Probiotika og immunstimulerende
midler for å bedre helse
SATS PÅ TORSK
Nettverksmøte 2011, 9-10 February
Kiron Viswanath
Faculty of Biosciences and Aquaculture, University of Nordland
Sykdommer på torsk: årsaker
Utilstrekkelig
sykdomsforebygging
Intensivt
oppdrett
Sykdom
på torsk
Interaksjoner
mellom
oppdretts- og
villfisk
Nye
sykdommer
Source: FAO
VETERINÆR
PROBIOTIKA
AKVATISK
MILJØ
DYR
MENNESKER
Produksjon av
inhiberende
forbindelser
Konkurranse om
adheranse
områder
PROBIOTIKA
Konkurranse om
næringsstoff;
Bidrag som
enzymer
Styrking av immunresponsen
Lumen





Mukus fra goblet celler
Apikal surt mikromiljø i tarmepitel
Cell turnover
Peristalsis
Antibakteriell aktivitet i epidermal mukus
Lumen
Disse proteiner gjør
epitelceller i stand til å
koordinere hendelser i
tarmen.
ENTEROCYTT FUNKSJONER
• Fanger opp
makromolekyler
• Absorberer næring
• Fungerer som
immunceller
 Tilstedeværelse av reseptorer for bakterielle
produkter
 Uttrykking av overflatemolekyler som inneholder
immunoglobulin områder
 Uttrykker proteiner som har interaksjoner med
immunocytter i tarm
Concept from Sanderson 2003, NeoReviews 4
Terrestrielle
probiotiske
organismer for
akvatisk bruk
Nyttige native
bakterier
?
Vert-opphav , fra
en akvatisk
organisme
Start
Ufôret
Fôret
1
15
2
3
4
5
6
7
8
9
16
10 11
13 12
14
Diversiteten i det bakterielle tarmsamfunnet ble redusert som følge av fôring, mens det var liten
forandring ved sulting.
Dhanasiri et al. 2010. Microbial Ecology 61
Eubacteria
(Uncultured
bacteria)
12
19
69
g-Proteobacteria
(Photobacterium
iliopiscarium
strains)
α-Proteobacteria
(Roseobacter sp.)
197 isolater ble undersøkt, 29 (14.8%) var antagonistisk mot Vibrio anguillarum, A. salmonicida.
19,3
Firmicutes
Actinobacteria
11,5
69,2
Others
188 isolater ble undersøkt, 6 (3.2%) var antagonistisk mot Vibrio anguillarum, A.
salmonicida subsp. achromogenes og V. salmonicida
Lauzon et al. 2008, Vet Microbiol 132
Egg/start
fôring
•Colwellia spp. (rapidly disappeared from microbiota)
•Vibrio logei, V. fischeri & V. anguillarum
1. 3 uker •V. anguillarum, Vibrio sp., Pseudoalteromonas sp. (larval GI tract)
med fôring
2. 3 uker
med fôring
•Flexibacter aurantiacus, a species of Sulfitobacter, &
putative Mycoplamsa sp (50th day dominant).
Ingen korrelasjon mellom mikrobiota assosiert med levende fôr og i tarm hos torskelarver.
Korsnes et al. 2006, ICES J Mar Sci 63
McIntosh et al. 2008, Aquaculture 275
Begynnelse av start fôring
Innsamling av prøver
Overføring av larver
**
0
1
*
2 3
4
+
+ + + +
*
*
5 6
+ + + +
*
*
+ +
*
+
*
+ +
*
+ +
*
+ + + +
*
*
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Dager etter klekking
**0.1 g/l probiotiske bakterier i sjøvann, *0.04g/l probiotiske bakterier i sjøvann
+hjuldyr anriket med 12 g blanding med probiotiske bakterier/500,000 hjuldyr
H. Sveinsdóttir et al. 2009. Comp Biochem Physiol 4
KONTROLL GRUPPE
PROBIOTISK GRUPPE
HMT
HMT
SOMATOLACTIN
SOMATOLACTIN
Transferrin
Transferrin
MAPK p38
MAPK p38
MAPK p38
MAPK p38
3 til 3.6 gang nedregulering av immunrelaterte proteiner i probiotisk gruppe.
