1. No category

Hengitystieinfektioita aiheuttavien
virusten diagnostiikasta
Hanna Tuokko
OYS mikrobiologian laboratorio
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
1
Mitä ovat hengitystieinfektiovirukset?
Jartti et al. , 2008
v. 1918 H1N1 Espanjan tauti ja v. 2009-10 vH1N1 Sikainfluenssa
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
2
Hengitystieinfektioepidemiat osittain
päällekkäin, esimerkkejä (THL-tartuntatautirekisteri)
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
Lisäksi uudet hengitystievirukset
ja rinot
3
Lisää…
Finnish
Otitis
Media
rokotetutkimus,
jossa
seurattiin
lapsia 2kk
iästä 2vuotiaaksi
saakka.
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
4
Miksi niitä diagnosoidaan?
• Erotusdiagnoosi bakteeri- vai virustauti, turhien
bakteeriantibioottien välttäminen ja virustaudin
hoitomahdollisuudet.
• Potilaan sijoitus osastoilla, mahdollisen
sairaalainfektion välttäminen.
• Potilaan vakava tauti. Yksittäisen potilaan
taudin aiheuttajan selvitys (esim.
immunosuppressiopotilaat).
• Epäily epidemian alusta: Väestön suojaus ja
varotoimenpiteet ( SARS, lintuinfluenssa, sikainfluenssa). Hoitomahdollisuudet.
• Epäily uudesta viruksesta, kuten edellä.
• Ennaltaehkäisy.PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
5
Hengitystievirusdiagnostiikkaa
YLEISTÄ: Potilaan oireet ( ePIDEMIAT!Anamneesi!)
• Laboratoriodiagnostiikka, jossa potilasnäytteestä osoitetaan:
• Kokonainen
virus (eletronimikroskopia=EM)
• Elävä virus ( virusviljelyn solumuutokset,
spesifisen antigeenin osoitus)
• Viruksen osia (antigeeneja l. virusproteiineja)
• Virukselle spesifisiä nukleiinihappojaksoja
• (Virukselle spesifisiä vasta-aineita l.
serologista vastetta)
6
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
6
Virus
Tulokset riippuen näytteestä
totaali Imuli- Sivelynäyte
ma
nenästä
RSV
72
70 (17)* 55 (2)*
Rino
15
12
12
InflA/B
12
12
11
Parainfl 9
8
8
Adeno
8
7
7
Entero
7
5
6
HSV
1
1
1
Yht:
124
115(24) 100 (5)*
löytynyt vain toisesta
*
Heikkinen et al., JCM 40,2002
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät
140215
7
SITTEN menetelmistä:
1) Elektromikroskopia
InfA,SARS
METAPneumo
Epäily uudesta viruksesta,
viruspartikkelin muoto ja koko, virusryhmä selville
” nopeaa virusdiagnostiikkaa”
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
8
NÄYTESäilytys:
-jääkaappi
-pitkäaikainen
-säilytys –40C–70C
- ei –20 C
Virusnäytteet ylähengitystieinfektioissa
Imulimanäyte------------nenänielu
virus(viljely)ras Huuhtelunäyte------------nenäontelo
kuljetusputki
Sivelynäyte-------nenäontelo, sieraimet
(Nylon) nukkatikku!
9
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
aluekoulutus/HTuokko9
Elektronimikroskooppikuva
lintuinfluenssa soluviljelmästä
2) VIRUSviljelmät :
Rino
RSV
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
10
3)VIRUSANTIGEENITESTIT :
1-8 hengitystievirukselle
•Tietyn viruksen esim. RSV:n
osoitus eritteistä EIA:lla
(enzymeimmunoassay)
• Immunofluoresenssimääritys
(FA) Ad, RSV, InflA, B,
Parainfl.1,2, 3, metapneumovirus
Paras näyte!
