתרה מכך‪ ,‬בעבודות רבות מתואר הוספת ‪ BHA‬למדיום התמיינות עצבית של תאים מזנכימליים ממח‬
‫העצם ) ;‪Woodbury et al., 2000; Rismanchi et al., 2003; Corft & Przyborski, 2004; Qian et al., 2004‬‬
‫‪.(Suon et al., 2004; Suzuki et al., 2004; Tao et al., 2005‬‬
‫בנוסף ל‪ BHA-‬כנוגד חימצון הוסף ‪ ascorbic acid‬וזאת על מנת "לדחוף" את התאים להתמיין לתאי עצב‬
‫דופאמינרגים וזאת על פי הממצאים בתאי גזע עובריים שהוספת ‪ ascorbic acid‬בשלב ההתמיינות האחרון מעלה‬
‫באופן מובהק את רמות ‪ TH‬בתאים )‪ .(Lee et al., 2000; Kim et al., 2002; Barberi et al., 2003‬כמו‪-‬כן‪,‬‬
‫נמצא ש‪ ascorbic acid-‬משפיע לחיוב באופן נרחב על תאי עצב דופאמינרגים מבחינה התפתחות מורפולוגית‬
‫ופעילותם הביוכימית )‪.(Kalir & Mytilineou, 1991‬‬
‫חומר נוסף שצורף למדיום התמיינות הוא )‪ ,retinoic acid (RA‬מטבוליט של ויטמין ‪ ,A‬המעורב בשלושה‬
‫צמתים חשובים בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית‪ :‬המרצת התפתחותם של תאי עצב‪ ,‬נדידתם של תאים ב‪-‬‬
‫‪ ,neural crest‬התפתחות אזורית ספציפית במוח התיכון‪ ,‬המרכזי והקדמי )‪ .(Maden, 2002‬בנוסף‪ ,‬כמתואר‬
‫‪160‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫בסעיף ‪ 2.5‬במבוא‪ RA ,‬מבקר את התפתחות המערכת העצבית הדופאמינרגית בשלבים שונים בהתהוות מערכת‬
‫העצבים המרכזית‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬במספר עבודות מתוארת הוספת ‪ RA‬למדיום ההתמיינות העצבית של תאים‬
‫מזנכימליים ממח העצם )‪.(Sanchez-Ramos et al., 2000; Jin et al., 2003; Abouelfetouh et al., 2004‬‬
‫לסיבות נוספות להוספת ‪ NGF ,GDBF ,RA‬ראה טבלה ‪.12‬‬
‫טבלה ‪ :12‬סיכום החומרים שנעשה בהם שימוש להתמיינות תאים מזנכימליים לתאי עצב דופאמינרגים*‬
‫‪Recent reviews‬‬
‫‪Action on‬‬
‫)‪(Trophic‬‬
‫‪Factors‬‬
‫‪Xian & Zhou, 2004‬‬
‫‪Wong, 2003‬‬
‫‪Stem cell proliferation, migration, differentiation, and survival‬‬
‫‪Neural/glial precursor cell proliferation, migration,‬‬
‫‪differentiation, and survival‬‬
‫‪EGF‬‬
‫‪Akai & Storey, 2003‬‬
‫‪Reuss & von Bohlen und‬‬
‫‪Halbach, 2003‬‬
‫‪Neural induction‬‬
‫‪Stem cell proliferation, migration. Neural/glial precursor‬‬
‫‪proliferation‬‬
‫‪bFGF‬‬
‫‪Jaaro et al., 2001‬‬
‫‪Kruttgen et al., 2003‬‬
‫‪Heerssen & Segal, 2002‬‬
‫‪Appel & Eisen, 2003‬‬
‫‪McCaffery et al., 2003‬‬
‫‪Neuronal plasticity‬‬
‫‪Regulation of neuron number‬‬
‫‪Neuronal maturation and survival‬‬
‫‪Retinoic acid Neurogenesis onset‬‬
‫‪Ventral neural patterning. Amplification of response to‬‬
‫‪neurotrophic factors. Neural differentiation (motor neuron‬‬
‫)‪subtype‬‬
‫‪NGF‬‬
‫‪Neuronal morphology, survival, development, and regeneration‬‬
‫‪Markus et al., 2002‬‬
‫‪Kirik et al., 2004, Nature‬‬
‫‪Neuroprotective and restorative of dopaminergic neuron‬‬
‫‪Neurosci 7:105–110‬‬
‫* העלאת רמות ‪ cAMP‬והוספת חומצת שומן ‪ DHA‬מפורטים בהרחבה בטקסט ולכן לא הוספו לטבלה‬
‫‪GDNF‬‬
‫‪ 2.2‬מנגנון פעולה מולקולרי של התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תא עצב‬
‫במחקר זה נמצא שתאים מזנכימליים ממח העצם של עכבר והן ממקור אנושי עוברים התמיינות לתאים דמויי‬
‫תאי עצב וזאת בעקבות הוספת "מדיום התמיינות ‪ "I‬ולאחריו "מדיום התמיינות ‪ ."II‬יתרה מכך‪ ,‬ניתן להשרות‬
‫התמיינות לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגיים‪ .‬השאלה הנשאלת מהו המנגנון המולקולארי המופעל שגורם‬
‫לתאים לשנות את הפנוטיפ שלהם בעקבות הוספה חיצונית של חומרים שונים וגורמי גידול? – בעבודה זאת לא‬
‫נבדקו שאלות אלו למרות שעל "קצה המזלג" נבדקו מהם השינויים בהופעתם ‪ /‬היעלמותם של פקטורי שעתוק‬
‫מסוימים בעקבות הוספת "מדיום התמיינות ‪) "II + I‬ראה סעיף ‪ 5.4‬בפרק התוצאות(‪ .‬בנוסף‪ ,‬הפוליפרציה של‬
‫התאים בעקבות ההתמיינות הופסקה כמו שנצפה במבחן של קליטת טימידן )סעיף ‪ 5.2‬בתוצאות(‪ .‬מעבר‪-‬לכך‪,‬‬
‫נמצא שבעקבות ההתמיינות ישנו שינוי במחזור החיים של התא )‪ (cell cycle‬וכ‪ 15% -‬מהתאים עוברים ממצב של‬
‫‪ G2/M‬למצב של ‪ ,G0/G1‬כלומר יציאה "ממחזור חיים פעיל" )פוליפרציה( למצב של ‪ .cell cycle exit‬היציאה‬
‫ממחזור החיים מייצגת שלב בסיסי ומהותי בהפעלת התמיינותם של תאים ואינדוקציה של ביטוי גנטי חדש‬
‫‪161‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫המוביל בסופו של דבר לעיבוד וקבלת פנוטיפ ייחודי )‪ .(Edlund & Jessel, 1999‬בנוסף‪ ,‬קיימות עדויות שמראות‬
‫שמספר מרכיבים במנגנון מחזור החיים משחקים תפקיד עיקרי וחשוב בהתמיינות ובספסיפיקציה של תאי עצב‬
‫)‪ .(Piette, 1997; ElShamy et al., 1998; Horsfield et al., 1998‬בתהליך התמיינותם של תאי גזע לתאי עצב‬
‫מעורבים שני תהליכים עיקריים‪ ,‬האחד‪ ,‬יציאה ממצב "‪ ,"uncommitted stat‬והשני כניסה לתהליך התפתחותי‬
‫ספציפי )במקרה שלנו‪ ,‬עצבי(‪ .‬ה‪ "preneural genes" -‬הם גורמי שעתוק השיכים למשפחת ‪basic-helix-loop-‬‬
‫)‪ helix (bHLH‬החיוניים וגם מספיקים על מנת לגרום לתאי גזע להתמיין לתאי עצב )‪(Ross et al., 2003‬‬
‫ומהווים את גני המפתח של "יציאה" ממצב של תאים לא מחויבים ו"כניסה" למצב של התמיינות עצבית‪ .‬יתרה‬
‫מכך‪ bHLH ,‬גורמים להפסקת התחלקות תאים ביחד עם הבשלת התאים‪ ,‬קרי יציאה מ‪Galderisi ) cell cycle-‬‬
‫‪ .(et al., 2003‬הוספת "מדיום התמיינות ‪) "II‬המכיל אנלוג ל‪ cAMP-‬ומעכב לפירוקו( מעלה את רמות ה‪cAMP-‬‬
‫התוך תאיות‪ .‬במחקרים שונים נמצא שהפעלת ‪ bHLH‬גורמת להתמיינות לתאי עצב בעקבות אקטיבציית מסלולי‬
‫‪ .(Cho et al., 2001; Shen et al., 2001 ) cAMP‬יתרה מכך‪ ,‬בניסוי ‪ protein/DNA array‬שביצענו נמצאה‬
‫נוכחות של גורמי שעתוק עצביים‪ ,‬ממשפחת ‪ ,bHLH‬בתאים מזנכימלים שלא עברו התמיינות כגון ‪AhR‬‬
‫ואחרים )ראה פרק ‪ 5.4‬בתוצאות(‪.‬‬
‫)‪ Protein kinase A (PKA‬הנו הרצפטור הקלאסי של ‪ cAMP‬שהפעלתו גורמת לזרחון של אתרים רבים בתא‪.‬‬
‫לאחרונה הוכח שהעלאת רמות ‪ cAMP‬תוך תאיות בתאים מזנכימליים ממח העצם גורמת לאקטיבציית המסלול‬
‫הקלאסי של ‪ PKA‬ולהתמיינות עצבית )‪ .(Jori et al., 2005‬כמו‪-‬כן‪ ,‬במספר עבודות נמצא שהפעלת המסלול של‬
‫‪ PKA‬גורמת להתמיינות תאים לתאי עצב )‪.(Bos, 1998; de Rooij et al., 2000‬‬
‫בנוסף למסלול העצבי יש ל‪ PKA-‬השפעה רבה על המסלול הדופאמינרגי‪ Tyrosine hydroxylase .‬עובר‬
‫פוספורילציה בחומצה אמינית )‪ serine (Ser‬בעמדות ‪.(Dunkley et al., 2004) Ser8, Ser19, Ser31, Ser40‬‬
‫בקרת הזרחון של ‪ TH‬בעמדות אלו משפיעה על פעילותו הן ‪ in-vitro‬והן ‪.(Dunkley et al., 2004) in-vivo‬‬
‫במחקרים שונים נמצא ש‪ PKA-‬מזרחן ישירות את האנזים ‪ TH‬ומשפיע על פעילותו ) ‪Edelman et al., 1978; Joh‬‬
‫‪ ,(et al., 1978‬בנוסף הוכח ש‪ Ser40-‬הנו אתר הזרחון )‪ .(Campbell‬כמו‪-‬כן‪ ,‬מסקירה של מאמרים רבים‬
‫)‪ (Dunkley et al., 2004‬נמצא שההשפעה הגדולה ביותר על פעילות ‪ TH‬הנה כתוצאה מזרחון בעמדה ‪ Ser40‬ו‪-‬‬
‫‪ PKA‬מזרחן רק אתר זה‪.‬‬
‫לאור הידוע בספרות ולאור התוצאות שקיבלנו ניתן להציע שאחד הזרועות של ההתמיינות העצבית הנה העלאת‬
‫רמות תוך תאיות של ‪ cAMP‬אשר גורמות להפעלת מסלולי זרחון באמצעות ‪ ,PKA‬שבסופו של דבר גורמים‬
‫‪162‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫לאינדוקציה של פקטרי שיעתוק ‪ bHLH‬המניעים את התאים ליציאה ממצב של תאי גזע ולכניסה להתמיינות‬
‫עצבית ומעבר ממצב ‪ G2/M‬במחזור החיים ל‪ G0/G1 -‬ולהפסקת הפוליפרציה‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬העלאת רמות ‪cAMP‬‬
‫תוך תאיות המביאות לפעילות ‪ PKA‬היכולות לגרום לזרחון ‪ Ser40‬ולהפעלת ‪ TH‬שהנו אנזים קובע הקצב לייצור‬
‫דופאמין‪) .‬תמונה ‪.(61‬‬
‫הזרוע השנייה במנגנון ההתמיינות העצבית שעובדת במקביל ויתכן אף באופן סנרגיסטי‪ ,‬הנה הוספת ‪Retinoic‬‬
‫)‪ RA .acid (RA‬מבצע את פעילותו ע"י היקשרות בציטופלסמה ל‪cellular RA-binding proteins (CRABP)-‬‬
‫המעביר את ‪ RA‬לתוך הגרעין‪ RA .‬נקשר בגרעין ל‪ RAR-‬ול‪ .retinoid X receptor (RXR)-‬בהמשך‪ ,‬נוצרים‬
‫בגרעין הומודימר )‪ (homodimer‬של ‪ RXR‬או ‪ RAR‬או הטרודימר )‪ (hetrodimer‬הנקשרים לאזורים ייחודיים על‬
‫פני ה‪ DNA-‬הקרויים )‪ RA response elements (RARE‬ומכאן מתחיל התרגום של גני המטרה ) ‪Guan et al.,‬‬
‫‪) .(2001‬ראה תמונה ‪.(61‬‬
‫‪Retinoic acid‬‬
‫‪IBMX , db-cAMP‬‬
‫‪PKA‬‬
‫‪Cell membrane‬‬
‫‪CRABP‬‬
‫‪Tyrosine P‬‬
‫‪Ser40‬‬
‫‪TH‬‬
‫‪DOPA‬‬
‫‪Dopamine‬‬
‫‪Vesicles‬‬
‫‪RA‬‬
‫‪RXR RAR‬‬
‫‪Induction of dopaminergic‬‬
‫‪neural-specific‬‬
‫‪bHLH‬‬
‫‪P‬‬
‫‪RARE‬‬
‫‪• Transcription factors‬‬
‫‪• Signaling molecules‬‬
‫‪• bHLH / RA-inducible genes‬‬
‫תמונה ‪ :61‬מנגנון פעולה מולקולרי )משוער( של התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תא עצב‬
‫‪RA, retinoic acid; IBMX, 3-isobutyl-1-methyl-xanthine; dbcAMP, dibutyryl cyclic AMP; PKA,‬‬
‫;‪protein kinase A; TH, tyrosine hydroxylase; DOPA, L-3, 4-dihydroxyphenylalanine; Ser, serine‬‬
‫‪bHLH, basic-helix-loop-helix; RAR, retinoic acid receptor; RXR, Retinoid X receptor; CRABP,‬‬
‫‪cellular RA-binding protein.‬‬
‫‪163‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ 2.3‬ביטוי סמנים עצביים בתאים שעברו התמיינות‬
‫החלפת מדיום הגידול למדיום התמיינות‪ ,‬בתרביות תאים מזנכימליים ממח עצם )אנושי ועכברי( הביאה לשינוי‬
‫מורפולוגי מרשים‪ .‬התאים הראו מורפולוגיה דמוי‪-‬תאי עצב שמתבטאת בגוף תא מכווץ ושלוחות ארוכות ודקות‬
‫)עכבר‪ -‬תמונה ‪ ,15‬אדם‪ -‬תמונה ‪ .(27‬כמו כן נמצא שתהליך השגשוג‪ ,‬האופייני לתאים לא ממוינים‪ ,‬מפסיק‬
‫כתוצאה מהדגרתם של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי במדיום ההתמיינות )תמונה ‪ .(28‬שינוי מורפולוגיית‬
‫התאים מדמויי‪-‬פיברובלאסטים לדמויי‪-‬תאי עצב דווח בכל העבודות בהם תאי מח עצם עברו השראת התמיינות‬
‫לתאי עצב )סעיף ‪ 83.1.1‬במבוא( ואף כאשר תאי גזע עובריים עברו התמיינות לתאי עצב ) ‪Lee et al., 2000; Kim‬‬
‫‪ .(et al. 2002‬התהליכים המולקולרים והביוכמיים בו השלד התוך תאי ואופן פיזור הציטופלסמה משתנים לצורת‬
‫תאים דמויי‪-‬תאי עצב בעקבות השראת התמיינות אינה ברורה דיה‪.‬‬
‫המעקב אחר שינויים בביטוי הגנטי בתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי שעברו התמיינות לתאים דמויי עצב‬
‫בוצע בשיטות איכותיות וסמי כמותיות )‪ (RT-PCR‬ובשיטות כמותיות )‪.(real-time PCR, Northern blot‬‬
‫השינויים בביטוי הגנטי נבדקו ב‪ 11-‬גנים שונים‪ .‬בכל הגנים שנבדקו בשיטות כמותיות ) ‪(NEGF2, NF-200, NSE‬‬
‫נמצאה עלייה מובהקת ברמת הביטוי‪ .‬ראוי לציין שבשלשה גנים בלבד )‪ (necdin, NF-200, NF-68‬נמצא ביטוי‬
‫רק בתאים שעברו התמיינות לעומת תאים שלא עברו )ראה סיכום התוצאות בטבלה ‪ .(13‬תוצאות דומות‬
‫מתוארות בספרות שבעקבות התמיינותם של תאים מזנכימליים לתאים דמויי תאי עצב רמות הביטוי הגנטי של‬
‫‪ NEFG2, Glypican4, NF-160, NF-68‬עלו פי ‪ 1.5 ,1.5 ,4.9 ,44‬בהתאמה )‪.(Sanchez-Ramos et al., 2001‬‬
‫בנוסף לכך‪ ,‬תאים מזנכימליים ממקור אנושי שעברו הדגרה עם מדיום התמיינות ביטאו חלבונים ייחודיים ל ‪-‬‬
‫תאי גזע עצביים כגון‪ ;nestin, GFAP :‬תאי עצב לא בשלים כגון‪ ;β tubulin III :‬ולתאי עצב בוגרים כגון ‪.MAP2‬‬
‫בשיטות אנליזה שונות של מספר אנטיגנים התקבלו תוצאות שונות כגון‪ ,‬ב‪ Western blot -‬וב‪ RT-PCR-‬נמצאו‬
‫‪ nestin‬ו‪ NSE-‬ברמות נמוכות בתאים שלא עברו התמיינות ומאידך לא נצפו בצביעות אימונוציטוכימיות‪ .‬ייתכן‬
‫וההבדלים נובעים מהרגישויות השונות של הבדיקות וניתן לומר שבתאים שלא עברו התמיינות ישנן רמות נמוכות‬
‫של ‪ nestin‬ו‪) .NSE-‬סיכום התוצאות בטבלה ‪.(13‬‬
‫לאור התוצאות ניתן לומר שקיימת שונות בקצב ההתמיינות של התאים המזנכימליים ובעקבות כך יתכנו באותה‬
‫צלחת גדלים תאים דמויי‪-‬תאי עצב בשלים ליד תאים שעדיין נמצאים בהליך ההתמיינות‪ .‬לדוגמא ניתן לאתר‬
‫ביטוי גנטי וחלבוני של ‪) nestin‬חלבון המצוי בתאי גזע עצביים ולא בתאים בשלים( לאחר ‪ 48-52‬שעות ואף לאחר‬
‫‪ 28‬ימי התמיינות )תמונה ‪ ,(41‬ובמקביל לאחר ‪ 48‬שעות נמצאו תאים שביטאו ‪ MAP2‬המצוי בתאי עצב בשלים‬
‫)תמונה ‪ .(36‬ניתן לראות תופעה זאת ברוב המאמרים המתארים התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי תאי‪-‬‬
‫עצב‪.‬‬
‫‪164‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫דיון‬
‫ סמנים עצביים ודופאמינרגים שאותרו בתאים מזנכימליים לאחר התמיינות‬:13 ‫טבלה‬
Antigen
Neural Genes:
Alpha (α)-synuclein
Beta (β)-tubulin III
CD90
Glial acidic fibrillary protein (GFAP)
Glypican-4 (GPC4)
Microtubule-associated protein 2
(MAP2)
Necdin
Nestin
Neurite growth-promoting factor 2
(NEGF-2)
Neurofilament-Heavy (NF-H 200 kDa)
Neurofilament- Light (NF-L 68 kDa)
Neurofilament-Medium (NF-M 160 kDa)
Neuron specific enolase (NSE)
Neuronal Nuclei (NeuN)
Neurotrophic tyrosine kinase receptor
type 2 (TRK-2)
Patched homolog(PTCH)
Retinoic acid receptor type a (RARA)
Smoothened (SMO)
Tryptophan hydroxylase (TPH)
Dopaminergic Transcription Factors:
Engrailed 1(En-1)
Nuclear receptor related 1 (Nurr-1)
Paired-like homeodomain transcription
factor 3 (PITX-3)
Dopaminergic Genes:
Aldehyde dehydrogenase 1 (Aldh1)
Aromatic L-amino acid decarboxylase
(AADC)
Catechol-o-methyltransferase (COMT)
Dopamine transporter (DAT)
Dopamine receptor D2 (DRD2)
GTP cyclohydrolase-1 (GTPCH1)
Monoamine oxidase B (MAO-B)
Tyrosine hydroxylase (TH)
Vesicular monoamine transporter 2
(VMAT 2)
*Immunocytochemistry
RTPCR
Gene expression
Northern Real-time
blot
PCR
Protein expression
FlowWestern
*ICH
cytometry
blot
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
165
+
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ 2.4‬השפעת התמיינות על מדדים אלקטרופיסיולוגיים‬
‫בעבודה זו ראינו לראשונה שתאים מזנכימליים ממקור אנושי שעברו התמיינות לתאים דמויי‪-‬תאי עצב מציגים‬
‫מדדים אלקטרופיסיולוגיים המאפיינים תאי עצב‪ .‬רמות הסידן התוך תאיות עולות בעקבות דפולריזציה עם‬
‫העלאת רמות ‪ K+‬החוץ תאיות‪ .‬ייתכן‪ ,‬שרמות הסידן עולות בעקבות הפעלת תעלות סידן תלויות מתח על פני‬
‫ממברנת התאים‪ .‬בנוסף‪ ,‬במצב מנוחה זרם הממברנה הוא אפס‪ ,‬כלומר אין "דליפות" של יונים מהתא‪ .‬מאידך‪,‬‬
‫בשינוי מתח הממברנה אזי הזרם עולה‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬מתח המנוחה של הממברנה הנו ‪ ,-70mV‬וכאשר מעלים את‬
‫הזרם המתח עולה עד לנקודת מקסימום )תמונה ‪ (57‬ללא הצגת פוטנציאל פעולה‪ .‬ייתכן ולא נצפה פוטנציאל‬
‫פעולה מכיוון שמשך ההתמיינות הנו יחסית קצר‪ 48-72 ,‬שעות‪ ,‬והתאים אינם מספיק "בשלים" – לא נוצרו כל‬
‫התעלות ההכרחיות לטובת יצירת פוטנציאל פעולה‪ .‬תוצאות דומות תוארו בתאים מזנכימליים מעכבר שעברו‬
‫התמיינות לתאים דמויי תאי עצב )‪.(Kohyama et al., 2001‬‬
‫בשנה האחרונה פורסמו מספר עבודות התומכות בממצאים אלו‪ .‬מספר קבוצות מתעניינות בהתמיינות תאים‬
‫מזנכימליים לתאי שריר הלב )‪ (cardiomyocytes‬ובעקבות כך חקרו תעלות תלויות מתח בדופן התאים‬
‫)‪ .(Heubach et al., 2004; Li, G.R., et al., 2005‬נמצא שתאים מזנכימליים ממקור אנושי שלא עברו התמיינות‬
‫מבטאים תעלות יוניות תלויות מתח כגון‪:‬‬
‫‪large-conductance Ca2+-activated K+ current (MaxiK, IKCa), L-type Ca2+ current, slow K+ current‬‬
‫‪(Is) (Heubach et al., 2004); tetrodoxin-sensitive sodium current (INa,TTX) , transient outward K+ (Ito),‬‬
‫‪nifedipine-sensitive L-type Ca2+ current (ICa,L) (Li, G.R., et al., 2005).‬‬
‫במחקר אחר תוארו תאים מזנכימליים ממקור אנושי שהודגרו בנוכחות ‪ 30 µM‬חומצה רטינואית למשך ‪4-6‬‬
‫ימים הראו פעילות חשמלית סינפטית‪ ,‬קרי פעילות חשמלית פוסטסינפטית בעקבות גירוי התא הפרה‪-‬סינפטי‪.‬‬
‫בנוסף‪ ,‬נצפתה הפרשת ‪ substance P‬בעקבות גירוי עם ‪ .(Cho et al., 2005) interleukin-1α‬במחקר זה לא‬
‫הצלחנו לדגום תאים המסוגלים לייצר פוטנציאל פעולה‪.‬‬
‫יצירת פוטנציאל פעולה )‪ (action potential‬תוארה רק בהתמיינות תאים מזנכימליים לתאים עצב ממקור חולדה‬
‫)‪ .(Dezawa et al., 2004; Wislet-Gendebien et al., 2005‬במחקר זה אותר פוטנציאל פעולה ב‪40%-‬‬
‫מהתאים‪ ,‬המבטאים ביתר ‪ ,NICD‬ושהודגרו למשך ‪ 7‬ימים במדיום התמיינות שהכיל ‪froskolin, bFGF, CNTF‬‬
‫‪ ,‬ועוד ‪ 11‬ימים בנוכחות ‪ ,BDNF, NGF‬קרי סה"כ ‪ 18‬ימי התמיינות )‪ .(Dezawa et al., 2004‬במחקר השני‪,‬‬
‫תאים מזנכימליים ממקור חולדה הדגימו פוטנציאל פעולה לאחר התמיינות עצבית בתרבית כפולה )‪(co-culture‬‬
‫על ‪ mouse cerebellar granule neuron‬למשך ‪ 8‬ימים )‪ (21.5%‬ו‪ 12-‬ימים )‪Wislet-Gendebien et al., ) (25%‬‬
‫‪166‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ .(2005‬מאידך‪ ,‬בעבודתנו אנו מדוחים לראשונה על מדדים אלקטרופיסיולוגים בעקבות הוספת חומרים ‪ex-vivo‬‬
‫בלבד‪ ,‬ללא החדרת גן חיצוני או בנוכחות תאים אחרים‪ .‬למותר לציין ששימוש בגנים חיצוניים או תאים ממקור‬
‫שונה מהווים מגבלה משמעותית בשימוש האפשרי של תאים אלו למטרות השתלה בחולי פרקינסון‪.‬‬
‫‪ .3‬התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דופאמינרגים‬
‫‪ 3.1‬ביטוי סמנים דופאמינרגיים בתאים שעברו התמיינות‬
‫כמתואר בהרחבה בסעיף ‪ 2.5‬במבוא‪ ,‬ידועים כיום שלשה מסלולים של גורמי שעתוק אשר אחראים לייצור‬
‫מערכת דופאמינרגית במוח התיכון‪ .‬המסלול הראשון הכולל את גורם השעתוק ‪ Lmx1b‬המופיע ביום ‪E7.5‬‬
‫)בעובר עכבר( המוביל לייצור ‪ Pitx3‬ביום ‪ .E11.5‬המסלול השני כולל את גורמי השעתוק ‪ En1, En2‬המופיעים‬
‫כיממה לאחר ‪ .Lmx1b‬המסלול השלישי והמאוחר מביניהם כולל את ‪ Nurr1‬האחראי על היווצרות האנזים ‪.TH‬‬
‫בעוד שכל מסלול בנפרד תורם למאפיינים ייחודיים של תאי עצב דופאמינרגים‪ ,‬שלשתם נדרשים להישרדותם של‬
‫תאי העצב במהלך התפתחותם וקיימים יחסי גומלין בין המסלולים השונים )‪.(Burbach et al., 2003‬‬
‫באמצעות ‪ RT-PCR‬נמצא שתאים מזנכימליים שהודגרו במדיום התמיינות ביטאו גורמי שעתוק ‪Pitx3 ,Nurr1‬‬
‫‪ ,En1‬וכמו‪-‬כן ביטאו ‪ Aldh1a1‬הייחודי לתאי אב קדמון דופאמינרגים )תמונה ‪ .(48‬עוצמת הביטוי של ‪Nurr1‬‬
‫הייתה גבוהה יותר לעומת יתר גורמי הגידול ויתכן שזהו אחד ההסברים להופעת ‪ TH‬ולפעילותו‪ .‬יתרה מכך‪,‬‬
‫ממחקרים שנעשו לאחרונה במעבדתנו )ע"י אלכס בורשטיין( זוהתה עליה ברמת הביטוי הגנטי של ‪Nurr1‬‬
‫)‪ .(Northern blot‬עליה זו נמצאה בהתאמה לעליה במספר סמנים עצביים‪ ,‬ולעליית רמות ‪) TH‬כמתואר בסעיף‬
‫‪ 6.1‬בתוצאות(‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬לא נמצאו גורמי שעתוק האופייניים למערכת הנוראדרנרגית כדוגמת ‪Phox2b ,Mash1‬‬
‫)‪ (Goridis & Rohrer, 2002‬ולא האנזים ‪ DβH‬ההופך דופאמין לנוראפינאפרין‪.‬‬
‫באנליזה ‪ RT-PCR‬סמי‪-‬כמותית‪ ,‬נראתה עלייה בביטוי הגנטי )בעקבות התמיינות עצבית( של כל האנזימים‬
‫האופייניים לתאים דופאמינרגים‪ ,‬כגון‪ :‬אנזים המשתתף בביוסינטזה של דופאמין )‪ ,(AADC‬אנזימים‬
‫המפרקים דופאמין )‪ ,(COMT , MAO-B‬תעלות הקולטות בחזרה דופאמין מהמרווח הסינפטי )‪ (DAT‬ורצפטור‬
‫לדופאמין )‪ .(D2DR‬בנוסף לכך‪ ,‬רמות הביטוי של ‪ TH‬עלו בעקבות ההתמיינות ואף נצפו תעלות ‪VMAT2‬‬
‫המכניסות דופאמין לתוך ואסיקולות‪ .‬כלומר השראת ההתמיינות הביאה ליצירת תא בעל פוטנציאל לתפקד כתא‬
‫דופאמינרגי עם כל "המיכון" )‪ (machinery‬שהוא צורך‪.‬‬
‫‪167‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ 3.2‬הפרשת דופאמין ע"י תאים מזנכימליים שעברו התמיינות‬
‫על מנת שתאי גזע ממח עצם אנושי יוגדר כתא עצב דופאמינירגי ויוכל לשמש בעתיד בתרפיה תאית למחלת‬
‫פרקינסון‪ ,‬הכרחי שיהיה שתהיה לו יכולת לייצר ולהפריש דופאמין‪ .‬באנליזה ב‪ HPLC-‬ניתן לזהות ‪ DOPA‬לאחר‬
‫הדגרת התאים במדיום התמיינות ‪ .II‬רמות ‪ DOPA‬עולות ומצטברות במהלך ההדגרה של תאים‪ ,‬ומגיעות למעל‬
‫‪ 300 pg/ml‬עבור ‪ 105‬תאים לאחר ‪ 72‬שעות במדיום התמיינות ‪) II‬תמונה ‪ .(50‬יתרה מכך‪ ,‬נמצא שתאים‬
‫מזנכימליים ממקור אנושי שהודגרו במדיום התמיינות ‪ II‬מעושר ב‪ GDNF-‬הפרישו ‪ 186 pg/ml‬דופאמין‬
‫כהפרשה בסיסית ו‪ 65 pg/ml-‬לאחר דפולריזציה ) ‪ 2x105‬תאים(‪ .‬בנוסף תוארה שהפרשת ‪) DOPAC‬תוצר פירוק‬
‫של דופאמין( הולכת ועולה ככל שמשך זמן ההתמיינות הולך ומתארך‪ ,‬עובדה נוספת המעידה על המצאות‬
‫דופאמין בתאים שעברו התמיינות‪.‬‬
‫תוצאות אלו המתארות התמיינות תאי גזע ממקור אנושי לתאים דופאמינרגים דומות לתוצאות שתוארו‬
‫לאחרונה במספר מחקרים‪ ,‬בהם הצליחו להשרות ייצור והפרשה של דופאמין ע"י תאי גזע עובריים שעברו‬
‫התמיינות לתאי עצב דופאמינרגים )‪ .(Park et al., 2004; Schulz et al., 2004‬למעשה‪ ,‬אנו הקבוצה הראשונה‬
‫שמראה הפרשת דופאמין‪ DOPA ,‬ו‪ DOPAC-‬ע"י תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי‪ ,‬שעברו הדגרה במדיום‬
‫התמיינות לתאים דמויי‪-‬עצב דופאמינרגים בתרבית ללא ביטוי של גן חיצוני‪.‬‬
‫לאחרונה תוארו ‪ 2‬עבודות בהם דווחה השראת התמיינות של תאים ממח העצם של אדם לתאים מפרישי דופאמין‬
‫)‪ .(Dezawa et al., 2004; Hermann et al., 2004‬באחת תוארה הפרשת דופאמין לאחר השראת התמיינות של‬
‫תאים מזנכימליים‪ ,‬שעברו טרנסדוקציה של ‪ ,NICD‬בעקבות הוספת ‪) GDNF‬ראה הרחבה בסעיף ‪8.3.1.2‬‬
‫במבוא(‪ .‬המחברים מציינים שהתמיינות עצבית‪-‬דופאמינרגית נבעה בעקבות ביטוי יתר של ‪ NICD‬וללא החדרת‬
‫הגן התאים לא התמיינו אפילו בנוכחות גורמי גידול‪ ,‬נתון המהווה‪ ,‬כאמור‪ ,‬מגבלה בעתיד לשימוש תאים אלו‬
‫לחולי פרקינסון )‪ .(Salim et al., 2004‬בנוסף‪ ,‬תוצאות אלו אינן עולות בקנה אחד עם כל עשרות העבודות )כולל‬
‫עבודתנו( המתארות התמיינות תאים מזנכימליים לתאים דמויי‪-‬תאי עצב ללא החדרת גן לביטוי יתר של ‪.NICD‬‬
‫בעבודה השנייה‪ ,‬דווח שבהוספת ‪ EGF, bFGF‬למדיום הגידול של תאים מזנכימליים ממח עצם אנושי )בריכוז‬
‫חמצן ‪ (3%‬ניתן לקבל צברי תאים כדוריים )‪ (sphere‬החיוביים ל‪ ,nestin-‬ולאחר הפרדתם לתאים בודדים‬
‫והוספת ‪ BDNF, RA‬התאים מבטאים סמנים של תאי עצב )‪ .(Hermann et al., 2004‬בנוסף‪ ,‬נמצא שהתאים‬
‫מייצרים ומפרישים דופאמין אך רק בעקבות הוספת קופאקטור ‪ BH4‬למדיום ההתמיינות‪ .‬נתון זה מהווה מגבלה‬
‫לשימוש בתאים אלו בעתיד לחולי פרקינסון‪ .‬מאידך‪ ,‬בעבודתנו )כאן( תואר ייצור והפרשת דופאמין ‪ ex-vivo‬ללא‬
‫‪168‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫צורך בהוספת חומרים נוספים לאחר ההתמיינות‪ .‬סיכום התמיינות תאים ממקור בוגר לתאים דופאמינרגים‬
‫בטבלה ‪.14‬‬
‫‪ 3.3‬השפעת השתלת תאים מזנכימליים שעברו התמיינות במודלים למחלת פרקינסון‬
‫כמתואר בסעיף ‪ 9‬בפרק "תוצאות"‪ ,‬ראינו שיפור התנהגותי בחולדות וגם בעכברי מודל למחלת פרקינסון שעברו‬
‫השתלת תאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים שהתמיינו מתאים מזנכימליים )ממקור עכברי(‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬לאחרונה‬
‫הסתיים במעבדתנו ניסוי נוסף שבו השתילו לחולדות מודל למחלת פרקינסון תאים מזנכימליים ממקור אנושי‬
‫שעברו התמיינות לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים ונצפה שיפור התנהגותי בחולדות שעברו השתלה לעומת‬
‫חולדות ביקורת )תוצאות לא מוצגות(‪ .‬בנוסף‪ ,‬בימים אלו מתבצע במעבדתנו ניסוי בו השתילו לחולדות מודל‬
‫למחלת פרקינסון תאים מזנכימליים אנושיים שעברו התמיינות לאסטרוציטים המפרשים ‪ GDNF‬ובתוצאות‬
‫ראשוניות נצפה שיפור התנהגותי בחיות שעברו השתלה לעומת חיות הביקורת )בשיתוף מירב בהט סטרומזה‪,‬‬
‫תוצאות לא מוצגות(‪.‬‬
‫בעבודות רבות הראו שתאי גזע ממקורות שונים המושתלים לחיות מודל למחלת פרקינסון ביטאו סמנים‬
‫דופאמינרגים ואף חל שיפור התנהגותי בעקבות ההשתלה לעומת חיות הביקורת )ראה הרחבה בטבלה ‪ .(8‬מאידך‪,‬‬
‫העבודות שבוצעו במעבדתנו הינן העבודות הראשונות המתארות שיפור התנהגותי בחיות מודל למחלת פרקינסון‬
‫בעקבות השתלת תאים מזנכימליים ממח העצם שעברו התמיינות עצבית‪-‬דופאמינרגית‪.‬‬
‫השאלה הנשאלת מהו המנגנון בו התאים המזנכימליים המושתלים גורמים לשיפור התנהגותי בחיות המודל?‬
‫בראש וראשונה ניתן לטעון שקיימת עלייה ברמת הדופאמין בעקבות הפרשה מהתאים המושתלים‪ .‬טענה זו‬
‫מתבססת )נכון להיום( מתוצאות ‪ in-vitro‬שנצפתה הפרשת דופאמין למדיום מתאים מזנכימליים שעברו‬
‫התמיינות‪ .‬קביעה זו מצריכה אישוש נוסף מכיוון שבצביעות אימונוציטוכימיות נמצאו רק כ‪ 10%-‬מהתאים‬
‫המושתלים חיובים ל‪ .TH-‬לכן‪ ,‬לא ניתן לשלול את האפשרות שישנם מסלולים מקבילים נוספים בהם התאים‬
‫המושתלים מביאים לשיפור התנהגותי‪ .‬אפשר שהתרומה של התאים המושתלים היא בעקבות שחזור מקומי של‬
‫הרקמה הפגומה‪ ,‬וכתוצאה מכך שיקום היכולת של הפרשת נוירוטרנסמיטר למרווח הסינפטי‪ .‬יתרה מכך‪ ,‬ייתכן‬
‫שהתאים המזנכימליים המושתלים מייצרים ומפרשים לסביבתם גורמי גידול ו‪/‬או ציטוקינים נוירוטרופים‬
‫הגורמים לעצירת הניוון העצבי ו‪/‬או להגברת שרידותם של תאי עצב קיימים ו‪/‬או היווצרותם של חדשים‪ .‬בנוסף‪,‬‬
‫בעקבות הפרשת גורמי הגידול וציטוקינים ע"י התאים המושתלים‪ ,‬פרקורסורים אנדוגניים מסוגלים לנדוד לאזור‬
‫הנזק ולהתמיין לתאי פעילים )‪ .(Chopp & Li, 2002‬השערה זו יכולה לקבל תמיכה מהתוצאות הראשוניות‬
‫שהתקבלו לאחרונה במעבדתנו בהם נצפה שיפור התנהגותי בחולדות מודל למחלת פרקינסון שעברו השתלת‬
‫תאים מזנכימליים )ממקור אנושי( שהתמיינו לתאים אסטרוציטים מייצרי ‪.GDNF‬‬
‫‪169‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫דיון‬
Table 14: In-vitro differentiation of adult stem cells to dopaminergic neural lineag
Population of
cells
Induction of
differentiation
Protein markers
of neuronal
lineage
Dopaminergic
markers
(protein/RNA)
Dopamine
(HPLC)
% positive
cells for
tyrosine
hydroxylase
Others
neurotransmitter
(protein/RNA)
Reference
not tested
not tested
TH, GTPCH, LDOPA
L-DOPA
most of the
cells into the
isolated clone
no tested
Schwarz
2001
NF-M, tau,
synaptophysin
β-tubulinIII,
synaptophysin,
tau
β-tubulinIII,
MAP2, nestin,
NF-M
Nestin, MAP2,
β-tubulinIII,
TH
no
few
ChAT
Woodbury
2002
TH, Nurr1,
Lmx1b, En1,
Pitx3
TH
DA (rat)
41%
no tested
Dezawa
2004
DA (only
after added
BH4)
11%
no tested
Hermann
2004
β-tubulinIII, NSE,
NF-200, nestin,,
NeuN, COMT,
DAT, GTPCH,
MAOB
TH, AADC,
D2DR, VMAT2,
α-synuclein,
Nurr1, Pitx3,
Aldh1, En1
DA
L-DOPA,
DOPAC
60%
TPH (for serotonin)
Levy 2003,
2004 and
this study
GFAP, GalC, NF200, tau, MAP2
Nestin, NF-200,
MBP, GFAP, tau
AADC, TH
no
30%
GABA, Serotonin
AADC, TH, DAT,
DBH, dopamine,
Nurr1, En1
no
23%
(from
neuronal
markers)
GABA, TPH
Jiang
2002a
Jiang 2003
Gene expression
of neuronal
lineage
Bone marrow mesencymal stem cells (BMSc)
Rat BMSc
Rat BMSc
Rat & human
BMSc
Human BMSc
Human BMSc
Vectors construct consisting
of the TH gene and GTPCH
gene separated by an
internal ribosome entry site
BHA, forskolin, DMSO,
heparin, K252a, KCl,
valporic acid, bFGF, PDGF
Vectors construct consisting
of NICD gene, forskolin,
bFGF, CNTF, GDNF
Stage I: bFGF, EGF
Stage II: RA, N2, BDNF
Stage I: EGF, bFGF, DHA,
N2
Stage II: cAMP, RA, BHA,
ascorbic acid, N2, (± GDNF,
NGF, bFGF)
Mash1, Math1,
neurogenin 1
MBP, musashi1,
neurogenin 2, αsynuclein, βtubulin III, nestin
NEGF2, NSE,
glipican 4, necdin,
NF-H, NF-M, NFL, CD90, nestin,
Trk2, RAR,
PTCH, SMO
Multipotent adult progenitor cells (MAPC)
Rat & mouse
MAPC
Mouse MAPC
Sequentially with bFGF,
FGF8, BDNF for 7 days
Sequentially with bFGF,
FGF8, Shh, BDNF for 7
days, coculturing with
astrocytes
Otx2, Otx1, Pax2,
Pax5, nestin
Sox1, Otx1, Otx2,
Pax2, Pax5,
Nestin, GFAP,
MBP, GABA,
170
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫דיון‬
Adult neuronal stem cells (NSCs)
TH
no
1%
GABA, AChE
Takahashi
1999
not tested
MAP2, βtubulinIII,
calbindin, GFAP,
GalC,
MAP2
TH, AADC
no
1.5%
not tested
Sakurada
1999
not tested
not tested
TH
no
0.23%
not tested
Daadi &
Weiss 1999
not tested
Nestin, A2B5,
NG2, GFAP, RIP,
β-tubulin III
not tested
no
no tested
not tested
Lie 2002
Adult rat
hippocampus
NSCs
Sequentially with FGF2,
RA, NGF or BDNF or NT3
trkA, trkB, trkC,
Adult rat
hippocampus
NSCs
Vectors construct consisting
of Nurr1, Pitx3, Shh-N.
