Bacheloroppgave 2013
UTVIKLING AV EN VÆSKEKROMATOGRAFISKTANDEM-MASSESPEKTROMETRISK ANALYSEMETODE FOR SYNTETISKE CANNABINOIDER BIOIN-112 DET HELSEVITENSKAPELIGE FAKULTET INSTITUTT FOR MEDISINSK BIOLOGI BIOINGENIØRUTDANNING KANDIDATNUMMER: 5 OG 6 2013 1 Forord Som avsluttende bacheloroppgave ved bioingeniørutdanningen ved Universitetet i Tromsø (UIT), har vi bidratt til å starte utviklingen av en analysemetode for syntetiske cannabinoider ved Massespektrometri-laboratoriet (MS-laboratoriet) ved Universitetssykehuset Nord-Norge (UNN). Metodeutviklingen innebar en modifisering av laboratoriets analysemetode for Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) og til slutt en validering av den utviklede metoden. Vi er veldig takknemlig overfor vår veileder Ole-Martin Fuskevåg for svært god veiledning, faglig støtte og tilrettelegging av det praktiske arbeidet under metodeutviklingen. Vi ønsker også å takke de andre ansatte ved MS-laboratoriet for å få oss til å føle velkomne, og ikke minst hjelpen de har gitt oss med mange praktiske småting. Til slutt ønsker vi å takke vår skriveveileder Kirsten Raanaas Huseby ved UIT for den gode skriveveiledningen vi har fått underveis for skrivearbeidet med oppgaven. Sammendrag I denne oppgaven ble det utviklet en metode for analysering av syntetiske cannabinoider ved å bruke væskekromatografi-tandem-massespektrometri(LC-MS/MS), for å undersøke om metoden kan brukes til å analysere pasientprøver. For å skape best grunnlag for denne oppgaven ble det samlet inn faglitteratur fra biblioteket ved UIT, internasjonale forskningsrapporter og dokumenter fra MS-laboratoriet ved UNN. Forsøket begynte med pilotundersøkelser som gikk ut på å teste tjue organiske løsemidler og fire bufferløsninger for å se hvilken kombinasjon av disse ekstraksjonsreagensene som ga best ekstraksjon av oppgavens utvalg av syntetiske cannabinoider. Utvalget av organiske løsemidler og bufferløsninger var basert på de som brukes i rutineanalysene ved MSlaboratoriet ved UNN og faglitteraturen (14). Pilotundersøkelsen besto av fem testrunder/eliminasjonsrunder der den femte testrunden i utgangspunktet skulle gi en avgjørelse på hvilket organisk løsemiddel og bufferløsning som ville gi best ekstraksjon. For å stå igjen med det beste organiske løsemidlet og den beste bufferløsningen ble det fulgt fire 2 kriterier i de to første testrundene og fem kriterier i den tredje testrunden. Disse kriteriene er listet opp henholdsvis i tabell 20, 23 og 26. Ved å følge disse kriteriene kom man frem til at Diklormetan (DCM) og bufferløsning 4 (Ammoniumkarbonat) utgjorde de beste ekstraksjonsreagensene for analysemetoden. Ettersom pilotundersøkelsen ga en tilfredsstillende konklusjon angående best egnede ekstraksjonsreagenser, gikk man videre med å validere metoden. Metoden ble validert etter valideringsparameterne linearitet, reproduserbarhet, presisjon, gjenvinning, LOQ/LOD (Limit of Quantification/Limit of Detection) og systempresisjon. Resultatene til valideringen indikerte at metoden har potensial til å bli en rutineanalyse. Men metoden innfridde ikke flere av kravene satt for valideringsparameterne, og valideringsprosessen skulle vært gjort på nytt. Dette ble ikke gjort i denne omgang på grunn av tidsbegrensning. 3 Innholdsfortegnelse Forord ........................................................................................................................................... 2 Sammendrag .............................................................................................................................. 2 1. Introduksjon .......................................................................................................................... 8 1.1 Formålet med oppgaven .....................................................................................................................................8 2. Teori .......................................................................................................................................... 9 2.1 Effekten av syntetiske cannabinoider........................................................................................................ 10 2.2 LC-MS/MS .............................................................................................................................................................. 11 2.3 Massespektrometri ............................................................................................................................................ 13 2.3.1 Generelt .......................................................................................................................................................................................................... 13 2.3.2 Ionekilder ...................................................................................................................................................................................................... 13 2.3.3 ESI ..................................................................................................................................................................................................................... 13 2.4 Masseanalysator ............................................................................................................................................................................................ 14 2.5 Deteksjon ........................................................................................................................................................................................................... 16 2.5.1 Standardkurver .......................................................................................................................................................................................... 16 2.5.2 Internstandardmetoden ......................................................................................................................................................................... 17 2.5.3 Prøveopparbeidelse ................................................................................................................................................................................. 17 2.6 Validering av metode ........................................................................................................................................ 18 2.6.1 Presisjon......................................................................................................................................................................................................... 19 2.6.2 Nøyaktighet .................................................................................................................................................................................................. 19 2.6.3 Linearitet ....................................................................................................................................................................................................... 19 2.6.4 Gjenvinning................................................................................................................................................................................................... 19 2.6.5 LOD/LOQ ....................................................................................................................................................................................................... 20 3. Materiale og metoder...................................................................................................... 21 3.1 Utstyr ....................................................................................................................................................................... 21 3.2 Serum ...................................................................................................................................................................... 21 3.3 Vann ......................................................................................................................................................................... 21 3.4 Buffer ....................................................................................................................................................................... 21 3.5 Mobilfase ................................................................................................................................................................ 21 4. Fremgangsmåte ................................................................................................................. 24 5. Resultater ......................................................................................................................... 45 5.1 Kromatogrammet til forbindelsens datterioner, ekstrahert fra en spiked urinprøve........... 45 5.2 Pilotundersøkelse av ulike ekstraksjonsreagenser for å finne den beste væske-væske ekstraksjonsmetoden. .............................................................................................................................................. 46 5.2.1 Testrunde 1. ...................................................................................................................................................... 46 5.2.2 Testrunde 2 ....................................................................................................................................................... 48 5.2.3 Testrunde 3 ....................................................................................................................................................... 50 5.2.4 Testrunde 4 ....................................................................................................................................................... 51 4 5.2.5 Testrunde 5 ....................................................................................................................................................... 51 5.3 Eksempler på lineære standardkurver for forbindelsene JWH-018, 073 og metabolittene deres ................................................................................................................................................................................ 52 5.4 Validering .............................................................................................................................................................. 54 5.4.1 Aksept kriteria for valideringen ............................................................................................................... 54 5.4.2 Linearitet ............................................................................................................................................................ 54 5.4.3 Presisjon ............................................................................................................................................................. 54 5.4.4 Reproduserbarhet .......................................................................................................................................... 54 5.4.5 Systempresisjon .............................................................................................................................................. 55 5.4.6 LOD og LOQ ....................................................................................................................................................... 55 5.4.7 Gjenvinning ....................................................................................................................................................... 55 5.4.8 Linearitet ............................................................................................................................................................ 56 5.4.9 Presisjon ............................................................................................................................................................. 58 5.4.10 Reproduserbarhet ....................................................................................................................................... 59 5.4.11 Systempresisjon............................................................................................................................................ 61 5.4.12 LOD og LOQ..................................................................................................................................................... 62 5.4.13 Gjenvinning..................................................................................................................................................... 63 6.1 Pilotundersøkelse............................................................................................................................................... 66 6.1.1 Testrunde 1 ....................................................................................................................................................... 66 6.1.2 Testrunde 2 ....................................................................................................................................................... 67 6.1.3 Testrunde 3 ....................................................................................................................................................... 