Forskning
Af Anne Cathrine Schjøtt
Forskere vil revolutionere
udvikling og produktion
af lægemiddelproteiner
Danske forskere har fundet en
måde at styre proteinprotukion, så medicinalvirksomheder i
fremtiden vil være mere i kontrol
og dermed sikre at produktionen
altid er ensartet.
B
illigere, mere effektiv og mere målrettet medicin er det, forskerne lover med en ny opfindelse. Forskere
fra Københavns Universitet har i en peri-
ode arbejdet på at ændre proteiner med
påsat sukkermolekyler – også kendt som
glycoproteiner, som udgør en stor gruppe
af nye biologiske lægemidler.
Denne udvikling af biologiske lægemidler baserer sig på cellulær produktion, som gennem ændringer af cellerne
kan optimeres, så lægemidlet eksempelvis enten har en længere halveringstid eller bliver mere effektivt i behandlingen.
Mange af de nyeste biologiske lægemidler til eksempelvis kræft- og gigtpatienter er baseret på proteiner, hvor suk-
Ændringer i enkelte enzymer rammer forskellige steder
NeuAc (sialsyren)
kermolekyler bliver hæftet på. Sådanne
glycoproteiner er mere stabile end proteinet selv, men samtidig er de ønskede
sukkerstrukturer meget svære at lave
ensartede i de celler, som producerer
proteinerne. Men tilblivelsesprocessen
har KU-forskerne nu fået kontrol over.
Bliver mere human
Den typiske cellelinje til proteinproduktion stammer fra en kinesisk hamster, hvilket giver de fremstillede proteiner nogle
lidt andre karakteristika, end hvis det var
Typisk kompleks N-glykan med fire
grene som man eksempelvis finder i
erythropoietin (EPO).
De enkelte enzymers funktion i biosyntesen af kulhydratstrukturen er
vist med pile.
GlcNAc (N-acetylglukosamin)
Gal (galactose)
Man (mannose)
Fuc (fucose)
St3gal3/4/6
B3gnt1/2/8
B4galt1/2/3/4
Mgat1/2
Mgat3/4A/4B/4C/5/5B
Fut8
12
pharma september 2015
Enzymer
Eksempel på humanisering af sukkerstrukturer
Humanisering af sialylering i
CHO-celler
Sukkergrupperne har ikke
fuld human struktur
CHO-celler sætter sialsyrer på glykoproteiner via α(2,3)-binding i stedet for
α(2,6)-binding, som menneskeceller
ellers gør. Dette skyldes, at CHO-celler
mangler ST6GAL-1 enzymet, som sætter sialsyre på med α (2,6)-binding.
Sialsyrer er sat på glykoproteinerne
via α (2,3)-binding
I dette eksperiment er EPO produceret
i cellerne og derefter oprenset, inden
sukkergrupperne er spaltet fra proteinet og analyseret ved massespektrometri. I øverste panel er EPO produceret i den
normale CHO-cellelinie (WT). Det midterste panel viser sukkerstrukturerne,
når EPO produceres i celler, hvor forskerne har slået de to enzymer St3gal4/6, som laver α(2,3)-bindingen,
ud. Dermed har sukkergrupperne mistet sialsyrerne.
Sialsyrer er fjernet fra
glykoproteinerne
Knock out:St3gal4/6
Det nederste panel viser, hvordan det
ser ud, når forskerne først slår enzymerne St3gal4/6 ud og derefter indsætter det humane enzym ST6GAL1.
Så får proteinet igen sialylering, som
nu er påsat med α (2,6)-binding, og
dermed har sukkergrupperne fuld human struktur.
Figur: Yang Z, Wang S, Halim A, Schulz MA, Frodin M,
Rahman SH, Vester-Christensen MB, Behrens C, Kristensen
C, Vakhrushev SY, Bennett EP, Wandall HH, Clausen H.
Engineered CHO cells for production
of diverse, homogeneous glycoproteins.
Nat Biotechnol. 33, 842–844 (2015)
Sukkergrupperne har
fuld human struktur
Sialsyrer er nu sat på
glykoproteinerne via
α (2,6)-binding
Knock in:ST6GAL1
Knock out:St3gal4/6
m/z
2.000
4.000
6.000
pharma september 2015
13
Forskning
humane celler, der producerede dem. Til
gengæld har hamstercellerne andre fordele, hvilket har gjort dem til de mest anvendte i industrien.
Glycoproteinerne bliver mere specifikt
produceret af cellelinjer kendt som CHO
(Chinese hamster ovary) -celler . Sukkerstrukturerne i de proteiner, der bliver
dannet, er velegnede, da de har stor lighed med de sukkerstrukturer, som mennesker producerer. Problemet er bare, at
disse sukkerstrukturer langt fra altid ender med at være ens fra produktion til
produktion. Derfor må medicinalindustrien til tider smide en hel produktion ud,
fordi den viser sig at være for langt fra
det oprindeligt godkendte molekyle.
