1. No category

Leuko64™
Analyskit för detektion av akut systemisk inflammatorisk respons
TRILLIUM DIAGNOSTICS
i Produktinformation
h LK-064-75 (75 provtagningar)
LK-064-250 (250 provtagningar)
V För in vitro-diagnostik
SAMMANFATTNING OCH PRINCIPER
Uttryck av neutrofilt CD64 ökar snabbt både in vitro och in vivo inom några
timmar genom inflammationsmediatorer såsom interferon-gamma- och G-CSF (13). Samma förändring observeras som respons på dokumenterad infektion eller
vävnadsskada, vilket visar att mätningen av neutrofilt CD64 uttryck korrelerar med
förekomsten av sådana förhållanden hos människor (4-14).
Leuko64TM
analyskittet använder en blandning av tre monoklonala antikroppar med
specificiteter till CD64 (kloner 22 och 32.2) och CD163 (klon MAC2-158).
Användningen av två antikroppar mot olika epitoper av CD64 förbättrar signalbrusförhållandet av analysen och tillhandahåller en mekanism för minimering av
variation mellan batchar när det gäller reagensens fluorescenssignal. Tillsatsen
av den monoklonala antikroppen till CD163, en monocyt-specifik antigen, ökar
specificiteten av identifieringen av leukocytsubpopulationen och underlättar
därmed Leuko64TM. QuantiCALCTM programvarans klustersökande algoritm och
möjliggör identifiering av interna "positiva och negativa kontroll"-populationer.
Användning av automatiserad programvara eliminerar den inherenta variationen i
den standardiserade subjektiva flödescytometriska analysen enligt listan. En
suspension med fluorescerande pärlor för standardisering av den cellulära CD64kvantifieringen möljiggjorde spårbarhet till NIST Standard referensmaterial SRM
1932 (RM 8640) och tillhandahåller en mekanism för att minimera skillnader
mellan batchar i Leuko64TM analyskitten. Resultaten av Leuko64TM analysen
redovisas som en PMN CD64-index som den diagnostiska parametern
tillsammans med monocyt CD64 och CD163-indexen.
TILLÄMPNING
LK-064-75 och LK-064-250 versionerna av Leuko64TM analyskittet är
särskilt utformade för att användas med följande flödescytometrar:
Beckman Coulter XL, Beckman Coulter FC-500, Beckman Coulter Navios,
BD Biosciences FACScan, BD Biosciences FACSCalibur och BD
Biosciences Cantos.
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
Leuko64 ™
Analyskit för detektion av inflammation och vävnadsskada
AVSEDD ANVÄNDNING
Trillium Diagnostics Leuko64TM analyskittet är avsett för användning vid mätning av
leukocyt neutrofilt CD64 uttryck och är avsett att användas tillsammans med andra
laboratorieresultat och kliniska bedömningar som hjälp vid in vitro diagnos akut
systemisk inflammatorisk reaktion på vävnadsskada, såsom det förekommer i
vävnadsskada, infektion eller sepsis. Trillium Leuko64TM är endast avsedd för in
vitro diagnostik av utbildad kvalificerad personal.
KITKOMPONENTER
TRILLIUM
DIAGNOSTICS
Reagens A
Reagens B
Reagens C
Leuko64TM
Programvara
Blandning av murina monoklonala antikroppar (innehåller buffrad
saltlösning med 0,5 % renat bovint serumalbumin (BSA) och 0,01
% natriumazid).
10 ggr koncentrerad Trillium Lyse-lösning (innehåller
ammoniumklorid)
Suspension av 5-6 µm polystyrenkulor märkta med Starfire RedTM
och fluorescein-isotiocyanat (FITC), (innehåller <0,1 %
natriumazid och 0,01 % Tween 20).
Används för att analysera flödescytometriska listade filer och för
att beräkna CD64-index på leukocyter. Den medföljande CDskivan innehåller även självstudier för användarutbildning och
optimal användning av Leuko64TM analyskittet.
REAGENSER och MATERIAL SOM BEHÖVS MEN INTE INGÅR
Destillerat vatten
Flödescytometer
Vortexmixer
12x75 polystyrenrör för engångsbruk
Mikropipett (er) med förmåga att dispensera 5ul, 50ul,
och 1 ml
Dator för analys av listade filer
PROV
Leuko64TM analyskittet kräver endast 50 µL antikoagulerat helblod. EDTA, heparin,
