Användarinstruktion och tips
Anrikning av Cryptosporidium oocystor från kliniska material med IMS Dr Romanico Arrighi – Utredare Enheten för parasitologi, livsmedels- och vattenburen smitta (MI-PL) Sid . Krisberedskap projekt (2013-2015) Förbättrad förmåga för upptäckt, tidig varning, och analys av naturlig och avsiktlig spridning av Cryptosporidium spp. Skapa genomiska referensdata för Cryptosporidium spp. Baserad på framtagen genomisk information, identifiera genetiska markörer som möjliggör högupplösande typning av Cryptosporidium spp. Utveckling, test, och utvärdering av högupplösande typning för smittspårning baserad på NGS Sid 2. 2015-10-27 Bakgrund info - Cryptosporidium Foto: Marianne Lebbad • Encellig parasit (protozo), 4-6µm diameter • en oocysta som utsöndras i mycket höga halter via avföringen – infektiösa fas • Genom 9.1 Mb • Ungefär 25 olika arter • Vanligaste är C. hominis (bara infektera människor) och C. parvum (zoonotisk, boskap) • Fekal-oral spridning Sid 3. 2015-10-27 I got 99 problems………………………….. Order from chaos Purification/Isolation Sid 4. 2015-10-27 DNA extraction Amplification and sequencing What do we need? 1 Isolation 2 3 DNA extraction Amplification and sequencing 1) Immunomagnetic Separation (IMS) • Dynabeads “trap” the parasites • Direct from feces A B (A) pre-IMS (B) post-IMS Andersson et al: J Microbiol Methods. 2015 Mar 21;113:10-12 Sid 5. 2015-10-27 1 Isolation 2 DNA extraction 3 Amplification and sequencing 2) Bullet Blender and QIAamp DNA mini kit • Effective extraction of Cryptosporidium DNA 3) Ion Torrent platform • Library prep – enzymatic shearing of DNA and adaptor ligation • PCR max 25 cycles • Size Selection; 200-400bp (Pippin prep) • Emulsions PCR (Ion Chef/OT2 depending on DNA concentration and whether de novo assembly is required) and Ion Torrent PGM sequencing Sid 6. 2015-10-27 Proof of priniciple* # 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Species C. parvum Subtype IIdA24G1 IIbA14G1R1 IIaA15G2R1 IIaA16G1R1 IInA10 IIa A15G1R1 IIdA23G1 IIaA17G1R1 IIaA18G1R1 IIdA19G1 IIdA22G1 IIeA13G1 Total oocysts after IMS 2x10⁴ 6x10⁵ 2x10⁴ 8x10⁵ 2x10⁴ 6x10⁵ 6x10⁵ 7x10⁵ 7x10⁵ 1x10⁶ 1x10⁶ 1X10⁵ SNPs 1634 4497 940 4306 13726 4563 3947 2682 4765 4265 4910 11804 Unique 337 366 194 383 8557 485 365 216 536 921 445 7064 % Crypto DNA 73% 90% 16% 64% 55% 91% 73% 72% 92% 98% 84% 69% Frac Cov x Avg Cov 0,97 26 0,99 45 0,99 23 0,99 35 0,98 26 0,99 43 0,99 28 0,99 24 0,99 44 0,99 32 0,99 43 0,99 24 * Sample list until April 2015 Sid 7. 2015-10-27 More data please* # Species 1 2 3 4 C. hominis 5 6 7 8 Total oocysts after Subtype IMS IbA9G3 1x10⁶ IdA14 1x10⁵ IaA20R3 7x10⁵ IbA13G3 4x10⁵ IfA12G1 1x10⁵ IaA23R3 2x10⁵ IeA11G3T3 1x10⁵ IbA10G2 3x10⁵ SNPs Unique 3858 4138 381 4282 2969 4637 2183 2294 288 2551 1103 4055 % Crypto DNA 91% 86% 94% 74% 83% 94% 44% 96% Frac Cov x Avg Cov 400 0,99 35 0,99 51 0,92 35 0,99 42 0,99 43 0,77 24 0,99 34 and………………………………………….. # Species 1 C. viatorum 2 C. spp horse genotype 3 C. meleagridis 4 C. ubiquitum 5 C. cuniculus 6 C. erinacei Subtype n/a n/a IIIeA19G2R1 genA VcA18G1 XIIIaA23R12 Total oocysts after IMS % Crypto DNA x Avg Cov 6x10⁴ 65% 400 >>1x10⁶ 51% 166 6x10⁴ 72% 159 1x10⁶ 72% 239 7x10⁴ 84% 99 2x10⁴ 65% 102 * Sample list until April 2015 Sid 8. 2015-10-27 Summary • Method applied to clinical material, providing high quality genome sequencing data (>30 samples sequenced) • IMS can isolate and purify at least 12 different species from clinical specimens • Current method input threshold: approx. 1x104 oocysts (~400pg DNA) Project progress • Currently designing and testing markers for higher resolution genotyping Sid 9. 2015-10-27 Acknowledgements Jessica Beser Sara Byfors Benjamin Edvinsson Sofia Andersson Jadwiga Winiecka Krusnell Emma Bränn Per Sikora Erik Alm Maria Lind Karlberg Gabriel Östlund Björn Hallström Steve Glavas Reza Advani Sid 10. 2015-10-27 Karin Troell Cecilia Alsmark Parasitology Laboratory Development and Technology Transfer Swedish Defence Research Agency Anders Allgardsson Pär Larsson Per Stenberg Adrian Läkeryd
© Copyright 2024