Sequentially with FGF2, RA
or froskolin or FGF8
FGF2, glial cell conditioned
medium
Sequentially
DMEM/F12+N2+FGF8 or
FGF2, DMEM/F12+RA for
7 days
Adult mouse
subependyma
of lateral
ventricle of
forebrain
Adult rat
substantia nigra
progenitor cells
Acetylcholine esterase (AChE); acetyltransferase (ChAT); achaete-scute homolog 1 (Mash1); aldehyde dehydrogenase1 (Aldh1); aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC);
atonal protein homolog 1 (Math1); basic fibroblast growth factor (bFGF,FGF2); brain-derived neurotrophic factor (BDNF); butylated hydroxyanisole (BHA); catechol-Omethyltransferase choline (COMT); chondroitin sulfate proteoglycan (NG2); ciliary neurotrophic factor (CNTF); dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC); 3,4-dihydroxyphenylalanine
(l-DOPA); dimethyl sulfoxide (DMSO); dopamine (DA); dopamine β-hydroxylase (DBH); D2 dopamine receptor (D2DR); dopamine transporter (DAT); Docosahexaenoic acid
(DHA); Engrailed 1 (En1); epidermal growth factor (EGF); fibroblast growth factor 8 (FGF8); γ-aminobutyric acid (GABA); galactocerebroside (GalC); glial acidic fibrillary protein
(GFAP); glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF); GTP cyclohydrolase I (GTPCH); high-performance liquid chromatography (HPLC); LIM homeobox transcription factor
1 beta (Lmx1b); microtubule-associated protein 2 (MAP2); monoamineoxidase B (MAOB); myelin basic protein (MBP); N2 solution (N2); neurite growth-promoting factor 2
(NEGF2); neurofilament heavy (NF-200); neurofilament medium (NF-160); neurofilament light (NF-68); nerve growth factor (NGF); neuron specific enolase (NSE); neuronal nuclei
(NeuN); neurotrophin-3 (NT3); notch intracellular domain (NICD); nuclear receptor related-1 (Nurr1); orthodenticle homolog 1 or 2 (OTX 1 or 2); paired box gene 2 or 5 (Pax 2 or
5); patched 1 (PTCH); pituitary homeobox 3 (homeobox protein PITX3) (Pitx3 / Ptx3); platelet-derived growth factor (PDGF); all-trans retinoic acid (RA); retinoic acid receptor
(RAR); smoothened (SMO); sonic hedgehog (Shh); tetrahydrobiopterin (BH4); tryptophan hydroxylase (TPH); tyrosine hydroxylase (TH); tyrosine kinase receptor A, B (2) or C
(Trk A, B or C); vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2)
171
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ 3.4‬התמיינות לתאים סרוטונרגים )‪(serotonergic cells‬‬
‫בעבודתנו נמצא שהתאים שעברו התמיינות מבטאים ‪ ,TPH‬אנזים קובע הקצב ליצירת סרוטונין )תמונה ‪.(53‬‬
‫בנוסף‪ ,‬באנליזה ב‪ HPLC-‬נמצא שהתאים שעברו התמיינות מפרישים רמות נמוכות של ‪5-hydroxyindoleacetic‬‬
‫)‪ acid (5HIAA‬שהנו תוצר פירוק של סרוטונין‪ ,‬מאידך‪ ,‬לא נמצאה הפרשת סרוטונין‪.‬‬
‫תוצאות דומות נצפו בהתמיינות תאי גזע עובריים )ממקור עכבר( לתאים דופאמינרגים – ‪ 34%‬מתאי העצב‬
‫שהתמיינו היו דופאמינרגים ו‪ 11%-‬היו סרוטונרגים ולא נצפה ולו תא אחד שהיו לו גם סמנים סרוטונרגיים וגם‬
‫דופאמינרגים )‪ .(Lee et al., 2002‬בנוסף‪ ,‬נמצא שתאי גזע עובריים )נאיבים( שהושתלו לסטריאטום של עכברים‬
‫בריאים וחולדות מודל למחלת פרקינסון התפתחו לתאי עצב דופאמינרגים וסרוטונרגים )‪.(Deacon et al., 1998‬‬
‫צא ולמד ממחקרים אלו שקשה לכוון התמיינות תאי גזע רק לתאים דופאמינרגים ויתכן שאחוז נמוך של התאים‬
‫מתמיין לתאים סרוטונרגים‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬לאחר השתלה לסטריאטום התאים מתמיינים באופן ספונטני לתאים‬
‫דופאמינרגים וסרוטונרגים‪ .‬רמז לדבר‪ ,‬האנזים ‪ AADC‬מצוי גם בתאים דופאמינרגים וגם בתאים סרונונרגים‬
‫בהם מבצע דקרבוקסילציה ל‪ 5-hydroxytryptophan -‬ליצירת סרוטונין‪.‬‬
‫יתרה מכך‪ ,‬לאור תוצאות השתלת תאים ממקור עובר לבני אדם ולמודלים למחלת פרקינסון‪ ,‬השתלת תאים‬
‫דופאמינרגים לבדם אינה מספקת )‪ (Lang & Obeso 2004‬ויתכן וקיים יתרון בשתל המכיל תערובת של תאים‬
‫דופאמינרגים ומיעוט תאים סרוטונרגים‪ .‬כמתואר בהרחבה בפרק ‪ 6‬במבוא‪ ,‬הושתלו לסטריאטום של חולי‬
‫פרקינסון תאים שהופקו מ‪ ventral mesencephalic (VM)-‬בעוברים ואף בוצעו שני מחקרים כפולי סמיות ‪2001‬‬
‫)‪ (Freed et al., 2001; Olanow et al., 2003‬בהם נצפה שיפור קליני ארוך טווח בעיקר בחולים "הצעירים"‬
‫ומאידך‪ ,‬תוארו תופעות לוואי קשות של תנועות בלתי רצוניות ב‪ 15-56%-‬מהמושתלים‪ .‬הימצאותם ומספרם של‬
‫תאים סרוטונרגים בשתלים )שהופקו מעוברי אדם( יכולים להשפיע על פעילותם התקינה של התאים‬
‫הדופאמינרגים המושתלים )‪ .(Winkler et al., 2005‬יתכן שעל מנת למנוע דיסקינזיה במצב "‪off-phase ) "off‬‬
‫‪ (dyskinesias‬בחולים שעברו השתלת תאים מעובר יש צורך בהימצאותם של תאים סרוטונרגים בשתל המופק מ‪-‬‬
‫‪ .(Winkler et al., 2005) VM‬ממחקרים במכרסמים בהם תוארו השתלות תאים ממקור ‪ VM‬במודלים למחלת‬
‫פרקינסון נמצא שהימצאותם של תאים סרוטונרגים בשתל הביאה לעצבוב גבוהה יותר בסטריאטום ) ‪Takeuchi‬‬
‫‪ .(et al., 1991; Wright et al., 1991; Ishida et al., 1998‬למרות שהשפעתם הפונקציונאלית של התאים‬
‫הסרוטונרגים – חיובית או שלילית – לא נחקרה מספיק‪ ,‬נראה שהתאים הסרוטונרגים אינם משפעים רק על‬
‫היעילות של ‪ VM‬המושתלים אלא גם משמשים אתרים לאחסון והפרשת דופאמין ) ;‪Tanaka et al., 1999‬‬
‫‪ .(Kannari et al., 2001‬העצבוב המסופק ע"י התאים הסרוטונרגים יכול לפעול גם כאזור חיץ נוסף לדופאמין‬
‫‪172‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫ולהפחית את הפעילות הפרמקולוגית של דופאמין ו‪ L-dopa-‬ולהוריד את הסיכון ל‪L-dopa-induced -‬‬
‫‪.(Winkler et al., 2005) dyskinesias‬‬
‫ראיה נוספת שיתכן שבהשתלת תאים במחלת פרקינסון אין להסתפק רק בתאים דופאמינרגים אלא בתערובת‬
‫תאים דמויי תאי עצב הממתנים פעילות תופעת לוואי של דופאמין‪ ,‬מגיעה מכיוון הטיפול התרופתי‪ .‬איבוד‬
‫התאים הדופאמינרגים במחלת פרקינסון מחד ומתן תרופות הגורמות לעלייה ברמות הדופאמין מצד שני גורמות‬
‫לחוסר איזון במערכות נוירוטרנסמיטורים אחרות בנוסף לדופאמין‪ .‬בעבודות רבות במחלת פרקינסון מתואר‬
‫שחומרים אשר מטרתם אינה המערכת הדופאמינרגית ויש להם יכולת למנוע או להפחית את התנועות הבלתי‬
‫רצוניות במחלת פרקינסון מומלצים לשימוש )‪.(Jenner, 2000; Muller, 2001; Djaldetti & Melamed, 2002‬‬
‫יתרה מכך‪ ,‬רצפטורים לסרוטונין )‪ (5HT1A, 5HT1B, 5HT2C‬זוהו כבעלי פוטנציאל וכמטרות לטיפול במחלת‬
‫פרקינסון )‪.(Nicholson & Brotchie, 2002‬‬
‫‪173‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ .4‬המצאות סמנים עצביים בתאים מזנכימליים נאיביים‬
‫במחקר זה‪ ,‬עשינו אנליזה לגנים עצביים המתבטאים ע"י תאים מזנכימלים ממח עצם אנושי ‪ in-vitro‬והתמקדנו‬
‫בשלוש קבוצות עיקריות של גנים‪ :‬גנים עצביים‪ ,‬גורמי שעתוק עם מעורבות עצבית מתועדת וגנים עצביים‬
‫דופאמינרגים‪ .‬התוצאות שלנו מראות שאוכלוסיית התאים המזנכימלים ממח העצם שלא עברה התמיינות‬
‫מבטאת סוגים רבים של גנים אלה‪ ,‬ובכך מספקות מידע חיוני על דפוסי ביטוי גנים של תאים מזנכימלים ומרמזות‬
‫על פוטנציאל התמיינות רחב של התאים הללו‪.‬‬
‫מחקרים בבעלי חיים ובבני אדם מתעדים את הרפרטואר הגדל של פוטנציאל ההתמיינות של תאי גזע בוגרים‪.‬‬
‫גמישות זאת מכונה "פלסטיסיות" )‪ .(plasticity‬לא נקבעה עדיין ההגדרה המדויקת של המושג פלסטיסיות‪ .‬אף‬
‫על פי כן‪ ,‬באופן כללי‪ ,‬מושג זה מתאר את היכולת‪ ,‬שהתגלתה לאחרונה‪ ,‬של תאי גזע בוגרים לחצות את מחסומי‬
‫שורות התאים ולסגל לעצמם את פרופילי הביטוי והפנוטיפים התפקודיים של התאים הייחודיים לסוגים אחרים‬
‫של הרקמות‪ .‬הביטוי הנרחב של הגנים העצביים בתאים מזנכימלים נאיבים ממח העצם מרמז על טווח‬
‫פלסטיסיות רחב ועל הפוטנציאל להתמיין לנגזרות עצביות בנוסף לנגזרות הצפויות של השורה המזנכימלית )כגון‪:‬‬
‫אדיפוציטים‪ ,‬אוסטאובלסטים(‪ .‬תוצאות שהתקבלו במחקר זה מראות‪ ,‬שחלק ניכר מהתאים המזנכימלים‬
‫מבטאים גנים עצביים‪ .‬כמו‪-‬כן‪ ,‬במחקרים רבים מתואר ביטוי גנים עצביים בתאים מזנכימליים נאיבים )טבלה‬
‫‪ .(15‬האפשרות שתאים אלה נוצרו מתאי פרוגניטור פלוריפוטנטיים‪ ,‬כגון תאי פרוגניטור מולטיפוטנטיים בוגרים‬
‫)‪ (multipotent adult progenitor cells‬או תאים רדומים ממקור עוברי ) & ‪Reyes et al., 2001; Reyes‬‬
‫;‪ ,(Verfaillie, 2001; Jiang et al., 2002a,b; Labat et al., 2000‬קיימת‪ ,‬אך לא סבירה‪ ,‬מכוון שאלה אירועים‬
‫נדירים ביותר וניתן למצוא אותם באחוזים גבוהים באוכלוסיות תאים גדולות אם אלה נוצרו משיבוט של תא‬
‫מקור נדיר זה‪ ,‬דבר שאינו אופייני למחקר שלנו‪ .‬אנו טוענים‪ ,‬שביטוי גנים עצביים היא תופעה נפוצה המאפיינת‬
‫תאים מזנכימליים ממח העצם‪ ,‬בעלת משמעות פוטנציאלית במנגנוני הפלסטיסיות‪ .‬אפשרות נוספת היא שהתאים‬
‫עברו ספונטנית תהליך של דה‪-‬דיפרנציאציה ולאחר מכן רה‪-‬דיפרנציאציה לנגזרות של שורות תאי העצב ) ‪Walder‬‬
‫‪ .(et al., 2003; Li T.Y., et al., 2004; Straube et al., 2004‬יחד עם זאת‪ ,‬תופעה זו אינה נראית סבירה‪ ,‬מאחר‬
‫והתאים שומרים על התכונות האופייניות לתאי הגזע‪ ,‬כגון יצירת שבטים‪ ,‬מורפולוגיה האופיינית לתאים‬
‫מזנכימלים ממח העצם והפוטנציאל להתמיין לאדיפוציטים ואוסטאובלסטים‪ ,‬סימן להיותם תאים צעירים ולא‬
‫ממוינים‪ .‬טרנס‪-‬דיפרנציאציה )‪ (Herzog et al., 2003; Lagasse et al., 2000‬מהווה הסבר מתקבל על הדעת‬
‫לפלסטיסיות של תאים מזנכימלים ממח העצם‪ .‬אף על פי כן‪ ,‬אנו רוצים להציע מודיפיקציה של המנגנונים‬
‫הקלאסיים של הפלסטיסיות ולתמוך בהגדרת "מצב הגזע" )‪ (stem state‬המולטי‪-‬פוטנציאלי ) ‪Zipori, 1990,‬‬
‫‪ ,(2004‬לפיו תאי גזע מבטאים מגוון רחב של גנים‪ ,‬חלקם אופייניים לסוגי תאים ספציפיים‪ .‬פלסטיסיות‪ ,‬בהתאם‬
‫‪174‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫לתיאוריה זו‪ ,‬מוגדרת כיכולת של תאי הגזע לדכא את ביטוי גני ה‪"-‬רקע" שלא יהיו פעילים בתא מטרה ממוין‪,‬‬
‫ולהגביר את ביטוי הגנים המקנים מאפיינים ספציפיים לנגזרת הממוינת )‪.(Zipori, 1990; Egusa et al., 2005‬‬
‫משמעות הדבר‪ ,‬התאים המבטאים גנים עצביים לא בהכרח מיועדים להפוך לתאי העצב ואינם תאי עצב‬
‫תפקודיים‪ ,‬אלא שהביטוי של גנים אלה מקנה פוטנציאל להתמיינות עצבית שאחרת היה בלתי ניתן או קשה‬
‫להשיג‪ .‬במצב זה של גזעיות )‪ ,(stemness‬הגנים המופעלים מקנים הזדמנות לביטוי במורד הזרם )‪(downstream‬‬
‫של קבוצות מגוונות של גנים וחציית שורת התאים‪ ,‬המביאה לטרנס‪-‬דיפרנציאציה‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬מימוש מסלולי‬
‫התבגרות אלו דורש סיגנלים נוספים‪ ,‬שהעדרם יוביל לשמירה על המצב הקיים או מעבר לסוג תא מכוון‬
‫)‪ (committed‬יותר‪ .‬לכן‪ ,‬יתכן ששיעור הפלסטיסיות תלוי בפרופיל הביטוי הגנטי של התא‪ .‬תוצאות מחקר זה‬
‫תומכות בהיפותזת 'מצב הגזע' ומרמזות על נטייה עצבית מוקדמת של תאים מזנכימלים ממח העצם‪ ,‬כפי שנראה‬
‫ע"י הביטוי הנרחב של הגנים העצביים )טבלה ‪ .(16‬לכן‪ ,‬ביטוי גנים עצביים במצב הנאיבי מקנה לתא גזע את‬
‫הנטייה להפוך לפנוטיפים העצביים המתאפשרים ע"י גנים אלה‪ ,‬יותר מאשר לפנוטיפים של תאים שאת הגנים‬
‫המאפיינים אותם התא אינו מבטא‪ .‬בניגוד לכך‪ ,‬התא השכן‪ ,‬שאינו מבטא שום גנים עצביים‪ ,‬יתקל‪ ,‬לפי הגיון זה‪,‬‬
‫בקושי רב יותר להתמיין לפנוטיפ העצבי‪ .‬ראה הרחבה במאמרנו ‪.Blondheim et al., 2006‬‬
‫כאשר המנגנונים העומדים מאחורי הפלסטיסיות נתונים לוויכוח‪ ,‬ידוע ששינויים קריטיים בתאים מבוקרים ע"י‬
‫מנגנוני העברת הסיגנל וע"י בקרת השעתוק‪ .‬וויסות של ביטוי גורמי שעתוק יכול לייצג מנגנון רב‪-‬עצמה המשפיע‬
‫על מנגנונים תאיים האחראים על תפקוד התאים ועל התבגרותם‪ .‬כאופייני לרוב גורמי השעתוק‪ ,‬הם יכולים‬
‫להשפיע על ביטוי גנים רבים והשפעתם על הביטוי הגני לעתים קרובות מערבת גורמים נוספים‪ .‬מצב זה מקשה על‬
‫סווגו של גורם שעתוק כגורם שעתוק עצבי‪ .‬אי לכך‪ ,‬בהתבסס על סקירה ספרותית‪ ,‬מתוך ‪ 39‬פקטורים שנמצאו‬
‫פעילים בתאים מזנכימליים ממח עצם אנושי‪ ,‬התמקדנו בגורמי שעתוק שבסבירות רבה בעלי חשיבות עליונה‬
‫בתאים של השורה העצבית‪ .‬בהתחשב בכל אלה‪ ,‬האפקטים העצביים האפשריים‪ ,‬הנמצאים במורד הזרם‪ ,‬של‬
‫גורמי שעתוק אלה מרמזים‪ ,‬שבהינתן התנאים המתאימים הם יוכלו להשתתף בבניה ובאחזקה של הפנוטיפ‬
‫העצבי בתאים‪ ,‬אולי בתור המתווכים העיקריים של התפקוד העצבי‪ .‬בהמשך‪ ,‬אנו נדון במספר דוגמאות של גורמי‬
‫השעתוק הנמצאים בתאים מזנכימלים ממח עצם אנושי ובתפקידם האפשרי בוויסות הפנוטיפים העצביים )למידע‬
‫נוסף ראה טבלה ‪.(8‬‬
‫‪175‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
a
‫ סיכום של מאמרים שונים המתארים ביטוי של סמנים עצביים ע"י תאים מזנכימליים‬:15 ‫טבלה‬
Source
Method of
of cells
isolation
Characterization profile
Neuronal lineage
Neuronal
References
Proteins detected
lineage mRNA
detected
Bone marrow stromal cells (MSCs)
Human
Plastic adhesion
CD9+/low/CD90+/CD166+/C
–
–
D15 /CD34 /CD45
/CD133
Nestinb
GFAPd,MBPd,
–
d
d
MSI1 , nestin ,
–
Hermann
2004
d
NTRK1 ,
Neurog2d,
SOX1d, THd,
Tuj1d
Human
Human
Plastic adhesion
Plastic adhesion
CD44+/CD34-/CD45+
-
-
CD90 /CD5 /CD11b /CD20
-
-
+
-
/CD34 /CD45
Human
Plastic adhesion
NSE b
CD90 /CD34
Qian 2004
-
e
AADC , EN1
e
e
e
Nurr1 , Pitx3
Tuj1
b
Joannides
b
pan-NF
Human
Plastic adhesion
CD45
-
Levy 2004
2003
b
Nestin , Tuj1
b
g
g
Chen 2002
BDNF , NGF ,
VEFGg
Human
Human
MAP1Bc, NSEc Tuj1c
Plastic adhesion
b
Plastic adhesion
NueN , GFAP ,
c
NueN , nestin
Rat
Plastic adhesion
+
Rat
+
+
5-HT1A- receptor b
Plastic adhesion
Plastic adhesion
nestin
b
NF-M , Tuj1
Plastic adhesion
+
+
+
CD29 /CD54 /CD90 /CD11
-
-
-
b/c /CD31 /CD34 /CD45
-
d
b
Nestin b, NeuN b NSE b
Plastic adhesion
Li 2004
d
NF-M , tau
Rat
Croft 2004
-
b
Rat
SanchezRamos 2000
c
NSE b, nestin b
CD44 /CD90 /TRA2-54
/CD45
Rat
Deng 2001
c
b
GLAST , NF-M
b
b
b
nestin , 3-PGDH
NSEe
Neuhuber
2004
Lu 2004
e
e
Hes1 , Hes5 ,
e
Mash1 ,
Dezawa
2004
Neurog1e,
STAT1e, STAT3e
Rat
Plastic adhesion
Rat
Plastic adhesion
GFAP b, NueNb
CD11b-/CD45+
+
Rismanchi
2003
aldolase Ce,
+
e
/CD44 /CD71 /CD90
e
APP , GFAP ,
Woodbury
2002
GLUTe, NeuroDe,
syntaxine
Rat
Plastic adhesion
CD71+/CD90+/CD44+/CD11
-
b /CD45
NSE b, NSEc
-
176
Woodbury
2000, Black
2001
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
Mouse
Plastic adhesion
Sca-1+
DCX b, GABAb
b
GFAP , NCAM
Jin 2003
b
nestinb, NeuNb Tuj1b
Multipotent adult progenitor cells (MAPCs) h
Mouse
Depleted of
+
CD45 /glycoph
+
orin-A cells
CD13+/ CD90+/ low /Sca-1+/
low
+
-
/Flk1 /CD3 /CD19
-
-
cRetd, EN1d,
-
nestin
-
/CD34 /CD44 /CD45 /cKit
d
Jiang
2003
-
Marrow-isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells
Human
plastic adhesion
at 3% O2
CD29+/CD63+/CD81+/CD12
+
NSE b, NTRK3b
POU5F1e
g
2/
CNTFR
+
-
CD164 /CD34 /CD36
D'Ippolito
2004
-
/CD45-/cKit-
Size-sieved bone marrow stromal cells (SSCs)
Human
3-µm pores to
sieve out MSCs
CD29+, CD44+, CD51+,
+
+
+
-
CD90 , SH2 , SH3 , CD7 ,
-
-
CD34 , CD45 , CD133
a
Nestinc, NeuNc NSEc,
Tuj1
c
Hung
2002a,b
-
Summary from articles that described neural differentiation of mesenchymal stem cells. In all cases the neuronal
markers were shown to be expressed at a very low level. However, after induction of neuronal differentiation a
significant increase in marker level was observed.
b
h
Immunocytochemistry; cWestern Blot; dquantitative RT-PCR; eRT-PCR; fELISAs; gFlow cytometry analysis.
All articles that worked with MAPCs from bone marrow state that did not stain with antibodies against differentiated
neuron markers. Only in one article, by quantitative RT-PCR mouse MAPCs did express low level of cRet En-1 and
nestin mRNA but no other neural mRNA. This seems to be a rare occurance in these cells.
Abbreviations: Aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC); amyloid precursor protein (APP); β-Tubulin III
(Tuj1); brain-derived neurotrophic factor (BDNF); ciliary neurotrophic factor receptor (CNTFR); doublecortin (DCX);
engrailed 1 (En1); enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs); γ-aminobutyric acid (GABA); glial acidic fibrillary
protein (GFAP); glutamate transporter (GLAST); NMDA glutamate binding subunit (GLUT); hairy/enhancer of split 1
or 5 (Hes1, Hes5); mammalian achaete-schute Homolog 1 (Mash1); microtubule-associated protein 1B (MAP1B);
musashi 1 (MSI1); myelin basic protein (MBP); neural cell adhesion molecule (NCAM); neuronal nuclei (NeuN);
neurogenic differentiation (NeuroD); neurogenin 1 or 2 (Neurog1, Neurog2); neurofilament medium (NF-M);
neurofilament low middle and high (pan-NF);nerve growth factor (NGF); neuron specific enolase (NSE); neurotrophic
tyrosine kinase, receptor, type 1 or 3 (NTRK1, NTRK3); nuclear receptor related-1 (Nurr1); 3-phosphoglycerate
dehydrogenase (3-PGDH); Pit1-Oct1-Unc86 domain, class 5, transcription factor 1 (POU5F1); pituitary homeobox 3
(Pitx3); signal transducer and activator of transcription 1 or 3 (STAT1, STAT3); sex determining region Y-box 1
(SOX1); tyrosine hydroxylase (TH).