natriumcitrat eller ACD är alla kompatibla antikoagulantia med detta testsystem.
Blodprover håller sig i godtagbart skick i upp till 8 timmar när de förvaras vid
rumstemperatur (18-22  C) eller i 48 timmar i kylen (2-8C).
PROVBEREDNING
1. Späd 10 ggr Trillium Lyse (reagens B) 1:10 genom att blanda en del av den
koncentrerade reagensen B med 9 delar filtrerat destillerat vatten. Det slutliga pHvärdet av denna lösning bör vara 7,40+ 0,05. Gör i ordning en volym som är
tillräcklig för det förväntade antalet tester (1,0 ml krävs för varje prov). Utspädd
eller 1 ggr Trillium Lyse är stabil i 1 vecka vid rumstemperatur (20-26 °C) eller 30
dagar i kylskåp (2-8 °C).
2. Den utspädda Trilliumen Lyse-lösningen skall ha en temperatur på mellan 20 °C
och 37 °C vid användning. En kall lösning kan resultera i dålig lys och mindre
optimala analysförhållanden.
3. Märk ett 12 x 75 mm polystyrenrör för varje prov som skall analyseras.
4. Pipettera 50µL Leuko64TMreagens A i varje märkt rör.
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
LK64-V11-2013 A4 SV
Sidan 2 av 8
Leuko64 ™
Analyskit för detektion av inflammation och vävnadsskada
TRILLIUM
DIAGNOSTICS
5. Pipettera 50µL av det välblandade antikoagulerade blodprovet med vita
blodkroppar <25 x 109celler/l (utspädd efter behov) till motsvarande rör
innehållande reagens A, blanda försiktigt eller virvla, och inkubera under 10
minuter i mörker vid rumstemperatur (18-22 C).
6. Tillsätt 1 ml av 1X Trillium Lyse (utspätt reagens B) till varje rör och virvla
grundligt. Inkubera 15 minuter i mörker vid rumstemperatur. Om man virvlar då
och då förbättrar det lysen.
7. Tillsätt 5 µl Leuko64TM pärlor (reagens C) till varje rör, virvla, och analysera på
flödescytometern
genom
att
använda
instrumentarrangemanget
och
analysprotokollet nedan. Beredda prov som inte analyseras omedelbart bör
förvaras vid 2-8 °C och skyddas från ljus tills de analyseras. Analys med
flödescytometri bör utföras inom 4 timmars färgning.
KONFIGURATION AV FLÖDESCYTOMETER
Innan du kan analysera dina första prov, måste ett inhämtningsprotokoll
konfigureras på flödescytometern. Leuko64TM pärlor (reagens C) kommer att
fungera som kalibrator för instrumentets ökningar och spänningsinställningar. För
att den automatiserade programvaran ska kunna fungera korrekt, är det absolut
nödvändigt att noga följa följande steg. Se självstudierna på den medföljande
CD-skivan med Leuko64TM QuantiCALC programvaran (CD) för ytterligare
instruktioner.
1. Förbered ett12 x 75 mm polystyrenrör som innehåller 5 µl Leuko64TMpärlor
(reagens C) i 0,5 ml 1X Trillium Lyse (reagens B utspädd 1:10 med filtrerat
destillerat vatten, pH 7,40+0,05). Denna lösning med pärlor kommer att
användas
för
att
fastställa
den
optimala
PMT-spänningen
och
ljusspridningsinställningarna för flödescytometern.
2. I inhämtningsläge för din cytometer (Beckman Coulter XL, FC500 eller Naviosanvändare - se nedan), ska du konfigurera fem histogram med två parametrar:
 FS (lin) mot SS (log)
 FL3 (pärlor) mot SS (log)
 CD64 FITC mot SS (log)
 CD163 PE mot CD64 FITC
 CD163 PE mot SS (log)
Och 3 histogram med en parameter:
 FL1 - CD64 FITC
 FL2 - CD163 PE
 FL3 (eller PMT med filterinställningar som kan detektera 685 nm
ljus)
Beckman Coulter XL, FC500 och Navios-instrument måste ha
inhämtningsparametrarna markerade i följande ordning:
 P1 = FALS
 P4 = log PE
 P2 = log sidospridning (side
 P5=log PMT för 685 nM signal (vanligtvis
scatter)
FL4)
 P3 = log FITC
OBS:
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
LK64-V11-2013 A4 SV
Sidan 3 av 8
Leuko64 ™
Analyskit för detektion av inflammation och vävnadsskada
3. Stäng AV alla inställningar för kompensering och tröskel.
4. Spänningsinställningar för alla instrument, förutom BDB FACSCanto II.
(FACSCanto II-användare, se instruktioner nedan)

