TBT4170 - NO
Kompendium i Bioteknologi (TBT4170) Det følgende er en oppsummering av emnet TBT4170 Bioteknologi på NTNU basert på pensumboka Biotechnology for Beginners av Reinhard Renneberg, og forelesninger. Det ble i utgangspunktet skrevet som en slags ordliste (men det tok litt av), derfor starter mange avsnitt med en kort definisjon/beskrivelse av det som står i overskriften. På slutten av dokumentet ligger det en tonsill (mange dokumenter har appendiks, men man skal ikke glemme at kroppen har da sannelig andre organer som kan skjæres vekk også) med blant annet lenker til videoer og artikler, kildekoden til dette dokumentet, og et register. Sist oppdatert 29. mai 2015. Jonathan Reichelt Gjertsen [email protected] Innhold 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Cellebiologi Enzymer Genteknologi Industriell bioteknologi Medisinsk bioteknologi Miljøbioteknologi Grønn bioteknologi Kloning og embryoer Medisinsk bioteknologi II Analytisk bioteknologi 1 1 4 6 8 12 14 17 20 21 23 Cellebiologi samt dannelse av forløperne til makromolekyler som karbohydrater, aminosyrer og fettsyrer. Dette kapittelet er en innføring i hvordan celler er bygget opp, samt litt om hvordan celler tar opp og bruker Genetiske funksjoner Celler lagrer og prosesserer genetisk informasjon, som videreføres til etterkommere energi (metabolisme). gjennom reproduksjon. Denne informasjonen er lagret som DNA. De genetiske funksjonene til en celle fasiliterer 1.1 Celler reproduksjon. Genetiske funksjoner i cellen inkluderer transkripsjon (produksjon av RNA fra DNA) og translasjon Celle Den fundamentale enheten for liv. (produksjon av proteiner fra RNA). Alle celler • er avgrenset fra omgivelsene med en cellemembran, • er åpne systemer med metabolisme (de tar opp næringsstoffer fra miljøet, transformerer dem, og slipper ut avfallsstoffer i miljøet), • er i stand til å vokse ved å omforme kjemikaler fra miljøet til nye celler, og • inneholder gener, og er del av en evolusjonsprosess: endringer i genene videreføres til etterkommere. Noen celler • kan bevege seg på egenhånd ved hjelp av spesialiserte strukturer (dette kalles motilitet), • kan forandre form og egenskaper i løpet av forskjellige faser i en livssyklus (dette kalles differensiering), • kan kommunisere og interagere med andre celler ved hjelp av kjemikalier som tas opp og slippes løs i miljøet, eller • kan overføre arvematerialer til og fra andre celler (dette kalles horisontal genetisk utveksling). Prokaryot celle En kategori relativt enkle celler som omfatter bakterier og arkebakterier. Navnet kommer fra det greske karyon (kjerne), og forteller at dette er cellene som fantes før (pro) det fantes organismer med cellekjerne. Det hender at “bakterie” og “prokaryot” brukes om hverandre litt upresist, men det går stort sett fint. Alle prokaryoter har • en cytoplasmamembran (se eget avsnitt), • en nukleoid : sirkulært DNA som inneholder den genetiske koden til organismen, som ikke ligger i en cellekjerne, og • ribosomer, som utfører translasjon (lager proteiner fra RNA). De fleste prokaryoter har • plasmid er: små, ekstra fragmenter av DNA utenfor nukleoiden, • en cellevegg som beskytter cellen mekanisk og kjemisk fra omgivelsene og er et ekstra beskyttende lag, og/eller • flagella og pili (strukturer på utsiden av cellen som gjør cellen i stand til å bevege seg på egenhånd og kommunisere med andre celler). Katalytiske funksjoner Celler utfører kjemiske reaksjoner som akselereres via enzymer. Dette beskrives i Kapittel 2. De katalytiske funksjonene til en celle fasiliterer cellevekst, og inkluderer lagring av energi i form av ATP, 1 Eukaryot celle Cellene som planter, dyr og sopper selv om konsentrasjonsgradienten i miljøet skulle tilsi består av. De er større og mer komplekse enn prokaryote det motsatte, celler. De har forskjellige kompartementer som utfører • er et anker for viktige proteiner (som beskrevet over), spesifikke metabolske oppgaver og er adskilt fra hverandre og med membraner. • spiller en viss rolle i energilagring: det produseres eller brukes energi når ioner passerer cellemembraAlle eukaryoter har nen, avhengig av om ionet henholdsvis følger konsen• en cellekjerne, som inneholder cellens DNA, organistrasjonsgradienten eller går motsatt vei av den. ert i form av kromosomer, • mitokondrier som genererer energi, • en cytoplasmamembran (se under), Regler for bevegelse gjennom cellemembranen • ribosomer, • endoplasmatisk retikulum, et transportnettverk for • Enkelte små uladde molekyler (som vann) kan passere molekyler som skal til bestemte steder, og gjennom passiv diffusjon. • et golgiapparat som prosesserer og pakker makro• Store molekyler og små ladde molekyler kan ikke molekyler som syntetiseres av cellen, f.eks proteiner passere gjennom membranen på passivt vis, men og lipider. må delvis degraderes før opptak. For eksempel må Noen eukaryoter har proteiner degraderes til aminosyrene de består av. • kloroplaster, også kjent som grønnkorn, som utfører • Mange typer molekyler kan passere gjennom aktive fotosyntese, og transportsystemer - disse prosessene er forskjellige • cellevegg. fra stoff til stoff, og kan kreve energi ved bruk av ATP. Cellemorfologi Morfologi er læren om form, og celler kan ha forskjellige former. De vanligste celleformene for prokaryoter er coccus (kulerunde eller eggformede), stav 1.2 Metabolisme (sylindriske) og spirillum (spiralformede). Faktorer som Metabolisme De livgivende kjemiske reaksjonene som kan påvirke cellemorfologi er • Optimalisering av næringsopptak. Dette favoriserer foregår i celler. Den deles opp i katabolisme og anabolisme. små celler med stort areal per volum, siden næringsopptak skjer ved celleoverflaten. • Svømmeevne i tyktflytende medier eller nær over- Katabolisme Den delen av metabolismen som bryter ned organiske stoffer til enklere stoffer og henter energi gjenflater. Dette favoriserer spiralformede celler. nom en rekke kjemiske reaksjoner som kalles celleånding. • Glideevne. Dette favoriserer tynne bakterier. Alle avsnittene mellom dette og “Anabolisme” omhandler Cytoplasmamembran Halvgjennomtrengelig mem- aspekter ved katabolisme. bran som omringer cellen, og skiller innholdet i cellen (cytoplasmaet) fra miljøet. Den er 6-8nm tykk. Den består av et dobbeltlag av fosfolipider der de hydrofobe karbonkjedene er vendt mot hverandre og de hydrofile fosfat/glyserol-endene er vendt utover mot miljøet og innover mot cytoplasmaet. Det finnes andre variasjoner over samme tema, der andre kjemiske grupper er bundet til glyserol-“ryggraden”. Metabolsk diversitet Forskjellige mikroorganismer har gjennom 4 milliarder år med evolusjon utviklet metoder for å oppta energi fra miljøet på nesten alle tenkelige måter. Figur 1 viser en oversikt over metabolsk diversitet: organismer som bruker lys som energikilde kalles fototroper - dette kan skje ved oksygenisk fotosyntese (produserer oksygen) eller anoksygenisk fotosyntese (produserer ikke oksygen). Andre organismer kalles kjemotrofer og opptar energi ved å oksidere kjemisk drivstoff. Organismer som bruker uorganiske stoffer (H2 H2 SFe2+ NH4+ , etc) som energikilde kalles kjemolitotrofer - kun prokaryoter er kjemolitotrofer. Organismer som bruker organiske stoffer (glukose, acetat, etc.) som energikilde kalles kjemoorganotroper - aerobe organismer bruker oksygen for å ta opp energi og anaerobe organismer opptar energi i fravær av oksygen). Uansett hvordan energien er tatt opp fra miljøet, lagres den som ATP. Proteiner i cytoplasmamembranen Det finnes proteiner som “setter seg fast” inne i cellemembranen. Disse kalles membranproteiner. De kan enten stikke ut på en side (perifere membranproteiner) eller på begge (dvs. at de går tvers igjennom - integrale membranproteiner). Dette stabiliseres av hydrogenbindinger. I tillegg kan Mg2+ og Ca2+ -ioner stabilisere membranen ved å lage ionebindinger. Membranforsterkere Noen membranforsterkende stoffer er steroler (stive plane lipider som finnes i eukaryoter) og hopanoider (ligner på steroler og finnes i bakterier). Autotrofer og heterotrofer Alle organismer trenger karbon. Autotrofer får karbonet sitt fra CO2 , og kalles ofte primærprodusenter. Heterotrofer trenger ett eller flere organiske molekyler som kilde for karbon, og får tak i dette enten ved å spise autotrofer eller produkter som produseres av autotrofer, eller ved å spise andre heterotrofer. Funksjonene til cytoplasmamembranen Cytoplasmamembranen • er en halvtgjennomtrengelig membran som er spesifikk nok til at næringsstoffer kommer inn og avfallsstoffer går ut (ved hjelp av transportproteiner), 2 • nukleinsyrer (består av nukleotider, brukes til å lagre, transportere og uttrykke genetisk informasjon), • proteiner (består av aminosyrer, brukes til enzymer, som strukturelle komponenter og til transport av molekyler), og • lipider (består av glyserol, fettsyrer og i noen tilfeller fosfat, fungerer som membraner (enten cytoplasmamembranen eller intracellulære kompartmenter)). Ekstremofile organismer Organismer som overlever i ekstreme habitater der de har funnet sin egen nisje, for eksempel kokende varme kilder, breer, og vann med ekstremt høy saltkonsentrasjon eller pH. Teknikkene som ekstremofile organismer bruker for å takle slike miljøer, kan være interessante å studere, bruke og forsøke å gjenskape. Aerob glukosemetabolisme Aerob glukosemetabolisme er cellens mest effektive metode for å produsere ATP. Det kalles også respirasjon, og involverer den vanlige reaksjonen for celleånding: 38 ADP til ATP C6 H12 O6 + 6 O2 −−−−−−−−−−→ 6 CO2 + 6 H2 O Anaerob glukosemetabolisme Kalles fermentering, og involverer reaksjoner som 1-4 ADP til ATP C6 H12 O6 −−−−−−−−−−−→ 2 C2 H5 O2 + 2 CO2 Det produseres mye mindre cellemasse gjennom fermentering enn ved respirasjon (kun 5%). Reaksjonen krever mer glukose per ATP som blir produsert, og produserer sideprodukter som etanol. Eksempler på anaerob Figur 1: Klassifisering av organismer, basert på energikilde. glukosemetabolisme er gjæring, og er når menneskekroppen danner melkesyre. Energibærere Energivalutaen i celler er Adenosin trifosfat (ATP). ATP er det som produseres når cellen bryter ned næringsstoffer, og det som brukes når cellen skal gjøre noe som krever energi. Reaksjonen der ATP mister en fosfatgruppe for å bli adenosin difosfat (ADP) slipper løs 32 kJ/mol. De samme gjelder ADP −−→ AMP. AMP −−→ Adenosin slipper løs 14 kJ/mol når fosfatadenosin-bindingen kuttes. Ett vannmolekyl inngår i hver slik spaltning. Gjæring Når konsentrasjonen av O2 blir lav, endres genuttrykket i gjær slik at det er andre enzymer som aktiveres. I stedet for enzymene som utfører aerob metabolisme, aktiveres enzymene som utfører anaerob metabolisme. Dette er prinsippet bak gjøring. Elektronbærere Energibærere som overfører elektroner: Metabolsk spor Et metabolsk spor er en tegning av nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) og flavin adenin veien fra næringsstoff til produkt, med piler mellom mellomprodukter. Skissering av metabolske spor med glukose dinukleotid (FAD). som utgangspunkt sies å være veldig eksamensrelevant. Langtidslagring av energi Gjøres ved å lagre stoffer som uløselige polymerer som kan oksideres for å generere ATP. Noen eksempler er glykogen, polyhydroksyalkanoater Glukosemetabolisme Figur 2 er en omformulering av og svovel i prokaryoter; og stivelse og fettsyrer i eukaryoter. figuren på slides, og kan med fordel pugges siden detaljer herfra har vært eksamensoppgaver. Det er naturligvis en del forenklinger her, blant annet forklares det ikke hvor Anabolisme Den delen av metabolismen som lager celman får vann fra. Man blir ikke så fryktelig klok på hvorfor lens byggestoffer fra enklere stoffer gjennom energikrevende glukosemetabolisme er relevant for resten av stoffet ved å reaksjoner. se på denne figuren. Det blir man derimot ved å se på den utvidede figuren i Box 1.4 i Renneberg; når du er ferdig Cellens byggestoffer er med å lese hele pensum kan du stirre lenge og vel på den • karbohydrater (består av monosakkarider som figuren, og innse at nesten alle bioproduktene som har blitt glukose og fungerer som energilager samt en kompo- diskutert til syvende og sist stammer fra nedbrytning av nent i cellevegger), glukose. 3 når H fra en aminogruppe og OH fra en karboksylsyregruppe går ut som et vannmolekyl, og legger igjen en binding som ser slik ut: På grunn av resonans i peptidbindingen (i resonansstrukturen som ikke er vist i figuren, blir C−O-bindingen til en C−O– -binding, mens C−N-bindingen blir til en C−N+ binding) kan ikke molekylet rotere rundt en peptidbinding, og alle atomene som inngår i en peptidbinding (C, O, N, H) ligger i samme plan. Figur 2: Oversikt over glukosemetabolismen 2 Peptider Korte kjeder av aminosyrer kalles peptider og navngis ved å begynne på den terminale aminogruppen, traversere peptidet til man støter på den terminale karboksylsyregruppen, og ramse opp alle aminosyrene på veien. Fullstendig navngivning av proteiner er dermed upraktisk, men det som er så fint er at det finnes altså en russisk fyr som har uttalt hele det fullstendige systematiske navnet til verdens lengste protein (titin). Det tok så lang tid at man kunne se forskjellen i skjeggvekst på starten og slutten av opptaket. Enzymer Dette kapittelet forklarer hva proteiner er laget av og hvordan de er bygd opp. Så går vi nærmere på enzymer og hvordan de fungerer. Mot slutten også noen eksempler på enzymer, enzymkatalyserte reaksjoner og bioteknologiske løsninger som tar i bruk enzymer. 2.1 Proteiner Primærstrukturen til proteiner er sekvensen av aminosyrer, samt eventuelle disulfidbindinger mellom cysteingrupper. Primærstrukturen gir opphav til sekundær- og tertiærstruktur (men du blir ikke akkurat så mye klokere på høyere ordens struktur ved å se på aminosyresekvensen). Aminosyrer Karbon bundet til et hydrogenatom, en karboksylsyregruppe og en aminogruppe, samt en såkalt R-gruppe som kan være mye rart (upolar alifatisk som i glysin, aromatisk som i fenylalanin, polar uladd som i serin, positivt ladd som i lysin, negativt ladd som i aspartat). 9 av de 20 aminosyrene som brukes i proteinsyntese er essensielle aminosyrer som må opptas gjennom mat. Sekundærstrukturen til proteiner er lokale strukturer i proteinet. Det er bare to slike strukturer vi snakker noe særlig om: α-helikser og β-flak. D- og L-stereoisomeri En type stereoisomeri for aminosyrer, som fungerer som følger: hvis man lar hydrogenatomet gå inn i arket, har man L-formen hvis gruppene som går mot klokka er COOH −−→ R −−→ NH2 , og D-formen hvis man får denne rekkefølgen ved å gå med klokka. α-heliks Proteinet kan kveile seg i en spiral, som kan være venstre- eller høyrehendt. Denne strukturen stabiliseres av hydrogenbindinger langs spiralens akse. I en slik spiral kan man for eksempel ha at en side er hydrofob, mens den andre er hydrofil. β-flak Flak som dannes når rette “tråder” av proteinet bretter seg frem og tilbake, med hydrogenbindinger mellom trådene. Hvis trådene går i samme retning, er flaket parallelt, og hvis de går i alternerende retninger er flaket Av en eller annen grunn finnes kun L-enantiomerene antiparallelt. β-flak er foldet i “trekkspill-mønster”, og til aminosyrene i proteiner. D-aminosyrer finnes an- R-gruppene på aminosyrene vil stå ut av flaket. dre steder i naturen, der de fungerer som mellomtrinn i aminosyremetabolisme, i polypeptider i celleveggene til Tertiærstrukturen til proteiner er den tredimennoen bakterier, og som nevrotransmittere (signalstoffer). sjonale strukturen som reflekterer proteinets funksjon. Slik Det har også blitt syntetisert proteiner av D-enantiomerer struktur er stabilisert av hydrofobe interaksjoner med vann i laboratoriet - disse vil være speilbilder av proteinene som (hydrofobiske grupper vender seg mot midten av proteinet dannes fra L-enantiomerene. og hydrofile grupper vender seg utover) samt hydrogenbindinger og ioniske interaksjoner som optimaliseres i de Peptidbinding Aminosyrer bindes sammen via peptid- mest termodynamisk stabile strukturene. Disse interakbindinger i lange polymerer som vi kaller proteiner. En sjonene gjør at proteiner har en tendens til å “krølle seg peptidbinding dannes gjennom en kondensasjonsreaksjon sammen” til den karakteristiske klumpete formen. 