1. No category

Verifisering av MIC Test Strip
Bachelor oppgave for Bioingeniørutdanningen
29.05.2013
Kandidatnr: 7
http://www.liofilchem.net/img/img.login.area/mic_login.jpg (25.04.13)
Innhold
1. Innledning
2. Introduksjon
2.1 Generelt om bakterier
2.2 Bakgrunn til resistent bestemmelse
2.3 Antibiotika
2.4 Genoverføring mellom bakterier og spredning av resistens
2.5 Antibiotika resistens mekanismer
2.6 Resistensbestemmelse generelt og metoden (MIC) spesielt
2.6.1 Om E-test® fra BioMérieux og om MIC Test Strip fra Liofilchem
2.7 Dyrkningsmedier til resistensbestemmelse
3. Formål med studien
4. Materialer og metoder
4.1 Bakterier- og soppstammer
4.2 Materialer
4.3 Instrumenter/hjelpemidler
4.4 Metode
4.4.1 Forberedelse
4.4.2 Utførelse
4.4.3 Avlesning
5. Resultater
5.1 Verifisering av korrelasjonen mellom E-test og MIC Test Strip
5.2 Reproduserbarheten og repeterbarheten til MIC Test Strip
5.3 Sammenligning av medier
5.3.1 Sammenligning av anbefalte medier med MH med blod
6. Diskusjon
6.1 Metodesammenligning mellom E-test og MIC Test Strip
6.1.1 MIC verdier til ATCC stammer mot fasit
6.2 Reproduserbarheten til MIC Test Strip
6.3 Utfordringer i rutinen ved et bytte av metode til resistens bestemmelse
med MIC verdi
6.4 Sammenligning av medier for resistensbestemmelse
6.5 Feilkilder
7. Konklusjon
8. Referanser
s. 2
s. 2
s. 2
s. 3
s. 5
s. 6
s. 7
s. 9
s.10
s.11
s. 11
s. 12
s. 12
s. 14
s. 15
s. 15
s. 15
s. 16
s. 16
s. 17
s. 17
s. 21
s. 23
s. 24
s. 24
s. 24
s. 25
s. 26
s. 27
s. 28
s. 29
s. 30
s. 30
1
1. Innledning
Dette forsøket er en verifisering av en validering gjort av Helse Vest. De har validert bruken
av MIC Test Strip fra Liofilchem ved antibiotikaresistens- bestemmelse. Dette ble gjort ved å
sammenligne denne stripsen mot E-test fra Biomérieux som i dag benyttes i rutinen. E-test har
nå ved flere sykehus blitt erstattet av MIC test strip. Ved Bakteriologisk enhet ved
Nordlandssykehuset i Bodø gjøres det derfor en verifisering av valideringen til Helse Vest for
å undersøke om det er aktuelt å bytte ut den etablerte metoden med bruk av E-test mot MIC
test strip. I tillegg til å undersøke om MIC test strip kan erstatte E-test undersøkes nye medier
mot etablerte som brukes i rutinen.
2. Introduksjon
2.1 Generelt om bakterier
Bakteriene finnes i størrelsesordenen fra 0,6µm til 4µm. Bakteriene har forskjellig form som
kokker, staver og spiralformete. De er organisert i forskjellige former som staver i kjeder og
kokker i hauger. I motsetning til eukaryote celler har ikke bakterier organeller, ER og en
kjerne. Ribosomene befinner seg i cytoplasma og transkriberer peptidkjeder i hele cella.
DNAet til bakteriene består av et sammenhengende kveilet kromosom uten membran rundt. I
tillegg til kromosomet har bakterier gener på plasmider. Plasmidene er små sirkulære
dobbelttrådede DNA biter med eget replikasjonsorigo (1).
Bakteriene deles gjerne generelt inn i to grupper, Gram positive og Gram negative bakterier.
Denne inndelingen oppsto fra en fargemetode som kalles Gram farging. De Gram negative
bakteriene farges rød-rosa og de Gram positive bakteriene farges blå-fiolett. I denne
fargemetoden brukes krystall-fiolett-jodid og de Gram positive bakteriene holder på dette
fargekomplekset inni cella, mens Gram negative bakterier ikke holder på denne fargen når
man avfarger med alkohol. Gram negative bakterier kontrastfarges derfor med rød
kontrastfarge.
Gram negative bakterier og Gram positive bakterier farges ulikt på grunn av deres strukturelle
oppbygning av celleveggen. I figur 1 vises de to forskjellige cellevegg strukturene. Gram
positive bakterier har cytoplasmamembran innerst, dette er en dobbelt fosfolipid membran.
Deretter følger et tykt lag med peptidoglykan i sped teikoinsyre. Peptidoglykanlaget utgjør
celleveggen. De Gram negative bakteriene har også en cytoplasmamembran og utenfor denne
2
har de et periplasmatisk rom. Utenfor dette rommet ligger et tynt lag med peptidoglykan og
deretter et lag med polysakkarider og yttermembran-proteiner. Polysakkaridene og
yttermembran-proteinene utgjør yttermembranen til de Gram negative bakteriene (1).
Figur 1: Illustrasjon over celleveggen til Gram positive og Gram negative bakterier. Bilde til venstre viser
oppbyggingen av celleveggen til Gram positive bakterier. Til høyre ser man oppbyggingen av celleveggen
til Gram negative bakterier (2).
Bakterier som dyrkes i klinisk sammenheng defineres som kravstore og ikke-kravstore
bakterier. De kravstore bakteriene har behov for mye næring og gode og /eller spesielle
vekstvilkår for å kunne vokse på medier og danne kolonier som kan benyttes i diagnostikken.
Ikke-kravstore bakterier trenger ikke mye næring eller spesielle vekstvilkår. De vokser bra
med lite næring i mediet.
De fleste kliniske bakterier er aerobe og kan vokse fint i inkubatorer med aerobt miljø. Andre
bakterier er anaerobe og må dyrkes i anaerobt miljø for at de skal overleve og vokse til å bli
kolonier som kan benyttes.
2.2 Bakgrunnen til resistent bestemmelse.
Den første store oppdagelsen av antibiotika ble gjort av Alexander Flemming ved St. Mary’s Hospital i London. Han hadde glemt skåler dyrket med stafylokokker over sommerferien sin i
1928, når han kom tilbake hadde en av skålene blitt forurenset med en muggsopp som hadde
en klar sone rundt seg. Flemming rendyrket soppen og fant ut at filtratet hemmet veksten til
3
stafylokokker, streptokokker, pneumokokker, meningokokker og gonokokker. Denne
muggsoppen var Penicillium notatum. Senere på slutten av 1930 tallet greide Howard Florey
og Ernst Boris Chain å oppkonsentrere penicillinet slik at det kunne benyttes medisinsk og
den første pasienten ble behandlet med penicillin i 1941. Videre i 1944 begynte en utstrakt
bruk av penicillin da produksjonen økte i kapasitet og man hadde nok produkt til å kunne
bekjempe bakterieinfeksjonene til pasienten (1).
Waksmann definerte i 1942 antibiotika som en kjemisk substans som produseres av en
mikroorganisme og som i høy fortynning undertrykker veksten av eller dreper andre
mikroorganismer (1). Denne definisjonen stemmer ikke helt i dag da de fleste antibiotika
produseres syntetisk. Det første syntetiske antibakterielle midlet; Prontosil ble oppdaget av
Gerhard Domagk. Dette er et antibiotikum innenfor sulfonamidene og det ble brukt til
behandling av blant annet urinveisinfeksjon og lungebetennelse i 1930 årene (3).
Resistens mot antibiotika ble oppdaget tidlig og man fant allerede på slutten av 40-tallet at
stafylokokker kunne være resistente mot penicillin. Ved hvert nye fremstilte antibiotikum tar
det ikke lang tid før resistens utvikles hos en del bakterier. Mellom et til et tiår etter
introduksjon utvikles det stammer med resistens til det introduserte antibiotikumet (4). I
begynnelsen var bakteriene kun resistente mot et antibiotikum, men på 1950 tallet ble det
oppdaget multiresistente bakterier. De første multiresistente bakteriene var Shigella ssp og
E.coli (1).
Et annet eksempel på at resistensen utvikles raskt er resistensen funnet hos Meticillin
resistente gule stafylokokker (MRSA) ble oppdaget tre år etter lanseringen av det modifiserte
penicillinet; meticillin. Dette antibiotikumet blir ikke påvirket av penicillinase, men man fant
raskt ut at andre beta-laktamaser kunne hydrolysere det (5).