67 6.1.4 Testrunde 4 ....................................................................................................................................................... 67 6.1.5 Testrunde 5 ....................................................................................................................................................... 68 6.2 Feilkilder ................................................................................................................................................................ 68 6.3 Validering .............................................................................................................................................................. 69 6.3.1 Linearitet ............................................................................................................................................................ 69 6.3.2 Nøyaktighet ....................................................................................................................................................... 69 6.3.3 Presisjon ............................................................................................................................................................. 69 6.3.4 Systempresisjon .............................................................................................................................................. 69 6.3.5 Reproduserbarhet .......................................................................................................................................... 69 6.3.6 LOD og LOQ ....................................................................................................................................................... 70 6.3.7 Gjenvinning ....................................................................................................................................................... 70 6.4 Feilkilder ................................................................................................................................................................ 70 6.5 Konklusjon ............................................................................................................................................................ 71 6.5.1 Pilotundersøkelse ........................................................................................................................................... 71 6.5.2 Validering ........................................................................................................................................................... 71 7. Kilder .................................................................................................................................. 72 Vedlegg 1: Analyseprosedyre for THC 5 Forkortelser ACN Acetonitril JWH John W. Huffman CV Coefficient of variation KV Konespenning KE Kollisjonsenergi kV Kilo Volt ESI Electrospray ionization HPLC High performance Liquid Chromatography IS Interstandard LC Liquid Chromatography m/z masse/ladning ratio MS/MS Tandem mass spectrometry SD Standardavvik UPLC Ultra performance Liquid Chromatography Mw Molekylvekt VVE Væske-væske ekstraksjon LOD Limit of detection LOQ Limit of quantitation MS Massespektrometri TBME Tert-butylmetyleter MeOH Metanol DCM Diklormetan D:E Dietyleter:Etylacetat n-H:D n-Heksan: Dietyleter n-H:D:E n-Heksan:Dietyleter:Etylacetat TBME:ETOAC Tert-butyl metyleter:Etylacetat THC Δ9-Tetrahydrocannabinol n-H:E n-Heksan:Etylacetat IPA Isopropanol IS Internstandard T:IMA Toluen:Isoamylalkohol 6 n- H n-Heksan IMA Isoamylalkohol SH Sykloheksan KB Klorbutan UIT Universitet i Tromsø UNN Universitetssykehuset i Nord-Norge RSD Relative Standard Deviation OFK Omvendt-Fase-Kromatografi Q1 Første kvadrupol Q3 Tredje kvadrupol Q2 Kvadrupol nummer 2 MRM Multiple Reaction Monitoring APPI Atmospheric-pressure Photo Ionization APCI Atmospheric-Pressure Chemical Ionization IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry ICH International Conference of Harmonization GJ Gjenvinning 7 1. Introduksjon I løpet av 2011 og 2012 er det gjort flere større beslag av syntetiske cannabinoider i Norge som er klassifisert som narkotika. Men det kommer stadig nye strukturmodifiserte syntetiske cannabinoider som markedsføres over internett som lovlig cannabis. Derfor er det en pågående «konkurranse» mellom myndighetene og produsenter, med tanke på å føre disse nye syntetiske cannabisforbindelsene opp som narkotika og utvikle nye strukturer som ikke klassifiseres som narkotika. Syntetiske cannabinoider kan medføre alvorlige tilstander som kan være livstruende. Man får en liknende effekt som cannabisrus men i sterkere grad. (1) Per dags dato, mai 2013, er det ikke etablert noen rutineanalyse for syntetiske cannabinoider ved UNN. Derfor er det viktig å få startet utviklingen av en analysemetode for slike forbindelser, som kan etableres som en del av rutineanalysene på MS-laboratoriet ved UNN. Det kommer stadig endrede strukturer av syntetiske cannabinoider. Dermed bør metoden oppdateres i takt med utbredelse i bruk av de nye syntetiske cannabinoider. 1.1 Formålet med oppgaven Formålet med oppgaven var å utvikle en LC-MS/MS metode for kvantifisering av syntetiske cannabinoider («Spice») i urin. De mest vanlige syntetiske cannabinoider JWH-018 og JWH073 og deres hovedmetabolitter ble valgt ut. 8 2. Teori John W. Huffman (JWH) er professor i organisk kjemi ved Clemson University i USA. Han var den som syntetiserte de første syntetiske cannabinoider i 1990-årene (2), for å bruke dem som et mulig terapeutisk produkt. Figur 1. Figuren viser cannabinoidreseptorene (CB1 og CB2) og deres lokalisasjon. (3) Syntetiske cannabinoider inntas vanligvis ved røyking, men kan også inntas ved inhalasjon eller peroralt (4). Det finnes to cannabinoidreseptorer (CB1 og CB2) som er de samme reseptorene som blir stimulert ved å røyke vanlig cannabis. CB1-reseptorene er lokaliser i sentralnervesystemet, mens CB2-reseptorene er lokalisert i immunsystemet (4). Ved bruk av THC blir det delvis aktivering ved binding til CB1- og CB2-reseptorene, mens ved å bruke syntetiske cannabinoider blir CB1-reseptorene aktivert maksimalt, selv ved lav konsentrasjon. Bortsett fra at syntetiske cannabinoider omdannes av leverenzymer, vet man ikke hvordan stoffenes absorpsjon, distribusjon, metabolisme og eliminasjon fungerer. 9 Figur 2. Strukturer til et utvalg syntetisk cannabinoider. (5) 2.1 Effekten av syntetiske cannabinoider Under en internett-undersøkelse som ble gjort rapporterte 87 % av brukerne positive effekter, mens 40 % rapporterte om uønskede effekter. Negative eller uønskede effekter er blant annet kramper, koma, hypertensjon, kvalme, depresjon, psykose og i verstefall livstruende effekter ved langvarig bruk. I tillegg til disse er syntetiske cannabinoider avhengighetsskapende og man kan fort få en overdose på grunn av at forskjellen mellom doser som gir effekt og doser som kan være skadelige er liten. (1) 10 2.2 LC-MS/MS LC-MS/MS er et instrument som består av fire hoveddeler i tillegg til en datamaskin, se figur 3. Figur 3. Skjematisk fremstilling av et massespektrometer. Instrumentet er satt sammen av et tandem-massespektrometer som er koblet sammen med en væskekromatograf. Massespektrometrisk analyse av rusmidler og legemidler i biologiske prøver er en meget spesifikk og utbredt metode som benyttes både til kvantitative og kvalitative analyser. Kromatografi er en betegnelse på metoder som brukes til å separere stoffer fra hverandre. Stoffer som føres inn i en væskekromatograf separeres på grunnlag av stoffenes kjemisk affinitet til det som kalles mobilfasen og stasjonærfasen. Mobilfasen er en væske som prøvestoffene suspenderes i etter en prøveopparbeidelse, og som pumpes gjennom LC-MS/MS systemets kolonne og kapillærrør med en bestemt hastighet. De stoffene i en prøve som har større affinitet til stasjonærfasen enn mobilfasen vil strømme saktere gjennom kolonnen enn de stoffene som har større affinitet til mobilfasen. Det forutsettes at mobilfasen har en jevn hastighet gjennom kolonnen, som ivaretas av pumpesystemet i LC-delen av LCMS/MS instrumentet. På grunnlag av dette kan man separere forskjellige stoffer i en prøve fra hverandre ved at stasjonærfasen retarderer de ulike stoffene i ulik grad. Stoffene kan på denne måten separeres fra hverandre og kvantiteres ved at de elueres inn MS detektoren. Den elektriske detektorresponsen for analyttene bearbeides av en tilkoblet datamaskin som viser konsentrasjon av analyttmolekylene i form av et kromatogram. (6) 11 Figur 4. Figuren viser et skjematisk oppsett for et LC-MS/MS instrument, modifisert fra (7) Det finnes forskjellige typer væskekromatografi, men Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC) med omvendt-fase-kromatografi (OFK) er den som omtales i denne teksten. UPLC innebærer at stasjonærfasen består av små runde og like store partikler, pakket uniformt inn i en kolonne. OFK innebærer at stasjonærfasen har hydrofobe grupper som dekker deres overflate. Mobilfasen som benyttes ved OFK består av en miks av vann og organiske løsemidler som er blandbare med vann, slik som metanol (MeOH) og acetonitril (ACN). Retensjonsmekanismene ved OFK består av et samspill mellom stasjonærfasen og mobilfasen. Ved OFK retarderes stoffene i en prøve av stasjonærfasen med hydrofobe bindinger, slik som van der Waals-krefter. I denne bacheloroppgaven ble det og benyttet en HSS T3 kolonne som er en hybrid, som betyr at den kan retardere både polare og nøytrale forbindelser med det fabrikanten kaller T3 binding. (6)(8) Konsentrasjonen av organiske løsemidler i mobilfasen er faktoren som regulerer retensjonen av stoffer i kolonnen. Nøytrale forbindelsers retensjon minker når konsentrasjonen av organiske løsemidler øker, og motsatt for polare forbindelser. (6) 12 2.3 Massespektrometri 2.3.1 Generelt LC-delen eluerer analyttmolekylene fra prøven inn i MS/MS delen av instrumentet. Prøvemolekylene vil først ankomme ionekilden der de ioniseres. Etter ioniseringen ledes de ioniserte prøvemolekylene inn i masseanalysatoren ved hjelp av elektriske spenninger. I masse analysatoren separeres de ioniserte prøvemolekylene basert på deres masse til ladnings forhold (m/z) og ledes til en detektor som registrerer prøvemolekylene. (6) 2.3.2 Ionekilder Det finnes flere forskjellige typer ionekilder som anvendes i LC-MS/MS instrumenter som f.eks. Elektrosprayionisasjon (ESI), Atmospheric - Pressure Chemical Ionization (APCI) og Atmospheric-pressure Photo Ionization (APPI). I denne teksten vil kun ESI omtales. Dette er en meget utbredt ioniseringsteknikk for prøvestoffer ved bruk av MS for deteksjon med væskekromatografi i form av High Performance Liquid Chromatography (HPLC) eller UPLC. (6) 2.3.3 ESI ESI er en ioniseringsteknikk som foregår under atmosfærisk trykk og er en såkalt myk ioniseringsteknikk. Myk ioniseringsteknikk vil si at det for det meste dannes ioniserte prøve/analyttmolekyler som ikke fragmenteres videre. Ved bruk av ESI føres analyttmolekylene, som er suspendert i en strøm av mobilfase, inn i MS ved å passere gjennom et kapillærrør. Når mobilfasen når utgangen av kapillæret forstøves væsken til aerosoler ved hjelp av nitrogengass og varme. Enden på utgangen av kapillæret er en elektrode som kan ha en spenning på flere kilovolt (kV) f.eks. 2 kV. Spenningen på elektroden gir aerosolene en elektrisk ladning som kan være enten positiv eller negativ, dette avhenger av om instrumentet er stilt inn på positiv eller negativ ioniseringsmodus. Ved positiv modus oksiderer elektroden aerosolene og ved negativ modus reduserer den. Mobilfasen som benyttes ved OFK er relativt flyktig og aerosolene vil etter hvert fordampe. Fordampingsprosessen hjelpes ved at de ladede aerosolene dusjes med en strøm av nitrogengass som kalles tørkegass. Etter å ha blitt dusjet med tørkegass gjenstår bare de ioniserte analyttmolekylene som føres videre inn i MS sin masseanalysator ved hjelp av elektrisk spenning. (6) 13 Figur 5. : Figuren viser en skisse over ioniseringsteknikken ESI. (9) 2.4 Masseanalysator Masseanalysatoren i de fleste LC-MS/MS instrumenter som benyttes i dag er bygd etter kvadrupolprinsippet. En kvadrupol masseanalysator består av fire parallelle metall staver der det pålegges felt av likestrøm (DC) og radiofrekvenser mellom dem. Styrken på likestrømmen og frekvensen til radiosignalet i det pålagte feltet, bestemmer hvilke ioner som får passere videre gjennom masseanalysatoren til detektoren, basert på deres m/z. Endring av styrken på likestrømmen, og frekvensen på radiofrekvensen, regulerer hvilke m/z verdier som skal slippes gjennom til detektoren. Disse endringene utføres med programvaren til instrumentet på en datamaskin. 