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Curso de Química Forense. Módulo I. Lic. Daniela C. Parodi
2014
PERITAJES SOBRE SEMEN
Aparato genital masculino
Los genitales se llaman también órganos sexuales o reproductores. El aparato genital
masculino lo formas los órganos externos, pene y escroto, e internos, que son los
testículos, los epidídimos, los conductos deferentes, las vesículas seminales, la próstata
y la uretra.
El pene
Es el órgano copulatorio del hombre destinado a depositar semen en la vagina. Se trata
de un órgano muy complejo en su estructura y funcionamiento.
Está situado en la pared anterior de la pelvis y en estado de reposo es blando y móvil. Se
compone de tres cuerpos cilíndricos: dos cavernosos, unidos lateralmente y que se
comunican entre sí; y uno esponjoso, esencialmente muscular, situado por debajo. Este
cuerpo esponjoso termina en la punta del pene y tiene forma piramidal o de bellota y por
este último motivo recibe el nombre de glande.
En el glande se abre un orificio: el meato urinal, que es donde desemboca el conducto
de la uretra y por donde sale la orina y el semen. Curiosamente, gracias a un dispositivo
que regula cada función, nunca se mezclan.
La piel que recubre el pene es muy elástica y tiene una zona móvil llamada prepucio,
que es la que recubre el glande. El prepucio tiene la capacidad de replegarse totalmente
para dejar al descubierto el glande cuando se produce la erección. La piel del prepucio
está unida al glande por el frenillo, que es un delgado ligamento. Debajo del prepucio se
acumula una sustancia blanquecina y sebosa con un olor característico, denominada
esmegma que se elimina con una buena higiene.
El escroto
El escroto es una bolsa de piel dividida en su interior en dos cámaras que alojan los
testículos o glándulas sexuales masculinas. Su función es protegerlos.
Los testículos
Los testículos o gónadas masculinas, son las glándulas sexuales masculinas. Están
ubicados debajo del pene, entre los dos muslos. El hecho de que estén situados por fuera
tiene una explicación fisiológica: para que puedan funcionar correctamente necesitan
estar a una temperatura inferior a la del interior del cuerpo.
Realizan una doble función: reproductora y hormonal. Por un lado, están destinados a
fabricar las células principales del semen: los espermatozoides. Por otro lado, funcionan
como unas glándulas de secreción interna que producen las hormonas, que hacen
posible la activación de las funciones sexuales masculinas. Una de las hormonas más
importantes es la testosterona.
El interior del testículo esta formado por infinidad de pequeños conductos- túmulos
seminíferos- que se unen a otros más grandes los cuales confluyen en el epidídimo, un
órgano en forma de media luna, situado sobre el testículo. Desde los túmulos
seminíferos, los espermatozoides inician un viaje en dirección al epidídimo.
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En los túmulos seminíferos de los testículos, se forman los espermatozoides durante un
proceso que se llama espermatogénesis, influido por una hormona llamada testosterona
y por la FSH. Al principio los espermatozoides carecen de movilidad y avanzan gracias
a los movimientos peristálticos de estos túmulos. Pero según van avanzando, se van
diferenciando y adquieren movilidad.
Los epidídimos
Están situados en la parte posterior, encima del testículo, por eso se llama epidídimo
(sobre testículo) y, en realidad, no son una parte de los testículos, sino unas estructuras
formadas por la unión de pequeños tubos. Constituyen el primer segmento del conducto
espermático, aquí los espermatozoides son retenidos durante mucho tiempo, incluso
semanas, recorriendo su trayecto lentamente e impulsados por las contracciones
peristálticas del músculo liso de la pared de este conducto. En el epidídimo los
espermatozoides aumentan su capacidad fertilizante. Es el lugar principal de
almacenamiento de los gametos masculinos.
El epidídimo tiene su continuación en el conducto deferente, una estrecha vía que va a
parar a las vesículas seminales, lugar donde se produce el líquido necesario para que los
espermatozoides sigan vivos y en movimiento. Debajo de la vejiga urinaria se encuentra
la próstata, que tiene una función similar a la vesícula seminal.
Los conductos deferentes
Son dos canales por los cuales los espermatozoides que han madurado inician el ascenso
hacia las vesículas seminales. Los espermatozoides maduros ascienden por los
conductos para instalarse en las vesículas seminales. Contienen escasos
espermatozoides. Su función, con su gruesa capa muscular, es la de transportar
rápidamente el semen durante el coito, hacia la uretra.
Las vesículas seminales
Como su nombre lo indica, son unos depósitos situados debajo de la vejiga urinaria. Su
misión consiste en acoger a los espermatozoides maduros. Las vesículas seminales se
encargan de fabricar un líquido viscoso, llamado plasma seminal, para que los
espermatozoides puedan nutrirse, protegerse y desplazarse con facilidad.