Obs: Sätt alla loggparametrar på visning med 4-decimaler i
flödescytometrins uppsamlingsprogram före inhämtningen

Kör pärlsuspensionen och gör följande justeringar på histogrammen med
en parameter (se diagram)

Mitten av toppen på FL1 (FITC)-axel ska centreras på kanal 100, (i
början av den tredje decimalen av fluorescensintensiteten.

Mitten av toppen på FL2 (PE)-axel ska centreras på ~ 20, (på första
strecket för den tredje decimalen av fluorescensintensiteten).
Mitten av toppen på FL3-axeln ska centreras på kanal 100, (i början av den
tredje decimalen för fluorescensintensiteten.
På FS vs log SS histogrammet ska pärlpopulationen placeras i slutet av den
tredje decimalen för log sidospridningssignalen och nära kanal 200 för framåt
eller lågvinkel spridningssignal (för 256-skalan används kanal 25-50).
TRILLIUM
DIAGNOSTICS


För alla användare av Beckman Coulter-modeller, FACSCalibur och
FACScanTM:
CD64‐FITC
CD163‐PE
StarfireRed
SSCLog
**Spänningsinställningar endast för användare av BDB FACSCanto IITM: BD
FACSCanto II flödescytometrar kräver alternativa installationsinstruktioner på grund
av skillnader i visningen av logg fluorescensskalan som är unik för
inhämtningsprogrammet BD FACSDiva som används på Canto II.


Obs: Sätt alla loggparametrar på visning med 4-decimaler i
flödescytometrins uppsamlingsprogram före inhämtningen.
Kör pärlsuspensionen och gör följande justeringar på histogrammen med
en parameter (se diagram):

Mitten av toppen på FL1 (FITC)-axel ska centreras på kanal 3000,
(det
andra
strecket
för
den
tredje
decimalen
för
fluorescensintensiteten).

Mitten av toppen på FL2 (PE)-axel ska centreras nära den andra
decimalen av fluorescensintensiteten.

Mitten av toppen på FL3-axel ska centreras på kanal 3000, (det andra
strecket för den tredje decimalen för fluorescensintensiteten).
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
LK64-V11-2013 A4 SV
Sidan 4 av 8
Leuko64 ™
Analyskit för detektion av inflammation och vävnadsskada

På FS vs. log SS histogrammet ska pärlpopulationen placeras i slutet
av den tredje decimalen för log sidospridningssignalen och i kanal 2550 för framåt eller lågvinkel spridningssignal.
Endast för användare av BD FACSCanto II:
TRILLIUM
DIAGNOSTICS
CD64‐FITC
CD163‐PE
StarfireRed
SSCLog
5. Tröskeln för att utesluta blodplättar och debris av röda blodkroppar kommer att
ställas in på log SS med användning av lymfocyter. Diskriminatorn på log SS ska
ställas in precis till vänster om lymfocytpopulationen. Använd inte en diskriminator
som är inställd på framåtspridning, eftersom pärlor kommer att uteslutas från
inhämtningen.
6. Inställningar för inhämtning och lagring bör justeras för att möjliggöra insamling av
50 000 obevakade händelser. Det rekommenderas i allmänhet att ställa in
upplösningen till 1024 rekommenderas i allmänhet, men det krävs när man
använder cytometrar från Beckman Coulter CytomicsTM FC500 eller BD
Biosciences FACSCantoTM.
7. Spara inställningarna och inhämtningsmallen. Upprepa steg 4-7 med valfri ny
batch Leuko64TM eller efter nästa service på instrumentet.
LISTMODE FILANALYS
Installera medföljande Leuko64TM QuantiCALC program på den Macintosh eller PC
som kommer att användas för dataanalysen. Följ de användarvänliga
instruktionerna för listmode dataanalys som du hittar i hjälpfilen för programmet.
OBS: Programmet är batch-specifikt och protokoll för användning är
specifika för instrumentmodellerna. Du kommer att uppmanas att verifiera
rätt val.
STRATEGI FÖR KVALITETSKONTROLL VID LEUKO64 TMANALYS
Analysen använder autologa cellpopulationer inom patientproven för både positiva
och negativa kontroller, vilket optimerar bedömningen av pre-analytiska variabler.
Lymfocytpopulationen, som saknar uttryck av både CD64 och CD163 tjänar som
en negativ kontrollpopulation och säkerställer tillsättning av lämpliga reagens och
kan detektera närvaron av fluorescerande ämnen inom det diagnostiska provet.
Monocytpopulationen, som har konstitutivt uttryck av både CD64 och CD163,
fungerar som en positiv kontroll för försäkran om rätt provfärgning med reagens A.
Följ de användarvänliga instruktionerna för listmode dataanalysen i hjälpfilen
tillLeuko64TMprogramvaran för vidare detaljer angående analysens negativa och
positiva kontroller. OBS: Programmet har kontrollrelaterade flaggor och
direktiv.
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
LK64-V11-2013 A4 SV
Sidan 5 av 8
Leuko64 ™
Analyskit för detektion av inflammation och vävnadsskada
tl H Y C
HANTERING OCH FÖRVARING
DIAGNOSTICS
Förvara flaskorna upprätt, väl förslutna, vid 2-8C när de inte används. Oöppnade
flaskor är stabila fram till det utgångsdatum som anges på varje flaska och
analysformulär. Undvik onödiga cykler av uppvärmning och nedkylning eftersom
analysen är validerad till trettio (30) eller mindre termiska cykler. Skydda produkten
från frost, temperaturer över 30 C eller längre tid i rumstemperatur (18-26 C) eller
från långvarig exponering för ljus.
VARNING
Alla komponenter i denna sats innehåller natriumazid (<0,1% vikt/volym). Denna
kemikalie är en giftig och farlig förening i kombination med syror eller metaller.
Hanteras varsamt. Lösningar som innehåller natriumazid ska avfallshanteras rätt
sätt.
KONTROLL AV PRODUKTKVALITET
Prestandan och specificiteten av reagenser som ingår i denna sats skall testas med
hjälp av Trilliums interna kvalitetskontrollmetoder. Tillverkningen av denna produkt
görs med hjälp av kvalitetssystem och riktlinjer för tillverkning och produktion i
enlighet med FDA QSR och ISO 13485:2003.
TRILLIUM
PRODUKTBEGRÄNSNINGAR