4 Kvartærstrukturen til proteiner I noen tilfeller er det flere proteiner, eller flere molekyler av det samme proteinet, som går sammen for å danne en større struktur. Denne strukturen kalles da kvartærstrukturen til proteinet. Et eksempel på et protein med kvartærstruktur er hemoglobin, der 4 polypeptidkjeder går sammen for å danne én funksjonell enhet. gjør at enzymet lokalt ligner på en organisk (upolar) løsning. Dermed blir de få polare gruppene i nærheten svært reaktive i forhold til det de ville vært i vandig løsning. Kofaktorer Kjemiske stoffer som ikke er proteiner, og som et enzym krever for å utføre oppgaven sin. Typisk inorganiske molekyler som Fe3+ , Mg2+ , Mn2+ og Zn2+ . Koenzymer Organiske forbindelser som binder seg til eller i nærheten av det aktive setet. De modifiserer strukEnzym Biologisk katalysator som får reaksjonene i cellen turen til substratet eller beveger elektroner, protoner eller til å gå raskere ved å senke aktiveringsenergien til reakkjemiske grupper mellom substratet og enzymet. I motsetsjonene. ning til enzymene selv brukes koenzymer opp i enzymkatalyserte reaksjoner. Mange av disse kommer fra vitaminer, Struktur til enzymer De fleste enzymer er proteiner. for eksempel NAD+ fra vitamin B. Det finnes også enzymer som består helt eller delvis av RNA, disse kalles ribozymer. Proteiner er bygget opp av Klassifisering av enzymer Det finnes seks typer enaminosyrer som er kovalent bundet til hverandre i lange zymer, som navngis etter hva de gjør: kjeder. Et område på en enzym der det foregår en reaksjon • oksidoreduktaser reduserer ett stoff og oksiderer et kalles et aktivt sete. annet, • transferaser overfører kjemiske grupper fra et stoff Substrat Enzymer er gjerne veldig spesifikke, i så stor til et annet (gjerne ved hjelp av koenzymer), grad at proteinet har en fysisk form der molekylet som skal • hydrolaser kløyver stoffer med addisjon av vann, prosesseres (dette molekylet kalles substratet) passer inn. • lyaser kløyver stoffer uten addisjon av vann (og danner gjerne dobbeltbindinger eller ringstrukturer), • isomeraser omdanner et molekyl til en annen isomer, Nøkkel-i-lås Dette var den første hypotesen om samog spillet mellom enzymet og substratet: at substratet passer • ligaser bruker ATP for å binde sammen to stoffer. perfekt inn i enzymet fordi enzymet er en romlig negativ av substratet. En slik hypotese forklarer hvordan enzymer kan være så spesifikke. Eksempler på enzymer og enzymkatalyserte reaksjoner • Ekstracellulære hydrolaser produseres av mikrober Hånd-i-hanske Det har vist seg at substratet fungerer og slippes ut i miljøet for å degraderer biopolymerer mer som en hånd i en handske, fordi substratet og enzymet til mindre enheter som kan tas opp av mikroben. kan påvirke hverandre underveis i reaksjonen. Enzymet og De brukes også av edderkopper til såkalt ekstrainsubstratet er altså litt mer fysisk fleksible enn nøkkel-i-låstestinal fordøyelse. Ekstracellulære hydrolaser er av analogien skulle tilsi. naturlige grunner de enzymene som er enklest og billigst å ekstrahere fra en cellekultur - det er ikke Lysozym er det første proteinet som ble analysert ned til noen cellemembran mellom deg og enzymet. De fire den minste atomære detalj. Lysozym hydrolyserer bindinneste eksemplene er ekstracellulære hydrolaser. gen mellom sukkerring 4 og 5 i et molekyl som består av 6 • Malt inneholder amylaser, som bryter opp stivelse til sukkerringer. kortere oligosakkarider, samt glucoamylase, som bryter opp oligosakkarider til glukose. Disse enzymene Glukoseoksidase Dette proteinet omformer β − Dkan brukes i baking for å bryte ned stivelse til sukker glukose, men ingen andre sukkerarter eller karbohydrater, og dermed akselerere heving, samt for å degradere til glukonolaton. Dette er fordi det kun er β − D-glukose klebrig gluten og gjøre deigen luftigere. I tekstilindussom er lite nok og passer akkurat inn i den romlige struktrien tilsetter man gjerne stivelse for å få fibrene til turen til glukoseoksidase. Glukoseoksidase er med andre å holde seg sammen under veving. Amylaser brukes ord svært substratspesifikt enzym. til å fjerne stivelse når vevingen er ferdig. • Pektinaser bryter ned de store pektinmolekylene i Mulige årsaker til reduksjon i aktiveringsenergi frukt for å gjøre juicen mindre tyktflytende. Hvis Enzymer kan redusere aktiveringsenergien til en reaksjon. man ikke fjerner pektin, får juicen en gel-aktig konEnzymet binder seg ikke til substratet i sin opprinnelige sistens som er uønsket og vanskelig å håndtere. Pekkonfigurasjon, men til en mellomtilstand som kan være tinaser hentes fra Aspergillus- og Rhizopus-sopp. deformert i forhold til det originale stoffet. • Papaya, fiken og ananas inneholder proteaser som Inne i enzymet er svært reaktive funksjonelle grupper bryter ned bindevev i kjøtt, og dermed gjør det konsentrert på et veldig lite område, og satt sammen på mørere. De samme enzymene brukes også for å mykne en måte som gjør at de er i direkte kontakt med bindinlær. gene i substratet som skal modifiseres. Området rundt • Hydrolaser med lav substratspesifisitet: brukes som det aktive setet består stort sett av upolare grupper, som vaskemidler som bryter ned fett og proteiner, som 2.2 Enzymer 5 binder seg til fibrene i tøy. Fett og proteiner er “limet” som gjør at skitt setter seg fast i klær. Enzymer er nyttige fordi de gjør at man kan gjøre oppvasken på relativt lav temperatur. Før i tida måtte slike enzymer hentes ut fra bukspyttkjertler til dyr, men etter at enzymet subtilisin ble oppdaget i Bacillus licheniformis på 60-tallet, inneholder vaskemiddel som regel hydrolytiske enzymer fra mikroorganismer. Andre enzymer som brukes i vaskemiddel er cellulaser, som bryter ned mikrofibre i bomull og gjør stoffet mer mykt, og amylaser og lipaser som fjerner matrester i vaskemaskiner. • Fosfor i planter lagres gjerne i form av fytat, en seksringet forbindelse. Mennesker og dyr klarer ikke å ta opp fosfor i denne formen, men det finnes mikrobiell fytase som hydrolytisk kløyver fytat slik at man ender opp med fosfat, som vi kan ta opp. Fytaser er et spesielt nyttig tilskudd i grisefôr, fordi man slipper å tilsette så mye miljøskadelig fosfat (kapittel 6) i fôret. • Glukoseisomerase: brukes til å omdanne glukose til fruktose, som er søtere enn glukose (og sukrose). eukaryote celler er DNA lagret i cellekjernen, samt i mitokondrier og kloroplaster, som har eget DNA (da disse organellene opprinnelig var bakterier med eget arvemateriale). Grunnenheten som DNA består av er en nukleotid : en base (adenin(A), guanin(G), cytosin(C) eller tymin(T)/uracil(U) (sistnevnte er henholdsvis for DNA og RNA)) bundet til et molekyl av sukkeret deoksyribose (eller ribose, i RNA), som så er bundet til en fosfatgruppe. Sammensetning Nukleotidene er bundet til hverandre gjennom fosfodiesterbindinger for å danne en polynukleotidkjede. Vi sier at kjeden har en retning, 5’→3’, fordi 5’-hydroksygruppen på ett nukleotid er bundet til 3’hydroksygruppen på et annet nukleotid via en fosfatgruppe. Per konvensjon begynner vi på ende-fosfatgruppen som er bundet til en 5’-hydroksygruppe. Dobbeltstrengen i DNA i DNA er hver nukleotid i en polynukleotidkjede bundet til en tilsvarende nukleotid i en annen polynukleotidkjede etter regelen A ←−→ T, G ←−→ C. Denne baseparringen skjer på grunn av hydrogenbindinger mellom basene: adenin og tymin danner to hydrogenbindinger seg imellom, guanin og cytosin danner tre hydrogenbindinger seg imellom. Dette holder DNA, som altså egentlig er to molekyler (polynukleotidkjeder), sammen som om det var ett molekyl. Derfor kommer det noe ukorrekte begrepet “DNA-molekyl” til å bli brukt videre i teksten. De to strengene i DNA er antiparallelle - 3’-enden på en streng korresponderer til 5’-enden på en annen streng. Immobiliserte enzymer Enzymer som på en eller annen måte sitter fast i et medium. Metoder for å immobilisere enzymer inkluderer adsorbsjon til fibre, kovalente bindinger til fibre, krysslinking mellom enzymer, immobilisering i gel eller hule fibre og mikrokapsler. Det som er fint med immobiliserte enzymer, er at de kan utføre reaksjoner under kontrollerte betingelser uten å legge igjen enzymrester i produktet (nyttig for å forhindre immunreaksjoner i pasienter). Samtidig blir mindre av Replikasjon av DNA At DNA tar form som en dobbeltenzymet kastet bort; enzymet er resirkulerbart. streng, gir opphav til en mekanisme for å kopiere et DNAmolekyl. De to strengene separeres, og en ny streng settes Enzymkilder Hvis vi vil ha tak i enzymer til eget bruk, sammen ved å bruke nukleotider etter regelen for baseparhar vi forskjellige kilder. Av det som ikke er nevnt tidligere: ing. Dermed pares hver av strengene i DNA opp med en Bukspyttkjertler, spesielt til gris, inneholder mye fint: nylig syntetisert komplementær streng, og da har man to trypsin, chymotrypsin, lipaser og amylaser. Magesekker DNA-molekyler. Enzymene som utfører denne operasjonen inneholder pepsin. En av de nyttigste enzymkildene er heter DNA polymerase. mikroorganismer, som er veldig greie å ha med å gjøre og kan gros på laben og i reaktorer - og via genteknologi kan en- Strukturen til RNA RNA ligner mye på DNA, med zymene skreddersys. Det finnes også mange bruksområder følgende forskjeller: for enzymene som dannes av ekstremofile mikroorganismer, • der det er deoksyribose i DNA er det ribose i RNA for eksempel DNA polymerase, som vi skal se blir nyttig i • der det er tymin i DNA er det uracil i RNA analytisk bioteknologi (kapittel 10). • RNA består av én streng i stedet for to 3 RNA kan ha intrikate sekundærstrukturer, som gjør at det også kan danne enzymer. Ribosomer, for eksempel, er komplekser av protein og RNA. Genteknologi Proteinsyntese Proteiner dannes som vist i Figur 3. mRNA (messenger-RNA) syntetiseres fra DNA-et (transkripsjon), som inneholder informasjonen som skal til for at et ribosom kan sette sammen det riktige proteinet (translasjon). Under translasjon er det grupper på tre baser, som kalles kodoner, som bestemmer hvilken aminosyre som skal settes inn i polypeptidkjeden. At informasjonsflyten er DNA→RNA→protein, og ikke motsatt, kalles det sentrale 3.1 Strukturen til DNA og RNA dogmet i molekylærbiologi. Likevel kan noen virus synteByggecellene i DNA og RNA DNA er molekylet som tisere DNA fra en RNA-mal gjennom reverstranskripsjon inneholder den genetiske informasjonen til organismer. I (kapittel 5). Dette kapittelet Del 1 forklarer strukturen til organismers arvemateriale, og hvordan kroppen bruker DNA til å lage proteiner. Del 2 forklarer hvordan man kunstig kan modifisere arvematerialet med genteknologi. Del 3 tar for seg historien til kunstig fremstilt insulin, som tar opp en del plass i boka. 6 Kloning av gener med plasmider Konjugering kan utnyttes til å klone gener: ved å klippe opp DNA med et gen man ønsker å kopiere, samtidig som man kløyver et plasmid, og så prøver å “smugle inn” det ønskede genet i plasmidet med ligaser, vil det modifiserte plasmidet spre seg i bakteriekolonien slik at man etter hvert har en bakteriekoloni full av bakterier med det ønskede genet (inni et plasmid). Restriksjons-endonukleaser Klippingen som ble beskrevet over, gjøres med restriksjons-endonukleaser - molekylære “sakser”. Restriksjons-endonukleasene er hentet fra bakterier som bruker enzymet som en forsvarsmekanisme til å klippe opp virus-DNA. Det er mer enn 1200 kjente restriksjonsendonukleaser, og hver av dem er svært spesifikke (de kutter ved bestemte sekvenser på en bestemt måte). Enzymet lager et “skjevt kutt” slik at det er “klebrige” ender med enkelt-streng-DNA på hver side av kuttet. Se figur i Renneberg om akkurat hvordan dette kuttet er. Dette gjør at andre DNA-fragmenter med like ender kan hektes på (med andre enzymer som kalles DNA-ligaser). Ved å kombinere forskjellige restriksjonsendonukleaser som danner DNA-fragmenter som passer sammen på riktig måte, kan man altså overføre gener fra ett sted til et annet. Figur 3: Genetisk informasjonsflyt i cellen. En noenlunde nøyaktig beskrivelse av veien fra DNA til protein (med korrekte molekylmodeller) finnes her: https://www.youtube.com/watch?v=D3fOXt4MrOM Strukturen til et gen Strukturelle gener inneholder informasjonen som skal til for å kode enkeltproteiner, for eksempel enzymer. Ved siden av de strukturelle genene er det sekvenser som kontrollerer om genet skal uttrykkes (det vil si om det faktisk skal dannes proteiner basert på informasjonen som ligger i genet). En slik sekvens - en start-sekvens (promoter ) - en kort sekvens som enzymet RNA-polymerase kan binde seg til, før det vandrer langs DNA-kjeden og syntetiserer RNA fra og med start-sekvensen. Etter hvert møter RNA-polymerase på en stopp-sekvens (terminator ) som avslutter transkripsjonen. Mellom promoteren og det strukturelle genet finnes det ofte en operator-region der et repressorprotein kan sette seg fast og forhindre at genet blir uttrykt. En inducer kan binde seg til dette proteinet på en slik måte at proteinet endrer form og forlater operatorregionen. Et eksempel på en slik inducer er sukker, som kan binde seg til repressorproteiner for gener for sukkernedbrytende enzymer. Dermed kan forskjellige gener uttrykkes avhengig av hvilke stoffer som befinner seg i organismen. Introner For å klone et eukaryot gen kan man ikke akkurat kutte opp DNA-et, fordi det er fullt av ikke-kodende sekvenser (introner). I RNA danner slike introner sløyfer som kuttes av før det dannes proteiner av RNA-et, så intronene har ikke noen effekt på hvordan genet uttrykkes, men det fører til kaos når man prøver å klone genet med restriksjons-endonukleaser. Kloning av eukaryote gener Derfor trenger man heller såkalt “voksent” mRNA der de ovennevnte sløyfene har blitt kuttet av. Ved å bruke et enzym fra virus, revers transkriptase, kan man danne DNA fra slikt mRNA. Det resulterende kopi-DNAet (cDNA) kan så inkorporeres i et plasmid på samme måte som beskrevet over, og proteinet man ønsker kan syntetiseres i bakterielle celler. Hvis riktig mRNA ikke er tilgjengelig er det også mulig å syntetisere akkurat de nukleotidsekvensene man vil med en DNA-synthesizer (keyboard selges separat). Rekombinasjon Utveksling av genetisk materiale mellom to DNA-molekyler. Sammen med mutasjon er rekombinasjon den viktigste mekanismen som fører til genetisk variasjon. Det er mekanismen som gjør at et barn har DNA som er en blanding av DNA-et til foreldrene. Det er også en mekanisme som virus bruker for å injisere arvematerialet sitt i vertens DNA (kapittel 5). 3.2 Hybridisering Man har en DNA-probe som består av en enkeltstreng med den komplementære sekvensen til den sekvensen man vet at man ønsker. Den kan for eksempel lages med en DNA-synthesizer. Proben markeres med et radioaktivt eller selvlysende molekylært “flagg”. Proben legges til en bakteriekultur der man har ødelagt cellemembranene med vaskemiddel og spaltet dobbeltheliksen med natronlut, slik at man har en masse enkeltstrenger. Proben vil kun pare opp med sekvensen man ønsker seg, som resulterer i et hybridisert DNA av typen man ønsker seg. Så vasker man ut probene som ikke har bundet seg til noe. Hvis man har selvlysende flagg kan man enkelt identifisere en del av en bakteriekoloni som har rekombinant DNA ved å lyse på den med røntgenstråler og se på den i et mørkt rom. Genmodifisering OBS! Teknikkene som diskuteres i dette delkapittelet er ekstremt viktige, og dukker opp igjen og igjen i senere kapitler. Særlig bruken av restriksjons-endonukleaser og plasmider er fundamentale verktøy. Plasmider Små ring-formede biter av DNA som finnes utenfor den mye større DNA-kjeden til bakteriene. En celle har ofte 50-100 små og 1-2 store plasmider, og de fleste kan reprodusere i cellen uavhengig av hoved-DNAet. De store plasmidene kan utveksles mellom bakterier i en prosess som kalles konjugering. 7 Affinitetskromatografi En form for kromatografi der man utnytter at forskjellige stoffer binder seg forskjellig til spesifikke antistoffer (kapittel 5). Dette kan brukes for å foredle rekombinante proteiner man har laget fra resten av proteinene i bakterieekstraktet. For eksempel binder insulin seg mer til insulin-antistoffer enn andre proteiner gjør. Ved å la bakterieekstraktet renne gjennom en kolonne med slike insulin-antistoffer, vil kun insulinet sette seg fast i antistoffet og forbli i kolonnen. Deretter løser man opp antistoff-insulin-bindingen med en spesifikk svak syre, slik at man ender opp med en løsning insulin er det eneste proteinet. og ender opp med griseinsulin der alanin er erstattet med treonin, det vil si menneskelig insulin. Rekombinant insulin fra E. coli Insulin består av 2 separate kjeder som er bundet til hverandre med disulfidbindinger. Disse to kjedene kommer fra det samme proteinet, som har blitt spaltet i to i bukspyttkjertelen. Bakterier og gjær har ikke evnen til å gjøre dette, så direkte syntese av insulin med rekombinante plasmider er ikke mulig. For å syntetisere insulin med bakterier gror man heller to kjedene separat og setter dem sammen etterpå. På grunn av Frederick Sangers arbeid med DNA-sekvensering (kapittel 10) er basesekvensen i genet for DNA kjent, så ved å manuelt syntetisere de riktige oligonukleotidene for de to kjedene, og sette det inn i plasmid-DNA, kan man syntetisere de riktige kjedene. Ved Asilomar-konferansen i 1975 diskuterte noen forskere mulige risikoer ved genteknologi. For eksempel: hva om man kunne lage antibiotikaresistente karsinogene tarmbakterier og forårsake en kreft-epidemi? Eller hva om man fikk bakterier til å produsere aktivt insulin, og de ved et uhell kom seg inn i mennesker og overlevde der? Det ville forårsaket insulinsjokk. Disse hypotetiske situasjonene ble blåst opp til skremmehistorier i mediene, og National Institute of Health satt ned strenge retningslinjer for genteknologi. En konsekvens av dette var at de to kjedene i insulin måtte gros separat i forskjellige bakteriekulturer. Genmodifisering av eukaryote celler Genmodifisering av eukaryote celler er mye mer komplisert enn det tilsvarende for prokaryote celler, fordi genmaterialet er pakket inn som kromosomer i en cellekjerne. Genet man ønsker å introdusere må injiseres inn i DNAet via en eller annen vektor (gjerne et bakterielt plasmid med et antibiotikaresistens-gen, av grunner som blir åpenbare senere i avsnittet), men man må også sørge for at genet faktisk uttrykkes i cellen. DNA-genet man ønsker å introdusere, introduseres til plasmidet med kloningsmetodene som er beskrevet over (restriksjonsendonukleaser og ligaser). Samtidig må en startsekvens/promoter legges inn rett før genet, slik at man i sluttproduktet får et gen som faktisk blir uttrykt. Så lar man dette plasmidet forplante seg gjennom en bakteriekoloni i en løsning med et antibiotikum. Kun bakterier med det ønskelige plasmidet vil ha resistansgenet som gjør at de kan vokse og replisere på tross av antibiotikumet. Når man så har massevis av det rekombinante plasmidet, kan det introduseres i den eukaryote cellen på forskjellige måter: enten ved mikroinjeksjon (fysisk injisere plasmidet med en veldig tynn nål, rett inn i cellekjernen, slik at plasmidet, om man er heldig, blir en del av kromosom-DNAet) eller fagocytose (at man på et eller annet vis utnytter cellens egne mekanismer som den bruker for å “spise opp” partikler). Deretter gror man de eukaryote cellene i et selektivt medium som kun lar cellene med rekombinant DNA overleve. Menneskeskapte insulinvarianter Det har blitt produsert varianter av insulin som ikke eksisterer i naturen, og som har litt andre egenskaper enn vanlig insulin. Et vanlig problem med insulin er at det når blodomløpet for sakte: høye konsentrasjoner av insulin danner heksamerer, men insulin