1. No category

Side 1
ARBEIDSBESKRIVELSE
Institutt for husdyr- og akvakulturvitenskap, UMB
___________________________________________________________________________
Metodenavn: Aminosyreanalyse - oksiderte prøver
IHA-nr:1050
___________________________________________________________________________
1. Innledning/hensikt
Metoden bestemmer totalinnholdet (peptidbundede og frie) aminosyrer i fôr og faeces, ved
å bruke en aminosyreanalysator med ionebytterkolonne, ninhydrinanordning, post kolonnederivatisering og fotometrisk detektor. Metoden er egnet for aminosyrene cyst(e)in,
methionin, asparaginsyre, threonin, serin, glutaminsyre, prolin, glysin, alanin, valin,
isoleucin, leucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, lysin og arginin.
2. Reagenser
Oksidasjonsvæske, står i kjøleskap.
– mål ut 111 g vann (MilliQ/ionebyttet).
– tilsett 889 g konsentrert maursyre (98-100%) og bland godt (pass på
varmeutvikling).
– tilsett 4,73 g fenol (står i kjøleskap) og bland godt.
Hydrolysevæske, står i kjøleskap.
– mål ut 400 mL vann (MilliQ/ionebyttet).
– tilsett, forsiktig, 492 mL kons. HCl (37%/rykende) mens blandingen avkjøles.
– tilsett 1 g fenol og fortynn til 1 L med vann (MilliQ/ionebyttet).
7,5M NaOH, står under avtrekksskap.
– vei ut 300 g NaOH og løs dette porsjonsvis i 500 mL vann (MilliQ/ionebyttet)
ved hjelp av magnetrører.
– fortynn med vann (MilliQ/ionebyttet) til 1 L når løsningen er blitt kald.
1,0M NaOH, står under avtrekksskap.
– vei ut 40 g NaOH og løs dette i ca 500 mL vann (MilliQ/ionebyttet) ved hjelp av
magnetrører.
– fortynn med vann (MilliQ/ionebyttet) til 1 L når løsningen er blitt kald.
Hydrogenperoksid (30%)
Buffere til Biochrom30
Sodium Citrate Loading Buffer pH 2,20
Sodium Citrate Buffer pH 3,35
Sodium Citrate Buffer pH 4,25
Sodium Citrate Buffer pH 2,65
Borate / Citrate Buffer pH 8,60
Sodium Hydroxide Solution
Ultra Ninhydrin Regent Kit
IHA/NMBU
Utarbeidet av
Hanne Kolsrud
Hustoft
Godkjent
Gjelder fra
0208-2015 092015
Kari
Norberg
Bestillingsnummer
80-2037-67
80-2037-80
80-2038-08
80-2037-79
80-2037-88
80-2037-57
80-2118-30
Revisjon Erstatter
Buffernummer
Loadingbuffer
1
2
3
4
6
Ninhydrin
ARB
Dokumentnavn: Side
Arb_1050_
1-7
aminosyreanaly
se
Side 2
3. Risikovurdering
-Bruk vernebriller/briller og avtrekk ved håndtering av fenol og syrer.
-Støvfilter P3 eller bruk av vekt i avtrekksskap ved innveiing av natriumdisulfitt (natrium
metabisulfitt).
Koking av fenolløsning SKAL utføres i avtrekkskap og i varmeskap skal lokkene på flaskene
være godt skrudd igjen.
4. Utstyr
Biochrom 30 Amino Acid Analyzer med Midas autoinjektor
Varmeskap (110 °C)
Varmeblokk (145 °C)
Autotitrator, 751 GPD Titrino med 685 Dosimat fra Metrohm
Whirlmixer
Bordsentrifuge
Testglass 60 ml
Sintilasjonsglass
150 mL begerglass
200 mL målekolbe
Trakt
2 mL GC-vials
300 μL GC-vials
0,45 μm membranfilter
2 mL engangssprøyte
5. Prøvemateriale
Mengde prøvemateriale beregnes ut ifra nitrogenmengden i prøvene. Dette bestemmes
først med Kjeldahlmetoden.