177
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫בעבר דווח‪ ,‬שביטוי יתר של ‪ EVI-1‬מביא להתמיינות עצבית של תאי ‪ P19‬לאחר טיפול בחומצה רטינואית‪ ,‬חוסם‬
‫את המשך ההתמיינות לאסטרוציטים ומרמז על האפשרות ש‪ EVI-1-‬הוא פקטור שעתוק חשוב בבקרה על‬
‫ההתמיינות הנוירו‪-‬אקטודרמלית המוקדמת )‪ .(Kazama H, 1999‬אנחנו מצאנו עליה ברמות הביטוי של ‪EVI-1‬‬
‫פי ‪ 48 ,9.24‬שעות לאחר ההתמיינות העצבית‪ .‬עליה זו ברמת גורם השעתוק מתאימה לפנוטיפ העצבי הנרכש‬
‫בתאים ויכולה לרמז על תפקידו של גורם שעתוק זה בהתמיינות העצבית‪ .‬לא ידוע תפקידו של גורם שעתוק זה‬
‫בתאים הלא ממוינים‪ ,‬אך יתכן כי נוכחותו הראשונית של פקטור זה ברמות הנמוכות מאפשרת את העלייה‬
‫המהירה‪ ,‬בהינתן התנאים המתאימים‪ .‬לכן‪ ,‬זמינותו של ‪ EVI-1‬מאפשרת לו לקחת חלק בתהליך ההתמיינות‬
‫העצבית‪ .‬באופן דומה‪ ,‬נמצאה עליה משמעותית ברמות של ‪ GAG‬ו‪ human FKHR-‬בעקבות ההתמיינות העצבית‬
‫‪ FKHR .in-vitro‬משמש בין השאר כגורם שעתוק של רצפטור תוך גרעיני של ‪ ,RA‬ויתכן שפעילות ‪ RA‬שהוספה‬
‫למדיום ההתמיינות מתווכות ע"י פקטור שעתוק זה‪.‬‬
‫טבלה ‪ :16‬התבטאות סמנים עצביים בתאים מזנכימליים נאיביים‬
‫‪Methods‬‬
‫‪Gene name‬‬
‫‪Expression‬‬
‫‪Neural Genes:‬‬
‫‪ICH‬‬
‫_‬
‫‪Alpha (α)-synuclein‬‬
‫‪ICH‬‬
‫_‬
‫‪Beta (β)-tubulin III‬‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫‪+‬‬
‫‪CD90‬‬
‫‪ICH, FC‬‬
‫_‬
‫)‪Glial acidic fibrillary protein (GFAP‬‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫‪+‬‬
‫)‪Glypican-4 (GPC4‬‬
‫‪ICH‬‬
‫_‬
‫)‪Microtubule-associated protein 2 (MAP2‬‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫_‬
‫‪Necdin‬‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Nestin‬‬
‫‪Western blot‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Northern blot‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Real-time PCR‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Northern blot‬‬
‫‪+‬‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Flow-cytometry‬‬
‫‪+‬‬
‫‪ICH,‬‬
‫_‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫_‬
‫)‪Neurofilament- Light (NF-L 68 kDa‬‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫‪+‬‬
‫)‪Neurofilament-Medium (NF-M 160 kDa‬‬
‫‪RT-PCR‬‬
‫‪+‬‬
‫)‪Neuron specific enolase (NSE‬‬
‫‪Western blot‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Northern blot‬‬
‫‪+‬‬
‫‪Flow-cytometry‬‬
‫‪+‬‬
‫)‪Neurite growth-promoting factor 2 (NEGF-2‬‬
‫)‪Neurofilament-Heavy (NF-H 200 kDa‬‬
‫‪178‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
Neuronal Nuclei (NeuN)
+
Western blot
_
ICH
Neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2 (TRK-2)
+
RT-PCR
Patched homolog(PTCH)
+
RT-PCR
Retinoic acid receptor type a (RARA)
+
RT-PCR
Smoothened (SMO)
+
RT-PCR
Tryptophan hydroxilase (TPH)
_
RT-PCR
_
Western blot
+
Protein/DNA array
Ecotropic viral integration site 1 (EVI-1)
+
Protein/DNA array
Forkhead box O1A human (FKHRhu)
+
Protein/DNA array
Glycosaminoglycan (GAG)
+
Protein/DNA array
Hepatocyte nuclear factor 3β (HNF-3β)
+
Protein/DNA array
Myelin gene expression factor 2 MEF2(2)
+
Protein/DNA array
Nuclear Y box factor (NF-Y)
+
Protein/DNA array
Neural zinc fingure 3 (NZF-3)
+
Protein/DNA array
Paired box gene 3 (Pax-3)
+
Protein/DNA array
Paired box gene 6 (Pax-6)
+
Protein/DNA array
Xenobiotic response element (XRE)
+
Protein/DNA array
Engrailed 1(En-1)
+
RT-PCR
Nuclear receptor related 1 (Nurr-1)
+
RT-PCR
Paired-like homeodomain transcription factor 3 (PITX-3)
+
RT-PCR
Aldehyde dehydrogenase 1 (Aldh1)
+
RT-PCR
Aromatic L-amino acid decarboxylase (AADC)
+
RT-PCR
Catechol-o-methyltransferase (COMT)
+
RT-PCR
Dopamine transporter (DAT)
_
RT-PCR
Dopamine receptor D2 (DRD2)
_
RT-PCR
GTP cyclohydrolase-1 (GTPCH1)
+
RT-PCR
Monoamine oxidase B (MAO-B)
_
RT-PCR
Tyrosine hydroxilase (TH)
+
Western blot
_
Real-time PCR
_
ICH
_
Flow-cytometry
_
ICH
Neurally Significant Transcription Factors:
Aryl hydrocarbon receptor/Aryl hydrocarbon receptor
nuclear translocator binding element (AhR/Arnt)
Dopaminergic Transcription Factors:
DOPAMINERGIC GENES:
Vesicular monoamine transporter 2 (VMAT 2)
ICH, Immunocytochemistry
179
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫מעניין‪ ,‬כי ‪ Pax-3‬מתבטא בתאים המזנכימליים הלא ממוינים‪ Pax-3 .‬הנו גורם שעתוק הדרוש להתפתחות של‬
‫הצינור העצבי העוברי‪ ,‬הרכס העצבי והנגזרות הסומאטיות )‪ ,(Goulding et al., 1991‬הנו מרקר של‬
‫תאי ‪ Schwann‬עובריים ותאי ‪ (Haggiag S,2001) nonmyelinating Schwann‬ובעל תפקיד בבקרת ההתמיינות‬
‫של תאי עב פריפריים )‪ .(Koblar et al., 1999‬במערכת העצבים‪ ,‬יתכן כי ‪ Pax-3‬משחק תפקיד חשוב במהלך‬
‫ההתמיינות של תאי ‪ Schwann‬ע"י ייסוד ואחזקת הפנוטיפ של תאי ‪ Schwann‬לפני התמיינותם הסופית‪ .‬בעבר‬
‫נמצא‪ ,‬כי קשירת דנ"א ע"י ‪ Pax-3‬עוברת דיכוי מהיר בהתמיינות‪ ,‬רמז לכך שהירידה בפעילות של פקטור שעתוק‬
‫זה קשורה ביצור תא עצב בוגר מורפולוגית ומעלה את האפשרות שדיכוי הפעילות של ‪ Pax-3‬עלול להיות מאורע‬
‫מווסת חשוב בהתמיינות מורפולוגית של התאים העצביים )‪ .(Reeves et al., 1998‬התוצאות שלנו תואמות את‬
‫הממצאים האלה‪ ,‬כאשר אנו רואים ירידה ב‪ Pax-3-‬בעקבות ההתמיינות העצבית ‪ .in vitro‬רמות ביטוי של ‪Pax-‬‬
‫‪ 3‬בתאים מזנכימליים ממקור אנושי ירדו בצורה לא משמעותית ‪ 24‬שעות לאחר ההתמיינות ההעצבית והמשיכו‬
‫לרדת ‪ 48‬שעות לאחר ההתמיינות‪ ,‬ירידה כוללת של ‪ 3.7‬רמות‪.‬‬
‫גורמי שעתוק נוספים שהתגלו בתאים מזנכימליים ממקור אדם כוללים‪ PITX ,En-1 :‬ו‪ .Nurr1-‬הומולוגים‬
‫הומניים ‪ En-1‬ו‪ En-2-‬מקודדים לחלבונים המכילים ‪ homeodomain‬ומעורבים בבקרה של יצירת דפוסים‬
‫במהלך ההתפתחות של מערכת העצבים המרכזית‪ En-1 .‬הנו שחקן חיוני בייסוד מוקדם ובאחזקה של אזור המוח‬
‫התיכון‪/‬המוח האחורי‪ ,‬שממנו נוצרים צרבלום והמוח התיכון )‪ PITX-3 .(Danielian & McMahon, 1996‬הוא‬
‫הגן שמקודד לחלבון השייך למשפחת ‪ ,homeobox RIEG/PITX‬השייכת למחלקה ‪ bicoid‬של חלבוני‬
‫‪ .homeodomain‬חברי משפחה זו מתפקדים כפקטורי שעתוק )‪ .(Simon et al., 2003‬אלמנטים המגיבים ל‪Pitx3-‬‬
‫תוארו בפרומוטר של ‪.(Cazorla et al., 2000) TH‬‬
‫בנוסף‪ ,‬נמצא שתאים מזנכימליים מבטאים גנים דופאמינרגים רבים‪ .‬הסבר אפשרי )לביטוי גנים דופאמינרגים(‬
‫הוא נוכחותם של גורמי שעתוק פעילים יחד עם תוצרי הגנים של הפרומוטורים המהווים את המטרה שלהם‪.‬‬
‫הפרומוטר של ‪ AADC‬מכיל אתר המזהה את ‪ .HNF-3β‬הראו כי ‪ HNF-3β‬קושר פרומוטר עצבי ) ‪Blaud et al.,‬‬
‫‪ AADC .(2004‬הוא אחד מאנזימי המפתח של המערכת הדופאמינרגית ונמצא כי הוא מתבטא ע"י תאי הגזע‬
‫המזנכימליים‪ .‬לכן‪ ,‬סביר להניח שנוכחותו של פקטור שעתוק פעיל ‪ HNF-3β‬משפיעה על ביטוי הגן ‪AADC‬‬
‫בתאים אלה‪ .‬בנוסף לכך‪ HNF-3β ,‬קושר ישירות את הפרומוטר של ‪ ,TH‬בדומה ל‪) Nurr1-‬נמצא כי גם הוא‬
‫מתבטא בתאים מזנכימליים( )‪ .(Kessler et al., 2003‬התוצאות שלנו מראות שפקטור שעתוק ‪ Pitx3‬מתבטא‬
‫בתאים מזנכימליים‪ ,‬וגם ביטוי זה יכול להסביר את ביטוי הגן של ‪ TH‬בתאים האלה‪ .‬ביטוי של ‪ Pitx3‬בתאי ‪TH+‬‬
‫‪180‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫של ה‪ mesencephalon-‬מרמז על תפקידו האפשרי של ‪ Pitx3‬בקביעת הפנוטיפ הדופאמינרגי ) ‪Smidt et al.,‬‬
‫‪ .(1997‬מאוחר יותר‪ ,‬ייחסו את הבקרה של ‪ Pitx3‬על הגן של ‪ TH‬לקיום אזור בודד של קשירה באפיניות רבה‬
‫)אלמנט קושר ‪ (bicoid‬הנמצא בפרומוטר של ‪ TH‬בחולדה )‪.(Lebel M 2001‬‬
‫לכן‪ ,‬ניתן להסיק שמערך רחב של גורמי מפתח בייצור דופאמין ובבקרה של הגנים הדופאמינרגים מתבטא בתאים‬
‫מזנכימליים ומספק את הבסיס לפעילות דופאמינרגית פוטנציאלית של תאים מזנכימליים‪ ,‬בהינתן התנאים‬
‫המתאימים‪ .‬יתר על כן‪ ,‬הממצאים שלנו יכולים להצביע על מכאניזם כללי של פלסטיסיות שאיננה רק תהליך‬
‫"הדלקת" גנים של התאים העוברים התמיינות ו"כיבוי" גנים של התאים הצעירים והלא ממוינים אלא מציעה‬
‫גישה אלטרנטיבית כוללת יותר של תהליך ההתמיינות וזהות משתנה של תאי הגזע )‪.(Zipori, 2004‬‬
‫מחקר זה שופך אור על מה שיכול להיות ההיבט הקריטי של זהות תאים מזנכימליים בפרט ואולי של‬
‫הפלסטיסיות בכלל‪ .‬הנתונים המצטברים לגבי ביטוי הגנים העצביים בתאים מזנכימליים ממח העצם מעלים‬
‫שאלות חשובות‪ ,‬וביניהן‪ :‬האם הביטוי של הגנים העצביים בתאים אלה משפיע על הפעילות שלהם‪ ,‬או שתוצרי‬
‫גנים אלה אינם פונקציונליים?; האם התאים הם כבר עצביים בצורה חלקית? האם הרמה הבזאלית של ביטוי‬
‫גנים עצביים בתאים מזנכימליים משנה את זהותם‪ ,‬או את זהותם הפוטנציאלית?; כיצד ניתן לשלוט ולשנות את‬
‫הביטוי על מנת להפוך את הזהות התאית לתא עצב תפקודי קבוע? אולי האימפליקציה המיידית ביותר של‬
‫התוצאות האלה צריכה להיות אימוץ הגישה היותר מורכבת לחקר תהליך ההתמיינות‪.‬‬
‫לאור העובדה‪ ,‬שמקובל כבר זמן רב‪ ,‬לבסס את ההוכחה של ההתמיינות על סמנים עצביים בודדים שרוכשים תאי‬
‫הגזע‪ ,‬אנו מאמינים שמחקר זה מספק הוכחות רבות לצורך בשיטה יותר מורכבת ושיטתית על מנת להעריך שינוי‬
‫משמעותי ומתמשך בזהות ובתפקוד התאים‪.‬‬
‫‪181‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ .5‬מנגנונים אפשריים לפלסטיסיות של תאי גזע בוגרים ממח העצם‬
‫תאי גזע בהגדרתם הם תאים המסוגלים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוג אחד לפחות של תא בוגר‪ .‬תת חלוקה של‬
‫תאי גזע מתבססת על מוצאם‪ ,‬רקמת המקור והיכולת להתמיין לסוג ספציפי אחד או יותר של תאים מתפקדים‬
‫בשלים‪ .‬תאי גזע מבוגר )לאחר הלידה( ]="תאי גזע בוגרים"[‪ ,‬למרות היותם מולטיפוטנטיים‪ ,‬נחשבו בעבר לבעלי‬
‫יכולת התמיינות מוגבלת לתאים ייחודיים לרקמת מקורם בלבד‪ .‬במהלך השנים האחרונות מספר עולה של‬
‫מחקרים אתגרו את התפיסה המסורתית הטוענת כי תאי גזע מאורגניזם בוגר‪ ,‬מסוגלים באופן בלעדי להתמיין‬
‫לתאים בשלים האופייניים לרקמת מקורם‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬נראה כי הרקמה הכי רב‪-‬תכליתית הידועה כיום היא‬
‫מח העצם‪ ,‬המכילה תאי גזע המטופואטים ותאי גזע מזנכימלים המסוגלים לרכוש פנוטיפים לא צפויים כגון‪ :‬תאי‬
‫עצם‪ ,‬תאי השריר החלק ושריר הלב‪ ,‬תאי הכבד ותאי העצב )כפי שתואר בהרחבה במבוא(‪.‬‬
‫מהם המנגנונים המוצעים לפלסטיסיות של תאי גזע בוגרים בנוסף על האמור למעלה )דיון‪ ,‬פרק ‪?(5‬‬
‫א‪ .‬קיומם של תאי גזע פרימיטיביים ברקמה הבוגרת‬
‫ב‪ .‬קיומם של תאי גזע‪/‬פרוגניטורים רבים ברקמה שמקורם בשכבות נבט עובריות שונות‬
‫ג‪ .‬הסרה ישירה ועקיפה של התמיינות )‪(dedifferentiation‬‬
‫ד‪ .‬התמיינות "במהופך" )‪(transdifferentiation‬‬
‫ה‪ .‬איחוי תאי )‪(fusion‬‬
‫‪ 5.1‬קיום תאי גזע פרימיטיביים ברקמה הבוגרת‬
‫קיימים מעט אינדיקציות בספרות להמצאות שיירים של תאי גזע‪ ,‬בעלי פוטנציאל התפתחותי רחב טווח‪ ,‬בתוך‬
‫מח העצם הבוגר )‪ .(Reyes et al., 2001; Reyes & Verfaillie, 2001; Jiang et al., 2002a,b‬הפקה וריבוי של‬
‫אוכלוסיית התאים הפלוריפוטנטיים כוללת איסוף אחוז נמוך מהתאים בעלי גרעין אחד ממח העצם באמצעות‬
‫סלקציה אימונו‪-‬מגנטיות ובהמשך ריבוי שלהם בתרביות תאים )ראה פרק ‪ 8.3.2‬במבוא(‪ .‬תהליך זה הביא ליצירה‬
‫של אוכלוסיית תאים אחידה המכונה ‪ .MAPCs‬תאים אלה לא שינו את הפנוטיפ או את המורפולוגיה שלהם‬
‫במהלך ‪ 120‬הכפלות של האוכלוסייה‪ .‬בהתבסס על מספר השלבים ומספר ההעברות של התאים במהלך תהליך‬
‫העשרתם‪ ,‬שכיחותם במח העצם של ‪ MAPCs‬נעמדת במספרים נמוכים מאוד )‪ .(1:107-108‬קיימות השערות רבות‬
‫לגבי מקורם של התאים האלה‪ .‬מאידך‪ ,‬קיימת האפשרות שמעברים תכופים ‪ in vitro‬גרמו ליצירה‪ ,‬דרך מסלולים‬
‫לא ברורים דיים של הסרת התמיינות‪ ,‬של שורת תאים חדשה ) ‪.( Song & Sanchez-Ramos 2003‬‬
‫‪ 5.2‬קיומם של תאי גזע רבים‪ ,‬שמקורם בשכבות נבט עובריות שונות‬
‫במקרה זה‪ ,‬מניחים שמקורם של תאי הגזע הבוגרים הינם מאוכלוסיית תאי הנבט מהתקופה העוברית‪ .‬לכן‪,‬‬
‫המאפיינים של תאי גזע בוגרים אמורים להיות דומים‪ ,‬עם שינויים קלים המתאימים אותם למיקרו‪-‬סביבה‬
‫‪182‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫הייחודית שלהם‪ .‬בעת הצורך‪ ,‬תאי גזע אלה יכולים לייצור מחדש כל איבר‪ Minasi .‬וחבריו )‪ (2002‬אישרו‪ ,‬שתאי‬
‫גזע הקיימים ברקמות מזודרמליות באורגניזם הבוגר‪ ,‬יכולים להיות ‪ meso-angioblast stem cells‬ממקור‬
‫עוברי‪ ,‬המופיעים בהתפתחות אב‪-‬עורקים דורסלי )‪ ,(dorsal aorta‬כאשר התפתחות כלי הדם יכולים לשמש‬
‫כמוביל של תאי גזע אלה לרקמות שונות בעובר המתפתח )‪ .(Joshi & Enver 2002‬בנוסף לכך‪ ,‬דיווחים רבים‬
‫מציעים שהפלסטיסיות מתרחשת תוך כדי ניצול אוכלוסיות מעורבות של תאים המכילות תאי פרוגניטור לא‬
‫מזוהים‪ ,‬שמקורם בשכבות נבט עובריות שונות‪ .‬לדוגמא‪ ,‬תאי רכס עצבי )‪ (neural crest‬לא פעילים נמצאו בעצבים‬
‫ובאיברים פריפריים )‪ .(Morrison et al., 1999‬יתר על כן‪ ,‬הרכבן של רקמות בוגרות יכול לכלול תאי דם משרשת‬
‫תאים אריתרואידית‪ ,‬מיאלואידית ולימפואידית‪ ,‬תאים אנדוטליאליים של כלי הדם‪ ,‬פיברובלסטים ותאי שוואן‬
‫)‪ ,(Schwann‬בנוסף לתאים פרנכימליים האופייניים לרקמה‪ .‬למרות שתאים אלה נמצאים בכמויות קטנות מאוד‬
‫ברקמה בוגרת נורמאלית‪ ,‬הם עשויים‪ ,‬תחת תנאי ניסוי‪ ,‬להתמיין לנגזרות עצביות ) ‪Song & Sanchez-Ramos,‬‬
‫‪.(2003‬‬
‫‪ 5.3‬התמיינות ישירה ועקיפה )‪(dedifferentiation‬‬
‫תאי מח העצם בעלי היכולת להתמיין לסוגי תאים מגוונים )שריר‪ ,‬שומן‪ ,‬עצב ועוד(‪ ,‬מתאימים לאוכלוסייה‬
‫קדומה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המצויים במח העצם ולא מכוונים ליצור תאים ייחודיים לרקמה זו‪ .‬בנוסף‬
‫לכך‪ ,‬התאים יכולים לחזור לפנוטיפ הקודם ולהשתחרר מתוכנית ההתפתחות הראשונית שלהם‪ .‬לאחר מכן‪,‬‬
‫התאים מסוגלים להתמיין מחדש בתגובה לסיגנלים תאיים והומורליים מתאימים )ראה תמונה ‪.(62B‬‬
‫תמונה ‪ :62‬מנגנונים אפשריים לפלסטיסיות של תאי גזע בוגרים )דיאגרמה סכמתית(‪ .‬תאים ייחודיים‬
‫לרקמה מוצגים כעיגולים כתומים או ירוקים‪ ,‬תאים גזע פלוריפוטנטים כעיגולים כחולים‪ .‬תאים ממוינים‬
‫מהתאים "הכתומים" מוצגים כעיגולים אדומים ומהתאים "הירוקים" כמשושה ירוק ) & ‪Wagers‬‬
‫‪ Weissman, 2004‬עם שינויים קלים(‪.‬‬
‫‪183‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ 5.4‬התמיינות "במהופך" )‪(transdifferntiation‬‬
‫התמיינות "במהופך" )‪ (transdifferntiation‬מוגדרת כיכולת של סוג תא מכוון להפוך את דפוס הביטוי הגני שלו‬
‫לדפוס ביטוי המאפיין סוג תא שונה לחלוטין‪ .‬ניתן לתאר ‪ 2‬מנגנונים שונים‪ ,‬האחראיים ליכולת זו‪ (1 :‬התמיינות‬
‫לא ישירה "במהופך"‪ ,‬תהליך הדורש הסרת התמיינות ומלווה בהתבגרות במסלול אלטרנטיבי‪(2 ,‬התמיינות‬
‫ישירה "במהופך"‪ ,‬שבה יש שינוי ישיר בדפוס הביטוי הגני )תמונה ‪ Lagasse .(62A‬וחבריו היו מהראשונים לספק‬
‫תמיכה חזקה לרעיון ההתמיינות "במהופך" ברמה התפקודית‪ ,‬תוך שימוש במספר מועט של תאי גזע טהורים‪.‬‬
‫הם הראו ש‪ 30-‬תאי גזע המטופואטיים טהורים הוזרקו לתוך עכבר‪ ,‬שעבר השריית מחלה לטלית ותורשתית של‬
‫הכבד‪ , tyrosinaemia type 1 ,‬הצליחו לשקם את המערכת ההמטופואטית‪ ,‬להתמיין להפטוציטים ולהציל את‬
‫החיות מכשל כבד וממוות )‪ .(Lagasse et al., 2000‬מסובך מאוד לוודא שההתמיינות "במהופך" לא כוללת‬
‫בהתחלה צעד אחורה למצב יותר פרימיטיבי‪ ,‬בייחוד אם ההליך הנו מהיר‪ .‬אם ההתמיינות "במהופך" הייתה‬
‫מתרחשת באופן הדרגתי‪ ,‬ניתן היה לנסות ולזהות מרקרים המאפיינים שלבי התפתחות מוקדמים יותר‪.‬‬
‫תהליך ההתמיינות "במהופך" נצפה מתרחש ‪ in vivo‬בצמחים ‪ -‬תאי מזופיל )‪ (mesophyll‬המבצעים פוטוסינתזה‬
‫ומופקים מעלי ‪ Zinnia elegans‬מתמיינים במהופך לתאי ‪ xylem‬בתהליך של שינוי צורה בעל מאפיינים שונים‪,‬‬
‫כגון‪ :‬יצירת דופן שני לתא ומוות תאי מתוכנן )‪ .(Demura et al., 2002‬בנוסף‪ ,‬תהליך ההתמיינות "במהופך"‬
‫נצפה ‪ in vivo‬אף בבעלי‪-‬חיים ‪ -‬תאי גזע עצביים אקטודרמליים בזנב המתחדש של ‪Urodele amphibia‬‬
‫מתמיינים במהופך‪ in vivo‬בתדירות גבוהה לשריר וסחוס מזודרמליים )‪.(Echeverri & Tanaka, 2002‬‬
‫יחד עם זאת‪ ,‬קיימת אפשרות שהמודלים המוצגים להתמיינות לא משקפים את הפלסטיסיות האמיתית של‬
‫התאים האלה ‪ .(Herzog et al., 2003) in vivo‬כלומר‪ ,‬עדיין לא ברור האם הפלסטיסיות הנצפת‪ ,‬או "הפוטנציאל‬
‫להתמיינות במהופך"‪ ,‬של תאי גזע בוגרים טבוע בתאים וניתן למצוא תאים כאלו ‪ ,in-vivo‬או תוצאה של תנאי‬
‫הגידול בתרבית‪ ,‬ולכן לא ניתן למצוא תאים אלו באורגניזם הבוגר )‪.(Joshi & Enver 2002‬‬
‫בפרסום בלתי רגיל של נתונים "שליליים"‪ Castro ,‬וחבריו )‪ (2002‬תיארו את ניסיונותיהם העקרים להשרות‬
‫התמיינות עצבית )‪ (in-vivo‬מתאי גזע של מח העצם‪ .‬אנליזה של ‪ 8‬עכברים מושתלים עם תאים ‪Side population‬‬
‫ממח העצם ו‪ 12-‬עכברים מושתלים עם כל אוכלוסיית תאי מח העצם לא הראו התפתחות תאים דמויי‪-‬עצב‬
‫במערכת העצבים המרכזית‪ .‬נתונים אלה מרמזים על כך שההתמיינות לתאים דמויי תאי עצב אינה תהליך כללי‪,‬‬
‫אלא תהליך התלוי במערכת ניסוי שבה נבדקת ההיפותזה‪ .‬יחד עם זאת‪ Mezey ,‬וחבריו הראו בעכברים ובבני‬
‫אדם‪ ,‬שתאים ממח העצם שהוזרקו לווריד פריפרי נמצאו ממוינים לתאי עצב במע"מ וזאת ללא איחוי )‪(fusion‬‬
‫עם תאים מהמאחסן )‪.(Mezey et al., 2000, 2003‬‬
‫‪184‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ 5.5‬איחוי תאים )‪(Fusion‬‬
‫הסבר נוסף שניתן להציע לתהליך "פלסטיסיות" הנו איחוי תאים )‪ ,(fusion‬שמקורם במח העצם‪ ,‬עם התאים של‬
‫הרקמה המושתלת ויצירה של הטרוקריון )‪ ,(heterokaryon‬המשנה את דפוס הביטוי הגני של התא המקורי ממח‬
‫העצם לדפוס ביטוי של התא החדש וכן בתכנות מחדש של גנום התא המארח‪ .‬מכוון שגורמי שעתוק הייחודיים‬
‫לרקמה כבר נמצאים בתאים לאחר האיחוי‪ ,‬האותות החוץ תאיים‪ ,‬האחראיים לתכנות מחדש של הגנום‪ ,‬יכולים‬
‫לשנות את הגורל ההתפתחותי של תאי מח העצם‪ .‬לדעת המצדדים בגישה זאת‪ ,‬ניתן להסביר עבודות רבות‬
‫המתארות "התמיינות" תאי גזע בוגרים ממח העצם כאיחוי של התאים המושתלים עם תאי הרקמה הבוגרת ולא‬
‫כהתמיינות ושינוי פנוטיפ מתא מזודרמלי לתא אקטודרמלי או אנדודרמלי ) & ‪Terada et al., 2002; Wurmser‬‬
‫‪Gage 2002; Ying et al., 2002; Alvarez-Dolado et al., 2003; Medvinsky & Smith 2003; Rudnicki,‬‬
‫‪2003; Spees et al., 2003; Vassilopoulos et al., 2003; Vassilopoulos & Russell 2003; Wang et al.,‬‬
‫‪ Ying .( 2003‬וחבריו )‪ (2002‬הראו‪ ,‬שתאי גזע עצביים התאחו עם תאי גזע עובריים ורכשו חלק מהמאפיינים‬
‫הפנוטיפיים שלהם לאחר תרבית משותפת‪ .‬ניסוי דומה הראה שתאים ממח העצם של עכבר מסוגלים להתאחות‬
‫ספונטנית עם תאי גזע עובריים ‪ ,in vitro‬בתרבית המכילה ‪ interleukin-3‬ולאמץ את הפנוטיפ שלהם‪ ,‬תהליך‬
‫אשר יכול לכאורה להתפרש כהסרת התמיינות או התמיינות במהופך )‪ .(Terada et al., 2002‬לאחרונה‪ ,‬הראו כי‬
‫איחוי תאים הוא הסיבה לדוגמא מאופיינת היטב של תאים ממח העצם המחדשים כבד ) ‪Vassilopoulos et al.,‬‬
‫;‪ .(Wang et al., 2003 2003‬יתר על כן‪ ,‬נמצא שתאים המופקים ממח העצם מתאחים ‪ in vivo‬עם תאים בכבד‪,‬‬
‫תאי עצב ‪ Purkunje‬במוח ותאי שריר הלב וגורמים ליצירה של תאים רב גרעיניים‪ ,‬ומאידך לא נצפתה עדות‬
‫להתמיינות במהופך ללא איחוי ברקמות האלה )‪.(Alvarez-Dolado et al., 2003‬‬
‫למרות שאיחוי הוא מאורע נדיר‪ ,‬התופעה של איחוי תאים ללא גירוי המעודד את התופעה היא אפשרות קיימת‪.‬‬
‫לכן‪ ,‬אנו כחוקרים בתחום זה אמורים‪ ,‬במידת האפשר‪ ,‬לבחון האם האיחוי אחראי על דפוס ביטוי גני )התמיינות(‬
‫של תאים מזנכימליים ממח העצם לסוגי תאים אחרים‪ .‬אם כן‪ ,‬עדיין מדובר בפלסטיסיות מסוימת‪ ,‬אך התאים‬
‫המעורבים לא חייבים להיות תאי גזע‪ .‬יש לציין‪ ,‬שבתוצאות הניסויים ‪ in-vitro‬המוצגים בעבודה זאת ניתן‬
‫לשלול על הסף התמיינות כתהליך איחוי )‪ (fusion‬מכיוון שהתאים המזנכימליים גודלו לבד ללא תוספת של תאי‬
‫עצב או תאים אחרים )‪.(co-culture‬‬
‫‪185‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ .6‬השימוש בתאי גזע למטרות מחקר וריפוי ‪ -‬היבטים אתיים והלכתיים‬
‫חלק נכבד מהדברים המובאים בפרק זה נכתבו על פי מאמריו השונים של הרב פרופ' אברהם שטינברג ודו"ח‬
‫הוועדה המייעצת לביואתיקה של האקדמיה הלאומית הישראלית למדעים )ראה רשימת ספרות(‪.‬‬
‫‪ 6.1‬פוטנציאל העובר‬
‫הסוגיה האתית השנויה במחלוקת בנוגע לשימוש בתאי גזע נוגעת בעיקר להפקת תאי גזע מקדם‪-‬עוברים‬
‫ומעוברים ולא מהפקת תאי גזע מבוגר‪ .‬הלגיטימיות המוסרית של ביצוע מחקר בעובר האדם תלויה‪ ,‬במידה‬
‫ניכרת‪ ,‬במעמד המיוחס לעובר‪ .‬האופן שבו אנו מגדירים ומסווגים את העובר בשלבי ההתפתחות השונים שלו הוא‬
‫גורם מכריע בסוגיה מה מותר ומה אסור לנו לעשות אתו‪ .‬אם העובר הוא בן‪-‬אנוש‪ ,‬הרי שאפשרויותינו מבחינת‬
‫הטיפול בו מוגבלות‪ ,‬ועלינו לנהוג בו כפי שהיינו נוהגים בכל אדם אחר‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬אם העובר הוא לא יותר‬
‫מאשר אוסף של תאי אדם )בעיקר בימיו הראשונים(‪ ,‬הרי שיש הרבה פחות מגבלות לטיפול בו‪ .‬בתחום של חקר‬
‫תאי גזע‪ ,‬המחלוקת המוסרית במדינות רבות נכרכה במידה ניכרת בשאלה לגבי מהות העובר‪ ,‬בייחוד בשלב שלפני‬
‫השתלתו ברחם‪.‬‬
‫ברור הוא שלעובר‪ ,‬גם בשלבי ההתפתחות הראשוניים שלו‪ ,‬יש סטטוס ייחודי במונחים ביולוגיים‪ .‬בניגוד לכל‬
‫קבוצה אחרת של תאים חיים‪ ,‬לקבוצה זו היכולת להתפתח לכדי אורגניזם מורכב ומתפקד‪ .‬אפשר לתאר הבדל זה‬
‫כ'פוטנציאל' של העובר ‪ -‬הפוטנציאל להפוך ליציר אנוש מפותח‪ .‬זו‪ ,‬כמובן‪ ,‬אינה אלא עובדה ביולוגית ‪ -‬אך‬
‫לעובדה ביולוגית זו השלכות מוסריות‪.‬‬
‫במקרה של הפריה חוץ‪-‬גופית )שמתהליך זה מופקים תאי גזע עובריים(‪ ,‬המושג של 'פוטנציאל העובר' מורכב אף‬
‫יותר‪ ,‬שכן השרשתו של העובר ברחם מצריכה התערבות רפואית ישירה‪ .‬שיעור ההשתלות המוצלחות עדיין נמוך‪,‬‬
‫ורק כשליש מעוברי המבחנה עשויים להתפתח לכדי בלסטוציסטים בעלי יכולת השרשה עם מבנה כרומוזומים‬
‫נורמלי‪ .‬בנוסף לכך‪ ,‬מספר העוברים המושתלים בו‪-‬זמנית מוגבל‪ ,‬לבל יתפתחו הריונות מרובי עוברים‪ .‬עקב כך‪,‬‬
‫לחלק מעוברי המבחנה שלא יושתלו ברחם‪ ,‬מטעמים רפואיים או בעקבות החלטתם של ההורים שלא להשתיל‬
‫עובר נוסף‪ ,‬אין פוטנציאל להתפתח לכדי בן‪-‬אדם‪ .‬היעדר‪-‬פוטנציאל זה הוא גם מנת חלקם של עוברים הנוצרים‬
‫בעקבות העברת גרעין )שיבוט( ‪ -‬עוברים שהשתלתם נמנעת במסגרת האיסור הקיים על שכפול גנטי בבני אדם‪.‬‬
‫הוויכוח הנטוש בין החוקרים והאתיקאים מבוסס על קביעת המאזן הראוי בין הצורך לפתח טיפולים לחולים‬
‫חיים וקיימים‪ ,‬הסובלים ממחלות ניווניות קשות וקטלניות‪ ,‬לבין האיסור המוסרי לפגוע בקדם‪-‬עוברים בשלב‬
‫הבלסטוציסט‪ .‬ככל שמעמדו של קדם‪-‬העובר נחשב יותר‪ ,‬כן נוטה הכף להכריע נגד השמדתו‪ ,‬גם במחיר המשך‬
‫הסבל של חולים קיימים; ולהיפך‪ ,‬ככל שמעמדו נחשב רחוק יותר מיצור אנושי‪ ,‬כן נוטה הכף להכריע להשתמש בו‬
‫על מנת לסייע לחולים חיים וקיימים‪ .‬באותה מידה‪ ,‬ככל שפעולת הצלת חיים קרובה יותר למימוש‪ ,‬כן גובר‬
‫המשקל המוסרי להתיר הפקת תאי גזע‪ ,‬ולהיפך‪ ,‬ככל שמדובר במחקר ערטילאי ורחוק מיישום‪ ,‬כן גובר במשקל‬
‫‪186‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫המוסרי של קדם‪-‬העובר שלא להשמידו‪.‬‬
‫‪ 6.2‬השקפות דתיות ואתיות בנוגע לשימוש בתאי גזע עובריים לצורכי מחקר וריפוי רפואי‬
‫בקהילות תרבותיות‪ ,‬פילוסופיות ודתיות שונות הועלו טיעונים רבים במחלוקת לגבי מעמד העובר וקדם‪-‬עובר‪,‬‬
‫ובאף לא אחת מהן הגיעו הצדדים להסכמה‪.‬‬
‫‪ 6.2.1‬השקפות נוצריות‬
‫הגישה הקתולית היא חד‪-‬משמעית ומחמירה ביותר‪ .‬על פי גישה זו יש לראות בביצית המופרית מרגע ההפריה‬
‫יצור אנושי לכל דבר‪ ,‬ולפיכך כל פעולה הגורמת להשמדתה היא בבחינת רצח‪ .‬על כן‪ ,‬לדעתם גם אם מדובר בעודפי‬
‫ביציות מופרות מוקפאות שאין להן כל דורש‪ ,‬אסור להשתמש בהן לצורך הפקת תאי גזע‪ ,‬אף שניתן להציל הרבה‬
‫מאד אנשים סובלים‪ .‬הקתולים הרומיים והאורתודוקסים מאמינים שקיים רצף שתחילתו בהתעברות וסופו בבן‪-‬‬
‫האנוש‪ ,‬וכי ההתפתחות נמשכת בכל שלבי החיים )התפתחות גופנית כמו גם רוחנית ‪ -‬השאיפה להיות בצלמו של‬
‫האלוהים(‪ .‬רצף זה מעניק ערך של קדושה לכל שלבי ההתפתחות‪ .‬את ההתנגדות הנחרצת ביותר לשימוש בעוברים‬
‫לצורכי מחקר‪ ,‬גם אם הוא רפואי במהותו‪ ,‬מביעה הכנסייה הקתולית‪-‬רומית)‪.(Correa & Sgreccia 2000‬‬
‫התיאולוגיה הפרוטסטנטית הנה פלורליסטית‪ ,‬ולכן אין סמכות אחת אליה ניתן להתייחס בנוגע לסוגיית המחקר‬
