Fastsetting av brytningspunkt ved
resistensbestemmelse
Villtypepopulasjon, Mikrobiologiske,
Farmakologiske og kliniske kriterier
Martin Steinbakk
Avdeling for bakteriologi og infeksjonsimmunologi
Divisjon for smittevern
FHI, AFA
Forelesning AFA-kurs 2015
Antibiotikaresistens og resistensbestemmelse.
Noen begreper
•
•
MIC
MBC
•
Agardiffusjon (hemningssone i mm)
Minimum inhibitory concentration
Minimum bactericidal concentration
Resultatet tolkes som S, I eller R
– Sensitiv
• Midlet er aktivt ved vanlig dosering (tolkning: det er stor sannsynlighet for at
mikroben vil svare på terapi med midlet)
– Resistent
• Midlet er ikke aktivt mot mikroben (tolkning: det er liten sannsynlighet for at
mikroben vil svare på terapi med midlet)
– Intermediært følsom (el. usikkert resultat)
• Midlet er aktivt dersom det kan gis høye doser eller midlet konsentreres i
infeksjonsfokus
• Usikkert resultat (teknisk ”buffersone”)
Resistensbestemmelse
•
MIC-bestemmelse
– Buljong-fortyning med MH (micro broth dilution)
• Referansemetode for resistensbestemmelse (ISO 20776-1 Part 1: Reference method
for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing
aerobic bacteria involved in infectious diseases), 2006
– Agar-fortynning
– Agar-gradientdiffusjon (Etest®, MIC Test Strip, MICE®)
– Beregnet ”IC” (fra brytningspunkt-metoder og automatiserte systemer)
•
Agar-diffusjon
– Standard betingelser og gode tolkningskriterier (ie. EUCAST disk diffusion)
– Ficks diffusjonslover
• Beregnet ”IC” (fra regresjonsligning)
•
Resultatet tolkes som S, I eller R
Sammenhengen mellom
mm hemningssone og MIC
•
Fick’s diffusjonslov
– Diffusjonskonstanten for et middel bestemmes av molekylstørrelse og mediets
viskositet
– Temperatur
•
Dannelse av hemningssone
– IC (inhibitory concentration)
– Kritisk tid (avhengig av inokulat og veksthastighet)
•
•
Antibiotikakonsentrasjonen i agaren er omvendt proporsjonal med kvadratet
av avstand fra diffusjonsentrum.
For de fleste mikrober og antibiotika finnes det en IC som akkurat hemmer
veksten og her vil hemningssonen dannes.
– Litteratur: Bakteriologiske undersøkelsesmetoder Kapittel 38, s 355-395. FADL,s
Forlag 1979
EUCAST suggested updated definitions 2015
Hvordan bestemmer vi bakteriers følsomhet for
antibiotika?
– Villtype-populasjoner
– Resistensmekanismer
– Definere følsomme og resistente populasjoner
– Farmakokinetikk og farmakodynamikk (PK/PD)
– Mikrobiologisk respons
– Klinisk respons
• Tolkning baseres på brytningspunkt (BP)
– S, I eller R
• som indikerer sannsynlighet for et gitt utfall
Wild type MIC distributions of target organisms
and epidemiological cut-off values
Wild type (WT) - EUCAST definition
A micro-organism is defined as wild type (WT) for a
species by the absence of acquired and mutational resistance
mechanisms to the drug in question.
A micro-organism is categorized as wild type (WT) for a
species by applying the appropriate cut-off value in a defined
phenotypic test system.
The cut-off value will not be altered by changing
circumstances
Wild type micro-organisms may or may not respond
clinically to antimicrobial treatment.
E.coli and ciprofloxacin in ECO•SENS
The tentative epidemiological breakpoint
25
Canada
20
25
15
15
10
10
5
Sweden
20
5
0
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
25
Spain
20
0
0
25
15
10
10
5
5
0
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Slide by Gunnar Kahlmeter
10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
E.coli ATCC 25933 vs Ciprofloxacin 10 µg
20
15
0
5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
S
.a
u
r
e
u
s-c
lin
ic
a
l is
o
la
te
sv
sS
.a
u
r
e
u
sA
T
C
C
2
9
2
1
3
1
2
5c
lin
ic
a
lis
o
la
te
sv
s
.1
2
5d
e
te
rm
in
a
tio
n
so
fo
n
ety
p
es
tra
in
3
6
3
3
3
0
2
7
S
.a
u
r
e
u
s-c
lin
ic
a
lis
o
la
te
s
S
.a
u
r
e
u
sA
T
C
C2
9
2
1
3
2
4
Noofobs
2
1
Linezolid
1
8
1
5
1
2
9
6
3
0
0
5
1
0
1
5
2
0
Z
o
n
ed
ia
m
e
te
r(m
m
)
Slide by Gunnar Kahlmeter
2
5
3
0
3
5
4
0
Hvordan karakterisere mikrobers antibiotikafølsomhet?