Manipulerer skabercellen
Men det problem bør blive løst med forskernes nye metode. Forskerne kan nemlig manipulere CHO-cellen, så nogle gener
bliver taget ud, andre gener bliver sat ind,
eller begge ændringer gøres. Det afhænger helt af, hvad lægemiddelproducenten
ønsker at få ud af celleproduktionen.
Forskerne har specifikt arbejdet med
og ændret på 19 gener i CHO-cellen. Det
er gener, der hver især har en betydning
for enkelte dele i sukkerstrukturen, der
sidder på proteinerne.
»Det er de gener, som umiddelbart er
interessante inden for glykosylering. Af-
14
pharma september 2015
hængigt af hvilken CHO-celle producenterne nu bruger, kan de få cellen til at
lave specifikke ændringer i sukkerstrukturen,« fortæller Claus Kristensen, forsker på Copenhagen Center for Glycomics på Københavns Universitet.
Eksempelvis kan nogle af de nye
CHO-celler bestemme, hvor lange sukkerstrukturer man får, eller om det yderste
led i sukkerstrukturen er en sialsyre, eller den er klippet væk.
Tidligere tog det forskere et år at udvikle den første CHO-celle, som havde et
specifikt gen slået ud. Knockout af det
gen, der styrede den enkelte proces, var
langsommelig, men nu tager det kun en
til to uger at knockoute et gen fra cellen.
Samtidig er forskerne nået så langt, at de
kan knockoute flere gener på én gang.
Historien
om en
kinesisk
hamster
Chinese hamster ovary (CHO) celler er den hyppigst brugte cellelinje i produktion af biologiske lægemidler. Cellelinjen stammer tilbage
fra 1957, hvor den blev isoleret fra
en enkelt hamsters æggestok.
CHO-cellelinjen er blevet et velanset valg, fordi den kendes bredt
i den lægemiddelvidenskabelige
verden og hos myndigheder. Den
er kendt for at være en cellelinje,
der vokser hurtigt, er relativt stabil
og giver en høj proteinproduktion.
CHO-cellerne blev for alvor indført i 1960'erne. De blev først dyrket i monolag kulturer, typisk på
plastikoverflader, men senere
adapteret til dyrkning som frie opslæmmede celler i kulturer, hvilket
er nødvendig for effektiv industriel
produktion. CHO-cellerne er de
mest almindeligt anvendte værter
til industriel produktion af rekombinante terapeutiske proteiner.
I 2011 blev CHO-cellens genom
publiceret og er nu tilgængeligt.
Kendskab til den fulde genomsekvens er en vigtig forudsætning for
at manipulere med specifikke gener i CHO-celler, som er den metode forskerne på Copenhagen Center for Glycomics har brugt.
Sådan manipulerer forskerne CHO-cellen
ZFN
Zinc Finger domains
FokI
TALEN
NTD
Først klippes et udvalgt gen ud
af CHO’ens DNA. Dermed bliver
der ikke lavet flere enzymer i
cellen. Uden enzymet kan
CHO-cellen ikke længere lave
et bestemt trin i sukkerstrukturen. Dermed vil de proteiner,
som bliver lavet i cellen, have
en anderledes sukkerstruktur.
Indtil videre har forskerne gjort
dette med 19 gener. Nogle af
de nye CHO-celler har også
fået indsat et andet gen. Ud fra
grundlæggende viden om sukkerstrukturer og metoderne til
at fjerne og indsætte specifikke gener kan celler skræddersys efter det formål, forskerne
ønsker at opnå med et givent
protein.
TALE repeat domains
CTD
FokI
CRISPR/Cas9
Cas9
tracrRNA
crRNA
NGG
20 bp target site
Til at klippe i cellens gener gør
forskerne brug af tre forskellige metoder: ZFN, TALEN og
CRISPR/Cas. Forskerne på Københavns Universitet brugte
primært ZFN gennem de først
par år, men bruger nu også
CRISPR/Cas-systemet, som er
mere effektivt og dermed også
hurtigere.
PAM
Det bestemte gen klippes ud, og gensekvensen lappes sammen igen af cellen.
Når gensekvensen lappes sammen, kan man miste et stykke af sekvensen, hvormed genet ikke længere kan bruges til at syntetisere det tilsvarende protein.
Man taler så om knockout af genet og dermed også af proteinet.
Figur: Steentoft C, Bennett EP, Schjoldager KT, Vakhrushev SY, Wandall HH, Clausen H. Precision genome
editing:
a small revolution for glycobiology. Glycobiology. 24(8):663-80 (2014)
pharma september 2015
15