Assistert befruktning i laboratoriet

Assistert befruktning i
laboratoriet
Assistert befruktning i Norge
Mette Haug Stensen
Senior klinisk embryolog
Laboratoriesjef
@
Medisinsk fødselsregister (MFR)
2010: > 23 000 ART barn født
1994: 1/100 barn
2009: 2.9/100 barn
Oslo
Assistert befruktning i Norge
Medisinsk fødselsregister (MFR)
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Assistert befruktning i Norge
Medisinsk fødselsregister (MFR)
Flerlingeraten er redusert fra ca 42% (2002) til ca 20% (2008) pga single embryo transfer (SET)
50% IVF
40% ICSI
10% andre (PESA/TESA, sæddonasjon,TIN, IUI)
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Historien om ART
1959:
kaniner
født
etter IVF
1965:
humane
oocytter
fertilisert
in vitro
1978:
første
fødsel
etter
naturlig
syklus
IVF
(Louise
Brown)
1983:
første
fødsel
med
donerte
oocytter
1983:
første
fødsel
etter
frys/tin
ART metoder i Norge
1983:
modning
og fertilisering av
umodne
oocytter
dyrket
frem in
vitro
(IVM)
1986:
første
fødsel
etter
PESA
1989:
PGD for
kjønnsbundet
sykdom
1990:
første
fødsel
etter
vitrifisering av
embryo
1992:
første
fødsel
etter
ICSI
1993:
første
fødsel
etter
TESA
2005:
første
fødsel
etter
ovarialvev
transplantasjon
2014:
første
fødsel
etter
livmor
transplantasjon
• Intrauterin inseminering (IUI)
• In vitro fertilisering (IVF)
• Intracytoplasmisk spermie injeksjon (ICSI)
• Kryopreservering (frys): oocytter, sæd og embryo
• Uthenting av sædceller fra testiklene (PESA/TESA/TESE)
• Sæddonasjon (mannlig faktor og lesbiske par)
• Kryopreservering av ovarialvev
• In vitro modning (IVM)
• Preimplantasjons genetisk screening (PGD) i utlandet
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Lovverket § Lov om humanmedisinsk bruk av bioteknologi m.m.
(Bioteknologiloven)
• Godkjent virksomhet – rapporteres årlig til Helsedirektoratet
• Ufrivillig barnløse som lever i et langvarig parforhold (2 år eller mer)
• ICSI: tillatt i en prøveperiode fra høsten 1995
• PESA/TESA/TESE: prøveordning fra 2004
• Sæddonasjon tillatt (men ikke lenger anonym sæddonor – siden
2005)
• Lesbiske par kan behandles (siden 2009)
• Oppbevaring av frosne embryo i opptil 5 år (tidligere 3 år)
• PGD nemd
• Eggdonasjon, surrogati, behandling av enslige og preimplanatasjons
genetisk screening (PGS) forbudt
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Assistert befruktning
+
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
MEIOSEN
• Bare i eggstokken (oocyttene)
og i testikkelen (spermiene)
• Fullføring av meiosen kan ta
mange år (opptil 50 år)
• En runde med DNA replikasjon
og to celledelinger
• Fire haploide datterceller som
er genetisk forskjellig fra
morcellen
OOGENESEN
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
SPERMATOGENESEN
• 1. Spermatocytogenesen:
spermatogonia til
spermatocytt
• 2. Meiose: spermatocytt til
spermatid
• 3. Spermiogenese:
spermatid til spermatozoa:
-Spermatozoa frigis inn i
tubuli lumen
- Spermiemodningen
fortsetter i epididymis
i 2 uker
• Mitose i tidlig fosterstadiet
• Meiose I: begynner i fjerde
mnd i fosterstadiet, stanser i
Profase I ved 20 uker
• Pause i opptil 50 år
• Etter puberteten: LH↑,
fullføring av meiose I, 1.