10 𝑚𝑔
× 1000 (𝑔⁄𝑘𝑔) = 𝑝𝑟ø𝑣𝑒 𝑠𝑜𝑚 𝑠𝑘𝑎𝑙 𝑣𝑒𝑖𝑒𝑠 𝑢𝑡 (𝑚𝑔)
𝑚𝑒𝑛𝑔𝑑𝑒 𝑛𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔𝑒𝑛 (𝑔⁄𝑘𝑔)
Prøvemengde: 100 - 1000 mg homogen prøve (prøvene må inneholde ca. 10 mg nitrogen).
Malingsgrad: 0,5 mm.
Faeces: 1 parallell
Fôr: 3 paralleller (anbefales)
6. Arbeidsbeskrivelse
Oksidasjon
1. Beregne mengde prøve som skal veies ut.
2. Vei ut beregnet mengde prøve i et testglass, 60 ml.
3. Vei ut 140 ± 5 mg soyakontroll i et testglass, 60 ml.
4. Lag oksidasjonsblandingen:
- 4,5 mL oksidasjonsvæske x ant. prøver.
- 0,5 mL hydrogenperoksid (30%) x ant. prøver.
5. Dekk til beholderen og la blandingen stå 1 time ved 20-30 °C, til den er lys gulblank.
6. Avkjøl blandingen på isbad i ca. 15 min.
IHA/NMBU
Utarbeidet av
Hanne Kolsrud
Hustoft
Godkjent
Gjelder fra
0208-2015 092015
Kari
Norberg
Revisjon Erstatter
ARB
Dokumentnavn: Side
Arb_1050_
2-7
aminosyreanaly
se
Side 3
7. Tilsett 5 mL oksidasjonsblanding til prøvene og soyakontrollen.
8. Bland eller miks kun om dette er helt nødvendig (små klumper vil løse seg selv) med en
spatel.
NB! Forsøk alltid å få mest mulig av prøvematerialet ned i glasset, ikke på kanten. NB!
9. Inkuber prøvene ved 4 °C i kjøleskap i 17 timer. Eks. sett på kjøling kl. 15 og ta ut
prøvene kl. 08 neste dag. Merk deg tidspunktet prøvene settes til inkubasjon.
10. Vei inn 0,84 g natriumdisulfitt × antall analyseprøver i sintilasjonsglass med hvit
skrukork (trenger ikke vaskes). Gjøres i avtrekk.
11. Etter 17 timer tas prøvene ut og natriumdisulfitt tilsettes alle prøvene.
Hydrolyse
12. Sett varmeskapet på 110 °C.
13. Tilsett 25 mL hydrolysevæske direkte til det oksiderte materialet i glasset. Gjøres i
avtrekk.
14. Sett prøvene til koking i varmeskapet i 24 timer (110 °C).
15. Husk løs kork første timen. Deretter skru til kork godt.
NB! HUSK AVTREKK! NB!
16. Ta ut prøvene av varmeskapet og sett dem til avkjøling i avtrekk. Slipp ut trykket i
glassene og sett dem i isbad (is og vann) til avkjøling.
pH justering (pH 2,2) ved bruk av autotitrator
17. Kontroller at det er nok løsninger i flaskene og spyl ut det som sitter i slangene
Bruk 751GPD Titrino Keyboard:
- Trykk Prep (tast 4) en gang for å velge internal D0 (7,5 M NaOH) som står til høyre
- Trykk START.
- Trykk Prep (tast 4) to ganger for å velge external D1 (1 M NaOH) som står til
venstre.
- Trykk START. Pass på at det ikke er noen luftbobler i slangene. Utspyling av
slangene kan måtte gjentas i mange runder.
18. Kalibrering av pH-meter med bufferne 1,68/4,01/7,00:
Bruk 751GPD Titrino Keyboard:
- Trykk User Meth (tast 3).