‫הרפואי בתאי גזע עובריים‪ .‬האתוס הפרוטסטנטי מכתיב כי שאלות מוסריות מוכרעות על ידי המצפון‬
‫האינדיבידואלי‪ .‬משמע‪ ,‬על פי ההשקפה הפרוטסטנטית‪ ,‬בסוגיה זו ייתכנו דעות נוצריות שונות‪ ,‬שכולן עולות‬
‫בקנה אחד עם האמונה הנוצרית‪ .‬ענפים מסוימים במסורת הפרוטסטנטית גורסים כי הסטאטוס הרשמי של בן‪-‬‬
‫אדם נרכש בהדרגה‪ ,‬ולכן ייתכן כי אינו קיים בעובר המוקדם‪.‬‬
‫‪ 6.2.2‬השקפות מוסלמיות‬
‫האיסלאם מתיר את השימוש בעוברים לצורכי מחקר רפואי ‪ ,‬ובלבד שהתהליך יתרחש לפני השלב שבו מקבל‬
‫העובר את נשמתו‪ ,‬דהיינו מהיום הארבעים לאחר ההפריה‪ .‬בקוראן ובחוק המוסלמי )שערייה( מעוגנת האמונה‬
‫המסורתית שלפיה המסע העוברי להיותו אדם הוא בבחינת תהליך התפתחותי וכי קבלת הנשמה מתרחשת בתום‬
‫שלוש תקופות של ‪ 40‬יום‪ ,‬קרי‪ ,‬ביום ה ‪ ,120 -‬או בסוף השליש הראשון להריון‪ .‬ואולם‪ ,‬העובר הינו חי ברחם עוד‬
‫לפני קבלת הנשמה‪ Abdulaziz Sachedina .‬מאוניברסיטת וירג'יניה מסכם את הדיון המשפטי‪-‬מוסרי של‬
‫הפוסקים המוסלמים בדוח השלישי של ה‪ The national bioethics advisory commission-‬ואומר‪" :‬מרבית‬
‫ההשקפות המוסלמיות המודרניות מציינות רגע אחד מעבר לשלב הבלסטוציסט שבו העובר הופך לאדם‪.‬‬
‫‪ 6.2.3‬השקפות יהודיות‬
‫לפי השקפת היהדות יש היתר וחובה לבנות ולשכלל את העולם בכל דרך וכיוון לתועלת בני האדם‪ .‬באופן עקרוני‬
‫אין לראות בפעולות של שכלול ושיפור העולם משום התערבות שלילית בבריאה‪ ,‬אלא אדרבה משום שותפות‬
‫חיובית בין הקב"ה לבין בני האדם‪ .‬לפיכך‪ ,‬מבחינה השקפתית ניתן לומר כי באופן עקרוני השימוש בטכנולוגיות‬
‫‪187‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫ובחידושים מדעיים איננו מהווה התערבות מהותית שלילית בבריאה‪ .‬שכן טכנולוגיות כאלו הן מעשה טבעי‪ ,‬ואינן‬
‫יוצרות מין חדש שלא קיים בטבע‪ ,‬ובכך הן שונות הן מכישוף והן מכלאים‪ .‬לפיכך‪ ,‬במובן זה לא יהא הבדל‪,‬‬
‫למשל‪ ,‬בין טכנולוגית שיבוט למטרות ריפוי לבין שימוש באנטיביוטיקה לקטילת חיידקים מחוללי מחלה‪ ,‬אף שיש‬
‫בטכניקה זו משום התערבות ב'רצון' הקב"ה‪ ,‬שהוא זה שגרם למחלה‪ ,‬או בהשתלת איברים לאנשים הזקוקים‬
‫לכך‪ ,‬למרות שמחלתם נגרמה על ידי הקב"ה‪.‬‬
‫על פי המקרא והתלמוד‪ ,‬המעמד האנושי נרכש בהדרגה במהלך התפתחות העובר‪ ,‬ולא ברגע ההפריה‪ .‬מהיבטים‬
‫מסוימים‪ ,‬העובר יכול להיחשב לחלק מגופה של האם; ומובן שאין אנו רשאים להסיר חלק זה על פי בחירה‪.‬‬
‫ואולם‪ ,‬אם העובר מסכן את חיי האישה‪ ,‬או משפיע קשות על בריאותה )הגופנית והנפשית(‪ ,‬הרי שיש לשקול‬
‫ביצוע הפלה‪ ,‬משום שפיקוח נפש האם דוחה כל שיקול אחר‪ .‬רק בלידה עצמה הופך מעמד העובר למעמד בן‪-‬אדם‪,‬‬
‫שאינו נופל ממעמד האם‪ .‬אשר לעובר שטרם הושתל ‪ -‬על פי היהדות‪ ,‬לחומר גנטי שמחוץ לרחם אין כל סטאטוס‬
‫משפטי‪ ,‬שכן עד להשתרשות ברחם אין הוא נחשב ואפילו כחלק מבן‪-‬אדם‪ .‬יתר על כן‪ ,‬גם ברחם עצמו‪ ,‬העובר אינו‬
‫זוכה למעמד של עובר אנוש "מגובש" אלא בתום ‪ 40‬הימים הראשונים‪ .‬סטאטוס העובר מחוץ לרחם דומה לזה‬
‫של תאי‪-‬מין‪ ,‬זרע וביציות ‪ -‬אמנם אין לבזבזם לחינם‪ ,‬אך מותר להשתמש בהם לצרכים ריפויים‪ .‬מכאן שעדיף‬
‫להשתמש בעוברים שנוצרו בעקבות טיפולי הפריה חוץ‪-‬גופית‪.‬‬
‫‪ 6.2.4‬השקפת אתיקאנים חילוניים‬
‫גם בין אתיקאנים חילוניים מתנהל וויכוח עקרוני בשאלת המעמד המוסרי של קדם עובר‪ .‬יש מהם שמגיעים‬
‫למסקנות דומות לכנסייה הקתולית‪ ,‬והם אוסרים מבחינה מוסרית את השמדת הביצית המופרית לצורך הפקת‬
‫תאי גזע‪ ,‬מתוך גישה הרואה בקדם‪-‬העובר לפחות פוטנציאל אנושי‪ ,‬ודרך של כבוד האדם שלא לפגוע בו‬
‫ולהשמידו‪ ,‬גם כאשר הדבר נעשה למען מטרה נעלה של הצלת חיי אדם‪.‬‬
‫לעומתם אתיקאים רבים סבורים‪ ,‬ששלב הבלסטוציסט הוא כה מוקדם בהתפתחות העוברית‪ ,‬שאין לייחס לה‬
‫משקל מוסרי כלשהו‪ ,‬ובוודאי שבמאזן מול הצלת חיי אנשים סובלים‪ ,‬גובר השיקול של הצלת חיים ומניעת סבל‬
‫רב הנוגע לאנשים חיים וקיימים על פני שיקול רחוק של שימור קדם‪-‬עובר בשלב התפתחותי כה מוקדם‪ .‬יתר על‬
‫כן‪ ,‬כאמור‪ ,‬פוטנציאל אנושי יש גם בתאי זרע ובביציות קודם ההפריה‪ ,‬ולא מקובל בין אומות העולם איסור‬
‫מוסרי כלשהו בהשמדתם‪.‬‬
‫‪188‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫‪ .7‬השימוש בתאי גזע למטרות ריפוי ‪ -‬תהליכים פוליטיים‪ ,‬תקשורתיים וחקיקתיים‬
‫מקובל לחשוב שתאי גזע עובריים מהווים את ההבטחה הגדולה ביותר לפיתוח טיפולים רפואיים חדשים‪.‬‬
‫הדיווחים התקשורתיים‪ ,‬בעלי השפעה רבה על דעת הציבור‪ ,‬מדגישים את החשיבות של המחקר בתאי הגזע‪ .‬כך‪,‬‬
‫כל תוצאה חדשה‪ ,‬אפילו קטנה ביותר‪ ,‬במחקר בתאי גזע עובריים מנופחת ע"י התקשורת לפריצת דרך גדולה‪ .‬אך‬
‫כאשר החוקרים מכריזים על תוצאה יותר משמעותית‪ ,‬תוך שימוש בתאי גזע בוגרים או במקורות אלטרנטיביים‬
‫לתאי הגזע‪ ,‬תוצאותיהם מתועדות ע"י רשומות קטנות השמורות לדפים מדעיים‪.‬‬
‫ישנה מטרה פוליטית ברורה לסחרור התקשורתי‪ ,‬שכן לתקשורת יש השפעה רבה על הדיון הנוכחי בארצות‬
‫הברית וגם מחוצה לה‪ .‬קיימת חזית חזקה‪ ,‬הכוללת את חברות הביוטכנולוגיה ואת המשקיעים‪ ,‬השואפים לחשוף‬
‫את המחקר המדעי לשיבוט ולשימוש בתאי גזע למטרות ריפוי‪ ,‬תוך זלזול בהתנגדות המוסרית‪ .‬אומנם המחקר‬
‫בתאי גזע בוגרים ממשיך‪ ,‬בפרופיל תקשורתי נמוך‪ ,‬אך עם הישגים יוצאים מן הכלל‪ .‬לעומת זאת הציבור מתעניין‬
‫בעיקר במחקר בתאי גזע עובריים‪ .‬הדיון המתמשך בקונגרס של ארצות הברית‪ ,‬האם לאשר שיבוט של עוברים‬
‫אנושיים למטרות מחקר‪ ,‬משקף את העניין הרב בנושא‪.‬‬
‫מחקרים בתאי גזע הומאניים הופיעו לאחרונה כאחד התחומים הכי שנויים במחלוקת במחקר הביו‪-‬רפואי‪ .‬לא‬
‫רק שהתאים האלה מופקים מהפלות של עוברים או מהרס עוברים מופרים‪ ,‬אלא גם שזמינותם מעלה חששות‬
‫משיבוט של בני האדם‪ .‬אחד הטיעונים המרכזיים בעד המחקר בתאי גזע מתמקד בפוטנציאל של התאים לספק‬
‫טיפולים חדשים למחלות נוירודגנרטיביות חשוכות מרפא ולכן לחוקרים בתחום מדעי העצב יש הרבה מה לתרום‬
‫לדיון הזה‪ .‬מכוון שרגשות חזקים מעורבים בשני הצדדים ‪ -‬מפעילים נגד הפלות ועד לקבוצות הגנה על החולים ‪-‬‬
‫חשוב שהדיון הציבורי והפוליטי יהיה מודע להערכות זהירות לגבי הפוטנציאל וההגבלות של הטיפול בתאי הגזע‬
‫עצביים‪.‬‬
‫ללא ספק ההחלטה האם לאפשר את המשך המחקר בתאי גזע הנה החלטה פוליטית‪ ,‬שתתקבל בנפרד בכל מדינה‪.‬‬
‫ב ‪ 9 -‬באוגוסט‪ ,2001 ,‬בשעת שיא בצפייה בטלוויזיה‪ ,‬נשיא ארה"ב‪ ,‬ג'ורג' בוש‪ ,‬הכריז על החלטתו לאפשר מימון‬
‫של מחקרים בתאים עובריים קיימים של בני אדם מקרנות פדרליים ‪ ,‬תחת התנאים הבאים‪ (1) :‬תהליך ההפקה‬
‫של התאים )הכולל את ההסרה של מסת התאים הפנימית של הבלסטוציט( התחיל לפני ה‪ 9-‬באוגוסט ‪(2) ,2001‬‬
‫לעובר‪ ,‬שממנו הופקה שורת התאים‪ ,‬לא הייתה אפשרות להתפתח לישות אנושית‪ .‬בנוסך לכך‪ ,‬הנשיא בוש קבע‬
‫קריטריונים הבאים שיש לעמוד בהם‪) :‬א( תאי גזע הופקו מעובר שנוצר בהליך של הפריה חוץ גופית ולא‬
‫באמצעות שיבוט‪) ,‬ב( יש להשיג הסכמה לתרומת העובר )ג( תרומתו של העובר לא הייתה מלווה בתמריצים‬
‫כספיים‪ .‬בכדי למסד את המחקר בתאי גזע הומניים‪ National Institutes of Health (NIH) ,‬מקים משרד רישום‬
‫לתאי גזע עובריים הומניים שירשום את כל תאי הגזע ההומניים העומדים בקריטריונים אלה‪ .‬במפורש‪ ,‬המעבדות‬
‫‪189‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫או החברות המספקות את התאים‪ ,‬הרשומים במשרד הרישום‪ ,‬יגישו הבטחה חתומה ל‪ .NIH-‬כל ספק יחזיק‬
‫מסמכים כתובים‪ ,‬המאמתים את ההצהרות הרשומות בהבטחה החתומה ‪ ,‬לשם הגשה ל‪.NIH-‬‬
‫כל מה שדרוש לתהליך החקיקה הוא פרספקטיבה ברורה לגבי התוצאות של ההחלטות האלה‪ .‬החוקרים לא‬
‫יכולים להשיג התקדמות ע"י רמיסה של ערכים אנושיים בסיסיים‪ .‬לדוגמא‪ ,‬פיתוח טיפולים למחלות שונות ע"י‬
‫הריגת עוברים אנושיים‪ .‬יש הטוענים‪ ,‬שאין הבדל משמעותי בין שיבוט עוברים אנושיים למטרות "טיפוליות"‬
‫)להשיג תאי גזע עובריים( לבין מטרות "רבייה" )לייצר שיבוט אנושי שלם(‪ ,‬ההבדל ביניהם הוא טכני בלבד‪.‬‬
‫אנשים התומכים בשיבוט טיפולי חייבים להכיר בעובדה זו‪.‬‬
‫המחוקקים של ארה"ב עדיין מהססים‪ .‬הבית הלבן )תחנת הנהגתו של ג'ורג' בוש( תומך באיסור חמור של שיבוט‬
‫ובשימוש בתאי גזע עובריים וסנטורים רבים מעודדים ותומכים בשיבוט של עובריים אנושיים ל‪"-‬מחקר רפואי‬
‫בלבד"‪ .‬בגרמניה‪ ,‬ניסויים אלה נשארים אסורים‪ ,‬אך הותר כעת היבוא של שורות תאי גזע עובריים‪ ,‬המיוצרים‬
‫בשיטה זאת‪ ,‬ממדינות אחרות‪ .‬בבריטניה‪ ,‬הממשלה נוקטת בגישה יותר זהירה והחליטה לאחרונה לדחות כל‬
‫החלטה בנוגע לשינוי החוק שיאפשר את השיבוט הטיפולי‪ ,‬עד לחקירה מתקדמת של התועלת האפשרית‬
‫והסיכונים הנלווים‪ .‬מדינת ישראל‪ ,‬בזכות אופייה היהודי‪ ,‬הנה חלוצה עולמית בתחום החקיקה בנושא והתירה‬
‫לבצע מחקרים בתאי גזע עובריים ואף ממקור שיבוט למטרות ריפוי בלבד‪ .‬ברור‪ ,‬שנקיפות המצפון שאנשים‬
‫רבים חשים בנוגע להתערבות בהתפתחות של עוברים אנושיים ישקלו לצד התועלת הפוטנציאלית‪ ,‬לא רק בתחום‬
‫מדעי העצב‪ ,‬אלא גם בתחומים אחרים‪ .‬אם החוקרים של מדעי העצב אכן ישתתפו אפקטיבית בדיון זה‪ ,‬יהיה‬
‫חשוב לייצג את התחום במדויק‪ ,‬לא להגזים בתוצאות הצנועות שהושגו עד כה ולא להמעיט בפוטנציאל האדיר‬
‫שיכול להיות שטומן בחובו העתיד‪ .‬בנוסף‪ ,‬הם חייבים להבהיר את המעט שאנו יודעים ואת העבודה הרבה‬
‫שנצטרך לבצע לפני שהטיפול בהשתלות תאים יהפוך לאופציה שגרתית לטיפול במחלות נוירולוגיות‪.‬‬
‫‪ .8‬גישות עתידיות‬
‫בעתיד‪ ,‬חייבים לפתור את הנושאים הלוגיסטיים‪ ,‬האתיים והפוליטיים הנוגעים לשימוש בתאי הגזע כמקור‬
‫אלטרנטיבי להשתלות‪ .‬קיימת אי הסכמה לגבי יישומם של תאי גזע בוגרים לעומת תאי גזע עובריים‪.‬ייתכן כי‬
‫תאי גזע בוגרים יכולים ליצור רק מספר מוגבל של סוגי תאים‪ ,‬כאשר תאי גזע עובריים יכולים ליצור את כל‬
‫הצורות של התאים הממוינים בגוף‪ ,‬מפגינים פוטנציאל התרבות ארוך טווח ומספקים את האפשרות לשגשוג לא‬
‫מוגבל בתרבית‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬תאי גזע עובריים משמרים את היכולת המיטוטית שלהם לאחר ההשתלות ולכן‬
‫עלולים ליצור גידולים‪ .‬בהתאם לכך‪ ,‬הפלסטיסיות המוגבלת של תאי הגזע הבוגרים יכולה להוות יתרון בנוגע‬
‫לשליטה על היכולת המיטוטית שלהם לאחר ההשתלה‪ .‬יתר על כן‪ ,‬תאי גזע בוגרים לא יהוו נושא לשאגות אתיות‬
‫המקיפות את השימוש ברקמות עובריות‪ ,‬כולל השימוש בתאי גזע עובריים )‪ .(Borlongan & Sanberg 2002‬לכן‪,‬‬
‫נושאי הבטיחות והיעילות בשימוש בתאי גזע כוללים את השאלות הבאות‪ :‬האם התאים משמרים את הפנוטיפים‬
‫‪190‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫העצביים‪ ,‬היציבים לטווח הרחוק וההכרחיים להצלת המוח המתנוון? האם תאי הגזע המושתלים מתפקדים‬
‫כנוירונים דופאמינרגיים ולכן מסוגלים לספק אפקטים מועילים?‬
‫בבואנו לפתח טכנולוגיות טיפול חדשניות למחלת פרקינסון כדוגמת השימוש בתאי גזע להשתלה‪ ,‬חייבים להציב‬
‫דרישות סף מדעיות ויעדים בהם צריכים לעמוד‪ .‬לדוגמא‪ ,‬מהו היעד להשתלות תאים במחלת פרקינסון – האם‬
‫טיפול שיקומי )החלפת התאים הפגועים בתאי עצב דופאמינרגים חדשים( או טיפול תומך ומגן )תאים שיפרישו‬
‫‪ NTFs‬שיתמכו ברקמה הפגועה(‪ .‬קוים מנחים לשימוש בתאי גזע למחלת פרקינסון מסוכמים בטבלה ‪.17‬‬
‫טבלה ‪ :17‬קוים מנחים לשימוש בתאי גזע למחלת פרקינסון )‪(Svendsen & Langston 2004‬‬
‫‪Requirements for cells in all cellular therapy trials‬‬
‫‪• Free of contact with animal products‬‬
‫‪• Easily banked and stored‬‬
‫‪• Checked for growth stability and chromosome abnormalities‬‬
‫‪• Free of teratomas or other tumor formations after transplantation into nude mice or rats‬‬
‫‪Neuronal cell replacement trials‬‬
‫‪• Neurons must be able to show full phenotypic differentiation‬‬
‫‪• Neurons must be able to extend axons to appropriate targets with proven correlative effects‬‬
‫‪on function in animal models‬‬
‫‪• Side effects should be predicted and studied in detail in animal models‬‬
‫‪Neuronal protection trials‬‬
‫‪• Cells must be shown to migrate into or close to regions of degeneration‬‬
‫‪• Survival within these regions should correlate with functional recovery‬‬
‫‪• If secreting growth factors, regulatable vectors and proof of long-term delivery are desirable‬‬
‫‪• Absence of extensive migration and adverse effects in other brain regions‬‬
‫‪Required animal studies‬‬
‫‪• Preliminary studies in mouse and rat models of Parkinson disease‬‬
‫‪• For Parkinson disease, primate studies are also required‬‬
‫‪• Movement into the clinic may thus be warranted based on successful outcomes in 1−3 above‬‬
‫נראה ברור שיש צורך דחוף לבצע מחקר יסודי נוסף‪ ,‬אם התחום יתפתח מעבר לרמה של פנומנולוגיה‬
‫)‪ (phenomenology‬קלינית‪ .‬כעת‪ ,‬קיימים שלשה אתגרים עיקריים‪ .‬ראשית כל‪ ,‬יהיה הכרחי ללמוד יותר על‬
‫ההתפתחות העצבית‪ ,‬על מנת לקבוע את סוגי התאים שניתן לגדל בתרביות תאים בכמויות מספקות ושיכולים‬
‫לאמץ את הגורל המתאים לאחר ההשתלה לאזורים שונים ‪ .in vivo‬שנית‪ ,‬יהיה הכרחי לפתח מודלים טובים‬
‫יותר בחיות ‪ -‬בכללם אולי פרימטים שעברו שינוי גנטי ‪ -‬בכדי לבצע מבחנים יותר מציאותיים של התאוששות‬
‫תפקודית וקוגניטיבית לאחר ההשתלה‪ .‬שלישית‪ ,‬יהיה חשוב לפתח שיטות לבחון האם תאי העצב המושתלים‬
‫יכולים להשתלב תפקודית ברשתות עצבים במוח‪ ,‬במילים אחרות‪ ,‬האם הם יכולים לתרום בפועל לשיקום‬
‫העיבוד התקין של האינפורמציה במוח הפגוע‪ .‬לשם כך ידרשו זיהוי ואפיון אלקטרו‪-‬פיזיולוגי של תאי‪-‬העצב‬
‫המושתלים ‪. in vivo‬‬
‫‪191‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאי עצב דופאמינרגים‬
‫דיון‬
‫הדוגמאות המובאות בעבודת מחקר זו באות להציג את הנושאים הרבים של הביולוגיה התאית‪ ,‬המקדמים את‬
‫הגישה הטיפולית‪ ,‬בעלת חשיבות מבחינה תפקודית‪ ,‬לטיפול במחלת הפרקינסון‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬המסקנה המדעית‬
‫מכל המחקרים על ההתמיינות וההשתלה של תאי גזע של מכרסמים‪ ,‬פרימטים ובני האדם היא שהחלפת תאים‬
‫במחלות נוירודגנרטיביות בכלל ובמחלת הפרקינסון בפרט יכולה להצליח‪ .‬בכל אופן‪ ,‬חשוב להדגיש‪ ,‬שטיפול תאי‬
‫במחלת הפרקינסון‪ ,‬המועיל קלינית‪ ,‬עדיין לא זמין‪ .‬במחקרנו ניסנו לתרום במעט למאמץ העולמי למציאת תאי‬
‫גזע בעלי יכולת להתמיין לתאי עצב דופאמינרגים ולהבנת תהליכי ההתמיינות של תאי גזע מזנכימליים אנושיים‬
‫לתאי עצב דופאמינרגים‪ .‬תאי העצב הדופאמינרגיים המיוצרים מסוגים שונים של תאי הגזע‪ ,‬נראים כאופציה‬
‫מבטיחה להשתלות תאים בחולי הפרקינסון‪ .‬לא ידוע כעת מהו המקור הטוב ביותר לתאי הגזע על מנת ליצור‬
‫נוירונים דופאמינרגיים‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬לאור עבודה זו‪ ,‬אנו מאמינים שתאי גזע מזנכימליים ממח עצם של אדם‬
‫בוגר‪ ,‬עשויים להיות התאים המתאימים ביותר להשתלה עצמית לטיפול במחלת הפרקינסון‪.‬‬
‫‪192‬‬
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
‫רשימת ספרות‬
References
‫דו"ח הוועדה המייעצת לביואתיקה של האקדמיה הלאומית הישראלית למדעים על השימוש בתאי גזע עובריים‬
.2001 ‫ אוגוסט‬.‫לצורכי מחקר רפואי‬
‫נייר עמדה של שלש הועדות העוסקות בנושא הביואתיקה בישראל בעניין חוק "איסור התערבות גנטית )שיבוט‬
.2004 – ‫אדם ושינוי גנטי בתאי רביה( " וחידושו בכנסת ב‬
,‫ פרשת נח‬,‫ משרד המשפטים‬.‫עובר ותאי גזע בהלכה‬-‫ מעמד קדם‬- "‫ שֹׁפך דם האדם באדם דמו ישפך‬.‫ א‬,‫שטינברג‬
.142 '‫ גיליון מס‬,‫תשס"ד‬
.2003 ,241-254 ;‫ כג‬,‫ תחומין‬.‫ אתיים והלכתיים‬,‫ תאי גזע – היבטים רפואיים‬.‫ א‬,‫שטינברג‬
.‫ תשנ"ז‬,3 ,‫ בשדה חמד‬.‫ מוסריים ויהודים‬,‫ היבטים מדעיים‬.‫ שיבוט בני אדם‬/‫ תיכפול‬.‫ א‬,‫שטינברג‬
Abeliovich, A., Schmitz, Y., Farinas, I., Choi-Lundberg, D., Ho, W.H., Castillo, P.E., Shinsky, N.,
Verdugo, J.M., Armanini, M., Ryan, A., Hynes, M., Phillips, H., Sulzer, D., Rosenthal, A.
2000 Mice lacking alpha-synuclein display functional deficits in the nigrostriatal dopamine
system. Neuron 25: 239-252.
Abouelfetouh, A., Kondoh, T., Ehara, K., Kohmura, E. 2004 Morphological differentiation of bone
marrow stromal cells into neuron-like cells after co-culture with hippocampal slice. Brain
Res. 1029: 114-119.
Abuljadayel, I.S. 2003 Induction of stem cell-like plasticity in mononuclear cells derived from
unmobilised adult human peripheral blood. Curr Med Res Opin. 19: 355-375.
Adams, J.M., Cory, S. 1998 The Bcl-2 protein family: Arbiters of cell survival. Science 281: 13221326.
Adams, K.A., Maida, J.M., Golden, J.A., Riddle R.D. 2000 The transcription factor Lmx1b
maintains Wnt1 expression within the isthmic organizer. Development 127: 1857–1867.
Akai, J., Storey, K. 2003 Brain or brawn: how FGF signaling gives us both. Cell. 115: 510-512.
Akbar, M., Kim, H.Y. 2002 rotective effects of docosahexaenoic acid in staurosporine-induced
apoptosis: involvement of phosphatidylinositol-3 kinase pathway. J Neurochem. 82: 655-65.
Akerud, P., Canals, J.M., Snyder, E.Y., Arenas, E. 2001 Neuroprotection through delivery of glial
cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson’s
disease. J Neurosci. 21: 8108-8118.
193
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Alvarez-Dolado, M., Pardal, R., Garcia-Verdugo, J.M., Fike, J.R., Lee, H.O., Pfeffer, K., Lois, C.,
Morrison, S.J., Alvarez-Buylla, A. 2003 Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje
neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature 425: 968- 973.
Amemiya, K., Haruta, M., Takahashi, M., Kosaka, M., Eguchi, G. 2004 Adult human retinal
pigment epithelial cells capable of differentiating into neurons. Biochem Biophys Res
Commun. 316: 1-5.
Andersen, B., Hariri, A., Pittelkow, M.R. et al. 1997 Characterization of Skn-1a/i POU domain
factors and linkage to papillomavirus gene expression. J Biol Chem. 272: 15905-15913.
Appel, B., Eisen, J.S. 2003 Retinoids run rampant: multiple roles during spinal cord and motor
neuron development. Neuron. 40: 461-464.
Arenas, E. 2002 Stem cells in the treatment of Parkinson’s disease. Brain Res. 57: 795-808.
Armstrong, R.J.E., Barker, R.A. 2001 Neurodegeneration: a failure of neuroregeneration? Lancet
358: 1174-1176.
Arts, M.P., Groenewegen, H.J., Veening, J.G., Cools, A.R. 1996 Efferent projections of the
retrorubral nucleus to the substantia nigra and ventral tegmental area in cats as shown by
anterograde tracing. Brain Res Bull. 40: 219-228.
Arvidsson, A., Collin, T., Kirik, D., Kokaia, Z. Lindvall, O. 2002 Neuronal replacement from
endogenous precursors in the adult brain after stroke. Nat. Med. 8: 963-970.
Asahara, T., Kalka, C., Isner, J.M. 2000 Stem cell therapy and gene transfer for regeneration. Gene.
Ther. 7: 451-457.
Ashjian, P.H., Elbarbary, A.S., Edmonds, B., DeUgarte, D., Zhu, M., Zuk, P.A., Lorenz, H.P.,
Benhaim, P., Hedrick, M.H. 2003 In vitro differentiation of human processed lipoaspirate
cells into early neural progenitors. Plast Reconstr Surg. 111: 1922-1931.
Assady, S., Maor, G., Amit, M., Itskovitz-Eldor, J., Skorecki, K.L., Tzukerman M. 2001 Insulin
production by human embryonic stem cells. Diabetes 50: 1691-1697.
Azizi, S.A., Stokes, D., Augelli, B.J., DiGirolamo, C., Prockop, D.J. 1998 Engraftment and
migration of human bone marrow stromal cells implanted in the brains of albino rats––
similarities to astrocyte grafts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95: 3908–3913.
Backman, C., Perlmann, T., Wallen, A., Hoffer, B.J., Morales, M. 1999 A selective group of
dopaminergic neurons express Nurr1 in the adult mouse brain. Brain Res. 851: 125-132.
Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettne, J.E., Gottlieb D.I. 1995 Embryonic stem cells express
neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168: 342-357.
Bannon, M.J. 1998 Dopamine, in Nature Encyclopedia of Life Sciences. London: Nature
Publishing Group. http://www.els.net/ [doi:10.1038/npg.els.0000279].
194
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Barberi, T., Klivenyi, P., Calingasan, N.Y., Lee, H., Kawamata, H., Loonam, K., Perrier, A.L.,
Bruses, J., Rubio, M.E., Topf, N., Tabar, V., Harrison, N.L., Beal, M.F., Moore, M.A.,
Studer, L. 2003 Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic
stem cells and application in Parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21: 1200-1207.
Barker, R.A., Ratcliffe, E., McLaughlin, M., Richards, A., Dunnett, S.B. 2000 A role for
complement in the rejection of porcine ventral mesencephalic xenografts in a rat model of
Parkinson's disease. J Neurosci. 20: 3415-3424.
Bavisotto, L., Kaushansky, K., Lin, N., Hromas, R. 1991 Antisense oligonucleotides from the
stage-specific myeloid zinc finger gene MZF-1 inhibit granulopoiesis in vitro. J Exp Med.
174: 1097-1101.
Beal, M.F., Hyman, B.T., Koroshetz, W.1993 Do defects in mitochondrial energy metabolism
underlie the pathology of neurodegenerative diseases? Trends Neurosci. 16:125-131.
Beckman, J.S., Beckman, T.W., Chen, J., Marshall, P.A., Freeman, B.A. 1990 Apparent hydroxyl
radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and
superoxide. Proc Natl Acad Sci U S A. 87:1620-1624.
Ben-Hur, T., Idelson, M., Khaner, H., Pera, M., Reinhartz, E., Itzik, A., Reubinoff, B.E. 2004
Transplantation of human embryonic stem cell-derived neural progenitors improves
behavioral deficit in Parkinsonian rats. Stem Cells. 22: 1246-1255.
Berland, R., Wortis, H.H. 2002 Origins and functions of B-1 cells with notes on the role of CD5.
Annu Rev Immunol. 20: 253-300.
Betarbet, R., Sherer, T.B, Mackenzie, G., Garcia-Osuna, M., Panov, A.V., Greenamyre, J.T. 2000
Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkinson’s disease Nat. Neuro.
3: 1301-1306.
Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S., Robey, P.G. 2001 Bone marrow stromal cells: Nature,
biology, and potential application. Stem Cells 19: 180-192.
Bianco, P., Robey, P.G. 2000 Marrow stromal stem cells. J Clin Invest. 105: 1663-1668.
Bjorklund, A., Stenevi, U. 1979 Reconstruction of the nigrostriatal dopamine pathway by
intracerebral nigral transplants. Brain Res. 177: 555-560.
Björklund, L.M., Sánchez-Pernaute, R., Chung, S., Andersson, T., Chen, I.Y., McNaught, K.S.,
Brownell, A.L., Jenkins, B.G., Wahlestedt, C., Kim, K.S., Isacson, O. 2002 Embryonic stem
cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantation in a Parkinson rat
model. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 2344-2349.
Black, I.B., Woodbury, D. 2001 Adult rat and human bone marrow stromal stem cells differentiate
into neurons. Blood Cells Mol Dis. 27: 632-636.
195
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Blaud, M., Vossen, C., Joseph, G., Alazard, R., Erard, M., Nieto, L. 2004 Characteristic patterns of
N Oct-3 binding to a set of neuronal promoters. J Mol Biol. 339: 1049-1058.
Blondheim, N.R., Levy, S.Y, Ben-Zur, T., Burshtein, A., Cherlow, T., Kan, I., Barzilai, R., BahatStromza, M., Barhum, Y., Bulvik, S., Melamed, E., Offen D. 2006 Human mesenchymal
stem cells express neural genes, suggesting a neural predisposition. Stem Cells Dev. 15: 141164.
Bohn, M.C., Cupit, L., Marciano, F., Gash, D.M. 1987 Adrenal medulla graft enhanced recovery of
striatal dopaminergic fibers. Science 237: 913-916.
Bonaguidi, M., Mcguire T., Samanta, J. 2004 LIF promotes a GFAP+ stem cell state whereas
BMP4 induces a mature astrocitic fate. The 2nd annual meeting of the International Society
for Stem Cell Research (ISSCR), Boston, Massachusetts, USA, June 10-13. (Poster 181).