14 Figur 6. Figuren viser en kvadrupol som slipper gjennom ioner med den rette m/z i forhold til styrken på likestrømmen og radiofrekvensen i feltet mellom stavene. (10) I LC-MS/MS instrumenter som benyttes til kvantifisering av stoffer, benyttes det masseanalysatorer bestående av trippel-kvadrupoler. Trippel-kvadrupol analysatorer består av tre sett kvadrupoler men det er kun første kvadrupol (Q1) og tredje kvadrupol (Q3) som fungerer som masseanalysator. Kvadrupol nummer 2 (Q2) kalles en kollisjonscelle. Q1 fungerer som et massefilter som akselererer de ionene med valgt m/z videre til Q2, de ionene som ikke har korrekt m/z filtreres ut ved at de kolliderer med metall stavene og går til grunne. I Q2 kolliderer analyttionene med en inert gass som for eksempel argon. Resultatet av kollisjonen er at analyttionene fragmenters til ioner med mindre masse enn utgangspunktet. Fragment ionene akselereres videre til Q3 hvor det foretas en ny masse filtrering der fragment ionene med korrekt m/z sendes videre til detektoren. (10) Figur 7. Skisse av en trippel-kvadrupol, modifisert fra (11) 15 2.5 Deteksjon For kvantifisering av rusmidler og legemidler benyttes ofte analysemodusen som kalles Multiple Reaction Monitoring (MRM). MRM analyse modus utføres med triple-kvadrupol masseanalysatorer og man kan kvantitere flere ulike typer analyttmolekyler samtidig. Dette utføres ved at man låser Q1 til m/z verdiene for de aktuelle stoffene som skal analyseres. De ioniserte analyttmolekylene som analyseres omtales som morioner fordi man ved MRM fragmenterer morioner til datterioner, grunnen til dette omtales senere. Morionene i Q1 akselereres videre til kollisjonscellen Q2 hvor de fragmenteres til datterioner med et bestemt m/z. (6)(12) Fragmenteringen av morioner til datterioner med et bestemt m/z kalles en overgang og skrives ofte som (morion masse -> datterion masse) (12). Fragmenteringen av morioner reguleres av den kollisjonsenergien som er stilt inn for kollisjonscellen. I Q3 akselereres datterionene til detektoren som registrerer ionene. Programvaren på datamaskinen som er koblet til instrumentet lager et plott kalt massekromatogram basert på detektorresponsen og retensjonstiden til stoffene som kvantiteres. Et massekromatogram er en plotting av intensiteten til den detekterte massen som funksjon av retensjonstiden for analytten. Et eksempel på et massekromatogram er vist i figur 14 under resultater. MRM er en svært følsom og spesifikk analysemodus, fordi datterionene man kan danne med denne modusen er vanligvis veldig spesifikk for en gitt analytt, dermed vil påvisningen av datter-ioner med gitte masser gi en sikker identifikasjon av analytten. Dette gir med andre ord analysemetoden en svært høy selektivitet og sensitivitet. Fordi alle andre stoffer som kan gi bakgrunnsstøy, på grunn av lik masse med morionene til analytten, blir eliminert når ionene i kollisjonscellen fragmenteres. (6) 2.5.1 Standardkurver For å finne den ukjente konsentrasjonen til analytter i en prøve, settes det opp en standardkurve for hvert stoff som skal kvantifiseres. Standardkurver som benyttes i LCMS/MS består av topparealer (detektorresponsen i massekromatogrammet) fra standarder som inneholder kjente konsentrasjoner av stoffet som skal kvantifiseres. Når det analyseres samme volum av standardløsninger og prøveløsninger, kan den ukjente konsentrasjonen til analytten beregnes. Beregningen av den ukjente konsentrasjonen til analytten skjer på bakgrunn av at 16 dens toppareal i massekromatogrammet plottes som funksjon av konsentrasjonen. Denne beregningen utføres av programvaren på datamaskinen koblet til LC-MS/MS instrumentet. (6) 2.5.2 Internstandardmetoden For analyser med prøveopparbeidelser som inkluderer ekstraksjon av analytt fra prøven, kan analyse uten internstandard (IS) gi utilfredsstillende nøyaktighet og presisjon. Dette er på grunn av tilfeldige endringer som kan skje under prøveopparbeidelsen og mikroskopiske tap av prøveløsning ved overføringer fra et reagensrør til et annet. For slike analyser er det vanlig å benytte en IS i tillegg. En IS består av kjente konsentrasjoner av samme forbindelse som analytten, som er isotopmerket. Siden internstandarden vil oppføre seg likt med analytten under prøveopparbeidelsen, vil den korrigere for de tilfeldige endringene som måtte skje i løpet av den prosessen. (6) 2.5.3 Prøveopparbeidelse Rusmiddel- og legemiddelanalyser utføres stort sett på prøver med en biologisk matrise som urin eller blod. Sammensetningen av disse prøvematrisene er for kompleks til at prøvene kan analyseres direkte, og må opparbeides til løsninger som kan introduseres for LC-MS/MS instrumenter. En problematikk med de biologiske matrisene blod og urin er at de kan inneholde ett eller flere stoffer som gir samme detektorrespons som analytten. Dette er en interferensproblematikk der responsen til analytten ikke kan skilles fra det eller de interfererende stoffene. En annen problematikk er at prøvematriser slik som blod og urin inneholder proteiner som ikke er løselig i mobilfasen. Proteinene kan dermed felles ut i injektoren og kolonnen til LCMS/MS systemet slik at det tettes igjen. For å hindre ødeleggelse av LC-MS/MS instrumenter er det vanlig prosedyre ved MS-laboratoriet på UNN å ekstrahere analyttene ut fra prøvematrisen før prøvene analyseres med væske-væske-ekstraksjon (VVE). VVE benytter seg av egenskapen organiske forbindelser har til å fordele seg mellom en polar (vandig) og upolar (organisk løsemiddel) væske. Hensikten med VVE er å benytte et organisk løsemiddel som løser analytten godt og de interfererende stoffene dårlig. Normalt sett er det bare den nøytrale formen av analytter som vil ekstraheres fra den polare matrisen og over i det organiske løsemidlet. Dermed vil ekstraksjonsutbyttet man får av en analytt avhenge av pH i den vandige fasen hvis analytten er en base eller syre. Hvis analytten for eksempel er en svak base må VVE løsningen tilsettes en basisk buffer for å gjøre analytten nøytral. 17 Den praktiske delen av ekstraksjon innebærer å riste VVE løsningen, som består av prøven og det organiske løsemidlet som benyttes, slik at analytten løses i løsemidlet. Etter ristingen sentrifugeres VVE løsningen slik at man får skilt den organiske og vandige fasen. Den organiske fasen som skal inneholde analytten overfører man til et egnet reagensrør og dampes inn. Til slutt tilsettes mobilfasen analytten skal løses i og injiseres i LC-MS/MS instrumentet for analyse. (6) 2.6 Validering av metode Når det utvikles en ny analysemetode må metoden alltid testes for å sjekke at den gir resultater som er tilfredsstillende i henhold til dens hensikt. En slik testing av nye metoder kalles validering. Vanlig prosedyre for validering er å følge et sett av standardiserte tester som gir data for de ulike testene metoden valideres for. Settet av tester man benytter til valideringen avhenger av hvilken kategori metoden tilhører. Hvis det er en kvantitativ metode benyttes ofte testene presentert i figur 8, og gjerne andre tester som ikke er nevnt der, slik som spesifisitet. Hvis det er en kvalitativ metode benytter man gjerne et sett med færre tester enn de presentert i figur 8. Linearitet benyttes for eksempel ikke som et valideringsparameter for kvalitative metoder. Disse settene av tester presenteres gjerne i valideringsveiledere utarbeidet av ulike internasjonale organisasjoner slik som International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) og International Conference of Harmonization (ICH). (13) Validering Presisjon Nøyaktighet Gjenvinning Reproduserbarhet LOD/LOQ Systempresisjon Linearitet Figur 8. Valideringsparameterne for kvantitative analysemetoder. 18 2.6.1 Presisjon Presisjon er uttrykk for variasjonen til et sett av analyseresultater som stammer fra målinger av paralleller fra en homogen prøve, der analyseforholdene er de samme ved hver måling. Måling av presisjonen til en metode viser graden av tilfeldige feil for metoden. Presisjon kan deles inn i underkategoriene repeterbarhet og reproduserbarhet. Repeterbarhet måles ved at prøveparalleller som benyttes for dette formålet analyseres av kun en person, på samme instrument, samme dag og på det samme laboratoriet. Reproduserbarhet måles når en av testforholdene som definerer repeterbarhet varierer, som for eksempel at en prøve analyseres en gang per dag over flere dager, eller måles på to forskjellige instrumenter. Siden presisjon avhenger av analyttkonsentrasjon måles presisjonen ved forskjellige konsentrasjonsnivå innenfor måleområdet for metoden. Presisjon oppgis enten som coefficient of variation (CV) eller Relative Standard Deviation (RSD) fra en serie av analyseresultater. (13) 2.6.2 Nøyaktighet Nøyaktighet er differansen mellom den målte verdien av analytten i en prøve og dens sanne verdi eller referanse verdi, og oppgis vanligvis i prosent. For å bestemme nøyaktighet må det benyttes prøvemateriale i form av kontrollprøver der man vet fasitverdien på prøven, og ideelt sett benyttes det sertifisert referanse materiale for dette. For rusmidler er det dog sjeldent at sertifiserte referanse materialer er tilgjengelig men som alternativ kan det benyttes referansestandarder fra godkjente kommersielle aktører. (13) 2.6.3 Linearitet Hensikten med å dokumentere lineariteten til en metode er å undersøke om signalresponsene for målingen av en analytt er proporsjonal med dens konsentrasjon innenfor et definert måleområde. Lineariteten dokumenteres ved lineær regresjon med regresjonslinjen: y = ax + b, hvor y er respons, x er konsentrasjonen og b er kurvens skjæringspunkt med y-aksen og regresjonskoeffisienten r2 regnes ut. En regresjonskoeffisient større eller lik 0,99 brukes vanligvis som et kriterium for linearitet for kvantitative metoder, og kvalitative metoder med konsentrasjonsterskelverdi for å rapportere negativt/positivt resultat. (13) 2.6.4 Gjenvinning Gjenvinning er den andelsprosenten av den opprinnelige mengden analytt i en prøve som måles etter siste behandlings-steg i metodeprosedyren. En vanlig måte å utføre dette på er å 19 tilsette en kjent mengde analytt til en blank matrise og deretter utføre analyseprosedyren for metoden. Dette gjøres ofte med triplikater med henholdsvis tre konsentrasjonsnivåer. (13) 2.6.5 LOD/LOQ LOD er den laveste konsentrasjon som analytten i en prøve kan påvises med en viss grad av sikkerhet. LOQ er den laveste konsentrasjonen som en analytt i en prøve kan kvantifiseres med tilfredsstillende nøyaktighet og presisjon. (13) 20 3. Materiale og metoder 3.1 Utstyr Utstyr Fabrikant og modell Fabrikant/sted Reagensrør Sarstedt rør Numbrecht, Tyskland UPLC hetteglass Waters. Massachusetts, USA Eppendorf Research Eppendorf AG. Tyskland Eppendorf Reference Eppendorf AG. Tyskland Inndampningsinstrument Organomation Associates Inc Massachusetts, USA Sentrifuge Hettich Zentrifugen Tyskland Vortex mikser Heidolph REAX Tyskland Vannrensesystem Millipore Milli-Q rensesystem Frankrike Vekt Mettler Toledo MT5 Sveits LC-MS/MS UPLC iClass Waters TQ-Stepwave Waters. Massachusetts, USA Kolonne Acquity UPLC HSST3 100mm x 2,1mm, 1,8µm Waters. Massachusetts, USA Pipetter 3.2 Serum Teknisk serum fra blodbanken ved UNN. 3.3 Vann Vann som er brukt under hele analysen er fra Milli-Q vann (Millipore Milli-Q-rensesystem, USA). 3.4 Buffer Bufferløsning 1 Natriumtetraborat buffer: pH 9,2, mettet. (12) Bufferløsning 2 Karbonat buffer: pH 11, 0,1 M Bufferløsning 3 Fosfat buffer: pH 2,5, 0,1 M Bufferløsning 4 Ammoniumkarbonat buffer: pH 9,2, 0,2 M 3.5 Mobilfase Mobilfase A: 5 mM NH4oAC (Ammoniumacetat) Mobilfase B: ACN:MeOH (1:1 v/v) + 5 mM NH4oAC 21 Chiron AS.Trondheim; Norge. Chiron AS.Trondheim; Norge. 99 98 98 99 12549 9306 12027 9305 1,000 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml 1,0 mg/ml Konsentrasjon Acetonitrile Metanol Metanol Metanol Løsemiddel Kjemikalier/reagenser JWH-018 Chiron AS.Trondheim; Norge. 98 3.6 JWH-073 Chiron AS.Trondheim; Norge. 9390 12424 0,1 mg/ml 0,1 mg/ml 100 µg/ml 100 µg/ml Batch nummer JWH-210 LGC GmbH: Luckenwalde; Tyskland. 11209 Chiron AS.Trondheim; Norge. 11209 Renhet % JWH-250 99 Chiron AS.Trondheim; Norge. FN090211-02 Fabrikant: JWH- 081 LGC GmbH: Luckenwalde; Tyskland. 99 Reagenser: RCS-4 LGC GmbH: Luckenwalde; Tyskland. Virkestoff/analytt AM-2201 JWH-073-d9 Cerilliant: Round Rock, Texas; USA Internstandard/analytt JWH-018-d11 Cerilliant: Round Rock, Texas; USA Metabolitt/analytt JWH-018 JWH-073 Dietyleter Heksan n-Klorbutan Diklormetan Acetonitrile SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland Kjemikalier Metanol SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland Isopropanol SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland tert-butyl metyleter Sykloheksan SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland Etylacetat Isoamylalkohol 22 Ammoniumacetat di-Natriumhydrogenfosfat-Dihydrat Natriumkarbonat Ammoniumkarbonat Natrium tetraborat SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland Merck. Darmstadt; Tyskland. Merck. Darmstadt; Tyskland. SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland SIGMA-ALDRICH Chemie GmbH. Steinheim; Tyskland 23 4. Fremgangsmåte 4.1 Tilvirkning av Stokkløsninger De syv syntetiske cannabisforbindelsene som denne analysemetoden i utgangspunktet ble utviklet for å kvantifisere, ble bestilt i tilnærmet ren form (98-99 % ≥) fra to ulike produsenter/leverandører av referansematerialer. Disse syv forbindelsene ble levert i ampuller, der fem av dem ble levert som konsentrert stokkløsning og to av dem i pulverform. For forbindelsene, JWH-018 og -073, ble deres hovedmetabolitt bestilt i tillegg til isotopmerkede forbindelser fra en tredje produsent til bruk for IS. Stokkløsningene fra produsentene ble videre fortynnet på laboratoriet av praktiske årsaker som større volumer å arbeide med og reduksjon av effekten avdamping av løsemiddelet analyttene er løst i. I tillegg til enklere tilvirkning av bruksløsninger med tilfredsstillende nøyaktighet. 