- Velg recall method med Enter.
- Bruk piltastene, ← eller →, til å finne programmet CAL3.
- Trykk Enter.
- Trykk START.
- Trykk Enter for å akseptere temperaturen (25 °C).
- Sett elektroden i buffer 1. Aksepter at første buffer er pH=1,68 ved å trykke Enter.
Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann.
IHA/NMBU
Utarbeidet av
Hanne Kolsrud
Hustoft
Godkjent
Gjelder fra
0208-2015 092015
Kari
Norberg
Revisjon Erstatter
ARB
Dokumentnavn: Side
Arb_1050_
3-7
aminosyreanaly
se
Side 4
- Sett elektroden i buffer 2. Aksepter at andre buffer er pH=4,01 ved å trykke på
Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann.
- Sett elektroden i buffer 3. Aksepter at tredje buffer er pH=7,00 ved å trykke på
Enter. Vent på klarsignal. Skyll med RO-vann.
- Kalibreringsresultatene blir automatisk skrevet ut av skriveren.
19. Innstilling av pH til 2,20 i aminosyreprøver:
Bruk 751GPD Titrino Keyboard:
- Trykk User Meth (tast 3).
- Velg recall method med Enter.
- Bruk piltastene, ← eller →, til å finne programmet AMINO.
- Trykk Enter.
20. Merk 150 mL begerglass med prøvenummer.
21. Hell første prøve over i et merket 150 mL begerglass.
22. Vask testglasset (rist) tre ganger med loadingbuffer (Sodium Citrate Loading Buffer
pH 2,20, 80-2037-67), som står i kjøleskap, og fortynn med samme buffer til volumet er
ca. 75 mL.
23. Tilsett 10 mL 7,5 M NaOH for at pH-justeringen skal gå raskere. Følg med på hvor
mye NaOH pH-instrumentet bruker. Tilsett eventuelt mer 7,5M NaOH før titreringen
starter.
24. Gjenta trinn 21 til 23 med alle prøvene.
25. Forbered 4-5 prøver før pH-justeringen startes.
26. Plass nr. 16 på prøvekarusellen skal være et begerglass med vann (MilliQ/ionebyttet).
27. Sjekk at elektroden, røreren og ledningene på autotitratoren er skikkelig på plass (slik
at de treffer i midten av begeret).
28. Når alt er klart: Trykk START (bruk 750 SC Controller).
29. Etter pH-justeringen settes rørestav og slangeendene i ionebyttet vann over natt for
”vask” av disse. pH-elektroden skal skylles og tilbake i KCl-løsning (3 M).
Fortynning av pH-justerte prøver
30. Merk telleglass med ID-nummere som finnes på SKRIV HVOR FILA FINNES.
31. Hell analyseprøven over i en 200 mL målekolbe.
32. Skyll ut av begerglasset med loadingbuffer.
33. Fortynn til 200 mL med loadingbuffer.
34. Sett på kork og bland godt (snu kolben opp/ned 12 ganger).
35. Hell av litt av blandingen og fyll så opp et merket telleglass med prøve.
36. Hell resten i vasken.
37. Skyll målekoblen med vann (MilliQ/ionebyttet) og bruk denne på nytt.
38. Gjenta punkt 31 til 37 med alle prøvene.
39. Telleglassene skal i kjøleskapet på prøverommet.
40. Loadingbuffer står i kjøleskapet på labben.
Analyse ved bruk av HPLC
Klargjøring av prøver og standarder:
41. Filtrer ca 2 mL av de opparbeidede prøvene og overfør den filtrerte løsningen til GCglass. Bruk sprøyte og sprøytefilter (0,45 µm).