kommer ikke inn i blodomløpet med mindre det er i form av dimerer eller monomerer. Dermed blir insulinnivået for lavt i begynnelsen, og etter hvert som insulinet brytes opp i mindre komponenter, holder nivået seg for høyt for lenge. Derfor har man produsert insulin der man har byttet plass på prolin og lysin på plass 28 og 29. Denne typen insulin fungerer raskere enn naturlig insulin. Andre varianter som fungerer enda tregere enn 3.3 Kunstig fremstilt insulin vanlig insulin, som varer i opp til 24 timer, forskes det også Konvertering av griseinsulin til menneskelig in- på. I slike trege varianter har man forlenget én av kjesulin Insulin til behandling av diabetes ble i begynnelsen dene for å danne insulin som danner enda mindre løselige tatt ut fra bukspyttkjertelen til ku og gris. Slikt insulin heksamerer. er ikke helt likt vårt - griseinsulin er forskjellig i en av aminosyrene på enden: de har alanin der mennesker har 4 Industriell bioteknologi treonin - og dette fører til bivirkninger og immunreaksjoner fordi immunsystemet kjenner igjen dyreinsulinet som forskjellig fra dens eget insulin. En metode for å konvertere den terminale aminosyra Dette kapittelet Del 1 beskriver hvordan celler responi griseinsulin til treonin ble funnet på 80-tallet. Det viser derer på endringer i omgivelsene. Del 2 forklarer metoder seg at trypsin, et proteinnedbrytende enzym i magesekken, vi har for å få cellene til å lage kjemikalier vi ønsker oss. spesifikt hydrolyserer proteiner og peptider ved siden av Del 3 er eksempler på industrielle produkter. Det siste aminosyrene lysin og arginin. I griseinsulin er alaninet man eksempelet, antibiotika, er stort nok til å få sin egen del. ønsker å konvertere rett ved siden av lysin, og dermed kan alaninet kløyves av insulinet ved å tilsette trypsin. Sam4.1 Adaptasjon tidig behandler man insulinet med en treonin-tertbutylester i organisk løsning, slik at treonin setter seg der alaninet var. Taktisk og strategisk adaptasjon Vi skiller mellom Til slutt tilsetter man vann for å kløyve av tert-butanol, to kategorier av mekanismer som celler har for å tilpasse 8 seg endringer i miljøet. Kort og godt er forskjellen mellom dem at: • Taktisk adaptasjon er endring i enzymaktivitet: miljøet påvirker hvordan og i hvor stor grad et enzym fungerer. • Taktisk adaptasjon går raskt, gjerne i løpet av noen sekunder. • Strategisk adaptasjon er endring i genuttrykk : miljøet påvirker hvorvidt genet for et enzym uttrykkes. • Strategisk adaptajon går tregt, gjerne i løpet av timer eller dager. glukose til et medium der eneste sukkerart er laktose, vil slutte å vokse (fordi de ikke har enzymene som kreves for å bryte ned laktose) i 20 minutter, før de begynner å vokse igjen (fordi de nå har klart å lage disse enzymene). Fenomenet, som kalles induksjon, skjer fordi laktose er en inducer (kapittel 3, “Strukturen til et gen”) som binder seg til repressorproteinet som sitter på genet for laktosenedbrytende enzymer. Repressorproteinet endrer form slik at det ikke lenger sitter fast på DNA-et, og kan ikke lenger blokkere RNA polymerase fra å transkribere genene for laktosenedbrytende proteiner. Et tilsvarende eksempel er gjær, som beskrevet mot slutten av kapittel 1. Å motvirke endringer i miljøet ved å midlertidig hemme hemmingen av syntesen av et enzym kalles, noe forvirrende, “negativ kontroll”, og må for all del ikke forveksles med negativ feedback. Strategisk adaptasjon lar cellen bruke ressursene sine effektivt - for en bakterie ville det vært uøkonomisk å til enhver tid produsere alle enzymene den noensinne trenger, og for en høyere organisme er strategisk adaptasjon en absolutt nødvendighet (det hadde jo ikke vært så fint hvis nerveceller drev og produsere magesyre-enzymer). Taktisk adaptasjon Når cellen regulerer metabolismen ved å bruke enzymene som er tilgjengelig for å utføre reaksjonene som kreves der og da. Et eksempel på taktisk adaptasjon er hvis produktet av en enzymdrevet reaksjon forhindrer enzymets funksjon, slik at konsentrasjonen av produktet kontrolleres ved negativ feedback. Allosteriske enzymer Proteiner som i tillegg til det aktive setet har et allosterisk sete med høy affinitet for bestemte små molekyler. Når slike molekyler er tilstede, forandrer de formen til proteinet slik at virkemåten forandres (det vil si at proteinet aktiveres eller deaktiveres). Det allosteriske setet trenger ikke å ligne på det aktive setet, så aktiviteten til allosteriske enzymer kan påvirkes av stoffer som ikke på noen måte ligner på substratet eller produktet til enzymet. Allosteriske enzymer representerer en type taktisk adaptasjon i celler. Samtidig er mange enzymer laget av flere underenheter, der alle inneholder et aktivt sete og minst ett allosterisk sete. Disse enhetene er så tett bundet sammen at kjemisk binding på ett allosterisk sete vil forandre den romlige strukturen til både den gjeldende enheten og de andre enhetene. Denne koblingen mellom underenheter gjør det mulig å forsterke responsen på de hemmende eller aktiverende signalstoffene (altså stoffene som binder seg til de allosteriske setene) som organismen tar opp. Slike allosteriske enzymer fungerer som regulatorer i organismen, og har en viktig rolle flere steder i den metabolske prosessen. For eksempel kan ett enkelt allosterisk “pacemaker”enzym i begynnelsen av prosessen bestemme takten på hele metabolismen. Et eksempel på dette er syntesen av glutamin i bakterier: når sluttproduktet akkumulerer i cellen, trigger det en negativ feedack-mekanisme. Vi skal se i senere eksempler at negativ feedback i mikrober blir et problem når vi ønsker å bruke organismene til å produsere kjemikalier for oss. Konstitutive enzymer Essensielle metabolske enzymer som alltid er til stede og produseres med en omtrentlig konstant rate. Induserbare enzymer Enzymer som kun produseres når de trengs. Ellers er det repressorproteiner til stede som forhindrer at genet for det induserbare enzymet uttrykkes. 4.2 Industriell bioteknologi Industriell bioteknologi Bioteknologi som brukes i industrielle prosesser. Også kjent som “hvit bioteknologi”. Black box model Den enkleste matematiske modellen av cellevekst, der alle cellereaksjoner grupperes sammen i én enkelt reaksjon, og cellen ses på som en “svart boks” der man ikke bryr seg om mekanismene for reaksjonen. En energikilde, en karbonkilde, en elektronakseptor og nitrogen går inn (energikilde og karbonkilde er som regel, men ikke alltid, den samme); cellen transformerer reaktantene; og biomasse, CO2 , vann og et metabolsk produkt kommer ut. Med denne modellen kan de 6 hovedtypene cellemetabolisme illustreres som i figur 4, hvor vi har henholdsvis 1. Fullstendig oksidasjon. 2. Aerob cellevekst. Forholdet mellom karbon, hydrogen, nitrogen og oksygen i biomassen er 10:18:2:5. 3. Aerob cellevekst med produktdannelse. Eksempel på produkt er glutamat. 4. Anaerob cellevekst med produktdannelse. Eksempel på elektronakseptor er NO3 , eksempel på redusert elektronakseptor er NO2 . 5. Fermentering: metabolisme i mangel av både oksygen og en elektronakseptor. Gir minimal cellevekst. Forskjellene mellom aerob metabolisme og fermentering ble beskrevet i kapittel 1. Strategisk adaptasjon Alle celler i en organisme inneholder den komplette genetiske informasjonen til organismen i DNA-et, men spesialiserte celler i høyere organismer trenger ikke å uttrykke alle genene i DNA-et. Derfor er mye av den genetiske informasjonen undertrykt, avhengig av celletype. Strategisk adaptasjon er cellens metoder for å uttrykke de genene det er ønskelig å uttrykke, og undertrykke resten av genene. Også enkle organismer har strategisk adaptasjon. Enkelte bakterier, når de flyttes fra et vekstmedium med 9 6. Crabtree-effekten (i gjær). Skjer når det er såpass Utbytte kan oppgis som gram biomasse pr. gram suboverskudd av glukose at cellen må produsere etanol strat; gram produkt pr. gram substrat; eller teoretisk for å unngå intracellulær akkumulering av metabolit- maksutbytte, maks gram produkt pr. gram substrat. ter. Utvikling av bioprosesser Den tradisjonelle måten å utvikle organismer som produserer et kjemikalium man ønsker seg, kalles klassisk mutagenese (“classical mutagenesis”) og består av følgende trinn: 1. Identifisere og isolere organismen som produserer det kjemikaliet man ønsker seg. 2. Avle frem organismer med mutasjoner som fører til overproduksjon av produktet. Teknikker for å øke mutasjonsraten beskrives senere, i avsnittet om mutagener. 3. Lab- og pilotprosjekt, der man finner optimale vekstforhold og slikt. 4. Til slutt, produksjon på industriell og kommersiell skala. Alternativer til denne fremgangsmåten innebærer målrettet modifisering av DNA-et til en organisme for å frembringe det ønskede produktet (“metabolic engineering”). Figur 4: Forskjellige typer cellemetabolisme. I “black box”-modellen anter vi at veksten i biomasse er proporsjonal med biomassen (altså enkel eksponensiell vekst). Proporsjonalitetskonstanten µ kalles spesifikk veksthastighet, og er et resultat av at man dumper alle faktorer som kan påvirke veksthastigheten i én og samme parameter. Ligningen for biomassen blir dm = µm, dt der m er biomassen. Hvis biomassen er m0 ved t = 0, er løsningen på differensialligningen at Bioreaktorer Større ståltanker der man lager optimale vekstforhold for ønskelige mikrober ved å kontrollere • Temperatur: høy temperatur steriliserer utstyret og forhindrer forurensning. Lav temperatur hindrer vekst av mikrober, men dreper dem ikke - derfor kan kulde brukes for å oppbevare mikroorganismer. • Trykk: høyt trykk inni reaktoren forhindrer forurensende organismer fra å komme inn i reaktoren. • Fuktighet: det finnes et optimalt fuktighetsnivå for mikroorganismene. • pH: ved å kontrollere pH kan man forhindre vekst av uønskede mikrober og oppfordre til vekst av mikrobene man ønsker. 4.3 m = m0 eµt . Hvis vi måler tiden td som det tar biomassen å fordoble seg, kan vi regne ut µ. Siden m = 2m0 ved t = td , blir ligningen 2m0 = m0 eµtd , så td = ln 2 ln 2 =⇒ µ = . µ td En slik enkel modell har naturligvis sine begrensninger for eksempel forutsier den at en E. coli -bakterie med masse m0 = 3 × 10−13 g som deler seg etter td = 20 min (realistisk ved optimale vekstbetingelser) i løpet av 44 timer vil rekke å vokse til en koloni på størrelse med jordkloden. Produktivitet kan oppgis som total produktivitet i milligram pr. sekund eller tonn pr. år; volumetrisk produktivitet som gram pr. liter pr. time; eller spesifikk produktivitet som gram pr. gram biomasse pr. time. 10 Eksempler Lysin Essensiell aminosyre som i naturen kun finnes i små mengder i korn. Man ønsker derfor å produsere lysin industrielt til f.eks dyrefôr. Lysin kan blant annet hentes fra Corynebacterium glutamicum. For å få organismen til å produsere lysin i store mengder, må man forhindre negativ feedback: proteinet som lager lysin, aspartatkinase, blir deaktivert dersom det er både lysin og treonin til stede (treonin blir produsert litt senere i den metabolske prosessen via homoserin dehydrogenase). Hvis man finner en organisme med en mutasjon som forårsaker defekter i denne selvreguleringen, kan man produsere lysin i store mengder. To slike mutasjoner har blitt funnet: det finnes mutanter med • en mutasjon i homoserin dehydrogenase forhindrer produksjon av treonin, slik at det alltid er lave treoninnivåer og aspartatkinase aldri blir deaktivert, og en med • en mutasjon i aspartatkinase som gjør at det ikke deaktiveres av lysin. Glutamat Aminosyre som kan brukes som tilsetning i mat for å få umami-smak. Glutamat dannes i sitronsyresyklusen. Den samme bakterien som ble brukt for produksjon av lysin, Corynebacterium glutamicum, har en lite aktiv variant av enzymet oksoglutarat dehydrogenase. Dette ville forårsaket en opphopning av 2-oksoglutarat i cellen hvis det ikke hadde vært for et annet enzym, glutamat dehydrogenase, som konverterer 2-oksoglutarat til L-glutamat når det er ammoniumioner tilgjengelig. Ved å boble ammoniakk gjennom en bakteriekoloni kan man dermed produsere store mengder glutamat. Et siste problem er hvordan man får cellen til å skille ut glutamat i stedet for å la det hope seg opp i cellen. Løsningen kommer fra at bakterien ikke kan produsere biotin, en viktig komponent i cellevegger, men er avhengig av at det finnes i omgivelsene. Ved å gro bakteriene i et medium med minimale mengder biotin (akkurat nok til å tillate cellevekst) får man bakterier som slipper glutamat gjennom celeveggene. Mikrobiell produksjon av aminosyrer Syntese via mikrober fungerer gjerne mye bedre enn kjemisk syntese hvis man skal produsere stereokjemisk komplekse molekyler, for eksempel biologiske aminosyrer som finnes i L-form som er biologisk aktiv og D-form som er biologisk inaktiv. Med kjemisk syntese ender man opp med rasemater - 50/50-blandinger av L- og D-formen, slik at halvparten av produktet er ubrukelig. Mikrobiell produksjon gir et produkt i 100% L-form (siden enzymene i mikrobene er laget for å produsere L-formen). Vitamin C Også kjent som L-askorbinsyre. Vitamin C kan ikke produseres av menneskekroppen og må derfor være i maten man spiser. Reichstein-metoden for å produsere Vitamin C er en kombinasjon av kjemisk syntese og bioteknologi som består i å D-glukose til D-sorbitol med 1. redusere nikkelkatalysator, 2. la Acetobacter suboxydans konvertere D-sorbitol til L-sorbose med sorbitol dehydrogenase (nesten 100% effekt etter 2 dager), og til slutt 3. kjemisk oksidere L-sorbose til 2-keto-L-gulonsyre, som i sur løsning danner L-askorbinsyre. Aspartam Søtningsstoff som kan dannes av aspartat og fenylalanin, som begge produseres av bakterier eller med enzymer i bioreaktorer. Varer kun i 6-9 måneder, og er noget dyrere enn sakkarin og enzymprodusert fruktose men hvis noen en dag finner en måte å bruke rekombinant genteknologi til å lage aspartamproduserende bakterier vil det trolig få en større markedsandel. Her er det gode muligheter, folkens. Kortison Smertedempende stoff som kan produseres syntetisk med en komplisert prosess på 37 trinn, der noen av trinnene krever ekstreme forhold, til en pris på $260 pr. gram. Ved å ta i bruk mikrobiell hydroksylering kan syntesen kuttes ned til 11 trinn som alle skjer ved normale betingelser, og prisen faller til $1,30 pr. gram. Frem til 1975 hadde den meksikanske produsenten Proquivenex monopol på utgangsstoffet som ble brukt til å produsere kortison (diosgenin). Da de tidoblet prisen, svarte markedet ved å se etter alternative metoder som etter hvert erstattet den meksikanske råvaren, og markedet for diosgenin kollapset. 4.4 Antibiotika Penicillin Etter at Alexander Fleming oppdaget penicillinens bakteriedrepende egenskaper, var det tre problemer som måtte løses for å kunne produsere penicillin billig og i store mengder: 1. Man måtte finne Penicillium-stammen som produserte mest penicillin. 2. Man måtte finne en metode for å gro store mengder av bakterien. 3. Man måtte finne en metode for å isolere penicillin fra vekstmediet. Det første problemet ble “løst” ved at man fant en svært effektiv penicillium-sopp på en cantaloupe i Peoria, Illinois - all sopp som brukes for å produsere penicillin i dag, er muterte etterkommere av denne soppen. Det andre og tredje problemet løses med bioreaktorer. Mutagener For å finne sopp med mutasjoner som øker penicillin-produksjonen, ønsker man å øke mutasjonsraten - det er dessverre umulig å gjøre en målrettet mutasjon av bare ett gen, så man peiser på med mutasjoner og satser på at en av mutasjonene fungerer. Mutagener som øker mutasjonsraten inkluderer • UV-stråling, som gjør at nabo-tymin i DNA dimeriserer. • ioniserende stråling (røntgenstråler, gammastråler, nøytronstråler). • diverse kjemikalier som reagerer med DNA-basene eller påvirker kopieringsprosessen. Bruk av mutagener er en generell teknikk som er spesielt nyttig når man bare ønsker en mutasjon i ett gen. Det er litt verre med produksjon av sopp og bakterier som skal lage antibiotika, siden produksjonen avhenger av mange forskjellige gener. Derfor var det nødvendig med mange runder med seleksjon over et par tiår for å kunne gå fra penicilliumsoppen på cantaloupen i Peoria, til dagens penicillin-produsenter som produserer opp til 2000 ganger så mye penicillin. For å skape virkelig effektive organismer kan man avle frem flere forskjellige stammer parallelt, og etter flere generasjoner med kunstig seleksjon lage hybridorganismer av de forskjelilge datterkoloniene. Se boks 4.7. Merk at superproduserende organismer ikke selv tjener noe på å lage en masse penicillin - de har bare dukket opp fordi mennesker i hvert trinn har valgt ut organismene som tilfeldigvis produserte litt mer penicillin. 