4.2 Fortynning av konsentrerte stokkløsninger De forbindelsene som ble levert i form av konsentrert stokkløsning ble fortynnet 1:3 (v/v) på følgende måte: 1. Hele innholdet på 1 ml fra produsentens ampulle overføres til et farget hetteglass med en pipette. Hetteglasset har nå et totalvolum på 1 ml. 2. 1 ml av et identisk løsemiddel til det forbindelsen er løst i, MeOH eller ACN, tilsettes produsentens ampulle og overføres til hetteglasset for å vaske med rester av forbindelsen i ampullen. Hetteglasset har nå et totalvolum på 2 ml. 3. 2 ml identisk løsemiddel tilsettes hetteglasset som nå har et totalvolum på 4 ml, og produsentens stokkløsning er fortynnet 1:3 (v/v). 24 Tabell 1: Oversikt over forbindelsenes stokkløsning, fortynningen og sluttkonsentrasjonen deres Forbindelser Rent virkestoff og løsemiddel Molekylvekt renhet Stokkløsningens startkonsentrasjon Fortynnet stokkløsnings sluttkonsentrasjon fortynnet 1:4 (v/v) Sluttvolum JWH-018 (MeOH) 341,45 g/mol 99% 1 mg/ml 725 µM 4 ml JWH-073 (MeOH) 322,42 g/mol 98% 1 mg/ml 760 µM 4 ml JWH-081 (ACN) 371,47 g/mol 99% 1 mg/ml 666 µM 4 ml JWH-210 (MeOH) 386,5 g/mol 98% 1 mg/ml 634 µM 4 ml JWH-250 (MeOH) 335,44 g/mol 99% 1 mg/ml 738 µM 4 ml JWH-073 N-(3-OH-butyl) (MeOH) 343,4 g/mol 99% 0,1 mg/ml 72 µM 4 ml JWH-018 N-(4-OHpentyl) (MeOH) 357,44 g/mol 99% 0,1 mg/ml 69 µM 4 ml d11-JWH-018 (MeOH) 352,45 g/mol 99,99% 0,1 mg/ml 71 µM 4 ml d9-JWH-073 (MeOH) 331,42 g/mol 99% 0,1 mg/ml 75 µM 4 ml Metabolitter Internstandarder 4.3 Tilvirkning av stokkløsning fra referansemateriale i pulverform Det ble tilvirket en stokkløsning for hver av de to forbindelsene som ble levert i pulverform på følgende måte: 1. En nøyaktig mengde av forbindelsen ble veid på vekten MT5 fra Mettler Toledo. 2. Den oppveide mengden av pulveret ble tilsatt et farget hetteglass, deretter ble 4 ml MeOH tilsatt. Den nøyaktige mengden av forbindelsene og sluttkonsentrasjonen på stokkløsningene er vist i tabell 2. 25 Tabell 2: Oversikt over tilvirkning av stokkløsning fra referansemateriale i pulverform og deres sluttkonsentrasjon Forbindelser Molekylvekt Renhet Oppveid Mengde Stokkløsningens konsentrasjon i hetteglass med 4 ml MeOH AM-2201 359,436 g/mol 99% 1,294 mg 891 µM RCS-4 321,413 g/mol 99% 1,114 mg 858 µM 4.4 Tilvirkning av testløsning nummer 1 Testløsningen ble fremstilt for å tilvirke tuningsløsninger. Tuningsløsningene ble brukt til å stille inn parameterne på MS/MS delen av LC-MS/MS instrumentet for de forbindelsene som enda ikke hadde blitt lagt inn i apparaturets programvare når metodeutviklingen startet. Testløsning nummer 1 inneholdt en cirka konsentrasjon av alle de rene virkestoffene JWH018,-073, -081, -210, -250, AM-2201 og RCS-4 og hovedmetabolittene JWH-018 og -073 forbindelsene på henholdsvis 2 µM og 1 µM. Det ble brukt en passende konsentrasjon av forbindelsene siden det for tuningen sin del bare er viktig at forbindelsene er i løsningen. Fremgangsmåte: 1. 5 µl fortynnet stokkløsning fra hver av de ni rene virkestoffene og 30 µl fortynnet stokkløsning fra hver av de to metabolittene, ble tilsatt et Sarstedt rør. Totalt 105 µl. 2. 1,9 ml mobilfase ble til slutt tilsatt Sarstedt røret. 4.5 Tilvirkning av tuningsløsningene Tuningsløsningene ble tilvirket etter behov i den delen av fasen da MS/MS delen av LCMS/MS instrumentet skulle stilles inn til de ulike analyttene, siden det var vanskelig å forutse hvor store volum som trengtes. Tuningsløsningene besto av et nøyaktig volum av testløsning nummer 1 som ble fortynnet en tusendedel (1:1000). De rene virkestoffene fikk da en cirka konsentrasjon på 2 µM og metabolittene cirka 1 µM. 26 4.6 Tilvirkning av testløsning nummer 2 Testløsningen besto av spiked urin, der et nøyaktig volum av fortynnet stokkløsning fra hver enkelt forbindelse, både de rene virkestoffene JWH-018,-073, -081, -210, -250, AM-2201, RCS-4 og metabolittene JWH-018 og 073, ble fortynnet med ett nøyaktig volum urin. Selv om volumene var nøyaktige var konsentrasjonene av analytter i denne testløsningen bare omtrentlig nøyaktig siden testløsningen skulle brukes til en kvalitativ pilotundersøkelse av 20 ulike organiske løsemidler og 4 forskjellige buffere for å gi en indikasjon av hvilket løsemiddel og buffer som ga best ekstraksjon. Testløsningen ble tilvirket ved å tilsette 5 µl fortynnet stokkløsning av de rene virkestoffene og 28 µl av metabolittenes fortynnede stokkløsning til ca. 1,9 ml blank urin. 4.6 Tilvirkning av IS-løsning nummer 1 IS-løsningen ble tilvirket av personalet ved MS-laboratoriet ved UNN og hadde en konsentrasjon på 0,01 µM av internstandardforbindelsene d11-JWH-018 og d9-JWH-073. 4.7 Tilvirkning av IS-løsning nummer 2 IS-løsningen ble tilvirket av personalet ved MS-laboratoriet ved UNN og hadde en konsentrasjon på 0,02 µM av internstandardforbindelsene d11-JWH-018 og d9-JWH-073. 27 4.8 Tilvirkning av bruksløsninger for standardrekkene og kontrollene 4.8.1 Tilvirkning av bruksløsning nummer 1 Bruksløsningen ble laget for bruk til videre tilvirking av standardrekke 1 og kontrollgruppe 1, med urin som matrise. Bruksløsningens volum var 1 ml og konsentrasjonen av hver enkelt forbindelse var 5 µM. Bruksløsningen ble laget ved å tilsette følgende volum av den fortynnede stokkløsningen til alle de aktuelle forbindelsene listet i tabellen nedenfor. Tabell 3: Oversikt over tilvirkning av bruksløsning nummer 1, volum på en ml med fem µM konsentrasjon Forbindelse fortynnet stokkløsning Volum fortynnet stokkløsning som tilsettes JWH-018 6,9 µl JWH-073 6,6 µl JWH-081 7,5 µl JWH-210 7,9 µl JWH-250 6,8 µl JWH-073 N-(3-OH-butyl) 69,4 µl JWH-018 N-(4-OH-pentyl) 72,2 µl Totalt volum av fortynnet stokkløsninger tilsatt 177,3 µl Volum urin som tilsettes 822,7 µl 4.8.2 Tilvirkning av bruksløsning nummer 2 Bruksløsningen ble laget for bruk til videre tilvirkning av standardrekke 2 og kontrollgruppe 2 med serum som matrise. Bruksløsningens volum var 1 ml og konsentrasjonen av hver enkelt forbindelse var 5 µM. Bruksløsningen ble laget ved å tilsette følgende volum av den fortynnede stokkløsningen til alle de aktuelle forbindelsene listet i tabell 4. Tabell 4: Oversikt over tilvirkning av bruksløsning nummer 2, volum på en ml med fem µM konsentrasjon Forbindelse fortynnet stokkløsning Volum fortynnet stokkløsning som tilsettes JWH-018 6,9 µl JWH-073 6,6 µl JWH-073 N-(3-OH-butyl) 69,4 µl JWH-018 N-(4-OH-pentyl) 72,2 µl Totalt volum av fortynnet stokkløsninger tilsatt 155,1 µl Volum serum som tilsettes 844,9 µl 28 4.8.3 Tilvirkning av standardrekke 1 med urin som matrise Standardrekke 1 består av syv standarder, og tilvirkningen startet med å lage utgangsløsning nummer 1 der forbindelsene hadde en konsentrasjon på 1000 nM. Utgangsløsning nummer 1 ble brukt til å lage standard 1 ved fortynning, og de neste standardene ble tilvirket ved videre fortynning av et nøyaktig volum fra de foregående standardene. De to understående tabellene 5 og 6 viser henholdsvis tillagingen skjematisk. Tabell 5: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning nummer 1, volum på to ml med 1000 nM konsentrasjon Volum bruksløsning nummer 1 som tilsettes 400 µl Volum urin som tilsettes 1600 µl Tabell 6: Oversikt over tilvirkningen av standardrekke 1 med urin som matrise Tilvirkning av standardrekke nummer 1 Konsentrasjon S1 = 0,5 ml utgangsløsning nummer 1 + 4,5 ml urin 100 nM S2 = 0,5 ml S1 + 4,5 ml urin 10 nM S3 = 1 ml S2 + 9 ml urin 1 nM S4 = 5 ml S3 + 5 ml urin 0,5 nM S5 = 0,5 ml S3 + 4,5 ml urin 0,1 nM S6 = 0,5 ml S4 + 4,5 ml urin 0,05 nM S7 = 0,5 ml S5 + 4,5 ml urin 0,01 nM 4.8.4 Tilvirkning av kontrollgruppe 1 med urin som matrise Kontrollgruppe 1 består av tre kontroller, K1, K2 og K3, med henholdsvis tre ulike konsentrasjonsnivåer av alle forbindelsene fra bruksløsning nummer 1. Tilvirkningen startet med å lage utgangsløsning nummer 2 fra bruksløsning nummer 1 ved fortynningsforholdet 1:9 (v/v) slik at utgangsløsning nummer 2 hadde en konsentrasjon på 800 nM. Tabellene 7 og 8 nedenfor viser fremstillingen av henholdsvis utgangsløsning nummer 2 og kontrollgruppe 1 skjematisk. Tabell 7: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning nummer 2, volum på to ml med 800 nM konsentrasjon Volum bruksløsning nr. 1 som tilsettes 320 µl Volum urin som tilsettes 1680 µl 29 Tabell 8: Oversikt over tilvirkning av kontrollgruppe 1 Tilvirkning av kontrollgruppe 1 Konsentrasjon K1 = 0,5 ml utgangsløsning nr. 2 + 4,5 ml urin 80 nM K2 = 0,5 ml K1 + 4,5 ml urin 8 nM K3 = 0,5 ml K2 + 4,5 ml urin 0,8 nM 4.8.5 Tilvirkning av standardrekke 2 med serum som matrise Standardrekke 2 består av syv standarder og tilvirkningen startet med å lage utgangsløsning nummer 3 der forbindelsene hadde en konsentrasjon på 500 nM. Utgangsløsning nummer 3 ble brukt til å lage standard 1 og 2 ved fortynning og de neste standardene ble tillaget ved videre fortynning av et nøyaktig volum fra de foregående standardene. De to understående tabellene 9 og 10 viser tilvirkningen skjematisk. Tabell 9: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning 3, volum på to ml med 500 nM konsentrasjon Volum bruksløsning nummer 2 som tilsettes 200 µl Volum serum som tilsettes 1800 µl Tabell 10: Oversikt over tilvirkning av standardrekke nummer 2 med serum som matrise Tilvirkning av standardrekke nummer 2 Teoretisk Konsentrasjon Justert konsentrasjon S1 = 0,2 ml utgangsløsning nummer 3 + 0,8 ml serum 100 nM 60,000 nM S2 = 0,2 ml utgangsløsning nummer 3 + 1,8 ml serum 50 nM 30,000 nM S3 = 0,4 ml S2 + 3,6 ml serum 5 nM 3,000 nM S4 = 1 ml S3 + 1 ml serum 2,5 nM 1,500 nM S5 = 0,2 ml S3 + 1,8 ml serum 0,5 nM 0,300 nM S6 = 0,2 ml S4 + 1,8 ml serum 0,25 nM 0,150 nM S7 = 0,2 ml S5 + 1,8 ml serum 0,05 nM 0,030 nM 30 4.9 Tilvirkning av ekstern kontrollgruppe Eksterne kontroller var ikke tilgjengelig i det tidsrommet denne bacheloroppgaven ble utført. Kontrollene i denne kontrollgruppen er tillaget av personal på MS laboratoriet og brukt til å justere konsentrasjonene i standardrekke 2. EQ1 66 nM (JWH-018, -073) 33 nM (Metabolittene) EQ2 6,6 nM (JWH-018, -073) 3,3 nM (Metabolittene) EQ3 0,66 nM (JWH-018, -073) 0,33 nM (Metabolittene) 4.10 Tilvirkning av Kontrollgruppe 2 med serum som matrise Kontrollgruppe 2 består av tre kontroller, K1, K2 og K3, med henholdsvis tre ulike konsentrasjonsnivåer av alle forbindelsene fra bruksløsning nummer 2. Tilvirkningen startet med fortynning av et nøyaktig volum av bruksløsning nummer 2 slik at utgangsløsning nummer 4 hadde en konsentrasjon på 800 nM. Tabellene 11 og 12 nedenfor viser fremstillingen av henholdsvis utgangsløsning nummer 4 og kontrollgruppe 2 skjematisk. Tabell 11: Oversikt over tilvirkning av utgangsløsning nummer 4, volum på en ml med konsentrasjon 800 nM Volum bruksløsning nummer 2 som tilsettes 160 µl Volum serum som tilsettes 840 µl Tabell 12: Oversikt over tilvirkning av kontrollgruppe 2 Tilvirkning av kontrollgruppe 2 Konsentrasjon K1 = 0,1 ml utgangsløsning nummer 4 + 0,9 ml serum 80 nM K2 = 0,1 ml K1 + 0,9 ml serum 8 nM K3 = 0,1 ml K2 + 0,9 ml serum 0,8 nM 31 4.11 Tilvirkning av kontrollgruppe 3 Kontrollene i denne kontrollgruppen ble tillaget av personal ved MS-laboratoriet. 4.11.1 Labkontroll 1 Målt konsentrasjon av forbindelsene: JWH-018 1,22 nM JWH-018 metabolitt 0,93 nM JWH-073 1,12 nM JWH-073 metabolitt 0,89 nM 4.11.2 Labkontroll 2 Målt konsentrasjon av forbindelsene: JWH-018 3,56 nM JWH-018 metabolitt 3,38 nM JWH-073 3,53 nM JWH-073 metabolitt 3,34 nM 4.11.3 Labkontroll 3 Målt konsentrasjon av forbindelsene: JWH-018 0,51 nM JWH-018 metabolitt 0,45 nM JWH-073 0,43 nM JWH-073 metabolitt 0,42 nM 32 4.13 Tuning av massespektrometri-parameterne for hver enkelt analytt og funn av deres datter-ioners spektrum For å kunne kvantifisere analyttene for metoden ble det utført en tuning av hver enkelt forbindelse på MS-instrumentet. Dette ble gjort ved å injisere tuningsløsninger som inneholdt den aktuelle forbindelsen løst i MeOH. De MS-parameterne som ble tunet var konespenningen og kollisjonsenergien, alle andre parametere ble kjørt i standard modus. MSinnstillingene som ble brukt er gitt i tabell 13, sammen med massen for mor og datterionene til forbindelsene JWH-018, -073, metabolittene og deres IS. Figur 9 viser massespektrumet for datterionene til metabolitten JWH-018 og er et representativt eksempel for massespektraene til de andre forbindelsene og metabolitten. 4.13.1 Konespenning For å optimalisere ioniseringen av analyttmolekylene ble spenningen i konen justert til den spenningen som ga mest intenst signal for analytten. 4.13.2 Kollisjonsenergi For å kvantifisere analyttene ble morionet til disse analyttene fragmentert i instrumentets kollisjonscelle med kollisjonsgass, til det som kalles datterioner. Det best egnede datterionet for kvantifisering er det som gir mest intenst responssignal med størst mulig masse. Den elektronvolt verdien som gir slike datterioner er den mest optimale og den som blir valgt som innstilling for analytten. 