– Påvise resistensmekanisme
– Populasjonsstudier (histogram) kan skille følsom
og resistent bakteriepopulasjon
– Helbredelse versus MIC
• Mikrobiologisk effekt (mikroben blir borte)
• Klinisk effekt (pasienten blir bra)
Clinical
classification
Susceptible
Intermediate
Resistent
No. of isolates
MIC
Low
High
Susceptible
Microbiological
classification
Resistant
Low-level
Intermediate
High-level
Hypotethical distribution of MICs among strains of bacteria from infected patients classified as
Clinically suscpetible, Intermediate or Resistant and Microbiologically Susceptible or Low-level,
Moderately or Hig-level Resistant
Påvisning av resistensfaktor
påvisning av resistens-gen eller resistens-protein
• Enkelt faktor som gir resistens
– Penicillinase hos S. auerus og andre mikrober (penicillinaseømfindtlige penicilliner)
– mecA-protein hos S. aureus (penicilliner, cefalosporiner og
karbapenemer)
– rpoB-gen hos M. tuberculosis (rifampicin)
• Samspill mellom flere faktorer (i samme gen eller mellom ulike gener)
gir samlet høy MIC-verdi
– Kinolonresistens (ofte flere mutasjoner i gyrA, parC eller andre gener
(qnr) )
– Efflux (gir ofte lavgradig resistens når eneste faktor)
– Porintap (kan gi både lavgradig og høygradig resistens)
BP – basert på MIC-fordeling (populasjonsbasert)
• Godt egnet ved bimodal fordeling med god separasjon av
følsom og resistent populasjon (eller unimodal fordeling
som for S. pyogenes og penicillin)
• Reduserer metodefeil ved resistensbestemmelse
• Skiller følsom vill-type populasjonen (WT) fra annen og
mer resistent populasjon
• Bør danne basis for følsomhetskategorisering ved
diffusjonsmetode
NORM Blood cultures E. coli 2002 (n=959)
BP- basert på farmakokinetikk og
farmakodynamikk
• Farmakokinetikk og dyreeksperimentelle studier viser
antibiotikas (og bakterienes) skjebne i vev (oftest hos
mus)
• Tar også i betraktning ulike vertsfaktorer for å bestemme
brytningspunkt (f. eks. må serumkonsentrasjonen av
beta-laktamantibiotika overstige MIC i 40-50% av
doseintervallet)
• Tar ikke hensyn til fordeling av bakteriepopulasjonen og
kan introdusere metodefeil (BP som deler villtypepopulasjonen)
Pharmakodynamic parameters for Ciprofloxacin
Enterobacteriaceae
fAUC/MIC
bacteriostasis
P. aeruginosa
30-40
fAUC/MIC
2 log drop
80-100
fAUC/MIC
clinical data
80-100
Cmax/MIC
12.2
S. pneumoniae
30-40
100
EUCAST Rational document Ciprofloxacin v 1.9
30-40
fAUC/MIC
Probabilities of Target Attainment (PTA) for 500 mg x 2 oral
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0.25
Ciprofloxacin 500 mg x 2 oral
95% percentile
99% percentile
mean
2 teoretiske mål
(target attainment),
35 og 20
0.5
1
2
4
8
MIC mg/L
The following pharmacokinetic parameters were used to obtain the PTA: Volume of Distribution
(Vd): 180L, CV 17% Clearance (Cl): 31 L/h, CV 17%Fraction unbound (Fu): 70% Absorption
rate coefficient (Ka): 2h-1 Bioavailability (F): 0.8, CV 12 % Results of simulations for the 400
mg x 2 iv dose do not markedly influence conclusions.