pollegme (oocytt modning)
• Meiose II: fullføring av
meiose II etter (og bare
etter) fertilisering av en
spermie (oocytt aktivering),
2.pollegeme
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
SPERMIOGENESE
Spermatocytogenese +
spermiogenese =
spermatogenese (≈74 days)
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
DAG 0: SÆDANALYSE
SÆDPREPARERING – Swim up
Behandlingsforsøk IVF/ICSI
• Dag 0: sædanalyse, sædpreparering,
egguttak (ovum pick up = OPU),
inseminering (IVF/ICSI)
• Dag 1: bedømmelse av befruktning
• Dag 2 – 5: vurdering av
embryokvalitet og utvelgelse av
embryo til tilbakesetting av livmor
(ET)
• Dag 2 – 5: ET
• Dag 0 – 5: Kryopreservering (frys) av
egg (oocytter), befruktede egg
(zygoter), embryo, blastocyster
• Analyserer konsentrasjon og motilitet
• Preparerer sædprøver med bevegelige
spermier
• Swim up: sæd på bunnen av reagensglass
med medium over i varmeskap (37 °C) –
ca 45min - 1 time
• Beste svømmerne øverst,
de døde på bunnen
• Naturlig
• Fjerne sædplasma
- hindrer kapasitering samt
fjerning av prostaglandiner som
kan forårsake kontraksjoner i livmor
Bioteknologirådet
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
DAG 0: SÆDPREPARERING –
gradient sentrifugering
• Sæd på toppen
• Sentrifugeres gjennom flere lag medium med ulik tetthet
• Beste sædcellene
på bunnen
• Grums og andre
celler over
• Sædprøver med
få sædceller
• Kapasitering
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Kapasitering
•
•
•
•
•
Kapasitet til å bindes til og penitrere oocytten
Økning i membranens fluiditet
Hyperaktiv bevegelse
Ca 6 timer, 37 - 39 °C
Fjerner epididymale og seminal plasma
proteiner rundt spermiene
• Follikkelvæsken kan forårsake kapasitering
• Akrosomreaksjon:
1) ytre akrosomale membraner smelter sammen
med plasmamembranen på hodet til spermien
2) Akrosomale granuler brytes ned; frigir lysiner
3) Plasmamembranen på spermiehodet og
oocyttens plasmamembran fusjonerer
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Preparert sæd kan benyttes til….
IVF/ICSI:
DAG 0: egguthenting (OPU = ovum pick up)
• Intrauterin inseminering (IUI): Indikasjon: mild
mannlig faktor, ukjent årsak til fertilitet
• In vitro fertilisering (IVF): kvinnelig/ukjent
årsak, mild mannlig faktor
• Intracytoplasmisk spermieinjeksjon (ICSI):
mannlig faktor, tidligere forsøk med lav/ingen
befruktning IVF
• Forbereder skåler
med medium dagen før
• Follikkelvæske med egg (oocytt)
• Observeres i et mikroskop av
embryolog ca 100 μm i diameter
• Antall egg (gjennomsnittlig 8 stk)
• Skylling
• NB: temperatur!
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
ICSI: Modenhet oocytter
DAG 0: Kvalitet/modenhet oocytter
• Modne oocytter for å fertiliseres
• IVF: kompaktheten av cumulus celler rundt egget (cumulus oophorus)
• ICSI – eggene må
vurderes om modne (MII)
Oocytt
• Fjerne cumuluscellene
rundt egget- denudering
• Legges i HYASE
• Pipeteres inn og ut
av denuderings pipette
PV
1.PB
ZP
GV
CYTOPLASMA
MII
OOLEMMA
Cumulusceller
GV = germinal vesikkel
MI
MI = metafase I
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
MII = metafase II
ZP = Zona Pellucida
ICSI: OOCYTTKVALITET
• Cytoplasma (vakuoler,
mørkt, lyse flekker)
• Unormal størrelse
• Zona pellucida
• Perivitillin-rommet (PV)
• 1.pollegeme
• Modenhet
Dag 0: ICSI = intracytoplasmatisk spermieinjeksjon
Normal
Unormal
vakuole
Stort PV-rom
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Dag 0: IVF
• Modne egg (MII)
• Immobiliserer en spermie –
morfologisk normal, svømmer
godt
• Inn i egget, suger ut litt
cytoplasma, oolemma breakage
• Avleverer spermie ved oolemma
på motsatt side
• Unngå å stikke rett under
pollegemet
• Bedømmes dag 1 for befruktning
1.pollegemet = PB
spindel