Probiotiske bakterier kan ha utkonkurrert patogene bakterier, som kan ha
resultert i lavere uttrykking av immunrelaterte proteiner i denne gruppen.
H. Sveinsdóttir et al. 2009. Comp Biochem Physiol 4
Melkesyre bakterier
Log CFU/g
5
4
3
Pyloric caeca
2
Intestines
1
0
1
2
LABC
1
2
LABC+P
Torskeyngel (prøver 1 & 2; 5 fisk hver) etter 3 uker på fôr som inneholdt Carnobacterium divergens
(LABC); LABC + P gruppe – Som også inneholdt immunstimulerende peptider (fiskeprotein hydrolysate)
Gildberg & Mikkelsen, 1998, Aquaculture 167
A – Fisk som er gitt kontrol fôr. B - Fisk som er gitt fôr inneholdende C. divergens
Gildberg & Mikkelsen, 1998, Aquaculture 167
GP21 & GP12 isolert fra
tarm til Atlantisk torsk
Stimulering av epitelceller
Cellulær
Aderhanse
Antagonisme
& koloni
overlevelse
Humoral
Transkriptsjonelle
responser
Karakterer undersøkt
GP21
GP12
Sterk
Svak
Svak
Moderat
Antagonistisk mellom GP21 & GP12
Nei
Nei
Produksjon av syre
Nei
Nei
Produksjon av sideroforer (enheter)
33%
15%
Resistent mot syre (pH 3)
Ja
Ja
Resistent mot galle (5%)
Ja
Ja
Ufarlig for vert
Ja
Ja
Antagonistisk mot patogener*
Bakteriesuspensjon
Vibrio anguillarum
Aeromonas salmonicida
* Inhiberingssone : Sterk, > 6 mm; Moderat, 3-6 mm; Svak, < 3mm.
Control
GP21
2
1,6
b
GP12
b
1,6
b
1,2
b
b
0,8
0,8
0,4
HI
2
b
1,2
Live
a
0,4
a
a
c
a
a
0
0
3hpi
24hpi
3hpi
24hpi
Relativ ekspresjonsprofiler (gjennomsnitt+SD) av bakterielle forsvarsgener (BPI/LBP) i hodenyre
leukocytter co-inkubert med levende og varem-innaktiverte tarmbakterier. (n = 7)
Lazado et al. 2010, Comp Biochem Physiol 155
Percentage adhesion (%)
15
Ant.intestine
Midintestine
Post.intestine
Rectum
12
c
b
a
9
6
3
a
d
a
b
b
0
GP21
GP12
N = 3 forsøk i triplikat
Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148
Neglesjerbar adhering
i for-tarm (~0.2%)
Adhering til gjennværende
segmenter er nesten den samme
(6.8-7.2%)
N = 3 førsøk i triplikater
Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148
Med tilstedeværelse av GP21
Forbedret adhering til fortarm (økning til 5.5%)
Interferanse av adhering gjennom KONKURRANSE
N = 3 førsøk i triplikater
Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148
Med tilstedeværelse av GP12
Forbedret adhering til fortarm (økning til 8.5%)
Interferanse av adhering gjennom EKSKLUDERING
N = 3 førsøk i triplikater
Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148
Sannsynlig høyere enn
A. salmonicida (~2.0%)
Høyest adhering til
midt-tarm (~13.0%)
N = 3 trials in triplicates
Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148
Med tilstedeværelse av GP21
IKKE noe definitiv mønster med bakteriell interferanse!