Producen una densa secreción que contribuye de manera muy importante al volumen del
eyaculado, que oscila entre el 46% y el 80%, siendo la última parte del semen en salir
en una eyaculación. Esta secreción es rica en fructuosa o levulosa, que es el azúcar
principal del semen y proporciona los hidratos de carbono utilizados como fuente de
energía de los espermatozoides móviles, y relacionada con la motricidad de los mismos.
Es la productora de colina, una base orgánica constitutiva de la lecitina, que interviene
en el metabolismo y transporte de los lípidos. También contiene pequeñas cantidades de
un pigmento amarillo, flavonas en su mayor parte, que aportan al semen una fuerte
fluorescencia a la luz ultravioleta, que tiene mucho interés en medicina legal para la
detección de manchas de semen en una violación.
La próstata
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Es una glándula masculina que se encuentra situada entre la vejiga, la uretra y el recto.
En la próstata confluyen la vía seminal y la urinaria. A partir del punto de confluencia,
la trayectoria del semen y la de la orina por la uretra es la misma. Recordemos que
nunca llegan a juntarse ambos líquidos, ya que existen unas válvulas que abren o cierran
el paso, según convenga.
La próstata segrega un fluido viscoso y blanquecino muy parecido al líquido seminal.
Ambos líquidos, junto con los espermatozoides forman el semen. El semen es el líquido
blanco y denso que se expulsa a través de la uretra cuando se produce la eyaculación.
La próstata fabrica un líquido llamado porción prostática que protege, alienta y facilita
la movilidad de los espermatozoides, que constituye entre el 13 y 33% del volumen
eyaculado. El líquido prostático es muy rico en enzimas fosfatasas y ácido cítrico. La
próstata produce también el fosfato de espermita, un compuesto nitrogenado presente en
cantidad abundante en el semen humano. Cuando el semen se enfría y comienza a
secarse, esta sustancia forma los cristales de Böttcher. Otra sustancia de importancia es
una proteína específica del semen, la proteína P30 o E1, de PM 30000 y también
denominada antígeno prostático específico.
Las glándulas de Cowper
Debajo de la próstata hay dos pequeños órganos que reciben el nombre de glándulas de
Cowper. Su función es la de segregar un líquido que se vierte en la uretra con el fin de
lubricar al semen, poco abundante pero rico en mucoproteínas, galactosa, galactosamina
y ácido galacturónico, siendo la primera parte del eyaculado y que facilitan la
lubricación de la uretra que recorre el pene para el paso del semen a gran velocidad
hacia el exterior, gracias a la contracción de los músculos bulbo-uretrales, cuando se
produce la excitación sexual. Esta secreción limpia la uretra y la lubrica, dejándola
preparada para la eyaculación. Hay que tener en cuenta que esta secreción puede
contener espermatozoides, por tanto, si hay penetración, puede haber embarazo aunque
la eyaculación se produzca fuera de la vagina.
La uretra
Es un conducto que atraviesa la próstata hasta llegar al final del glande, donde se
ensancha formando el meato urinario, que es por donde sale la orina o el semen. La
uretra conduce el semen o la orina hacia el meato urinario para expulsarlos hacia el
exterior.
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Los espermatozoides
Los espermatozoides son las células reproductoras masculinas. Los que ya han
madurado se componen de cabeza, cuerpo y cola.
La cabeza es oval vista de frente y aguzada vista de perfil. Se distinguen en ella el
acrosoma y el núcleo, recubierta por la galea capitis. Siendo el acrosoma quien tiene la
función de la penetración en el óvulo. El segmento intermedio es cilíndrico y contiene la
mayor parte del citoplasma el cual recubre dos filamentos, uno axial y otro espiral como
una vaina formada especialmente por mitocondrias. La cola constituye el aparato
locomotor quien le provee de movimientos traslativos rápidos que constituyen el índice
de viabilidad de los mismos, alrededor de 50 micrones/seg.
Por lo general, los espermatozoides pueden mantenerse activos unos tres días dentro del
aparato genital femenino. No obstante, se han encontrado algunos vivos en el cuello del
útero ocho días después de la eyaculación. Tardan más de setenta días en madurar. En
este momento inician el ascenso desde los testículos para juntarse con las porciones
seminales. Se calcula que en cada centímetro cúbico de semen hay un mínimo de unos
veinte millones de espermatozoides.
El semen o esperma es un líquido libre de bacterias. Está compuesto por los
espermatozoides, la porción seminal y la porción prostática. Los espermatozoides
inician una veloz carrera que va de los testículos a la ampolla seminal, desde donde
pasan al pene a través de la próstata.
Semen
El semen o esperma, proviene del griego sperma (que significa semilla), es un líquido
viscoso y blanquecino, que es expulsado a través del pene durante la eyaculación. Está
compuesto por espermatozoides (de los testículos) y plasma seminal (de glándulas
vesicales, próstata y glándulas bulbo-uretrales).
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Espermograma
Se denomina así al estudio clínico que se efectúa parea apreciar las características
físicas y químicas del semen.
