DNA-labb / Plasmidlabb
2012-04-27 Översikt DNA-labb / Plasmidlabb • Varför är vi här idag? Preparation och analys av plasmid-DNA från Escherichia coli • Vad skall vi göra idag? – Kort introduktion till biokemi och rekombinant DNA- teknologi – Genomgång av protokollet • Hur skall vi lära oss något? – Genomgång av hur resultaten analyseras. / Biokemi och biofysik • Vi försöker få molekylär förståelse för biologiska system. – Ex: DNA/RNA, proteiner, små molekyler (ATP). • En viktig del är proteiners funktion och struktur. Varför? • Både akademi och industri. – Grundforskning; fundamentala frågor. – Koppling till fysiologiska tillstånd. – Läkemedel. Vanlig bakterie för produktion av proteiner: Escherichia coli Bakterier – vad har de med oss att göra? • Ger oss sjukdomar, men vi klarar oss inte utan dem. • Senaste decennierna: Bakterier är i vår tjänst som proteinfabriker. • Plasmid-DNA – Kan modifieras av oss och tas upp av bakterien. – Möjligt att göra förändringar i proteinet, byta ut aminosyror. – Produktion av det protein som plasmidgenen kodar för. Några bilder av E. coli Medsols, från ö.v: Odling på platta; elektronmikroskopi (EM); genom; EM, tillsammans med Bacillus megaterium. • Finns naturligt i mag/tarmkanalen • Vissa varianter kan orsaka diarre & urinvägsinfektion • Enkel att jobba med, växer snabbt • Enkel att modifera genetiskt, plasmider • Uttrycker stora mängder protein 1 2012-04-27 Från DNA till protein Transkription: En gen i DNA-molekylen skrivs om till RNA. Translation: I ribosomen byggs ett protein upp efter RNA-ritningen. Vad är plasmider? Vad ska vi göra idag? • Isolera och analysera plasmid-DNA från E. coli genom att: – Extrahera plasmid-DNA från E.coli celler – Klyva plasmiden med restriktionsenzymer – Analysera de kluvna fragmenten med agarosgelelektrofores Hur uttrycker man ett främmande protein i en bakterie? • plasmider är en sorts DNA-molekyler som är separata från bakteriens egen kromosom •Klona/kopiera genen • cirkulära och icke-essentiella (inte nödvändiga för bakteriens överlevnad) •Klyv plasmiden •PCR (Polymerase Chain Reaction). • små -några tusen baspar långa -fåtal gener •Restriktionsenzymer (så att genen kan sättas in i plasmiden). •Ligera (klistra ihop) ihop fragmenten •Enzymet Ligas • när vi använder dem innehåller plasmiden (oftast): •Sätt in plasmiden med genen i en bakterie •Analysera -gen som kodar för det protein vi vill ha -gen/gener som kodar för antibiotikaresistens •Rätt plasmid med rätt gen i bakterien? •men plasmider finns också naturligt i bakterier Först: Innehåller alla bakterier i odlingen en plasmid? Ja! Bakterien växer i närvaro av antibiotikan ampicillin, och i plasmiden finns en gen som kodar för antibiotikaresistens. •Alltså: Bara de bakterier som har en plasmid överlever... Vi måste isolera plasmiden och analysera den. Restriktionsenzymer • Känner igen och klyver DNA • specifika symmetriska sekvenser • Finns i bakterier •försvar mot främmande DNA (virus). • Ger upphov till, a) blunt ends (ex AluI) b) sticky ends (ex BamHI) ...men sitter genen vi vill titta på i plasmiden? 