Det er en generell oppfatning at mye av resistensen som utvikles er på grunn av at økt bruk av
antibiotika ved sykdom, men også ved dyrehold og ellers sluppet ut i miljøet, har ført til et
sterkt selektivt press for utvikling av flere resistente bakterie stammer (5).
4
2.3 Antibiotika
Antibiotika kan kategoriseres på flere måter, i denne oppgaven kategoriseres de antibiotikaene
som var med i verifiseringen etter virkemekanisme. Antibotikaene deles da inn fem grupper:
Hemming av celleveggsyntesen.
Hemming av proteinsyntesen
Hemming av nukleinsyresyntesen
Hemming av metabolske trinn i bakteriecellen
Antibiotikaene som brukes i denne verifiseringen er Metronidazol, Ceftazidim, Ciprofloxacin,
Gentamicin , Meropenem, Ampicillin, Penicilin, Vancomycin, Klindamycin og Fluconazole.
Fluconazole er ikke et antibiotikum, men et anti-fungal middel som benyttes ved
soppinfeksjoner. Dette middelet er tatt med da det er viktig innenfor behandling og man vil da
også undersøke korrelasjonen mellom E-test og MIC test strip for dette midlet.
Antibiotikaene Ceftazidim, Meropenem, Ampicillin, Penicillin, og Vancomycin hører under
gruppe 1. Disse antibiotikaene virker slik at bakterien ikke får syntetisert celleveggen ved at
de fungerer som pseudosubstrater til transpeptidasede som er med i celleveggsyntesen (6). I
tillegg er Ceftazidim, Meropenem, Ampicillin og Penicillin betalaktamantibiotika med den
samme ringstrukturen; beta-laktamringen. Gentamicin og Klindamycin hemmer
proteinsyntesen og tilhører gruppe 3. Da får ikke bakterien syntetisert noen proteiner til vekst
og/eller overlevelse. De siste to antibiotikaene; Metronidazol og Ciprofloxacin tilhører gruppe
4 og hemmer da DNA syntesen til bakteriene (7).
Beta-laktamantibiotikaene er delt videre inn i Penicilliner (Ampicillin og Penicillin),
Cefalosporiner (Ceftazidim) og Karbapenemer (Meropenem). Penicillin virker bra på Grampositive og Gram-negative kokker og Gram-positive staver. Dette antibiotikumet er et
smalspektret antibiotikum. Ampicillin er bredt-spektret antibiotikum og det er aktivt mot
mange Gram-negative staver. Ceftazidim virker spesielt på P.aeruginosa. Ceftazidim er et 3.
generasjons cefalosporin og antibiotikaene i denne gruppen er resistente mot beta-laktamser
fra Gram-negative staver. Meropenem er et bredspektret antibiotikum med særlig effekt på
Gram-negative bakterier (1).
Vancomycin er et glykopeptid antibiotikum og dette antibiotikumet virker bare mot Grampositive bakterier, da det ikke kan penetrere yttermembranen til Gram-negative bakterier (4).
5
Virkemekanisme til vancomycin er å binde substratet til hindre at det kan bindes til
transpeptidasene eller transglycosylasene i oppbygningen av peptidoglykanet (6). Dette
antibiotikumet kan benyttes i behandlingen på MRSA. Vider hører Gentamicin og
Klindamicin til aminoglykosidene og disse antibiotikaene virker ved at de binder til 30S
subenheten til ribosomet og hindrer dermed proteinsyntesen (4). Ciprofloxacin er et kinolon.
Kinolonene angriper bakteriene ved å blokkere DNA gyrase og DNA topoisomerase under
replikasjon og reperasjon av DNAet til bakterien (4). Det siste antibiotikumet; Metronidazol
er et nitromidazol og antibiotikumet fungerer bare på anaerobe bakterier fordi Metronidazol
må reduseres i bakterien før det får antibakteriell effekt (1).
Antibiotikaene fungerer enten på en baktericid eller en bakteriostatisk måte. Virker
antibiotikumet baktericid forårsaker det død av bakteriene ved normale konsentrasjoner. Er
antibiotikumet bakteristatisk stoppes veksten og/eller formeringen av bakteriene (1).
2.4 Genoverføring mellom bakterier og spredning av resistens
Man mener at bakteriene alltid har hatt et genetisk grunnlag for å utvikle resistens. Bakteriene
kan ha en naturlig resistens eller en ervervet resistens. Den naturlige resistensen vil si at
bakterien ikke har de strukturene som antibiotikumet virker på, eller at antibiotikumet ikke
kommer seg inn i bakteriecella. Ervervet resistens vil si at bakteriene har fått spontane
mutasjoner i arvematerialet slik at de får et resistent gen eller de tar opp genmateriale fra
omgivelsene eller fra andre bakterier. Dette kan gi bakterien resistente gener.
Den ervervete resistensen kan overføres mellom bakterier med horisontal genoverføring.
Genoverføringen mellom bakterier skjer med tre ulike mekanismer; transformasjon, der
bakteriene tar opp nakent DNA fra omgivelsene. Da kommer ofte DNAet fra døde bakterier i
omgivelsene. Konjugasjon er en annen måte å overføre DNA mellom to bakterier. Da dannes
det en konjugasjonsbro mellom bakteriene og en bakterie overfører plasmider til den andre.
En tråd av plasmidet sendes over og så replikeres denne enkelttråden til dobbelttrådet plasmid
i begge bakteriene. Den tredje mekanismen er transduksjon der DNA blir overført mellom
bakterier med hjelp av bakteriofager. Dette skjer ved at viruset har pakket inn en del av
arvematerialet til bakterien istedenfor sitt eget og ved neste infeksjon kan den infiserte
bakterien få dette arvematerialet inn i sitt eget DNA. Alle tre mekanismene er illustrert i figur
2 (1) (7).
6
Figur 2: Illustrasjon over de tre mekanismene av horisontal genoverføringene mellom bakterier;
transformasjon, konjugasjon og transduksjon (3).
2.5 Antibiotika resistens mekanismer
Det finns flere ulike mekanismer som fører til antibiotika resistens i bakteriene. Disse
mekanismene kan være at målproteinet eller reseptor til antibiotikumet er endret, at bakterien
sender ut antibiotikumet like fort som det kom inn i bakterien. Eller bakterien produserer
enzymer som hemmer antibiotikumet (1).
7
Figur. 3: Oversikt over de forskjellige mekanismene for antibiotika resistens. Med klokka viser figuren
efflux pumpe, enzymatisk endring av antibiotikumet og enzymatisk degradering av antibiotikaene (8).
Efflux er en av resistens mekanismene som bakterier kan ha. Dette vil si at bakterien har
pumper i cellemembranen som sender ut antibiotikumet så fort det kommer inn i cella. Denne
resistens mekanismen er vanlig hos bakterier resistente mot aminoglykosider som Gentamicin
(1).
Ved å endre målproteiner kan bakteriene unngå effekten av antibiotikumet. En endring kan
skje med en spontan mutasjon, eller det kan skje ved at bakterien har fått gener med horisontal
genoverføring som gir den et endret protein. Et eksempel på denne mekanismen er endring av
Penicillin Bindende Protein (PBP). PBP er med i oppbyggingen av peptidoglykanlaget til
bakteriene og alle beta-laktamantibiotikaene binder seg kovalent til dette proteinet og hemmer
det. Det finns mange forskjellige PBP og de er forskjellige fra art til art. Så ikke alle er
resistente for de samme antibiotikaene. Meticillin-resistente-gule- stafylokokker (MRSA) er
resistente mot alle beta-laktamantibiotikaene og disse har en ny type PBP som kalles PBP2’
(1).
Enzymatisk hemming av antibiotikumet er en tredje mekanisme og denne er også vanlig for
resistens mot beta-laktamantibiotikaene. Da produserer bakterien et enzym som hemmer eller
ødelegger antibiotikumet slik at det ikke kan binde seg eller på annen måte kan utøve sin
8
anibakterielle effekt i bakterien. Ved resistens mot beta-laktamene produserer bakteriene
enzymet beta-laktamase som hydrolyserer beta-laktamringen i beta-laktamantibiotikaene.
Beta-laktamasene kan være spesifikke mot et antibiotikum eller de kan være mer generelle og
kan hydrolysere fler forskjellige antibiotika. Pencillinase er for eksempel en beta-laktamase
som bare kan hydrolysere Penicilliner (1).