Borlongan, C.V., Sanberg, P.R. 2002 Neural transplantation for treatment of Parkinson’s disease.
Drug Discov Today. 7: 674-682.
Bos, J.L. 1998 All in the family? New insights and questions regarding interconnectivity of Ras,
Rap1 and Ral. EMBO J. 17:6776-6782.
Bossolasco, P., Cova, L., Calzarossa, C., Rimoldi, S.G., Borsotti, C., Deliliers, G.L., Silani, V.,
Soligo, D., Polli, E. 2005 Neuro-glial differentiation of human bone marrow stem cells in
vitro. Exp Neurol. 193: 312-25.
Bottenstein, J.E. Growth of neural cells in defined media. In: Bottenstein, J.E., Sato G., editors.
Cell Culture in the Neurosciences. New York, NY: Plenum Press; 1985. p.1-40.
Braak, H., Braak, E. 2000 Pathoanatomy of Parkinson's disease. J Neurol. 247(Suppl 2):II3-10.
Branton, R.L., Love, R.M., Clarke, D.J. (1998) cAMP included during cell suspension preparation
improves survival of dopaminergic neurons in vitro. Neuroreport. 9: 3223-3227.
Brazelton, T.R., Rossi, F.M.V., Keshet, G.I., Blau, H.M. 2000 From marrow to brain: Expression
of neuronal phenotypes in adult mice. Science 290: 1775-1779.
Brundin, P., Bjorklund, A. 1987 Survival, growth and function of dopaminergic neurons grafted to
the brain. Prog Brain Res. 71: 293-308.
Brundin, P., Duan, W.M., Sauer, H. Functional effects of mesencephalic dopamine neurons and
adrenal chromaffin cells grafted to the rodent striatum. In: Dunnett, S.B., Björklund A.,
editors. Functional neural transplantation. New York, NY: Raven press; 1994. p. 9-46.
Brundin, P., Karlsson, J., Emgard, M., Schierle, G.S., Hansson, O., Petersen, A., Castilho, R.F.
2000 Improving the survival of grafted dopaminergic neurons: a review over current
approaches. Cell Transplant. 9: 179-195.
196
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Brundin, P., Nilsson, O.G., Strecker, R.E., Lindvall, O., Astedt, B., Bjorklund, A. 1986 Behavioural
effects of human fetal dopamine neurons grafted in a rat model of Parkinson's disease. Exp
Brain Res. 65: 235-240.
Brundin, P., Pogarell, O., Hagell, P., Piccini, P., Widner, H., Schrag, A., Kupsch, A., Crabb, L.,
Odin, P., Gustavii, B., Bjorklund, A., Brooks, D.J., Marsden, C.D., Oertel, W.H., Quinn,
N.P., Rehncrona, S., Lindvall, O. 2000 Bilateral caudate and putamen grafts of embryonic
mesencephalic tissue treated with lazaroids in Parkinson's disease. Brain 123: 1380–1390.
Brundin, P., Strecker, R.E., Widner, H., Clarke, D.J., Nilsson, O.G., Astedt, B., Lindvall, O.,
Bjorklund, A. 1988 Human fetal dopamine neurons grafted in a rat model of Parkinson's
disease: immunological aspects, spontaneous and drug-induced behaviour, and dopamine
release. Exp Brain Res. 70 :192-208.
Budowski, P. 1988 Omega 3-fatty acids in health and disease. World Rev Nutr Diet. 57: 214-274.
Burbach, J.P., Smits, S., Smidt, M.P. 2003 Transcription factors in the development of midbrain
dopamine neurons. Ann N Y Acad Sci. 991: 61-68.
Buytaert-Hoefen, K.A., Alvarez, E., Freed, C.R. 2004 Generation of tyrosine hydroxylase positive
neurons from human embryonic stem cells after coculture with cellular substrates and
exposure to GDNF. Stem Cells. 22: 669-674.
Cameron, H.A., McKay, R.D. 2001 Adult neurogenesis produces a large pool of new granule cells
in the dentate gyrus. J Comp Neurol. 435: 406-417.
Campbell DG, Hardie DG, Vulliet PR. 1986 Identification of four phosphorylation sites in the Nterminal region of tyrosine hydroxylase. J Biol Chem. 261: 10489-10492.
Carpenter, M.K., Inokuma, M.S., Denham, J., Mujtaba, T., Chiu, C.P., Rao M.S. 2001 Enrichment
of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp Neurol. 172; 383397.
Carvey, P.M., Ling, Z.D., Sortwell, C.E., Pitzer, M.R., McGuire, S.O., Storch, A., Collier, T.J.
2000 A clonal line of mesencephalic progenitor cells converted to dopamine neurons by
hematopoietic cytokines: a source of cells for transplantation in Parkinson's disease. Exp
Neurol. 171: 98–108.
Castillo, S.O., Baffi, J.S., Palkovits, M., Goldstein, D.S., Kopin, I.J., Witta, J., Magnuson, M.A.,
Nikodem, V.M. 1998 Dopamine biosynthesis is selectively abolished in substantia
nigra/ventral tegmental area but not in hypothalamic neurons in mice with targeted disruption
of the Nurr1 gene. Mol Cell Neurosci. 11: 36-46.
197
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Castro, D.S., Hermanson, E., Joseph, B., Wallen, A., Aarnisalo, P., Heller, A., Perlmann, T. 2001
Induction of cell cycle arrest and morphological differentiation by Nurr1 and retinoids in
dopamine MN9D cells. J Biol Chem. 276: 43277-43284.
Castro, R.F., Jackson, K.A., Goodell, M.A., Robertson, C.S., Liu, H., Shine, H.D. 2002 Failure of
bone marrow cells to transdifferentiate into neural cells in vivo. Science 297: 1299.
Cazorla, P., Smidt, M.P., O'Malley, K.L., Burbach, J.P. 2000 A response element for the
homeodomain transcription factor Ptx3 in the tyrosine hydroxylase gene promoter. J
Neurochem. 74: 1829-1837.
Chalon, S., Delion-Vancassel, S., Belzung, C., Guilloteau, D., Leguisquet, A.M., Besnard, J.C.,
Durand, G. 1998 Dietary fish oil affects monoaminergic neurotransmission and behavior in
rats. J Nutr. 128: 2512-2519.
Check, E. 2003 Second cancer case halts gene-therapy trials. Nature 421: 305-305.
Chen, J., Li, Y., Wang, L., Zhang, Z., Lu, D., Lu, M., Chopp, M.. 2001a Therapeutic benefit of
intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats.
Stroke 32: 1005–1011.
Chen, J., Sanberg, P.R., Li, Y., Wang, L., Lu, M., Willing, A.E., Sanchez-Ramos, J., Chopp, M.
2001b Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits
after stroke in rats. Stroke. 32: 2682-2688.
Chen, N., Reith, M.E. 2000 Structure and function of the dopamine transporter. Eur J Pharmacol.
405, 329–339.
Chen, X., Katakowski, M., Li, Y., Lu, D., Wang, L., Zhang, L., Chen, J., Xu, Y., Gautam, S.,
Mahmood, A., Chopp, M. 2002 Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by
traumatic brain tissue extracts: growth factor production. J Neurosci Res. 69: 687-691.
Cho, J.H., Kwon, I.S., Kim, S., Ghil, S.H., Tsai, M.J., Kim, Y.S., Lee, Y.D., Suh-Kim, H. 2001
Overexpression of BETA2/NeuroD induces neurite outgrowth in F11 neuroblastoma cells. J
Neurochem. 77: 103-109.
Cho, K.J., Trzaska, K.A., Greco, S.J., McArdle, J., Wang, F.S., Ye, J.H., Rameshwar, P. 2005
Neurons derived from human mesenchymal stem cells show synaptic transmission and can
be induced to produce the neurotransmitter substance P by interleukin-1 alpha. Stem Cells
23: 383-391.
Chomczynski, P., Sacchi, N. 1987 Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium
thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochiemistry 162:156-159.
Chopp, M., Li, Y. 2002 Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet Neurol. 1:
92-100.
198
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Chopp, M., Zhang, X.H., Li, Y., Wang, L., Chen, J., Lu, D., Lu, M., Rosenblum, M. 2000 Spinal
cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation. NeuroReport 11:
3001–3005.
Chung, S., Sonntag, K.C., Andersson, T., Bjorklund, L.M., Park, J.J., Kim, D.W., Kang,U.J.,
Isacson, O., Kim, K.S. 2002 Genetic engineering of mouse embryonic stem cells by Nurr1
enhances differentiation and maturation into dopaminergic neurons. Eur J Neurosci. 216:
1829-1838.
Cibelli, J.B., Grant, K.A., Chapman, K.B., Cunniff, K., Worst, T., Green, H.L., Walker, S.J., Gutin,
P.H., Vilner, L., Tabar, V., Dominko, T., Kane, J., Wettstein, P.J., Lanza, R.P., Studer, L.,
Vrana, K.E., West, M.D. 2002 Parthenogenetic stem cells in nonhuman primates. Science.
295: 819.
Cicchetti, F., Costantini, L., Belizaire, R., Burton, W., Isacson, O., Fodor, W. 2002 Combined
inhibition of apoptosis and complement improves neural graft survival of embryonic rat and
porcine mesencephalon in the rat brain. Exp. Neurol. 177: 376-384.
Colter, D.C., Class, R., DiGirolamo, C.M., Prockop, D.J. 2000 Rapid expansion of recycling stem
cells cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc. Natl. Acad. Sci U S
A. 97: 3213-3218.
Colter, D.C., Sekiya, I., Prockop, D.J. 2001 Identification of subpopulation of rapidly self-renewing
and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 98: 7841-7845.
Connor, J.R., Snyder, B.S., Arosio, P., Loeffler, D.A., LeWitt, P. 1995 A quantitative analysis of
isoferritins in select regions of aged, parkinsonian, and Alzheimer's diseased brains. J.
Neurochem. 65:717-724.
Corotto, F.S., Henegar, J.A., Maruniak, J.A. 1993 Neurogenesis persists in the subependymal layer
of the adult mouse brain. Neurosci Lett. 149: 111-114.
Correa Juan de Dios Vial, Sgreccia S.E. Mons. Elio. Declaration on the production and the
scientific and therapeutic use of human embryonic stem cells. Pontifical academy for life,
Vatican City, August 25, 2000.
Costantini, L.C., Bakowska, J.C., Breakefild, X.O., Isacson, O. 2000 Gene therapy in the CNS.
Gene Therapy 7: 93-109.
Cowan, C.A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Witmyer, J., Zucker, J.P., Wang, S.,
Morton, C.C., McMahon, A..P, Powers, D., Melton, D.A. 2004 Derivation of embryonic
stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med. 350: 1353-1356.
199
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Croft, A.P., Przyborski, S.A. 2004 Generation of neuroprogenitor-like cells from adult mammalian
bone marrow stromal cells in vitro. Stem Cells Dev. 13: 409-420.
Crosby, N., Deane, K.H., Clarke, C.E. 2003 Amantadine in Parkinson's disease. Cochrane Database
Syst Rev. 1.
Daadi, M.M., Weiss, S. 1999 Generation of tyrosine hydroxylase-producing neurons from
precursors of the embryonic and adult forebrain. J Neurosci. 19: 4484-4497.
Dahlström, A., Fuxe, K. 1964 Evidence for the existence of monoamine-containing neurons in
central nerve system. Demostration of monoamine in the cell bodies of brain neurons. Acta
Physiol Scand. 62: 1-55.
Danielian, P.D., McMahon, A.P. 1996 Engrailed-1 as a target of the wnt-1 signaling pathway in
vertebrate midbrain development. Nature 383, 332-334.
Dauer, W., Przedborski, S. 2003 Parkinson's disease: Mechanisms and models. Neuron. 39:889909.
de la Fuente-Fernandez, R., Schulzer, M., Stoessl, A.J. 2002 The placebo effect in neurological
disorders. Lancet Neurol. 1: 85-91.
de Rooij, J., Rehmann, H., van Triest, M., Cool, R.H., Wittinghofer, A., Bos, J.L. 2000 Mechanism
of regulation of the Epac family of cAMP-dependent RapGEFs. J Biol Chem. 275: 2082920836.
Deacon, T., Dinsmore, J., Costantini, L.C., Ratliff, J., Isacson O. 1998 Blastula-stage stem cells
can differentiate into dopaminergic and serotonergic neurons after transplantation. Exp
Neurol. 149: 28-41.
Deans, R.J., Moseley, A.B. 2000 Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical use. Exp
Hematol. 28: 875-884.
Decker, T., Lew, D.J., Mirkovitch, J. et al. 1991 Cytoplasmic activation of GAF, an IFN-gammaregulated DNAbinding factor. EMBO J. 10: 927-932.
Demura, T., Tashiro, G., Horiguchi, G., Kishimoto, N., Kubo, M., Matsuoka, N., Minami, A.,
Nagata-Hiwatashi, M., Nakamura, K., Okamura, Y., Sassa, N., Suzuki, S., Yazaki, J.,
Kikuchi, S., Fukuda, H. 2002 Visualization by comprehensive microarray analysis of gene
expression programs during transdifferentiation of mesophyll cells into xylem cells. Proc
Natl Acad Sci U S A. 99: 15794-15799.
Deng, W., Obrocka, M., Fischer, I., Prockop, D.J. 2001 In-vitro differentiation of human marrow
stromal cells into early progenitors of neural cells by conditions that increase intracellular
cyclic AMP. Biochem Biophys Res Commun. 282:148-152.
200
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Dezawa, M., Kanno, H., Hoshino, M., Cho, H., Matsumoto, N., Itokazu, Y., Tajima, N., Yamada,
H., Sawada, H., Ishikawa, H., Mimura, T., Kitada, M., Suzuki, Y., Ide, C. 2004 Specific
induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous
transplantation. J Clin. Invest.; 113: 1701-1710.
D'Ippolito, G., Diabira, S., Howard, G.A., Menei, P., Roos, B.A., Schiller, P.C. 2004 Marrowisolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells, a unique population of postnatal young
and old human cells with extensive expansion and differentiation potential. J Cell Sci. 117:
2971-2981.
Djaldetti, R., Melamed, E. 2002 New drugs in the future treatment of Parkinson's disease. J
Neurol.249 Suppl 2: II30-35.
Doetsch, F., Caille, .I, Lim, D.A., Garcia-Verdugo, J.M,. Alvarez-Buylla, A. 1999 Subventricular
zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell. 97: 703-716.
Donovan, P.J. 1994 Growth factor regulation of mouse primordial germ cell development. Curr
Top Dev Biol. 29: 189-225.
Duan, Z., Horwitz, M. 2003 Targets of the transcriptional repressor oncoprotein Gfi-1. Proc Natl
Acad Sci U S A. 100: 5932-5937.
Dubois-Dauphin, M., Frankowski, H., Tsujimoto, Y., Huarte, J., Martinou, J.C. 1994 Neonatal
motoneurons overexpressing the bcl-2 protooncogene in transgenic mice are protected from
axotomy-induced cell death. Proc Natl Acad Sci U S A. 91: 3309-3313.
Dugast, C., Weber, M.J. 2001 NF-Y binding is required for transactivation of neuronal aromatic Lamino acid decarboxylase gene promoter by the POU-domain protein Brn-2. Brain Res Mol
Brain Res. 89: 58-70.
Dunkley, P.R., Bobrovskaya, L., Graham, M.E. von Nagy-Felsobuki, E.I., Dickson, P.W. 2004
Tyrosine hydroxylase phosphorylation: regulation and consequences. J Neurochem. 91:
1025-1043.
During, M.J., Naegele, J.R., O’Malley, K.L., Geller, A.I. 1994 Long-term behavioral recovery in
parkinsonian rat by an HSV vector expressing tyrosine hydroxylase. Science 266:1399-1403.
During, M.J., Samulski, R.J., Elsworth, J.D., Kaplitt, M.G., Leone, P., Xiao, X., Li, J., Freese, A.,
Taylor, J.R., Roth, R.H., Sladek, J.R. Jr., O'Malley, K.L., Redmond, D.E. Jr. 1998 In vivo
expression of therapeutic human genes for dopamine production in the caudates of MPTPtreated monkeys using an AAV vector. Gene Ther. 5:820-827.
Echeverri, K., Tanaka, E. 2002 Ectoderm to mesoderm lineage switching during axolotl tail
regeneration. Science 298: 1993-1996.
201
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Edelman, A.M., Raese, J.D., Lazar, M.A., Barchas, J.D. 1978 In vitro phosphorylation of a purified
preparation of bovine corpus striatal tyrosine hydroxylase. Commun Psychopharmacol.
2:461-465.
Edlund, T., Jessell, T.M. 1999 Progression from extrinsic to intrinsic signaling in cell fate
specification: a view from the nervous system. Cell 96: 211-224.
Eglitis, M.A., Mezey, E. 1997 Hematopoietic cells differentiate into both microglia and macroglia
in the brains of adult mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 94: 4080-4085.
Egusa, H., Schweizer, F.E., Wang, C.C., Matsuka, Y., Nishimura, I. 2005 Neuronal differentiation
of bone marrow-derived stromal stem cells involves suppression of discordant phenotypes
through gene silencing. J Biol Chem. 280: 23691-23697.
ElShamy, W.M., Fridvall, L.K., Ernfors, P. 1998 Growth arrest failure, G1 restriction point
override, and S phase death of sensory precursor cells in the absence of neurotrophin-3.
Neuron. 21: 1003-1015.
Engele, J. 1998 Spatial and temporal growth factor influences on developing midbrain
dopaminergic neurons. J Neurosci Res. 53 :405-414.
Enochs, W.S., Sarna, T., Zecca, L., Riley, P.A., Swartz, H.M. 1994 The roles of neuromelanin,
binding of metal ions, and oxidative cytotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease: a
hypothesis. J Neural Transm Park Dis Dement Sect. 7:83-100.
Ershov, P.V., Ugrumov, M.V., Calas, A., Krieger, M., Thibault, J. 2002 Differentiation of tyrosine
hydroxylase-synthesizing and/or aromatic L-amino acid decarboxylase-synthesizing neurons
in the rat mediobasal hypothalamus: quantitative double-immunofluorescence study. J Comp
Neurol. 446:114-122.
Ethical issues in human stem cells research. Vol III, Religious perspectives. The national bioethics
advisory commission (NBAC), Rockville, Maryland, June 2000.
Evans, M.J., Kaufman, M.H. 1981 Establishment in culture of pluripotent cells from mouse
embryos. Nature 5819: 154-156.
Falck, B., Hillarp, N.A., Thieme, G., Torp, A. 1962 Fluorescence of catechol amines and related
compounds condensed with formaldehyde. J Histochem Cytochem. 10: 348-354.
Fallon, J., Reid, S., Kinyamu, R., Opole, I., Opole, R., Baratta, J., Korc, M., Endo, T.L., Duong, A.,
Nguyen, G., Karkehabadhi, M., Twardzik, D., Patel, S., Loughlin, S. 2000 In vivo induction
of massive proliferation, directed migration, and differentiation of neural cells in the adult
mammalian brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 97:14686-14691.
202
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Farlie, P.G., Dringen, R., Ress, S.M., Kannourakis, G., Bernard O. 1995 bcl-2 transgene expression
can protect neurons against developmental and induced cell death. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 92: 4397-4401.
Farrer, M., Gwinn-Hardy, K., Muenter, M., DeVrieze, F.W., Crook, R., Perez-Tur, J., Lincoln, S.,
Maraganore, D., Adler, C., Newman, S., MacElwee, K., McCarthy, P., Miller, C., Waters, C.,
Hardy, J. 1999 A chromosome 4p haplotype segregating with Parkinson's disease and
postural tremor. Hum Mol Genet. 8:81-85.
Faucheux, B.A., Nillesse, N., Damier, P., Spik, G., Mouatt-Prigent, A., Pierce, A., Leveugle, B.,
Kubis, N., Hauw, J.J., Agid, Y. 1995 Expression of lactoferrin receptors is increased in the
mesencephalon of patients with Parkinson disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 92:9603-9607.
Fawcett, J.W., Barker, R.A., Dunnett, S.B. 1995 Dopaminergic neuronal survival and the effects of
bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral
mesencephalon. Exp Brain Res. 106: 275-282.
Ferrari, G., Cusella-De Angelis, G., Coletta, M., Paolucci, E., Stornaiuolo, A., Cossu, G., Mavilio,
F. 1998 Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science 279:
1528-1530.
Fischbach, G.D., Fischbach, R.L. 2004 Stem cells: science, policy, and ethics. J Clin Invest. 114:
1364-1370.
Fisher, L.J., Jinnah, H.A., Kale, L.C., Higgins, G.A., Gage, F.H. 1991 Survival and function of
intrastriatally grafted primary fibroblasts genetically modified to produce L-dopa. Neuron. 6:
371-380.
Fitoussi, N., Sotnik-Barkai, I., Tornatore, C., Herzberg, U., Yadid, G. 1998 Dopamine turnover and
metabolism in the striatum of parkinsonian rats grafted with genetically-modified human
astrocytes. Neuroscience. 85: 405-413.
Floor; E., Wetzel, M.G. 1998 Increased protein oxidation in human substantia nigra pars compacta
in comparison with basal ganglia and preforontal cortex measured with an improved
dinitrophenylhydrazine assay. J. Neurochem. 70:2675-2682.
Fredriksson, A., Gentsch, C., Archer, T. 1994 Effect of the competitive NMDA antagonist, CGP 40
116, and a low dose of l-Dopa on the motor activity deficit of MPTP-treated mice. Behav
Pharmacol. 5:599-606.
Freed, C.R., Greene, P.E., Breeze, R.E., Tsai, W.Y., DuMouchel, W., Kao, R., Dillon, S., Winfield,
H., Culver, S., Trojanowski, J.Q., Eidelberg, D., Fahn, S. 2001 Transplantation of embryonic
dopamine neurons for severe Parkinson's disease. N Engl J Med. 344: 710-719.
203
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Freed, W.J., Poltorak, M., Becker, J.B. 1990 Intracerebral adrenal medulla grafts: a review. Exp
Neurol. 110:139-166.
Freeman, T.B., Olanow, C.W., Hauser, R.A., Nauert, G.M., Smith, D.A., Borlongan, C.V.,
Sanberg, P.R., Holt, D.A., Kordower, J.H., Vingerhoets, F.J., Snow, B.J., Calne, D., Gauger,
L.L. 1995 Bilateral fetal nigral transplantation into the postcommissural putamen in
Parkinson's disease. Ann Neurol. 38: 379–388.
Friedenstein, A.J., Chailakhjan, R.K., Lalykina, K.S. 1970 The development of fibroblast colonies
in monolayer cultures of guinea-pig bone marrow and spleen cells. Cell Tissue Kinet. 3: 393403.
Friedenstein, A.J., Chailakhyan, R.K., Gerasimov, U.V. 1987 Bone marrow osteogenic stem cells:
in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tissue Kinet. 20: 263-72.
Friedenstein, A.J., Gorskaja J.F., Kulagina, N.N. 1976 Fibroblast precursors in normal and
irradiated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol. 4: 267-274.
Friedenstein, A.J., Petrakova, K.V., Kurolesova, A.I., Frolova, G.P. 1968 Heterotopic of bone
marrow.Analysis
of
precursor
cells
for
osteogenic
and
hematopoietic
tissues.
Transplantation. 6: 230-247.
Frodl, E.M., Duan, W.M., Sauer, H., Kupsch, A., Brundin, P. 1994 Human embryonic dopamine
neurons xenografted to the rat: effects of cryopreservation and varying regional source of
donor cells on transplant survival, morphology and function. Brain Res. 647:286-298.
Gage, F.H. 1998 Cell therapy. Nature 392: 18-24.
Galderisi, U., Jori, F.P., Giordano, A. 2003 Cell cycle regulation and neural differentiation.
Oncogene. 22: 5208-5219.
Garbuzova-Davis, S., Willing, A.E., Zigova, T., Saporta, S., Justen, E.B., Lane, J.C., Hudson, J.E.,
Chen, N., Davis, C.D., Sanberg, P.R. 2003 Intravenous administration of human umbilical
cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration,
and differentiation. J Hematother Stem Cell Res. 12: 255-270.
Garcia, A.D., Doan, N.B., Imura, T., Bush, T.G., Sofroniew, M.V. 2004 GFAP-expressing
progenitors are the principal source of constitutive neurogenesis in adult mouse forebrain.
Nat Neurosci. 7: 1233-1241.
Garcia, M.C., Ward, G., Ma, Y.C., Salem, N.Jr., Kim, H.Y. 1998 Effect of docosahexaenoic acid
on the synthesis of phosphatidylserine in rat brain in microsomes and C6 glioma cells. J
Neurochem. 70: 24-30.
204
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Gash, D.M., Gerhardt, G.A., Hoffer, B.J. 1998 Effects of glial cell line-derived neurotrophic factor
on the nigrostriatal dopamine system in rodents and nonhuman primates. Adv Pharmacol. 42:
911-915.
Gasser, T., Muller-Myhsok, B., Wszolek, Z.K., Oehlmann, R., Calne, D.B., Bonifati, V., Bereznai,
B., Fabrizio, E., Vieregge, P., Horstmann, R.D. 1998 A susceptibility locus for Parkinson's
disease maps to chromosome 2p13. Nat Genet. 18:262-265.
Gearhart, J. 2004 New human embryonic stem-cell lines--more is better. N Engl J Med. 350:12751276.
George, J.M., Jin, H., Woods, W.S., Clayton, D.F. 1995 Characterization of a novel protein
regulated during the critical period for song learning in the zebra finch. Neuron 15:361-372.
Ghirlando, R., Trainor, C.D. 2003 Determinants of GATA-1 binding to DNA: the role of nonfinger residues. J Biol Chem. 278: 45620-45628.
Ghirnikar, R.S., Le,e Y.L., Eng, L.F. 1998 Inflammation in traumatic brain injury: role of cytokines
and chemokines. Neurochem Res. 23: 329-340.
Gilgun-Sherki, Y., Djaldetti, R., Melamed, E., Offen, D. 2004 Polymorphism in candidate genes:
implications for the risk and treatment of idiopathic Parkinson's disease. Pharmacogenomics
J. 4:291-306.
Gilgun-Sherki, Y., Melamed, E., Offen, D. 2001. Oxidative stress induced-neurodegenerative
diseases: the need for antioxidants that penetrate the blood brain barrier. Neuropharmacology
40: 959-975.
Gill, S.S., Patel, N.K., Hotton, G.R., O'Sullivan, K., McCarter, R., Bunnage, M., Brooks, D.J.,
Svendsen, C.N., Heywood, P. 2003 Direct brain infusion of glial cell line-derived
neurotrophic factor in Parkinson disease .Nat Med. 9:589-595.
Giros, B., Caron, M.G. 1993 Molecular characterization of dopamine transporter. Trends
Pharmacol. Sci. 14: 43-49.
Glozman, S., Yavin, E. 1997 Lipid peroxides are generated by the fetal rat brain after episodes of
global ischemia in utero. Neurochem Res. 22: 201-208.
Goetz, C.G., Olanow, C.W., Koller, W.C., Penn, R.D., Cahill, D., Morantz, R., Stebbins, G.,
Tanner, C.M., Klawans, H.L., Shannon, K.M. 1989 Multicentar study of autologous adrenal
medullary transplantation to the corpus striatum in patients with advanced Parkinson’s
disease. N Engl J Med. 320: 337-341.
Goldman, S. 2005 Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.
Nat Biotechnol. 23: 862-871.
205
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Goodell, M.A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A.S., Mulligan, R.C. 1996 Isolation and functional
properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183:
1797-1806.
Goodell, M.A., Rosenzweig, M., Kim, H., Marks, D.F., DeMaria, M., Paradis, G., Grupp, S.A.,
Sieff, C.A., Mulligan, R.C., Johnson, R.P. 1997 Dye efflux studies suggest that
hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in
multiple species. Nat Med. 3:1337-1345.
Goolsby, J., Marty, M.C., Heletz, D., Chiappelli, J., Tashko, G., Yarnell, D., Fishman, P.S., DhibJalbut, S., Bever, C.T. Jr., Pessac, B., Trisler, D. 2003 Hematopoietic progenitors express
neural genes. Natl Acad Sci U S A. 100: 14926-14931.
Gordon, P.H., Yu, Q., Qualls, C., Winfield, H., Dillon, S., Greene, P.E., Fahn, S., Breeze, R.E.,
Freed, C.R., Pullman, S.L. 2004 Reaction time and movement time after embryonic cell
implantation in Parkinson disease. Arch Neurol. 61: 858-861.
Goridis, C., Rohrer, H. 2002 Specification of catecholaminergic and serotonergic neurons. Review.
Nat Rev Neurosci; 3: 531-541.
Gottwald, M.D., Bainbridge, J.L., Dowling, G.A., Aminoff, M.J., Alldredge, B.K. 1997 New
pharmacotherapy for Parkinson's disease. Ann Pharmacother. 31:1205-1217.
Gould, E., Reeves, A.J., Graziano, M.S., Gross, C.G. 1999 Neurogenesis in the Neocortex of Adult
Primates. Science 286: 548-552.
Goulding, M.D., Chalepakis, G., Deutsch, U., Erselius, J.R., Gruss, P. 1991 Pax-3, a novel murine
DNA binding protein expressed during early neurogenesis. EMBO J. 10: 1135-1147.
Green, P., Yavin, E. 1995 Modulation of fetal rat brain and liver phospholipid content by
intraamniotic ethyl docosahexaenoate administration. J Neurochem. 65: 2555-2560.
Gritti, A., Parati, E.A., Cova, L., Frolichsthal, P., Galli, R., Wanke, E., Faravelli, L., Morassutti,
D.J., Roisen, F., Nickel, D.D., Vescovi, A.L. 1996 Multipotential stem cells from the adult
mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J.
Neurosci. 16: 1091–1100.
Guan, K., Chang, H., Rolletschek, A., Wobus, A.M. 2001 Embryonic stem cell-derived
neurogenesis. Retinoic acid induction and lineage selection of neuronal cells. Cell Tissue
Res. 305: 171-176.
Gussoni, E., Soneoka, Y., Strickland, C.D., Buzney, E.A., Khan, M.K., Flint, A.F., Kunkel, L.M.,
Mulligan, R.C. 1999 Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell
transplantation. Nature 401: 390-394.
206
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Hadjantonakis, A.K., Gertsenstein, M., Ikawa, M., Okabe, M., Nagy, A. 1998 Generating green
fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells. Mech Dev. 76: 7990.
Hagell, P., Piccini, P., Björklund, A., Brundin, P.Rehncrona, S., Widner, H., Crabb, L., Oertel,
W.H., Quinn, N., Brooks, D.J., Lindvall, O. 2002 Dyskinesias following neural
transplantation in Parkinson's disease. Nat Neurosci. 5: 627-628.
Hagell, P., Schrag, A., Piccini, P., Jahanshahi, M., Brown, R., Rehncrona, S., Widner, H., Brundin,
P., Rothwell, J.C., Odin, P., Wenning, G.K., Morrish, P., Gustavii, B., Bjorklund, A., Brooks,
D.J., Marsden, C.D., Quinn, N.P., Lindvall, O. 1999 Sequential bilateral transplantation in
Parkinson's disease: effects of the second graft. Brain. 122: 1121-1132.
Haggiag, S., Zhang, P.L., Slutzky, G., Shinder, V., Kumar, A., Chebath, J., Revel, M. 2001
Stimulation of myelin gene expression in vitro and of sciatic nerve remyelination by
interleukin-6 receptor-interleukin-6 chimera. J Neurosci Res. 64: 564-574.
Halliwell, B., Jenner, P. 1998 Impaired clearance of oxidised proteins in neurodegenerative
diseases. Lancet 351:1510.
Hao, H.N., Zhao, J., Thomas, R.L., Parker, G.C., Lyman, W.D. 2003 Fetal human hematopoietic
stem cells can differentiate sequentially into neural stem cells and then astrocytes in vitro. J
Hematother Stem Cell Res. 12: 23-32.
Harada, H., Takahashi, E., Itoh, S., Harada, K., Hori, T.A., Taniguchi, T. 1994 Structure and
regulation of the human interferon regulatory factor 1 (IRF-1) and IRF-2 genes: implications
for a gene network in the interferon system. Mol Cell Biol. 14: 1500-1509.
Harik, S.I., Schmidley, J.W., Iacofano, L.A., Blue, P., Arora, P.K., Sayre, L.M. 1987 On the
mechanisms underlying 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine neurotoxicity: the
effect of perinigral infusion of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, its metabolite
and their analogs in the rat. J Pharmacol Exp Ther. 241:669-676.
Hauser, R.A., Freeman, T.B., Snow, B.J., Nauert, M., Gauger, L., Kordower, J.K., Olanow, C.W.
1999 Long-term evaluation of bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson disease. Arch
Neurol. 56: 179–187.
Heerssen, H.M., Segal, R.A. 2002 Location, location, location: a spatial view of neurotrophin
signal transduction. Trends Neurosci. 25: 160-165.
Henry, B., Crossman, A.R., Brotchie, J.M. 1998 Characterization of enhanced behavioral responses
to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model
of Parkinson's disease.Exp Neurol. 151:334-342.
207
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Hermann, A., Gastl, R., Liebau, S., Popa, M.O., Fiedler, J., Boehm, B.O., Maisel, M., Lerche, H.,
Schwarz, J., Brenner, R., Storch, A. 2004 Efficient generation of neural stem cell-like cells
from adult human bone marrow stromal cells. J Cell Sci; 117: 4411-22.
Herzog, E.L., Chai, L., Krause, D.S. 2003 Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood 102:
3483-3493.
Heubach, J.F., Graf, E.M., Leutheuser, J., Bock, M., Balana, B., Zahanich, I., Christ, T., Boxberger,
S., Wettwer, E., Ravens U. 2004 Electrophysiological properties of human mesenchymal
stem cells. J Physiol. 554(Pt 3):659-72.
Hochedlinger, K.,
Jaenisch, R. 2003 Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the
potential for cell therapy. N Engl J Med. 349: 275-286.
Hoffman, P.W., Chernak, J.M. 1995 DNA binding and regulatory effects of transcription factors
SP1 and USF at the rat amyloid precursor protein gene promoter. Nucleic Acids Res. 23:
2229-2235.
Holden, C. and Vogel, G. 2002 Plasticity: Time for a reappraisal? Science 296: 2126-2129.
Horellou, P., Vigne, E., Castel, M.N., Barneoud, P., Colin, P., Perricaudet, M., Delaere, P., Mallet,
J. 1994 Direct intracerebral gene transfer of an adenoviral vector expressing tyrosine
hydroxylase in rat model of Parkinson’s disease. Neuroreport 6:49-53.
Horsfield, J., Penton, A., Secombe, J., Hoffman, F.M., Richardson, H. 1998 Decapentaplegic is
required for arrest in G1 phase during Drosophila eye development. Development. 125:
5069-5078.