2 2012-04-27 Agarosgelelektrofores Hur ska vi kunna se vårt DNA? Traditionellt: etidiumbromid • Agaros Major groove – Socker från alger som bildar polymer så att gelen stelnar Ladda proverna i varsin brunn. DNA har en nettoladdning på minus. Lägg på elektrisk spänning. DNA:t kommer att vandra mot pluspolen. Efter ca 45 minuter har DNA-fragmenten rört sig lagom långt genom gelen. Etidiumbromid •binder till DNA •fluorescerar i UV-ljus •starkare när det är bundet till DNA MEN: Etidiumbromid är mycket mutagent och binder till allt DNA! Dessutom: Kan ta sig igenom cellmembran. Därför använder vi GelRed, en molekyl (hemlig struktur) med liknande fluorescensegenskaper, men passerar inte cellmembran. Vi blandar GelRed direkt i agarosgelen. / Hur ska vi kunna analysera vårt DNA? Referens – DNA-stege DNA-fragment med kända storlekar •körs bredvid prov Labben •se ungefärlig storlek av vårt DNA DNA-storlek anges i baspar (bp) eller i kilobaspar (Kb) B Storleks Referens Utförande Vandringssträcka (mm) - A + ”Plasmidprepp” dvs isolering av plasmid P1 1 2 Skaka • Buffert • Tillsätts i ett eppendorf rör med E. coli • RNAser – RNA bryts ner 3 Centrifugera Sup Pellet 4 Pellet av bakterier som innehåller plasmiden / 3 2012-04-27 P2 • Lyseringsbuffert N3 • Ättiksyra – NaOH, Natriumhydroxid • Basiskt – Neutraliserar pH • Salt – Sodium Dodecyl Sulfat • Löser upp membranet • Tillsätt P2 i eppendorfröret som innehåller E. Coli och P1. Blanda! – Fäller ut proteiner, genomiskt (E. colis eget) DNA och det nedbrutna RNAt från P1 • Tillsätt N3 i eppendorfröret som innehåller E. Coli, P1 och P2. Blanda! / / Separera plasmiden Centrifugera • Balansera rören • Flera grupper kör tillsammans • Spara supernatant (Sup) = lösningen ovanpå – DÄR FINNS PLASMIDEN! • Pellet = det fasta i botten (Vit) – Fällda proteiner – Genomiskt DNA – Nedbrutet RNA / / Tvätta kolonnens filter Eluera plasmiden • Centrifugera kolonnen – Plasmiden fastnar i filtret i kolonnen – Släng vätskan som gått igenom • Buffert PB – Tvättar bort proteiner – Centrifugera – Släng vätskan som gått igenom • Vatten (för eluering) – – – – Byt kolonnens uppsamlings rör till ett nytt eppendorf rör med lock Tillsätt vatten och låt stå/inkubera 1 min Centrifugera Plasmiden finns nu i eppendorfröret, löst i vatten. SPARA DENNA LÖSNING! • 4 mikroliter (ml) eluerad plasmid förs över till restriktionsenzym-mixer A, B och C • Buffert PE – Centrifugera – Tvättar bort salt – Centrifugera – Släng vätskan som gått igenom • Inkubera 5 minuter i vattenbad – Klyvning av plasmiden / / 4 2012-04-27 BglII Klyvning av plasmid-DNA Restriktionsenzym-mix A, BglII: gen gen plasmid BglII Klyvning av plasmid-DNA gen plasmid plasmid 5´GAATTC3´ 3´CTTAAG5´ gen BglII EcoRI plasmid gen EcoRI 5´AGATCT3´ 3´TCTAGA5´ Restriktionsenzym-mix C, BglII och EcoRI: gen 5´GAATTC3´ 3´CTTAAG5´ Restriktionsenzym-mix B, EcoRI: BglII plasmid EcoRI Klyvning av plasmid-DNA 5´AGATCT3´ 3´TCTAGA5´ gen EcoRI plasmid Tillsätt provpåsättningsbuffert Analysera med gelelektrofores. Separerar DNA fragment med avseende på storlek. plasmid gen EcoRI gen EcoRI plasmid plasmid Analys med agarosgelelektrofores • Fluorescerande band i UV ljus är GelRed bundet till DNA • Foto av gelen • Stege med kända storlekar av DNA • Jämför era band med stegens band. A B DNADNA- stegeC stege mall / 5
© Copyright 2024