Penetrering inn i bakterien er den siste mekanismen for resistens mot antibiotika. Denne
mekanismen er vanligst hos de Gram-negative bakterien fordi antibiotikumet ikke klarer å
penetrere rett gjennom celleveggen, men må gjennom ytterveggen og da må benytte seg av
hydrofile porinene i yttermembranen. Ladning og størrelse på antibiotikumet bestemmer om
det slippes inn i bakterien da det er forskjell på størrelse og antall av poriener mellom de
forskjellige bakteriene. Resistens oppnår ved at porinene endres litt eller at det blir færre av
dem. P. aeruginosa er en type bakterier som er resistente mot mange beta-laktamantibiotika
på grunn av porinene (1).
2.6 Resistensbestemmelse generelt og metoden (MIC) spesielt
MIC står for minimum inhiberende konsentrasjon av et antibiotikum, (minimal inhibitory
concentration) og verdien oppgis i µg/ml. Det er viktig for klinikerne å få vite MIC verdien til
bakterien som forårsaker infeksjon i pasienten. Ved å vite MIC verdien er det lettere for dem å
få en korrekt behandling av infeksjonen. MIC verdier er nyttige i behandlingen av sepsis,
lungebetennelse, endokarditt, og behandling av høy-risiko pasienter som cystisk fibrose
pasienter og immunkopromitterte (9).
MIC kan måles på tre forskjellige måter. Den første metoden er en buljongfortynnings test.
Da settes det opp buljong med forskjellig konsentrasjon av det aktuelle antibiotikumet i
stigende konsentrasjoner. Dette kan gjøres i rør eller på en microtiterplate Hvert rør øker med
to-folds konsentrasjon. Denne testen kan for eksempel begynne på 0,125 mg/l og går opp til
32 mg/l. En aktuell MIC verdi blir bestemt og målt ved det første røret med buljong i som det
ikke er vekst i. Man kan og benytte agarskåler med økende konsentrasjoner av antibiotikumet.
En annen metode å bestemme MIC til en stamme er å benytte seg av agardiffusjonsmetoden
som består av papirlapper som er impregnert med forskjellige konsentrasjoner av
antibiotikumet. Antibiotikumet vil diffundere ut i mediet og det vil bli dannet runde soner
9
rundt lappene. Ved vekst inntil lappen har ikke den aktuelle konsentrasjonen klart å hemme
veksten av bakterien. Sonen som oppstår rundt lappen kalles en hemmingssone og denne
sonen kan korreleres til MIC verdien til bakterien. Den tredje metoden er en kombinert
agardiffusjonsmetode og agarfortynningsmetode (10).
I denne metoden benyttes strimler med impregnert antibiotika i økende konsentrasjoner
oppover strimmelen. E-test og MIC Test Strip er slike konsentrasjonsgradient strimler.
Stripsen er impregnert med økende konsentrasjoner med antibiotikum. To-folds fortynningen
er markert på strimmelen samt alle halve fortynningstrinn. Antibiotikumet vil diffundere ut i
mediet og det dannes en ellipse formet sone rundt strimmelen. MIC leses av der kanten av
vekstsonen krysser strimmelen (11).
Ved anvendelse av MIC kan man så si noe om bakteriestammen er resistent, intermediær og
sensitiv. Dette kalles SIR systemet og klinikerne får da oppgitt om de aktuelle bakteriene fra
en pasient er sensitive mot et antibiotikum, eller om de er intermediære eller er resistente (12).
2.6.1 Om E-test® fra BioMérieux og om MIC Test Strip fra Liofilchem
E-test® produseres av BioMérieux og stripsen er en tynn plaststrimmel med en
forhåndsbestemt 15 trinns gradient med fortynninger av det aktuelle antibiotikumet. Det
benyttes tørr kjemi teknologi for å lage denne stripsen. E-testen kan benyttes til å bestemme
MIC verdien til en mikroorganisme. Man kan få bekreftet en spesifikk resistent type som
extended-spectrum beta-lactamese (ESBL). Stripsen kan også benyttes for å oppdage lave
nivåer med resistens i en mikrobe. E-test® kan benyttes til over 100 antimikrobielle referanser
innenfor kategoriene antibiotika, antifungal, antimycobacterium og resistens fenotypetesting
(13).
MIC Test Strips produseres av Liofilchem og som E-testen inneholder også denne en gradient
med fortynninger på 15 trinn. MIC Test Strip er en impregnert papir strimmel. Strimmelen
impregneres med en forhåndsbestemt gradient av antibiotikumet. MIC Test Strips finnes også
for over 100 forskjellige antimikrobielle midler innenfor de samme kategoriene som E-test
(14).
10
2.7 Dyrkningsmedier til resistensbestemmelse.
Liofilchem som produserer MIC Test Strip anbefaler at man bruker Mueller -Hinton Agar II
til aerobe bakterier og at det benyttes Brucella med blod til anaerobe bakterier ved
resistensbestemmelsen. Mediene som ble brukt i verifiseringen er kort beskrevet under.
-
RPMI 1640 inneholder MOPS og 2 % glukose benyttes ved resistensbestemmelse av
antifungale midler ved Candida ssp (15).
-
Brucella med blod er et næringsrikt medie. Det inneholder hemin og vitamin K1, samt
blod. Mediet er et ikke-selektivt medie og kan benyttes til dyrkning og antibiotika
resistens bestemmelse ved anaerobe bakterier (16).
-
Mueller –Hinton (MH) er en næringsrik skål som inneholder kjøtt ekstrakt, kasein
hydrolysat, stivelse og agar. Dette mediet er et ikke-selektivt og ikke-differensiert
medium. Dette mediet benyttes primært til resistensbestemmelse i kliniske
laboratorium. Agaren er løs og gir dermed en god diffusjon av antibiotikumet i agaren.
I tillegg absorberer stivelsen toksiner som noen bakterier produserer, dette er viktig da
toksinene kan interferere med antibiotikumet (17).
-
Mueller-Hinton med blod inneholder det samme som Mueller- Hinton, men har tilsatt
blod slik at kravstore bakterier vokser bedre.
-
Mueller- Hinton Fastidios (MH-F) inneholder 5 % hesteblod og 20 mg/L beta-NAD.
Dette er et næringsrikt medie og er anbefalt å bruke på kravstore bakterier som
Streptokokker og Haemophilus specier (18)
3. Formål med studien
Formålet med studien er å verifisere valideringen til Helse Vest av MIC Test Strip før de
eventuelt skal innføres i rutinen ved Bakteriologisk enhet ved Nordlandssykehuset. Sammen
med metodesammenligningen mellom E-test og MIC Test Strip sammenlignes medium som
benyttes i rutinen i dag mot medium som er anbefalt fra leverandøren av de nye strimlene.
Grunnen til at dette gjøres er at rutinen nå benytter annet medium til resistens bestemmelse
enn det som er anbefalt fra produsent. Valideringen undersøker antibiotika, ATCC stammer
og kliniske stammer som er mest brukt i rutinen. I både verifiseringen og undersøkelsen på
nytt medium ble det satt en grense på forskjell i metoder på maks 2 fortynningstrinn.
11
4. Materialer og metoder
Antibiotikaene som er valgt i dette forsøket er valgt i samarbeid med fagansvarlig bioingeniør
og to overleger innenfor mikrobiologi tilhørende Bakteriologisk enhet ved
Nordlandssykehuset. Antibiotikaene ble valgt ut i fra hva som benyttes mest innenfor rutinen
og at det ble et bredt spekter innenfor virkemekanismen til antibiotikaene og at det var
antibiotikaer innenfor de forskjellige gruppene, som penicilliner og cefalosporiner.
Isolatene i dette forsøket ble valgt ut i forhold til de antibiotika som man ved Bakteriologisk
avdeling ved Nordlandssykehuset i Bodø ønsket å sammenligne med den etablerte metoden
E-test. Det ble valgt minst en ATCC-stamme med kjent referanseområde til hvert
antibiotikum for å ha som en fasit i forhold til avlesning av MIC. De kliniske stammene ble
valgt ut ved å finne isolater med kjent resistent og kjent sensitivitet mot antibiotikumet og
fordi det er disse som oftest resistent-testes mot antibiotikaene i forsøket. Alle isolatene og
stammene ble inokulert på skål som beskrevet i Tabell 1 og inkubert i tidsintervallene som
leses i tabell 1.
4.1 Bakterier- og soppstammer
Tabell 1: Oversikt over antibiotikum, ATCC-stammer, kliniske stammer, RID nummer, resistens skåler,
McFarland (McF) og inkuberingstiden til alle isolatene.