33 Tabell 13:Oversikt over MS innstillingene, massen og fragmentene for virkestoffene JWH-018, -073 og metabolittene og internstandardene deres Fordampingstemperatur 550 Kildetemperatur 150 Kapillærspenning [1,80, 1,95] kV Kone gass-strøm [150, 148] L/t Konespenning 50 V Ioniseringsmodus ES+ Fordampings gass-strøm [1000, 993] L/t Kollisjons gass-strøm [0,15, 0,14] ml/min Aerosol gass-strøm [7,00, 6,34] bar Funksjonstype MRM med 10 kanaler Kanal Forbindelse 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Fragmenteringsreaksjon Mw Kollisjonsenergi Elektronvolt 342,30 > 127,00 45 342,30 > 155,00 23 358,05 > 126,70 45 358,05 > 154,70 26 328,30 > 127,00 42 328,30 > 155,00 23 344,10 > 126,70 44 344,10 > 154,60 20 JWH-018-d11 353,30 > 155 23 JWH-073-d9 336,30 > 155 23 JWH-018 JWH-018 metabolitt JWH-073 JWH-073 metabolitt Figur 9. Massespektrumet for datterionene til JWH-018 metabolitten, med massene 155 og 127 etter fragmentering når kollisjonsenergien er stilt til 26 EV 34 4.14 Kromatografisk seperasjon Den kromatografisk seperasjonen som ble utført i løpet av denne bacheloroppgaven ble gjort med de samme kjemiske seperasjonsforholdene for alle analysene. Det ble benyttet reversert fase kromatografi, med en HSS T3 kolonne og en mobilfasegradient som er vist i tabell 14. Figur 14 er et eksempel på hvordan et kromatogram ser ut for alle forbindelsene i tabell 1 med unntak av IS-forbindelsene. Tabell 14: Mobilfasegradienten brukt ved kromatografisk seperasjon med HSS T3 kolonne Tid minutt Strømhastighet ml/min Mobilfase A% Mobilfase B% 1 Initiell 0,4 50 50 2 0,30 0,4 50 50 3 1,50 0,4 1 99 4 3,00 0,4 1 99 5 3,01 0,4 50 50 4.15 Pilotundersøkelse av ulike ekstraksjonsreagenser for å finne den beste væske-væske ekstraksjonsmetoden Pilotundersøkelsen startet med et utvalg av 19 ulike organiske løsemidler, både mikser av og rene løsemidler som er listet opp i tabell 16, i tillegg til fire forskjellige bufferløsninger vist under materiale og metode. Hensikten med pilotundersøkelsen var å finne et organisk løsemiddel og en bufferløsning som kunne benyttes i en ekstraksjonsmetode basert på ekstraksjonsmetoden for THC utviklet ved MS-laboratoriet på UNN. Prosedyren for ekstraksjon av THC ved MS laboratoriet på UNN er lagt ved som vedlegg 1. Utvalget av ekstraksjonsreagenser var basert på både faglitteratur, og løsemidler som brukes i rutineanalysene ved MS-laboratoriet. Undersøkelsen endte opp med fem testrunder der målet med hver testrunde var å finne de organiske løsemidlene og de bufferløsningene som ga best ekstraksjon av analyttene. Målet var å til slutt ende opp med det løsemidlet og den bufferløsningen som ga best ekstraksjon. Testrunde 1 til 3 kan betraktes som rene eliminasjonsrunder, der de løsemidlene som ikke oppfylte kriteriene satt for den gjeldende testrunden ble utelatt fra neste testrunde. Kriteriene satt for testrunde 1 til 3 er gitt henholdsvis i tabell 20, 23 og 26. For testrunde 4 ble det ikke satt noen konkrete kriterier til løsemidlene 35 av grunner oppgitt i diskusjonsdelen av oppgaven. Testrunde 5 var den siste testrunden og det ble ikke satt noen konkrete kriterier for denne testrunden heller av grunner oppgitt i diskusjonsdelen av oppgaven. 4.15.1 Generell fremgangsmåte for ekstraksjon i alle testrundene Som nevnt tidligere tok uttestingen i pilotundersøkelsen utgangspunkt i ekstraksjonsmetoden for THC. Med dette menes det volumene av prøve/IS/kontroll, bufferløsning og løsemiddel, som tilsettes reagensrøret ekstraksjonen foregår i. Forskjellen i fremgangsmåten fra testrunde til testrunde består av hvilke prøver/IS/kontroll, bufferløsning og løsemiddel som ble tilsatt. Detaljene om hvilke løsninger som ble tilsatt i henhold til volumene og rekkefølgen til den generelle fremgangsmåten vil bli redegjort for under fremgangsmåten for hver testrunde. Den generelle fremgangsmåten som har blitt brukt for hver testrunde basert på THC metoden er listet opp i tabell 15. Tabell 15: Generell fremgangsmåte for væske-væske ekstraksjon 1. 100 µl standard/kontroll/prøve tilsettes hvert sitt merkede 4 ml Sarstedt rør. 2. 50 µl IS tilsettes alle rør. 3. 50 µl bufferløsning tilsettes alle rør. 4. 1 ml organisk løsemiddel tilsettes alle rør. 5. Rørene korkes og ristes i ett minutt. 6. Rørene sentrifugers i 2,5 min ved 3000 g 7. 750 µl av den organiske fasen i rørene overføres til ett nytt, identisk, merket 4 ml Sarstedt rør. 8. Ekstraktet i rørene inndampes på varmeblokk (40oC) med nitrogengass. 9. 100 µl mobilfase tilsettes Sarstedt røret for å løse opp inndampet standard/kontroll/prøvemateriale ved å bruke virvelmikser i cirka 5 sekunder. 10. 80 µl av løsningen, bestående av mobilfase og inndampet standard/kontroll/prøvemateriale, overføres til et UPLChetteglass som er merket likt med det Sarstedt røret løsningen ble overført fra. 11. UPLC-hetteglass settes inn i analyseverktøyet LC-MS/MS for analyse. 36 4.15.2 Testrunde 1 Fremgangsmåte: Figur 10. Illustrasjon av fremgangsmåten punkt en til fire i testrunde 1 Resten av fremgangsmåten ble utført i henhold til punkt 5-11 i tabell 15. Tabell 16: Liste over løsemidler brukt i testrunde 1 Løsemiddel/blanding: Blandingsforhold (v/v) 1. Tert-butyl metyleter (TBME) 2. Tert-butyl metyleter:n-Klorbutan (TBME:n-KB) 9:1 3. n-Klorbutan:Acetonitril (n-KB: ACN) 4:1 4. n-Heksan: Dietyleter (n-H:D) 1:1 5. Sykloheksan (SH) 6. Toluen:Isoamylalkohol (T:IMA) 8:2 7. n-KB:Etylacetat (n-Klorbutan: ETOAC) 4:1 8. Dietyleter: n-Heksan:Etylacetat (D:n-H:ETOAC) 9. n-Klorbutan (n-KB) 10. Tert-butyl metyleter:Etylacetat (TBME: ETOAC) 1:1 11. Metanol:Diklormetan (MeOH:DCM) 1:9 12. n-Heksan (n-H) 13. Tert-butyl metyleter:Fosforsyre(85%) (TBME:F) 14. Isoamylalkohol: n-Klorbutan (IMA:n-KB) 9:1 15. n-Klorbutan: Isopropanol (n-KB:IPA) 9:1 16. Diklormetan (DCM) 17. n-Heksan + 2% Isoamylalkohol (n- H + 2% IMA) 18. Dietyleter:Etylacetat (D:ETOAC) 1:1 19. n-Heksan:Etylacetat (n-H:E TOAC) (14) 9:1 1:1:1 250:1 37 4.15.3 Testrunde 2 I testrunde 2 ble det brukt samme fremgangsmåte som i testrunde 1, bortsett fra at det i denne testrunden ble testet kun åtte organiske løsemidler i tillegg til løsemiddel nummer 20, som er listet opp i tabell 17. Derav kun ni parallell-sett som ble opparbeidet for analyse. De åtte løsemidlene testet i denne testrunden var de løsemidlene som oppfylte kriteriene satt for testrunde 1, vist i tabell 20. Løsemiddel nummer 20 skulle i utgangspunktet vært med i testrunde 1, men dette ble ikke gjort og den ble dermed tatt med i testrunde 2. Tabell 17: Liste over organiske løsemidler brukt i testrunde 2 Løsemiddel/blanding: Blandingsforhold (v/v) 4. n-H:D 1:1 8. D:n-H:ETOAC 1:1:1 10. TBME:ETOAC 1:1 11. MeOH :DCM 1:9 12. n-H 16. DCM 18. D:ETOAC 1:1 19. n-H:E TOAC (14) 9:1 20. Etylacetat (ETOAC) 4.15.4 Testrunde 3 Fremgangsmåten er generelt den samme som for testrunde 1 og 2 bortsett fra at det i denne testrunden ble testet kun to forskjellige løsemidler, D:ETOAC og DCM. I tillegg ble hvert av de to løsemidlene testet med bufferløsning 1, 2, 3 og 4 i paralleller. De to løsemidlene som ble undersøkt i denne testrunden var de løsemidlene som oppfylte kriteriene satt for testrunde 2, vist i tabell 23. I denne testrunden ble det i tillegg satt opp et ytterligere testsett med DCM og de fire bufferløsningene, der tilsetting av IS ble utelatt for å avklare noen spørsmål som blir diskutert under diskusjonsdelen for denne testrunden. 38 4.15.5 Testrunde 4 I testrunde 4 ble det satt opp to rekker av standardrekke 1(S1-S7) og to kontrollgrupper (K1K3) av kontrollgruppe 1. I tillegg ble det kjørt en blank prøve med egen urin. I disse rekkene ble analyttene ekstrahert henholdsvis med løsemidlene DCM og D:ETOAC, og bufferløsning nummer 4. Hensikten med denne testrunden var å teste ut om standardrekke 1 var lineær og hvilke av de to løsemidlene som oppfylte kriteriene satt for testrunde 3 i tabell 26, som skulle benyttes for validering av ekstraksjonsmetoden. Fremgangsmåte: 1. 100 µl standardløsning fra standardrekke 1, 100 µl kontroll-løsning fra kontrollgruppe 1 og 100 µl egen urin til blank prøve, ble tilsatt hvert sitt merkede 4 ml Sarstedt rør. 2. 50 µl IS-løsning nummer 2 ble tilsatt alle rør. 3. 50 µl bufferløsning 4 ble tilsatt alle rør. 4. 1 ml av de organiske løsemidlene DCM og D:ETOAC ble tilsatt hver sin standardrekke (S1-S7) av standardrekke 1, og kontrollgruppe (K1-K3) av kontrollgruppe 1, sine merkede rør. Resten av fremgangsmåten ble utført i henhold til punkt 5-11 i tabell 15. 4.15.6 Testrunde 5 I testrunde 5 ble det satt opp tre rekker av standardrekke 2(S1-S7) og tre kontrollgrupper (K1K3) av kontrollgruppe 2. I tillegg ble det kjørt en blank prøve bestående av serum. I disse rekkene ble analyttene ekstrahert henholdsvis med løsemidlene DCM, D:ETOAC og D:nH:ETOAC og bufferløsning nummer 4. DCM og D:ETOAC oppfylte kriteriene satt for testrunde 3 i tabell 26, mens D:n-H:ETOAC ble tatt med av grunner oppgitt i diskusjonsdelen Fremgangsmåte: 1. 100 µl standardløsning fra standardrekke 2, kontroll-løsning fra kontrollgruppe 2 og negativt serum ble tilsatt hver sine merkede 4 ml Sarstedt rør. 2. 50 µl IS-løsning nummer 1 ble tilsatt alle rør. 3. 50 µl bufferløsning 4 ble tilsatt alle rør. 4. 1 ml av de organiske løsemidlene DCM, D:ETOAC og D:n-H:ETOAC ble tilsatt hver sin standardrekke (S1-S7) av standardrekke 1, og kontrollgruppe (K1-K3) av kontrollgruppe 1, sine merkede rør. 39 Resten av fremgangsmåten ble utført i henhold til punkt 5-11 i tabell 15. 4.16 Validering av metoden Validering av den modifiserte THC metoden, med DCM og bufferløsning 4 som ekstraksjonsreagenser, ble utført i henhold til International Conference on Harmonisation (ICH) sine internasjonale retningslinjer (15) for validering av analytiske prosedyrer. Valideringen innebar å sjekke lineariteten, presisjonen, systempresisjonen, reproduserbarheten, gjenvinningen, og LOQ og LOD, til den modifiserte THC metoden for analyttene JWH-018, JWH-073 og metabolittene til disse forbindelsene. Fremgangsmåten som ble brukt for alle valideringspunktene, bortsett fra gjenvinning og systempresisjon, er presentert i tabell 18. Hvilket analysemateriell som ble tilsatt for hvert valideringspunkt i henhold til den generelle fremgangsmåten presentert i tabell 18, blir redegjort for i detalj senere i teksten. Tabell 18: Generell fremgangsmåte for validering av metoden. 1. 100 µl standard/kontroll/prøve tilsettes hvert sitt merkede 4 ml Sarstedt rør. 2. 50 µl IS-løsning nummer 2 tilsettes alle rør. 3. 50 µl bufferløsning 4 tilsettes alle rør. 4. 1 ml DCM tilsettes alle rør. Resten av fremgangsmåten ble utført i henhold til punkt 5-11 i tabell 15. I fremgangsmåten for gjenvinning er det kun punkt 1 i tabell 18 som er gjort annerledes, fremgangsmåten for dette punktet er redegjort for i tabell 19 senere i teksten. I fremgangsmåten for systempresisjon ble alle volumene, i henhold til den generelle fremgangsmåten i tabell 18 og 15, doblet. Alle analyserundene som ble gjort under valideringen ble analysert med standardrekke 2 og kontrollgruppe 2. 40 Figur 11. Oppsett for opparbeidelsen av standardrekke 2 og prøver som skal analyseres 4.16.1 Linearitet For validering av lineariteten til metoden ble det opparbeidet tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7) sammen med tre paralleller av kontrollgruppe 2 (K1-K3) og tre blanke prøver bestående av negativt serum. Opparbeidelsen av disse parallellene ble utført i henhold til den generelle fremgangsmåten beskrevet i tabell 18. Figur 12. Illustrasjon av prøveopparbeidelses prosessen for validering av lineariteten for den modifiserte metoden 4.16.2 Reproduserbarhet Validering av metodens reproduserbarhet gikk over tre dager. For valideringen ble det tilvirket ti forskjellige spikede prøver. Disse prøvene bestod av serum der hver prøve ble spiked med en tilfeldig ukjent mengde av analyttene JWH-018, -073 og metabolittene deres. Hver dag i løpet av tredagers perioden, ble det opparbeidet ekstrakter fra hver av disse ti 41 prøvene som ble analysert i LC-MS/MS instrumentet. Reproduserbarhet dag 1 ble analysert i samme analyse runde som ekstraktene fra analysematerialet brukt for validering av presisjon og gjenvinning. Reproduserbarhet dag 2 ble analysert i egen analyse runde og reproduserbarhet dag 3 ble analysert i samme analyse runde som ekstraktene for systempresisjon. 4.16.3 Presisjon For validering av presisjonen ble det opparbeidet 6 parallelle ekstrakter av henholdsvis analysematerialet Labkontroll 1og Labkontroll 2, hvis konsentrasjoner er oppgitt i kapittel 4.11. Totalt 12 ekstrakter. 4.16.4 Gjenvinning For validering av gjenvinning ble det tilvirket 3 analysematerialer kalt GJ A, GJ B og GJ C som hadde henholdsvis tre ulike teoretiske konsentrasjonsnivåer (høy, mellom og lavt) av analyttene. Disse analysematerialene ble tilvirket i henhold til generell fremgangsmåte i tabell 18 med unntak av punkt 1. Fremgangsmåten for gjenvinning ved punkt 1 av analysematerialene GJ- A, -B og –C er vist i tabell 19. Tabell 19: Tilvirkning av analysematerialene GJ A, GJ B og GJ C under punkt 1 for valideringens generelle fremgangsmåte, og konsentrasjonene deres. Analysemateriale: Teoretisk konsentrasjon av Tilvirkning: analyttene GJ A 15,5 nM 50 µl (Standard 2 av standardrekke 2) + 50 µl Labkontroll 1 GJ B 2,5 nM 50 µl (Standard 4 av standardrekke 2) + 50 µl Labkontroll 2 GJ C 0,3 nM 50 µl (Standard 6 av standardrekke 2) + 50 µl Labkontroll 3 For selve analysen ble det opparbeidet 3 paralleller av henholdsvis GJ A, GJ B og GJ C, totalt 9 ekstrakter. 42 Figur 13. 