1. No category

Laborationer i mikrobiologi för sjuksköterskestuderande (A Blücher, B-I Marklund)
MIKROORGANISMER I OMGIVNINGEN
Laborationstillfälle 1.
MATERIAL:
NA-platta stor (Ø 14 cm) – en per grupp
NA-platta mindre (Ø 9 cm) – en per person
Kontaktplattor 2 st
UTFÖRANDE:
1. Placera den stora NA-plattan med locket öppet under 1 timma på någon plats
där ni vill studera nedfall av mikroorganismer. Olika grupper placerar på olika
ställen.
En grupp gör i stället på följande sätt. Tag 2 stora nedfallsplattor och placera
dem med öppet lock på golvet på toaletten. Tag av och på alla kläder. Lägg
locket på den ena plattan efter 5 minuter. Lämna den andra kvar med öppet
lock under 1 timma. Under tiden skall ingen besöka toaletten ( sätt upp
försegling på dörren).
Efter anvisad tid läggs locket på plattorna som därefter placeras i inkubator
30ºC till nästa laborationstillfälle (1-2 dygn).
2. Varje student delar in den mindre NA-plattan i 4 sektorer. Markera på
baksidan med en vattenfast penna.
• Gör ett avtryck med otvättad tumme i sektor 1. (lägg tummen löst på
men med så stor yta som möjligt)
• Tvätta därefter händerna med tvål och vatten. Torka med
pappershandduk och gör ett nytt avtryck – med samma tumme - i
sektor 2.
• Använd ett handdesinfektionsmedel och låt händerna lufttorka.. Gör ett
nytt tumavtryck i sektor 3.
• Återkontaminera händerna genom att ”ta” i eller på något, rätta till
håret eller klia dig på kinden. Gör ett nytt tumavtryck i sektor 4.
Inkubera plattorna i 37ºC till nästa laborationstillfälle (1-2 dygn).
3. Tryck kontaktplattan mot en yta som skall undersökas. Tryck inte för hårt men
se till att hela plattan kommer i kontakt med ytan. Inkubera 30ºC till nästa
laborationstillfälle (1-2 dygn).
OBS! Märk alla plattor ordentligt. För att undvika kondens inkuberas alla plattor
med locket neråt.
FÖRSÖK MED YTDESINFEKTIONSMEDEL
MATERIAL:
Övernattenkultur av Escherichia coli i NB (näringsbuljong) som har spätts 105
gånger. Detta är det bakteriematerial som används för försöket.
NA-plattor 8 st/grupp
Lösningar av desinfektionsmedel (4,5 ml i rör)
•
•
•
•
•
•
•
•
Jodopaxlösning spädd till 0,4%
Jodopaxlösning spädd till 1%,
Ytdesinfektion, bruksfärdig lösning
70% etanol
Virkon, bruksfärdig lösning
Klorhexidinlösning
Handdesinfektionslösning
sterilt kranvatten (= 0 prov)
Pipetter, sterila, 0,5 och 0,1 ml.
Etanol, 95% för flambering
Kärl för uppsamling av kontaminerat gods.
UTFÖRANDE:
Tillsätt 0,5 ml bakteriesuspension till vardera av rören med
desinfektionsmedel och röret med vatten. Blanda genom att snurra röret
mellan händerna. Låt medlen verka 20 sekunder. Tag därefter 0,1 ml från varje
rör till vars en NA-platta. Rackla ut med flamberad rackla (svalna racklan
genom att föra den över agarn VID SIDAN AV droppen med
bakteiesuspension)
Låt vätskan torka in och inkubera i 37ºC över natt.
Laborationstillfälle 2
Avläsning:
MIKROORGANISMER I OMGIVNINGEN
Räkna antalet mikroorganismer på nedfallsplattorna. Jämför och diskutera med andra
grupper utifrån var plattorna stått. Studera koloniernas utseende – hur många olika
kan ni se.
Studera resultatet av handtvätten (räkna inte kolonier utan bedöm antal). Diskutera
och kommentera resultaten. Vilken metod för handtvätt verkar effektivast?
FÖRSÖK MED YTDESINFEKTIONSMEDEL
Räkna antalet bakteriekolonier (CFU) på samtliga plattor. Jämför med kontrollplattan
och diskutera resultaten. Vilka medel och vilka koncentrationer verkar effektivast
avdödande på bakterien E.coli?
DEMONSTRATIONSFÖRSÖK
Patogenicitetsfaktorer
Bakterien Streptococcus pyogenes respektive Enterococcus faecium har odlats på en
blodagarplatta, dvs ett näringsmedium som innehåller helblod (dvs. blod med hela
celler) från häst (eller får). Vissa bakterier bildar enzymet hemolysin som får röda
blodceller (och andra eukaryota celler) att lysera (gå sönder).
Har någon av de aktuella bakterierna bildat hemolysin?