Los parámetros que se evalúan en un espermograma son: el volumen de la muestra, el
número de espermatozoides que contiene cada mililitro, el porcentaje de ellos que
presentan movilidad, buena, muy buena o nula; también el porcentaje de
espermatozoides cuya anatomía es anormal (morfología) y el número total de
espermatozoides móviles útiles.
Características del semen
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El volumen medio de semen de una eyaculación es de 3 a 5 mililitros, con
máximo de 15 ml.
El cuerpo humano elimina periódicamente el semen almacenado.
El color del semen es normalmente blancuzco o blanco lechoso. Si el líquido
eyaculado presenta un color anaranjado o rojizo puede que contenga sangre,
signo que se conoce como hematospermia, que puede indicar un trastorno
urológico.
El semen tener una consistencia de coágulo, debido a la facilidad de
solidificación que posee gracias al fosfato de espermita.
El olor y el sabor del semen es peculiar y variable en cada individuo
dependiendo de múltiples factores. El aroma puede ser muy intenso.
El pH del semen es de 7,8 a 8,2.
Menos del 10% del volumen del semen de una eyaculación corresponde a los
espermatozoides.
Más del 90% del volumen del semen de una eyaculación corresponde al líquido
seminal.
La concentración normal de los espermatozoides en el semen varía de 50 a 150
millones por mililitro.
El semen contiene algunas otras células, desprendidas del epitelio de los
conductos excretores y de la uretra, a veces también puede contener leucocitos.
En caso de infección del organismo, el semen puede llegar a contener altas
concentraciones de gérmenes o virus, como por ejemplo el VIH (responsable de
la infección en humanos, mal denominada SIDA).
Debido a la composición del semen, en condiciones adecuadas, los espermatozoides
pueden permanecer vivos fuera del organismo durante varios días. También sobreviven
durante cierto tiempo en los conductos excretores después de la muerte del varón. Se
han llegado a encontrar gametos masculinos vivos en la trompa de Falopio y en el útero
de la mujer varios días después del coito. Pueden almacenarse en estado congelado con
nitrógeno líquido durante meses o años ya que mantienen su capacidad fertilizante tras
la conservación o criopreservación. Debido a esta última característica es posible la
inseminación artificial y la fecundación in Vitro con semen congelado o criopreservado.
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Composición del semen
Entre las sustancias que componen al semen se encuentran además de lo ya
mencionado, fructosa, aminoácidos, fósforo, potasio y hormonas, aportadas por las
vesículas seminales.
La próstata aporta de 15 a 30% del plasma seminal y su secreción contiene, ácido
cítrico, fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida, calcio, sodio, zinc, potasio, enzimas
proteolíticas y fibrolíticas.
El último elemento que se agrega al semen es un fluido que secretan las glándulas
uretrales y bulbouretrales, una proteína espesa, clara y lubricante conocida como moco.
Edad de producción de semen
El semen comienza a producirse a partir de la pubertad y tiene las características del
adulto a partir de los 11-14 años en la mayoría de los adolescentes. La cantidad
producida aumenta con la edad hasta un nivel máximo que depende de cada individuo,
luego disminuye a medida que el varón envejece, no obstante, se produce semen durante
toda la vida adulta del varón.
Análisis pericial de manchas seminales
El material bajo pericia suele ser de lo más variado, es habitual trabajar con ropa interior
de la víctima y sospechado, ropas de cama, toallas, alfombras y material de tapicería en
general, etc. En ocasiones debe efectuarse con exudados vaginales o rectales, o hisopos
obtenidos luego del levantamiento de dichos rastros. Otras veces es necesario
trasladarse al lugar del hecho para realizar la observación sobre pisos, escaleras, interior
de vehículos, etc.
En función de la porosidad del soporte podemos encontrar distintas características, en
materiales absorbentes las manchas presentan un color grisáceo que se amarillenta con
el tiempo, con bordes irregulares. Si el soporte es flexible, caso de las telas, estas
adquieren una consistencia apergaminada al tacto, por el gran tenor de hidratos de
carbono presentes en el semen.
Si el soporte no es absorbente, el semen al secarse deja un residuo constituido por una
película o escamas brillantes que se pueden retirar por raspados con elementos
adecuados.
Cuando deben revisarse grandes superficies sospechadas es conveniente la utilización
de una lámpara UV, las manchas de semen suelen presentar una fluorescencia
amarillenta, debido a que tal característica no es exclusiva, el análisis químico posterior
será el que determinará su naturaleza. En numerosos casos las fluorescencias típicas de
los soportes enmascaran esa característica y en esos casos se verán manchas opacas
sobre fondo con fluorescencia.
La fluorescencia es independiente de la presencia o no de espermatozoides.
Una vez localizadas las manchas debe efectuarse el estudio pericial propiamente dicho,
nuevamente vamos a tener reacciones de orientación y de certeza.