Terapeutisk användning av interferon-gamma, G-CSF, eller andra medel som
modulerar det medfödda immunförsvaret, är kända för att påverka uppregleringen
av leukocyt CD64 uttryck och kommer därför att påverka tolkningen av analysen.
Leuko64TM analysresultat ska inte användas som enda mått på inflammation hos
dessa patienter, men de kan användas för att följa effekten av dessa
behandlingar.
Anvisningar om korrekt förvaring och hantering av denna produkt samt de prover
som skall testas måste följas för optimal prestanda och för att undvika falska eller
felaktiga resultat.
Ofullständig blandning av reagens C före användning kan ogiltiggöra både
alikvoten som har tagits och återstoden av materialet i flaskan.
Valet av felaktig instrument protokoll eller batchnummer till kittet när du startar
programmet kan leda till en minskning av noggrannheten i listmode dataanalysen.
Programmet är batch-specifikt och protokoll för användning är specifika för
instrumentmodellerna. Gör rätt urval när du uppmanas att göra det.
Varje fil från en allvarligt leukopeniskt eller neutropent blodprov somvisar mindre
än 200 WBC händelser som övervakas av Leuko64TM programmet i någon av de
tre kategorierna (PMN, lymfocyter eller monocyter) kan inte analyseras av
Leuko64TM analyskittet utan betydande minskning av noggrannhet och precision
av PMN CD64-indexen.
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
LK64-V11-2013 A4 SV
Sidan 6 av 8
Leuko64 ™