Antibiotika
ATCC-stammer
Kliniske stammer
RID
Res.
McF
Inkuberingstid (t)
1
24 – 72
MH
0,5
16 – 20
MH
0,5
16 – 20
MH
0,5
24
skål
Metronidazol
Bacteroides
B. fragilis
60741668
fragilis ATCC
B. fragilis
60767363
MH
25285
Clostridium
60786963
m/blod
Brucella
perfringens
Ceftazidim
C. perfringens
60703174
Echerichia coli
P. aeruginosa
60739770
ATCC 25922
P. aeruginosa
60773325B
Pseudomonas
E. coli
60740876
aeruginosa
E. coli (ESBL)
60748781
ATCC 27853
Klebsiella
60741160
pneumoniae
Ciprofloxacin
E. coli ATCC
P. aeruginosa
60739770
25922
P. aeruginosa
60773325B
P. aeruginisa
E. coli
60740876
ATCC 27853
K. pneumoniae
60741160
Staphylococcus
60739406
aureus
Gentamicin high
Enterococcus
E. faecalis
faecalis ATCC
(HLAR)
60755525
12
Meropenem
Ampicillin
Penicillin low
Vancomycin
Klindamycin
Fluconazole
29212
E. faecalis
60739770
(24t)
P. aeruginosa
60739770
E. coli ATCC
P. aeruginosa
60773325B
25922
E. coli
60740876
E. coli ATCC
P. aeruginosa
60739770
25922
P. aeruginosa
60773325B
P. aeruginisa
E. coli
60740876
ATCC 27853
E. coli
60748781
K. pneumoniae
60741160
Streptococcus
S. pneumoniae
60745634
pneumoniae
S. pneumoniae
60775874B
ATCC 49619
Streptococcus
60769550
Haemophilus
pyogenes
influenzae ATCC
H. influenzae (R)
60599134
49247
H. influenzae (S)
60599381
S. pneumonia
S. pneumonia (R)
Dips 61130
ATCC 49619
S. pneumonia (I)
60775874B
S. pneumonia (S)
60745634
S. pyogenes
60769550
S. pyogenes
60777836
E. faecalis
S. aureus
60739406
ATCC 29212
Staphylococcus
60744118
E. faecalis
epidermidis MR
ATCC 51299
E. faecalis (S)
60739770
S. aureus ATCC
E. faecalis (S)
60740221
29213
E. faecalis (R)
60774522B
S. aureus ATCC
S. pneumoniae
60775874B
MH-F
29213
S. pneumoniae
60745634
MH
S. pyogenes
60769550
m/blod
S. aureus (S)
60739406
S. aureus (R)
60417991
Candida
C. albicans
60741845
albicans ATCC
C. albicans
60714385
90028
Candida glabrata
60787015
C. glabrata
60733681
Candida
60739771
16 – 20
MH
0,5
16 – 20
0,5
20 – 24
0,5
20 – 24
0,5
24
0,5
16 – 20
0,5
24 – 48
MH-F
MH
m/blod
MH-F
MH-F
MH
m/blod
MH
MH
RPMI
dublinensis
13
4.1.1. Materialer:
Tabell 2: oversikt over alle materialer som ble brukt i verifiseringen.
Innhold
Leverandør
Produktnummer
Skåler:
Mueller Hinton
Mueller Hinton Agar
Oxoid
CM – 0337
MH m/blod
Mueller Hinton II Agar
Oxoid
CM – 0337
Oxoid
CM - 0337
Hesteblod
MH-F
Mueller Hinton Agar
Hesteblod
NAD Selectavial
Brucella
Agar med Hemin og vit.
Fluka Analytical
K1
Hesteblod
RPMI 1640
Agar Bacteriological
Oxoixd
LP - 0011
Glukose
Merck
1.08342
RPMI 1640
Sigma
R – 1383
MOPS buffer
M - 3183
NaOH 5M
Blod
Blood Agar Base no. 2
Oxoid
CM – 0271
Oxoid
CM – 0233
Oxoid
CM – 367
Hesteblod
Laktose
Tryptose Blood Agar
Base
Laktose BTB
GK
Gc Agar Base
Hesteblod
E – 5 løsning
Glukoseløsning
Saboraud
Saboraud Glukose Agar
Merck
1.05438
Saltvann 0,85 %
Natriumklorid
Merck
1. 06404
Glukosebuljong 1 %
Veal Infusion Broth
Difco
234420
E-test
Biomérieux
MIC test strip
Liofilchem
Leveres av Montebello
14
4.1.2. Instrumenter/hjelpemidler:
Tabell 3: oversikt over alt av utstyr brukt i verifiseringen.
Type
Produsent
CO2 inkubator
Steri-cycle CO2 incubator
Thermo electron
HEPA class 100
corporation
Inkubator
Thermals
Kjøleskap
Bosch
Rotator
EPA
AES laboratorie
Densitometer
DensiCHEK plus
Biomerieux
Øser
Blå, 10µl
Sarstedt
Ref.nr 86.1562.050
Blanke, 1µl
Sarstedt
Ref. nr 86.1567.050
Meditip clean
Mediware
Bomullspinner
Anaerobe kolber
Mikroprossessor
MART
Anoxomat
MART
Omdanner miljøet inni
kolbene til anaerobt miljø
Dispenser
Dispensette
®
BRAND
Stativ
Glassrør
5 ml
Sarstedt
4.2 Metode
Alle valgte ATCC stammer og de kliniske stammene ble funnet i blodkulturarkivet og hentet
ut av -70oC fryseren og spredd på skåler.
Tillaging av inokulat til kravstore bakterier gjøres i glukosebuljong og til ikke kravstore
bakterier og sopp brukes saltvann til tillaging. Kravstore bakterier må inkuberes i 5 % CO2,
mens ikke kravstore inkuberes ved vanlig atmosfære ved 35oC.
4.2.1 Forberedelse
Alle stammene må spres på ny skål og inkuberes over natt før inokluering.
E-tester og MIC test strips må hentes ut av fryseren (-20o) 1 time før de tas i bruk.
15
4.2.2 Utførelse
1. Hent 5 til 10 kolonier fra skålen med en bomullspinne og ha i saltvann. Løsningen skal
være homogen og den måles på et densitometer til ønsket tetthet er oppnådd. Det er viktig å
hente materiale fra forskjellige kolonier siden det kan være forskjellig genetisk materiale i de
forskjellige koloniene som påvirker antibiotikaresistensen.
2. Suspensjonen inokuleres på skål. En bomullspinne dyppes i suspensjonen og overflødig
væske presses av på innsiden av glasset. Skåla plasseres på en rotator og man fører penselen
sakte over skåla mens den roterer en gang. Pass på at det blir en tett inokulering.
Obs! Ved inokulering av sopp skal bomullspinnen dyppes to ganger og strykes over skålen to
ganger.
3. Spre fra suspensjonen på en renhetsskål.
4. De inokulerte skålene må tørkes på benk ved at de plasseres utover uten lokk. 10 – 15
minutter.
5. Når skålen er tørr kan en E-test/MIC test strip legges på agaren. Denne må legges med
skriften opp og den må ikke flyttes på etter at den er lagt på agaren.
6. Skålene inkuberes så etter Tabell 1.
4.2.3 Avlesning
Skålene leses av etter inkubasjonstiden er ferdig. MIC verdien leses av der hemningssonen
treffer stripsen. Baktericide antibiotika leses av ved komplett veksthemming og
bakteriostatiske antibiotika leses av ved 80 % veksthemming når det er slørdannelse. (19) (20)
Figur 4 viser et eksempel på tilsvarende MIC test strip og E-test satt opp på samme
bakterieisolat. MIC verdien skal leses av ved hemmingssonens rand, eller om den er mellom
to streker skal den leses av ved høyeste konsentrasjon.
16
Figur 4: MH skål inokluert med S.epidermis MR 60744118. Til venstre ser man resistensskål med MIC test
strip og til høyre sees skål med E-test. Det er en lik sone rundt begge stripsene og sonen ender omtrent ved
1,5 µg/l.