11 Virkemåten til penicillin Penicillin dreper (Gramnegative) bakterier ved å forhindre produksjon av cellevegger. Dette gjør den ved å ha en β-laktamring som imiterer peptidbroa i celleveggen. Resultatet er at celleveggen blir så svak at cellen sprekker. Streptomycin og cephalosporiner Alternative antibakterielle stoffer som er nødvendige for å drepe Gramnegative bakterier, samt Gram-positive bakterier som har blitt resistente til penicillin. Lytisk angrep Viruset binder seg til overflaten av cellen og injiserer det genetiske materialet. Cellens egne enzymer og ribosomer sørger for å lage mange kopier av virusets bestanddeler ved å replikere det virale genmaterialet og produsere de virale proteinene. Til slutt setter de forskjelResistens Bakterier kan bli penicillin-resistente ved å lige bestanddelene seg sammen til mange nye, hele virus, produsere β-laktamaser som bryter ned β-laktamringen i som destruerer cellen som skapte dem og sprer seg videre i penicillin. Som svar på dette har man laget nye semisyn- miljøet (eller, hvis cellen er del av en flercellet organisme, tetiske varianter av mikrobiell antibiotika, men hvert nye resten av organismen). antibiotikum er bare en midlertidig løsning før det dukker opp nye bakterier som er resistente til dét også. Sovende viralt DNA Etter å ha infiltrert verten kan viruset, i stedet for å umiddelbart reprodusere og destruere Hvorfor er overforbruk av antibiotika farlig? Over- cellen, forbli inaktivt. Det virale DNAet blir replikert samforbruk av antibiotika vil føre til at resistente bakterier men med resten av cellen når cellen deler seg. Først senere, dannes, fordi man skaper et miljø der kun de antibiotikare- etter flere celledelinger, slår viruset til. sistente bakteriene overlever. Siden bakterier kan utveksle arvemateriale horisontalt via plasmider, vil et antibiotikare- Ikke-lytisk angrep Viruset angriper på andre måter sistansgen kunne spre seg raskt gjennom bakteriekolonien. enn å ødelegge cellen, for eksempel når et “enveloped virus” tar med seg litt cellemembran. Enkelte virus kan også Cyclosporin I jakten på nye former for antibiotika op- angripe celler ved å integrere genomet sitt i verten. pdaget man at Tolypocladium inflatum lager et ringformet peptid som, i tillegg til å være et OK antibiotikum, har en immundempende effekt. Peptidet, cyclosporin, var det første immundempende stoffet som ikke var så kraftig at det satte hele immunsystemet ute av spill. Cyclosporin binder seg spesifikt til visse reseptorer på T-celler og forhindrer reaksjonen av interleukin-2 (et signalmolekyl som setter i gang betennelsesreaksjoner). Oppdagelsen førte til en dramatisk økning i vellykkede organtransplantasjoner, fordi man på noenlunde kontrollert vis kunne forhindre immunsystemet i å avvise det transplanterte organet. Antivirale medisiner Antibiotika har ingen effekt på virus, siden virus ikke har noen egen metabolisme som antibiotika kan angripe. I stedet forsøker man å tukle med hver av de forskjellige stegene i virusets reproduksjonssyklus: • Fusjonshemmere: forhindrer viruset fra å trenge inn i cellen ved å binde seg til de samme reseptorene som viruset binder seg til når det skal trenge inn i cellen. • Transkriptasehemmere: molekyler som stikker kjepper i hjulene for reverstranskriptaseenzymet til retrovirus ved at de ligner på nukleotider, slik at enzymet feilaktig setter inn transkriptasehemmeren i polynuk5 Medisinsk bioteknologi leotidkjeden. Dette fører til ubrukelig DNA som ikke kan leses. • Integrasehemmere/antisense RNA: RNA som er ekDette kapittelet handler om virus og hvordan de funsakt komplementært til virusets RNA, og binder seg gerer, immunforsvaret, og hvordan vi kan bruke vaksiner til det. Dermed dannes et ubrukelig RNA/RNAtil å sette immunforsvaret på rett kurs. hybrid som ikke kan brukes til å danne nye viruskomponenter. • Proteasehemmere: klipper opp de virale polypepti5.1 Virus dene i små fragmenter akkurat når de skal settes Virus Et virus er en liten genetisk ensammen til nye virus. het/agens/dingsboms som benytter seg av den reproduktive mekanismen til verten den infiserer for å reprodusere seg Naturlige strategier mot virus Blant menneskelige selv. Siden virus ikke har sin egen metabolisme, regnes de cellers naturlige forsvarsmekanisme mot virus finnes inikke som levende organismer i seg selv (de er i beste fall hibitorer som blokkerer reversskriptase (mot retrovirus), på grensen). Nakne virus er beskyttet av en proteinkjerne antistoffer (senere avsnitt), og interferoner (neste avsnitt). som kalles et kapsid. “Enveloped viruses” beskytter seg selv ved å ta med seg en bit av vertens cellemembran som et ekstra lag med beskyttelse. Noen virus koder for Interferon Signalprotein som produseres av virusinfisenzymer som de trenger for å reprodusere - blant annet har erte celler for å si ifra til immunsystemet om at cellen er retrovirus revers-transkriptase, som brukes for å lage DNA infisert og skal destrueres. fra RNA. Kort sagt klarer virus å pakke inn utrolig mye sluhet i et vanvittig lite volum (de har typisk en lengde på 5.2 Immunforsvar rundt 50 nanometer). Virus kan enten inneholde RNA eller DNA. Eksem- Immunsystemet Det komplekse systemet som gjør orpler på RNA-virus er HIV, meslinger, rabies, tobakkmo- ganismen i stand til å skille mellom “selv” og “ikke-selv”. saikkvirus, poliovirus, forkjølelse og SARS. Eksempler på Immunsystemet består av den humorale immunresponsen DNA-virus er kopper, kukopper, herpes og bakteriofager. og den cellulære immunresponsen. Man kan også dele det 12 inn i medfødt og adaptiv immunrespons - mer om det senere. Her er en fin video som forklarer immunsystemet: https://www.youtube.com/watch?v=zQGOcOUBi6s. En del av det som står i Renneberg nevnes også i videoen, og gjentas derfor ikke her. På samme Youtube-kanal finnes også beskrivelser av mekanismene til forskjellige virus (meslinger, HIV, ebola). #viralvideo Adaptiv immunrespons Den delen av immunresponsen som husker hvilke antigener som har vært til stede tidligere. Ved første eksponering for et patogen vil den adaptive immunresponsen være tregere - men ved senere eksponeringer vil den adaptive immunresponsen være like rask som, og mer effektiv enn, den medfødte immunresponsen, se Figur 5. Dette fordi det da finnes “minne-celler” (dette er spesialiserte T- og B-celler) som “husker” den første eksponeringen og “vet” hvordan immunsystemet må Den humorale immunresponsen bruker antistoffer - handle for å raskt og effektivt eliminere akkurat dét patoproteiner som produseres av B-celler (eller mer presist: genet. Det er denne egenskapen til immunsystemet som B-celler produserer plasmaceller, som produserer antistof- utnyttes med vaksiner. fer) for å beskytte mot fremmede stoffer (for eksempel fra infiserende virus/bakterier) som i denne sammenhengen kalles antigener. Antistoffer binder seg til antigener på svært spesifikt vis for å markere dem som inntrengere og oppfordre makrofager til å spise dem opp. Epitop Den delen av et antigen som antistoffet binder seg til. Kalles også antigendeterminant. Strukturen til et antistoff Antistoffer består av 4 proteinkjeder - to “lette” L-kjeder og to “tunge” H-kjeder. Proteinkjedene holdes sammen av disulfidbindinger. Disse settes sammen til en Y-form (se figur i bok/internett). Bunnen av Y-en er en “fot” som kalles Fc (fragment constant) som holder antistoffet til overflaten av B-cellen. Samtidig har de en variabel region - Fv - som er antigen-spesifikk. Cellen har standardiserte polypeptidelementer som den kan bruke for å bygge molekylære antistoffer for opp til 100000000 forskjellige antigener (men man har altså ikke gener for hvert eneste antigen - det ville vært uøkonomisk). Den cellulære immunresponsen består av T-cellene. Blant disse har man cytotoksiske T-celler (“killer T-cells”) som er på utkikk etter fremmede komponenter på overflaten til cellene de møter - og hvis de finner fremmede komponenter, destruerer de cellen. Mange celler hjelper til med dette ved å kutte ut et fragment av peptider som stammer fra nedbrytningen av proteinene til en inntrenger. Dette fragmentet transporteres til overflaten av cellemembranen, der MHC-proteiner (major histocompability complex) viser frem fragmentet til omverdenen. I tillegg til cytotoksiske T-celler finnes det T-hjelpeceller som fremmer vekst av B-celler og cytotoksiske T-celler når de trengs. Figur 5: Skisse av immunrespons ved første og andre eksponering for et patogen. Rødt: medfødt immunrespons. Blått: adaptiv immunrespons. 5.3 Vaksine Vaksine Immunogent materiale som gjør at immunsystemet produserer “minne-celler” for en bestemt type patogen (sykdomsfremkallende virus eller mikroorganisme). Dette gjør at immunsystemet raskt kan produsere riktig type antistoffer dersom patogenet skulle angripe på et senere tidspunkt. Dermed blir man (i det ideelle tilfellet) immun mot patogenet. Den første vaksinen var mot kopper, og ble utført ved at Edward Jenner testet sin hypotese om at det å overleve kukopper gir en livslang immunitet mot både kukopper og kopper: han injiserte en liten dose puss fra en kukoppinfisert jente i blodet til en gutt. To uker senere injiserte han den samme gutten med en potensielt dødelig dose kopper. Gutten overlevde dette, og begynte antakelig å gruble over hva i alle dager det var han hadde gjort for Neopterin En liten molekylær forbindelse som skilles at det var akkurat han som ble valgt ut til et slikt latut av makrofager når de stimuleres av interferon-γ (som terlig uetisk eksperiment. Grunnen er at kukopper er nært skilles ut av T-hjelpeceller). Dette skjer allerede før immun- beslektet med kopper, og de samme antistoffene som virker systemet har identifisert intrengeren, så å teste neopterin- mot kukopper virker også mot kopper. nivåene i blodet gir en rask test for virusinfeksjoner: en høy konsentrasjon av neopterin indikerer at det foregår et Moderne vaksiner tar i bruk eller annet viralt angrep. Siden det skilles ut uavhengig • toksoider: nøytraliserte ekstrakter av toksinene som av hvilket virus som angriper, er det spesielt nyttig for å patogenene skiller ut teste bloddonorer. • døde eller svekkede patogener som er harmløse, men fortsatt trigger en immunrespons • genmodifiserte varianter av patogener, som det for Medfødt immunrespons Betegnelsen for den delen av tiden forskes på immunresponsen som er rask, men uspesifikk. Dette er den evolusjonært eldste delen av immunsystemet, i motsetning Prinsippet er det samme i hvert tilfelle: kroppen produserer til... de riktige antistoffene før en eventuell infeksjon. 13 Polyklonale antistoffer Ved å immunisere et dyr mot et antigen kan man (ofte etter flere omganger med immunisering) hente ut og isolere antistoffer for antigenet fra dyret. Hvis man gjør det på denne enkleste mulige måten får man polyklonale antistoffer - en blanding av forskjellige antistoffer som alle reagerer på det samme antigenet, men som har forskjellig aminosyresekvens og binder seg til forskjellige steder (epitoper) på antigenet med forskjellig styrke. billigere og raskere, og ved å bruke E. coli kan man utnytte alt man vet om bakterien i produksjonen. 6 Miljøbioteknologi Dette kapittelet begynner med en lengre innføring i forurensning av ferskvann og hvordan vi kan forhindre det. Så går vi nærmere på hvordan vi kan bruke mikroorganismer som mer miljøvennlige energikilder og kjemikalieproMonoklonale antistoffer Antistoffer med identisk dusenter. molekylær struktur og spesifisitet, som stammer fra én enkelt type B-celler. Disse kan man få tak i ved å ta Bceller og fusjonere dem med tumorceller for å få en hybrid- Avløpsvann Det er litt terminologi i forbindelse med celle som er udødelig og deler seg raskt (som en kreftcelle), avløpsvann: 1. 5-dags Biochemical Oxygen Demand (5-day BOD): men også produserer de samme antistoffene som B-cella. mengden O2 (aq) som metaboliseres av mikrobene Monoklonale antistoffer er et kraftig analytisk verktøy fordi i en vannprøve i løpet av 5 dager for å fullstendig man kan bruke dem til å oppdage små mengder av et antibryte ned de organiske forurensningene i prøven. gen (for eksempel ved å sette en radioaktiv markør på 2. Population equivalent (PE): den gjennomsnittlige orantistoffene, slik at områder med antigenet “lyser opp”). ganiske forurensningen, altså 60 gram 5-dags BOD. Dermed kan man for eksempel finne størrelsen og posisjoSiden løseligheten til O2 i vann er 10mg O2 pr. liter vann, nen til en tumor. Kombinert med annen teknologi kan man trenger man 6000 liter rent vann for å fjerne forurensningen også levere medikasjon spesifikt til der antigenet befinner som én gjennomsnittlig bybeboer produserer i løpet av 5 seg (targeted drug delivery). dager. ELISA-testen Står for “enzyme-linked immunosorbent assay” og kan brukes til å finne ut om pasienten har produsert antistoffer mot et bestemt virus - det vil si, om pasienten er infisert. Prosessen er som følger: 1. Man gror viruset og isolerer kapsidet ved at det adsorberes på en plate. 2. Kroppsveske fra pasienten legges til på platen. 3. Man legger til enzym-markerte monoklonale antistoffer mot pasientens antistoffer. 4. De monoklonale antistoffene som ikke har bundet seg, vaskes vekk. 5. Man legger til et substrat som er fargeløst, men som skifter farge i møte med enzymet på de monoklonale antistoffene. Løsningen vil bli farget hvis det er noe enzym der, som kun kan være tilfelle dersom det var noen antistoffer de monoklonale antistoffene kunne binde seg til - altså hvis pasienten har vært infisert. Ellers vil alle de monoklonale antistoffene vaskes ut, og løsningen forblir fargeløs. Konsekvensene av urenset avløpsvann som slippes ut i innsjøer og elver, er at • aerobe mikroorganismer bryter ned organisk materiale og bruker samtidig opp tilgjengelig oksygen, • fisk og de fleste andre oksygenavhengige organismer dør av oksygenmangel, og til slutt • anaerobe mikroorganismer tar over og produserer giftig ammoniakk (NH3 ) og hydrogensulfid (H2 S) som dreper de resterende vannlevende organismene. Dermed ender man opp med at elvene blir til illeluktende kloakk. Aerob vannrensning Et vanlig kloakkrenseanlegg bruker aerobe mikroorganismer til å bryte ned forurensninger i vannet før det slippes ut i ferskvannskildene. Dette krever en del plass. Trickling filters En annen metode for å rense avløpsvann. Dette er tanker fylt med porøst materiale Rekombinante antistoffer Det er ofte nyttig å gjøre med et stort indre overflateareal der mikroorganismer kan antistoffet er så lite som mulig. Dette har tradisjonelt blitt sette seg. Dette store overflatarealet gjør at man sparer en gjort ved å kløyve av alt annet enn den variable delen del plass. (Fv) av antistoffet. Hvis du ser på Box 5.3 ser du at en slik enkeltstående Fv-bit ikke vil være sammenhengende, Aktivert slam En tredje metode for å rense avløpsvann. og faller fra hverandre uten ekstra stabilisering. Derfor Her har man latt aerobiske bakterier, fungus og andre bruker man en ekstra peptidkjede for å lenke sammen de mikroorganismer danne store flak som andre mikrober kan to halvdelene, for å få en scFv (Box 5.3, nederst til høyre). sette seg på. I tillegg rører man i vannet for å stadig tilTradisjonelt har dette blitt gjort med proteaser, men nu til føre oksygen fra luften. Vannrensning med “aktivert slam” dags lager man dem heller fra scratch med rekombinante består av følgende trinn (se gjerne på figur på slide): organismer. 1. Avløpsvann går inn i en oppbevaringstank. En fordel med rekombinante antistoffer er at det er 2. Større objekter fjernes med mekanisk filter. mer etisk å lage antistoffer slik, enn det er å la dyr eller 3. I et “gruskammer”: væskeflyt justeres, og større parmennesker produsere antistoffene man vil ha. Det er også tikler som grus, sand og glass fjernes. 14 4. I en sedimenteringstank: flakene av mikroorganismer, samt den løselige komponenten av avløpsvannet, separeres fra uløselig bunnfall (sedimenter). 5. Flakene og den løselige komponenten av avløpsvannet brytes ned under aerobiske forhold for å lage “aktivert slam” (som beskrevet i starten av avsnittet). 6. Rent vann separeres fra slammet. Deler av slammet resirkuleres. 7. Slammet sendes til et “fordøyelsestårn” der det produseres biogass. 8. Rent vann separeres fra restene av slam fra fordøyelsestårnet. Det siste slammet kan ende opp i spesialiserte dynger, der lukt kan bli et problem. 9. Drikkbart vann behandles med klor eller ozon for å drepe bakterier, før vannet sendes ut i elva. Eutrofiering Avrenning av fosfor og nitrogen (i gjødsel) fra landbruk, med påfølgende opphopning av slike næringsstoffer i miljøet. Dette fører til ukontrollert oppblomstring av alger, som igjen degraderes av aerobiske mikroorganismer som bruker opp det som er av tilgjengelig oksygen. Til slutt ender man opp i samme situasjon som man får fra å slippe ut urenset avløpsvann i ferskvannsområdene. Det går bedre med biogass i Kina, der det kjøres mange hundre tusen bioreaktorer, ofte som kommunale prosjekter. I den industrialiserte verden kan bioreaktorer hjelpe til med å løse avfallsproblemene til industrielle gårdsbruk. På grunn av begrenset mengde biomasse kan ikke biogass dekke stort mer enn 1-5% av energibehovet. Husholdningsavfall som ellers ville havnet på avfallsdynger er en annen potensiell kilde til biogass - det produseres allerede så mye metan på avfallsdynger at det kan være farlig, så det kan være gunstig å dekke dem opp og ekstrahere metan derfra. Naturlig forekommende metan Mikroorganismer som enten lever fritt eller i fordøyelsessystemene til større organismer, produserer totalt mellom 500 millioner til 1 milliard tonn metan i året, omtrent det samme som det som ekstraheres fra naturgassfelt. Eksempler er • I myrer og sumper kommer det en del metan fra bakterier som dekomponerer organisk materiale i fravær av oksygen. • Mikroorganismer i magen til en ku produserer 100200 liter metan. • Termitter er de største produsentene av metan: en maur produserer 0.5 milligram metan om dagen, som blir til en årlig produksjon på 150 millioner tonn. Fjerning av nitrogen Først bruker man Nitrosomonas til å oksidere ammoniakk til nitritt (NO2– ). Deretter bruker man Nitrobacter til å oksidere nitritt til nitrat (NO3– ). Til Bioetanol I Brazil finnes det en del bioetanoldrevne biler som går på hydrert etanol (93% etanol/7% vann). slutt reduseres nitratet til nitrogengass1 . Dette ble satt i gang på grunn av oljekrisene i 1973/4 og 1979. Prosjektet heter Proalcool og var en både politisk Fjerning av fosfor Det finnes to metoder: fosforet og økonomisk motivert affære som har vist seg å være kan enten tas opp av bakterier (som man så lagrer som kontroversiell fordi “biosolids” som brukes som gjødsel), eller det kan presip• bioetanolproduksjon konkurrerer med matprodukiteres ut kjemisk med jern- eller aluminiumsalter. sjon: én bil krever like mye råmateriale som mat for 30 mennesker. Biogass Metanogene arkebakterier kan konvertere organ• produksjonen har en alvorlig effekt på miljøet: hver isk materiale til metan, som kan brukes som en energikilde. liter etanol som produseres danner 12-15 liter sukkerDette skjer i en anaerob prosess: rester og 100 liter skittent vann, som av økonomiske 1. Hydrolytisk fase: ekstracellulære enzymer bryter ned grunner slippes ut i elver uten å renses. Bioetanolstore organiske molekyler til enklere bestanddeler som produksjonen fører også til erosjon av jordsmonnet. monosakkarider, aminosyrer, glyserol og fettsyrer. Problemet med vannforurensning er på bedringens vei: et2. Acidogen fase: de enkle bestanddelene brytes ned ter at forurenset vann fra bioetanolindustrien forurenset til H2 , CO2 , eddiksyre og andre organiske syrer og drikkevannforsyningen til hele byer, beordret den brazilalkoholer. ianske regjeringen alkoholindustrien til å holde vannet i en 3. Metanogenese: Hydrogen, eddiksyre og karbondioklukket syklus og til å bruke sukkerrestene som gjødsel. sid reagerer med hverandre for å danne vann og metan i to reaksjoner: CH3 COOH −−→ CH4 + CO2 og CO2 + 4H2 −−→ CH4 + 2H2 O. Oljedegraderende bakterier Etter å ha oppdaget at Biogass er en fin energikilde dersom det eneste andre al- det finnes bakterier som kan degradere plantegiften Agent ternativet er å brenne ved eller annen biomasse. Biogass Orange, klarte Ananda Chakrabarty å produsere oljekan dannes i små reaktorer som fylles med ekskrement fra spisende bakterier ved å kombinere plasmider fra fire Pseumennesker og dyr. domonias-stammer som hver for seg var i stand til å deMen: da man prøvde dette med Gobarprosjektet i India, gradere enten kamfer, oktan, xylol eller naftalen. Plasmible prosjektet forringet av at det kun er rike bønder som dene ble kombinert til superplasmider som ble reintrodusert har råd til de rustfri ståltankene man trenger og har nok i bakterier slik at de ble i stand til å degradere alle de fire avfallsstoffer til å fylle tankene. Det endte opp med at stoffene. Disse organismene var ment til å raskt spise opp rike bønder kjøpte opp kumøkk i store kvanta og dermed oljeutslipp og så bli spist opp av organismer høyere opp i brukte opp biomassen som de fattige ellers ville brent for næringskjeden. Organismene er de første genmodifiserte varme. organismene som har blitt patentert i USA. 1 Slides strider med Renneberg og internett: reduksjonen av nitrat gjøres ikke biologisk. 