RSV, InflA,
InflB,
metapn
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
humaani ripuliviruksista/HTuokko
11
3) NordLabin alueella käytettyjä RSV-, Adeno- ja
influenssa A- ja B-pikatestejä
Pikatesti
t=tikku
K=kasetti
Mitä
Antigeeni (Ag) / Vasta- aine (Ab)/
Missä tehdään
Lx-pallot
(LP) /k ultakol (KK)
CerTest
BinaxNOW
QuickVue
Directigen EZ
RSV-Adeno
RSV
RSV
RSV
Ag/Kemi (RSV; h. >99% sp. > 99%)
Ag/ Kokkola (h. 89-93%, sp. 100-93%)
Ag/ Oys lasten taut.pkl (h. 99%, sp.92%
Kajaani (h. 66,7-92,1%, sp. 79-98.2%)
LPk
LPk
LPt
LPk
Actim Infl A&B *
Infl A &B
LPt
Tru Flu*
Infl A &B
Directigen Flu A+B*
Infl A &B
Ag/Oulu, Rovaniemi, Kemi, Ylitornio,
Tornio (h. 81- 93%, sp. 95-99%)
Ag/Kokkola (A; h.85-87,2%, sp. 89,399,4%
B; h. 50-63,6% , sp. 93-100%)
Ag/Kajaani((A; h.76,7-95,7%, sp. 89,7100% B; h. 70,6-87,5% , sp. 89,7-100%)
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
KKt
LPk
• * tilalle
• XpertFlutestillä
12
4) Virusnukleotidiosoitusmenetelmät
• Spesifinen nukleiinihappojakso hybridisaatiolla tai
ko. jakso monistamalla (esim. PCR) potilasnäytteestä
yhdelle virukselle.
Monistusmenetelmiä ja laitteistoja kehitetty , mikä
mahdollistaa usean eri PCR:n teon samanaikaisesti (multiplexPCR).
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
13
5)Syitä uusiin monistustesteihin
•
•
•
•
Usea mikrobi aiheuttaa samankaltaisen taudinkuvan.
Epidemiat päällekkäin.
Näytemäärä ei riitä useaan yksittäiseen testiin.
Standardoitu testipaneli uusille hengitystieviruksille
(metapneumo-, boca-viruksille) sekä entero- ja
rinoviruksille.
• Ajan, kustannusten ja työn säästö.
• Automaattilaitteistot: lyhyt ”hands-on”-aika,
kontaminaatiomahdollisuuksien minimointi.
• Sekavirusinfektioiden osoitus.
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
14
MULTIPLEX- MAHDOLLISUUDET
1
GeneXpert System : InfA, B ja vH1N1
• Hands-on-time
muutamia
minuutteja
• Tulos n. 75 min
kuluttua
• Real-time-PCRkäyrät
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
15
testikasetista
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
16
Esimerkkejä PCR-automaateista:
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
17
2
Sulamislämpötilakäyrät ja RT –PCR : 16
virusta (Seegene RV16)
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
18
Seegene Multiplex
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
19
OMIA
tuloksia:
Testi käytössä 1 v 4,5 kk:
V. 2013 näytteitä 2743 kpl
VIRUS
löydöksiä kpl
VIRUS
löydöksiä kpl
Infl A
Infl B
263
52
116
75
Parainfl 1
Parainfl 2
54
6
Parainfl 3
Parainfl 4
RSV
68
35
203
Adeno
Metapneumo
Rhino
Korona
Boca
Entero
Positiivisia
52,6 %
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
413
69
33
55
20
1 virus
2 virusta
3 virusta
4 virusta
384
56
10
1
Infl A
161
A (vH1N1)
30
Rhino
6
Rhino
1
(103) Korona
19
Korona
5
Adeno
1
Infl B
2
Adeno
18
Adeno
5
Parainfl1
1
Metap.
3
Parainfl1-4
12
Parainfl1-4
2
Boca
1
Boca
0
Infl A
11
Infl A
2
Korona
27
RSVa
7
RSVa
5
RSVa
40
RSVb
4
RSVb
1
RSVb
19
Boca
9
Boca
2
Entero
7
Entero
2
Metap.
2
Adeno
17
Parainfl 1-4
45
Rhino
63
Rhino
Viruslöydökset v. 2014 viikot 1-10:
- Näytteitä 971 kpl
- Positiivisia näytteitä 451 kpl ( 46,4%)
- Viruslöydöksiä 530 kpl
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
21
InflA/ 1-10 viikossa v. 2014
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
<1
vuosi
1--5
6--10 11--15 16--20 21--25 26--30 31--35 36--40 41--45 46--50 51--55 56--60 61--65 66--70 71--75 76--80 81--85 86--90
RHINO/1-10viikossa v. 2014
25
20
15
22
10
5
81--85
76--80
71--75
66--70
61--65
56--60
51--55
46--50
41--45
36--40
31--35
26--30
21--25
16--20
11--15
6--10
1--5
<1 vuosi
0
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
2 hengitystievirusta / näyte
35
20
Rhinovirus +
muu
hengitystievirus
18
16
30
14
25
12
10
20
8
15
6
4
10
2
5
IKÄ
<1 vuosi
1--5
6--10
11--15
16--20
21--25
26--30
31--35
36--40
41--45
46--50
51--55
56--60
61--65
66--70
71--75
76--80
81--85
86--90
0
8
Rhinovirus+
Adeno- tai
Bocavirus
7
6
5
IKÄ
<1 vuosi
1--5
6--10
11--15
16--20
21--25
26--30
31--35
36--40
41--45
46--50
51--55
56--60
61--65
66--70
71--75
76--80
81--85
0
6
3- tai 4
hengitystievirusta/näyte
5
4
3
4
2
3
2
1
1
0
IKÄ
0
IKÄ
<1 vuosi
1--2,5
<1 vuosi 1--5
2,6-5PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
6--10
11--15 16--20 21--25
23
Jos käytössä 8
hengitystieviruksen testi,
tulos VAIN 298:lle
(451-153) näytteelle.
kpl
virus/näyte
Korona
27
Rhino
63
Parainf 4
5
Entero
7
Yht.