EUCAST Rational document Ciprofloxacin v 1.9
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0.25
ciprofloxacin 500 mg q12h oral
fAUC/MIC
fAUC/MIC
4. Using available Pk/Pd data, Monte Carlo simulations are performed and a Pk/Pd
breakpoint calculated based on conventional dosing regimens
99% CI
Average
0.5
1
2
4
8
MIC mg/L
S < 0.25 mg/L
For S. pneumoniae
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0.25
levofloxacin 500 mg q24h oral
99% CI
Average
0.5
1
2
MIC mg/L
Pk/Pd
S < 1 mg/L
4
8
4. Using available Pk/Pd data, Monte Carlo simulations are
performed and a Pk/Pd breakpoint calculated
based on conventional dosing regimens
S < 0,125
mg/l
R > 2 mg/l
BP– basert på bakteriologisk respons
• Proof of the pudding?
– Mikroben forsvinner
• hvordan har pasienten det?
– Oppfølgende prøve er ofte vanskelig el. uetisk å få
tatt
– Hvilken mikrobe er årsak til infeksjonen?
• Luftveisinfeksjoner
– Må baseres på gode kvantitative data (mm eller
MIC) – SIR-kategorier ikke godt nok
Sammenheng mellom mikrobiologisk respons og MIC ved nosokomial
pneumoni – et eksempel
BP – basert på klinisk respons
• Proof of the pudding?
– Pasienten blir bra av infeksjonen, men hva skjedde med
mikroben og hadde antibiotika noe med resultatet å gjøre
• F. eks LVI, H. influenzae og makrolider
• Det er jo bakterien vi måler (resistens-bestemmer) og ikke
egenskaper ved pasienten
– Vanskelig å skaffe gode data
– Krever gode kvantitative resistensdata
– Slike data er avgjørende for evaluering av behandlingseffekt (og
indirekte resultat av resistensbestemmelse)
Relationship Between Ciprofloxacin AUC:MIC and Efficacy in Treating
Bacterial Pneumonia
Forrest, AAC 37:1073.
Percent
Clinical Cure
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0-62.5
Eradication
62.5-125 125-250 250-500
24 hr AUC:MIC
>500
NF-M 2001
Dicloxacillin dose vs. Time > MIC of free (non-proteinbound) concentration
Dose
1gx3
1gx4
2gx3
2gx4
Time > MIC
in h
in % of dosing interval
1.8 – 2.8
-2.4 – 3.6
--
23 - 35 %
30 - 47 %
30 - 45 %
40 - 60 %
T½ = 0.6-0.8 h; Vd= 0,13- 0,19 l/kg; Prot.bind.= 91-98 %; MIC-s.a.= 0,4
Treatment and outcome of S. aureus bacteremia:
A prospective study of 278 cases
Jensen AG et al. Arch Intern Med, 2002, 162: 25-32.
+ Risk
-Risk factor Univariate
factor
Died/total,%
Died/total,%
P
Focus not
eradicated
42/125
34%
4/61
7%
7.2
<0.001
Septic
shock
18/38
47%
28/148
19%
3.9
0.001
Diclox daily
dose < 4g
40/142
28%
6/44
14%
2.5
0.02
Age > 60 y
32/96
33%
14/90
16%
2.7
0.006
NF-M 2001
Momenter ved valg av metode for
resistensbestemmelse
• Biologisk variasjon
– innen en gruppe, slekt eller art
– mellom bakterieslekter
• Metodens egnethet
– Valgt metode må kunne skille mellom følsomme
og resistente stammer
– Enkelte midler er bedre egnet til å påvise
følsomhet enn andre innen samme
legemiddelgruppe
Måleunøyaktighet og biologisk variasjon
- MIC for WT viser genusspesifikk variasjon
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
E. coli
MIC (mg/l)
Gentamicin
128
64
32
16
8
4
2
1
0.5
0.25
0.125
P. aeruginosa
0.064
No of isolates
Distribution of MIC-values
Relationship between max. Peak/MIC ratio and the rate of clinical response for
aminoglycosides
Response
rate, %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Moore et.al. J Infect Dis, 1987, 155: 93
2
NF-M 2001
4
6
8
10
Maximum Peak/MIC ratio
12
Måleunøyaktighet og biologisk variasjon
- gjentatte analyser gir ulike svar, WT (Wild type)
Ampicillin 10 ug
15
Ampicillin 10 ug lapp
10
ant.