Por supuesto que la presencia de espermatozoides en la misma será concluyente, pero la
ausencia de los mismos en el semen de muchos individuos (azoospermia u
oligozoospermia grave) por razones de enfermedades congénitas o adquiridas, la
posibilidad de sujetos vasectomizados, por excusión parcial de los conductos deferentes
y las alteraciones que el material pericial pueda sufrir por exposición a los factores
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actínicos que afecten su morfología. Es muy común el desprendimiento del filamento
denominado cola del espermatozoide, lo que hace en numerosas ocasiones tal
identificación imposible, o al menos, insegura. También es muy común que la víctima
luego de un ataque de este tipo proceda a higienizarse cuidadosamente antes de
proceder a la denuncia del hecho, de manera que esa operación arrastra la presencia de
los espermatozoides.
Por lo tanto la Criminalística ha adoptado el criterio de aceptar otras pruebas químicas
con valor concluyente, como veremos más adelante aunque tal situación es cuestionada
por algunos Criminalistas.
Pasamos a continuación a describir las técnicas propuestas:
1. Métodos cristalográficos
Reacción de Florence
Se basa en la formación de cristales de Yoduro de colina, como ya se ha mencionado la
colina se encuentra en la composición normal del esperma en forma de fosforil colina y
de lecitina.
El reactivo de Florence está constituido por una solución de Yodo metálico y yoduro de
potasio en agua destilada, el agregado de IK es con la finalidad de facilitar la disolución
del Yodo. El material a analizar, obtenido por raspado o por disolución según la
naturaleza del soporte, se coloca sobre un portaobjetos, en el segundo caso se deposita
una gota de la solución y se deja secar sobre el mismo, a continuación se cubre con un
cubreobjetos, y finalmente por capilaridad se agrega entre porta y cubre una gota del
reactivo, se deja en reposo, no más de 20 minutos, pues los cristales pueden redisolverse
y se observa al miscroscopio. La presencia de unos cristales laminares de color pardo
indican la formación de yoduro de colina.
Este ensayo requiere la presencia de colina libre, que normalmente está en el semen
como fosforicolina, por lo tanto es necesaria la actividad de la enzima fosfatasa,
también presente en el semen para liberarla.
Reacción de Barberio
Se basa en la formación de cristales de picrato de espermita, hemos mencionado que la
misma se encuentra en el semen como fosfato de espermita en cantidades importantes
aunque no es exclusiva del semen.
El reactivo de Barberio está constituido por una solución saturada de ácido pícrico. La
técnica de la reacción es similar a la anterior y se obtienen cristales fusiformes
refringentes de color amarillo.
De la misma manera que el anterior, este ensayo requiere la desfosforilación de la base
nitrogenada.
2. Observación microscópica de espermatozoides
Observación microscópica directa
El reconocimiento de un espermatozoide en una mancha es una prueba irrefutable de la
presencia de semen, esa visualización es fácil en manchas frescas especialmente si
dicho líquido aun no se ha secado totalmente. Ayudado por la morfología característica
del espermatozoide y aun por el movimiento típico.
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Por el contrario en manchas secas y eventualmente contaminado por partículas, la
observación del espermatozoide íntegro es muy dificultosa, ya hemos mencionado la
posibilidad de la “pérdida de la cola” que es muy común y por lo tanto, distinguir los
fragmentos entre otro tipo de material celular, fibras, bacterias, etc. es muy complicado
y normalmente el estudio finaliza con un informe negativo. Si sumamos a ello la
posibilidad de azoospermia u oligozoospermia del sospechoso podemos concluir en la
dificultad de obtener resultados positivos.
No obstante se debe efectuar el intento, macerando el soporte con la muestra sospechada
en unas gotas de solución fisiológica durante varias horas y luego transfiriendo el
líquido resultante a una portaobjetos de vidrio, cubrir con cubreobjetos y mirar con
medio aumento. Algunos autores ponen a centrifugar el macerado para decantar el
material celular y luego de eliminar el sobrenadante transferir el semen al cubreobjeto.
Esta técnica está cuestionada por la posibilidad de alteración de la morfología celular
por el efecto de centrifugación.
Observación microscópica previa coloración
Los preparados mencionados más arriba pueden colorearse previa fijación de manera
que aprovechando la coloración celular, sea más sencillo detectar los espermatozoides.
El secado se hace a temperatura ambiente cuidando que el preparado no se contamine,
luego se fija para lo cual es suficiente el rápido pasaje sobre la llama del portaobjetos o
de lo contrario sumergirlo en alcohol 70º durante 5 minutos.
Se proponen varios métodos de coloración, con eritrosina, con hematoxilina-eosina, con
azul de anilina-eosina, con anaranjado de acridina.
Mencionaremos con más detalle la técnica de May Grunwald-Giemsa que es la más
común y además con la ventaja que los colorantes ya preparados por su gran difusión se
comercializan ya preparados en el mercado. El colorante de May Grunwald es eosinato
de azul de metileno y el colorante de Giemsa es una mezcla de Azur II y eosina.