IHA/NMBU
Utarbeidet av
Hanne Kolsrud
Hustoft
Godkjent
Gjelder fra
0208-2015 092015
Kari
Norberg
Revisjon Erstatter
ARB
Dokumentnavn: Side
Arb_1050_
4-7
aminosyreanaly
se
Side 5
42. Kork glassene og sett dem i kjøleskap fram til analysen skal startes.
43. Hent fire standarder (50, 100, 300 og 400 mM).
44. Bland standardene på whirlmixer og sett de deretter i bordsentrifugen og la de spinne i
ca 1 minutt. Overfør til 300µl-GCglass. Pass på at det ikke er luftbobler i bunnen på
glassene.
45. Kork glassene og sett dem i kjøleskap fram til analysen skal startes.
Klargjøring av Midas autoinjektor
46. Kontroller at det er nok vaskeløsning (1:1 vann(MilliQ/ionebyttet):MeOH) i flaska
som står til venstre for autoinjektoren.
47. Vask injektoren:
- Trykk EXIT.
- Trykk WASH.
48. Prosedyren må gjentas helt til det ikke er mer luft i stemplet.
49. Etter vask aktiveres autosampleren ved å trykke på SERIAL (knapp nr. 3 øverst).
Vinduet skal nå vise PANIC STOP og EXIT.
50. Dersom autosampleren har vært av: Tray: 5°C, Cooling: ON.
Sett opp sekvens i Chromeleon:
51. Åpne Chromelon.
52. Åpne Browseren og gå inn på Sequenses under Biochrom.
53. Åpne riktig årstallmappe under Sequenses og lag en ny sekvens (kopier en gammel).
54. Ved kopiering av en eldre sekvens – pass på at dette er en sekvens for natriumsystemet
og ikke litiumsystemet.
55. Gi sekvensen nytt navn, MMDD_ÅÅÅÅ.
56. Marker sekvensen og høyreklikk.
57. Velg Properties og skriv inn oppdragsgiver der hvor det står Title.
58. Kontroller at det står Hydrolysater.qnt og OX_HP_rask.pgm i vinduet over sekvensen.
59. Lag sekvensen slik at den ser slik ut (tilpass til antall prøver):
Generelt prøveoppsett:
- Standarder
- Soyakontroll
- 10 prøver
- Standarder
- 10 prøver
- Standarder
- 10 prøver
- Soyakontroll
- Standarder
Ved færre enn 20 prøver plasser standardene etter at halvparten av prøvene er kjørt.
60. Marker alle prøvene i sekvensen (alt skal bli svart).
61. Trykk Ctrl+c og Ctrl+v – fjerner de gamle kromatogrammene.
62. Lagre sekvensen.
63. Trykk Start/Stop batch.
- fjern eventuelt andre sekvenser.
64. Trykk Ready check.
- eventuelle feilmeldinger som kommer opp må rettes/fjernes.
IHA/NMBU
Utarbeidet av
Hanne Kolsrud
Hustoft
Godkjent
Gjelder fra
0208-2015 092015
Kari
Norberg
Revisjon Erstatter
ARB
Dokumentnavn: Side
Arb_1050_
5-7
aminosyreanaly
se
Side 6
65. Trykk OK – Start.
66. Åpne mappen Panels under Biochrom og åpne panelet Biochrom30.pan.
67. Chromelon er nå klar til analyse og venter på signal fra BioSys.
- Skal stå som WAIT.
Sett opp sekvens i BioSys:
68. Åpne BioSys Manual.
69. Trykk på View og Program Control.
a. BioSys Programmer: 1000 åpnes.
70. Trykk på Insert.
71. Trykk på Program Filename og velg OX_HP_rask_2012.prg.
72. Ved sample ID.
73. Trykk på No. Samples: og skriv inn antall analyser (injeksjoner i analysen).
74. Trykk på Vial no.og skriv inn hvor første prøve/standard starter.
75. Trykk på Volume og skriv inn 40 μL.
76. Trykk på Details og velg Microliter pick-up.
77. Trykk deretter på OK og OK.
78. Den alle første prøven i BioSys-sekvensen skal hete "regen". Denne må være med da
kolonnematerialet må regenereres før første injeksjon. Resten av sekvensen skal være
helt lik den som er laget i Chromelon. Pass på å få inn riktig "vial no(s)" for standardene
og prøvene som skal analyseres flere ganger.
