Kvalitetskontroll av
resistensbestemmelse
Iren Høyland Löhr
Avd. for medisinsk mikrobiologi, Stavanger Universitetssjukehus
AFA-kurs, november 2015
Disposisjon
EUCASTs lappediffusjonsmetode
Resistensbestemmelse og faktorer som
påvirker resultatet (kontrollstasjoner)
Kvalitetskontroll
EUCASTs lappediffusjonsmetode
EUCAST:
◦
◦
◦
◦
Disk diffusion – Manual v. 5.0
Disk diffusion – Slide Show v. 5.0
Disk diffusion – Reading guide v. 4.0
QC table v. 5.0
NordicAST:
◦ Metodbeskrivning – bildspel v. 5.0
◦ Avläsningsguide v. 4.0
AFA:
◦ «Resistensbestemmelse av bakterier. Metodebeskrivelse»
◦ «Kvalitetskontroll av reistensbestemmelse av bakterier»
www.eucast.org
www.nordicast.org
www.unn.no/afa/
Faktorer som påvirker resultatet av
resistensbestemmelsen
(kontrollstasjoner)
Medium
Antibiotikadepot (lapper og gradienttester)
Praktisk gjennomføring:
◦ Inokulum
◦ Applikasjon av lapper
◦ Inkubering
Avlesning
Medium (I)
Mueller Hinton (MH)
Mueller Hinton Fastidious (MH-F)
◦ 5% defibrinert hesteblod; 20 mg/L β-NAD
pH: 7,2 – 7,4
◦ Lav pH kan gi både for små og for store soner
Agardybde: 4 ± 0,5 mm
Medium (II)
Divalente kationer (Ca2+, Mg2+)
◦ For høye nivåer gir små soner (f. eks. aminoglykosider)
Thymin og thymidin
◦ For høye nivåer gir små soner (f. eks. trimetoprim og sulfa)
Forurensning?
Oppbevaring / holdbarhet (8-10°C; en uke…)
Antibiotikadepot
Oppbevaring av antibiotikadepoter (= lapper og
gradienttester)
◦ Følg produsentens anvisninger nøye
◦ Obs: lys, temperatur, fuktighet og holdbarhetsdato
Både antibiotikadepoter og medier skal ha
værelsestemperatur når de brukes
Inokulum (I)
Standardisert inokulum: 0,5 McFarland
Konfluerende og jevn vekst
◦ Tykkelse på inokulum og bløt/tørr pensel påvirker
sonediameter mest!
Inokulum (II)
E. coli – riktig
S. aureus - riktig
H. influenzae - riktig
E. coli – for tynn
S. aureus – feil teknikk
H. influenzae – feil
teknikk og for tynn
Applikasjon av lapper og inkubering
15-15-15 minutters regelen
Max 6 lapper på en vanlig skål (90 mm)
Skålene inkuberes med bunnen opp ved
35±1oC i 16-20 timer
◦ MH-F i atmosfære med 5±1% CO2
3-4 skåler i en stabel…
Avlesning
Avlesning ved full hemningssone
100%
Avles mot mørk bakgrunn og med påfallende
lys (ca. 30 cm avstand)
◦ MH: fra baksiden
◦ MH-F: fra forsiden (uten lokk)
Bruk linjal, skyvelær eller automatisk
sonemåler
Avlesning – unntak
Bakterie
Antibiotika
Avlesning
Proteus spp.
Alle
Overse sverming.
Streptococcus spp.
Alle
Avles vekstsone, ikke βhemolyse (det er ofte
vekst i områder med αhemolyse).
Alle bakterier
Trimetoprim,
trimetoprimsulfamethoxazol
Mål den indre sonen ved
tydelig dobbelsone, men
overse svak vekst i den
indre hemningsonen.
Stenotrophomonas
maltophilia
Trimetoprimsulfamethoxazol
Se bort fra innvekst og
mål den ytre sonen
Enterococcus spp.
Vancomycin
Hold skålen opp mot lyset
og undersøk sonen.
Utydelig sonekant og
enkeltkolonier i sonen
indikerer vancomycin
resistens.
Bakterie
Antibiotika
Avlesning
Enterobacteriaceae
Ampicillin
Overse svak vekst som
kan opptre som en indre
sone.
E. coli
Mecillinam
Overse enkeltkolonier
inne i sonen.
S. aureus
Bensylpenicillin
Hold skålen opp mot lyset
og undersøk sonekanten.
Dersom sonekanten er
skarp (og ≥26 mm),
rapporter som R.
Staphylococcus spp.
Linezolid
Hold skålen opp mot lyset
og undersøk sonen.
Staphylococcus spp.