12:Illustrasjon Kan slettesav prøveopparbeidelsesprosessen for valideringsparameterne reproduserbarhet dag 1, presisjon og gjenvinning 4.16.5 LOQ/LOD For å validere LOQ og LOD ble det kjørt seks paralleller av henholdsvis standard 6 og standard 7 av standardrekke 2 fra et tidligere analyse runde som var oppbevart i en fryseboks. 4.16.6 Systempresisjon For å validere systempresisjonen ble det utført 10 analyser i samme analyse runde på en spiked prøve. Serumprøven besto av analyttene JWH-018, JWH-073 og metabolittene deres med ukjent konsentrasjon. 4.16.7 Beregning av data For beregning og prosessering av rådata fra både pilotundersøkelsen og valideringstestene ble programvaren Masslynx 4.1og Excel benyttet. I pilotundersøkelsens tre første testrunder ble det benyttet en-punkts kalibrering i Masslynx for beregning av resultatene til prøvene. Alle prøvene ble analysert som standarder med en målverdi på 100 nM. Målverdien på 100 nM ble benyttet som utgangspunkt for å vurdere ekstraksjonsegenskapene til de forskjellige løsemidlene som ble testet i pilotundersøkelsen. 43 Dette betyr at det ble beregnet et gjennomsnitt av signalresponsen fra alle forbindelsene i testløsning nummer 2 i alle prøvene, som ble gitt konsentrasjonsverdien 100 nM. På grunnlag av dette gjennomsnittet ble det beregnet en konsentrasjon for hver enkelt forbindelses signalrespons i hver prøve. Konsentrasjonen som ble beregnet var ikke nødvendigvis den sanne konsentrasjon til forbindelsen i prøven, og er uten betydning siden hensikten var å se hvilke av løsemidlene som ga best ekstraksjon i forhold til hverandre. Definisjonen på best ekstraksjon for hver av de tre første testrundene gis henholdsvis av kriteriene i tabell 20, 23 og 26. For testrunde 4, 5 og valideringstestene ble det satt opp en standardkurve med standardrekke 2 og alle prøvers konsentrasjon ble beregnet på grunnlag av dette med regresjonslinjen y = ax+b. 44 5. Resultater 5.1 Kromatogrammet til forbindelsens datterioner, ekstrahert fra en spiked urinprøve. Figur 14. Eksempel på et kromatogram for alle forbindelsene i tabell 1 med unntak av internstandard forbindelsene 45 5.2 Pilotundersøkelse av ulike ekstraksjonsreagenser for å finne den beste væske-væske ekstraksjonsmetoden. 5.2.1 Testrunde 1. Tabell 20: Kriterier til løsemidlenes ekstraksjonsegenskaper av virkestoffene Kriterier for Virkestoffene JWH -018 og -073 Metabolittene JWH-018 og-073 Kriterium 1. Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn 0%> Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn 0%> Kriterium 2. Areal over 75000> Areal over 36000> Kriterium 3. Paralleller; avvik mindre enn 14 prosentenheter Paralleller; avvik mindre enn 12 prosentenheter Kriterium 4. Symmetriske topper i kromatogrammet Symmetriske topper i kromatogrammet Tabell 21: Oversikt over kriterier som har blitt oppfylt av løsemidlene for ekstraksjon av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og-073 i testrunde 1 Bufferløsning: 1 1 1 1 1 1 1 1 Løsemiddel n-H:D n-H:D:ETOAC TBME:ETOAC MeOH: D n-H DCM D:ETOAC n-H:ETOAC Kriterium 1 Oppfylt Ikke oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Kriterium 2 Oppfylt Ikke oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Kriterium 3 Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Kriterium 4 Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Oppfylt Tabell 22: Oversikt over resultatene til de løsemidlene som ble vurdert som best i testrunde 1 utfra testrundens kriterier. Forbindelse: JWH-018 JWH-018 JWH-018 JWH-018 Bufferløsning 1 1 1 1 Løsemiddel H:D H:D:ETOAC TBME:ETOAC MeOH: D Gjennomsnittlig prosent 15,00% -4,25% 16,55% 55,80% Gjennomsnittlig areal 85782 71421 86980 116226 Antall prosentenheter i 13 -0,3 13 13 Forbindelse: JWH-018 JWH-018 JWH-018 JWH-018 Bufferløsning 1 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC n-H:ETOAC Gjennomsnittlig prosent 15,5,0% 103,55% 21,9,0% 2,75% Gjennomsnittlig areal 86187 151849 90916 76682 Antall prosentenheter i 13,8 11,3 1,6 5,3 Forbindelse: JWH-073 JWH-073 JWH-073 JWH-073 Bufferløsning 1 1 1 1 Løsemiddel n-H n-H:ETOAC TBME:ETOAC MeOH:D Gjennomsnittlig prosent 8,00% 2,50% 21,05% 58,85% avvik fra target avvik mellom parallellene avvik fra target avvik mellom parallellene 46 avvik fra target Gjennomsnittlig areal 121706 115504 136438 179006 Antall prosentenheter i 12,2 3 7,9 7,5 avvik mellom parallellene Forbindelse: JWH-073 JWH-073 JWH-073 JWH-073 Bufferløsning 1 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC n-H:ETOAC Gjennomsnittlig prosent 10,60% 105,55% 14,05% 2,45% Gjennomsnittlig areal 124625 231640 128542 115455 Antall prosentenheter i 7,6 14,9 1,1 13,6 Forbindelse: JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt Bufferløsning 1 1 1 1 Løsemiddel n-H:D n-H:D:ETOAC TBME:ETOAC MeOH: D Gjennomsnittlig prosent 6,50% -9,10% 29,75% 5,65% Gjennomsnittlig areal 42148 35986 51340 41808 Antall prosentenheter i 1,4 7 10,5 6,7 Forbindelse: JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt Bufferløsning 1 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC n-H:ETOAC Gjennomsnittlig prosent 27,75% 23,45% -7,10% 18,40% Gjennomsnittlig areal 50557 48883 36780 46848 Antall prosentenheter i 10,5 11,7 0,2 5,3 Forbindelse: JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt Bufferløsning 1 1 1 1 Løsemiddel n-H:D n-H:D:ETOAC TBME:ETOAC MeOH: D Gjennomsnittlig prosent 10,85% -1,35% 19,70% 11,80% Gjennomsnittlig areal: 38116 33924 41159 38450 Antall prosentenheter i 0,7 -2,7 5,6 10 Forbindelse: JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt Bufferløsning: 1 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC n-H:ETOAC Gjennomsnittlig prosent 20,15% 32,30% 21,75% 25,60% Gjennomsnittlig areal: 41191 44809 41856 43189 Antall prosentenheter i 5,3 6,8 1,2 8,6 avvik fra target avvik mellom parallellene avvik fra target avvik mellom parallellene avvik fra target avvik mellom parallellene avvik fra target avvik mellom parallellene avvik fra target avvik mellom parallellene 47 5.2.2 Testrunde 2 Tabell 23: Kriterier til løsemidlenes ekstraksjonsegenskaper av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og -073 Kriterier for Virkestoffene JWH -018 og -073 Metabolittene JWH-018 og-073 Kriterium 1. Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn 0%> Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn 0%> Kriterium 2. Gjennomsnittlig areal over 8500> Gjennomsnittlig areal over 3000> Kriterium 3. Paralleller; avvik mindre enn 14 prosentenheter Paralleller; avvik mindre enn 12 prosentenheter Kriterium 4. Symmetriske topper i kromatogrammet Symmetriske topper i kromatogrammet Tabell 24: Oversikt over kriterier som har blitt oppfylt av løsemidlene for ekstraksjon av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og-073 i testrunde 2 Bufferløsning: 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC Kriterium 1 Oppfylt Oppfylt Oppfylt Kriterium 2 Oppfylt Oppfylt Oppfylt Kriterium 3 Oppfylt Oppfylt Oppfylt Kriterium 4 Oppfylt Oppfylt Oppfylt 48 Tabell 25: Oversikt over resultatene til de løsemidlene som ble vurdert som best i testrunde 2 utfra testrundens kriterier. Forbindelse: JWH-018 JWH-018 JWH-018 Bufferløsning 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC Gjennomsnittlig prosent avvik fra target 10,90% -8,15% 44,70% Gjennomsnittlig areal 11320,5 9376,5 12489,5 Antall prosentenheter i avvik mellom parallellene 3,2 17,5 11,7 Forbindelse: JWH-073 JWH-073 JWH-073 Bufferløsning 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC Gjennomsnittlig prosent avvik fra target 8,10% 1,65% 19,65% Gjennomsnittlig areal 15420 14499 17061,5 Antall prosentenheter i avvik mellom parallellene 0,8 8,5 4,9 Forbindelse: JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt Bufferløsning 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC Gjennomsnittlig prosent avvik fra target 5,45% -11,55% 4,10% Gjennomsnittlig areal 9638 8038 9303,5 Antall prosentenheter i avvik mellom parallellene 2,3 1,5 2,85 Forbindelse: JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt Bufferløsning 1 1 1 Løsemiddel n-H DCM D:ETOAC Gjennomsnittlig prosent avvik fra target 6,15% -15,55% -14,30% Gjennomsnittlig areal 3901 3095 3138 Antall prosentenheter i avvik mellom parallellene 5,1 5,5 6,4 49 5.2.3 Testrunde 3 Tabell 26: Kriterier til løsemidlenes ekstraksjonsegenskaper av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og -073 Kriterier for Virkestoffene JWH -018 og -073 Metabolittene JWH-018 og-073 Kriterium 1. Prosent avvik fra target verdien på 100 nM, større enn Prosent avvik fra target verdien på 0%> 100 nM, større enn 0%> Kriterium 2. Areal over 75000> Areal over 36000> Kriterium 3. Paralleller; avvik mindre enn 14 enheter Paralleller; avvik mindre enn 12 enheter Kriterium 4. Symmetriske topper i kromatogrammet Kriterium 5. Rene prøver Symmetriske topper i kromatogrammet Rene prøver Tabell 27: Oversikt over kriterier som har blitt oppfylt av løsemidlene for ekstraksjon av virkestoffene og metabolittene JWH-018 og-073 i testrunde 3 Bufferløsning 4 4 Løsemiddel DCM D:ETOAC Kriterium 1 Oppfylt Oppfylt Kriterium 2 Oppfylt Oppfylt Kriterium 3 Oppfylt Oppfylt Kriterium 4 Oppfylt Oppfylt Kriterium 5 Oppfylt Ikke oppfylt 50 Tabell 28: Oversikt over resultatene til de løsemidlene som ble vurdert som best i testrunde 3 utfra testrundens kriterier. Forbindelse: JWH-018 JWH-018 Bufferløsning 4 4 Løsemiddel D:ETOAC DCM Gjennomsnittlig prosent avvik fra 17,85% 5,10% Gjennomsnittlig areal 13070 11657,5 Antall prosentenheter i avvik 4,7 21,8 Forbindelse: JWH-073 JWH-073 Bufferløsning 4 4 Løsemiddel D:ETOAC DCM Gjennomsnittlig prosent avvik fra 11,45 5,15 Gjennomsnittlig areal 17369,5 16385 Antall prosentenheter i avvik 1,3 16,5 Forbindelse: JWH-018 metabolitt JWH-018 metabolitt Bufferløsning 4 4 Løsemiddel D:ETOAC DCM Gjennomsnittlig prosent avvik fra 6,75% 11,45% Gjennomsnittlig areal 10090,5 10531 Antall prosentenheter i avvik 0,5 14,3 Forbindelse: JWH-073 metabolitt JWH-073 metabolitt Bufferløsning 4 4 Løsemiddel D:ETOAC DCM Gjennomsnittlig prosent avvik fra 7,85% 13,20% Gjennomsnittlig areal 4923,5 5167,5 Antall prosentenheter i avvik 6,3 25,8 target mellom parallellene target mellom parallellene target mellom parallellene target mellom parallellene 5.2.4 Testrunde 4 Resultatene for denne testrunden viste en standardkurve som ikke var lineær, grunnen til dette blir redegjort for senere i oppgaven under diskusjonsdelen. 5.2.5 Testrunde 5 Resultatene fra testrunde 5 har blitt utelat av grunner oppgitt i diskusjonsdelen. 51 5.3 Eksempler på lineære standardkurver for forbindelsene JWH-018, 073 og metabolittene deres JWH-018 Figur 15. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for forbindelsen JWH-018, fragment 155 JWH-018 metabolitt Figur 16. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for metabolitten JWH-018, fragment 155 52 JWH-073 Figur 17. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for forbindelsen JWH-073, fragment 155 JWH-073 metabolitt Figur 18. Figuren viser et eksempel på standardkurve og residualplot for metabolitten JWH-073, fragment 155 53 5.4 Validering Tabell 29: Aksept kriteria for valideringen (15) Parameter Aksept kriteria Linearitet R > 0,99 Presisjon System repeterbarhet Repeterbarhet Reproduserbarhet LOD ≤ 15 % CV LOQ ≤ 15 % CV Nøyaktighet ≤ 15 % CV Gjenvinning 100 ± 15% 2 ≤ 15% ≤ 15% ≤ 15% 5.4.1 Aksept kriteria for valideringen Alle valideringsparameterne som har blitt utført i denne bacheloroppgaven er listet opp i tabell 29 sammen med valideringskriteriene for hver enkelt parameter. Kriteriene som stilles kommer fra ICH(16). Kommentar til resultatene 5.4.2 Linearitet I figur 19, 20, 21 og 22 kan man se at kriteriene som stilles for linearitet, oppfylles av henholdsvis forbindelsene, JWH-018, -073 og metabolittene deres. 5.4.3 Presisjon I tabell 30 kan man se at kriteriene som stilles for presisjon kun oppfylles av kontrollen med lavt konsentrasjonsnivå (Labkontroll 1) der CV ligger mellom 5,5 og 10,7 %. 5.4.4 Reproduserbarhet I tabell 31 kan man se resultatene for reproduserbarhet for forbindelsene JWH-018, -073 og metabolittene deres. Forbindelsen JWH-018 var det kun en av 10 prøver (prøve C) som oppfylte kravet til reproduserbarhet. 54 Metabolitten til JWH-018 var det to av 10 prøver (prøve D og I) som ikke oppfylte kravet til reproduserbarhet. Forbindelsen JWH-073 oppfylte alle prøvene kravet til reproduserbarhet bortsett fra prøve G og J. Metabolitten til JWH-073 oppfylte alle prøvene kravet til reproduserbarhet bortsett fra prøve D og H. 5.4.5 Systempresisjon I tabell 32 kan man utfra resultatene se at alle forbindelsene har en CV <3% og dermed oppfyller kriteriene for systempresisjon. 5.4.6 LOD og LOQ I tabell 33 kan man se utfra resultatene at alle forbindelsene oppfyller kravet til LOD og LOQ. 5.4.7 Gjenvinning I tabellene 34, 35 og 36 kan man se resultatene for gjenvinning på henholdsvis høyt, medium og lavt konsentrasjonsnivå. Av disse konsentrasjonsnivåene er det kun forbindelsene JWH018, JWH-018 metabolitt og JWH-073 metabolitt på lavt konsentrasjonsnivå som oppfyller kravene for gjenvinning. Forbindelse JWH-073 på lavt nivå oppfyller ikke kriteriene til gjenvinning. 