5. Resultater
5.1 Verifisering av korrelasjonen mellom E-test og MIC test strips.
Til denne verifiseringen ble det valgt ut 9 ATCC stammer og 30 forskjellige stammer hentet
fra rutinen. Av disse stammene ble det tatt med stammer med kjent resistent og stammer med
kjent sensitivitet for det aktuelle antibiotikumet. Et eksempel er H. influenzea 60599134 som
er resistens mot Ampicillin og H. influenzea 60599381 som er sensitiv mot Ampicillin. Totalt
er det tatt med 6 resistente stammer med i forsøket. Ved å se i tabell 1 ser man at dette gjelder
for antibiotikaene; Ceftazidim, Gentamicin, Ampicillin, Penicillin, Vancomycin og
Klindamycin. Det ble bestemt at det i tillegg til ATCC stammer ved hvert antibiotikum skulle
være 5 stammer fra rutinene. Disse stammene ble valgt ut ifra hva som er vanlig å benytte ved
de aktuelle antibiotikaene og at de dekte hele spekteret med MIC verdier der det var mulig.
Alle stammene ble inokulert en gang og MIC verdien ble lest av med ½ fortynningstrinn av
tre forskjellige bioingeniører.
Repeterbarhetene til alle antibiotikaene som var med i forsøket ble beregnet for alle tre
avlesningene. Resultatet av repeterbarheten for avlesing sees i tabell 4. Tabellen viser også en
17
metodesammenligning mellom E-test og MIC test strips mellom hvert av de utprøvde
antibiotikaene.
Tabell 4:Oversikt over alle antibiotikaene og gjennomsnittlige avvik av fortynningstrinn i prosent for
repeterbarhetene og for metodesammenligningen av E-test/ MIC test strips.
Repeterbarhet til MIC Test Strip (avlesing)
% =±0
%≤±½
% ≤ ± 1
% ≤ ± 2
Metodesammenligning E-test / MIC test strips
% =±0
% ≤ ± ½
% ≤ ± 1
R2
% ≤ ± 2
Metronidazol
40 %
100 %
100 %
100 %
0%
20 %
20 %
100 %
0,8684
Ceftazidim
29 %
100 %
100 %
100 %
0%
57 %
71 %
100 %
0,9639
Ciprofloxacin
Gentamicin
High
14 %
100 %
100 %
100 %
17 %
100 %
100 %
100 %
0,9881
57 %
100 %
100 %
100 %
29 %
100 %
43 %
100 %
0,9739
Meropenem
71 %
100 %
100 %
100 %
14 %
86 %
100 %
100 %
0,9976
Ampicillin
14 %
100 %
100 %
100 %
0%
86 %
100 %
100 %
0,9913
Penicillin Low
33 %
100 %
100 %
100 %
17 %
100 %
100 %
100 %
0,9952
Vancomycin
63 %
75 %
100 %
100 %
0%
75 %
75 %
100 %
0,9714
Klindamycin
33 %
100 %
100 %
100 %
17 %
100 %
100 %
100 %
0,9989
Fluconazole
17 %
67 %
100 %
100 %
17 %
100 %
100 %
100 %
0,9939
100 %
100 %
11 %
82 %
81 %
100 %
Gjennomsnitt
1
For repeterbarheten viser kolonne 1; % = ±0, viser hvor mange prosent av avlesningene som er helt like.
Kolonne 2; % ≤ ± ½, viser hvor mange prosent av avlesningene som har mindre enn eller lik ett halvt
fortynningstrinn i forskjell, den tredje kolonnen viser hvor mange av avlesningene som har mindre enn eller lik
ett helt fortynningstrinn i forskjell. Den siste kolonnen;; % ≤ ± 2 viser hvor mange avlesninger som har mindre eller lik to fortynningstrinn i forskjell.
2
For metodesammenligningen viser kolonne 1 hvor mange avlesninger som var helt like mellom de to metodene.
Kolonne 2 viser hvor mange avlesninger som er mindre enn eller lik et halvt fortynningstrinn mellom de to
metodene. Videre viser kolonne 3 hvor mange avlesninger som er mindre enn eller like ett fortynningstrinn
forskjell mellom metodene. Kolonne 4 viser hvor mange avlesninger som er mindre enn eller lik to
fortynningstrinn mellom E-test og MIC Test Strip. Den siste kolonnen viser korrelasjonen mellom de to
metodene.
For alle antibiotikaene ble det satt opp et histogram der man ser visuelt hvor mange av
isolatene som har ingen, en halv, ett, ett og et halvt eller to fortynningstrinn i avvik mellom Etest og MIC test strip. Figur 2 viser histogramet for antibiotikumet Klindamycin. Her ser man
at ingen isolater har mer enn et halvt fortynningstrinn i forskjell mellom avlesningen gjort
med E-test og avlesningen gjort med MIC test strip. Histogramet viser i tillegg til
gjennomsnittet alle avlesningene gjort av de tre bioingeniørene.
18
Avvik MIC test strip/E-test
6
5
Antall
4
1.avlesning
3
2.avlesning
2
3.avlesing
1
Gjennomsnitt
0
±0
± 0.5
±1
± 1.5
±2
± >2
Avvik fortynningstrinn
Figur 5: Avvik i fortynningstrinn mellom MIC test strip avlesningen og E-test avlesningen for
antibiotikumet Klindamycin.
Det ble også satt opp en korrelasjonsgraf mellom E-test og MIC test strip. Korrelasjonen viser
hvor like de to testene er. R-kvadrat (R2) er også oppgitt og forteller hvor mange % av
avlesningene som er helt like. I eksempelet under er 99,9 % likt avlest når man sammenligner
gjennomsnittet av de tre avlesingene.
Korrelasjon MIC test strip/E-test
1000,0
y = 0,8601x1,0283
R² = 0,9989
MIC test strip
100,0
0,0
1.avlesning
2.avlesning
10,0
3.avlesing
1,0
0,1
1,0
10,0
100,0
1000,0
Gjennomsnitt
0,1
0,0
E-test
Geometrisk
(Gjennomsnitt)
Figur 6: Graf som viser korrelasjonen mellom MIC test strip og E-test for Klindamycin. X-aksen viser
avlesningene med E-test og y-aksen viser avlesningene med MIC test strip. Aksene er logaritmiske.
Korrelasjonen er god ved at R2=0,9989.
19
Den samlete oversikten over alle antibiotikaene sees i figur 7. Dette stablede histogrammet
viser hvor mange isolater som er like. Og hvor mange isolater som har ett halvt, ett, ett og ett
halvt, to og over to fortynningstrinn i forskjell. Ingen isolater har mer enn +/- 1.5 avvik i
fortynningstrinn mellom avlesningene av E-test og MIC test strips.
9
8
7
6
± >2
5
±2
4
3
± 1.5
2
±1
1
± 0.5
0
±0
Figur 7: Samlet oversikt over alle antibiotikaene i verifiseringen og hvor mye avvik i fortynningstrinn det
er mellom avlesning på E-test og MIC test strip.
MIC verdier fra undersøkelser i laboratoriet omgjøres til SIR systemet til klinikerne. De får
oppgitt om stammen er resistent (R), intermediær (I) eller sensitiv (S). Seks stammer i
forsøket er oppgitt som resistente og 5 er oppgitt som sensitive og 1 er oppgitt som
intermediær.
Tabell 5: MIC verdier for E-test og MIC Test Strip og EUCATs brytningspunkter i SIR systemet
Stammer
Nr.
S≤
R>
E-test
MIC Test Strip
E.coli
(ESBL)
E. faecalis (HLAR)
H. influenzae (R)
H. influenzae (S)
S.pneumonia (R)
S.pneumonia (I)
S.pneumonia (S)
E. faecalis (R)
E. faecalis (S)
E. faecalis (S)
S. aureus (R)
S. aureus (S)
60748781
60755525
60599134
60599381
Dips 61130
60775874B
60745634
60774522B
60739770
60740221
60417991
60739406
1
4
4
2
128
128
1
1
0,06
2
4
4
0,25
0,5
1024
32
0,5
1,0
0,5
0,04
10
1,6
1,5
256
0,1
1024
29
0,2
1,1
0,5
0,05
8
1,3
1
256
0,1
20
5.2 Reproduserbarheten og repeterbarheten til MIC Test Strips
Reproduserbarheten og repeterbarheten ble undersøkt for MIC Test Strips med to ATCC
stammer; S.aureus ATCC 29213 og E.coli ATCC 25922. Det ble satt opp 10 uavhengige
inokulater med 0,5 McF. Og alle 10 fra hver stamme ble inoklulert på resistens skål. MIC Test
Strip for antibiotikaene Vancomycin og Ceftazidim ble lagt på skålene. Neste dag ble skålene
lest av tre forskjellige personer. Resultatene for S.aureus ATCC 29213 sees i tabell 5 og
resultatene for E.coli ATCC 25922 sees i tabell 6.