N = 3 trials in triplicates
Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148
Med tilstedeværelse av GP12
Interferase av adhering gjennom KONKURRANSE (AI, MI
og PI) og FORSKYVNING (PI og RC)
N = 3 trials in triplicates
Lazado et al. 2011, Vet Microbiol, 148
Probiotisk
GP21
GENER
F
BPI
↓
H
GP12
R
F
H
↑
↑
↑
↑
↑
↓
↓
↓
↓
↑
Hepcidin
Lysozyme
↓
Galectin
↓
↓
Metallothionein
↓
↓
↓
↓
↑
↑
↑
↑
IL-1β
IL-10
↓
R
↓
↑
↑
Opp- eller nedregulering sammenlignet med kontrollgruppen, P<0.05
↓
• Fôring med probiotika med opphav i verten
forbedrer evnen fisken har til å inhibere
patogener etter 20 dager
• Transkriptom responser var mer prominente i
for-tarmen; men andre regioner ble også
funnet å bli stimulert ved opptak av probiotika
i fôr
Tarm
mikrobiota
Homeostase
Tarm epitelium
Tarm immunsystem
Fiskelarver
Immunsystem ikke
fullt ut kompetent
Biotisk/abiotisk
faktorer
SYKDOM
Biotisk/abiotisk
faktorer
Fysiologisk status
Juvenile/
Voksne
Bærekraftige alternativer
Vaksinasjon?
Priming av immunsystem – innate/ikke-spesifikke forbindelser
MAKRO & MIKRONÆRINGSTOFF
Aminosyrer, Fettsyrer,
Polysakkarider, Mineraler,
Vitaminer
BIOLOGISKE TILEGG
Bakteriell/Sopp derivater
Dyr & plante derivater
Effektive immunresponser
Sykdomsmotstand
Vert får bedre
motstandskraft
mot sykdom
Utløser forsvarsmekanismer/veier
Aktiverer celler
overflate reseptorer
Immun‘stimulant’
Naturlig forekommende
forbindelser
Concept from Bricknell & Dalmo, 2005, Fish Shellfish Immunol 19
In vitro assays på leukocytter: fagocytose, produksjon av frie radikaler,
migrasjon, cytokin produksjon, enzym aktivitet, produksjon av nitric
oksid, evne til å drepe bakterier, cytotoxisitet, cell proliferasjon
In vivo evaluering: Antistoff produksjon–vaksinasjon, overlevelse i
smitteforsøk (bakterier/virus), anti-parasitisk effekt, vekstfremming
Magnadottir et al.
Asa-LPS: A. salmonicida ssp. LPS
Ec-LPS: Escherichia coli
Lichenan: Et linjært (1–3), (1–4) β-glucan fra Cetraria islandica
Thamnolan: Et komplekst heteroglycan fra Thamnolia vermicularis
var. subuliformis
Chitosan: Crustacean polysakkarider
DNA: Fra gjær, Saccharomyces cerevisiae
Polymannuronic syre: Fra brunalgen Durvillea antarctica
Laminarin: Fra algen Laminaria digitata
Levamisol: En syntetisk stimulant
Vitamin C: Askorbinsyre
Oil: Fra torskelever
Magnadottir et al. 2006, J Fish Dis 29
Dødelighet (%) ved 5.5°C
90
Control
Dødelighet (%) ved 10°C
90
Asa-LPS
75
75
60
60
45
45
21dph
51dph
Smitte med Asa (2x105 cfu/mL)
Control (5.3g) Ass-LPS (6.2g)
Asa-LPS behandling – foredret motstand mot sykdom
Magnadottir et al. 2006, J Fish Dis 29
Overlevelse (%) ved 27 dph
Overlevelse (%) ved dag 18-30
50
50
40
40
30
20
10
30
*
20
*
10
0
0
Control
Diatom
glucan
Yeast glucan
Control
Skjermo et al. 2006, Aquaculture 261
Diatom
glucan
H M Alginate
Dybdeforståelse av substansene som stimulerer
Kunnskap om reseptorer i vertens celler som kan gjennkjenne og
respondere på disse substansene
Kartlegge responsene i humorale markører som er lette å måle
Dokumenterte effekter  praktisk bruk i oppdrett
Functional feeds?
TAKK TIL
FORSKNINGSRÅDET
(Prosjektene: Preventive Health Care of Farmed
Fish; Mucosal Immune System of Atlantic Cod –
Creating a Knowledge Base)
•H A V F O R S K N I N G S I N S T I T U T T E T
(Øivind Bergh, Hari Rudra, Rolf Hetlelid Olsen,
Ann Cathrine Einen)
•A n u s h a D h a n a s i r i
•C a r l o L a z a d o
•C h r i s t o p h e r C a i p a n g
•K j e t i l K o r s n e s
•H i l d e R i b e
•I n g v i l d B e r g
•M o n i c a B r i n c h m a n n