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Sperm – oocytt sammensmelting
• Setter til 50 000 – 100 000
preparerte spermier til hvert egg i
fertiliseringsmedium
• Flere proteiner i
zona pellucida
involvert
• Avhengig av
temperatur, pH og
[Ca2+]
• Endringer i
intracellulært Ca2+ i
oocytten – fullfører
meiose II
• Befrukter egget selv,
gjerne i løpet av 1-2 t
• Må ha cumulusceller
• Denuderes på dag 1
for å se befruktning
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
DAG 1: FERTILISERING - ZYGOTE
Kortikal reaksjon
Sjekker fertilisering 16 – 19 timer etter
inseminering/mikroinjeksjon
Gjennomsnittlig 60 -70% av oocyttene
• Frigjøring av kortikale granuler
rett under zona pellucida
• Indusert av Ca 2+
• Hindrer polyspermi ved
endringer i zona pellucida (blir
hard)
• Spermiekjernen går inn i
oocytten og utvikles til mannlig
pronucleus (forkjerne)
1PB
2PB
1PN
2PN
ZP
Ikke fertilisert
0 pronuclei = PN, 1PB
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
2PB
ZP
Fertilisert = zygote
2PN, 2PB
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Dag 1/Dag 2: EMBRYOUTVIKLING
DAG 1: FERTILISERING
• Early cleavage 25 -27 timer etter
inseminering/mikroinjeksjon: 2 celler – økt
graviditets – og implantasjonsrate (Lundin et al., 2001)
• Dag 2: 44 – 48 timer etter inseminering: 2 – 6
celler; 4 celler foretrekkes (Ziebe et al., 1997)
ZP
ZP
Nucleolar
precursor
bodies
2PB
1PN
3PN
2PB
ZP
1
ZP
2
4
1
1PN, 2PB
3 PN, 2PB
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
3
2
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Dag 5: EMBRYOUTVIKLINGBLASTOCYST
Dag 3/dag 4: EMBRYOUTVIKLING
• Dag 3: 64 – 72 timer etter inseminering: 4 – 10 celler; 8 celler
foretrekkes, morula
• Dag 5: blastocyst; ca 100 celler, inner cell mass (foster), trophectoderm
(placenta) og blastocoel (væskefylt rom). Tynn zona pellucida.
• Hatching: Trophectoderm cellene kommer ut av zona pellucida.
• Dag 4: morula: ≈ 16 celler. Kompaksjon: tight junctions og
desmosomer holder cellene
tett sammen
2
ZP
6
7
12
3
ICM
ZP
BL
BL
13
8
8
4
11
10
2
5
4
1
1
TE
3
5
7
9
6
TE
ICM
ZP
ZP
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
EMBRYOMORFOLOGI – delingshastighet
Antall blastomerer:
«Ikke for sent, ikke for raskt»
• Dag 1: early cleavage
• Dag 2: 4 celler
• Dag 3: 8 celler
• Synkronisert deling – (2,4,8,16….)
• Dag 4: morula
• Dag 5: blastocyst/ekspandert blastocyst
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Hatching
ICM = inner cell mass
TE = trophectoderm
BL = blastocoel
Morula
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Antall blastomerer dag 2 og dag 3
25 %
20 %
15 %
10 %
Implantasjonsrate
5%
0%
2 celler 3 celler 4 celler
>4
celler
Ziebe et al, Human Reprod., 1997
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
EMBRYOMORFOLOGI - fragmentering
• Økende grad av fragmentering korrelerer med aneuplodi (Hnida et al., 2004)
• Økende grad av fragmentering korrelerer negativt med graviditets- og
implantasjonsrater (Ziebe et al., 1997)
• Kan inneholde kromosomer (Chavez, et al., 2012)
• Svært ofte sett i humane embryo
(75 %)
EMBRYOMORFOLOGI – blastomerstørrelse
• Ujevne blastomerer korrelerer med sannsynlighet for
aneuploidi (Hardarson et al, 2001)
• Ujevne blastomerer har økende grad av multinukleære
blastomerer og lavere implantasjonsrate (Hardarson et al., 2001)
•Kan endres gjennom celleutviklingen
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
EMBRYOMORFOLOGI – antall kjerner
• Èn synlig kjerne i hver blastomer
• Multinukleære blastomerer: binukleære,
multinukleære, mikronukleære
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Blastomerer med èn kjerne og multinukleære
blastomerer
• Dess flere blastomerer med èn synlig kjerne, jo høyere graviditetsrate