Tabell 5: Reproduserbarheten og repeterbarheten til MIC test strips for 10 oppsett med 0,5 McF
inokulater av S. aureus ATCC 29213 med antibiotikumet Vancomycin. Alle verdier er oppgitt i mg/l.
Reproduserbarhet
Avlesning
1
2
3
gjennomsnitt
median
# ± ∆½
# ± ∆1
#±
∆>1
S.aureus
1
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0
0
0
ATCC 29213
2
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0
0
0
3
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0
0
0
4
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0
0
0
5
0,75
0,75
0,50
0,66
0,75
1
0
0
6
1,00
1,00
1,00
1,00
1,00
0
0
0
7
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0
0
0
8
0,75
0,75
0,50
0,66
0,75
1
0
0
9
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0
0
0
10
0,75
0,75
0,75
0,75
0,75
0
0
0
gjennomsnitt
0,78
0,78
0,73
2
0
0
median
0,75
0,75
0,75
20 %
0%
0%
min
0,75
0,75
0,50
max
1,00
1,00
1,00
antall utenfor
0
0
0
1
1
1
Repeterbarhet:
referanse
intervallet
antall = target
1
Referanse intervall for S. aureus ATCC 29213 på vancomycin : 0,5 – 2 mg/L. Targetverdi: 1 mg/L
På reproduserbarhet viser kolonne 1 gjennomsnittet mellom de tre avlesningene, kolonne 2 viser medianen til
de tre avlesningene, kolonne 3 viser antall avlesninger som skiller mer eller mindre enn et halvt fortynningstrinn,
kolonne 4 viser antall avlesninger som skiller mer eller mindre et fortynningstrinn og kolonne 5 viser antall
avlesninger som skiller mer enn ett fortynningstrinn.
2
21
Tabell 6: Reproduserbarheten til MIC test strips på 10 oppsett med 0,5 McF inokulater av E.coli ATCC
25922 med antibiotikumet Ceftazidim. Alle verdier er oppgitt i mg/l.
Reproduserbarhet
#±
1
2
3
geo.gj.snitt
median
E.coli
1
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0
0
0
ATCC 25922
2
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0
0
0
3
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0
0
0
4
0,38
0,25
0,25
0,29
0,25
1
0
0
5
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0
0
0
6
0,38
0,25
0,25
0,29
0,25
1
0
0
7
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0
0
0
8
0,38
0,25
0,38
0,33
0,38
1
0
0
9
0,38
0,25
0,25
0,29
0,25
1
0
0
10
0,25
0,25
0,25
0,25
0,25
0
0
0
gjennomsnitt
0,30
0,25
0,26
4
0
0
median
0,25
0,25
0,25
40 %
0%
0%
min
0,25
0,25
0,25
max
0,38
0,25
0,38
0
0
0
6
10
9
Repeterbarhet
antall utenfor
referanseintervallet
antall = target
1
2
∆½
# ± ∆1
#±
Avlesning
∆>1
Referanseintervall for E.coli ATCC 25922 for ceftacidim: 0,06 – 0,5 mg/L. Targetverdi: 0,12 – 0,25 mg/L
For forklaring på kolonner se tabell 5 over.
22
Tabell 7: Referanseintervallet til ATCC stammene til de forskjellige antibiotikaene. Alle verdier er oppgitt
i mg/L
B.fragilis
C.albicans
E.coli
E.
E.faecalisATCC
H.influenzea
P.
S.
S.
ATCC
ATCC
ATCC
faecalis
51299
ATCC 49247
aeruginosa
aureus
pneumoniae
25285
90028
25922
ATCC
ATCC
ATCC
ATCC 49619
29212
27853
29213
Ampicillin
2–8
0,06 – 0,25
(0,12)
Ceftazidim
0,06 –
1–4
0,5
(2)
(0,12 –
0,25)
Ciprofloxacin
0,004 –
0,25 – 1
0,015
(0,5)
(0,008)
Fluconazol
0,125 – 0,5
Gentamicin
0,25 – 1
4 – 16
High
(0,5)
(8)
Klindamycin
0,06 –
0,25
(0,12)
Meropenem
0,008 –
0,25 – 1
0,06
(0,5)
(0,0150,03)
Metronidazol
0,25 – 1
Vancomycin
1–4
resistent
(2)
1
0,5 – 2
(1)
Target til da antibiotikumet som har oppgitt target er satt i ( ) i tabellen.
5.3 Sammenligning av medier.
Bakteriologisk enhet ved Nordlandssykehuset Bodø ønsket i tillegg til verifiseringen å
undersøke to nye medier til bruk når man resistensbestemmer med MIC test strips. Disse
mediene er Brucella som brukes ved resistensbestemmelse på anaerobe isolater og MH-F som
benyttes på kravstore bakterier. MH-F benyttes nå i rutinen til lappediffusjonsmetoden og til
E-test ved Haemophilus. MH med blod brukes i dag til alle andre kravstore bakterier ved
undersøkelser med E-test. Grunnen til at man vil undersøke disse to mediene er at Brucella
anbefales på anaerobe bakterier og MH-F likestilles med MH med blod ved MIC Test Strips
til streptokokker, pneumokokker.
Kriteriet om at mediet forkastes om det er < +/- 2 fortynningstrinn mellom avlesningene ble
satt.
23
5.3.1 Sammenligning av anbefalte medier med MH med blod
Det ble satt opp MIC Test Strips på de anbefalte mediene fra produsenten og på resistens
skåla MH med blod som benyttes i rutinen. De resistensskålene som er anbefalt fra produsent
er å benytte Brucella med blod ved analysering av anaerobe og MH-F kan benyttes ved
analysering av kravstore bakterier.
6
5
5
4
4
3
Antall
Antall
Resultatene fra sammenligningen mellom mediene sees i figur 8.
2
Ampicillin
2
1
Penicillin Low
1
0
3
0
±0
± 0.5
±1
± 1.5
±2
Avvik fortynningstrinn
± >2
Clindamycin
± 0 ± ± 1 ± ± 2 ± >2
0.5
1.5
Avvik fortynningstrinn
Figur 8:Histogram til venstre viser avvik i fortynningstrinn mellom Brucella og MH med blod ved bruk
av MIC Test Strip med Metronidazol. Histogram til høyre viser avvik i fortynningstrinn mellom MH-F og
MH m/blod. Sammenlignet med antibiotikaene Ampicillin, Penicillin og Klindamycin fra MIC Test Strip.
Stammene som ble brukt i forsøket er de samme som sees under de respektive antibiotikaene i Tabell 1 for
Metronidazol og Streptococcus pneumoniae og Streptococcus pyogenes stammer ble undersøkt for
Ampicillin, Penicillin og Klindamycin.
6. Diskusjon
6.1 Metodesammenligning mellom E-test og MIC Test Strip
Tabell 4 i resultater viser en oversikt over Metodesammenligningen mellom E-test® og MIC
Test Strip. Tabellen viser at alle avlesningene som ble gjort hadde mindre enn to
fortynningstrinn i forskjell mellom de to metodene. Det er altså ingen avlesninger som skiller
så mye som to fortynningstrinn i forskjell mellom E-test® og MIC Test Strip. Det vil si at
kriteriet for verifiseringen er godkjent og metodene er like nok. Ser man på de andre
kolonnene er det noen av antibiotikaene som har likere avlesning enn andre og 89 % av
antibiotikaene har bare et halvt fortynningstrinn i forskjell mens 88 % har ett fortynningstrinn
i forskjell mellom de to metodene.
24
Repeterbarheten mellom avlesningen sees også i tabell 4 viser også at ingen avlesninger har
mer enn ett fortynningstrinn mellom avlesningene. Det er og bare Mitronidazol og
Fluconazole som har avlesninger som her mer enn ett og ½ fortynningstrinn i forskjell mellom
avlesningene, henholdsvis. Fluconazole som benyttes på sopp stammer er vanskelige å lese av
på grunn av at det blir slørvekst over hele skålen. Resultatene viser at det er god repeterbarhet
på avlesningene og man kan dermed stole på at resultatene man ser i metodesammenligningen
er riktig. Det er ikke stor forskjell mellom de tre avleserne. Alle tre har lest av MIC verdien til
det aktuelle antibiotikumet med god likhet.
Metodesammenligningen mellom E-test og MIC Test Strip er også vist i figur 7 illustrert med
et stablet histogram. Her er resultatet satt opp etter antall stammer i motsetning til tabell 4 som
viser resultatet i prosent. Denne figuren illustrerer godt at det ikke er noen stammer som har
mer enn 1,5 fortynningstrinn i forskjell mellom de to metodene. Grafen illustrerer at det stort
sett er et halvt fortynningstrinn i forskjell mellom avlesningen på de to metodene. De er altså
like nok til at Bakteriologisk enhet kan bytte leverandør.