Hou, L., Cao, H., Wang, D., Wei, G., Bai, C., Zhang, Y., Pei, X. 2003 Induction of umbilical cord
blood mesenchymal stem cells into neuron-like cells in vitro. Int J Hematol. 78: 256-261.
Hromas, R,, Davis, B., Rauscher, F.J. 3rd, Klemsz, M., Tenen, D., Hoffman, S., Xu, D. Morris, J.F.
1996 Hematopoietic transcriptional regulation by the myeloid zinc finger gene, MZF-1. Curr
Top Microbiol Immunol. 211: 159-164.
Huang, D., Chen, S.W., Gudas, L.J.2002 Analysis of two distinct retinoic acid response elements in
the homeobox gene Hoxb1 in transgenic mice. Dev Dyn. 223: 353-370.
Huang, Y., Cheung, .L, Rowe, D., Halliday, G. 2004 Genetic contributions to Parkinson's disease.
Brain Res Brain Res Rev. 46: 44-70.
Hung, S.C., Chen, N.J., Hsieh, S.L., Li, H., Ma, H.L., Lo, W.H. 2002a Isolation and
characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow. Stem Cells. 20: 249258.
Hung, S.C., Cheng, H., Pan, C.Y., Tsai, M.J., Kao, L.S., Ma, H.L. 2002b In vitro differentiation of
size-sieved stem cells into electrically active neural cells. Stem Cells. 20: 522-529.
208
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Hunot, S., Brugg, B., Ricard, D., Michel, P.P., Muriel, M.P., Ruberg, M., Faucheux, B.A., Agid,
Y., Hirsch, E.C. 1997 Nuclear translocation of NF-kappaB is increased in dopaminergic
neurons of patients with parkinson disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 94:7531-7536.
Hwang, W.S., Roh, S.I., Lee, B.C., Kang, S.K., Kwon, D.K., Kim, S., Kim, S.J., Park, S.W., Kwon,
H.S., Lee, C.K., Lee, J.B., Kim, J.M., Ahn, C., Paek, S.H., Chang, S.S., Koo, J.J., Yoon,
H.S., Hwang, J.H., Hwang, Y.Y., Park, Y.S., Oh, S.K., Kim, H.S., Park, J.H., Moon, S.Y.,
Schatten, G. 2005 Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT
blastocysts. Science 308: 1777-1783.
Hwang, W.S., Ryu, Y.J., Park, J.H., Park, E.S., Lee, E.G., Koo, J.M., Jeon, H.Y., Lee, B.C., Kang,
S.K., Kim, S.J., Ahn, C., Hwang, J.H., Park, K.Y., Cibelli, J.B., Moon, SY. 2004 Evidence of
a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science 303:
1669-1674.
Hynes, M., Rosenthal, A. 1999 Specification of dopaminergic and serotonergic neurons in the
vertebrate CNS. Curr Opin Neurobiol. 9: 26-36.
Innis, S.M., de La Presa Owens, S. 2001 Dietary fatty acid composition in pregnancy alters neurite
membrane fatty acids and dopamine in newborn rat brain. J Nutr. 131: 118-122.
Isacson O. 2002 Models of repair mechanisms for future treatment modalities of Parkinson’s
disease. Brain Res. Bull. 57: 839-846.
Isacson O. 2003 The production and use of cells as therapeutic agents in neurodegenerative
diseases. Lancet Neurol. 2:417-424.
Ishida, Y., Hashiguchi, H., Todaka, K., Kuwahara, I., Ishizuka, Y., Nakane, H., Uchimura, D.,
Nishimori, T., Mitsuyama, Y. 1998 Serotonergic activity in the rat striatum after intrastriatal
transplantation of fetal nigra as measured by microdialysis. Brain Res. 788: 207-214.
Jaaro, H., Beck, G., Conticello, S.G., Fainzilber, M. 2001 Evolving better brains: a need for
neurotrophins? Trends Neurosci. 24: 79-85.
Jackson, K.A., Majka, S.M., Wang, H., Pocius, J., Hartley, C.J., Majesky, M.W., Entman, M.L.,
Michael, L.H., Hirschi, K.K., Goodell, M.A. 2001 Regeneration of ischemic cardiac muscle
and vascular endothelium by adult stem cells. J Clin Invest. 107: 1395-1402.
Jackson-Lewis, V., Vila, M., Djaldetti, R., Guegan, C., Liberatore, G., Liu, J., O'Malley, K.L.,
Burke, R.E., Przedborski, S. (2000) Developmental cell death in dopaminergic neurons of the
substantia nigra of mice. J Comp Neurol. 424: 476-488.
Javazon, E.H., Colter, D.C., Schwarz, E.J., Prockop, D.J. 2001 Rat marrow stromal cells are more
sensitive to plating density and expand more rapidly from single-cell-derived colonies than
human marrow stromal cells. Stem cells 19: 219-225.
209
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Jellinger, K., Linert, L., Kienzl, E., Herlinger, E., Youdim, M.B. 1995 Chemical evidence for 6hydroxydopamine to be an endogenous toxic factor in the pathogenesis of Parkinson's
disease.J. Neural Transm. Suppl.46: 297-314.
Jellinger, K., Linert, L., Kienzl, E., Herlinger, E., Youdim, M.B. 1995 Chemical evidence for 6hydroxydopamine to be an endogenous toxic factor in the pathogenesis of Parkinson's
disease.J. Neural Transm. Suppl.46: 297-314.
Jenner, P. 2000 Pathophysiology and biochemistry of dyskinesia: clues for the development of nondopaminergic treatments. J Neurol. 247 Suppl 2: II43-50.
Jenner, P., Dexter, D.T., Sian, J., Schapira, A.H., Marsden, C.D. 1992 Oxidative stress as a cause of
nigral cell death in Parkinson's disease and incidental Lewy body disease. The Royal Kings
and Queens Parkinson's Disease Research Group. Ann Neurol. 32 Suppl: S82-S87.
Jenner, P., Olanow, C.W. 1998 Understanding cell death in Parkinson's disease. Ann Neurol. 44(3
Suppl 1): S72-S84.
Jeong, J.A., Gang, E.J., Hong, S.H., Hwang, S.H., Kim, S.W., Yang, I.H., Ahn, C., Han, H., Kim
H. 2004 Rapid neural differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells.
Neuroreport. 15: 1731-1734.
Jiang, Y., Henderson, D., Blackstad, M., Chen, A., Miller, R.F., Verfaillie, C.M. 2003
Neuroectodermal differentiation from mouse multipotent adult progenitor cells. Proc Natl
Acad Sci U S A. 100(Suppl. 1): 11854-11860.
Jiang, Y., Jahagirdar, B.N., Reinhardt, R.L., Schwartz, R.E., Keene, C.D., Ortiz-Gonzalez, X.R.,
Reyes, M., Lenvik, T., Lund, T., Blackstad, M., Du, J., Aldrich, S., Lisberg, A., Low, W.C.,
Largaespada, D.A., Verfaillie CM. 2002a Pluripotency of mesenchmal stem cells derived
from adult marrow. Nature 418: 41-49.
Jiang, Y., Vaessen, B., Lenvik, T., Blackstad, M., Reyes, M., Verfaillie C.M. 2002b Multipotent
progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. Exp
Hematol. 30: 896-904.
Jiao, S., Wolff, JA. 1992 Long-term survival of autologous muscle grafts in rat brain. Neurosci
Lett. 137:207-210.
Jin, K., Mao, X.O., Batteur, S., Sun, Y., Greenberg, D.A. 2003 Induction of neuronal markers in
bone marrow cells: differential effects of growth factors and patterns of intracellular
expression. Exp Neurol. 184: 78-89.
Joannides, A., Gaughwin, P., Schwiening, C., Majed, H., Sterling, J., Compston, A., Chandran, S.
2004 Efficient generation of neural precursors from adult human skin: astrocytes promote
neurogenesis from skin-derived stem cells.Lancet 364: 172-178.
210
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Joannides, A., Gaughwin, P., Scott, M., Watt, S., Compston, A., Chandran S. 2003 Postnatal
astrocytes promote neural induction from adult human bone marrow-derived stem cells. J
Hematother Stem Cell Res. 12: 681-688.
Joh, T.H., Park, D.H., Reis, D.J. 1978 Direct phosphorylation of brain tyrosine hydroxylase by
cyclic AMP-dependent protein kinase: mechanism of enzyme activation. Proc Natl Acad Sci
U S A. 75: 4744-4748.
Jones, C.R., Arai, T., Rapoport, S.I. 1997 Evidence for the involvement of docosahexaenoic acid in
cholinergic stimulated signal transduction at the synapse. Neurochem Res. 22: 663-670.
Jori, F.P., Melone, M.A., Napolitano, M.A., Cipollaro, M., Cascino, A., Giordano, A., Galderisi, U.
2005a RB and RB2/p130 genes demonstrate both specific and overlapping functions during
the early steps of in vitro neural differentiation of marrow stromal stem cells. Cell Death
Differ. 12: 65-77.
Jori, F.P., Napolitano, M.A., Melone, M.A., Cipollaro, M., Cascino, A., Altucci, L., Peluso, G.,
Giordano, A., Galderisi, U. 2005b Molecular pathways involved in neural in vitro
differentiation of marrow stromal stem cells. J Cell Biochem. 94: 645-655.
Jori, F.P., Napolitano, M.A., Melone, M.A., Cipollaro, M., Cascino, A., Giordano, A., Galderisi, U.
2004 Role of RB and RB2/P130 genes in marrow stromal stem cells plasticity. J Cell
Physiol. 200: 201-212.
Joshi, C.V., Enver, T. 2002 Plasticity revisited. Curr Opin Cell Biol. 14: 749-755.
Joyner, A.L. 1996 Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development. Trends
Genet. 12: 15-20.
Joyner, A.L., Martin, G.R. 1987 En-1 and En-2, two mouse genes with sequence homology to the
Drosophila engrailed gene: expression during embryogenesis. Genes Dev. 1: 29-38.
Kabos, P., Ehtesham, M., Kabosova, A., Black, K.L., Yu, J.S. 2002 Generation of neural progenitor
cells from whole adult bone marrow. Exp Neurol. 178: 288–293.
Kalir, H.H., Mytilineou, C. 1991 Ascorbic acid in mesencephalic cultures: effects on dopaminergic
neuron development. J Neurochem. 57: 458-464.
Kang, S.K., Lee, D.H., Bae, Y.C., Kim, H.K., Baik, S.Y., Jung, J.S. 2003 Improvement of
neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal
cells after cerebral ischemia in rats. Exp Neurol. 183: 355-366.
Kannari, K., Yamato, H., Shen, H., Tomiyama, M., Suda, T., Matsunaga, M. 2001 Activation of 5HT(1A) but not 5-HT(1B) receptors attenuates an increase in extracellular dopamine derived
from exogenously administered L-DOPA in the striatum with nigrostriatal denervation. J
Neurochem. 76: 1346-1353.
211
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Kassem, M., Burns, J.S. 2005 Adult stem cells and cancer. Cancer Res. 65:9601.
Katsuki, H., Akino, N., Okuda, S., Saito, H. 1995 Antioxidants, but not cAMP or high K+, prevent
arachidonic acid toxicity on neuronal cultures. Neuroreport. 6: 1101-1104.
Kaufman, D.S., Hanson, E.T., Lewis, R.L., Auerbach, R. Thomson, J.A. 2001 Hematopoietic
colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A.
98: 10716-10721.
Kawaguchi, A., Miyata, T., Sawamoto, K., Takashita, N., Murayama, A., Akamatsu, W., Ogawa,
M., Okabe, M., Tano, Y., Goldman, S.A., Okano, H. 2001 Nestin-EGFP transgenic mice:
visualization of the self-renewal and multipotency of CNS stem cells. Mol Cell Neurosci. 17:
259-73.
Kawasaki, H., Mizuseki, K., Nishikawa, S., Kaneko, S., Kuwana, Y., Nakanishi, S., Nishikawa, S.I,
Sasai, Y. 2000. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell–
derived inducing activity. Neuron 28: 31-40.
Kawasaki, H., Suemori, H., Mizuseki, K., Watanabe, K., Urano, F., Ichinose, H., Haruta, M.,
Takahashi, M., Yoshikawa, K., Nishikawa, S., Nakatsuji, N., Sasai, Y. 2002 Generation of
dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived
inducing activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 99: 1580-1585.
Kazama, H., Kodera, T., Shimizu, S., Mizoguchi, H., Morishita, K. 1999 Ecotropic viral integration
site-1 is activated during, and is sufficient for, neuroectodermal P19 cell differentiation. Cell
Growth Differ. 10: 565-573.
Keene, C.D., Ortiz-Gonzalez, X.R., Jiang, Y., Largaespada, D.A., Verfaillie, C.M., Low, W.C.
2003 Neural differentiation and incorporation of bone marrow-derived multipotent adult
progenitor cells after single cell transplantation into blastocyst stage mouse embryos. Cell
Transplant. 12: 201-213.
Kessler, M.A., Yang, M., Gollomp, K.L., Jin, H., Iacovitti, L. 2003 The human tyrosine
hydroxylase gene promoter. Brain Res Mol Brain Res. 112: 8-23.
Kim, H.Y., Akbar, M., Lau, A., Edsal, L. 2000 Inhibition of neuronal apoptosis by
docosahexaenoic acid (22:6n-3). Role of phosphatidylserine in antiapoptotic effect. J Biol
Chem. 275: 35215-35223.
Kim, J.H., Auerbach, J.M, Rodríguez-Gómez, J.A., Velasco, .I, Gavin, D., Lumelsky, N., Lee,
S.H., Nguyen, J., Sanchez-Pernaute, R., Bankiewicz, K., McKay, R. 2002 Dopamine neurons
derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson's disease.
Nature 418: 50-56.
212
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Kim, J.H., Hui, P., Yue, D et al. 1998 Identification of candidate target genes for EVI-1, a zinc
finger oncoprotein, using a novel selection strategy. Oncogene 17: 1527-1538.
Kim, K.S., Kim, C.H., Hwang, D.Y., Seo, H., Chung, S., Hong, S.J., Lim, J.K., Anderson, T.,
Isacson, O. 2003 Orphan nuclear receptor Nurr1 directly transactivates the promoter activity
of the tyrosine hydroxylase gene in a cell-specific manner. J Neurochem. 85: 622-634.
Kimura, H., Weisz, A., Ogura, T. et al. 2001 Identification of hypoxia-inducible factor 1 ancillary
sequence and its function in vascular endothelial growth factor gene induction by hypoxia
and nitric oxide. J Biol Chem. 276: 2292-2298.
Kirik, D., Georgievska, B., Bjorklund, A. 2004 Localized striatal delivery of GDNF as a treatment
for Parkinson disease. Nat Neurosci. 7: 105-110.
Kitada, T., Asakawa, S., Hattori, N., Matsumine, H., Yamamura, Y., Minoshima, S., Yokochi, M.,
Mizuno, Y., Shimizu, N. 1998 Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive
juvenile parkinsonism. Nature 392:605-608.
Koblar, S.A., Murphy, M., Barrett, G.L., Underhill, A., Gros, P., Bartlett, P.F. 1999 Pax-3 regulates
neurogenesis in neural crest-derived precursor cells. J Neurosci Res. 56: 518-530.
Kohyama, J., Abe, H., Shimazaki, T., Koizumi, A., Nakashima, K., Gojo, S., Taga, T., Okano, H.,
Hata, J., Umezawa A.. 2001 Brain from bone: Efficient “meta-differentiation” of marrow
stroma-derived mature osteoblasts to neurons with Noggin or a demethylating agent.
Differentiation 68: 235-244.
Kondo, T., Johnson, S.A., Yoder, M.C., Romand, R., Hashino, E. 2005 Sonic hedgehog and
retinoic acid synergistically promote sensory fate specification from bone marrow-derived
pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102: 4789-4794.
Kopen, G.C., Prockop, D.J., Phinney, D.G. 1999 Marrow stromal cells migrate throughout
forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal
mouse brains. Proc Natl Acad Sci U S A. 96: 10711–10716.
Kopin, I.J. 1987 MPTP: an industrial chemical and contaminant of illicit narcotics stimulates a new
era in research on Parkinson's disease. Environ Health Perspect. 75: 45-51.
Kordower, J.H., Freeman, T.B., Chen, E.Y, Mufson, E.J., Sanberg, P.R., Hauser, R.A., Snow, B.,
Olanow, C.W. 1998 Fetal nigral grafts survive and mediate clinical benefit in a patient with
Parkinson's disease. Mov Disord. 13: 383–393.
Kordower, J.H., Freeman, T.B., Snow, B.J., Vingerhoets, F.J.G., Mufson, E.J., Sanberg, P.R.,
Hauser, R.A., Smith, D.A., Nauert, G.M., Perl, D.P., Olanow, C.W. 1995 Neuropathological
evidence of graft survival and striatal reinnervation after the transplantation of fetal
mesencephalic tissue in a patient with Parkinson's disease. N Engl J Med 332: 1118–1124.
213
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Kordower, J.H., Rosenstein, J.M., Collier, T.J., Burke, M.A., Chen, E.Y., Li, J.M., Martel, L.,
Levey, A.E., Mufson, E.J., Freeman, T.B., Olanow, C.W. 1996 Functional fetal nigral grafts
in a patient with Parkinson's disease: chemoanatomic, ultrastructural, and metabolic studies. J
Comp Neurol. 370 : 203-230.
Kornack, D.R., Rakic, P. 2001 Cell proliferation without neurogenesis in adult primate neocortex.
Science 294: 2127-2130.
Kotobuki, N., Hirose, M., Takakura, Y., Ohgushi, H. 2004 Cultured autologous human cells for
hard tissue regeneration: preparation and characterization of mesenchymal stem cells from
bone marrow. Artif Organs. 28: 33-39.
Krause, D.S. 2002 Plasticity of marrow-derived stem cells. Gene Ther. 9: 754-758.
Kruttgen, A., Saxena, S., Evangelopoulos, M.E., Weis, J. 2003 Neurotrophins and
neurodegenerative diseases: receptors stuck in traffic? J Neuropathol Exp Neurol. 2003 62:
340-350.
Kuhn, H.G., Winkler, J., Kempermann, G., Thal, L.J. Gage, F.H. 1997 Epidermal growth factor and
fibroblast growth factor-2 have different effects on neural progenitors in the adult rat brain. J.
Neurosci. 17: 5820–5829.
Kuramoto, N., Baba, K., Gion, K., Sugiyama, C., Taniura, H., Yoneda, Y. 2003 Xenobiotic
response element binding enriched in both nuclear and microsomal fractions of rat
cerebellum. J Neurochem. 85: 264-273.
Labat, M.L., Milhaud, G., Pouchelet, M., Boireau, P. 2000 On the track of a human circulating
mesenchymal stem cell of neural crest origin. Biomed Pharmacother. 54: 146-62.
Lagasse, E., Connors, H., Al Dhalimy, M., Reitsma, M., Dohse, M., Osborne, L., Wang, X.,
Finegold, M., Weissman, I.L., Grompe, M. 2000 Purified hematopoietic stem cells can
differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 6: 1229-1234.
Lang, A.E., Lozano, A.M. 1998 Parkinson's disease. N Engl J Med. 339:1044-1053, 1130-1143.
Lang, A.E., Obeso, J.A. 2004 Challenges in Parkinson's disease: restoration of the nigrostriatal
dopamine system is not enough. Lancet Neurol. 3:309-316.
Langston, J.W. 2005 The promise of stem cells in Parkinson disease. J Clin Invest. 115: 23-25.
Langston, J.W., Ballard, P., Tetrud, J.W., Irwin, I. 1983 Chronic Parkinsonism in humans due to a
product of meperidine-analog synthesis. Science 219:979-980.
Lantz, K.A., Kaestner, K.H. 2005 Winged-helix transcription factors and pancreatic development.
Clin Sci (Lond). 108: 195-204.
Law, S.W., Conneely, O.M., DeMayo, F.J., O'Malley, B.W. 1992 Identification of a new brainspecific transcription factor, NURR1. Mol Endocrinol. 6: 2129-2135.
214
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Le, W., Conneely, O.M., Zou, L., He, Y., Saucedo-Cardenas, O., Jankovic, J., Mosier, D.R., Appel,
SH. 1999 Selective agenesis of mesencephalic dopaminergic neurons in Nurr1-deficient
mice. Exp Neurol. 159: 451-458.
Lebel, M., Gauthier, Y., Moreau, A., Drouin, J. 2001 Pitx3 activates mouse tyrosine hydroxylase
promoter via a high-affinity binding site. J Neurochem. 77: 558-567.
Lee, J., Elkahloun, A.G., Messina, S.A., Ferrari, N., Xi, D., Smith, C.L., Cooper, R. Jr., Albert,
P.S., Fine, H.A. 2003 Cellular and genetic characterization of human adult bone marrowderived neural stem-like cells: a potential antiglioma cellular vector. Cancer Res. 63: 88778889.
Lee, R.H., Kim, B., Choi, I., Kim, H., Choi, H.S., Suh, K., Bae, Y.C., Jung, J.S. 2004
Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone
marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14: 311-324.
Lee, S.H., Lumelsky, N., Studer, L., Auerbach, J.M., McKay, R.D. 2000 Efficient generation of
midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 18: 675679.
Lee, Y.J., Emily Shacter, E. 1997 Bcl-2 does not protect Burkitt's lymphoma cells from oxidantinduced cell death. Blood 89: 4480-4492.
Leist, M., Nicotera, P. 1998 Apoptosis, excitotoxicity, and neuropathology. Exp Cell Res. 239:
183-201.
Lemischka I. 2002 A few thoughts about the plasticity of stem cell. Exp Hematol. 30: 848-852.
Leroy, E., Boyer, R., Auburger, G., Leube, B., Ulm, G., Mezey, E., Harta, G., Brownstein, M.J.,
Jonnalagada, S., Chernova, T., Dehejia, A., Lavedan, C., Gasser, T., Steinbach, P.J.,
Wilkinson, K.D., Polymeropoulos, M.H. 1998 The ubiquitin pathway in Parkinson's disease.
Nature 395:451-452.
Levesque, M.F., Neuman, T. 2002a Autologous transplantation of adult human neural stem cells
and differentiated dopaminergic neurons for Parkinson’s disease: A one year post-operative
clinical outcome. The 70TH annual meeting of the American association of neurological
surgeons, Chicago, Illinois, USA, April 2002.
Levesque, M.F., Neuman, T. 2002b Autologous transplantation of adult human neural stem cells
and differentiated dopaminergic neurons for Parkinson’s disease: Long term post-operative
clinical and functional metabolic results. Exp Neurol. 175: 425. (8TH international conference
on neural transplantation and repair, Keystone, Colorado, USA, June 2002).
Levy, Y.S., Bulvik, S., Burshtein, A., Barhum, Y., Melamed, E., Offen, D. Bone marrow stem
cells: possible source for cell therapy in Parkinson's disease. In: Hanin, I., Cacabelos, R.,
215
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Fisher, A., editors. Progress in Alzheimer's and Parkinson's disease. Abingdon, United
Kingdom: Taylor & Francis Group; 2005. p. 45-51.
Levy, Y.S., Gilgun-Sherki, Y., Melamed, E., Offen, D. 2005 Therapeutic potential of neurotrophic
factors in neurodegenerative diseases. BioDrugs. 19: 97-127.
Levy, Y.S., Merims, D., Panet, H., Barhum, Y., Melamed, E., Offen, D. 2003 Induction of neuronspecific enolase promoter and neuronal markers in differentiated mouse bone marrow
stromal cells. J Mol Neurosci. 21: 121-132.
Levy, Y.S., Stroomza, M., Melamed, E., Offen, D. 2004 Embryonic and adult stem cells as a source
for cell therapy in Parkinson's disease. J Mol Neurosci. 24: 353-386.
Li, G.R., Sun, H., Deng, X., Lau, C.P. 2005 Characterization of ionic currents in human
mesenchymal stem cells from bone marrow. Stem Cells. 23 : 371-382.
Li, H., Liu, H., Heller, S. 2003 Pluripotent stem cells from the adult mouse inner ear. Nat Med. 9:
1293-1299.
Li, L., Mignone, J., Yang M, Mati.c M, Penman, S., Enikolopov, G., Hoffman, R.M. 2003 Nestin
expression in hair follicle sheath progenitor cells.roc Natl Acad Sci U S A. 100: 9958-9961.
Li, T.Y., Shu, C., Wong, C.H., Lo, P.S., Zhu, H., Lau, M.C., Chan, M.Y., Tsang, L.L., Gou,Y.L.,
Chung, Y.W., Chan, H.C. 2004 Plasticity of rat bone marrow-derived 5-hydroxytryptaminesensitive neurons: dedifferentiation and redifferentiation. Cell Biol Int. 28: 801-807.
Li, X., Xu, J., Bai, Y., Wang, X, Dai, X., Liu, Y., Zhang, J., Zou, J., Shen, L.2005 Isolation and
characterization of neural stem cells from human fetal striatum. Biochem Biophys Res
Commun. 326:425-434.
Li, Y., Chen, J., Chen, X.G., Wang, L., Gautam, S.C., Xu, Y.X., Katakowski, M., Zhang, L.J., Lu,
M., Janakiraman, N., Chopp, M. 2002 Human marrow stromal cell therapy for stroke in rat:
neurotrophins and functional recovery. Neurology 59: 514-523.
Li, Y., Chen, J., Wang, L., Lu, M., Chopp, M. 2001a Treatment of stroke in rat with intracarotid
administration of marrow stromal cells. Neurology 56: 1666–1672.
Li, Y., Chen, J., Wang, L., Zhang, L., Lu, M., Chopp, M. 2001b Intracerebral transplantation of
bone marrow stromal cells in a 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model
of Parkinson’s disease. Neurosci Lett. 316: 67-70.
Lie, D.C., Dziewczapolski, G., Willhoite, A.R., Kaspar, B.K., Shults, C.W., Gage F.H. 2002 The
adult substantia nigra contains progenitor cells with neurogenic potential. J Neurosci. 22:
6639-6649.
Lin, L.F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S., Collins, F. 1993 GDNF: A glial cell line-derived
neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260:1130-1132.
216
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Lindahl, R., Evces, S., 1984 Rat liver aldehyde dehydrogenase. II. Isolation and characterization of
four inducible isozymes. J Biol Chem. 259: 11991-11996.
Lindner, M.D., Winn, S.R., Baetge, E.E., Hammang, J.P., Gentile, F.T., Doherty, E., McDermott,
P.E., Frydel, B., Ullman, M.D., Schallert, T., Emerich D.F. 1995 Implantation of
encapsulated catecholamine and GDNF-producing cells in rats with unilateral dopamine
depletions and parkinsonian symptoms. Exp Neurol. 132: 62-76.
Lindvall, O. 2003 Stem cells for therapy in Parkinson’s disease. Pharmacol. Res. 47: 279-287.
Lindvall, O., Backlund, E.O., Farde, L., Sedvall, G., Freedman, R., Hoffer, B., Nobin, A., Seiger,
A., Olson L. 1987 Transplantation in Parkinson's disease: two cases of adrenal medullary
grafts to the putamen. Ann Neurol. 22 :457-468.
Lindvall, O., Brundin, P., Widner, H., Rehncrona, S., Gustavii, B., Frackowiak, R., Leenders, K.L.,
Sawle, G., Rothwell, J.C., Marsden, C.D. 1990 Grafts of fetal dopamine neurons survive and
improve motor function in Parkinson's disease. Science 247(4942):574-577.
Lindvall, O., Hagell, P. 2002a Cell replacement therapy in human neurodegenerative disorders.
Clin. Neurosci. Res. 2: 86-92.
Lindvall, O., Hagell, P. 2002b Role of cell therapy in Parkinson disease. Neurosurg Focus. 13: 1-9.
Lindvall, O., Rehncrona, S., Gustavii, B., Brundin, P., Astedt, B., Widner, H., Lindholm, T.,
Bjorklund, A., Leenders, K.L., Rothwell, J.C. 1988 Fetal dopamine-rich mesencephalic grafts
in Parkinson's disease. Lancet. 8626-8627:1483-1484.
Lindvall, O., Sawle, G., Widner, H., Rothwell, J.C., Björklund, A., Brooks, D., Brundin, P.,
Frackowiak, R., Marsden, C.D., Odin, P., Rehncrona, S. 1994 Evidence for long-term
survival and function of dopaminergic grafts in progressive Parkinson's disease. Ann Neurol.
35: 172–180.
Ling, E.A., Wong, W.C. 1993 The origin and nature of ramified and amoeboid microglia: a
historical review and current concepts. Glia 7: 9-18.
Ling, Z., Potter, E.D., Lipton, J.W., Carvey, P.M. 1998 Differentiation of mesencephalic progenitor
cells into dopaminergic neurons by cytokines. Exp Neurol. 149: 411–423.
Locatelli, F., Corti, S., Donadoni, C., Guglieri, M., Capra, F., Strazzer, S., Salani, S., Del Bo, R.,
Fortunato, F., Bordoni, A., Comi, GP. 2003 Neuronal differentiation of murine bone marrow
Thy-1- and Sca-1-positive cells. J Hematother Stem Cell Res. 12: 727-734.
Long, X., Olszewski, M., Huang, W., Kletzel, M. 2005 Neural cell differentiation in vitro from
adult human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 14: 65-69.
217
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Lu, D., Li, Y., Mahmood, A., Wang, L., Rafiq, T., ChoppM. 2002 Neural and marrow-derived
stromal cell sphere transplantation in a rat model of traumatic brain injury. J Neurosurg. 97:
935-940.
Lu, D., Li, Y., Wang, L., Chen, J., Mahmood, A., ChoppM. 2001a Intraarterial administration of
marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma. 18, 813-819.
Lu, D., Mahmood, A., Wang, L., Li, Y., Lu, M., Chopp M. 2001b Adult bone marrow stromal cells
administered intravenously to rats after traumatic brain injury migrate into brain and improve
neurological outcome. Neuroreport. 12: 559-563.
Lu, P., Blesch, A., Tuszynski, M.H. 2004 Induction of bone marrow stromal cells to neurons:
differentiation, transdifferentiation, or artifact? J Neurosci Res. 77: 174-191.
Lucking, C.B., Durr, A., Bonifati, V., Vaughan, J., De Michele, G., Gasser, T., Harhangi, B.S.,
Meco, G., Denefle, P., Wood, N.W., Agid, Y., Brice, A. 2000 Association between earlyonset Parkinson's disease and mutations in the parkin gene. French Parkinson's Disease
Genetics Study Group. N Engl J Med. 342:1560-1567.
Luskin, M.B. 1993 Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived
from the forebrain subventricular zone. Neurons 11: 173-189.
Lynch, D.R., Dawson, T.M. 1994 Secondary mechanisms in neuronal trauma. Curr Opin Neurol. 7:
510-516.
Maden, M. 2002 Retinoid signalling in the development of the central nervous system. Nat Rev
Neurosci. 3: 843-853.
Maeda, T., Cheng, N., Kume, T., Kaneko, S., Kouchiyama, H., Akaike, A., Ueda, M., Satoh, M.,
Goshima, Y., Misu, Y. 1997 L-DOPA neurotoxicity is mediated by glutamate release in
cultured rat striatal neurons. Brain Res. 771:159-162.
Mahalik, T.J., Hahn, W.E., Clayton, G.H., Owens, G.P. 1994 Programmed cell death in developing
grafts of fetal substantia nigra. Exp Neurol. 129: 27-36.
Mahmood, A., Lu, D., Wang, L., Li, Y., Lu, M., Chopp, M. 2001 Treatment of traumatic brain
injury in female rats with intravenous administration of bone marrow stromal cells.
Neurosurgery 49, 1196–1204.
Makino, S., Fukuda, K., Miyoshi, S., Konishi, F., Kodama, H., Pan, J., Sano, M., Takahashi, T.,
Hori, S., Abe, H., Hata, J., Umezawa, A., Ogawa, S.1999 Cardiomyocytes can be generated
from marrow stromal cells in-vitro. J. Clin. Invest. 103: 697-705.
Maries, E., Dass, B., Collier, T.J., Kordower, J.H., Steece-Collier, K. 2003 The role of alphasynuclein in Parkinson's disease: insights from animal models. Nat Rev Neurosci. 4: 727738.
218
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Markus, A., Patel, T.D., Snider, W.D. 2002 Neurotrophic factors and axonal growth. Curr Opin
Neurobiol. 12: 523-531.
Maroteaux, L., Campanelli, J.T., Scheller, R.H. 1988 Synuclein: a neuron-specific protein localized
to the nucleus and presynaptic nerve terminal. J. Neurosci. 8:2804-2815.
Martin, G.R. 1981 Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in
medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 78: 76347638.
Martin, J.F., Schwarz, J.J Olson, E.N. 1993 Myocyte enhancer factor (MEF) 2C: a tissue-restricted
member of the MEF-2 famaly of transcription factors. Proc Natl Acad Sci USA . 90: 52825286.
Martin, M.J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. 2005 Human embryonic stem cells express an
immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11: 228-232.
Martinou, J.C., Dubois-Dauphin, M., Staple, J.K., Rodriguez, I., Frankowski, H., Missotten, M.,
Albertini, P., Talabot, D., Catsicas, S., Pietra, C. 1994
Overexpression of BCL-2 in
transgenic mice protects neurons from naturally occurring cell death and experimental
ischemia. Neuron. 13: 1017-1030.
Maruyama, W., Akao, Y., Carrillo, M.C., Kitani, K., Youdium, M.B., Naoi, M. 2002
Neuroprotection by propargylamines in Parkinson's disease: suppression of apoptosis and
induction of prosurvival genes. Neurotoxicol Teratol. 24:675-82.
Mastick, G.S., Davis, N.M., Andrew, G.L., Easter, S.S. Jr. 1997 Pax-6 functions in boundary
formation and axon guidance in the embryonic mouse forebrain. Development. 124:19851997.
Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, BL. 1992 Derivation of pluripotential embryonic stem cells from
murine primordial germ cells in culture. Cell 4: 841-847.
Matsui, Y., Zsebo, K., Hogan, BL. 1992 Derivation of pluripotential embryonic stem cells from
murine primordial germ cells in culture. Cell 4: 841-847.
McCaffery, P.J., Adams, J., Maden, M., Rosa-Molinar, E. 2003 Too much of a good thing: retinoic
acid as an endogenous regulator of neural differentiation and exogenous teratogen. Eur J
Neurosci. 18: 457-472.
McDermott, J.C., Cardoso, M.C., Yu, Y.T., Andres, V., Leifer, D., Krainc, D., Lipton, S.A., NadalGinard, B. 1993 hMEF2C gene encodes skeletal muscle- and brain-specific transcription
factors. Mol. Cell Biol. 13: 2564-2577.
McGeer, P.L., Kawamata, T., Walker, D.G., Akiyama, H., Tooyama, I., McGeer, E.G. 1993
Microglia in degenerative neurological disease. Glia.7: 84-92.
219
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Medvinsky, A., Smith, A. 2003 Stem cells: Fusion brings down barriers. Nature 422: 823-825.