Analyskit för detektion av inflammation och vävnadsskada
Alla filer med ett antal pärlhändelser under 1000 bör utvärderas för att fastställa
orsaken till det låga antalet pärlor, som kan orsakas av felaktig
instrumentinställningar eller av ett outspätt blodprov med ett WBC >25 x 109
celler/l.
Ibland kan flödescytometri-instrument ha filter som är anordnade i en atypisk
konfiguration vari FL1 inte är CD64 FITC-signalen och FL2 är inte CD163 PEsignalen och därigenom kan de äventyra prestandan hos Leuko64TM programmet.
Kontakta din instrumentleverantör och Trillium Diagnostics tekniska support för att
få hjälp med att lösa en sådan situation eller problem med använding av
programmet.
DIAGNOSTICS
PRESTANDAEGENSKAPER
Varje laboratorium bör fastställa ett acceptabelt referensomfång för varje batch av
Leuko64TM. Referensomfånget för PMN CD64-index för friska normala blodprover
beräknas vara ≤ 1,00. I allmänhet gäller att ju allvarligare den systemiskt akuta
inflammatoriska reaktionen är, desto högre PMN (och monocyt) CD64 index-värden
kommer att mätas. De förväntade referensomfången för Monocyt CD64 och
CD163-index har inte fastställts.
REFERENSER
1.
2.
TRILLIUM
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Davis BH. Improved diagnostic approaches to infection/sepsis detection. Expert Rev Mol Diag
2005;5:193-207.
Schiff D, Rae J, et al. Increased phagocyte CD64 expression and improved Fc-receptor
mediated phagocytosis following in vivo recombinant human interferon-Ɣ treatment of normal
human subjects. Blood 1997;90:2987-94.
Petroni KC, Shen L, Guyre PM. Modulation of human polymorphonuclear leukocyte IgG Fc
receptors and Fc receptor-mediated functions by IFN-gamma and glucocorticoids. J Immunol
1988;140:3467-72.
Davis BH, Bigelow NC, et al. Neutrophil CD64 expression: potential diagnostic indicator of
acute inflammation and therapeutic monitor of interferon-&#xf067; therapy. Lab Hematol
1995;1:3-12.
Guyre PM, Campbell AS, et al. Monocytes and polymorphonuclear neutrophils of patients with
streptococcal pharyngitis express increased numbers of type I IgG Fc receptors. J Clin Invest
1990;86:1892-1.
Ng PC, Lam HS. Diagnostic markers for neonatal sepsis. Curr Opin Pediatr 2006;18:125-31.
Davis BH, Bigelow NC. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity
counts, and automated hematology analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab
Hematol 2005;11:137- 47.
Leino L, Sorvajarvi K, et al. Febrile infection changes the expression of IgG Fc receptors and
complement receptors in human neutrophils in vivo. Clin Exp Immunol 1997;107:37-43.
Davis BH, Olsen S, et al. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in
emergency room patients. Arch Pathol Lab Med 2006;130(5):654-61.
Van der Meer W, Pickkers P, et al. Hematological indices, inflammatory markers and neutrophil
CD64 expression: comparative trends during experimental human endotoxemia. J Endotoxin
Res 2007;13:94-100.
Groselj M, Ihan A, Derganc M. Neutrophil and monocyte CD64 and CD163 expression in
critically ill neonates and children with sepsis: comparison of fluorescence intensity and
calculated Indexes. Mediators Inflamm 2008; 2008:202646.
Bhandari V, Wang C, et al. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a
diagnostic marker. Pediatrics 2008;121:129-134.
Hoffmann JJ. Neutrophil CD64 as a sepsis biomarker. Biochemica Medica 2011;21:282-90.
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
LK64-V11-2013 A4 SV
Sidan 7 av 8
Leuko64 ™
14.
Analyskit för detektion av inflammation och vävnadsskada
Icardi M, Erickson Y, Kilborn S, et al. CD64 Index provides simple and predictive testing for
detection and monitiroing of sepsis and bacterial infection in hospital patients. J Clin Microbiol
2009;47:3914-19.
US Department of Labor, Occupational Safety and Health Administration. 29 CFR Parts 1910.
1030, Occupational Exposure to Bloodborne Pathogens; Final Rule. Federal Register
235:64175-82. 1991.
US Department of Health and Human Services. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. HHS Publication (NIH) 93-8395.Washington: US Government Printing Office.
1993.
15.
16.
VARUMÄRKEN
TRILLIUM
DIAGNOSTICS




Leuko64TM QuantiCALC programmet är upphovsrättsskyddad och har utvecklats i
samarbete med VERITY SOFTWARE HOUSE • Topsham, Maine, USA •
www.vsh.com och TRILLIUM DIAGNOSTICS, LLC • Brewer, Maine, USA •
www.trilliumdx.com
FACSCantoTM och FACScanTM är varumärken som tillhör BD Biosciences • San
Jose, CA, USA • www.bdbiosciences.com
NaviosTM, GalliosTMCytomics FC500TM och XLTM är varumärken som tillhör
Beckman Coulter, Inc • Brea, CA, USA • www.beckman.com
Leuko64TM är ett patenterat analyskit, som omfattas av US patentnr. 8,116,984,
japanskt patentnr. 5047803, och EPO-patentansökannr. 05851842.4.
KUNDTJÄNST
M
Trillium Diagnostics, LLC
PO Box 67
Brewer, Maine, USA 04412
Tel. +1 207 945 0900
Fax +1 207 942 0346
Tekniska frågor [email protected]
Beställningar per telefon, fax eller hemsida på
www.trilliumdx.com
P
IQ Products BV
Rozenburglaan 13a
9727 DL Groningen, Nederländerna
Tel. +31 (0) 50 57 57 000
Fax +31 (0) 50 57 57 002
Tekniska frågor [email protected]
Beställningar
[email protected]
Hemsida www.iqproducts.nl
Tel: +1 207 945 0900  Fax: +1 207 942 0346  [email protected]  www.trilliumdx.com
LK64-V11-2013 A4 SV
Sidan 8 av 8