Cefoxitin
Undersøk sonen nøye for
å detektere evt. kolonier
inne i sonen.
www.eucast.org
www.nordicast.org
Avlesning – unntak (bilder)
For eksempler vist på kurset se:
www.nordicast.org
◦ Metodbeskrivning – bildspel v. 5.0
◦ Avläsningsguide v. 4.0
Kvalitetskontroll
Standardprogram
◦ Kontroll av medium
◦ Kontroll av nøyaktighet og presisjon
◦ Kontroll av evne til å påvise spesifikke
resistensmekanismer
Utvidet program
http://www.eucast.org/ast_of_bacteria/
http://www.nordicast.org/kvalitetskontroll
http://www.unn.no/kvalitetskontroll/category19026.html
Standardprogram
Kontroll av medium (medieproduksjon)
◦ Forurensning, vannkvalitet, autoklavering, pH,
agartykkelse, innhold av divalente kationer, thymin og
thymidin etc.
Kontroll av nøyaktighet og presisjon
◦ Praktisk utføring av resistensbestemmelse og avlesning
◦ Referansestammer testes daglig mot et representativt
utvalg av antibiotika (target/range finnes i QC-tabellen)
Kontroll av evne til å påvise spesifikke
resistensmekanismer
◦ Referansestammer med aktuelle mekanismer (MRSA,
VRE, ESBL, BLNAR…) testes mot relevante antibiotika
Referansestammer - standard
Mikrobe
Referansestamme
Egenskaper
E. coli
ATCC 25922; NCTC 12241; CIP 7624; DSM1103;
CCUG 17620; CECT 434
Følsom villtype
E. coli
ATCC 35218; NCTC 11954; CIP 102181; DSM 5923;
CCUG 30600; CECT 943
TEM-1 β-lactamase produserende
(ampicillin resistent)
P. aeruginosa
ATCC 27853; NCTC 12903; CIP 76110; DSM 1117;
CCUG 17619; CECT 108
Følsom villtype
S. aureus
ATCC 29213; NCTC 12973; CIP 103429; DSM 2569;
CCUG 15915; CECT 794
Svakt β-lactamase produserende
E. faecalis
ATCC 29212; NCTC 12697; CIP 103214; DSM 2570;
CCUG 9997; CECT 795
Følsom villtype
S. pneumoniae
ATCC 49619; NCTC 12977; CIP 104340; DSM 11967;
CCUG 33638
Nedsatt følsomhet for bensylpenicillin
H. influenzae
ATCC 49766; NCTC 12975; CIP 103570; DSM 11970;
CCUG 29539
Følsom villtype
Campylobacter jejuni
ATCC 33560; NCTC 11351; CIP 702; DSM 4688;
CCUG 11284
Følsom villtype
http://www.eucast.org/ast_of_bacteria/qc_tables/
Referansestammer - spesifikke
resistensmekanismer
Mikrobe
Referansestamme
Egenskaper
K. pneumoniae
ATCC 700603; NCTC 13368; CCUG 45421; CECT
7787
NCTC 12493
ESBLA produserende (SHV-18)
H. influenzae
ATCC 49247; NCTC 12699; CIP 104604; DSM 9999;
CCUG 26214
β-lactamase negativ, ampicillin resistent
(BLNAR)
E. faecalis
ATCC 51299; NCTC 13379; CIP 104676; DSM 12956;
CCUG 34289
Høygradig aminoglycosid resistent (HLAR)
og vankomycin resistent (VRE); vanB
positiv; vankomycin MIC 8-16 mg/L
S. aureus
Meticillin heteroresistent (MRSA);
mecA positiv
http://www.eucast.org/ast_of_bacteria/qc_tables/
Referansestammer
En referansestamme er genetisk stabil og skal ha en
MIC-verdi som ligger innenfor det
konsentrasjonsområdet som er aktuelt ved bruk av
disk diffusjonsmetoden
Leverandører
◦
◦
◦
◦
◦
ATCC: American Type Culture Collection
NCTC: National Collection of Type Cultures
CCUG: The Culture Collection University of Gothenburg
CIP: Collection de Institut Pasteur
DSMZ: Deutche Stammensammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen
◦ CECT: Colection Espanola de Cultivos Tipo
Referansestammer krever spesiell pleie og
oppbevaring
Utvidet program
50-100 kliniske isolater testes fortløpende
en gang i året mot spesifikke antibiotika
Medianverdien av sonediameter skal ikke
avvike mer enn ± 2 mm fra EUCASTs
medianverdi
http://www.eucast.org/mic_distributions_and_ecoffs/
Ampicillin / E. coli
http://www.eucast.org/mic_distributions_and_ecoffs/
Cefotaxime / K. pneumoniae
http://www.eucast.org/mic_distributions_and_ecoffs/
Takk for oppmerksomheten!