Meirelles, Lda S., Nardi, N.B. 2003 Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in
vitro expansion, and characterization. Br J Haematol.123: 702-711.
Mendez, I., Dagher, A., Hong, M., Hebb, A., Gaudet, P., Law, A., Weerasinghe, S., King, D.,
Desrosiers, J., Darvesh, S., Acorn, T., Robertson, H. 2000 Enhancement of survival of stored
dopaminergic cells and promotion of graft survival by exposure of human fetal nigral tissue
to glial cell line-derived neurotrophic factor in patients with Parkinson's disease. J
Neurosurg. 92: 863–869.
Merims, D., Ziv I., Djaldetti R. Melamed, E. 1999 Riluzole for levodopa- induced dyskinesias in
advanced Parkinson’s disease. Lancet 353: 1764-1765.
Merims, D., Ziv, I., Sherki, Y., Djaldetti R, Melamed, E. 2001 The role of glutamatergic
transmission in the pathogenesis of levodopa-induced dyskinesias. Potential therapeutic
approaches. Neurol. Neurochir. Pol. 35(Suppl 3):65-68.
Mezey, E., Chandross, K.J., Harta, G., Maki, R.A., McKercher S.R. 2000 Turning blood into brain:
Cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science 290: 17791782.
Mezey, E., Key, S., Vogelsang, G., Szalayova, I., Lange, G.D., Crain B. 2003 Transplanted bone
marrow generates new neurons in human brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 1364-1369.
Miller, G.W., Gainetdinov, R.R., Levey, A.I., Caron, M.G. 1999 Dopamine transporters and
neuronal injury. Trends Pharmacol Sci. 20: 424–429.
Minasi, M.G., Riminucci M., De Angelis L., Borello, U., Berarducci, B., Innocenzi, A., Caprioli,
A., Sirabella, D., Baiocchi, M., De Maria, R., Boratto, R., Jaffredo, T., Broccoli, V., Bianco,
P., Cossu, G. 2002 The meso-angioblast: a multipotent, self-renewing cell that originates
from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Development 129:
2773–2783.
Mizuseki, K., Sakamoto, T., Watanabe, K., Muguruma, K., Ikeya, M., Nishiyama, A., Arakawa, A.,
Suemori, H., Nakatsuji, N., Kawasaki, H., Murakami, F., Sasai, Y. 2003 Generation of neural
crest-derived peripheral neurons and floor plate cells from mouse and primate embryonic
stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 5828-5833.
Montero-Menei, C.N., Tatard, V., Schiller, P., Menei, P., Benoit, J.P., D'Ippolito, G. 2004
Dopaminergic differentiation of human marrow- isolated adult multilineage inducible cells
for cell therapy. The 2nd annual meeting of the International Society for Stem Cell Research
(ISSCR), Boston, Massachusetts, USA, June 10-13. (Poster 395).
220
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Moore, S.A. 2001 Polyunsaturated fatty acid synthesis and release by brain-derived cells in vitro. J
Mol Neurosci. 16:195-200.
Morizane, A., Takahashi, J., Takagi, Y., Sasai, Y., Hashimoto, N. 2002 Optimal conditions for in
vivo induction of dopaminergic neurons from embryonic stem cells through stromal cellderived inducing activity. J Neurosci. Res. 69: 934-939.
Morrison, S.J., White, P.M., Zock, C. Anderson, D.J. 1999 Prospective identification, isolation by
flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.
Cell 96: 737–749.
Mullen, R.J., Buck, C.R., Smith, A.M. 1992 NeuN, a neuronal specific nuclear protein in
vertebrates. Development 116: 201-211.
Muller T. 2001 Non-dopaminergic drug treatment of Parkinson's disease. Expert Opin
Pharmacother. 2 :557-572.
Munoz-Elias, G., Marcus, A.J., Coyne, T.M., Woodbury, D., Black, I.B. 2004 Adult bone marrow
stromal cells in the embryonic brain: engraftment, migration, differentiation, and long-term
survival. J Neurosci. 24: 4585-4595.
Munoz-Elias, G.., Woodbury, D., Black, I.B. 2003 Marrow stromal cells, mitosis, and neuronal
differentiation: stem cell and precursor functions. Stem Cells 21: 437-448.
Munoz-Sanjuan, I., Brivanlou, A.H. 2002 Neural induction, the default model and embryonic stem
cells. Nat Rev Neurosci. 3: 271–280.
Mytilineou, C., Walker; R.H., JnoBaptiste, R., Olanow, C.W. 2003 Levodopa is toxic to dopamine
neurons in an in vitro but not an in vivo model of oxidative stress. J. Pharmacol. Exp. Ther.
304: 792-800.
Nakatomi, H., Kuriu, T., Okabe, S., Yamamoto, S., Hatano, O., Kawahara, N., Tamura, A., Kirino,
T., Nakafuku M.. 2002 Regeneration of hippocampal pyramidal neurons after ischemic brain
injury by recruitment of endogenous neural progenitors. Cell 110: 429-441.
Nash, J.E., Fox, S.H., Henry, B., Hill, M.P., Peggs, D., McGuire, S., Maneuf, Y., Hille, C.,
Brotchie, J.M., Crossman, A.R. 2000 Antiparkinsonian actions of ifenprodil in the MPTPlesioned marmoset model of Parkinson's disease. Exp Neurol 165:136-142.
Neuhuber, B., Gallo, G., Howard, L., Kostura, L., Mackay, A., Fischer, I. 2004 Reevaluation of in
vitro differentiation protocols for bone marrow stromal cells: disruption of actin cytoskeleton
induces rapid morphological changes and mimics neuronal phenotype. J Neurosci Res. 77:
192-204.
Newton, A., Mackay, J., Crossley, M.J. 2001 The N-terminal zinc finger of the erythroid
transcription factor GATA-1 binds GATC motifs in DNA. J Biol Chem. 276: 35794-35801.
221
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Nicholson, S.L., Brotchie, J.M. 2002 5-hydroxytryptamine (5-HT, serotonin) and Parkinson's
disease - opportunities for novel therapeutics to reduce the problems of levodopa therapy.
Eur J Neurol. 9 Suppl 3: 1-6.
Nishimura, F., Yoshikawa, M., Kanda, S., Nonaka, M., Yokota, H., Shiroi, A., Nakase, H.,
Hirabayashi, H., Ouji, Y., Birumachi, J., Ishizaka, S., Sakaki, T. 2003 Potential use of
embryonic stem cells for the treatment of mouse parkinsonian models: improved behavior by
transplantation of in vitro differentiated dopaminergic neurons from embryonic stem cells.
Stem Cells 21: 171-180.
Nutt, J.G., Burchiel K.J., Comella, C.L., Jankovic, J., Lang, A.E., Laws, E.R. Jr., Lozan,o A.M.,
Penn, R.D., Simpson, R.K. Jr., Stacy, M., Wooten, G.F. 2003 ICV GDNF Study Group
Implanted intracerebroventricular. Glial cell line-derived neurotrophic factor. Randomized,
double-blind trial of glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) in PD. Neurology 60:
69-73.
Odorico, J.S., Kaufman, D.S., Thomson, J.A. 2001 Multilineage differentiation from human
embryonic stem cell lines. Stem Cells 19: 193-204.
Offen, D., Beart, P.M., Cheung, N.S., Pascoe, C.J., Hochman, A., Gorodin, S., Melamed, E.,
Bernard, R., Bernard, O. 1998 Transgenic mice expressing human Bcl-2 in their neurons are
resistant
to
6-hydroxydopamine
and
1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine
neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 5789-5794.
Offen, D., Kaye, J.F, Bernard, O., Merims, D., Coire, C.I., Panet, H., Melamed, E., Ben-Nun, A.
2000 Mice overexpressing Bcl-2 in their neurons are resistant to myelin oligodendrocyte
glycoprotein (MOG)-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Mol.
Neurosci. 15: 167-176.
Offen, D., Ziv, I., Barzilai, A., Gorodin, S., Glater, E., Hochman, A., Melamed, E. 1997 Dopaminemelanin induces apoptosis in PC12 cells; possible implications for the etiology of Parkinson's
disease. Neurochem Int. 31:207-216.
Offen, D., Ziv, I., Panet, H., Wasserman, L., Stein, R., Melamed, E., Barzilai, A. 1997 Dopamineinduced apoptosis is inhibited in PC12 cells expressing Bcl-2. Cell Mol Neurobiol. 17: 289304.
Offen, D., Ziv, I., Sternin, H., Melamed, E., Hochman, A. 1996 Prevention of dopamine-induced
cell death by thiol antioxidants: possible implications for treatment of Parkinson's disease.
Exp Neurol. 141:32-39.
Ogawa, N. 1994 Levodopa and dopamine agonists in the treatment of Parkinson's disease:
advantages and disadvantages. Eur Neurol. 34 Suppl 3:20-28.
222
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Ogawa, N., Tanaka, K., Asanuma, M., Kawai, M., Masumizu, T., Kohno, M., Mori, A. 1994
Bromocriptine protects mice against 6-hydroxydopamine and scavenges hydroxyl free
radicals in vitro. Brain Res. 657:207-213.
Okano H. 2002a Stem cell biology of the central nervous system. J Neurosci Res. 69: 698-707.
Olanow, C.W., Goetz, C.G., Kordower, J.H., Stoessl, A.J., Sossi, V., Brin, M.F., Shannon, K.M.,
Nauert, G.M., Perl, D.P., Godbold, J., Freeman, T.B. 2003 A double-blind controlled trial of
bilateral fetal nigral transplantation in Parkinson's disease. Ann Neurol. 54; 403-414.
Olanow, C.W., Koller, W., Goetz, C.G., Stebbins, G.T., Cahill, D.W., Gauger, L.L., Morantz, R.,
Penn, R.D., Tanner, C.M., Klawans, H.L. 1990 Autologous transplantation of adrenal
medulla in Parkinson's disease. 18-month results. Arch Neurol. 47:1286-1289.
Olanow, C.W., Tatton, W.G. 1999 Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease. Annu Rev
Neurosci.22:123-144.
Orlic, D., Kajstura, J., Chimenti, S., Jakoniuk, I., Anderson, S.M., Li, B., Pickel, J., McKay, R.,
Nadal-Ginard, B., Bodine, D.M., Leri, A., Anversa, P. 2001 Bone marrow cells regenerate
infarcted myocardium. Nature. 410: 701-705.
Padovan, C.S., Jahn, K., Birnbaum T., Reich, P., Sostak, P., Strupp, M., Straube, A. 2003
Expression of neuronal markers in differentiated marrow stromal cells and CD133+ stem-like
cells. Cell Transplant. 12: 839-848.
Paisan-Ruiz, C., Jain, S., Evans, E.W., Gilks, W.P., Simon, J., van der Brug, M., de Munain, A.L.,
Aparicio, S., Gil, A.M., Khan, N., Johnson, J., Martinez, J.R., Nicholl, D., Carrera, I.M.,
Pena, A.S., de Silva, R., Lees, A., Marti-Masso, J.F., Perez-Tur, J., Wood, N.W., Singleton,
A.B. 2004 Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson's
disease. Neuron. 44:595-600.
Palkovits, M., and Brownstein, M. Catecholamines in the central nervous system. In:
Trendelenberg, U., and Weiner N., editors. Catecholamines II. Berlin, Germany: Springer;
1989. p. 1–26.
Palmer, T.D., Schwartz, P.H., Taupin, P., Kaspar, B., Stein, S., Gage F.H. 2001 Progenitor cells
from human brain after death. Nature 411: 43-43.
Park, C.H., Minn, Y.K., Lee, J.Y., Choi, D.H., Chang, M.Y., Shim, J.W., Ko, J.Y., Koh, H.C.,
Kang, M.J., Kang, J.S., Rhie, D.J., Lee, Y.S., Son, H., Moon, S.Y., Kim, K.S., Lee, SH. 2005
In vitro and in vivo analyses of human embryonic stem cell-derived dopamine neurons. J
Neurochem. 92: 1265-1276.
223
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Park, S., Lee, K.S., Lee, Y.J., Shin, H.A., Cho, H.Y., Wang, K.C., Kim, Y.S., Lee, H.T., Chung,
K.S., Kim, E.Y., Lim, J. 2004 Generation of dopaminergic neurons in vitro from human
embryonic stem cells treated with neurotrophic factors. Neurosci Lett. 359: 99-103.
Parkinson, J. 1817 An essay on the shaking palsy. Sherwood. Neely and Jones, London.
Parmacek, M.S., Vora, A.J., Shen, T., Barr, E., Jung, F., Leiden, J.M. 1992 Identification and
characterization of a cardiac-specific transcriptional regulatory element in the slow/cardiac
troponin C gene. Mol Cell Biol. 12: 1967-1976.
Partridge, T.A., Davies, K.E. 1995 Myoblast-based gene therapies. Br Med Bull. 51: 123-137.
Paxinos, G., Watson, C. 1986 The rat brain in stereotaxic coordinate. New York Academic Press.
Pei, Y., He, X., Xie, Z. 2003 Dopaminergic neuron differentiation of ventral mesencephalic
progenitors regulated by developmental signals in vitro. Neuroreport. 2003 Aug
26;14(12):1567-70.
Perese, D.A., Ulman J., Viola, J., Ewing, S.E., Bankiewicz, K.S. 1989 A 6-hydroxydopamineinduced selective parkinsonian rat model. Brain Res. 494: 285-293.
Perkins, A.S., Mercer, J.A., Jenkins, N.A., Copeland, N.G. 1991 Patterns of Evi-1 expression in
embryonic and adult tissues suggest that Evi-1 plays an important regulatory role in mouse
development. Development. 111: 479-487.
Perrier, A.L., Studer, L. 2003 Making and repairing the mammalian brain––in vitro production of
dopaminergic neurons. Semin Cell Dev Biol. 14: 181-189.
Perrier, A.L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M.E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N.L., Studer L.
2004 Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl
Acad Sci U S A. 101: 12543-12548.
Perry, V.H., Gordon, S. 1988 Macrophages and microglia in the nervous system. Trends Neurosci.
11: 273-277.
Peschanski, M., Defer, G., N'Guyen, J.P., Ricolfi, F., Monfort, J.C., Remy, P., Geny, C., Samson,
Y., Hantraye, P., Jeny, R., Gaston, A., Kéravel, Y., Degos, J.D., Cesaro, P. 1994 Bilateral
motor improvement and alteration of L-DOPA effect in two patients with Parkinson's disease
following intrastriatal transplantation of foetal ventral mesencephalon. Brain 117: 487–499.
Petersen, B.E., Bowen, W.C., Patrene, K.D., Mars, W.M., Sullivan, A.K., Murase, N., Boggs, S.S.,
Greenberger, J.S., Goff, J.P. 1999 Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells.
Science 284: 1168-1170.
Pettemann, B., Henderson, C.E. 1998 Neural cell death. Neuron 20: 633-647.
224
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Piccini, P., Brooks, D.J, Björklund, A., Gunn, R.N., Grasby, P.M., Rimoldi, O., Brundin, P.,
Hagell, P., Rehncrona, S., Widner, H., Lindvall, O. 1999 Dopamine release from nigral
transplants visualized in vivo in a Parkinson's patient. Nat Neurosci 2: 1137–1140.
Piette, J. 1997 The transition from proliferation to differentiation in nerve cells: what can we learn
from muscle? Exp Cell Res. 234: 193-204.
Pittenger, M.F., Bradley, J.M. 2004 Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac
therapeutics. Circ Res. 95: 9-20.
Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas, R., Mosca, J.D., Moorman
M.A., Simonetti, D.W., Craig, S., Marshak, D.R. 1999 Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells. Science 284: 143-147.
Potter, E.D., Ling, Z., Carvey, P.M. 1999 Cytokine-induced conversion of mesencephalic-derived
progenitor cells into dopamine neurons. Cell Tissue Res. 296: 235–246.
Prockop, D.J. 1997 Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science 276:
71-74.
Qian, L., Saltzman, W.M. 2004 Improving the expansion and neuronal differentiation of
mesenchymal stem cells through culture surface modification. Biomaterials 25: 1331-1337.
Qin, H., Powell-Coffman, J.A. 2004 The Caenorhabditis elegans aryl hydrocarbon receptor, AHR1, regulates neuronal development. Dev Biol. 270: 64-75.
Raff, M.C., Barres, B.A., Burne, J.F., Coles, H.S., Ishizaki, Y., Jacobson, M.D. 1993 Programmed
cell death and the control of cell survival: lessons from the nervous system Science. 262:
695-700.
Ratan, R.R., Murphy, T.H., Baraban, J.M. 1994 Oxidative stress induces apoptosis in embryonic
cortical neurons. J Neurochem. 62: 376-379.
Ray, J., Peterson, D.A., Schinstine, M., Gage, F.H. 1993 Proliferation, differentiation, and longterm culture of primary hippocampal neurons. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3602–3606.
Reeves, F.C., Fredericks, W.J., Rauscher, F.J. 3rd, Lillycrop, K.A. 1998 The DNA binding activity
of the paired box transcription factor Pax-3 is rapidly downregulated during neuronal cell
differentiation. FEBS Lett. 422:118-122.
Remy, P., Samson, Y., Hantraye, P., Fontaine, A., Defer, G., Mangin, J.F., Fenelon, G., Geny, C.,
Ricolfi, F., Frouin, V., N'Guyen, J.P., Jeny, R., Degos, J.D., Peschanski M., Cesaro, P. 1995
Clinical correlates of [18F]fluorodopa uptake in five grafted parkinsonian patients. Ann
Neurol. 38: 580–588.
Reubinoff, B.E., Itsykson, P., Turetsky, T., Pera, M.F., Reinhartz, E., Itzik, A., Ben-Hur T. 2001
Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19: 1134-1140.
225
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Reubinoff, B.E., Pera, M.F., Fong, C.Y., Trounson, A., Bongso, A. 2000 Embryonic stem cell lines
from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18: 399-404.
Reuss, B., von Bohlen und Halbach, O. 2003 Fibroblast growth factors and their receptors in the
central nervous system. Cell Tissue Res. 313: 139-57.
Reyes, M., Dudek, A., Jahagirdar, B., Koodie, L., Marker, P.H., Verfaillie, C.M. 2002 Origin of
endothelial progenitors in human postnatal bone marrow. J Clin Invest. 109: 337-346.
Reyes, M., Lund, T., Lenvik, T., Aguiar, D., Koodie, L., Verfaillie, C.M. 2001 Purification and ex
vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells. Blood 98: 26152625.
Reyes, M., Verfaillie, C.M. 2001 Characterization of multipotent adult progenitor cells, a
subpopulation of mesenchymal stem cells. Ann N Y Acad Sci. 938:31-33.
Reynolds, B.A., Weiss, S. 1992 Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the
adult mammalian central nervous system. Science 255: 1707–1710.
Rhinn, M., Brand, M. 2001 The midbrain–hindbrain boundary organizer. Curr Opin Neurobiol. 11:
34–42.
Riddle, R., Pollock, J.D. 2003 Making connections: the development of mesencephalic
dopaminergic neurons. Brain Res Dev Brain Res. 147: 3-21.
Rideout, W.M. III, Hochedlinger, K., Kyba, M., Daley, G.Q., Jaenisch, R. 2002 Correction of a
genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy. Cell 109: 1727.
Riederer, F., Luborzewski, A., God, R., Bringmann, G., Scholz, J., Feineis, D., Moser, A. 2002
Modification of tyrosine hydroxylase activity by chloral derived beta-carbolines in vitro. J
Neurochem. 81:814-819.
Riederer, P., Sofic, E., Rausch, W.D., Schmidt, B., Reynolds, G.P., Jellinger, K., Youdim, M.B.
1989 Transition metals, ferritin, glutathione, and ascorbic acid in parkinsonian brains. J.
Neurochem. 52:515-520.
Rietze, R., Poulin, P., Weiss, S. 2000 Mitotically active cells that generate neurons and astrocytes
are present in multiple regions of the adult mouse hippocampus. J Comp Neurol. 424: 397408.
Rismanchi, N., Floyd, C.L., Berman, R.F., Lyeth, B.G. 2003 Cell death and long-term maintenance
of neuron-like state after differentiation of rat bone marrow stromal cells: a comparison of
protocols. Brain Res. 991: 46-55.
226
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Rolletschek, A., Changa, H., Guana, K., Czyza, J., Meyerb, M., Wobus, A.M. 2001 Differentiation
of embryonic stem cell-derived dopaminergic neurons is enhanced by survival-promoting
factors. Mech Dev. 105: 93-104.
Romero-Ramos, M., Vourc'h, P., Young, H.E., Lucas, P.A., Wu, Y., Chivatakarn, O., Zaman, R.,
Dunkelman, N., el-Kalay, M.A., Chesselet, M.F. 2002 Neuronal differentiation of stem cells
isolated from adult muscle. J Neurosci Res. 69: 894-907.
Rosenberg, N.L., Myers, J.A., Martin, W.R. 1989 Cyanide-induced parkinsonism: clinical, MRI,
and 6-fluorodopa PET studies. Neurology. 39:142-144.
Rosenblad, C., Martinez-Serrano, A., Bjorklund, A. 1996 Glial cell line-derived neurotrophic factor
increases survival, growth and function of intrastriatal fetal nigral dopaminergic grafts.
Neuroscience. 75: 979-985.
Rosenthal, A. 1998 Specification and survival of the dopaminergic neurons in the mammalian
midbrain. Adv Pharmacol. 42; 908-911.
Ross, S.E., Greenberg, M.E., Stiles, C.D. 2003 Basic helix-loop-helix factors in cortical
development. Neuron. 39: 13-25.
Roy, N.S., Wang, S., Jiang, L., Kang, J., Benraiss, A., Harrison-Restelli, C., Fraser, R.A.,
Couldwell, W.T., Kawaguchi, A., Okano, H., Nedergaard, M., Goldman, S.A. 2000 In-vitro
neurogenesis by progenitor cells isolated from the adult human hippocampus. Nat Med. 3:
271-277.
Rubio, D., Garcia-Castro, J., Martin, M.C., de la Fuente, R., Cigudosa, J.C., Lloyd, A.C., Bernad,
A. 2005 Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 65 :3035-3039.
Rudnicki, M.A. 2003 Marrow to muscle, fission versus fusion. Nat Med. 9: 1461-1462.
Ruiz I Altaba, A., Palma, V., Dahmane, N. 2002 Hedgehog-Gli signalling and the growth of the
brain. Nat Rev Neurosci. 3: 24-33.
Ryu, K.H., Cho, S.J., Jung, Y.J., Seoh, J.Y., Kie, J.H., Koh, S.H., Kang, H.J., Ahn, H.S., Shin, H.Y.
2004 In vitro generation of functional dendritic cells from human umbilical cord blood
CD34+ cells by a 2-step culture method. Int J Hematol. 80: 281-286.
Sacchetti, P., Mitchell, T.R., Granneman, J.G., Bannon, M.J. 2001 Nurr1 enhances transcription of
the human dopamine transporter gene through a novel mechanism. J Neurochem. 76, 1565–
1572.
Safford, K.M., Hicok, K.C., Safford, S.D., Halvorsen, Y.D., Wilkison, W.O., Gimble, J.M., Rice,
H.E. 2002 Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells.
Biochem Biophys Res Commun. 294: 371-379.
227
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Safford, K.M., Safford, S.D., Gimble, J.M., Shetty, A.K., Rice, H.E. 2004 Characterization of
neuronal/glial differentiation of murine adipose-derived adult stromal cells. Exp Neurol. 187:
319-328.
Saigoh, K., Wang, Y.L., Suh, J.G., Yamanishi, T., Sakai, Y., Kiyosawa, H., Harada, T., Ichihara,
N., Wakana, S., Kikuchi, T., Wada, K. 1999 Intragenic deletion in the gene encoding
ubiquitin carboxy-terminal hydrolase in gad mice. Nat Genet. 23:47-51.
Sakurada, K., Ohshima-Sakurada, M., Palme,r T.D., Gage, F.H. 1999 Nurr1, an orphan nuclear
receptor, is a transcriptional activator of endogenous tyrosine hydroxylase in neural
progenitor cells derived from the adult brain. Development 126: 4017–4026.
Salem, N. Docosahexaenoic acid: membrane function and metabolism. In: Simopoulos, A.P., Kifer,
R.R., Martin, R.E., editors. Health effects of polyunsaturated fatty acids in seafood. London:
Academic Press; 1986. p. 263-317.
Salim, A., Giaccia, A.J., Longaker, M.T. 2004 Stem cell differentiation. Nat Biotechnol. 22: 804805.
Salim, A., Giaccia, A.J., Longaker, M.T. 2004 Stem cell differentiation. Nat Biotechnol. 22: 1021.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (3 Volume Set).
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second edition, NY, 1989.
Sanchez-Pernaute, R., Studer, L., Ferrari, D., Perrier, A., Lee, H., Vinuela, A., Isacson, O. 2005
Long-term survival of dopamine neurons derived from parthenogenetic primate embryonic
stem cells (cyno-1) after transplantation. Stem Cells. 23:914-922.
Sanchez-Ramos, J.R, Song, S., Cardozo-Pelaez, F., Hazzi, C., Stedeford, T., Willing, A., Freeman,
T.B., Saporta, S., Janssen, W., Patel, N., Cooper, D.R., Sanberg, P.R. 2000 Adult bone
marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Exp Neurol. 164: 247-256.
Sanchez-Ramos, J.R., Song, S., Kamath, S.G., Zigova, T., Willing, A., Cardozo-Pelaez, F.,
Stedeford, T., Chopp, M., Sanberg, P.R. 2001 Expression of neural markers in human
umbilical cord blood. Exp Neurol. 171: 109-115.
Saucedo-Cardenas, O., Quintana-Hau, J.D., Le, W.D., Smidt, M.P., Cox, J.J., De Mayo, F.,
Burbach, J.P., Conneely, O.M. 1998 Nurr1 is essential for the induction of the dopaminergic
phenotype and the survival of ventral mesencephalic late dopaminergic precursor neurons.
Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 4013-4018.
Sawle, G.V., Bloomfield, P.M., Björklund, A., Brooks, D.J., Brundin, P., Leenders, K.L., Lindvall,
O., Marsden, C.D., Rehncrona, S., Widner, H., Frackowiak, R.S.J. 1992 Transplantation of
fetal dopamine neurons in Parkinson's disease: PET [18F]6-L-fluorodopa studies in two
patients with putaminal implants. Ann Neurol 31: 166–173.
228
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Schapira, A.H., Cooper, J.M., Dexter, D., Clark, J.B., Jenner, P., Marsden, C.D. 1990
Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson's disease. J. Neurochem. 54:823-827.
Schierle, G.S., Hansson, O., Leist, M., Nicotera, P., Widner, H., Brundin, P. 1999 Caspase
inhibition reduces apoptosis and increases survival of nigral transplants. Nat Med. 5: 97-100.
Schmoll, D., Walker, K.S, Alessi, D.R., Grempler, R., Burchell, A., Guo, S., Walther, R.,
Unterman, T.G. 2000 Evidence for insulin response unit-dependent and -independent effects
of insulin on promoter activity. J Biol Chem. 2000 Nov 17;275(46):36324-33.
Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R.S., Benvenisty, N.
2001 Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain Res. 913: 201205.
Schuldiner, M., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Melton, D.A., Benvenisty, N. 2000 Effects of eight
growth factors on the differentiation of cells derived from human embryonic stem cells. Proc
Natl Acad Sci U S A. 97: 11307-11312.
Schulz, T.C., Noggle, S.A., Palmarini, G.M., Weiler, D.A., Lyons, I.G., Pensa, K.A., Meedeniya,
A.C., Davidson, B.P., Lambert, N.A., Condie, B.G. 2004 Differentiation of human
embryonic stem cells to dopaminergic neurons in serum-free suspension culture. Stem Cells.
22: 1218-1238.
Schuur, E.R., Loktev, A.V., Sharma, M., Sun, Z., Roth, R.A., Weigel, R.J. 2001 Ligand-dependent
interaction of estrogen receptor-alpha with members of the forkhead transcription factor
family. J Biol Chem. 276: 33554-335660.
Schwartz, P.H., Bryant, P.J., Fuja, T.J., Su, H., O'Dowd, D.K., Klassen, H. 2003 Isolation and
characterization of neural progenitor cells from post-mortem human cortex. J Neurosci Res.
74: 838-851.
Schwartz, R.E., Reyes, M., Koodie, L., Jiang, Y., Blackstad, M., Lund, T., Lenvik, T., Johnson, S.,
Hu, W.S., Verfaillie, C.M. 2002 Multipotent adult progenitor cells from bone marrow
differentiate into functional hepatocyte-like cells. J Clin Invest. 109, 1291-1302.
Schwarz, E.J., Alexander, G.M., Prockop, D.J., Azizi, S.A. 1999 Multipotential marrow stromal
cells transduced to produce L-DOPA: Engraftment in rat model of Parkinson disease. Hum
Gene Ther. 10: 2539-2549.
Schwarz, E.J., Reger, R.L., Alexander, G.M., Class, R., Azizi, S.A., Prockop, D.J. 2001 Rat
marrow stroam cells rapidly transduced with a self-inactivating retrovirus synthesize LDOPA in vitro. Gene Ther. 8: 1214-1223.
229
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Seaberg, R.M., Smukler, S.R., Kieffer, T.J., Enikolopov, G., Asghar, Z., Wheeler, M.B., Korbutt,
G., van der Kooy D. 2004 Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse
pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22 :1115-1124.
Sechi, G., Deeden, M.G., Bua, G., Satta, W.M., Deiana, G.A., Pes, G.M., Rosati, G. 1996 Reduced
intravenous glutathione in the treatment of early Parkinson’s disease. Prog. Neuro.
psychopharmacol. & Biol. Psychiat. 20:1159-1170.
Seeman, P., Van Tol, H.H. 1994 Dopamine receptor pharmacology. Trends Pharmacol Sci. 15:264270.
Seidler, A., Hellenbrand, W., Robra, B.P., Vieregge, P., Nischan, P., Joerg, J., Oertel, W.H., Ulm,
G., Schneider, E. 1996 Possible environmental, occupational, and other etiologic factors for
Parkinson's disease: a case-control study in Germany. Neurology. 46:1275-1284.
Shamblott, M.J., Axelman, J., Wang, S., Bugg, E.M., Littlefield, J.W., Donovan, P.J., Blumenthal,
P.D., Huggins, G.R., Gearhart, J.D. 1998 Derivation of pluripotent stem cells from cultured
human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95: 13726-13731.
Shastry, B.S. 2001 Parkinson disease: etiology, pathogenesis and future of gene therapy. Neurosci
Res. 41:5-12.
Shen, M., Kawamoto, T., Teramoto, M., Makihira, S., Fujimoto, K., Yan, W., Noshiro, M., Kato,
Y. 2001 Induction of basic helix-loop-helix protein DEC1 (BHLHB2)/Stra13/Sharp2 in
response to the cyclic adenosine monophosphate pathway. Eur J Cell Biol. 80: 329-334.
Shetty, N., Friedman, J.H., Kieburtz, K., Marshall, F.J., Oakes, D. 1999 The placebo response in
Parkinson's disease. Parkinson Study Group. Clin Neuropharmacol. 22: 207-212.
Shim, J.W., Koh, H.C., Chang, M.Y., Roh, E., Choi, C.Y., Oh, Y.J., Son, H., Lee, Y.S., Studer, L.,
Lee, S.H. 2004 Enhanced in vitro midbrain dopamine neuron differentiation, dopaminergic
function, neurite outgrowth, and 1-methyl-4-phenylpyridium resistance in mouse embryonic
stem cells overexpressing Bcl-XL. J Neurosci. 24: 843-852.
Shimura, H., Hattori, N., Kubo, S., Mizuno, Y., Asakawa, S., Minoshima, S., Shimizu, N., Iwai, K.,
Chiba, T., Tanaka, K., Suzuki, T. 2000 Familial Parkinson disease gene product, parkin, is a
ubiquitin-protein ligase. Nat Genet. 25:302-305.
Shur, I., Marom, R., Lokiec, F., Socher, R., Benayahu, D. 2002 Identification of cultured progenitor
cells from human marrow stroma. J Cell Biochem. 87: 51-57.
Sian, J., Youdim, M.B.H., Riederer P., Gerlach, M. Neurotransmitters and disorders of the basal
ganglia. In: Siegel, G.J., Agranoff, B.W., Albers, W.R., Fisher, S.K., Uhler, M.D., edditors.
Basic neurochemistry: Molecular, cellular and medical aspects. Philadelphia, PA: Lippincott
Williams and Wilkins; 1999 sixth edition. chapter 45.
230
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Sieradzan, K.A., Fox, S.H., Hill, M., Dick, J.P., Crossman, A.R., Brotchie, J.M. 2001 Cannabinoids
reduces levodopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease: a pilot study. Neurology.
57:2108-2111.
Simon, H.H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. 2003 Midbrain dopaminergic neurons:
determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991:
36-47.
Simon, H.H., Saueressig, H., Wurst, W., Goulding, M.D., O'Leary, D.D. 2001 Fate of midbrain
dopaminergic neurons controlled by the engrailed genes. J Neurosci. 21: 3126-3134.
Sims, S.H., Cha, Y., Romine, M.F., Gao, P.Q., Gottlieb, K., Deisseroth, A.B. 1993 A novel
interferon–inducible domain: structural and functional analysis of the human interferon
regulatory factor 1 gene promoter. Mol Cell Biol. 13: 690-702.
Sinclair, S.R., Fawcett, J.W., Dunnett, S.B. 1999 Delayed implantation of nigral grafts improves
survival of dopamine neurones and rate of functional recovery. Neuroreport. 10: 1263-1267.
Smidt, M.P., Asbreuk, C.H., Cox, J.J., Chen, H., Johnson, R.L. Burbach, J.P. 2000 A second
independent pathway for development of mesencephalic dopaminergic neurons requires
Lmx1b. Nat Neurosci. 3: 337–341.
Smidt, M.P., Smits, S.M., Burbach, J.P 2003 Molecular mechanisms underlying midbrain
dopamine neuron development and function. Eur J Pharmacol. 480: 75-88.
Smidt, M.P., Van Schaick, H.A., Lanctot, C., Tremblay, J.J., Cox, J.J., van der Kleij, A.A.,
Wolterink, G., Drouin, J., Burbach, J.P. 1997 A homeodomain gene Ptx3 has highly
restricted brain expression in mesencephalic dopaminergic neurons. Proc Nat Acad Sci U S
A. 94: 13305–13310.
Smith, P.R., Cooper, J.M., Govan, G.G., Harding, A.E., Schapira, A.H. 1993 Smoking and
mitochondrial function: a model for environmental toxins.Q J Med. 86:657-660.
Sofic, E., Lange, K.W., Jellinger, K., Riederer, P. 1992 Reduced and oxidized glutathione in the
substantia nigra of patients with Parkinson's disease. Neurosci Lett. 142:128-130.
Song, S., Sanchez-Ramos, J. 2003 Brain as the Sea of Marrow. Exp Neurol. 184: 54-60.