15 Organismene har riktignok aldri blitt brukt, på grunn av restriksjoner på bruk av genmodifiserte organismer. I stedet gror man konvensjonelt fremavlede bakterier for å degradere olje på oljedekte steiner, som er det eneste som er lovlig å gjøre i dag. • Sukker og alkohol fra trevirke Den ideelle råvaren for å lage glukose og alkohol er stivelse, et polysakkarid som brukes som energilager i planter. Stivelse er et viktig næringsstoff og er derfor kontroversielt å bruke industrielt. Den nest beste råvaren er lignocellulose fra trevirke, som ikke kan brukes som en matressurs, men er et råmateriale i papirindustrien. Lignocellulose er en 4:3:2-blanding av cellulose, hemicellulose og lignin, eller kan hentes fra levende planter, og som biprodukt fra jordbruk og trevirke (sagflis). Noen problemer med lignocellulose som sukker- og alkoholkilde, er: • Cellulose er krystallint, uløselig i vann og vanskelig nedbrytbart for de fleste organismer. Men treormer, termitter og visse sopper kan degradere cellulose med cellulaser. • Degraderingsproduktene til lignin er giftige, slik at lignocellulose må syrebehandles før enzymdrevet nedbrytning. • Cellulaser hemmes av sine egne produkter (glukose og cellobiose), og er uansett temmelig treige. Hvitråte-sopp kan degradere 60 til 70 prosent av ligninet til karbondioksid, vann og hvit cellulose. Dette gjør de med ekstracellulære peroksidaser som bryter bindingene mellom fenolene i lignin. Hvor hvitråte får hydrogenperoksiden som trengs for å drive denne reaksjonen fra, er et lite mysterium, men man lurer på om ikke det kan komme fra ekstracellulære oksidaser som glukoseoksidase, som lager H2 O2 som biprodukt ved oksidering av glukose. Mulige strategier for å forbedre prosessen er å • fremtvinge mutasjoner som fjerner negativ feedback i cellulaser • klone cellulaser fra fungus til mer økonomiske bakterier • gi bakterier evnen til å bryte ned 5-ringede sukkerarter • bruke mikrober som metaboliserer lignocellulose direkte for å danne etanol og organiske syrer • lage nye enzymer som åpner opp krystallstrukturen til cellulose Eksempler på kjemikalier fra biomasse De 100 mest brukte kjemikaliene i industrien utgjør omtrent 99% av massen av alle kjemikalier som brukes, og de 5 mest brukte kjemikaliene (eten, propen, benzen, toluen og xylen) utgjør omtrent 75% av alle kjemikalier som brukes. Kjemikaliene kommer for det meste fra petrolium og naturgass, men alternativt kan de fleste kjemikaliene utvinnes fra bioteknologi: • Etanol: brukes som løsemiddel, antifrys, og som utgangsstoff for syntese av mange andre organiske forbindelser. Det kan som kjent utvinnes med fermentering, og destillasjonsprosessen kan i dag hjelpes • • • • • på vei med termofile og etanoltolerante mikroorganismer. Eddiksyre: produseres fra oksidering av etanol av Acetobakter, men høykonsentrert eddiksyre produseres ved kjemisk karbonylering av metanol. Et miljøvennlig bruksområde for eddiksyre er dannelse av kalsiummagnesiumacetat til salting av veier. I motsetning til natriumklorid fører det ikke til korrosjon i biler eller til tredød ved å konkurrere med næringsstoffene til planter. n-butanol: viktig organisk løsemiddel. Clostridium acetobutylicum produserer n-butanol med aceton som biprodukt. n-butanol er giftig for bakterier, men det problemet løses ved å bruke immobiliserte mikroorganismer. Glyserol: løsemiddel og lubrikant. Kan produseres med de samme mikrobene som man bruker for å produsere etanol, ved å legge til natriumsulfitt som binder seg til et viktig mellomprodukt i biologisk etanolsyntese. Sitronsyre: konserveringsmiddel, smakstilsetning og vaskemiddel. Produseres av Aspergillus-soppen. Melkesyre: syreregulerende middel og konserveringsmiddel. Produseres av Lactobacillus. Kan dehydreres til den sykliske laktonen laktid, som videre kan polymeriseres til den bionedgraderbare polyesteren polylaktat. Glukonsyre: lages av Aspergillus niger fra glukose via glukoseoksidase. Kan brukes som biosensor for å måle glukoseinnhold. Binder metallioner og forhindrer kalsiumflekker på glass. Er produksjon av industrielle kjemikalier fra fornybare kilder realistisk? Produkter med høy verdi som skal produseres i lite volum, for eksempel aminosyrer, er det ofte bedre å få tak i bioteknologisk. For kjemikalier som skal produseres i store volumer er det gjerne billigere å bruke fossile kilder - bruk av bioteknologiske løsninger avhenger da i stor grad av oljeprisen og økonomisk lønnsomme bioprosesser. Bakterier i gruvedrift Levende organismer kan brukes til å ekstrahere metaller fra årer i en prosess som kalles “bioleaching”. Omtrent 25% av kopperproduksjonen, 10% av gullproduksjonen og 3% av kobolt- og nikkelproduksjonen bruker levende organismer på denne måten. Mikrobene som brukes i kopperproduksjon er svovelbakteriene Acidithiobacillus ferrooxidans, som oksiderer Fe(II) til Fe(III) og angriper løselig svovel og uløselige sulfider for å konvertere dem til sulfater, og Acidithiobacillus thiooxidans, som vokser på svovel og løselige svovelforbindelser. I “direct leaching” får bakteriene energi ved å overføre elektroner fra jern og svovel til oksygen på cellemembranen. De oksiderte produktene, som er mer løselige, kan dermed lettere hentes ut. I “indirect leaching” oksideres Fe(II) til Fe(III), som i seg selv kan oksidere andre metallioner til lettere løselige former. I praksis er det noe overlapp mellom disse to prosessene. 16 MEOR står for “Microbially Enhanced Oil Recovery”, og er en betegnelse for tertiære oljeproduksjonsmetoder som brukes til å hente ut den siste oljen man ikke får tak i med primære og sekundære metoder. Én slik metode er å injisere bakterier som produserer gass og dermed øker trykket i reservene. En annen metode er å injisere mikroorganismer som lager biosurfaktanter (bio-Zalo), som bryter opp oljen i vannløselige dråper som lettere kan hentes ut fra porer i stein. En utfordring med slike løsninger er de ekstreme forholdene ved oljereservoarene: det er lite næringsstoffer og oksygen, høy saltkonsentrasjon, høyt trykk og høy temperatur, så kun ekstremofile mikroorganismer kan overleve der. Oljeprodusenter forsker også på bruken av biopolymerer som Xanthan, som produseres av plantepatogenet Xanthomonas campestris. Xanthan er et fortykkende stoff som gjør vann mer tyktflytende. Etter at biosurfaktanter har blitt pumpet inn i steinen, legger man til xantanfylt vann som utøver et trykk på oljen og presser den ut. Xanthan er fortsatt for dyrt til å være lønnsomt til slik bruk. Bioplast Plast som utledes fra fornybare kilder til biomasse, for eksempel vegetabilsk olje, stivelse og mikroorganismer. Mange, men ikke alle typer bioplast er laget for å kunne brytes ned biologisk i enten anaerobiske eller aerobiske miljøer. Eksempel på bioplast: • Pullulan er et cellofan-lignende polysakkarid som ikke kan fordøyes av mennesker eller degraderes av stivelsesnedbrytende amylaser, og brukes derfor som en kalorifattig tilsetning til mat for å øke viskositeten. Xanthan, som ble nevnt i forbindelse med oljeutvinning, brukes til det samme. Pullulan er også en bra lufttett matfolie som løser seg opp i varmt vann og kan nedbrytes mikrobielt når det er vått. Pullulan lages med Pullularia pullulans-soppen. • Polyhydroksybutyrat (PHB), med navnet Biopol, har de samme egenskapene som petroleumsproduktet polypropylen og produseres av bakterier som energilager (i så stor grad at bakteriene hovedsakelig består av plast). PHB fra Alcaligenes eutrophus-bakterien er en høykrystallin bioplast med smeltepunkt nær 180 celsiusgrader. Det brytes ned i en slik hastighet at det kan brukes i kapsler for medisin som skal slippes ut i kroppen over lengre tid, eller i sting (slik at de etter hvert fjerner seg av seg selv). • Man forsøker å produsere edderkoppsilke med recombinant E. coli under navnet Biosteel. • Polylaktat, under navnet NatureWorks PLA, dannes ved naturlig fermentering av kornstivelse og kan brukes til å lage miljøvennlige konvolutter, dørmatter, CD-er og lignende. “Grønn” er her i sammenheng med at vi snakker om planter, ikke at vi prøver å lage miljøvennlige løsninger (det var kapittel 6). 7.1 Mikrober Alger Blant alger har vi makroalger og mikroalger. Alger som er store nok til at man kan se dem med det blotte øye kalles makroalger, resten kalles mikroalger. Makroalger er mer økonomisk lønnsomme enn mikroalger. Blant makroalger har vi • brunalger, for eksempel tang og tare. Brunalger er råvaren for å lage alginat, agar, carrageenan og Lglutamat. Brukes i salater, supper, nudler eller med kjøtt. • rødalger, som har blitt kultivert i Japan siden middelalderen. • grønnalger, som antakelig er grønne. Blant mikroalger har vi blåalger som Spirulina, som egentlig ikke er alger, men cyanobakterier. De ble spist av indianerstammer i Sør-Amerika og i Afrika, og tas si dag som kosttilskudd for å redusere kolesterol og rense blodet. 100 gram spirulina inneholder 70 gram protein, 20 gram sukker, 2 gram fiber, 2 gram fett, samt en del viktige vitaminer og mineralsalter. Spirulina kan gros i algefarmer - store, flate vannbasseng - men det er fortsatt dyrere enn soyaprotein. Spiselige mikrober Mange mikrober inneholder verdifulle proteiner, fettsyrer, sukkerarter og vitaminer, og kan brukes som matkilder for å redusere sult. Eksempler på slike mikrober er mikroalger som Spirulina, samt gjær og bakterier. Som matkilde har mikrober den fordelen at de vokser svært fort: tiden det tar for en organisme å fordoble sin biomasse er 2 måneder for en kalv, 6 uker for en grisunge, 4 uker for en kylling, 2 uker for gress, 6 timer for mikroalger, 4 til 6 timer for gjær og 20 minutter til 2 timer for bakterier. Dessuten blir nesten alt fôret konvertert til spiselig protein, i motsetning til en ku som bare inneholder kjøtt tilsvarende 9% av planteproteinet den spiser. Single Cell Protein Produksjon av protein med mikroorganismer begynte under 1. verdenskrig, da man avlet store mengder gjær som proteinkilde i pølser og supper. Gjær var nyttig fordi gjær benytter seg av ellers ubrukelige sukkerløsninger, og kan konvertere sukker til nyttig protein. Senere har man opdaget lignende organismer som spiser andre “ubrukelige” stoffer i råolje og konverterer dem til nyttig protein: • i Øst-Europa konsentrerte man seg om Candidagjærceller som spiste alkaner. Bruken av slike er begrenset, i frykt for at cellene lager kreftfremkallende biprodukter. 7 Grønn bioteknologi • i Vest-Europa fant man gjær og bakterier som gikk på metanol, som man tenkte å bruke som dyrefôr. Dette Dette kapittelet handler om hvordan bioteknologiske ble ikke noen suksess, fordi EU-subsidier gjorde det løsninger kan øke matproduksjonen, redusere feilernæring billigere å bruke pulver av skummetmelk som tilskudd og produsere medisiner som består av komplekse molekyler. i dyrefôr, så da gjorde man heller det. 17 Oljekrisen bidro også til at begge prosjektene endte uten Somatisk hybridisering Siden protoplastene mangler suksess. cellevegg kan de relativt enkelt fusjoneres, enten med kjemisk cellefusjon eller med elektriske felt (elektrofusjon). Mykoprotein Quorn er et vellykket matprodukt basert Slike teknikker, som kalles somatisk hybridisering, ble brukt på det smak- og luktløse proteinet fra fungusen Fusarium for å lage pomatplanter - hybdrider av potet og tomat. venenatum. Men det kan transformeres til imitasjoner av Pomatene var uspiselige og ingen stor suksess, fordi de fisk samt hvitt og rødt kjøtt fordi det består av omtrent forskjellige karakteristiske komponentene i de to plantene det samme som kjøtt (50% protein, 13% fett, 25% fiber), ikke fungerer godt sammen. Slike problemer vil svært og man kan kontrollere lengden og finheten til fibrene ved å sannsynligvis dukke opp når man prøver seg på en somakontrollere hvor lenge man lar cellene vokse. En fordel med tisk hybridisering. fungus i forhold til bakterieceller er at cellene gjerne er mye større og enklere kan separeres fra vekstmediet. Fusarium Planteceller i bioreaktorer Man trenger ikke differgror i en blanding av glukosesyrup og ammoniakk. ensierte plantedeler for å produsere plantemateriale i en reaktor - callus er nok, hvis man leverer det som trengs 7.2 Planter av inorganiske salter, vitaminer, sukker og hormoner, Totipotente celler Planteceller er totipotente, som be- samt rister på løsningen for å få overført nok CO2 til tyr at man kan gro en helt ny plante fra en enkelt celle, plantene. Plantene vil da fortsette å gro, reprodusere og så lenge man har de riktige planteveksthormonene. Disse produsere planteprodukter i reaktoren. Planteceller i biorehormonene inkluderer auxiner, som regulerer vekst og dif- aktorer brukes for å produsere mange ekstremt kompliserte ferensiering, og cytokiner, som fremmer vekst av skudd og forbindelser, særlig medisiner (steroider, kodein, atropin, forhindrer vekst av røtter. Forholdet mellom auxiner og reserpin, digoksin, digitoksin, quinin og Hyperzin A). cytokiner blir dermed en viktig størrelse. Meristem Den delen av en plante som aktivt deler seg (altså der planten begynner på et utskudd). Det er her cellene er minst differensiert (analogt med stamceller i mennesker) Meristem kultur er bruk av celler fra meristem til å gro nye planter. Da skjærer man vekk en meristem og planter den på nytt i et vekstmedium. Siden planteceller er totipotente, særlig ved meristemene, er det på denne måten mulig å lage opp til 500000 kloner av den samme planten i løpet av ett år. Ved å gro dem in vitro (i testtuber med cellekultur) kan man raskt produsere nye varianter av den samme planten og avle frem egenskaper som resistans mot sykdommer og plantegift. Haploide kulturer Pollenknappene (anthers) til planter er plantenes mannlige kjønnsceller, og inneholder kun ett sett kromosomer. Fruktknutene (ovaries) er de hunnlige kjønnscellene, og inneholder det andre settet med kromosomer. Slike celler som kun inneholder ett av de to settene med kromosomer, kalles haploide (i motsetning til vanlige, diploide celler). Ved å gro celler fra pollenknapper i vekstmedium med hormoner kan man lage komplette, sterile planter der alle cellene er haploide. Disse er nyttige til planteavl fordi recessive mutasjoner blir synlige. Callus En “celleklump” med plantemateriale; den uorganiserte massen av celler som vokser der man har laget et kutt i en plante. Slik callus kan tas ut og gros videre i vekstmedium. Suspensjonskultur Det står ingenting om “suspensjonskultur” er, verken i Renneberg eller på slides, men det nevnes i forbindelse med protoplastkultur, så jeg antar at det er synonymt med det. Agrobacterium En “bakteriell genteknolog” som brukes for å genmodifisere planter. Bakterien tiltrekkes av molekyler som planten slipper ut når den er skadet. Denne bakterien har et såkalt Ti-plasmid (“Tumor-inducing plasmid” fordi plasmidet forårsaker tumorvekst i planter). Tiplasmidet har gener som koder for opin-detekterende proteiner. Opiner er spesielle aminosyrer som kun bakterien kan bruke, så bakterien “reprogrammerer” dermed plantecellen til sitt eget formål. I tillegg har Ti-plasmidet gener for proteiner som overfører DNA til skadede celler. Dette er et skjeldent eksempel på at gener overføres fra en prokaryot til en eukaryot. Ti-plasmider kan “temmes” ved å fjerne genet for opindetekterende proteiner og plantehormoner (det er de plantehormondannende genene som forårsaker tumorene). Samtidig setter man inn de genene man måtte ønske i Tiplasmidet. Det er vanlig å inkludere et antibiotikaresistensgen, slik at rekombinante celler kan velges ut enkelt (ved å bruke vekstmedium med antibiotika som dreper de ikkerekombinante bakteriene). De rekombinante plasmidene settes enten direkte inn i protoplaster, eller de settes inn i Agrobacterium igjen (det sistnevnte er standardmetoden). Protoplast Plantecelle der man har fjernet celleveggen (ved hjelp av cellenedbrytende enzymer som pektinaser og cellulaser). Når protoplaster vokser i vekstmedium vil de gjendanne celleveggene sine og danne calluser. Når plantehormoner dannes vil disse callusene få utskudd, og med andre hormoner vil disse utskuddene så slå røtter. Dermed kan man lage hele nye planter fra enkeltceller. 