Mikrobiologian uusia tuulia
Sairaalamikrobiologi Maija Korkeila/Eksote
Bioanalyytikot 19.2.2015
Mikrobiologia
•
•
•
•
Bakteerit
Virukset
Sienet (hiivat ja rihmasienet)
Parasiitit
Kliininen mikrobiologia
Robert Koch (1843-1910):
• Bakteerit aiheuttavat tauteja
• Bakteereja voidaan kasvattaa kehon ulkopuolella
• Nobel 1905
Bakteeridiagnostiikka
• Kulmakivi: viljely maljoille -> tunnistus, herkkyys
– Bakteerit kasvavat maljoilla tietyn näköisinä (ja hajuisina)
pesäkkeinä
– Selektiiviset maljat: vain osa bakteerilajeista tai - kannoista kasvaa
– Kromogeeniset maljat: bakteerit kasvavat tietyn värisinä, vain osa
kasvaa
– Tunnistusmaljat: esim. eskuliinimalja enterokokkeille
– Gram-värjäys: gram-positiiviset/gram-negatiiviset,
sauvat/kokit
– Biokemialliset testit:
• Pöytätestit: esim. katalaasi, oksidaasi, streptokokkien
ryhmitystestit
• Putkitestit, yleensä yön yli
• API-liuskat (1970-luku), yleensä yön yli
• VITEK : 6h – 18h
Mikä tässä on hyvän laboratoriokäytännön
vastaista?
API 20E
VITEK
Antigeenitestit
• Virukset: esim. influenssa, adenovirus, rotavirus, RS-virus,
noro
• Bakteerit: esim. pneumokokki, legionella
• Todetaan mikrobin osa (antigeeni) näytteestä vasta-aineen
avulla
• Ei tarvita eläviä mikrobeja
• Herkkyys jopa vain 50% (= 50 % vääriä negatiivisia)
• (Voi olla myös vääriä positiivisia), ristireaktiot
• Tulkinta joskus vaikeaa
Mutkia matkassa
Maanantai
Näyte otetaan klo 16
Tiistai
Näyte viljellään maljoille
Keskiviikko
Jatkot ( tunnistus 0h -> )
Mahdollisesti alustava vastaus
Torstai
Tunnistus ja herkkyys valmiina
Perjantai
Tunnistus ja herkkyys valmiina
Maanantai
Tunnistus ja herkkyys valmiina
Eikö ole mitään nopeampaa,
varmempaa?
• PCR ja muut geenimonistusmenetelmät
• Massaspektrometri
• Kokogenomisekvenointi
• Virtsaviljely: partikkelilaskenta seulontamenetelmänä
• Viljelyautomaatit
Virtsaviljely, partikkelilaskenta
• Virtaussytometria (esim. Sysmex UF-500 , UF-1000)
Bakteerimäärä, leukosyyttimäärä, ikä, sukupuoli
negatiiviset
positiiviset
viljely
Viljelyautomaatit
Uudet tuulet bakteerien tunnistuksessa
PCR
• polymerase chain reaction
• 1971 PCR:n kaltainen menetelmä (-> Nobel)
• 1980-luvun alku: PCR käytännön tasolle (-> Nobel)
• monistuksen kohteena haluttu geenipätkä
• nykyisin yleensä real-time-PCR
Real-time PCR
• Monistuksen kohde ( DNA- templaatti)
• Aluke (primer)
• Polymeraasientsyymi: monistaa kohde-DNA:n
• dNTP:t eli deoksinukleotidit : adeniini, tymiini, cytosiini, guaniini
• Fluoresoiva merkkiaine: monistettavan tuotteen määrää
seurataan reaaliaikaisesti
1.Denaturaatiovaihe
2. Alukkeiden liittymisvaihe (annealing)
3. Pidentymisvaihe (elongation)
Sisäiset kontrollit
Meillä GeneXpert
Meillä GeneXpert
•
•
•
•
•
•
Influenssa (A, H1N1, B)
Norovirus
Mycobacterium tuberculosis (+ rifampisiini-resistenssi)
Klamydia-tippuri
Clostridium difficile-toksiini
MRSA
- 1h- 1,5h
- hinta 30- 50euroa/testi
- laite: noin 10 000 e/testimoduuli
Massaspektrometri,
Maldi-tof
•
•
•
•
•
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight
Pesäkkeestä otetaan massaa ”kuoppalasille”
Tulos yhdessä minuutissa
Laite noin 150 000 e
Huolto noin 20 000e /v
– mm. reagenssisäästöt
• Noin 0,50 e/testi
Lisäkuvat liitteenä
Mutkia matkassa
Maanantai
Näyte otetaan klo 16
Tiistai
Näyte viljellään maljoille
Keskiviikko
Jatkot ( tunnistus 0h -> )
Mahdollisesti alustava vastaus
Torstai
Tunnistus ja herkkyys valmiina
Perjantai
Tunnistus ja herkkyys valmiina
Maanantai
Tunnistus ja herkkyys valmiina
Kokogenomisekvenointi
•
•
•
•
•
•
WGS, whole genome sequencing
90% genomin emäsjärjestyksestä määritetään
Nykyisin viljelmästä, tulevaisuudessa suoraan näytteestä!
Resistenssiomaisuudet (esim. MRSA)
Tyypitys -> epidemiaselvitykset
Esim. M.tuberculosis:
– Nykyisin lajimääritys + herkkyys kestää useita viikkoja
– WGS: pari päivää
• 100-200 euroa/tutkimus
• Tulee todennäköisesti korvaamaan ainakin osan nykymenetelmistä
Mikrobiologian laboratorio Eksotessa tulevaisuudessa?