79. Sjekk at sekvensen i Biochrom, etter "regen" er identisk med sekvensen i Chromeleon,
både navn og plassering.
80. Trykk Save as. Åpne Mine siste dokumenter, Sample Lists og lagre sekvensen som
dagens dato; MMDD_ÅÅÅÅ.
81. Plasser så prøvene og standardene på riktig plass i autosampleren.
Etterfylling av buffer på Biochrom30
82. Sjekk om det er nok buffer i flaskene som står i løsemiddelreservoaret oppe på
Biochrom30 til å kjøre alle prøvene.
83. Etterfyll om nødvendig! Ca. volum kan kontrolleres på. Husk å fyll ca 150 mL ekstra
slik at slangene i flaskene ikke trekker luft på slutten av analysen.
84. Sjekk om det er nok ninhydrinløsning. Lag ny og etterfyll om det skulle være aktuelt.
ALDRI etterfyll under en analyse! (-husk om bytte av filter legg dette først i et
begerglass med ninhydrinløsning og ha i ultralydbad i 5 min for å få ut luft).
85. Pass på at korkene blir skikkelig godt skrudd til på buffer og ninhydrinflaskene.
86. Sjekk at waste-beholderen ikke er full - tømmes om nødvendig.
Starte Biochrom 30
87. Hent fram vinduet Biosys Manual: 1000
88. Huk av REACTION COIL og LAMP.
89. La "reactioncoilen" bli varm og sjekk om lampa er riktig innstilt:
- Åpne framdekslet på Biochrom 30.
- Dra fram den øverste skuffen.
- Dekslet over der lampa lyser har to svarte skruer.
- Skru disse svarte skruene av og fjern dekslet.
IHA/NMBU
Utarbeidet av
Hanne Kolsrud
Hustoft
Godkjent
Gjelder fra
0208-2015 092015
Kari
Norberg
Revisjon Erstatter
ARB
Dokumentnavn: Side
Arb_1050_
6-7
aminosyreanaly
se
Side 7
- Kontroller at lysstrålen er konsentrert, har klare grenser, ved å føre et ark
når den borteste veggen.
- Juster fokuset på lampa, hvis nødvendig med det mørkerøde hjulet.
- Skru så på dekslet og dytt skuffa inn igjen.
90. Når "Column temp" har nådd 50 °C settes buffer 3 på. Husk å start med en lav
strømingshasstighet (flow), 5 mL/h. Økes stegvis til 35 mL/h når trykket har stabilisert
seg på hvert steg.
91. Start også ninhydrinpumpa (når temperaturen har nådd 135 °C. Se på "pressure" at de
svarte strekene går opp. Ellers sjekk trykket, korkene på bufferne.
92. Analysen tar 75 minutter.
93. Sjekk for lekkasjer - spesielt hvis man har skrudd på instrumentet.
Starte analysen
Biosys Programmer: 1000:
94. Hent fram BioSys Programmer: 1000.
95. Merk REGEN og trykk på RUN.
96. Trykk på Run og trykk på fanen Program som står ved siden av Sample list.
97. Merk så trinn 6 eller 7 (trinn 8-12 MÅ være med etter en vaskeprosess) og trykk på
Go to step og deretter OK.
98. Sjekk etter lekkasjer.
99. Biochrom30 slår seg av når analysen er ferdig. Fjern markeringen på LAMP.
Eventuelle avvik fra standard opparbeiding noteres under «comments» i data FILA
Husk å gi standardene riktig navn:
50 mM – std1
100 mM – std2
200 mM – std3
400 mM – std4
IHA/NMBU
Utarbeidet av
Hanne Kolsrud
Hustoft
Godkjent
Gjelder fra
0208-2015 092015
Kari
Norberg
Revisjon Erstatter
ARB
Dokumentnavn: Side
Arb_1050_
7-7
aminosyreanaly
se