Grafen i figur 7 viser og at Metronidazol og Gentamicin (High) har høyere andel avlesninger
med 1,5 fortynningstrinn i forskjell. Det er 80 % av avlesningene for Metronidazol som har en
forskjell på mer 1,5 fortynningstrinn og 57 % av avlesingen for Gentamicin (High) som har en
forskjell på 1,5 fortynningstrinn. Begge har 4 stammer som gir 1,5 fortynningstrinn i forskjell.
De er begge innenfor kriteriet om at svaret på MIC må være innenfor 2 fortynningstrinn for at
forskjellen på metodene ikke regnes som for stor. Alle bakteriestammene som var med i
forsøket var altså innenfor det satte kriteriet for verifiseringen.
6.1.1 MIC verdier til ATCC stammer mot fasit
ATCC stammer ble tatt med som fasiter på avlesningen av MIC verdiene. Alle ATCC
stammene har oppgitte referanse områder til forventet MIC verdi for hvert aktuelle
antibiotikum. Sett fra rådataene var det bare noen få som lå litt utenfor referanseområdet når
man sammenligner med gjennomsnittet til alle avlesningene for E-test og MIC Test Strip.
Disse var E.coli ATCC 25922 ved bruk av Ceftazidim. E-test MIC verdien er for høy.
Referanseområdet er på 0,06 – 0,5 mg/l og gjennomsnittlig avlesning viser 0,75 mg/l.
MIC avlesningen på både E-test og MIC Test Strip for Ciprofloxacin ved inokulat med
P.aeruginosa ATCC 27853 viser litt lavere MIC verdi enn referanseområdet.
25
Referanseområdet er på 0,25 – 1 mg/l og avlesningen ved E-test gir en MIC på 0,239 mg/l og
MIC Test Strip gir en MIC på 0,208 mg/l.
Ved å benytte ATCC stammer kan man altså undersøke at forsøket har vært korrekt og utført
riktig. Man får testet testbetingelsene som medium, inkuberingstid og miljø. Disse kontroll
stammene bør komme innenfor referanseverdiene for at man kan godta at forsøket ble utført
korrekt. Når en ATCC stamme havner utenfor referanseverdiene må man sette opp testen på
nytt. I dette forsøket ble det ikke tid til å repetere forsøket, men det er noe som bør bli gjort
før man tar i bruk MIC test strip i rutinen.
6.2 Reproduserbarheten til MIC Test Strip
Ved verifisering av en ny metode til et klinisk rutine laboratorium må man undersøke
reproduserbarheten til den nye metoden. Dette ble gjort i denne verifiseringen med MIC Test
Strip og man undersøkte antibiotikaene Vancomycin og Ceftazidim. Vancomycin ble testet på
10 forskjellige inokulater av S.aureus ATCC 29213 og Ceftazidim ble testet på 10 forskjellige
inokulater av E.coli ATCC 25922 og avlest av tre bioingeniører. Resultatene av
reproduserbarheten sees i tabell 6 og 7. Tabellene viser både reproduserbarheten og
repeterbarheten til hver avleser. Reproduserbarheten til både Vancomycin og Ceftacidim med
MIC Test Strip er god. Ved de ti forskjellige inokulatene laget med S.aureus ATCC 29213 er
det bare 20 % som har et halvt fortynningstrinn i forskjell, dermed er 80 % av avlesningen
mellom tre personer helt like. De ti forskjellige inokulatene laget med E.coli ATCC 25922
viser at 40 % av dem har ett halvt fortynningstrinn i forskjell. Her er da 60 % helt like. Alle de
ti avlesningene til begge antibiotikaene er innenfor ett fortynningstrinn og dette er bra siden
MIC verdier ikke oppgis i halve fortynningstrinn men i hele. Reproduserbarheten har liten
spredning og alle målingene er innenfor ± et halvt fortynningstrinn.
De to ATCC stammene kom begge innenfor det oppgitte referanseområdet hvilket betyr at
man kan stole på at resultatene man får er riktige og at MIC verdien lest av til hver strip er
riktig. Dette er viktig når man skal bytte til en ny metode i en klinisk rutine lab der man
arbeider med pasientprøver. Klinikeren benytter seg av det svaret som oppgis som SIR
kategorier basert på MIC verdien til det aktuelle antibiotikumet og da må man kunne stole på
at man får riktig svar ved hver strips som brukes.
I samme tabell ser man repeterbarheten til hver avleser og man kan se fra resultatene at de tre
avleserne har ganske like svar. Gjennomsnittsverdien mellom de tre avleserne varierer bare
26
med noen desimaler og disse verdiene er innenfor referanseverdiene. Repeterbarheten og
reproduserbarheten ble og undersøkt i valideringen til Helse Vest (se vedlegg 1). De benyttet
20 individuelle inokuleringer av stammene som ble undersøkt, i denne verifiseringen benyttet
vi bare 10 da det allerede fra Helse Vest var utført en god undersøkelse på repeterbarheten.
Resultatene fra denne verifiseringen i forhold til repeterbarheten til MIC Test Strip er det
samme resultatet som Helse Vest har fått.
Tabell 5 viser en oversikt over MIC verdiene til de stammene med kjent SIR kategorisering.
Alle stammene utenom S. pneumoniae (R) Dips 61130 viste samsvar med tidligere resultater.
I tilfellet for S. pneumoniae på Penicillin var ikke denne resistent slik tidligere oppgitt. Ved
avlesningene gjort i denne verifiseringen ble den kategorisert som intermediær. Grunnen til
dette kan være at brytningspunktene er forandret da akkurat denne prøven er en gammel prøve
>8 år. Totalt sett gir begge strimlene samme svar når man omgjør avlest MIC verdi til SIR
kategorisering.
I verifiseringen ble 30 stammer fra rutinen og 9 ATCC stammer benyttet. Dette er omtrendt i
samme størrelsesorden som Helse Vests validering (vedlegg 1) av de to metodene. Der
benyttes det 31 kontrollstammer. Andre studier som har sammenlignet metodene har benyttet
flere stammer fra 80 (21) til 125 (22). Det ble enighet mellom ansvarlig bioingeniør og
overlegene på Bakteriologisk enhet om at utvalget var tilfredsstillende med tanke på at dette
er en verifisering av en validering.
6.3 Utfordringer i rutinen ved et bytte av metode til resistens bestemmelse med MIC verdi
Ved Bakteriologisk enhet benytter man nå E-test fra Biomérieux og denne metoden er godt
innarbeidet. Alle vet hvordan man skal legge de på, hvordan de skal oppbevares og hvordan
de skal leses av. Ved et eventuelt bytte av metode til MIC Test Strip kan det komme noen
utfordringer samt at noe er bedre enn med den gamle metoden.
Den største utfordringen ved bytte av metode er at kodene på strimmelen er forskjellig fra Etest til MIC Test Strip. Det kan da være lett å legge feil, eller at man registrerer feil ved
avlesning om man er vant med å bruke kodene ved avlesning. For eksempel er Metronidazol
koden LZ på MIC Test Strip og koden MZ på E-test.
27
Det er forskjell i måten man appliserer strimmelen på mellom de to metodene. Med E-test kan
man ta øverst i strimmelen med fingrene og så legge den på skåla. Denne strimmelen er laget
av plast og suger seg godt ned i agaren uten at det blir store luftbobler mellom strimmelen og
agaren. Med MIC Test Strips er det enkles å bruke en pinsett når man tar en strimmel fra
røret. Disse strimlene er også tykkere enn E-testen og de må dyttes litt nedpå for at de ligger
skikkelig ned på agaren. Ulempen her er som vi også erfarte i verifiseringen at det kan være
enkelt å forurense pinsetten. Det er enklere å applisere E-test enn MIC Test Strips siden man
kan ta E-testen med fingrene.
MIC Test Strips kommer i små plastrør på størrelse med et reagensrør og de kan oppbevares i
disse i et lite stativ ved bruk. E-testen kommer i en liten skumgummi boks som må
oppbevares i en lufttett plastboks. E-testen bruker mye mer lagringsplass enn MIC Test Strips.
Til dags dato bruker E-testen fire store lufttette plastbokser. Ved et bytte trenger man ikke like
mye plass til MIC Test Strips.
I realiteten blir det ikke de store utfordringene å bytte til ny metode i rutinen og et valg av
bytte vil nok gå bra om man er obs på at strimlene har forskjellige koder mellom metodene.