Sonntag, K.C., Simantov, R., Isacson, O. 2005 Stem cells may reshape the prospect of Parkinson's
disease therapy. Brain Res Mol Brain Res. 134: 34-51.
Spees, J.L., Olson, S.D., Ylostalo, J., Lynch, P.J., Smith, J., Perry, A., Peister, A., Wang, M.Y.,
Prockop, DJ. 2003 Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of
epithelium by human adult stem cells from bone marrow stroma. Proc Natl Acad Sci U S A.
100: 2397-2402.
231
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Stacy, M., Jankovic, J. 1992 Differential diagnosis of Parkinson's disease and the parkinsonism
plus syndromes. Neurol Clin.10:341-359.
Starr, P.A., Vitek, J.L., Bakay, R.A. 1998 Ablative surgery and deep brain stimulation for
Parkinson's disease. Neurosurgery 43:989-1013.
Storch, A., Paul, G., Csete, M., Boehm, B.O., Carvey, P.M., Kupsch, A., Schwarz, J. 2001 Longterm proliferation and dopaminergic differentiation of human mesencephalic neural precursor
cells. Exp Neurol. 170, 317–325.
Straube, W.L., Brockes, J.P., Drechsel, D.N., Tanaka, E.M. 2004 Plasticity and reprogramming of
differentiated cells in amphibian regeneration: partial purification of a serum factor that
triggers cell cycle re-entry in differentiated muscle cells. Cloning Stem Cells. 6: 333-344.
Stuart, O.H., Morrison, S.J. 2002 Biomedicine: Stem-cell competition. Nature 418: 25-27.
Studer, L., Csete, M., Lee, S.H., Kabbani, N., Walikonis, J., Wold, B., McKay, R. 2000 Enhanced
proliferation survival and dopaminergic differentiation of CNS precursors in lowered
oxygen. J Neurosci. 20: 7377–7383.
Studer, L., Taba,r V., McKay, R.D. 1998 Transplantation of expanded mesencephalic precursors
leads to recovery in parkinsonian rats. Nat Neurosci. 1: 290-295.
Suarez-Rodriguez, R., Belkind-Gerson, J. 2004 Cultured nestin-positive cells from postnatal mouse
small bowel differentiate ex vivo into neurons, glia, and smooth muscle. Stem Cells 22:
1373-1385.
Suemori, H., Tada, T., Torii, R., Hosoi, Y., Kobayashi, K., Imahie, H., Kondo, Y., Iritani, A.,
Nakatsuji, N. 2001 Establishment of embryonic stem cell lines from cynomolgus monkey
blastocysts produced by IVF or ICSI. Dev Dyn. 222: 273-279.
Sun, G.Y., Huang, H.M., Kelleher, J.A., Stubbs, E.B., Sun, Jr.A.Y. 1988 Marker enzymes,
phospholipids and acyl group composition of a somal plasma membrane fraction isolated
from rat cerebral cortex: A comparison with microsomes and synaptic plasma membranes.
Neurochem Int. 12: 69-77.
Suon, S., Jin, H., Donaldson, A.E., Caterson, E.J., Tuan, R.S., Deschennes, G., Marshall, C.,
Iacovitti, L. 2004 Transient differentiation of adult human bone marrow cells into neuronlike cells in culture: development of morphological and biochemical traits is mediated by
different molecular mechanisms. Stem Cells Dev. 13 :625-635.
Suzuki, H., Taguchi. T,, Tanaka. H., Kataoka, H., Li, Z., Muramatsu, K., Gondo, T., Kawai, S.
2004 Neurospheres induced from bone marrow stromal cells are multipotent for
differentiation into neuron, astrocyte, and oligodendrocyte phenotypes. Biochem Biophys
Res Commun. 322: 918-922.
232
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Svendsen, C.N., Langston, J.W. 2004 Stem cells for Parkinson disease and ALS: replacement or
protection? Nat Med. 10: 224-225.
Tabbal, S., Fahn, S., Frucht, S. 1998 Fetal tissue transplantation [correction of transplanation] in
Parkinson's disease. Curr Opin Neurol. 11: 341-349.
Taguchi, A., Soma, T., Tanaka, H., Kanda, T., Nishimura, H., Yoshikawa, H., Tsukamoto, Y., Iso,
H., Fujimori, Y., Stern, D.M., Naritomi, H., Matsuyama, T. 2004 Administration of CD34+
cells after stroke enhances neurogenesis via angiogenesis in a mouse model. J Clin Invest.
114: 330-338.
Takagi, Y., Takahashi, J., Saiki, H., Morizane, A., Hayashi, T., Kishi, Y., Fukuda, H., Okamoto,
Y., Koyanagi, M., Ideguchi, M., Hayashi, H., Imazato, T., Kawasaki, H., Suemori, H.,
Omachi, S., Iida, H., Itoh, N., Nakatsuji, N., Sasai, Y., Hashimoto, N. 2005 Dopaminergic
neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate
model. J Clin Invest. 115: 102-109.
Takahashi, J., Palmer, T.D., Gage, F.H. 1999 Retinoic acid and neurotrophins collaborate to
regulate neurogenesis in adult-derived neural stem cell cultures. J Neurobiol. 38: 65-81.
Takeuchi, Y., Sawada, T., Blunt, S., Jenner, P., Marsden, CD. 1991 Serotonergic sprouting in the
neostriatum after intrastriatal transplantation of fetal ventral mesencephalon. Brain Res. 551:
171-177.
Tanaka, H., Kannari, K., Maeda, T., Tomiyama, M., Suda, T., Matsunaga, M. 1999 Role of
serotonergic neurons in L-DOPA-derived extracellular dopamine in the striatum of 6-OHDAlesioned rats. Neuroreport. 10: 631-634.
Tangvoranuntakul, P., Gagneux, P., Diaz, S., Bardor, M., Varki, N., Varki, A., Muchmore, E. 2003
Human uptake and incorporation of an immunogenic nonhuman dietary sialic acid. Proc Natl
Acad Sci U S A. 100: 12045-12050.
Tanner, C.M., Ottman, R., Goldman, S.M., Ellenberg, J., Chan, P., Mayeux, R., Langston, J.W.
1999 Parkinson disease in twins: an etiologic study. JAMA. 281:341-346.
Tao, H., Ma, D.D. 2003 Evidence for transdifferentiation of human bone marrow-derived stem
cells: recent progress and controversies. Pathology 35: 6-13.
Tao, H., Rao, R., Ma, D.D. 2005 Cytokine-induced stable neuronal differentiation of human bone
marrow mesenchymal stem cells in a serum/feeder cell-free condition Dev Growth Differ.
47: 423-433.
Taupin, P., Gage, F.H. 2002 Adult neurogenesis and neuronal stem cells of the central nervous
system in mammals. J Neurosci Res. 69: 745-749.
233
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Tedder, T.F., Engel, P. 1994 CD20: a regulator of cell-cycle progression of B lymphocytes.
Immunol Today. 15: 450-454.
Terada, N., Hamazaki, T., Oka, M., Hoki, M., Mastalerz, D.M., Nakano, Y., Meyer, E.M., More,
L., Petersen, B.E., Scott, E.W. 2002 Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by
spontaneous cell fusion. Nature 416: 542-545.
Thomson, J.A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S.S., Waknitz, M.A., Swiergiel, J.J., Marshall, V.S.,
Jones, J.M. 1998 Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 282:
1145-1147.
Thomson, J.A., Kalishman, J., Golos, T.G., Durning, M., Harris, C.P., Becker, R.A., Hearn, J.P.
1995 Isolation of a primate embryonic stem cell line. Proc Natl Aca. Sci U S A. 92: 78447848.
Thomson, J.A., Kalishman, J., Golos, T.G., Durning, M., Harris, C.P., Hearn JP. 1996 Pluripotent
cell lines derived from common marmoset (Callithrix jacchus) blastocysts. Biol Reprod. 55:
254-259.
Thomson, J.A., Marshall, V.S. 1998 Primate embryonic stem cells. Curr Top Dev Biol. 38: 133-65.
Toma, J.G., Akhavan, M., Fernandes, K.J., Barnabe-Heider, F., Sadikot, A., Kaplan, D.R., Miller,
F.D. 2001 Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat
Cell Biol. 3: 778-784.
Tondreau, T., Lagneaux, L., Dejeneffe, M., Massy, M., Mortier, C., Delforge, A., Bron, D. 2004
Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins
before any differentiation. Differentiation. 72:319-326.
Tondreau, T., Lagneaux, L., Dejeneffe, M., Massy, M., Mortier, C., Delforge, A., Bron, D. 2004
Bone marrow-derived mesenchymal stem cells already express specific neural proteins
before any differentiation. Differentiation. 72: 319-326.
Tornatore, C., Baker-Cairns, B., Yadid, G., Hamilton, R., Meyers, K., Atwood, W., Cummins, A.,
Tanner, V., Major, E. 1996 Expression of tyrosine hydroxylase in an immortalized human
fetal astrocyte cell line; in vitro characterization and engraftment into the rodent striatum.
Cell Transplant. 5:145-163.
Tzeng, S.F., Tsai, M.J., Hung, S.C., Cheng, H. 2004 Neuronal morphological change of size-sieved
stem cells induced by neurotrophic stimuli. Neurosci Lett. 367: 23-28.
Valente, E.M., Bentivoglio, A.R., Dixon, P.H., Ferraris, A., Ialongo, T., Frontali, M., Albanese, A.,
Wood, N.W. 2001 Localization of a novel locus for autosomal recessive early-onset
parkinsonism, PARK6, on human chromosome 1p35-p36. Am. J. Hum. Genet. 68:895-900.
234
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Van Damme, A., Vanden Driessche, T., Collen, D., Chuah, M.K. 2002 Bone marrow stromal cells
as targets for gene therapy. Curr. Gene Ther. 2: 195-209.
Van Duijn, C.M., Dekker, M.C., Bonifati, V., Galjaard, R.J., Houwing-Duistermaat, J.J., Snijders,
P.J., Testers, L., Breedveld, G.J., Horstink, M., Sandkuijl, L.A., van Swieten, J.C., Oostra,
B.A., Heutink, P. 2001 Park7, a novel locus for autosomal recessive early-onset
parkinsonism, on chromosome 1p36.Am J Hum Genet.69: 629-634.
Van Loo, G., Saelens, X., Van Gurp, MacFarlane, M., Martin, S.J., Vandenabeele, P. 2002 The role
of mitochondrial factors in apoptosis: a Russian roulette with more than one bullet. Cell
Death Differ. 9:1031-1042.
Vassilopoulos, G. Russell, D.W. 2003 Cell fusion: an alternative to stem cell plasticity and its
therapeutic implications. Curr Opin Genet Dev. 13: 480-485.
Vassilopoulos, G., Wang, P.R., Russell, D.W. 2003 Transplanted bone marrow regenerates liver by
cell fusion. Nature 422: 901-904.
Vindelov, L.L., Christensen, I.J., Nissen, N.I. 1983 A detergent-trypsin method for the preparation
of nuclei for flow cytometric DNA analysis. Cytometry 3: 323-327.
Vogel, W., Grunebach, F., Messam, C.A., Kanz, L., Brugger, W., Buhring, H.J. 2003
Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural
progenitor cells. Haematologica. 88:26-133.
Vourc'h, P., Romero-Ramos, M., Chivatakarn, O., Young, H.E., Lucas, P.A., El-Kalay, M.,
Chesselet, M.F. 2004 Isolation and characterization of cells with neurogenic potential from
adult skeletal muscle. Biochem Biophys Res Commun. 317: 893-901.
Vrana, K.E., Hipp, J.D., Goss, A.M., McCool, B.A., Riddle, D.R., Walker, S.J., Wettstein, P.J.,
Studer, L.P., Tabar, V., Cunniff, K., Chapman, K., Vilner, L., West, M.D., Grant, K.A.,
Cibelli, J.B. 2003 Nonhuman primate parthenogenetic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A.
100(Suppl 1): 11911-11916.
Wagers, A.J., Sherwood, R.I., Christensen, J.L., Weissman, I.L. 2002 Little evidence for
developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells. Science 297: 2256-2259.
Wagers, A.J., Weissman, I.L. 2004 Plasticity of adult stem cells. Cell 116: 639-648.
Wagner, J., Åkerud, P., Castro, D.S., Holm, P.C., Canals, J.M., Snyder, E.Y., Perlmann, T., Arenas
E. 1999 Induction of midbrain dopaminergic phenotype in Nurr1-overexpressing neural stem
cells by type 1 astrocytes. Nat Biotechnol. 17: 653-659.
Wagner, J.P., Black, I.B. DiCicco-Bloom, E. 1999 Stimulation of neonatal and adult brain
neurogenesis by subcutaneous injection of basic fibroblast growth factor. J. Neurosci. 19:
6006–6016.
235
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Wakayama, T., Tabar, V., Rodriguez, I., Perry, A.C., Studer, L., Mombaerts, P. 2001
Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear
transfer. Science 292: 740-743.
Walder, S., Zhang, F., Ferretti, P. 2003 Up-regulation of neural stem cell markers suggests the
occurrence of dedifferentiation in regenerating spinal cord. Dev Genes Evol. 213: 625-630.
Wallen, A,. Perlmann, T. 2003 Transcriptional control of dopamine neuron development. Ann N Y
Acad Sci. 991: 48-60.
Wallen, A., Castro, D.S., Zetterstrom, R.H., Karlen, M., Olson, L., Ericson, J., Perlmann, T. 2001
Orphan nuclear receptor Nurr1 is essential for Ret expression in midbrain dopamine neurons
and in the brain stem. Mol Cell Neurosci. 18: 649-663.
Wallen, A., Perlmann, T. 2003 Transcriptional control of dopamine neuron development. Ann N Y
Acad. Sci. 991: 48-60.
Wallen, A., Zetterstrom, R.H., Solomin, L., Arvidsson, M., Olson, L., Perlmann, T. 1999 Fate of
mesencephalic AHD2-expressing dopamine progenitor cells in NURR1 mutant mice. Exp
Cell Res. 253: 737-746.
Ward, C.D., Sanes, J.N., Dambrosia, J.M., Calne, D.B. 1983 Methods for evaluating treatment in
Parkinson's disease. Adv Neurol. 37:1-7.
Watanabe, Y., Kameoka, S., Gopalakrishnan, V., Aldape, K.D., Pan, Z.Z., Lang, F.F., Majumder,
S. 2004 Conversion of myoblasts to physiologically active neuronal phenotype. Genes Dev.
18: 889-900.
Waters, C. 2000 Catechol-O-methyltransferase (COMT) inhibitors in Parkinson's disease.J Am
Geriatr Soc.48:692-698.
Watts, R.L. 1997 The role of dopamine agonists in early Parkinson's disease.Neurology. 49 (1
Suppl 1):S34-S48.
Wenning, G.K., Odin, P., Morrish, P., Rehncrona, S., Widner, H., Brundin, P., Rothwell, J.C.,
Brown, R., Gustavii, B., Hagell, P., Jahanshahi, M., Sawle, G., Bjorklund, A., Brooks, D.J.,
Marsden, C.D., Quinn, N.P., Lindvall, O. 1997 Short- and long-term survival and function of
unilateral intrastriatal dopaminergic grafts in Parkinson's disease. Ann Neurol. 42: 95–107.
Winkler, C., Kirik, D., Bjorklund, A. 2005 Cell transplantation in Parkinson's disease: how can we
make it work? Trends Neurosci. 28: 86-92.
Wislet-Gendebien, S., Hans, G., Leprince, P., Rigo, J.M., Moonen, G., Rogister, B. 2005 Plasticity
of cultured mesenchymal stem cells: switch from nestin-positive to excitable neuron-like
phenotype. Stem Cells. 23: 392-402.
236
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Wislet-Gendebien, S., Leprince, P., Moonen, G., Rogister, B. 2003 Regulation of neural markers
nestin and GFAP expression by cultivated bone marrow stromal cells. J Cell Sci. 116: 32953302.
Wong, R.W. 2003 Transgenic and knock-out mice for deciphering the roles of EGFR ligands. Cell
Mol Life Sci. 60: 113-118.
Woodbury, D., Reynolds, K., Black, I.B. 2002 Adult bone marrow stromal stem cells express
germline, ectodermal, endodermal, and mesodermal genes prior to neurogenesis. J Neurosci
Res. 96: 908-917.
Woodbury, D., Schwarz, E.J., Prockop, D.J, Black, I.B. 2000 Adult rat and human bone marrow
stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61, 364-370.
Wright, A.K., Arbuthnott, G.W., Dunnett, S.B. 1991 Serotonin hyperinnervation after foetal nigra
or raphe transplantation in the neostriatum of adult rats. Neurosci Lett. 128: 281-284.
Wu, R.M., Murphy, D.L., Chiueh, C.C. 1996 Suppression of hydroxyl radical formation and
protection of nigral neurons by l-deprenyl (selegiline). Ann N Y Acad Sci. 786:379-90.
Wurmser, A.E., Gage, F.H. 2002 Stem cells: Cell fusion causes confusion. Nature 416: 485-487.
Wurst, W., Bally-Cuif, L. 2001 Neural plate patterning: upstream and downstream of the isthmic
organizer. Nat Rev Neurosci. 2: 99-108.
Xian, C.J., Zhou, X.F. 2004 EGF family of growth factors: essential roles and functional
redundancy in the nerve system. Front Biosci. 9: 85-92.
Xu, W., Zhang, X., Qian, H., Zhu, W., Sun, X., Hu, J., Zhou, H., Chen, Y. 2004 Mesenchymal
stem cells from adult human bone marrow differentiate into a cardiomyocyte phenotype in
vitro.Exp Biol Med (Maywood). 229: 623-631).
Yadid, G., Fitoussi, N., Kinor, R., Geffen, R., Gispan, I. 1999 Astrocyte line SVG-TH in rat model
of Parkinson’s disease. Prog Neurobiol. 59: 635-661.
Yamada, H., Dezawa, M., Shimazu, S., Baba, M., Sawada, H., Kuroiwa, Y., Yamamoto, I., Kanno,
H. 2003 Transfer of the von Hippel-Lindau gene to neuronal progenitor cells in treatment for
Parkinson's disease. Ann Neurol. 54: 352-359.
Yan, J., Studer, L., McKay, R.D. 2001 Ascorbic acid increases the yield of dopaminergic neurons
derived from basic fibroblast growth factor expanded mesencephalic precursors. J
Neurochem. 76: 307-311.
Yang, L., Matthews, R.T., Schulz, J.B., Klockgether, T., Liao, A.W,, Martinou, J.C., Penney, J.B.
Jr., Hyman, B.T., Beal, M.F. 1998 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyride neurotoxicity
is attenuated in mice overexpressing Bcl-2. J Neurosci. 18: 8145-8152.
237
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Yang, M.., Stull, N.D., Berk, M.A., Snyder, E.Y., Iacovitti, L. 2002 Neural stem cells
spontaneously express dopaminergic traits after transplantation into the intact or 6hydroxydopamine-lesioned rat. Exp Neurol. 177: 50-60.
Ye, W., Bouchard, M., Stone, D., Liu, X., Vella, F., Lee, J, Nakamura, H., Ang, S.L., Busslinger,
M., Rosenthal, A. 2001 Distinct regulators control the expression of the mid–hindbrain
organizer signal FGF8. Nat Neurosci. 4: 1175–1181.
Ye, W.L., Shimamura K., Rubenstein, J.L., Hynes, M.A., Rosenthal, A. 1998 FGF and Shh signals
control dopaminergic and serotonergic cell fate in the anterior neural plate. Cell 93: 755-766.
Yee, K.S., Yu, V.C. 1998 Isolation and characterization of a novel member of the neural zinc finger
factor/myelin transcription factor family with transcriptional repression activity. J Biol
Chem. 273: 5366-5374.
Ying, Q.L., Nichols, J., Evans, E.P., Smith, AG. 2002 Changing potency by spontaneous fusion.
Nature 416: 545-548.
Ying, Q.L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li M., Smith, A.G. 2003 Conversion of embryonic stem
cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21: 183–186.
Yoshikawa, K. 2000 Cell cycle regulators in neural stem cells and postmitotic neurons. Neurosci
Res. 37: 1-14.
Youdim, M.B., Ben-Shachar, D., Riederer, P. 1993 The possible role of iron in the etiopathology of
Parkinson's disease. Mov. Disord. 8:1-12.
Zawada, W.M., Cibelli, J.B., Choi, P.K., Clarkson, E.D., Golueke, P.J., Witta, S.E., Bell, K.P.,
Kane, J., Ponce de Leon, F.A., Jerry, D.J., Robl, J.M., Freed, C.R., Stice, S.L. 1998 Somatic
cell cloned transgenic bovine neurons for transplantation in parkinsonian rats. Nat Med. 4:
569-574.
Zawada, W.M., Zastrow, D.J., Clarkson, E.D., Adams, F.S., Bell, K.P., Freed, C.R. 1998 Growth
factors improve immediate survival of embryonic dopamine neurons after transplantation
into rats. Brain Res. 786: 96-103.
Zeng, X., Cai, J., Chen, J., Luo, Y., You, Z.B., Fotter, E., Wang, Y., Harvey, B., Miura, T.,
Backman, C., Chen, G.J., Rao, M.S., Freed, W.J. 2004 Dopaminergic differentiation of
human embryonic stem cells. Stem Cells. 22: 925-940.
Zetterstrom, R.H., Solomin, L., Jansson, L., Hoffe,r B.J., Olson, L., Perlmann, T. 1997 Dopamine
neuron agenesis in Nurr1-deficient mice. Science 276; 248-250.
Zhang, S.C., Wernig, M., Duncan, I.D., Brustle, O., Thomson, J.A. 2001 In vitro differentiation of
transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19:
1129-1133.
238
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Zhao, L.R., Duan, W.M., Reyes, M., Keene, C.D., Verfaillie, C.M., Low, W.C. 2002 Human bone
marrow stem cells exhibit neural phenotypes and ameliorate neurological deficits after
grafting into the ischemic brain of rats. Exp Neurol. 174: 11-20.
Zhao, M., Momma, S., Delfani, K., Carlen, M., Cassidy, R.M., Johansson, C.B., Brismar, H.,
Shupliakov, O., Frisen, J., Janson, AM. 2003 Evidence for neurogenesis in the adult
mammalian substantia nigra. Proc Natl Acad Sci U S A. 100: 7925-7930.
Zhou, Y., Zheng, J.B., Gu, X. et al. 2000 A novel Pax-6 binding site in rodent B1 repetitive
elements: coevolution between developmental regulation and repeated elements? Gene 245:
319-328.
Zigova, T., Song, S., Willing, A.E., Hudson, J.E., Newman, M.B., Saporta, S., Sanchez-Ramos, J.,
Sanberg, P.R. 2002 Human umbilical cord blood cells express neural antigens after
transplantation into the developing rat brain. Cell Transplant. 11: 265-274.
Zimmer, L., Delion-Vancassel, S., Durand, G., Guilloteau, D., Bodard, S., Besnard, J.C., Chalon S.
2000 Modification of dopamine neurotransmission in the nucleus accumbens of rats deficient
in n-3 polyunsaturated fatty acids. J Lipid Res. 41: 32-40.
Zimmer, L., Vancassel, S., Cantagrel, S., Breton, P., Delamanche, S., Guilloteau, D., Durand, G.,
Chalon, S. 2002 The dopamine mesocorticolimbic pathway is affected by deficiency in n-3
polyunsaturated fatty acids. Am J Clin Nutr. 75: 662-667.
Zimprich, A., Muller-Myhsok, B., Farrer, M., Leitner, P., Sharma, M., Hulihan, M., Lockhart, P.,
Strongosky, A., Kachergus, J., Calne, D.B., Stoessl, J., Uitti, R.J., Pfeiffer, R.F.,
Trenkwalder, C., Homann, N., Ott, E., Wenzel, K., Asmus, F., Hardy, J., Wszolek, Z.,
Gasser, T. 2004 The PARK8 Locus in Autosomal Dominant Parkinsonism: Confirmation of
Linkage and Further Delineation of the Disease-Containing Interval. Am. J. Hum. Genet.
74:11-19.
Zipori, D. 1990 Regulation of hemopoiesis by cytokines that restrict options for growth and
differentiation. Cancer Cells 2: 205–211.
Zipori, D. 2004 The nature of stem cells: state rather than entity. Nat Rev Genet. 5: 873-878.
Ziv, I, Zilkha-Falb R., Offen D, Shirvan, A., Barzilai, A., Melamed, E. 1997 Levodopa induces
apoptosis in cultured neuronal cells--a possible accelerator of nigrostriatal degeneration in
Parkinson's disease? Mov. Disord. 12: 17-23.
Ziv, I., Offen, D., Barzilai, A., Haviv, R., Stein, R., Zilkha-Falb, R., Shirvan, A., Melamed E. 1997
Modulation of control mechanisms of dopamine-induced apoptosis--a future approach to the
treatment of Parkinson's disease? J. Neural. Transm. Suppl. 49: 195-202.
239
‫תאי עצב דופאמינרגים‬-‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‬
‫רשימת ספרות‬
Ziv, I., Offen, D., Haviv, R., Stein, R., Panet, H., Zilkha-Falb, R., Shirvan, A., Barzilai, A.,
Melamed, E. 1997 The proto-oncogene Bcl-2 inhibits cellular toxicity of dopamine: possible
implications for Parkinson's disease. Apoptosis. 2: 149-55.
Zulewski, H., Abraham, E.J., Gerlach, M.J., Daniel, P.B., Moritz, W., Muller, B., Vallejo, M.,
Thomas, M.K., Habener, J.F. 2001 Multipotential nestin-positive stem cells isolated from
adult pancreatic islets differentiate ex vivo into pancreatic endocrine, exocrine, and hepatic
phenotypes. Diabetes. 50 :521-533.
Zweidler-Mckay, P.A., Grimes, H.L., Flubacher, M.M., Tsichlis, P.N. 1996 Gfi-1 encodes a
nuclear zinc finger protein that binds DNA and function as a transcriptional repressor. Mol.
Cell. Biol. 16: 4024-4034.
240
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫אישורי ועדות הלסינקי‬
‫אישורי ועדות הלסינקי‬
‫• אישור ועדת הלסינקי לניסויים רפואיים בבני אדם‪ ,‬בית‪-‬‬
‫החולים לניאדו‬
‫• אישור ועדת הלסינקי לניסויים רפואיים בבני אדם‪,‬‬
‫אוניברסיטת תל‪-‬אביב‬
‫• אישור לשימוש במודלים ניסויים למחלת פרקינסון‬
‫בחולדות‪ ,‬אוניברסיטת תל‪-‬אביב‬
‫• אישור לשימוש במודלים ניסויים למחלת פרקינסון‬
‫בעכברים‪ ,‬אוניברסיטת תל‪-‬אביב‬
‫‪241‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫אישורי ועדות הלסינקי‬
‫‪242‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫אישורי ועדות הלסינקי‬
‫‪243‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫אישורי ועדות הלסינקי‬
‫‪244‬‬
‫השראת התמיינות תאי גזע מזנכימלים מרקמת מח עצם אנושית לתאים דמויי‪-‬תאי עצב דופאמינרגים‬
‫אישורי ועדות הלסינקי‬
‫‪245‬‬
TEL AVIV UNIVERSITY
SACKLER SCHOOL OF MEDICINE
DEPARTMENT OF CLINICAL BIOCHEMISTRY
INDUCED DIFFERENTIATION OF HUMAN BONE
MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS INTO
DOPAMINERGIC NEURONS-LIKE CELLS
THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE
“DOCTOR OF PHILOSOPHY”
BY
LEVY YOSSEF
SUBMITTED TO THE SENATE OF TEL AVIV UNIVERSITY
SEPTEMBER 2005
This work was carried out under the supervision of
Prof. Eldad Melamed
Dr. Daniel Offen
Induced Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Into Dopaminergic
Neurons-Like Cells
Table of Content
Table of Content
Table of Content (Hebrew)
I-V
List of Figures
VI-VII
List of Tables
VIII
List of Abbreviations
IX-XV
Hebrew Abstract……………….………………………………………
‫ד‬-‫א‬
Introduction……………………………………………………………
1-69
Research Goals………………………………………………………..
70
Materials and Methods………………………………………………..
71-101
Results…………………………………………………………………
102-153
Discussion…………………………………………….……………….. 154-192
References……………………………………………………………..
193-293
Helsinki Committee…………………………………………………...
294
English Abstract ………………………………………………………
A-D
Induced Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Into Dopaminergic
Neurons-Like Cells
Abstract
Abstract
Parkinson’s disease (PD) is a neurological disturbance characterized by uncontrollable shaking,
rigidity, stiffness, instability and lack of mobility. These symptoms appear after the degeneration of
at least 60% of dopaminergic nerve cells in the Substantia Nigra pars compacta (SNpc) which
results in dopamine not reaching its target (the striatum) in sufficient quantity. There are several
treatments currently in use for PD, all of which target a reduction in disease symptoms, but do not
eliminate the cause of damage to the dopaminergic cells in the SNpc. Moreover, they do not prevent
atrophy of the neurons, and thus do not prevent the disease progression. Among the most popular
pharmacological treatments of PD are L-DOPA, an agonist to dopaminergic receptors, and several
inhibitors of the enzymes that break down dopamine. Many patients react favorably to the L-DOPA
treatment at first, but not as the disease progresses. As the pathology of PD is clear, i.e. a lack of
dopamine in the striatum, many researchers have concentrated on supplying dopamine to the “target
area”.
Over the past 20 years the search for an alternative treatment has lead to the transplantation of
dopminergic neuron cells into the brains of PD patients. The idea behind using neurons for
treatment of neuro-degenerative diseases is to replace the injured cells in the damaged area with
new ones, thus maintaining functional neural activity. In experiments in the early 90’s,
mesencephalic cells from human embryos of 6-8 weeks old, transplanted in the brains of PD
patients, were shown to adapt well and assimilate in the transplantation area and even initiated
production and release of dopamine. The monitored cells survived in 85% of the patients and in
some cases were detected up to 10 years after transplantation. Symptoms were significantly reduced
after transplantation, an improvement exceeding that of L-DOPA treatment, and patients did not
require any further pharmacological treatment.
A
Induced Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Into Dopaminergic
Neurons-Like Cells
Abstract
However, two double-blind experiments of mesencephalic cell transplantation reported that there
was little, if any, improvement and only at a young age or in mild cases. Moreover, 56% of the
patients developed dyskinesis even when they did not take any drugs. In one study, inflammation
was observed in the transplanted area, apparently as a result of an immune reaction and even partial
rejection of the transplanted cells. These reports have cast a pall on the efficacy of transplanting
embryonic cells in the adult, and demonstrate the moral dilemmas and serious biological obstacles
standing in the way of the use of human embryonic cells as a source for transplants.
Other studies concentrated on the use of bone marrow derived stem cells. In addition to cells of the
hematopoietic system, the bone marrow also contains a population of mesenchymal stem cells that
are a source for the development of bone, muscle, fat, tendons and cartilage cells. Recent studies
demonstrated the induction of mesenchymal stem cells differentiation into cells with neuronal
characteristics. Moreover, cells transplanted into rodents migrated throughout the brain and
developed into neuron-like cells. However, as yet no studies have reported the differentiation of
mesenchymal cells into active dopaminergic neuronal cells. The advantage of this type of cell is that
ethical problems accompanying the use of embryonic cells do not arise and as the adult patient’s
own cells are used, and transplantation would not initiate immunological complications that would
require pharmacological intervention.
The aim of this study is to induce the differentiation of human bone marrow mesenchymal cells to
dopaminergic neurons in vitro, using various growth factors and to transplant the differentiated cells
into rodent models of Parkinson’s disease, and to monitor changes in symptoms following
transplantation.
Breifly, samples of human bone marrow were obtained from donors, mononuclear cells were
separated using a Ficoll gradient and were seeded on polystyrene plates. After 48 hours, the growth
medium was washed and with it all the non-adherent hematopoeitic cells, thus leaving the plastic
adherent mesenchymal stem cell population. Cell antigens were characterized by flow-cytometry
B
Induced Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Into Dopaminergic
Neurons-Like Cells
Abstract
analysis, establishing that within a month after their production from human bone marrow, the
cultured cells expressed CD29, CD44, CD90 and CD105 mesenchymal markers. However, no
expression of hematopoeitic markers such as CD34 and CD45 was detected.
Induction of differentiation into neuronal dopaminergic cells was performed in two stages. First,
the differentiation medium was composed of epidermal growth factor (EGF), fibroblast growth
factor (bFGF); omega-3 type fatty acid, docosahexaenoic, and an N2 supplement essential for the
neuronal development. The medium of the second stage of differentiation consisted of intracellular
cAMP elevating factors, antioxidants, retinoic acid, N2 supplement, nerve growth factor (NGF) and
glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF).
Induction of differentiated neuronal dopaminergic cells was accompanied by impressive
morphological changes of the cell population, going from fibroblasts-like cells to neuronal-like
shapes. The differentiated cells exhibited a genetic expression profile specific to neuronal cells,
expressing genes such as: CD90, glypican-4, necdin, nestin, neurite growth-promoting factor 2,
neurofilament-heavy (NF-200), neurofilament-light, neurofilament-medium, neuron specific enolase
(NSE), neurotrophic tyrosine kinase receptor type 2, patched homolog, and retinoic acid receptor
type A. Differentiation was also accompanied by the expression of proteins specific to neuronal
cells: α-synuclein, β-tubulin III, glial acidic fibrillary protein, microtubule-associated protein 2,
nestin, NF-200, NSE, neuronal nuclei protein, and tryptophan hydroxylase. In addition, we
observed that mesenchymal cells that had differentiated into neuron–like cells, exhibited
electrophysiologic characteristics similar to those of neurons.
Moreover, we found that the cells that had differentiated to dopaminergic neurons, demonstrated
gene expression of transcription factors specific to dopaminergic cells such as: engrailed 1, nuclear
receptor related 1, paired-like homeodomain transcription factor 3. Moreover, we established the
expression of genes of all the key enzymes for the synthesis and metabolism of dopamine, as well
as channels characteristic of dopaminergic cells such as: aromatic L-amino acid decarboxylase,
C
Induced Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Into Dopaminergic
Neurons-Like Cells
Abstract
catechol-o-methyltransferase, dopamine transporter, dopamine receptor D2, monoamine oxidase B,
tyrosine hydroxylase (TH), vesicular monoamine transporter 2 was detected in the cells.
An increase in neuronal gene expression following differentiation was found to correlate to a rise in
levels of tyrosine hydroxylase, the rate-limiting enzyme of dopamine production. After incubation
in differentiation medium for 48 hours, we were able to identify L-DOPA and dopamine in the
medium, by HPLC analysis. Finally, transplantation of murine mesenchymal cells following
neuronal differentiation in vitro brought about a significant improvement of symptoms in the rodent
model of Parkinson’s disease.
The results of this study support the notion that mesenchymal stem cells from human bone marrow
are capable of differentiation to cells featuring distinct neural attributes. These cells could
potentially be used for replacement or protection of the dopaminergic system by autologous cell
transplantation in Parkinson’s disease patients.
D