55 5.4.8 Linearitet Linearitet for JWH-018 i standardrekke 2 y = 0,9501x + 0,0275 (S1-S7) R² = 0,9967 70 60 50 Mål40 konsentrasjon 30 (nM) 20 10 0 0 10 20 30 40 50 Målt konsentrasjon (nM) 60 70 Figur 19: Gjennomsnittlig linearitet for forbindelsen JWH-018 av tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7) Linearitet for JWH-018 metabolitt i y = 0,9669x - 0,069 standardrekke 2 (S1-S27) R² = 0,9886 70 60 50 40 Målkonsentrasjon 30 (nM) 20 10 0 -10 0 10 20 30 40 50 Målt konsentrasjon (nM) 60 70 80 Figur 20: Notat: rund av R2 Gjennomsnittlig linearitet for metabolitten JWH-018 av tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7) 56 Linearitet for JWH-073 i standardrekke 2 (S1S7) y = 0,9487x - 0,1671 R² = 0,994 70 60 50 40 Mål-konsentrasjon 30 (nM) 20 10 0 -10 0 10 20 30 40 Målt konsentrasjon (nM) 50 60 70 Figur 21: Gjennomsnittlig linearitet for forbindelsen JWH-073 av tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7) Linearitet for JWH-073 metabolitt i standardrekke 2 (S1-S7) y = 1,0052x - 0,003 R² = 0,9987 70 60 50 Mål-konsentrasjon 40 (nM) 30 20 10 0 0 10 20 30 40 Målt konsentrasjon (nM) 50 60 70 Figur 22: Gjennomsnittlig linearitet for metabolitten JWH-073 av tre paralleller av standardrekke 2 (S1-S7) 57 5.4.9 Presisjon Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Prøve: CV (%) Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Paralleller Prøve: Forbindelse: 23,17 1,009 4,35 4,40 5,14 3,51 5,91 3,84 3,32 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 2 7,15 0,087 1,22 1,24 1,10 1,28 1,29 1,27 1,11 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 1 JWH-018 CV % Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Prøve: CV (%) Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Prøve: Forbindelse: 18,2 0,639 3,52 3,80 3,37 3,49 3,77 4,28 2,38 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 2 10,7 0,107 1,00 1,09 0,99 1,11 0,86 1,05 0,88 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 1 JWH-018 metabolitt CV % Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Prøve: CV (%) Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Prøve: Forbindelse: 17,1 0,685 4,00 3,87 4,56 3,72 4,99 3,82 3,04 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 2 5,5 0,0612 1,11 1,18 1,02 1,12 1,15 1,15 1,06 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 1 JWH-073 CV % Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Prøve: CV (%) Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Prøve: Forbindelse: 16,3 0,565 3,48 3,63 3,38 3,60 3,82 4,02 2,41 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 2 9,3 0,088 0,94 0,94 0,98 1,07 0,83 0,98 0,86 Målt konsentrasjon (nM) Labkontroll 1 JWH-073 metabolitt Tabell 30: Resultat for validering av metodens presisjon med et høyt og et lavt nivå CV % 58 5.4.10 Reproduserbarhet Tabell 31: Oversikt over resultatene for reproduserbarheten for ti prøver over tre dager Forbindelse: JWH-018 F E D C B A Prøve: 3,30 5,11 2,23 6,35 4,93 6,64 6,19 Målt konsentrasjon nM H G F E D C B A Prøve: 2,81 4,50 3,03 7,07 2,55 9,33 4,12 7,92 4,77 Målt konsentrasjon nM J I H G F E D C B A Prøve: 2,71 2,15 2,85 2,21 4,67 1,66 5,66 4,38 5,70 4,34 Målt konsentrasjon nM 5,20 2,84 4,06 2,85 5,62 2,15 7,11 4,48 6,75 5,10 Gjennomsnitt: nM 2,177 0,700 1,064 0,568 1,278 0,451 1,950 0,414 1,114 0,968 Standardavvik nM 41,9 24,7 26,2 19,9 22,7 21,0 27,4 9,2 16,5 19,0 CV (%) Dag 3 G 4,84 I 6,76 Dag 2 H 3,55 J Dag 1 I 6,12 Forbindelse: JWH-018 metabolitt J F E D C B A Prøve: 3,65 7,05 2,37 7,77 4,82 7,03 5,68 Målt konsentrasjon nM H G F E D C B A Prøve: 3,72 5,12 3,49 6,42 2,71 8,40 5,43 7,37 6,71 Målt konsentrasjon nM I H G F E D C B A Prøve: 2,93 5,11 3,36 5,98 2,62 5,53 5,24 6,73 6,15 Målt konsentrasjon nM 3,58 5,33 3,50 6,48 2,57 7,23 5,16 7,04 6,18 Gjennomsnitt: nM 0,588 0,372 0,145 0,538 0,176 1,508 0,312 0,320 0,516 Standardavvik nM 16,4 7,0 4,2 8,3 6,9 20,9 6,0 4,5 8,3 CV (%) Dag 3 G 5,76 I Dag 2 H 4,08 Dag 1 I 59 A Prøve: 4,79 6,98 5,85 Målt konsentrasjon nM E D C B A Prøve: 3,27 6,26 2,43 8,22 4,37 7,34 5,46 Målt konsentrasjon nM I H G F E D C B A Prøve: 3,65 2,76 3,59 2,58 5,29 1,99 6,75 4,71 6,04 4,88 Målt konsentrasjon nM 5,07 3,06 4,24 3,15 5,71 2,23 7,22 4,62 6,79 5,40 Gjennomsnitt: nM 5,90 1,251 0,322 0,561 0,520 0,498 0,224 0,870 0,223 0,671 0,488 Standardavvik nM 0,491 24,7 10,5 13,3 16,5 8,7 10,0 12,1 4,8 9,9 9,0 CV (%) 8,3 5,40 B 6,68 F 4,52 J J C 2,28 G 3,02 Dag 3 E D C B A Prøve: 6,47 2,30 7,14 4,46 6,56 5,16 Målt konsentrasjon nM G F E D C B A Prøve: 4,54 3,33 5,73 2,40 7,72 4,85 6,57 6,00 Målt konsentrasjon nM I H G F E D C B A Prøve: 4,69 2,83 4,05 2,98 5,09 2,17 4,00 4,37 5,88 5,38 Målt konsentrasjon nM 5,33 3,34 4,75 3,32 5,76 2,29 6,29 4,56 6,34 5,51 Gjennomsnitt: nM 0,635 0,471 0,831 0,340 0,691 0,115 2,001 0,255 0,396 0,436 Standardavvik nM 11,9 14,1 17,5 10,2 12,0 5,0 31,8 5,6 6,2 7,9 CV (%) 5,93 D 5,58 H 6,00 J E 3,60 I F 3,66 H 3,42 J 6,38 F 4,60 J J G 3,40 Forbindelse: JWH-073 H 5,57 Dag 2 I Dag 1 J Forbindelse: JWH-073 metabolitt G 5,67 I 5,33 Dag 3 H 3,76 J Dag 2 I 5,96 Dag 1 J 60 5.4.11 Systempresisjon Tabell 32: Resultatene for validering av systempresisjon. Forbindelse: JWH-018 Forbindelse: JWH-073 Prøve: K2 Målt konsentrasjon nM Prøve: K2 Målt konsentrasjon nM Injeksjon 1 8,90 Injeksjon 1 8,41 Injeksjon 2 8,65 Injeksjon 2 8,53 Injeksjon 3 8,54 Injeksjon 3 8,60 Injeksjon 4 8,76 Injeksjon 4 8,36 Injeksjon 5 8,76 Injeksjon 5 8,33 Injeksjon 6 8,76 Injeksjon 6 8,55 Injeksjon 7 8,79 Injeksjon 7 8,53 Injeksjon 8 8,83 Injeksjon 8 8,46 Injeksjon 9 8,98 Injeksjon 9 8,39 Injeksjon 10 8,89 Injeksjon 10 8,48 Standardavvik: 0,127 Standardavvik: 0,089 Gjennomsnitt: 8,79 Gjennomsnitt: 8,46 CV % 1,44 CV % 1,06 Forbindelse: JWH-073 metabolitt Forbindelse: JWH-018 metabolitt Prøve: K2 Målt konsentrasjon nM Prøve: K2 Målt konsentrasjon nM Injeksjon 1 6,44 Injeksjon 1 7,32 Injeksjon 2 6,34 Injeksjon 2 7,32 Injeksjon 3 6,49 Injeksjon 3 7,35 Injeksjon 4 6,32 Injeksjon 4 7,31 Injeksjon 5 6,31 Injeksjon 5 7,28 Injeksjon 6 6,24 Injeksjon 6 7,34 Injeksjon 7 6,29 Injeksjon 7 7,26 Injeksjon 8 6,29 Injeksjon 8 7,31 Injeksjon 9 6,38 Injeksjon 9 7,26 Injeksjon 10 6,34 Injeksjon 10 7,29 Standardavvik: 0,075 Standardavvik: 0,031 Gjennomsnitt: 6,344 Gjennomsnitt: 7,304 CV % 1,18 CV % 0,42 61 5.4.12 LOD og LOQ Tabell 33: Resultat for validering av LOD og LOQ. Forbindelse: JWH-018 Forbindelse: JWH-018 metabolitt Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell 0,17 0,15 0,14 0,13 0,17 0,14 Målt konsentrasjon nM Gjennomsnitt: Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell Intet målbart Intet målbart Intet målbart Intet målbart Intet målbart Intet målbart Målt konsentrasjon nM Standardavvik Gjennomsnitt: Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell 2,88 0,004 0,14 0,14 0,14 0,14 0,15 0,14 0,14 Målt konsentrasjon nM CV (%) Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell 0,00 0 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 Målt konsentrasjon nM Prøve: S7 Parallell 6 0,15 Standardavvik CV (%) Prøve: S6 Gjennomsnitt 0,017 CV (%) Prøve: S7 Standardavvik 11,16 Prøve: S6 CV (%) Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell 0,16 0,15 0,15 0,14 0,14 0,15 Målt konsentrasjon nM Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell 0 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 Målt konsentrasjon nM CV (%) Standardavvik Gjennomsnitt Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell 14,3 0,021 0,15 0,16 0,16 0,15 0,16 0,13 0,11 Målt konsentrasjon nM CV (%) Standardavvik Gjennomsnitt: Parallell 6 Parallell 5 Parallell 4 Parallell 3 Parallell 2 Parallell 1 Parallell 14,1 0,005 0,04 0,03 0,04 0,04 0,04 0,03 0,04 Målt konsentrasjon nM Prøve: S7 Forbindelse: JWH-073 metabolitt Parallell 6 0,15 Standardavvik 0,00 Prøve: S6 Gjennomsnitt: 0,008 CV (%) Prøve: S7 Forbindelse: JWH-073 Standardavvik 5,1 Prøve: S6 CV (%) 62 5.4.13 Gjenvinning Tabell 34: Resultat av gjenvinning på en prøve med høy konsentrasjon (nivå 1) Forbindelse: JWH-018 Forbindelse: JWH-018 metabolitt Prøve: Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM Prøve : Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM Parallell 1 1,11 Parallell 1 0,88 Parallell 2 1,27 Parallell 2 1,05 Parallell 3 1,29 Parallell 3 0,86 Gjennomsnitt 1,22 Gjennomsnitt 0,93 Prøve: S2 Teoretisk konsentrasjon nM Prøve: S2 Teoretisk konsentrasjon nM S2 30 S2 30 Prøve GJ A: 50 µl Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM Prøve GJ A: 50 µl Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM + 50 µl std2 + 50 µl std2 Parallell 1 28,53 Parallell 1 23,99 Parallell 2 28,20 Parallell 2 18,63 Parallell 3 24,05 Parallell 3 20,70 Gjennomsnitt 26,93 Gjennomsnitt 21,11 Teoretisk konsentrasjon (nM) 15,61 Teoretisk konsentrasjon (nM) 15,465 Gjenvinning (%) 172,5 Gjenvinning (%) 136,48 Forbindelse: JWH-073 Forbindelse: JWH-073 metabolitt Prøve: Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM Prøve: Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM Parallell 1 1,06 Parallell 1 0,86 Parallell 2 1,15 Parallell 2 0,98 Parallell 3 1,15 Parallell 3 0,83 Gjennomsnitt 1,12 Gjennomsnitt 0,89 Prøve: S2 Teoretisk konsentrasjon nM Prøve: S2 Teoretisk konsentrasjon nM S2 30 S2 30 Prøve GJ A: 50 µl Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM Prøve GJ A: 50 µl Labkontroll 1 Målt konsentrasjon nM + 50 µl std2 + 50 µl std2 Parallell 1 24,09 Parallell 1 22,86 Parallell 2 24,26 Parallell 2 19,26 Parallell 3 22,26 Parallell 3 19,79 Gjennomsnitt 23,54 Gjennomsnitt 20,64 Teoretisk konsentrasjon (nM) 15,56 Teoretisk konsentrasjon (nM) 15,445 Gjenvinning (%) 151,26 Gjenvinning (%) 133,61 63 Tabell 35: Resultat av gjenvinning på prøve med medium konsentrasjon (nivå 2) Forbindelse: JWH-018 Forbindelse: JWH-018 metabolitt Prøve:Labkontroll 2 Målt konsentrasjon nM Prøve: Labkontroll 2 Målt konsentrasjon nM Parallell 1 3,32 Parallell 1 2,38 Parallell 2 3,84 Parallell 2 4,28 Parallell 3 3,51 Parallell 3 3,49 Gjennomsnitt 3,56 Gjennomsnitt 3,38 Prøve: S4 Teoretisk konsentrasjon Prøve: S4 Teoretisk konsentrasjon nM nM S4 1,5 S4 1,5 Prøve GJ B: 50 µl Labkontroll 2 + 50 Målt konsentrasjon nM Prøve GJ B: 50 µl Labkontroll 2 + 50 Målt konsentrasjon nM µl std4 µl std4 Parallell 1 4,14 Parallell 1 2,63 Parallell 2 3,89 Parallell 2 3,45 Parallell 3 3,49 Parallell 3 3,35 Gjennomsnitt 3,84 Gjennomsnitt 3,14 Teoretisk konsentrasjon (nM) 2,53 Teoretisk konsentrasjon (nM) 2,44 Gjenvinning (%) 151,9 Gjenvinning (%) 128,74 Forbindelse: JWH-073 Forbindelse: JWH-073 metabolitt Prøve : Labkontroll 2 Målt konsentrasjon nM Prøve : Labkontroll 2 Målt konsentrasjon nM Parallell 1 3,04 Parallell 1 2,41 Parallell 2 3,82 Parallell 2 4,02 Parallell 3 3,72 Parallell 3 3,60 Gjennomsnitt 3,53 Gjennomsnitt 3,34 Prøve: S4 Teoretisk konsentrasjon Prøve: S4 Teoretisk konsentrasjon nM nM S4 1,5 S4 1,5 Prøve GJ B: 50 µl Labkontroll 2 + 50 Målt konsentrasjon nM Prøve GJ B: 50 µl Labkontroll 2 + 50 Målt konsentrasjon nM µl std4 µl std4 Parallell 1 3,53 Parallell 1 2,60 Parallell 2 3,40 Parallell 2 3,25 Parallell 3 3,22 Parallell 3 3,22 Gjennomsnitt 3,38 Gjennomsnitt 3,02 Teoretisk konsentrasjon (nM) 2,51 Teoretisk konsentrasjon (nM) 2,42 Gjenvinning (%) 134,62 Gjenvinning (%) 124,85 64 Tabell 36: Resultat av gjenvinning på prøve med lav konsentrasjon. (nivå 3) Forbindelse: JWH-018 Forbindelse: JWH-018 metabolitt Prøve : Labkontroll 3 Målt konsentrasjon nM Prøve : Labkontroll 3 Målt konsentrasjon nM Parallell 1 0,45 Parallell 1 0,47 Parallell 2 0,55 Parallell 2 0,45 Parallell 3 0,54 Parallell 3 0,43 Gjennomsnitt 0,51 Gjennomsnitt 0,45 Prøve: S6 Teoretisk konsentrasjon nM Prøve: S6 Teoretisk konsentrasjon nM S6 0,15 S6 0,15 Prøve GJ C: 50 µl Labkontroll 3 Målt konsentrasjon nM Prøve GJ C: 50µl Labkontroll 3 Målt konsentrasjon nM + 50 µl std6 + 50 µl std6 Parallell 1 0,37 Parallell 1 0,30 Parallell 2 0,35 Parallell 2 0,31 Parallell 3 0,39 Parallell 3 0,32 Gjennomsnitt 0,37 Gjennomsnitt 0,31 Teoretisk konsentrasjon (nM) 0,33 Teoretisk konsentrasjon (nM) 0,30 Gjenvinning (%) 111,6 Gjenvinning (%) 103,3 Forbindelse: JWH-073 Forbindelse: JWH-073 metabolitt Prøve : Labkontroll 3 Målt konsentrasjon nM Prøve : Labkontroll 3 Målt konsentrasjon nM Parallell 1 0,36 Parallell 1 0,44 Parallell 2 0,46 Parallell 2 0,41 Parallell 3 0,47 Parallell 3 0,41 Gjennomsnitt 0,43 Gjennomsnitt 0,42 Prøve: S6 Teoretisk konsentrasjon (nM) Prøve: S6 Teoretisk konsentrasjon (nM) S6 0,15 S6 0,15 PrøveGJ C: 50 µl Labkontroll 3 + Målt konsentrasjon nM Prøve GJ C: 50 µl Labkontroll 3 Målt konsentrasjon nM 50 µl std6 + 50 µl std6 Parallell 1 0,34 Parallell 1 0,28 Parallell 2 0,35 Parallell 2 0,30 Parallell 3 0,33 Parallell 3 0,32 Gjennomsnitt 0,34 Gjennomsnitt 0,30 Teoretisk konsentrasjon (nM) 0,29 Teoretisk konsentrasjon (nM) 0,29 Gjenvinning (%) 117,2 Gjenvinning (%) 105,3 65 6. Diskusjon 6.1 Pilotundersøkelse For alle testrundene har det blitt benyttet kun en type kolonne og en mobilfase på grunn av tidsbegrensninger for denne bacheloroppgaven. I utgangspunktet skulle metodeutviklingen finne det løsemidlet og bufferløsningen som ga best ekstraksjon av alle forbindelsene listet under virkestoff/analytt og metabolitt/analytt i reagenslisten. Men i det tidsrommet denne bacheloroppgaven ble utført var det liten eller ingen tilgang til isotopmerkede utgaver av de syntetiske cannabinoidene, bortsett fra JWH-018 og 073. Av denne grunn ble det bestemt at valideringen skulle fokusere på forbindelsene JWH073, JWH-018 og deres metabolitter. I etterkant av denne bestemmelsen ble det enighet om at pilotundersøkelsen også skulle kun fokusere på forbindelsene JWH-018 og -073. Selv om fokuset har vært på disse to forbindelsene og deres metabolitter, har valgene av hvilke løsemidler som skulle gå videre i løpet av testrundene, eller eliminasjonsrundene, også vært påvirket av løsemidlene og bufferløsningenes evne til å ekstrahere de andre forbindelsene under kategorien virkestoff/analytt i reagenslisten. 