18 DNA-pistol En metode for å genmodifisere planter. Gull- og wolframpartikler dekkes med plasmid DNA, og partiklene skytes inn i vev på en måte som ikke skader cellene. Av og til integreres plasmid-DNAet i plante-DNAet selv om partiklene selv passerer gjennom cellene. Denne metoden kan også brukes for å sette inn DNA i kloroplaster, eller i andre organismer enn planter. • Noen driver og lager poppeltrær som samler opp tungmetaller. • Det gjøres forsøk på å lage planter som tåler tørke og høye konsentrasjoner av salt. Eksempler på transgene planter • Planter kan gjøres resistante til glyfosfat ved å øke produksjonen av visse enzymer. Glyfosfat er en del av urgressmiddelet “Round-Up” som skader planter ved å hemme EPSP-syntase, et viktig enzym for aminosyremetabolisme. Genet for EPSP-syntase kan inkorporeres i rekombinant E. coli og overføres til planter via Agrobacterium. Dette gir planter med mye høyere konsentrasjon av EPSP, som gjør at de tolererer konsentrasjoner av “Round-Up” som dreper andre planter i området. • Planter kan gjøres resistante til fosfinotricin (PPT) med PPT acetyl transferase. Fosfinotricin dreper planter ved å hemme syntesen av glutamin, med den konsekvens at ammoniakk akkumulerer og dreper cellen. PPT acetyl transferase, et enzym i blant annet tobakk, poteter og raps, nøytraliserer denne hemmelsen. • Luciferase, enzymet som gjør ildfluer selvlysende, har blitt introdusert i tobakkplanter. Hvis det er luciferin og mye næringsstoffer i vannet til plantene (for eksempel hvis de vannes med avløpsvann), lyser de genmodifiserte plantene med en gulgrønn glød. • Man har klart å lage blå nellik ved å introdusere genene for det blå pigmentet i petunia. Blå roser har man dessverre ikke kommet helt i mål med. • Tomater kan få tykkere skinn med mer stivelse (fint for å lage ketchup) ved å slå av polygalaktuonidase (PG) med antisense-RNA. • Transgen raps og soya har høyere innhold av lysin (som beskrevet tidligere er lysin en essensiell aminosyre, så høyere innhold av lysin betyr høyere næringsverdi). Transgen raps inneholder også et annet spekter av fettsyrer enn vanlig raps, blant annet noen av fettsyrene i palmeolje. Det kan derfor hende at transgen raps erstatter palmeolje. • Det gjøres forsøk på å lage planter som er resistante mot tørråtesopp. Slike planter produserer cellulase som angriper og løser opp celleveggen til tørråtesoppen. • Genmodifiserte vindruer er et forsøk på å unngå de sykdomsfremkallende soppene som er et stort problem for tradisjonelle vindruesorter som Riesling, Merlot og Chardonnay. • “Golden rice” er ris som har blitt modifisert til å inneholde en høy konsentrasjon av β-karoten (provitamin A). Det er kjekt å ha, fordi vitamin A-mangel er vanlig blant folk som hovedsakelig lever på ris: 800 millioner mennesker lider av akutt vitamin A-mangel som forårsaker at synet, immunsystemet, blodet og skjelettveksten svekkes, og er en stor grunn til blindhet og anemi. Med de nyeste variantene av “golden rice” kan man dekke opp til halvparten av det daglige vitamin A-behovet ved å spise ris. • Man prøver å lage koffeinfrie kaffeplanter. Sikkert kjekt for de 20 prosentene av verdens befolkning som drikker decaf-kaffe. Biologisk insektmiddel Insektmidler har en del ulemper: de dreper andre insekter enn insektmiddelet er beregnet på og forstyrrer dermed balansen i økosystemer, de akkumulerer i større fugler og dyr, og insektene blir etter hvert resistente (som tradisjonelt “løses” ved å bruke større mengde insektmiddel, slik at insektene etter hvert blir enda mer resistente, og så videre). Det biologiske insektmiddelet Bt-toksin er et mikrobeprodusert krystallinsk protein som blir til gift i fordøyelsessystemet til larver og dermed perforerer dem fra innsiden. Bt-toksin er harmløst mot mennesker, fisk og varmblodige dyr. Ved å bruke de ovennevnte teknikkene for å inkorporere Bt-genet i planter får man et insektmiddel som kun påvirker insekter som er parasitter på planten. “Refuge crops” Man ønsker å unngå spredningen av Bt-gener samt utviklingen og spredningen av Bt-resistente insekter. Dette gjøres ved å gro de transgene plantene ved siden av ikke-transgene planter. Dermed sørger man for at ikke-resistente insekter overlever og parrer seg med eventuelle resistente insekter; recessive resistensgener vil ikke komme til syne i avkommet til disse. Trusler med transgene planter Kan genmodifiserte planter spre seg til andre områder og bli til ugress der, på samme måte som kaniner ble til skadedyr da de ble introdusert til Australia? Trolig ikke: det ser ikke ut til at genmodifiserte planter kan overleve i naturen - det har i hvert fall aldri blitt vist at de kan det2 . Eller kan transgene planter overføre sine resistensgener til ugress gjennom krysspollinering, og dermed forverre ugressproblemet? Spørsmålet undersøkes for tiden. En tredje bekymring er pollenspredning av genmodifiserte planter til ikke-genmodifiserte avlinger. Når det gjelder Bt-korn viser det seg at andelen genmodifiserte planter faller under 0.9% (som er terskelen for når genmodifisert mat skal markeres i en del land, for eksempel Norge) når man er 10 meter unna et felt med Bt-planter. Derfor skal bønder som gror Bt-korn ha en tjue meter tykk separerende stripe rundt avlingen, for å utelukke økonomisk skade for nabobøndene. Merking av genmodifisert mat Skal genmodifisert mat merkes? DNAet i seg selv har ikke noen metabolsk effekt, da det blir brutt ned raskt i fordøyelsessystemet. Hvis genmodifisert mat har noen effekt som gjør at den bør markeres, vil det være på grunn av proteinene som dannes av de innsatte genene, og det varierer naturligvis fra tilfelle til tilfelle. Dermed er ikke “maten er genmodifisert” i seg selv en god nok helsemessig grunn til å markere genmod- 2 Renneberg sier at det er slik “as a general rule”, men forklarer ikke hvorfor. Nå er det jo slik at genene vi avler frem i transgene planter er til nytte for oss, ikke for plantene selv. Det er derfor ikke noen grunn til å bekymre seg for at genmodifiserte planter får egenskaper som gjør dem mer levedyktige i naturen enn sine ikke-genmodifiserte søsterplanter. Se også Genetically Modified Foods Are Nothing New, lenket til i Tonsill B. 19 ifisert mat. Derfor er genmodifisert mat FDA-godkjent i har fått et dårligere omdømme enn teknologien kanskje USA. fortjener. Man kan riktignok argumentere for at den skal markeres av andre grunner enn helse, for eksempel for å hensynta 8 Kloning og embryoer enkeltpersoners religiøse innvendinger mot genmodifisering. Regulering i Norge Med enkelte unntak gjelder de samme reglene i Norge som i andre europeiske land. Vi har matloven, som regulerer bearbeidede mat- og fôrprodukter som ikke inneholder levende, genmodifisert materiale, samt genteknologiloven om levende genmodifisert materiale (inkludert spiredyktige frø). Hittil har ingen genmodifiserte produkter blitt godkjent som mat eller fôr i Norge; før en eventuell godkjenning skal norske myndigheter ha gjennomført en risikovurdering. Dersom fôr- eller matvarer med mer enn 0.9% genmodifisert materiale tilbys på markedet i Norge, skal den være merket. Genopdrett Planter er 10-50 ganger billigere å gro enn E. coli, og 100 ganger billigere enn dyreceller. Det er også færre etiske kvalmer med å genmodifisere planter enn det er med å genmodifisere dyr, spesielt til medisinske formål. En annen viktig fordel med å bruke planter (og andre høyere organismer) til å gro gener, er at de kompliserte proteinene i høyere organismer modifiseres i cellen etter at de produseres (som vi så med insulin i kapittel 4). Det har allerede blitt laget tobakk med antistoffer mot karies, og poteter og bananer med “innebygd vaksine”. Slik mat, om den blir vellykket, kan ikke spises i for store doser og må derfor merkes tydelig, for eksempel ved å farge maten med en egen farge. Renneberg foreslår blå. Undertegnede er helt enig, og har alltid syntes at det er for lite blå mat på markedet. Dette kapittelet handler om kloning av høyere ordens organismer. Mot slutten, litt diskusjon rundt bruk av embryoer til andre ting enn kloning. Kloning Når en organisme får avkom som er genetisk helt identisk. Eksempler på naturlig kloning er den aseksuelle reproduksjonen til bakterier, samt noen insekter og planter. Somatisk celle En celle som er en del av kroppen til en organisme, det vil si alle andre celler enn kjønnsceller og stamceller (kapittel 9). Overføring av kjerne En måte å lage kloner på, er å overføre kjernen fra en somatisk donorcelle til en eggcelle der man har fjernet kjernen. Eggcellen blir så til et embryo, som settes inn i en surrogatmor. Kloner som produseres slik er ikke egentlig genetisk identiske med organismen som donorcellen kom fra, siden klonen vil ha mitokondrielt DNA fra eggcellen. De første eksperimentene med overføring av kjerne ble gjort med frosker og salamandre. Da man klarte å lage kloner med denne metoden, viste man at voksne somatiske celler • inneholder all den genetiske informasjonen som trengs for å skape hele organismen • har evnen til å aktivere fosterutvikling • kan “glemme” spesifikasjonene sine og oppføre seg som et totipotent (kapittel 9), befruktet egg Antifrost-bakterier Frost skader planter ved at iskrystaller dannes på bladene og bryter opp det levende vevet. Det viser seg at Pseudomonas syringae-bakterier spiller en Reproduktiv kloning Innebærer at man, etter overviktig rolle i denne prosessen: de har “frost-proteiner” som førig av kjerne, lar den nye hybridcella vokse til et embryo stimulerer krystallvekst. Ved å populere planter med P. sy- som settes inn i en surrogatmor med det formål å lage en ringae-bakterier der man har slettet DNAet som koder for ny organisme. frost-proteinene, beskyttes plantene fra frostskader fordi de skadelige naturlige bakteriene utkonkurreres av de harm- Terapeutisk kloning Innebærer at embryoet, i stedet løse genmodifiserte bakteriene. for å implanteres i en surrogatmor, las vokse in vitro til Samtidig brukes de ikke-genmanipulerte frostbakteriene en blastocyst. Så høster man cellene fra innsiden av blastil å produsere kunstig snø. De gros i bioreaktorer og øde- tocysten og overfører dem til et medium som fremmer legges (antagelig for å gjøre frost-proteinene tilgjengelige i vekst av visse typer celler (for eksempel muskel-, benmargløsning). Dette øker snøproduksjonen med 45% og sparer eller nerveceller) med det hensyn å produsere vev som kan energi som ellers ville blitt brukt på nedkjøling av naturlig brukes i transplantasjoner. snø. Sauen Dolly Det første klonede pattedyret, født i 1996. Andre etiske problemer med genmodifisert mat Dolly ble laget med overføring av kjerne, der kjernen kom Potensielle økologiske trusler er nevnt i avsnittet om fra jurene til en voksen sau. Dolly var det ene vellykede “Trusler med transgene planter”. Samtidig kan store felt forsøket ut av de 277 kloningsforsøkene som ble gjort, hvomed genmodifisert mat undergrave fornybart og alternativt rav 29 forsøk nådde stadiet der man hadde et embryo som jordbruk. Et problem som ikke er nevnt i Renneberg, men kunne overføres til en surrogatmor (men i alle andre tilsom er hintet til på slides, er at bruk av genmodifisert mat feller enn Dolly ble fostrene spontanabortert på et tidlig kan være mer lønnsomt for store bedrifter enn det er for stadium). små produsenter. Interesserte kan for eksempel lese seg Et problem med voksne celler er at mye av genmateopp på den kontroversielle businessmodellen til Monsanto, rialet er undertrykt (kapittel 4, “Strategisk adaptasjon”). som er en viktig grunn til at bioteknologi og genteknologi For å lage Dolly ble denne “genblokkaden” fjernet ved å 20 sulte donorcellene i et næringsfattig medium. Sannsyn- Preimplantasjonsdiagnostikk (PID) Prosedyrer inligvis gjorde dette at DNA-innpakkingen ble revertert til nenfor medisin og genetikk som utføres på embryo før de sin opprinnelige tilstand. settes inn i en livmor. Når embryoet er på 8-cellestadiet kan man fjerne 2 celler (en for analyse, en for backup av analysen) uten at embryoet tar skade. Denne embryoniske Årsaker til begrenset levetid Klonede dyr har en ten- cellen kan så destrueres for å studere genmaterialet inni. dens til å dø tidligere enn andre (Dolly døde 6 år gammel Informasjon som man kan finne ved slik analyse inkluderer av en lungesykdom som er typisk for eldre sauer). kjønn (siden man kan se forskjell på X- og Y-kromosomet Én mulig årsak er at cellene til kloner har kortere telom- fordi Y-kromosomet er mindre) og alvorlige kromosomfeil erer (repeterende DNA-sekvens på endene av kromosomene (fordi det er lett å finne et ektra eller manglende kromosom beskytter kromosomene fra skade, som blir kortere som). I prinsippet skal det også være mulig å lese hele ved hver celledeling og dermed er en indikator for cellens DNA-et, men med dagens teknologi ville det vært ekstremt alder) enn andre dyr. dyrt. En annen mulig årsak er at DNA-skade som er usynlig PID innebærer naturligvis et lass med etiske problemi en voksen celle kan komme frem når genmaterialet skal stillinger, fremst blant dem: er vi egentlig tjent med å brukes til å lage forskjellige celler (tenk for eksempel hva kunne bruke slik teknologi til å kunstig velge fostere med som skjer hvis man bruker en levercelle som ser helt fin ut, spesielle egenskaper (som kjønn, og etter hvert som teknolomen som har skade i genene som er aktiverte i nerveceller, gien forbedres, andre genetiske egenskaper)? Det kan i men ikke i leverceller). ytterste konsekvens føre til selektiv abort og et sorterEn tredje mulig årsak er feil i interaksjonen mellom ingssamfunn. I likhet med problemstillingene rundt kloning cellen man har fjernet cellekjernen fra og cellekjernen man diskuteres ikke disse i alt for stor detalj i Renneberg. har injisert inn i cella. Hvor mye forteller genmaterialet ditt om deg? Det vet man ennå ikke helt sikkert, siden mange arvelige Kloning av utryddede dyr Det gjøres forsøk på å egenskaper ikke avhenger av bare ett gen, men flere gener klone mammut med somatiske mammutceller som har blitt og interaksjonene mellom dem. Men man vet også at det bevart i den sibirske permafrosten. Hvis kjerner fra slike meste er avhengig av miljøet man vokser opp i: størrelse og celler kan settes inn i eggcellene til en elefant, bør det i prinhelse avhenger av ernæring, intelligens er sterkt påvirket sippet være mulig å lage en ny mammut. Forhåpentligvis av de hva som skjer de tre første leveårene, og man kan prøver man ikke å lage dyrepark av det denne gangen. være genetisk predisponert for mange sykdommer som bare kommer til syne hvis man lever usunt eller under stressede Kloning av mennesker På tross av påstander fra di- leveforhold. verse konspirasjonsteoretikere og andre tullinger rundt omkring i verden, er det trolig ingen som har klart å Bruk av genetisk data Det er umulig at en DNA-profil overvinne de tekniske utfordringene med å klone men- kan gi en komplett beskrivelse av et menneske og deres nesker. Siden det skjer ganske mange spontanaborter og personlighet, fordi de rundt 3 milliarder basepar i DNAmisdannelser for hver vellykkede kloning, og siden kloning et umulig kan kode for de rundt 100 milliarder nevroner av mennesker har en tendens til å være ulovlig (blant annet som hver er koblet til rundt 1000 andre nevroner. Siden i EU gjennom Lisboa-traktaten), er ikke klonede mennesker en DNA-profil ikke er en personlighetsprofil, må det være noe som forskes på i noen særlig grad. strenge regler som forbyr arbeidsgivere, forsikringsselskaper og andre aktører å bruke genetiske data til andre formål enn det formål som gjorde at man samlet dataene i utEtikk rundt kloning Det er tynt med diskusjon rundt gangspunktet. de etiske konsekvensene av kloning i Renneberg. To arguMed tanke på personvern kan man ikke si så alt for mye menter som presenteres mot reproduktiv kloning av men- om en person basert på genene deres (i hvert fall ikke i dag), nesker, er (i) at måten mennesker lages på blir en teknisk men det kan bli et farlig verktøy i kombinasjon med anprosess, og (ii) at man prøver å skape mennesker i sitt eget nen informasjon som pasientjournaler, nettlesningslogger, bilde. telefonsamtaler og bankkontoaktivitet. Også kloning av andre dyr enn mennesker har etiske konsekvenser knyttet til dyrevelferd. Lovgivning rundt kloning I Norge er forskning på befruktede egg og kloning av mennesker forbudt ved den norske bioteknologiloven siden 2004. Terapeutisk kloning, altså kloning av celler til bruk i medisin, er tillatt, men ofte bruker man heller stamceller til det samme formålet. I USA er kjøtt og andre produkter fra klonede dyr FDAgodkjent uten at maten må merkes på noen spesiell måte, fra og med 2006. Dette fordi mat fra klonede organismer er identisk med mat fra organismene som ble klonet. 21 9 Medisinsk bioteknologi II Dette kapittelet går litt i dybden på to forskjellige ting: stamceller, som er lovende verktøy for reparering av vev og behandling av sykdommer, og genterapi, som er modifisering av pasientens DNA for å behandle eller forebygge sykdommer. 9.1 In vitro kan differensiering av stamceller kontrolleres med faktorer som • komposisjonen til cellekulturen som stamcellene gror i • overflatematerialet og -formen til beholderen man gror stamcellene i • genmodifisering Stamceller Stamcelle Pluripotente celler, som kan spesialisere seg (gjennom differensiering) til å bli forskjellige typer celler ved behov. Dette gjør dem til lovende verktøy for reparering av vev og behandling av sykdommer. Hvis stamceller transplanteres til et sykt organ, kan de lage det riktige erstattende vevet på stedet. 