5
0
6
7
8
9
10 11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
WT
-5
H. influenzae
BLNAR
ATCC
WT
-10
mm hemningssone
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
Cefuroxim 30 ug lapp
Cefuroxime
10
8
WT
6
4
CXM
CXM atcc
2
0
6
7
8
9
10
11 12 13 14
15 16
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
-2
-4
-6
H. influenzae
BLNAR
Blood cultures E. coli 2002 (n=959)
Beta-laktamase-positive
isolat
Blood cultures E. coli 2002 (n=959)
Blood cultures E. coli 2002 (n=959)
BP basert på Pk/PD
Blood cultures Klebsiella spp 2002 (n=352)
R
Alle Klebsiella spp har kromosomal kl A bla og er resistente for Ampicillin
EUCAST definitions of clinical breakpoints
Clinically Susceptible (S)
•
•
a microorganism is defined as susceptible if inhibited in-vitro by a concentration of an antimicrobial agent that is
associated with a high likelihood of therapeutic success
a microorganism is categorized as susceptible (S) by applying the appropriate breakpoint in a defined phenotypic
test system.
Clinically Intermediate (I)
•
•
a microorganism is defined as intermediate by a level of antimicrobial agent activity associated with uncertain
therapeutic effect.
- It implies that an infection due to the isolate may be appropriately treated in body sites where the drugs are
physically concentrated or when a high dosage of drug can be used; -it also indicates a buffer zone that should
prevent small, uncontrolled, technical factors from causing major discrepancies in interpretations.
a microorganism is categorized as intermediate (I) by applying the appropriate breakpoints in a defined
phenotypic test system
Clinically Resistant (R)
•
•
a microorganism is defined as resistant if inhibited in-vitro by a concentration of an antimicrobial agent that is
associated with a high likelihood of therapeutic failure
a microorganism is categorized as resistant (R) by applying the appropriate breakpoint in a defined phenotypic
test system.
Clinical breakpoints may be altered with legitimate changes in circumstances
Clinical breakpoints are presented as S<x mg/L; I>x, <y mg/L; R>y mg/L
EUCAST wild type MIC distributions and epidemiological cut-off values – the
concept
EUCAST developed the concept of antimicrobial wild type MIC distributions and epidemiological
cut-off values (JAC 52:145-148, 2003).
Software was created to receive and display large volumes of MIC data for bacteria and fungi over
the internet. It is freely available at http://www.eucast.org.
Distributions are displayed in an aggregated format. Tables and graphs show the part of the MIC
distribution which, when EUCAST has defined the ”epidemiological cut-off value”, is considered the
”wild type distribution”.
The epidemiological cut-off value separating microorganisms without (wild type) and with acquired
or mutational resistance (non-wild type) and clinical breakpoints are shown on the bottom line of
the graph.
The epidemiological cut-off value (left lower corner) is shown as WT≤ X mg/L.
The clinical breakpoints (right lower corner) are shown as S≤ Y mg/L and R> Z mg/L.
Error rate method –
fra MIC til mm ved regresjonsanalyse
MIC
8
R
R
MiE
MiE
I
Very Major
Errors, VME
4
2
I
1
Minor Errors,
MiE
0,5
0,25
S
0,12
Major
Errors
0,06
MiE
S
0,03
14
16
18
20
24
28
30
36
38
40
42
44
46
48
mm
Brytningspunkt ~ tolkningskriterier ved
resistensbestemmelse
• S - indikerer stor sannsynlighet for terapeutisk suksess
• R - indikerer stor sannsynlighet for manglende terapeutisk suksess
• Kunnskap om mikrobe og antibiotikum
– MIC-distribusjon (histogram) er nødvendig
• Kunnskap om antibiotikums farmakokinetikk og –dynamikk
– Monte Carlo simulering
• Kunskap om terapirespons
– Mikrobiologisk respons og klinisk respons
• Kunnskap om en metodes egnethet til å måle mikrobers
antibiotikafølsomhet eller påvise resistens
EUCAST NordicAST og AFA
The EUCAST websites are accessed via www.eucast.org
This is a section of the official ESCMID website giving details of all EUCAST
activities including
- constitution, organisation, committee members, meetings
- EUCAST documents
- clinical MIC breakpoint tables
- MIC distributions for wild type bacteria and fungi
- epidemiological MIC cut-off values
• NordicAST http://www.nordicast.org
• www.Antibiotikaresistens.no
• Direkte til AFA
– http://www.unn.no/afa/category10274.html
Antimicrobial concentration (mg/L)
0
32
16
8
4
2
1
0,5
0,25
Agar gradient-diffusjon