La técnica de coloración es simple, inicialmente 3 minutos con el colorante de May
Grunwald en su concentración original, etapa de fijado, luego se diluye al 50% por el
agregado de gotas de agua, etapa de coloreado de contraste durante otros 3 minutos y
finalmente la coloración propiamente dicha con una dilución al 10-15% del colorante de
Giemsa, se deja secar y luego se observa microscópicamente.
Con esta coloración la cabeza del espermatozoide aparece con una coloración azul
intensa en la parte más próxima al segmento intermedio, mientras que la parte anterior,
el acrosoma de un color lila, el cuello y la cola de un gris oscuro, negro. Estas
características tintoriales permiten facilitar la diferenciación de filamentos varios,
esporas y partículas inespecíficas.
3. Métodos cromatográficos
Los ensayos cromatográficos ya sea sobre papel o placa fina, constituyen una buena
técnica para poner en evidencia la presencia de algunas sustancias que se encuentran
presentes en el semen. Dichos ensayos se realizan con líquidos resolutivos adecuados,
simultáneamente con testigo de esperma humano indubitable o de sustancias puras
componentes normales del semen, como tales habitualmente se utilizan las bases
nitrogenadas, colina y espermina y una enzima, la fosfatasa ácida.
Si bien es cierto que ninguna de tales sustancias son específicas y por lo tanto
concluyentes, su ausencia nos permitirá descartar la presencia de semen y la presencia
de ellas simultáneamente se convierten en resultados hartamente sugestivos.
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Así Yano y cols. realizan la determinación de colina y espermita por cromatografía en
placa fina.
Dzhalalov y cols. mediante cromatografía en papel investiga la presencia de fosfatasa
ácida utilizando un sustrato de fosfato de fenolftaleína que por acción de la enzima
liberan la fenolftaleína la que se pone en evidencia mediante un revelador alcalino que
producirá máculas rojas.
Hessel y Medgalin investigan las bases nitrogenadas con ClH 1 N como líquido
resolutivo y posterior revelado secuencial con Reactivo de Draggendorf para la colina y
Sol. de yodoplatinato de potasio para la espermita. El revelado se realizará de manera
secuencial, inicialmente protegiendo el tercio superior de la placa se revela el resto con
Draggendorf, en caso positivo para colina aparecerán manchas rojizas de Rf 0,5, y luego
protegiendo los dos tercios inferiores de la placa, con el yodoplatinato apareciendo
manchas violáceas de Rf 0,85 en caso positivo para espermina.
4. Métodos electroforéticos
a) Villanueva, Castilla y Gilbert Calbuig proponen un método mixto por electroforesis y
cromatografía bidimensional por el cual se pueden poner en evidencia las bases
nitrogenadas ya mencionadas y además alrededor de una decena de aminoácidos
presentes en el semen, entre ellos ornitina que proviene de la arginina, pues la ornitina
no es proteino-genética.
Inicialmente se practica la separación electroforética mediante una solución de piridina,
ácido acético, agua: de pH 3,9, separándose las bases nitrogenadas de los aminoácidos.
A continuación, previo secado del papel, se gira el mismo 90º y se practica mediante
cromatografía ascendente con un líquido resolutivo compuesto con n butanol-ácido
acético-agua, revelando con Ninhidrina en solución acetonita con calentamiento a 80º
luego de la aspersión.
Una vez eliminada la piridina por el calentamiento, se revela con el reactivo de
Draggendorf y el de yodoplatinato de potasio ya mencionados para las bases
nitrogenadas, por la electroforesis se obtiene un desplazamiento 10% mayor para la
espermina que para la colina dependiendo del tiempo de corrimiento. Por ejemplo a 350
volts y 1 hora y 50 minutos se obtiene un desplazamiento de 19,5 cm para la espermina
y 17 cm para la colina.
b) Método electroforético de la Metropolitan Police Forensic Sciencies (Londres).
El método consiste en la identificación de la banda de fosfatasa ácida luego de la corrida
electroforética, en este caso se aplica sobre la placa un papel impregnado con un
reactivo a base de fosfato de umbeliferona en solución de un buffer de pH 3.
La fosfatasa ácida actúa liberando la umbeliferona por ruptura del enlace fosfato. Esta
última es fluorescente azul pálido al UV largo, mientras que el sustrato no lo es.
La fosfatasa ácida prostática se diferencia de otras fosfatasas por su mayor movilidad y
la mayor actividad, revelada por la alta fluorescencia obtenida, muy superior a la de las
demás fosfatasas. La fosfatasa ácida sanguínea no es detectada por lo cual no interfiere.
Esta característica se debe a la poliacrilamida utilizada para el corrimiento
electroforético, (arcrilamida al 8% con 8% de almidón insertado) que inhibe la acción
de la fosfatasa ácida eritrocitaria.
La inserción del almidón en la zona de siembra, reemplazando al gel de poliacrilamida
se debe a que permite que el desplazamiento se efectúe en el seno del soporte y no en su
superficie., como el gel de poliacrilamida se fractura al intentar esa siembra en
profundidad se reemplaza por el almidón.