Vissa bakteriestammar kan även producera enzymet koagulas som medverkar i
blodets koagulering (fibrinogen → fibrin). För att påvisa detta har bakterier av arterna
Staphylococcus aureus och Staphylococcus epidermis satts till små rör med
kaninplasma som inkuberats i 37°C värmeinkubator.
Har någon av de aktuella bakterierna bildat koagulas?
Antibiotikaresistens
För att undersöka om en viss bakterie är känslig eller resistent mot antibiotika görs en
s.k. antibiotikaresistensbestämning. En suspension av den aktuella bakterien sprids på
en platta. Suspensionen får torka in och därefter läggs lappar impregnerade med
antibiotika på plattan. Antibiotika diffunderar då ut i plattan och ger en
koncentrationsgradient från lappen. Plattan inkuberas och diametern på eventuella
inhiberingszoner där ingen bakterieväxt skett kan avläsas och jämföras mot
definierade gränsvärden.
Vilka antibiotika verkar den aktuella bakterien vara känslig respektive resistent
mot?
Bakterieceller i mikroskop
Ett gramfärgat preparat av en blandkultur av Staphylococcus aureus och Escherichia
coli demonstreras.
Försök att identifiera bakteriearterna beträffande cellmorfologi, lagringsform
(om de bildar par, kedjor, druvklasar etc) och se vilken som är grampositiv
respektive gramnegativ.
Diskutera användbarheten av mikroskopstudier i klinisk diagnostik.
RESULTATRAPPORT – LABORATION I MIKROBIOLOGI
Laboranter: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ och _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
Mikroorganismer i omgivningen
Provtagningsplats
?
Växt på
plattan?
Ungefär hur många olika typer av
kolonier kan ses på plattan?
”Luftprov”
”Ytprov”
Kommentarer till resultatet:
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
Handtvätt/desinfektion
Student Växt på Växt på
Växt på
Hur gjordes
Växt på platta
platta
platta
platta
kontaminering?
efter
otvättad tvättad desinficerad
kontaminering?
tumme? tumme?
tumme?
Kommentarer till resultatet:
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
Försök med desinfektionsmedel
Desinfektionsmedel
Jodopax 0,4%
Växt på plattan?
Eventuell kommentar
Jodopax 1%
Ytdesinfektionsmedel
70 % etanol
Virkon, brukslösning
Klorhexidin, brukslösning
Handdesinfektionsmedel
Sterilt kranvatten
Sammanfattande kommentar:
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
__________________________________________________
DEMONSTRATIONSFÖRSÖK
Art
Hemolysinproduktion
Enterococcus
faecium
Streptococcus
pyogenes
Art
Koagulasproduktion
Staphylococcus aureus
Staphylococcus
epidermis
Hur detekteras hemolysinproduktion? _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
__________________________________________________
__________________________________________________
Hur detekteras koagulasproduktion? _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
__________________________________________________
__________________________________________________
Vilken nytta kan den infekterande bakterien ha av att producera:
hemolysin: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
__________________________________________________
koagulas: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
__________________________________________________
Antibiotikaresistens
Mät diametern på inhiberingszonerna med linjal!
Isolat av:
Zondiameter (mm)
Penicillin G
Zondiameter (mm)
Fusidinsyra
Zondiameter (mm)
Klindamycin
Staphylococcus aureus
OBS! För att kunna bestämma bakteriens känslighet måste inhiberingszonens diameter mätas, och jämföras med
referensvärden på www.srga.org , innan antibiotika väljs för behandling måste dessutom en mängd ytterligare
aspekter beaktas.
Referensvärdet för Fusidinsyra-Staphylococcus är: zondiameter ≥24mm = känsligt isolat,
zondiameter <24mm = resistent isolat.
Motsvarande värden för Klindamycin är 22 respektive 19 mm.
Är Staphylococcus aureus-isolatet känsligt för eller resistent mot Fusidinsyra? _ _ _ _ _ _ _ _
Är Staphylococcus aureus-isolatet känsligt för eller resistent mot Klindamycin? _ _ _ _ _ _ _
Referensvärde för Penicillin G saknas, ca 80% av alla Staphylococcus aureus producerar penicillinas (betalaktamas, penicillin G faller därmed bort som behandlingsalternativ). Vissa isolat har dessutom förändrats så att de
blivit resistenta mot i princip alla beta-laktamantibiotika, däribland meticillin, de kallas meticillin-resistenta
Staphylococcus aureus (förkortas ofta MRSA), behandlingsalternativen blir då betydligt färre.
Bakterieceller i mikroskop
De två arterna Staphylococcus aureus och Escherichia coli skiljer sig åt vad gäller
cellmorfologi, lagringsform och cellväggsuppbyggnad. Kommentera deras egenskaper i
tabellen nedan.
Art
cellmorfologi?
ev.aggregat eller
lagringsform?
Gram-positiv
eller Gram-negativ?
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Ungefär hur stora är bakterierna du tittat på i mikroskopet?
__________________________________________________