9.2 Typer stamceller De tre viktigste typene stamceller er • Embryoniske stamceller (ESC): stamcellene i en blastocyst (et embryo på stadiet der det består av ca. 100 celler). Disse hentes fra “overskudds-embryoer” i forbindelse med kunstig befruktning. Fordeler med ESC er at de vokser lett i cellekultur, og at de kan bli til absolutt alle typer celler i kroppen. En annen stor fordel er at de ikke aldrer, men forblir friske og pluripotente gjennom mange runder med celledivisjon (fordi de har høye nivåer av telomerase, som bevarer lengden på telomerene). Ulemper med embryoniske stamceller er at man risikerer dannelse av teratoma (se under), etisk kontrovers rundt det å hente celler fra embryoer, og risiko for avvisning fra immunsystemet. • Voksne stamceller: finnes i alt vev, men har begrenset levetid og vokseevne. Siden de ikke kan bli til alle typer celler i kroppen, men bare celler som finnes i vevet stamcellen kom fra, kalles de multipotente i stedet for pluripotente. Fordeler med bruk av voksne stammceller er at de er pasientens egne celler og dermed har mindre sannsynlighet for å bli avvist av kroppen, og man unngår det kontroversielle aspektet ved ESC. Problemer med bruk av voksne stamceller er at det finnes veldig få av dem, de har begrenset evne til å vokse in vitro, og de er begrenset i hvilke celler de kan bli til. • Induserte pluripotente stamceller (IPSC), som dannes fra spesialiserte voksne celler ved genetisk teknologi. Fordeler med slike celler er de samme som med voksne stamceller, men man er også mindre begrenset i hvilke celler man kan bruke, siden de pluripotente cellene kan blir til hva som helst. Utfordringer med IPSC er at de er vanskelige å produsere, resultatene man har oppnådd så langt er variable, man har ikke funnet ut hvilket potensial de har i forhold til ESC, og man risikerer i likhet med ESC dannelse av teratoma. Teratom Tumor med vev eller organkomponenter som ligner på vanlig vev, altså ikke en krefttumor. Ukontrollert differensiering av stamceller kan føre til dannelse av teratoma. Derfor er det nødvendig med streng kontroll på selvfornyelsen og differensieringen til stamceller når man skal bruke dem terapeutisk. Genterapi Genterapi Modifisering av en organisme sitt DNA for å behandle eller forebygge sykdommer. Fordelen genterapi har over tradisjonell medisinbasert terapi, er at man løser de underliggende genetiske problemene som forårsaker sykdommen i stedet for å kun behandle symptomene. Innen genterapi finnes det 3 vanlige metoder: • Erstatte et sykdomsfremkallende mutert gen med en frisk versjon av genet. Dette er den vanligste formen for genterapi. • Inaktivere et mutert gen som fungerer feil. • Introdusere et nytt gen i kroppen for å hjelpe til med å nedkjempe en sykdom. De to første skal vi se nærmere på senere. Eksempel: ADA-syndrom Mangel på adenosin deaminase (ADA), som hvite blodceller trenger for å vokse og dele seg, fører til immunsvikt. Proteinet kan administreres til pasienten, men dette er ekstremt dyrt fordi det er en sjelden sykdom. Mangelen er forårsaket av en defekt i ett enkelt gen, og derfor klarte man i 1990 å behandle sykdommen med genterapi. Prosedyren bestod i å injisere genet som koder for adenosin deaminase i et bakterielt plasmid (som beskrevet i kapittel 3), og så overføre plasmidet til et genetisk deaktivert retrovirus. Så lot man viruset angripe en kultur av T-celler fra pasienten, slik at retroviruset satt inn det fungerende ADA-genet i T-cellene. De virusinfiserte Tcellene, som nå kunne produsere adenosin deaminase, ble så sprøytet inn i pasienten igjen. Genvektor Mekanismen man bruker for å smugle et gen inn i en celle. En god vektor • går inn i de riktige cellene • integrerer genet i cellen • aktiverer genet • har ikke skadelige bivirkninger Virale vektorer Virus er fra naturens side allerede maskiner som er laget for å sette inn gener i celler. Fordeler med å bruke virus som vektorer er at de er gode på å finne og infiltrere celler, noen av dem går målrettet på bestemte typer celler, og de kan modifiseres slik at de ikke repliserer og destruerer celler. Problemer med å bruke virus som vektorer er at de er begrenset i hvor mye genetisk materiale de kan ta med seg (fordi de er små), og at de kan forårsake immunrespons i pasienter slik at pasienten enten blir syk eller forhindrer viruset fra å levere genet til cellene. Differensiering av stamceller Differensiering av stamceller kontrolleres i kroppen av gener og epigenetiske forandringer, samt til tider av eksterne signaler som cytokiner og vekstfaktorer som slipper ut av celler i nærområdet, og fysisk kontakt med nabooceller og den ekstracellulære matriksen. Ikke-virale vektorer Andre måter å levere gener på, er 22 • Plasmider. Disse kan være pakket inn i liposomer (små membranbundne pakker som leverer innholdet sitt ved å smelte sammen med cellemembranen). En fordel er at de kan ta med seg store gener, og de fleste forårsaker ikke en immunrespons. En ulempe er at de er mye mindre effektive enn virus for å overføre gener til celler. • Virosomer : liposomer dekket med virale overflateproteiner (disse proteinene hjelper virosomet med å trenge inn i cellen, og kan også bidra til spesifisitet). Disse kombinerer plasmiders evne til å ta med seg store gener og unngå immunsystemet med virusenes spesifisitet. • Polykationer: positivt ladde polymere som danner komplekser med det negativt ladde DNAet for å danne en partikkel som kan spises av cellen (fagocytose). SiRNA “Small interfering RNA”, små RNA-tråder på 21-23 nukleotider, som binder seg til mRNA og lager dobbeltstreng-RNA som destrueres av cellen. Så lenge RNA-trådene er korte nok, slipper de unna immunsystemet. Dette er den mest effektive måten man har for å slå av individuelle gener uten immunrespons. SiRNA er det samme som antisense-RNA. Ikke la noen fortelle deg noe annet. Eller, SiRNA er et subsett av antisense-RNA, det subsettet av antisense-RNA som faktisk fungerer. Reparasjon av mutasjoner Det har blitt utviklet forskjellige virale vektorer som reparerer mutasjoner direkte i DNAet. Disse bruker enzymer som målrettet går inn på spesifikke DNA-sekvenser, kutter ut den defekte sekvensen og setter inn en fungerende kopi. En annen teknologi, SMaRT (“Spliceosome-Mediated RNA Trans-splicing”) retter seg mot mRNA-et som har blitt transkribert fra det muterte genet, og reparerer den delen av mRNAet som inneholder mutasjonen. Dette kapittelet forklarer bioteknologisk måling og analyse, herunder: hvordan vi kan bruke enzymer og organismer til å teste nivåer av spesifikke molekyler; forskjellige metoder for å analysere DNA; og genomikk, en disiplin innen genetikken der man analyserer funksjonen og strukturen til hele genomer. Genterapi i fremtiden Det er omtrent 5000 gener som er av interesse i genterapi-sammenheng. Genterapi virker lovende for en del genetiske sykdommer, noen typer kreft og enkelte virusinfeksjoner, men det er fortsatt uvisst om teknikken er trygg og effektiv nok til å kunne bli vanlig. Genterapi testes for tiden kun på sykdommer som ikke har noen andre kjente kurer. Ex vivo og in vivo genterapi Gener kan enten leveres I 2012 ble den første genterapibehandlingen akseptert til pasienten in vivo, ved at pasienten injiseres direkte med for klinisk bruk i Europa og USA; Glybera er en genterapivektoren, eller ex vivo, ved at genet leveres til celler som behandling som kompenserer for mangel på lipoproteinhar blitt tatt ut av kroppen og gror i en cellekultur, og disse lipase, som er nødvendig for effektiv nedbryting av cellene settes så inn i pasienten igjen. Ex vivo genterapi fettsyrer. har mindre sjanse for å trigge en immunrespons fordi man ikke setter inn virus i pasienten, samtidig som man kan følge med på cellene og se at de fungerer som de skal før 10 Analytisk bioteknologi de settes inn i pasienten igjen. Gene silencing Hvis det er like greit at man ikke produserer det feilaktige genet i det hele tatt, finnes det forskjellige teknikker for å “slå av” genet slik at det ikke produseres noe protein fra det. Dette kan gjøres med oligonukleotider som binder seg til åpningen mellom de to DNA-strengene og blokkerer DNAet fra å transkriberes til mRNA. Det går også an å påvirke mRNAet etter at det har blitt transkribert. En måte å gjøre dette på, er å introdusere en liten bit RNA med en nukleotidsekvens som er komplementær til mRNAet som ble transkribert fra genet man ønsker å slå av. Det to bitene RNA vil binde seg til hverandre og lage en “ubrukelig” RNA/RNA-hybrid som cellen destruerer (dette kalles antisense-RNA, og ble brukt for å motvirke virus i kapittel 5). En annen metode kalles ribozym-genterapi, der man designer RNA-enzymer (ribozymer) som finner og destruerer mRNA som er transkribert fra det muterte genet. Denne typen RNA-interferens kan også brukes analytisk: ved å slå av gener på en systematisk måte kan man finne ut hvilke gener som fremkaller hvilken effekt når de uttrykkes. 10.1 Biologiske tester Enzymbaserte biologiske tester er basert på reaksjoner som katalyseres av spesifikke enzymer. Testen innebærer at et enzym, som regel produsert av en rekombinant mikroorganisme, konverterer et spesifikt molekyl til et produkt som kan detekteres og måles. En slik test må være sensitiv nok til å detektere små mengder av spesifikke molekyler. Et eksempel på en slik test er å bruke glukoseoksidase til å teste for diabetes. Glukoseoksidase tar elektroner fra glukose og bruker dem til å redusere oksygen til hydrogenperoksid. Denne reaksjonen kjøres samtidig med en peroksidasekatalysert reaksjon, der en indikator skifter farge i reaksjon med hydrogenperoksid. Dermed kan aktiviteten til glukoseoksidase, som er proporsjonal med glukosenivået, måles med kolorimetri. Testen brukes for å måle glukosenivå i blod og kroppsvæsker. Responsen til testen kalibreres med prøver med konstant mengde enzym og forskjellige mengder glukose. 23 Biosensor Enzym- og mikroorganismebaserte innretninger som brukes til å detektere spesifikke molekyler i en prøve. Disse kombineres som regel med elektronikk for å tolke og kvantifisere et signal. Et eksempel på en engangs-biosensor er glukoseoksidase som immobiliseres på en chip. Glukose i prøven binder FAD på det aktive setet i glukoseoksidase, og elektroner trekkes fra glukose gjennom FAD. Disse elektronene tas opp av ferrocen (en artig organisk forbindelse der et jernatom er klemt mellom to syklopentadienylringer i en sandwichkonfigurasjon), som diffunderer til chip-en og donerer elektronene sine der. Den resulterende elektriske strømmen, som er proporsjonal med glukosekonsentrasjonen, måles. Et eksempel på en gjenbrukbar biosensor er glukoseoksidase som immobiliseres på en membran som dekkes med en gel - se figur i Renneberg for oppsettet. Kun oksygen og andre små molekyler kan slippe gjennom membranen til siden med glukoseoksidase. Glukoseoksidase konverterer glukose til glukonolakton og reduserer oksygen til hydrogenperoksid, som vanlig. Hydrogenperoksid donerer så elektronene sine til en elektrode og genererer en elektrisk strøm som kan måles og er proporsjonal med glukosekonsentrasjonen. Organismebasert biosensor Også levende immobiliserte mikrober kan brukes i biosensorer. Vanligvis bruker man gjærceller i en polymer-gel på en oksygenelektrode. Det vanligste bruksområdet er måling av bionedgraderbare forurensninger. Som beskrevet i kapittel 6 vil mikrober konsumere en mengde oksygen som er proporsjonal med mengden degraderbare organiske forbindelser i prøven. Derfor kan man bruke en slik test til å måle forurensningsnivåer indirekte ved å måle oksygennivået i en prøve der man har tilsatt gjærceller. Immobilisering av gjærcellene gjør at man kan måle testen på 5 minutter i stedet for å gjøre en 5-dags BOD-test. Immunologisk testing Antistoffer gjør det mulig å utføre diverse tester: • Graviditetstest: graviditet medfører en dramatisk økning i hormonet hCG (“human chorionic gonadotropin”). hCG kan detekteres i urin på en papirstripe med monoklonale antistoffer for hCG. På den ene siden av papiret binder antistoffet seg til en bestemt epitop på hCG, og det resulterende komplekset beveger seg, på grunn av kapillærkrefter, til motsatt side av papiret. I midten av papiret er det en stripe med immobiliserte antistoffer som binder seg til en annen epitop på hCG. Det resulterende “sandwich-komplekset” av hCG og to antistoffer er synlig som en stripe på papiret. Hvis det ikke er hCG til stede vil ikke de immobiliserte antistoffene kunne binde seg til resten av antistoffene, som blir dratt videre av kapillærkreftene helt til den andre siden av papiret. Det er alltid én kontrollstripe ved siden av for å bekrefte at testen fungerer, så to striper indikerer graviditet. • Virusinfeksjon-tester: virusinfeksjoner kan detekteres med ELISA-testen som ble beskrevet i kapittel 5. • Hjerteinfarkt-tester: Døende hjerteceller slipper ut spesifikke proteiner som kreatinkinase og troponiner, som er pålitelige indikasjoner på hjerteinfarkt og kan måles direkte - men disse kan tidligst detekteres når hjerteinfarktet har pågått i en time. Med monok- lonale antistoffer kan man måle andre proteiner som slippes ut tidligere, men som er vanskeligere å måle, for eksempel det lille proteinet h-FABP. Testen fungerer på en lignende måte som graviditetstesten. • Point-of-Care-tester (POC): ved å måle forskjellige typer lipider i blodet kan man finne ut av risikoen for hjerteinfarkt eller hjerneslag. 10.2 DNA-analyse Gel-elektroforese DNA kan identifiseres ved å bruke de samme restriksjons-endonukleasene som vi brukte for å lage rekombinante bakterier i kapittel 3. Siden enzymene kutter på svært spesifikke steder, vil man få en blanding DNA-fragmenter med forskjellig fordeling av størrelser avhengig av DNA-sekvensen. Dermed kan man, ved å separere DNA-fragmentene basert på størrelse, danne et “genetisk fingeravtrykk” som gjør det mulig å se om to DNA-prøver kommer fra det samme individet. Se figur i bok/internett for å forstå oppsettet. Dette er prinsippet som brukes i rettsmedisinsk DNA-analyse. Ved DNA-testing er intronene, de “ubrukelige” delene av DNA-et som ikke koder for gener, nyttige. Siden mutasjoner i intronene som regel ikke har noen effekt på organismen, vil mutasjoner i introner lettere videreføres fra en generasjon celler til den neste (i motsetning til mutasjoner i DNA som koder for gener, som sannsynligvis vil føre til at immunsystemet destruerer cellen). Denne høyere mutasjonsraten i introner gjør at de er kan være svært forskjellige fra individ til individ. Dermed kan de genetiske fingeravtrykkene til forskjellige individer, til og med eneggede tvillinger, være ganske forskjellige. Southern blotting En dramatisk forbedring av gelelektroforese som gjør det mulig å detektere spesifikke gensekvenser. Før elektroforese denatureres DNA-et (det deles opp i de to enkeltstrengene det består av) med natronlut. Etter elektroforese plasseres gelen på et nitrocellulosefilter, og det påføres trykk (for eksempel ved å putte papirtørkler oppå). Da vil kapillærkrefter føre til at DNA-strengene fester seg på filteret og binder seg der, slik at man ender opp med et bilde av DNA-et i gelen på filteret. Så hybridiserer man DNA-et ved hjelp av DNA-prober med sekvensene man ønsker å teste (som beskrevet i kapittel 3). Hvis man for eksempel har en fluorescerende probe, vil påfølgende røntgenstråleeksponering gjøre at det hybridiserte DNAet “lyser opp”. Grunnen til at man må gjøre alle greiene med nitrocellulosefilter før hybridisering, er at DNAet er lettere tilgengelig og mindre mobilt på filteret enn i gelen. 24 PCR står for “Polymerase Chain Reaction”, og er en metode for å produsere mange kopier av et DNA-molekyl fra ett enkelt stykke DNA. Metoden bruker DNA polymerase, det samme enzymet som brukes for å kopiere DNA under celledeling i naturen. Metoden utføres slik: 1. Løsningen med DNA varmes opp til 92-94 grader. Dette fører til at DNA-molekylet spaltes opp i sine to enkeltstrenger. 2. Løsningen kjøles ned til 42-55 grader, og “primers” legges til. Dette er små oligonukleotuder som binder seg på DNA. Primers er nødvendig fordi de gir DNA polymerase et startpunkt - DNA polymerase trenger et startpunkt der det finnes dobbeltstrenget DNA. 3. Nukleotider legges til i overskudd, og DNA polymerase syntetiserer datter-DNA på hver av de to enkeltstrengene fra det opprinnelige DNA-molekylet. 4. Prosessen repeteres: løsningen varmes opp igjen, og hver av de to DNA-molekylene gir opphav til to nye molekyler. I løpet av noen minutter har man massevis av kopier av det ene DNA-molekylet man begynte med. DNA polymerasen som brukes, er ikke fra mennesker, men en genmodifisert variant av det tilsvarende enzymet fra den ekstremofile bakterien Thermus aquaticus. Dette enzymet tåler det første steget der løsningen varmes opp til 92-94 grader (i motsetning til menneskelig polymerase, som blir ødelagt av slike temperaturer). Før man fant på den lure løsningen om å bruke ekstremofile enzymer, måtte man legge til nytt DNA polymerase en gang per oppvarmingssyklus. Se boks 10.5 i tillegg til seksjonen om PCR i Renneberg! første basen i sekvensen (etter primer-seksjonen) den komplementære basen T. Det nest nederste merket gir informasjon om den nest første basen i sekvensen, og så videre. Hvorfor fungerer det? Renneberg og slides er ikke veldig gode for å beskrive Sangers kjede-termineringsmetode og hvorfor det fungerer. Disse videoene forklarer det bedre: https://www.youtube.com/watch?v= nudG0r9zL2M og https://www.youtube.com/watch?v= vK-HIMaitnE. Den viser også hvorfor det er begrenset hvor store sekvenser som kan leses med én iterasjon av metoden (grensen er på ca. 400 basepar). Det er riktignok mulig å lese lengre sekvenser ved å gjennomføre metoden flere ganger og sette sammen resultatene fra hver runde som i et puslespill. Automatisk DNA-sekvensering Datamaskiner gjør det mulig å lese ut lengre DNA-sekvenser. Med den automatiske metoden putter man fluorescerende merkelapper på de modifiserte nukleotidene (ddNTP). Man har forskjellige merkelapper på hver av nukleotidene, så reaksjonen kan skje i én prøve i stedet for 4. Reaksjonen utføres på samme måte som i Sangers kjede-termineringsmetode, men produktene separeres med kappilær elektroforese i stedet for gel-elektroforese. Så eksiterer en laser de fluoDNA-sekvensering er metodene man har for å finne rescerende merkelappene, og de modifiserte nukleotidenes den eksakte nukleotidsekvensen i DNA. Dette er nyttig respons måles med en detektor. Basert på kombinasjofor å utlede aminosyresekvensene i proteiner, finne den ek- nen av plassering i den kapillære tuben (som gir inforsakte sekvensen til et gen, finne regulerende elementer som masjon om reaksjonsproduktets størrelse, det vil si når promotere, finne forskjeller i gener og å finne mutasjoner. polymerasereaksjonen terminerte) og signalet fra detektoren (som gir informasjon om hvilken modifisert nukleotid Sangers kjede-termineringsmetode er den vanligste som forårsaket termineringen) kan man, med tilstrekklig metoden for å sekvensere DNA, og ble funnet opp av Fred- lur software, finne DNA-sekvensen. erick Sanger i 1977. 