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5. Métodos enzimáticos
Una enzima es una proteína que tiene la propiedad de magnificar la velocidad de una
reacción, existen numerosas enzimas que contribuyen a acelerar las reacciones químicas
en los organismos vivos, a semejanza de un catalizador químico.
Las enzimas tienen dos características importantes, no se consumen durante su acción y
mientras tengan las condiciones adecuadas de temperatura, pH y sustrato, denominando
así a la sustancia sobre la cual actúan, lo seguirán haciendo. La segunda característica es
la de especificidad sobre el enlace químico o función química sobre la que actúan, de
ello habitualmente deriva su nombre.
En el caso de la fosfatasa que nos ocupa se debe a que actúa específicamente sobre la
unión fosfato provocando su ruptura, la denominación de fosfatasa ácida, aclara que esta
acción se realiza óptimamente a pH ácido. En el caso de la fosfatasa ácida prostática se
la denomina así a la que se origina en la próstata y que tiene en el plasma seminal la
función de desdoblar la fosforil colina en radicales fosfatos y la base orgánica colina.
Esta enzima actúa sobre variadas sustancias que tienen el grupo fosfato como se verá y
a las que se denomina genéricamente sustratos.
Determinación cualitativa de fosfatasa ácida
La acción hidrolítica de la fosfatasa ácida se puede llevar a cabo detectando el ácido
fosfórico liberado o de la sustancia orgánica base del sustrato utilizado, como se ha
visto fosfato de umbeliferona, fosfato de fenolftaleína, fosforil colina, fenilfosfato de
sodio, alfa naftilfosfato, fosfato de nitrofenol, todos ellos por la hidrólisis enzimática
generan productos coloreados, fluorescentes o que pueden producir color con algún
reactivo cromogénico proporcionales a la concentración y que por lo tanto son
cuantificables por espectrofotometría.
Sustrato
Fosfato de umbeliferona
Fosfato de fenolftaleína
Fenil fosfato de sodio
Alfa naftil fosfato
Nitrofenilfosfato
Producto de hidrólisis
Umbeliferona
Fosfato
Fenolftaleína
Fosfato
Fenol
Fosfato
Alfa naftol
Fosfato
Nitrofenol
Fosfato
Reactivo cromogénico
Fluorescencia azul UV
Rojo en medio alcalino
Folin Cicolteau (azul)
Diazotación y copulación
Amarillo en medio alcalino
Habitualmente se efectúan reacciones cromáticas de dichas sustancias.
Así por ej. el fenol puede identificarse cualicuantitativamente mediante el reactivo de
Folin Cicolteau con quien produce coloración azul en medio alcalino.
El p nitrofenol tiene coloración propia y en medio alcalino produce una coloración
amarilla proporcional a la concentración.
Determinación cuantitativa de fosfatasa ácida
Ya se ha mencionado que la fosfatasa ácida no es una enzima específica del esperma, se
encuentra presente en numerosos humores y tejidos de origen animal y vegetal, sin
embargo no se conoce otro material que contenga tan elevada cantidad de esta enzima.
En función de esto es necesario establecer cuantitativamente la presencia de la enzima y
encontrar forma de diferenciarla de las restantes fosfatasas ácidas de otros orígenes.
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Para poder efectuar la cuantificación se requiere definir una unidad que se relacione con
la actividad de la misma. Generalmente se aplica la definición de King Amstrong
modificada por Gutman y Gutman y que dice que una unidad de fosfatasa ácida es la
cantidad de la enzima que actuando sobre el sustrato de fenilfosfatasa disódico a 37ºC y
pH 4,9 libera 1mg fenol en 1 hora. Nótese que si el sustrato es otro habrá que hacer los
cálculos que permitan la equivalencia en cuanto a la actividad enzimática. El suero
humano contiene de 0,5 a 4 U/100ml, mientras que el semen contiene de 400 a 8000
U/100ml.
Cuando se cuantifica la fosfatasa ácida en una mancha se acostumbra a expresarla en
unidades/cm2 de mancha debido a que en general se trabaja con materiales laminares,
debe fijarse un valor umbral experimental que para Kaye es de 30 UI/cm2 de muestra.
Otros autores prefieren expresar el resultado practicando el agotamiento de una porción
de mancha por maceración, pesando la muestra seca antes y luego de la extracción, la
diferencia entre ambas pesadas corresponde al peso de la muestra y se expresa el
resultado en UI/mg de la diferencia, tomando en ese caso el valor de 2UI/mg como
umbral.
Las investigaciones de varios autores determinaron que en ningún caso en diversos
materiales la concentración supera las 20UI/ml, recordando el hecho de que el semen
supera holgadamente las 400UI/ml podemos verificar que el hallazgo de cantidades
altas es altamente sugestivo de su origen.