102
2 virusta/
näyte
42
3-4 virusta /
näyte
YHT:
9
 Yhteenveto:
 Tulos työpäivän aikana
 Herkkyys parempi kuin FAtestin.
 Korona-,rhino-, parainfl4-,
entero-, ja bocavirusinfektiot
esille
 Kaksois/ sekavirusinfektiota
saatiin esille (75%), usein rinotai koronavirus mukana.
 Muuta:
 Asiakkaat tyytyväisiä
153
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
24
Tuloksia v. 2015
Xpert Flu
151214090215
KPL
InflA +
195
vH1N1
4
Infl B +
13
RV16
01310115
VIRUS
KPL
VIRUS
KPL
Metapneumo
25
Ade-no
12
Boca
15
Para-inf 1
0
Korona
22E
0
2
1
yht:
208
Kor NL63
16
Näytemäärä
1031
Kor O43
36
4
0
Löydös%
20,2%
RSVa
3
Inf A
15
Validaatio
Herkkyys
Tarkkuus
RSVb
2
Inf B
8
Infl B
90,9%
100%
Entero
0
Rino
39
Infl A
87,5%
100%
Yht:
384 näytteestä
Löydös%
46,6%
H1N1
100%
100%
179
viruslöydöstä
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
3
7
25
Testin luotettavuuden takeet l. testi on
hyödyllinen vain jos tulosta ei tarvitse laboratoriossa
toisella menetelmällä tarkistaa.
• Tekijän ammattitaito; tekijäksi suos. harjaantunut
laboratoriohoitaja/ bioanalyytikko.
• ”Se vastaa, kuka vastaa”
• Testin herkkyys ja spesifisyys; laadukas testi
• Testi validoitu niihin olosuhteisiin, jossa aiotaan käyttää.
• Laadunvarmistus
• Ohjeistus
• Koulutus
• Näytemäärä tarpeeksi iso, että tuntuma säilyy
• Tulosten dokumentointi ja tartuntatauti-ilmoitukset
• PCR-testin antaman löydöksen merkitys käytännössä
• Testit kalliita
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
26
Yhteenveto
•Viruslöydöksiä>>, herkkyydet paremmat
kuin FA+ virusviljelyn, kirjallisuuden
mukaan yksittäisiin PCR-testeihin 94-98%.
• Tulos nopeammin kuin virusviljelyssä.
•Kaksois/ sekavirusinfektiota saatiin esille
(15-30%), usein entero-, rino- tai
koronavirus mukana.
•Oireisten näytteistä osoitettiin > viruksia
kuin muilla menetelmillä, spesifisyys 98%.
Rino- , entero-ja bocavirusinfektiot esille.
•Pienet näytemäärät käyttökelpoisia.
Mutta, ovatko nyt osoitetut virukset oireiden
takana? (---- serologia)
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
27
Kim SK et al., 2008
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
28
Kim SK et al., 2008
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
29
Wong et al., 2009: 244 näytettä
LUMINEX-testissä (RVP), aikaisemmin
testattu FA:lla ja yksittäisillä PCR-testeillä
( InflA ja B, RSV A ja B,Parainf 1-4,
Metapneumo ja Adeno)
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
30
Referenssejä:
-
-
-
-
Comparison of Anyplex II RV16 with the xTAG
Respiratory Viral Panel and Seeplex RV15 for
Detection of Respiratory Viruses. Hyun-Ki KIM
et al., JCM 2013
Viral Infection is Not Uncommon in Adult
Patients with Severe Hospital-Acquired
Pneumonia. Hyo-Lim Hong et al., PlosONE
2014
Comparative Evaluation of Six Commercialized
Multiplex PCR Kits for the Diagnosis of
Respiratory Infections . Pillet S et al.,
PLoSONE 2013
The role of infections and coinfections with
newly
identified and emerging respiratory viruses in
Children. Debiaggi M et al., 2012
• KIITOKSET!
PohjoisSuomenBioanalyytikkopäivät140215
31