6.4 Sammenligning av medier for resistensbestemmelse
Ved bytte til ny metode var det anbefalt at man bruker Brucella m/blod til anaerobe bakterier
og at man kan bytte MH med blod til MH-F for streptokokker og pneumokokker. Brucella
med blod agaren er ikke blitt brukt før i rutinen og man vet ikke hvordan denne er i forhold til
rutinemetoden som benytter MH med blod til anaerobe nå. MH-F er allerede i bruk og det er
ønskelig å benytte kun denne slik at MH med blod da bare brukes til andre kravstore
bakterier, men som er sjeldne i forhold til streptokokker og pneumokokker. Ved bruk av Etest er det anbefalt å bruke MH med blod, men ved bruk av MIC Test Strip kan man erstatte
denne med MH-F. Ved å bytte til MH-F vil det lette litt på medieproduksjonen ved enheten da
disse allerede benyttes til annen resistensbestemmelse i rutinen.
Det ble laget inokulater av alle de anaerobe stammene som er med i verifiseringen og de ble
inokulert på både Brucella med blod skål og MH med blod skål. Resultatene som sees i figur
7 viser at alle avlesningene viser en forskjell på et halvt fortynningstrinn mellom de to
mediene. Som i verifiseringen mellom E-test og MIC Test Strip ble det satt et kriterium om at
28
forskjellen i avlest MIC ikke skulle overstige to fortynningstrinn. Forskjellen mellom Brucella
og MH m/blod er innenfor dette kriteriet og man kan da bytte til Brucella ved et bytte til MIC
Test Strip.
MH-F og MH m/blod ble sammenlignet med antibiotikaene Penicillin, Ampicillin og
Klindamycin. Resultatene som sees i figur 7 viser at også her er ikke forskjellen mellom
mediene mer enn ett halvt fortynningstrinn. Man kan dermed også her med fordel bytte til å
bare bruke MH-F ved et bytte til MIC Test Strip.
6.5 Feilkilder
Noen feilkilder skjedde under forsøket og de fleste ble rettet opp underveis, slik at resultatene
kan tolkes uten å måtte ta i betraktning feilkilder. Det var en del resistentbestemmelser som
ved avlesning var for tynne. Det var vanskelig å lese dem av og svaret hadde blitt feil når det
ikke var nok tetthet mellom koloniene. Denne feilen skyldes hovedsakelig uerfaren utøver av
inokuleringen. Alle de inokuleringene som ble for tynne ble satt opp med nytt inokulat og
avlest på nytt dagen etter.
En annen feilkilde var forurensing fra pinsetten. Dette vistes ved at det vokste en forurensing
på MIC Test Stripsene det pinsetten hadde strøket over stripsen ved påføring. Det var likevel
lett å lese av MIC verdien da forurensingen stort sett vokste på stripsen og ikke over i skåla.
Ingen ble inokluert på nytt, ved denne feilkilden.
Ved ett tilfelle var sonen rundt E-testen ikke symmetrisk, elipseformen var fin på den ene
siden, men ikke på den andre siden. På den andre siden vokste den nærmere stripsen. Dette
kan skyldes at overflaten på skåla enda var litt fuktig, slik at antibiotikumet ikke diffunderte
ut på korrekt måte. Denne E-testen ble satt opp på nytt sammen med ny MIC Test Strip for
samme antibiotikum.
Den siste feilkilden var dårlig vekst av en anaerob stamme. Det var originalt hentet opp en
anaerob stamme fra arkivet av typen C. septikum. Denne vokste ikke å kunne da ikke
benyttes. Deretter prøvde vi en ny av samme art som allerede var spred i rutinelab. Heller ikke
denne ga god nok vekst og ble forkastet. Vi forsøkte så med en tredje stamme fra en
29
inneliggende pasient, men det viste seg at denne ikke var en anaerob da det var vekst helt inn
til Metronidazol stripsen. Etter det tredje forsøket var det ikke mer tid til å få satt opp enda.
7. Konklusjon
Verifiseringen av MIC Test Strip fra Liofilchem stemte bra med resultatet som Helse Vest har
fått. Kriteriet om at forskjellen ikke måtte bli mer enn to fortynningstrinn i forskjell ble møtt i
alle de analyserte antibiotikaene og man kan dermed bytte over til ny metode fra E-test i
rutine laboratoriet også. I tillegg til at kriteriet om likhet ble møtt er reproduserbarheten også
god for MIC Test Strip og man kan stole på at MIC verdier som avleses og gis ut til klinikeren
er til å stole på og de er korrekte ved sammenligning av fasit på kjente ATCC stammer.
8. Referanser
1. Degré, M, Hovig, B og Rolland, H. Medisinks mikrobiologi. Oslo : Gyldendal Akademisk,
2008. ISBN 978-82-05-31590-7.
2. [Internett] [Sitert: 02 Mai 2013.]
http://water.me.vccs.edu/courses/env108/Lesson5_print.htm.
3. Todar, Kenneth. Bacterial Resistance to Antibiotics. Todar's online textbook og
bacteriology. [Internett] [Sitert: 7 Mai 2013.]
http://textbookofbacteriology.net/resantimicrobial.html.
4. Walsh, C. Where will new antibiotics come from? Nature Reviews. 2003, 1.
5. Davies, J og Davies, D. Origins an Evolution of Antibiotic Resistance. Mikrobiology an
molecular biology, reviews. 2010, Vol. 47, 3.
6. Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature. 2000,
406.
7. Tenover, F C. Mechanisms of Antimicrobial Rescistance in Bacteria. The American
Journal of Medicine. 2006, 119.
8. Levy, S B og Marshall, B. Nature. Antibacterial resistance worldwide: causes, challanges
and responses. [Internett] 2007. [Sitert: 21 Mai 2013.]
http://www.nature.com/nm/journal/v10/n12s/box/nm1145_BX4.html.
30
9. Biomérieux. Expertise. Minimum inhibitory concentrastion of an antibiotic. [Internett]
2013. [Sitert: 9 Mai 2013.] http//www.biomerieux.com/en/minimum-inhibitory-concentrationantibiotic.
10. Li, F M. Resistensbestemmelse med E-test. PR18413. Bodø : Helse Nord. 1.6.
11. Digranes, Asbjørn. Resistensbestemmelse av bakterier. Oslo : LEO Pharma AS, 2008.
ISBN:978-82-92347-15-7.
12. Olsvik, Ø. Antibiotikaresistens-en gammel fiende. Bioingeniøren. Temahefte 1, 2012.
13. Biomérieux. Products. Etest. [Internett] 7 Mai 2013. [Sitert: 9 Mai 2013.]
http://www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinicaldiagnostics/dynPage?doc=CNL_CLN_PRD_G_PRD_CLN_22.
14. Liofilchem. MIC Test Strip Prliminary Guide. Roseto degali Abruzzi : Liofilchem.
15. Thermo Scientific. Products. RPMI 1640 Agar w/ MOPS and 2 % Glucose. [Internett]
2013. [Sitert: 10 Mai 2013.]
http://www.thermoscientific.com/ecomm/servlet/productsdetail_11152___14787173_-1.
16. Anaerobe systems, The oxygen-free specialist. Products. Brucella Blood Agar (BRU).
[Internett] [Sitert: 10 Mai 2013.] http://www.anaerobesystems.com/Home/pras-mono-platedmedia/brucella-blood-agar.
17. Atlas, Ronald M. Handbook of Microbiological Media. s.l. : CRC Press, 2010.
ISBN:1439804060.
18. Biomerieux. Products. Conventional culture media. [Internett] 7 Mai 2013. [Sitert: 10
Mai 2013.] http://www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinicaldiagnostics/dynPage?open=CNL_CLN_PRD&doc=CNL_PRD_CPL_G_PRD_CLN_22&pub
params.sform=8&lang=en.
19. Li, M F. Resistensbestemmelse med E-test. PR18413. Bodø : Helse Nord, 2012. 1.6.
20. —. Resistensbestemmelse av sopp. PR18414. Bodø : Helse Nord, 2012. 1.2.
21. Leitner, E et al. Comparison of three different MIC - test strips for determination of
antimicrobial susceptibility of Camphylobacter spp. Niigata : Medical University of Graz,
2009.
22. Haldorsen, B og al, et. Agreement of the MIC Test Strips versus Etest in MIC
determination of Streptococcus pneumoniae. Tromsø : University of Tromsø, 2012.
31
Vedlegg 1
32