Este hecho puede ser mucho más definitorio en función de un descubrimiento de
Sivaram y Barni, en 1971 que fue confirmada por otros autores de que la actividad de la
fosfatasa ácida prostática es inhibida por el ácido L(+) tartárico en tanto que las
restantes no lo son.
Es en función de esto que los diversos métodos propuestos para cuantificar la fosfatasa
se basan en la incubación con exceso de sustrato, en condiciones de temperatura, pH y
en un estricto tiempo de incubación. Se mide el producto producido y en función de eso
se calcula la concentración de enzima en UI, referidas al área o al peso de la muestra.
Esta determinación debe hacerse con un blanco de reactivos, la muestra y una muestra
en presencia de ácido tartárico, un ensayo positivo daría color sólo con la muestra. Un
ensayo negativo daría todo incoloro y en el caso de que los tubos de muestra y muestra
+ tartárico dieran semejantes indicaría que estamos en presencia de una fosfatasa ácida
no prostática.
A continuación se propone un esquema básico para cuantificar FAP.
Inicialmente hay que obtener una solución de la muestra obtenida a partir de un
volumen conocido de solvente y un peso o área conocida de mancha para finalmente
hacer los cálculos necesarios.
Reactivo
Buffer
Solución de L(+) tartrato
Agua destilada
Extracto de tela manchada
Sustrato
c. A 37ºC
Inhibidor CO3Na2
Rvo. Cromógeno
Agua destilada
Blanco
1ml
---5ml
---1ml
1 hora
1ml
1ml
5ml
Muestra
1ml
------5ml
1ml
1 hora
1ml
1ml
5ml
Muestra + L(+) tartárico
1ml
5ml
---5ml
1ml
1 hora
1ml
1ml
5ml
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Finalmente se debe interpolar el valor de DO (densidad óptica) obtenida en el
espectrofotómetro de la muestra a la cual se le restó el blanco y ese dato se interpola en
una curva de calibración efectuada graficando las absorbancias obtenidas con
concentraciones conocidas de fenol, haciendo los cálculos correspondientes y
expresando el resultado en UI.
Métodos basados en la identificación de una proteína específica del semen
Hasta el momento los métodos descriptos con excepción de la visualización de un
espermatozoide humano se basa en la presencia de compuestos que no son específicos
del semen, ya hemos visto en qué condiciones la FAP adquiere trascendencia
definitoria. Actualmente se ha propuesto la búsqueda de una proteína específica que
podría utilizarse como marcador.
G. F. Sensabaugh descubrió en el plasma seminal, mediante estudios electroforéticos
que una de las proteínas que se aislaban no se encontraba en otros tipos de humores o
líquidos biológicos. En función de esos estudios logró separar numerosas fracciones
proteicas y polipeptídicas.
Es de sumo interés, por no haberse encontrado en otros humores biológicos y vegetales
la fracción denominada P30 por su PM 30000 a la cual se la denomina PSA o Antígeno
Prostático Específico. Con esta fracción, convenientemente purificada, se procedió a
obtener con animales de experimentación anticuerpos específicos y la detección de la
P30 se efectúa con reacciones antígeno anticuerpos con los distintos métodos
propuestos para inmunoensayos.
El inmunoensayo ofrece un método alternativo rápido y fiable de detección de PSA.
Tiene una sensibilidad de 99.4%, y a las 48h su sensibilidad disminuye a 96%, puesto
que a partir de las 27 horas desaparece progresivamente. Es una prueba confirmatoria.
SALIVA
La saliva es una sustancia involucrada en parte de la digestión, se encuentra en la
cavidad bucal, producido por las glándulas salivales, compuesto por agua, sales
minerales y algunas proteínas que tienen funciones enzimáticas.
La detección y análisis de saliva puede resultar de suma importancia en diferentes tipos
de casos criminales incluyendo, por ejemplo:
 Cuando se utilizo una máscara o pasamontaña como disfraz;
 En casos de ataque sexual cuando han ocurrido besos/lamidas/mordeduras;
 Casos que involucran ítems tales como estampillas/sobres, boquillas de
cigarrillos y botellas de bebidas.
La saliva puede contener un alto nivel de actividad de la enzima a-amilasa. La aamilasa, llamada también ptialina o tialina, es una enzima que tiene la función de
catalizar la reacción de hidrolisis al digerir el glucógeno y el almidón para formas
azucares simples, se produce principalmente en las glándulas salivares y en el páncreas.
Tiene un pH de 7. Cuando una de estas glándulas se inflama aumenta la producción de
amilasa y aparece elevado su nivel en sangre.
La a-amilasa sigue presente aún en las manchas secas y ha probado ser un indicador
claro de saliva. Sin embargo, la misma sustancia puede estar presente, pero en niveles
mucho más bajos, en otros fluidos como semen y material vaginal. También pueden
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detectarse niveles altos de amilasa en las heces. Por supuesto, la saliva contiene ADN y
cualquier trazo de saliva puede ser sometida a perfilación genética.