(Palmstierna et al., 1998)
• Multinuklære blastomerer korrelerer med kromosomale avvik
(Hardarson et al., 2001)
• Embryo med multinukleære blastomerer er assosiert med lavere
implantasjons-, graviditets- og fødselsrate (Van Royen et al., 2003)
nuclei
nuclei
nuclei
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
BLASTOCYSTMORFOLOGI
• Størrelse (ekspandert)
• Inner cell mass (ICM): antall celler og
kompaksjon
• Trophectoderm (TE): struktur og antall celler
• ZP: tynn
TE
MORFOLOGI- system
ICM
TE
BLASTOCOEL
ICM
ZP
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Morfokinetikk
• Time-lapse + morfologi
• Innebygd mikroskop i en inkubator (stabil
temperatur og pH)
• Bilde hvert 5 - 20 min, 6 ulike plan
• Hele embryoutviklingen fra inseminering
til transfer
• Oppdager dynamiske prosesser
(fragmentering, antall kjerner)
• Oppdager unormale celledelinger (direkte
eller reverserte delinger)
Ziebe et al., 2003
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Time lapse
Dag 2, 3 eller 5: TRANSFER
• Embryoet/blastocysten legges i
transfer – skål med medium
• Suges opp i et kateter vha
sprøyte
• Sprøytes inn i livmoren
• Kateteret sjekkes etterpå!
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Dag 0, 1, 2, 3 eller 5, 6: FRYS
•
•
•
•
Oocytter: MII (medisinsk grunnlag)
Zygoter: 2 PN
Embryo: dag 2 eller dag 3
Blastocyster: dag 5 eller dag 6
• Sæd – kreftbehandling/lagring
• Ovarialvev – kreftbehandling (Nasjonalt
senter OUS) – transplanteres tilbake
• Slow freeze eller vitrifisering
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
FRYS
• Fryseprosessen: vann i cellene, øker i
størrelse ved isdannelse, cellene sprekker,
vann i cellene ut, frysemedium inn som
hindrer isdannelse, lagres i strå/ampuller i
flytende nitrogen (- 196°C) eller
nitrogendamp
• Slow freeze: sakte nedfrysning, lav
konsentrasjon frysemedium, sakte økning
i konsentrasjon, toksisk, maskin
• Vitrifisering: høy konsentrasjon av
frysemedium, rask nedfrysning, rett i
flytende nitrogen glass-struktur, toksisk,
manuelt
• Embryo/blastocyster kan lagres i opptil 5
år
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
TIN
Dag -1 evt Dag 0 : TESA/PESA
• Tineprosessen: frysemedium ut,
væske fra mediumet inn i
cellene igjen til normal størrelse
• Minst 50% av et embryos
blastomerer (celler) må
overleve
• Oppbygging av
livmorslimhinnen
• Naturlig eller substituert syklus
• Ingen spermier i ejakulatet
• TESA = testikulær sperm aspirasjon
• PESA = percutanøs epidymal sperm
aspirasjon
• Moser/kutter opp tråder av vev med
spermier
• Bevegelige eller
ikke-bevegelige spermier
• ICSI
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
IVM = in vitro modning
• Umodne egg (GV)
• Follikler: 2 – 10 mm, ledende follikkel 10 mm
• Dyrkningsmedier til MII – befruktning
• Polycystisk ovarie syndrom (PCOS)
• Østrogen og progesteron
• Ikke helt utviklet metode
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
PGD = Preimplantasjons genetisk diagnostikk
• Alvorlig genetiske sykdommer med stor
fare for overføring til eventuelle barn
• Maternelle og paternelle sykdommer
• Vevstype – stamcelle donor for søsken
med alvorlig, arvelig sykdom
• Blastomerer eller trofektoderm-celler
• Mosaikker
• Biopsi – genetisk analyse – seleksjon og
transfer uaffektert embryo/blastocyst
• PGD-nemd
• Preimplantasjons genetisk screening
(PGS) er forbudt i Norge
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret
Framtidsutsikter i laboratoriet
Kom gjerne på besøk -
• Nye ikke-invasive metoder til å
bedømme embryokvalitet (time-lapse,
metabolomics, granulosaceller…)
• PGS versjon II
• Fryse alle embryo – ET i tin syklus
• Oocyttfrys på sosialt grunnlag
Mette Haug Stensen, Fertilitetssenteret