1. DNA denatureres, som beskrevet i Southern Blotting FISH står for “fluorescence in situ hybridization” og er en og PCR. En av de to strengene tas ut, denne kalles metode for å finne ut på hvilket kromosom et gen ligger, og en “template”-streng om det finnes mange kopier av genet spredt utover forskjel2. Template-strengen hybridiseres med en radioaktivt lige kromosomer. Genene spres ut på en glassplate, og man merket primer, for å tillate at nukleotider legges til legger til en DNA-probe med det komplementære DNA-et senere. til genet man skal undersøke, med en fluorescerende markør. 3. Man lager 4 separate løsninger. Til alle løsningene Proben hybridiserer med de relevante genene, slik at de legger man til DNA-et som skal sekvenseres, som nå lyser opp under fluoerescensmikroskop. har en primer på seg. FISH kan brukes til å identifisere kreftceller, som 4. DNA polymerase legges til i de 4 løsningene. har karakteristiske forvrengninger i DNA-et; blant annet 5. Frie nukleotider (dNTP, deoksyribonukleotider) er rekkefølgen av de 23 kromosomparrende mikset opp. legges til i de 4 løsningene. Alle de 4 nukleotidene i Teknikken er spesielt effektiv når man bruker forskjellige DNA (A, T, G, C) legges til i alle 4 løsningene. markører med forskjellige farger (da kalles det “multicolor 6. Modifiserte nukleotider (ddNTP, dideoksyribonuk- banding”). leotider) legges til i de 4 løsningene. Kun én type FISH-tester kan også brukes til å studere strukturen til modifisert nukleotid legges til i hver løsning. Vi kan kromosomer eller finne kromosomfeil. kalle de modifiserte nukleotidene A*, T*, G* og C*. ddNTP er som dNTP, men en OH-gruppe er erstat10.3 Genomikk tet med et H-atom. Dette gjør at DNA polymerase må stoppe etter at det har slengt på et modifisert Genom En komplett kopi av den genetiske informasjonukleotid i kjeden, fordi det ikke er noe OH-gruppe nen til en organisme kalles organismens genom. som den kan hekte neste nukleotid på. 7. Prøver tas ut av alle løsningene, og DNA-fragmentene i de 4 løsningene sammenlignes basert på størrelse Genomikk Disiplinen innenfore genetikk som innebærer ved hjelp av gel-elektroforese. å kartlegge, sekvensere og analysere funksjonene til hele Nå kan nukleotidsekvensen leses ut direkte fra gel-en! Hvis genomer. Analysen av genomets funksjon kalles funksjonell det nederste merket i gel-en er fra A*-løsningen, var den genomikk. 25 The Human Genome Project Et prosjekt som foregikk fra 1990 til 2005, med det formål å kartlegge hele det menneskelige genom - alle de 3.4 milliarder baseparene -, konstruere et detaljert fysisk kart over genomet og å bestemme nukleotidsekvensen til alle de 23 menneskelige kromosomene. Presis kunnskap om det menneskelige genomet er et viktig verktøy for å behandle og forebygge genetiske og genetisk påvirkede sykdommer. Blant disse har man de monogenetiske sykdommene som forårsakes av en feil i ett enkelt gen (som Huntington’s, fenylketonuri og cystisk fibrose), men også sykdommer som kreft og astma har genetiske komponenter. Genomisk kartlegging Siden genomet til en organisme består av milliarder av basepar, men sekvenseringsteknologien som er beskrevet over er begrenset til sekvenser på 750 basepar, må genomet settes sammen som et puslespill. For å hjelpe til med puslespillet trengte man genomiske kart som inneholder informasjon om bestemte jevnt fordelte “markører”. Slike genomiske kart finnes i to typer - genetiske kart og fysiske kart.3 Genetiske kart I genetiske kort er markørene korte stykker der sekvensen CACACA repeteres. Slike sekvenser kalles STRs for “short tandem repeats”. Slikt DNA finnes på alle kromosomer, og antallet repetisjoner i en STR kan man finne ut ved å bruke komplementært DNA med forskjellige lengder (f.eks Primer-CACACA-Primer og Primer-CACACACACACA-Primer) og kjøre det gjennom PCR og gel-elektroforese. Hvor langt det hybridiserte DNAet kommer i gel-en avhenger av hvor lang STR-en er. eller tilsvarende, og prøv å sette det hele sammen basert på genetiske markører. En annen metode er “Shotgun”-metoden til Craig Venter sitt firma Celera Genomics, som man tidligere hadde brukt for å sekvensere genomet til Haemophilus influenzae-bakterien. Shotgun-metoden er å tilfeldig fragmentere genomet med ultralyd, sekvensere fragmentene, og prøve å se etter overlapp. Dette fungerer bare hvis man finner overlapp mellom alle sekvenser. Det går fint med prokaryote celler som inneholder få repeterende sekvenser, men eukaryote celler har mange STR-er som gjør at man kan få falske positive resultater. Venter måtte utvikle kompliserte algoritmer for å løse problemet, og måtte til slutt støtte seg på resultatene fra Contiq-metoden til Human Genome Project. • Bioinformatikk: utviklingen av softwarealgoritmer som finner, setter sammen og analyserer DNAsekvenser. • Transkriptomikk: studiet av genuttrykk, et verktøy for å studere endringer i genaktivitet og hvordan de kan fremkalle sykdommer. Her studerer man voksent mRNA, hentet fra både friskt og sykt vev. Slikt voksent mRNA inneholder kun genetisk informasjon for uttrykte gener, så ved å sammenligne genuttrykket i friskt og sykt vev kan man vise hvilke endringer i genuttrykket som forårsaker sykdom. Til dette brukes DNA-chips - matriser med tusener av kjente genfragmenter. Reverstranskriptase brukes for å lage DNA (med fluorescerende eller radioaktive markører) som kan hybridisere med det komplementære DNAet på chip-en, slik at man kan se hvilke gener som er uttrykt. • Proteomikk: identifisering av alle proteinene i en celle; hvordan uttrykkes proteiner, og hvordan fungerer og interagerer de? Proteomikk består av å isolere enkeltproteiner, og så gjøre detaljert strukturell analyse av proteinene. Fysiske kart viser posisjonen til bestemte DNAsekvenser på DNA-molekylet. Disse sekvensene finner man ved å bruke revers-transkriptase på voksent mRNA for å lage DNA. Dette DNA-et brukes som prober i FISH eller andre teknikker for å finne posisjonen til genet på kromosomet. Farmakogenomikk Personalisert medisin basert på individets genetikk. Forskjellige pasienter har forskjellige Avansert genomanalyse Noen aspekter ved avansert gener som interagerer med medisin, og derfor vil medisin analyse av det menneskelige genomet er: fungere forskjellig for forskjellige pasienter. Dette med• DNA-sekvensering: her finnes det to metoder. fører at svært mange pasienter ikke har noen nytte av “Contig”-metoden, som ble brukt i Humane Genome medisinene sine. Den genetiske profilen til pasienten blir Project, er: lag kloner av genomet, kutt opp dermed et enormt nyttig verktøy for å bestemme hvilken med restriksjons-endonukleaser, introduser de re- medisin pasienten skal ta, og gjør at man kan ta medisin sulterende fragmentene i plasmidet til bakterier, som er mer effektiv og har færre bivirkninger. I tillegg er sekvenser hver av segmentene med Sangers metode det et nyttig verktøy for diagnostisk risikoanalyse. 3 Rennebergs beskrivelse av genomisk kartlegging oppleves av undertegnede som en ugjennomtrengelig ordsalat som overhodet ikke forklarer forskjellen mellom genetiske og fysiske kart, noe som kommer til uttrykk i de noenlunde intetsigende avsnittene jeg har skrevet om temaet. Artikkelen What type of genome maps are there?, lenket til i Tonsill B, gir en mye mer forståelig forklaring av den prinsipielle forskjellen mellom genetiske og fysiske genomkart, men den er så annerledes fra det Renneberg sier at jeg lurer på om de to beskrivelsene engang er enige. Ifølge en slik beskrivelse handler genetiske kart om hvilke gener som ofte arves sammen (som gir et mål på “genetisk avstand”), mens fysiske kart er basert på den faktiske fysiske avstanden mellom to sekvenser, målt i antall basepar fra det ene til det andre. Den eksamens-engstelige leser kan beroliges med at det trolig bare er nødvendig med overordnet kunnskap om genomikk og The Human Genome Project. 26 Tonsill A Video • Kurzgesagt forklarer det menneskelige immunsystemet med fin minimalistisk grafikk. https://www.youtube. com/playlist?list=PLFs4vir_WsTyY31efyHdmtp9l7DpR0Wvi • 3D-animasjoner som forklarer mye av det som beskrives i kapittel 3 og 10. http://www.dnalc.org/resources/ 3d/ B Andre linker • Genetically Modified Foods Are Nothing New : en litt bedre og grundigere forklaring enn den som står i Renneberg på hvorfor truslene med transgene planter ikke er så ille som enkelte skal ha det til. http://www.agbioworld. org/biotech-info/articles/agbio-articles/GM-food-nothing-new.html • What type of genome maps are there? : en rimelig enkel forklaring av den prinsipielle forskjellen mellom genetiske og fysiske kart av genomet. http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp3_2.shtml C Spekulering rundt eksamensoppgaver Det har vært et par eksamensoppgaver der man skal presentere en teknologi som en bioteknologisk løsning. Tidligere tema har vært genterapi og kloning. Disse oppgavene har en oppdelt struktur, der man skal presentere • Problem: Hvem sitt problem er dette? Er problemet presserende? Hvordan kan problemet formuleres anderledes? • Løsning: Hvem tjener eller taper på løsningen? Hvilke andre løsninger kunne vært valgt? Hvorfor er denne løsningen best? • Argument: Er tekniske løsninger optimale? Hvilken samfunnsmessig infrastruktur forutsettes? Er dette en stabil og realistisk løsning? Hvilke alternativer finnes? • Implikasjoner : Er det knyttet miljømessige eller andre risikoer til løsningen? Vil teknologien i praksis forsterke eller løse problemet? Hvilke konflikter kan oppstå? Er samfunnsmessige verdikonflikter involvert? Får utforksningen av implikasjonene følger for argumentet? Utdypningene på de tre punktene er hentet fra forelesning om bioetikk. D Forbedringspotensiale Det er ikke alt jeg var like sikker på (eller like interessert i å skrive om) da jeg skrev dette kompendiet: • Jeg vet ikke om jeg egentlig helt har forstått mekanismen for hvordan antibiotikaresistens induseres i rekombinante bakterier (kapittel 3). • DNA-replikasjon og slikt (kapittel 3) er ikke gjennomgått i detalj. Dette fordi det finnes hundre tusen millioner figurer og videoer om dette i bøker og på Internett. • Screening (kapittel 4) er hoppet over. • Strukturen til antistoffer (kapittel 5) er beskrevet noe knapt. • Rekombinante antistoffbibliotek (kapittel 5) er hoppet over. • Deler av kapittel 10, særlig om genomikk, er noe knappere enn de kanskje fortjener. Hvis noen vil skrive et avsnitt eller to om dette som jeg kan legge inn i dokumentet, mottas dette med takk. E Takk Takk til • Reinhard Renneberg, for at han har puttet masse bilder av kjæledyrene sine, samt personlige anekdoter, inn i Biotechnology for Beginners • De som startet på Nanoteknologi på NTNU i 2013, for å være en bra gjeng • Jeg har fått en forespørsel om å legge inn en dedikasjon. Jeg dediserer derfor herved dette kompendiet til meg selv, for uten meg hadde jeg aldri kunnet skrive denne teksten. Takk til meg for mange gode innspill under skriveprosessen F LaTeX Her er .tex-filer og bilder til dette dokumentet: http://folk.ntnu.no/jonathrg/biotex/ 27 Register α-heliks, 4 β-flak, 4 5-day BOD, 14 Acetobakter, 16 Acidithiobacillus, 16 ADA-syndrom, 22 adaptasjon, 8 adaptiv immunrespons, 13 aerob vannrensning, 14 aerobe organismer, 2 affinitetskromatografi, 8 Agrobacterium, 18, 19 aktivert slam, 14 aktivt sete, 5 alger, 17 allosterisk enzym, 9 aminosyrer, 4 amylaser, 5 anaerobe organismer, 2 anoksygenisk fotosyntese, 2 antifrost-bakterier, 20 antigendeterminant, 13 antisense-RNA, 12, 19, 23 antistoff, 13, 24 antiviral medisin, 12 arkebakterier, 1, 15 arvemateriale, 6 Asilomar-konferansen, 8 aspartam, 11 Aspergillus, 5, 16 ATP, 3 autotrofer, 2 auxin, 18 avløpsvann, 14 Bacillus licheniformis, 6 bakterier, 1 basepar, 6 bioetanol, 15 biogass, 15 bioinformatikk, 26 bioleaching, 16 biologisk test, 23 bioplast, 17 Biopol, 17 bioreaktor, 10, 18, 20 biosensor, 23 Biosteel, 17 biosurfaktanter, 17 blå nellik, 19 black box model, 9 Bt-toksin, 19 callus, 18 Candida, 17 cDNA, 7 celle, 1 celleånding, 2 cellekjerne, 2 cellemorfologi, 2 cellevegg, 1 cellulær immunrespons, 13 Clostridium acetobutylicum, 16 contig-metoden, 26 Corynebacterium glutamicum, 10, 11 cyclosporin, 12 cytokin, 18 cytoplasmamembran, 1, 2 cytotoksiske T-celler, 13 D- og L-stereoisomeri, 4, 11 deoksyribose, 6 det sentrale dogmet i molekylærbiologi, 6 differensiering, 1, 22 DNA, 6 DNA polymerase, 6 DNA-ligase, 7 DNA-pistol, 18 DNA-probe, 7 DNA-profil, 21 DNA-sekvensering, 25, 26 DNA-synthesizer, 7 Dolly, 20 E. coli, 14, 17, 19, 20 eddiksyre, 16 ekstracellulære hydrolaser, 5 ekstremofile organismer, 3, 25 ELISA-testen, 14 endoplasmatisk retikulum, 2 endring i enzymaktivitet, 9 endring i genuttrykk, 9 enzym, 5 enzymkatalyserte reaksjoner, 5 enzymkilder, 6 epitop, 13 essensielle aminosyrer, 4 etanol, 16 eutrofiering, 15 ex vivo, 23 FAD, 3, 24 fagocytose, 8, 23 farmakogenomikk, 26 ferrocen, 24 FISH, 25 fjerning av fosfor, 15 fjerning av nitrogen, 15 flagella og pili, 1 fosfinotricin, 19 fosfodiesterbinding, 6 fosfolipider, 2 fototroper, 2 Frederick Sanger, 25 Fusarium, 18 28 fusjonshemmer, 12 fysisk kart, 26 fytase, 6 gel-elektroforese, 24 gene silencing, 23 genetisk kart, 26 genetisk variasjon, 7 genetiske funksjoner, 1 genmodifisert mat, 19, 20 genom, 25 genomikk, 25 genomisk kartlegging, 26 genoppdrett, 20 genterapi, 22, 23 genvektor, 22 glukonsyre, 16 glukoseisomerase, 6 glukosemetabolisme, 3 glukoseoksidase, 5, 23 glutamat, 11 Glybera, 23 glykogen, 3 glyserol, 16 Gobarprosjektet, 15 golden rice, 19 golgiapparat, 2 graviditetstest, 24 hånd-i-handske, 5 Haemophilus influenzae, 26 haploid, 18 hCG, 24 hemoglobin, 5 Heterotrofer, 2 hjerteinfarkt, 24 hopanoider, 2 horisontal genetisk utveksling, 1 Human Genome Project, 26 humoral immunrespons, 13 hvit bioteknologi, 9 hvitråte, 16 hydrolase, 5 ikke-lytisk angrep, 12 ikke-viral vektor, 22 immobilisering, 6, 24 immunforsvar, 12 immunologisk testing, 24 in vitro, 18, 22 in vivo, 23 inducer, 7, 9 induserbart enzym, 9 industriell bioteknologi, 9 insulin, 8 integrasehemmer, 12 interferon, 12 intron, 7, 24 isomeraser, 5 katabolisme, 2 katalytiske funksjoner, 1 kjemikalier fra biomasse, 16 kjemolitotrofer, 2 kjemoorganotroper, 2 kjemotrofer, 2 klassisk mutagenese, 10 kloning, 20 kloning av gener, 7 kloroplaster, 2 kodon, 6 koenzym, 5 kofaktor, 5 kombinasjon av kjemisk syntese og bioteknologi, 11, 15 konjugering, 7 konstitutivt enzym, 9 kopper, 13 kortison, 11 kunstig snø, 20 kvartærstruktur, 5 Lactobacillus, 16 laktose, 9 ligaser, 5 lignocellulose, 16 liposom, 23 luciferase, 19 lyaser, 5 lysin, 10 lysozym, 5 lytisk angrep, 12 mammut, 21 medfødt immunrespons, 13 melkesyre, 16 membranproteiner, 2 MEOR, 16 meristem, 18 metabolic engineering, 10 metabolisme, 2 metabolsk diversitet, 2 metan, 15 metanogenese, 15 mikroinjeksjon, 8 minne-celler, 13 mitokondrier, 2 monoklonale antistoffer, 14 motilitet, 1 mRNA, 6 multicolor banding, 25 mutagen, 11 mutasjon, 11, 23 mykoprotein, 18 n-butanol, 16 nøkkel-i-lås, 5 NAD, 3 negativ feedack, 9 negativ kontroll, 9 neopterin, 13 Nitrobacter, 15 Nitrosomonas, 15 nukleoid, 1 nukleotid, 6 oksidoreduktaser, 5 oksygenisk fotosyntese, 2 oljedegraderende bakterier, 15 operator-region, 7 overføring av kjerne, 20 passiv diffusjon, 2 PCR, 24 pektinase, 5 penicillin, 11 peptidbinding, 4 peptider, 4 personalisert medisin, 26 planter, 18 plasmid, 1, 7, 8, 12, 18, 23 pluripotens, 22 polykation, 23 polylaktat, 17 Population equivalent, 14 preimplantasjonsdiagnostikk, 21 primærprodusenter, 2 primærstruktur, 4 produktivitet, 10 prokaryot, 1 promoter, 7 proteasehemmer, 12 proteaser, 5 proteiner, 4 proteomikk, 26 protoplast, 18 Pseudomonas, 20 Pseudomonias, 15 pullulan, 17 Quorn, 18 raps, 19 reduksjon i aktiveringsenergi, 5 refuge crops, 19 regulering i Norge, 20, 21 rekombinante antistoffer, 14 rekombinasjon, 7 repressorprotein, 7, 9 resistens, 12 resonans, 4 restriksjons-endonuklease, 7, 24 revers-transkripsjon, 12, 26 Rhizopus, 5 ribosom, 1, 6 ribozym, 5, 23 Round-Up, 19 Sangers kjede-termineringsmetode, 25 29 sekundærstruktur, 4 selektivt medium, 8 short tandem repeats, 26 shotgun-metoden, 26 Single Cell Protein, 17 SiRNA, 23 sitronsyre, 16 SMaRT, 23 somatisk celle, 20 somatisk hybridisering, 18 Southern blotting, 24 sovende viralt DNA, 12 soya, 19 spesifikk veksthastighet, 10 Spirulina, 17 spiselige mikrober, 17 stamcelle, 22 stereoisomeri, 4 steroler, 2 strategisk adaptasjon, 9 strukturelt gen, 7 substrat, 5 substratspesifikt enzym, 5 subtilisin, 6 suspensjonskultur, 18 T-celle, 13 tørråte, 19 taktisk adaptasjon, 9 telomer, 21 teratom, 22 terminator, 7 tertiærstruktur, 4 Thermus aquaticus, 25 Ti-plasmid, 18 titin, 4 toksoider, 13 Tolypocladium inflatum, 12 totipotens, 18 transferaser, 5 transgen plante, 19 transkripsjon, 6 transkriptasehemmer, 12 transkriptomikk, 26 translasjon, 6 trickling filters, 14 utbytte, 10 utvikling av bioprosesser, 10 vaksine, 13 vin, 19 viral vektor, 22 virosom, 23 virus, 12 vitamin C, 11 voksent mRNA, 26 Xanthan, 17 Xanthomonas campestris, 17
© Copyright 2024