6.1.1 Testrunde 1 For denne testrunden ble det tatt utgangspunkt i de 19 organiske løsemidlene listet opp i tabell 16, og bufferløsning nummer 1. Noen av disse løsemidlene i testutvalget ble valgt ut på bakgrunn av faglitteratur, mens de fleste av løsemidlene var allerede i bruk i rutineanalysene ved MS-laboratoriet ved UNN. Siden det i testrunde 1 kun ble fokusert på løsemidlene ble disse bare testet med bufferløsningen 1 fordi den hadde vært benyttet i faglitteratur (14) Fokuset for testrunden var å finne de organiske løsemidlene som kunne oppfylle de veiledende kriteriene som ble stilt til denne testrunden, kriteriene er listet opp i tabell 20. De løsemidlene som ikke oppfylte kriteriene for ekstraksjon av forbindelsene JWH-018 og-073 og metabolittene deres, stilt for testrunde 1, ble eliminert fra utvalget og ble ikke undersøkt videre. Resultatene til disse løsemidlene har blitt utelatt siden de ikke oppfylte minimumskriteriene. 66 7 av de 19 løsemidlene gikk videre til testrunde 2 fordi de oppfylte alle kriteriene for denne testrunden. Hvilke løsemidler som oppfylte kriteriene er vist i tabell 21 og resultatene deres er vist i tabell 22. n-H:D:ETOAC, oppfylte bare kriterium 3 og 4 og skulle på grunnlag av dette ikke blitt tatt med videre i pilotundersøkelsen. Men siden dette løsemidlet hadde blitt benyttet i en tidligere, lignende undersøkelse ved MS-laboratoriet med gode resultater, ble det undersøkt videre. Resultatet for dette løsemidlet er tatt med i tabell 22. 6.1.2 Testrunde 2 I denne testrunden ble det i likhet med testrunde 1 kun fokusert på undersøkelse av løsemidlene for utvikling av en ekstraksjonsmetode, dermed ble kun bufferløsning 1 benyttet. I denne testrunden ble det satt nye kriterier til løsemidlene, som er listet opp i tabell 23. Av de 9 løsemidlene som ble undersøkt var det kun de tre løsemidlene vist i tabell 24 som oppfylte kriteriene og følgelig gikk til videre undersøkelse i testrunde 3. Resultatene deres er vist i tabell 25. 6.1.3 Testrunde 3 I testrunde 3 ble hvert av løsemidlene n-H, D:ETOAC og DCM, undersøkt videre med bufferløsning 1, 2, 3 og 4. DCM ble i tillegg undersøkt med og uten tilsetting av IS for å undersøke om mengden MeOH i fra IS hadde signifikant betydning for ekstraksjon av forbindelsene. Av disse to løsemidlene og fire bufferløsningene var det kun DCM kombinert med bufferløsning 4 som oppfylte kriteriene i tabell 26 satt for denne testrunden. I tabell 27 kan man se at D:ETOAC kombinert med bufferløsning 4 ikke oppfylte kravet om rene prøver. 6.1.4 Testrunde 4 I testrunde 4 ble standardrekke 1 (S1-S7) og kontrollgruppe 1 satt opp for ekstraksjon med løsemidlene DCM og D:ETOAC og henholdsvis bufferløsning 4 (K1-K3) for å undersøke hvilke av disse ekstraksjonsreagensene som ville gi best linearitet. Siden standardrekken var tillaget med urin som matrise ga den en avbøyd standardkurve. MS-laboratoriet ved UNN har erfaring fra utviklingen av ekstraksjonsmetoden av THC at polypropylenplastikken i Sarstedtrørene som benyttes for ekstraksjon, holder tilbake en signifikant mengde av THC analyttene. Grunnen til dette er at THC er meget klebrig og det samme gjelder for de syntetiske cannabinoidene. I denne runden ble det derfor bestemt at urin ikke passet som matrise for standardene ved denne analysemetoden. Det ble i stedet besluttet at man skulle benytte serum som matrise i standardrekken slik som i THC metoden. Dette var fordi serum har bedre 67 egenskaper for å holde syntetiske cannabinoider løst i matrisen enn urin, slik at analyttene ikke fester seg til polypropylenplastikken i Sarstedt-rørene i like stor grad. 6.1.5 Testrunde 5 I denne testrunden ble standardrekke 2 (S1-S7) og kontroll gruppe 2 (K1-K3) satt opp for ekstraksjon med løsemidlene DCM, D:ETOAC og n-H:D:ETOAC og bufferløsning 4. n-H:D:ETOAC ble tatt med i denne testrunden til tross for at den ikke har gitt gode resultater i noen av de tidligere testrundene, fordi det var ønsket av veileder å se hvordan lineariteten på standardkurven ville bli i denne pilotundersøkelsen. I utgangspunktet skulle resultatene fra denne testrunden benyttes til å ta en endelig avgjørelse av hvilket løsemiddel og bufferløsning som skulle benyttes som ekstraksjonsreagenser av de syntetiske cannabinoidene. Men resultatene til standardkurvene, ekstrahert med de tre ulike løsemidlene, bidrog ikke til noen konkret konklusjon. Av denne grunn er resultatene for denne testrunden ikke tatt med i resultatdelen. Bare noen få av standardkurvene for enkelte forbindelser, ekstrahert med samme løsemiddel og bufferløsning, var lineær. 6.2 Feilkilder Generelle feilkilder som kan ha påvirket resultatene er pipetteringsfeil, spesielt med små volum ved pipettering av prøver/standarder og IS i ekstraksjonsdelen av analysemetoden. En konkret feil skjedde i testrunde 3 der det ikke ble tatt med en parallell til undersøkelse av DCM og bufferløsning 3 fordi det ikke var nok prøvemateriale igjen av testløsning 2 (spiked urinprøve). En annen konkret feilkilde som har hatt stor innvirkning på resultatene for testrunde 5 er standardrekke 2 og kontrollgruppe 2. Denne standardrekken og kontrollgruppen fikk target-verdiene sine justert til mer korrekte verdier i etterkant av pilotundersøkelsen. 68 6.3 Validering 6.3.1 Linearitet Lineariteten for forbindelsene JWH-018, -073 og metabolittene deres ble testet på syv ulike konsentrasjonsnivåer ved å benytte standardrekke 2 med tre paralleller. Alle forbindelsene innfrir valideringskravet til linearitet listet i tabell 29. 6.3.2 Nøyaktighet Nøyaktigheten har ikke vært mulig å validere på grunn av dårlig tilgang til referansemateriale for forbindelsene denne metoden skulle valideres for. 6.3.3 Presisjon Presisjonen for metoden ble testet ved å analysere to kontroller, en med høy konsentrasjon og en med lav konsentrasjon, med tre paralleller hver. Utfra resultatene i tabell 30 er det kun kontrollprøven med lavt nivå som innfrir valideringskravet til presisjon, listet i tabell 29, for alle forbindelsene. Kontrollprøven med høy konsentrasjon innfrir ikke valideringskravene til presisjon. 6.3.4 Systempresisjon Systempresisjonen ble testet ved å analysere 10 injeksjoner av en spiked prøve, resultatene i tabell 30 viser at systempresisjonen oppfyller valideringskravene. 6.3.5 Reproduserbarhet Reproduserbarheten for denne metoden ble testet ved å analysere 10 spikede prøver, med forskjellige konsentrasjoner av analyttene, over tre dager. Resultatene i tabell 31 viser at kravet til metodens reproduserbarhet for JWH-018 bare innfris for en av de 10 prøvene. Alle prøvene for JWH-018 sin metabolitt og JWH-073 sin metabolitt innfrir kravet til reproduserbarhet, bortsett fra en, Forbindelsen JWH-073 innfrir alle prøvene, bortsett fra to, kravet til metodens reproduserbarhet. 69 6.3.6 LOD og LOQ I tabell 33 kan man se utfra resultatene at alle forbindelsene oppfyller kravet til LOD og LOQ JWH-018 LOQ er 0,15 nM JWH-018 metabolitt LOQ er 0,03nM JWH-073 LOQ er 0,03nM JWH-073 metabolitt LOQ er 0,03 nM 6.3.7 Gjenvinning Gjenvinning for denne metoden ble testet med prøver på tre konsentrasjonsnivåer ved å tilsette standard til en kontroll som inneholder analyttene. Med unntak av resultatene for gjenvinning på det laveste nivået, nivå 3, gir ingen av resultatene for de to andre konsentrasjonsnivåene mening hvis den praktiske gjennomføringen ble utført korrekt i henhold til fremgangsmåten. Resultatene for gjenvinning nivå -1, -2 og -3 er vist henholdsvis i tabell 34, 35 og 36. Beregningene av gjenvinning viser en gjenvinningsrate for alle forbindelsene som er altfor høy, det vil si over 115 %. Resultatene for gjenvinning vil omtales videre under feilkilder for valideringen. 6.4 Feilkilder Den feilkilden som virker å ha hatt størst innvirkning på valideringsprosessen av denne metoden er uheldige feilpipetteringer i begynnelsen av gjennomføringen av denne bacheloroppgaven. Konsekvensen av dette har vært mest tydelig med standardrekke 2. Ved tilvirkningen av standardrekke 2 ble det begått noen feil. I utgangspunktet skulle det tilvirkes to bruksløsninger for standardrekke 2. Den ene bruksløsningen på 5000 nM skulle fortynnes videre til en bruksløsning på 1000 nM. Sistnevnte bruksløsning skulle brukes videre til å lage standardrekker fra S1 til S7 med konsentrasjonene 100, 10, 1, 0,5, 0,1, 0,05 og 0,01. Men på grunn av en misforståelse ble det tatt utgangspunkt i den førstnevnte bruksløsningen på 5000 nM. Dermed ble de teoretiske konsentrasjonene på standardrekke 2 i stedet slik som de er 70 beskrevet i tabell 10. Etter tillagingen av standardrekke 2 ble det kjørt en kontroll analyse for å sjekke konsentrasjonene til standardrekken og det viste seg den teoretiske konsentrasjonen ikke stemte med den målte konsentrasjonen. Konsentrasjonen til de syv standardene ble derfor justert ned til konsentrasjonene beskrevet i tabell 10 ved hjelp av referansematerialer tilvirket av veileder. En annen feilkilde er IS-løsningen som har blitt benyttet. Ved slutten av valideringen fremsto det uklart om problemene IS har forårsaket skyldes feilpipetteringer eller andre omstendigheter. Problemene har artet seg i at IS har gitt mindre god linearitet i noen tilfeller når den har vært benyttet til å beregne standardkurven, enn når beregningen ble foretatt uten. 6.5 Konklusjon 6.5.1 Pilotundersøkelse Valget av endelige ekstraksjonsreagenser sto mellom DCM med bufferløsning 4, og D:E med bufferløsning 4. DCM og bufferløsning 4 ble valgt som ekstraksjonsreagenser fordi de ga de reneste prøvene etter ekstraksjon. Etter testrunde 4 ble det også bestemt at det skulle benyttes serum som matrise for standarder og kontrollgrupper av grunner nevnt i diskusjonen. Valget av de endelige ekstraksjonsreagensenes ble tatt på grunnlag av resultatene fra testrunde 3. 6.5.2 Validering Arbeidet med å modifisere THC metoden til en metode som kan benyttes som en kvantitativ analyse for påvisning av inntak av de syntetiske cannabinoidene JWH-018 og -073 er kommet i gang. Resultatene viser at metoden har potensial selv om den ikke innfrir flere av valideringskravene som stilles for at den skal kunne benyttes som rutineanalyse. Mye av dette skyldes feil som ble begått i begynnelsen av denne oppgaven på grunn uerfarenhet, men også det faktum at dette er en ny metode som ikke er spesielt utbredt i Norge. 71 7. Kilder 1. Tuv SS et al. Syntetiske cannabinoider – effekt og forekomst. Tidsskrift for den norske legeforening. 2012; 132: 2285-8. 2. “Synthetic marijuana” chemist John.w.Huffman interviewed on regional NPR program. CENtral science. http://cenblog.org/terrasigillata/2011/01/26/synthetic-marijuana-chemist-john-w-huffman-interviewedon-regional-npr-program/ (29.05.2013) 3. Mode of action. Technische Universitat München. http://www.dopingprevention.sp.tum.de/substances-and-methods/cannabinoids/mode-ofaction.html (25.05.2013) 4. Khiabani HZ og Mørland J. Cannabis og cannabinoider som legemidler. Tidsskrift for den norske legeforening. 2007;127: 579-82. 5. Gottardo R et al. Micellar electrokinetic chromotography: A new simple tool for the analysis of synthetic cannabinoids in herbal blends and for the rapid estimation of their log P values. Journal of Chromatography A. 2012; 1267: 198-205. 6. Bjergaard SP og Rasmussen KE. Legemiddelanalyse (2. utgave). Bergen: Fagbokforlaget Vigmostad & Bjørke AS; 2010. 7. Retensjonstid. MedTekipedia. http://medtekipedia.wikispaces.com/Retensjonstid (23.05.2013) 8. Atlantis T3 and Acquity UPLC HSS T3 Columns. Waters Corporation. http://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720001887en.pdf (27.05.2013) 9. Electrospray Ionization. National High Magnetic Field Laboratory. http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_esi.html (25.05.2013) 10. What Types of Instruments Are Used? Waters Corporation. http://www.waters.com/waters/en_NO/What-Types-of-Instruments-AreUsed%3F/nav.htm?locale=en_NO&cid=10090937 (27.05.2013) 11. Laboratory services Biological mass spectrometry centre Metabolomics. University College London. http://www.ucl.ac.uk/ich/services/labservices/mass_spectrometry/metabolomics/hplc (28.05.2013) 72 12. Introduction to MS Quantitation and Modes of LC/MS Monitoring. Thermo Fisher Scientific Inc. http://www.ionsource.com/tutorial/msquan/intro.htm (28.05.2013) 13. Guidance for the Validation of Analytical Methodology and Calibration of Equipment used for Testing of Illicit Drugs in Seized Materials and Biological Specimens. United Nations Publications, Østerrike: 2009. 14. Dresen S et al. Development and validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the quantitation of synthetic cannabinoids of the aminoalkylindole type and methanandamide in serum and its application to forensic samples. J Mass Spectrom. 2011; 46: 163-71. 15. ICH-Q2A, Guideline for Industry, Test on Validation of Analytical Procedures, March 1995. 16. ICH-Q2B, Guidance for Industry, Validation of Analytical Procedures: Methodology, November 1996. 73
© Copyright 2024