Para medir la actividad enzimática de la a-amilasa, se utilizará un test colorimétrico que
detecta el almidón. Para ello se contará con una solución de iodo/ioduro de potasio
(I2/IK), ya que el almidón en presencia de esta solución adquiere una coloración
azulada característica. Esto tiene una explicación física: el iodo se coloca en el interior
de la hélice que forma la amilosa (en las regiones hidrofóbicas), formando un complejo
de color azul. Cuando la a-amilasa actúa, degrada la amilosa, se desintegra la hélice y
por tanto en presencia de I2/IK ya no dará una coloración azul.
IDENTIFICACIÓN DE PELOS Y CABELLOS
En todo hecho criminal la pericia en pelos y cabellos reviste suma importancia. Tanto
pleos como cabellos pueden encontrarse en las manos de la víctima o adheridas al arma
homicida, como así también al agresor. La adherencia de los pelos sobre distintas
superficies, se ve facilitada por la rugosidad que presentan los pelos en su superficie
(cutícula). Este tipo de pericias reviste también cierta importancia en aquellas
investigaciones relacionadas con actos de violación o atentados al pudor. Otra propiedad
de este material es su resistencia a la putrefacción siendo este hecho de gran importancia
cuando se realizan pericias muy posteriormente a la fecha del hecho investigado, en
algunos casos a pesar de inadecuadas condiciones de conservación.
Constitución del pelo
Los pelos son filamentos conificados que se desarrollan en la epidermis. Su longitud
varía entre varios milímetros hasta más de un metro y el diámetro de su sección
transversal varía entre 0,08 y 0,8 mm. Se distribuyen con densidad variable por toda la
piel con excepción de las palmas de las manos y plantas de los pies, las caras inferiores
y laterales de los dedos de la mano y del pie, la cara superior de la 3ª falange, los labios,
el glande del pene, el prepucio y la superficie interna de los labios mayores.
Cada pelo se forma por una invaginación tubular d el apiel, el folículo piloso, cuyas
paredes están formadas por epidermis y dermis. En el extremo profundo del folículo
piloso hay una saliente de tejido conectivo que constituye la papila pilosa. La raíz se
continúa con el tallo piloso cuyo extremo sale a la piel. Conectado a cada folículo piloso
hay una o más glándulas sebáceas, estas están situadas en ángulo obtuso y se abren en el
cuello del folículo. En la parte media de la vaina se inserta un haz de fibras musculares
lisas, las cuales por el otro extremo terminan en la capa papilar de la dermis.
La mayoría de los bulbos pilosos
producen al renovar el brote
capilar, pelos en la longitud y
espesor crecientes.
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El pelo de la cabeza solo alcanza su pleno desarrollo en el momento de la pubertad, este
pelo puede ser rígido, alisado, ondulado, erizado o crespo.
El crecimiento del pelo se efectua a un promedio diario de 0,3 a 0,4mm, lo que da un
crecimiento promedio de 1 cm. al mes, se encuentra condicionado por glándulas
endócrinas tales como hipófisis, suprarrenales, gonadas y tiroides. La formacion de
rizos en el pelo, se debe a la rotación del folículo sobre su eje.
En el orden cronológico, el primer pelo en aparecer en el ser humano es el lanugo, este
posee una longitud de 10 a 15 mm. Y un grosor de 0,014 a 0,027 mm. Presenta una
diferenciación cromática en su tallo, la punta es blanca y el resto presenta variedades en
lo que hace a su pigmentación, puede ser amarillento, pardo o rojizo. El lanugo se
pierde en el séptimo u octavo mes de vida intrauterina y puede encontrárselo flotando en
el líquido amniótico.
En el recién nacido, el pelo de la cabeza carece de médula y su longitud habitualmente
es de 20 a 25 mm. este pelo se pierde dentro de los seis meses iniciales, siendo
reemplazado por el pelo infantil. El pelo del recién nacido tiene su origen en el 4to. mes
de embarazo y perfora el cuero cabelludo en el 6to. mes.
El pelo infantil, si no es cortado, conserva su punta original, llegando a una longitud de
144 mm. con un diámetro de 0,08 mm. va adquiriendo gradualmente un aspecto mas
recio al 3er. o 4to. mes de vida, alcanzando su máximo desarrollo y características
particulares, en la pubertad, pudiendo llegar a un diametro de 0,14 mm.
En el nacimiento puede existir aún lanugo, especialmente en el tronco, región de los
hombros y en partes posteriores de los brazos.
En la pubertad, aparece el denominado pelo puberal, formado por el vello pubiano,
axilar y mentoniano, que por lo general, son crespos. El vello del pubis, puede alcanzar
diámetros considerables, de hasta 0,30 mm.,los pelos mentonianos se caracterizan por
su secredad, siendo el diámetro del orden de 0,20 mm. El vello axilar, es mas delgado
que los anteriores, de longitud variable pudiendo llegar a varios centímetros. En las
fosas nasales y conductos auditivos pueden encontrarse pelos no muy largos pero tan
recios como los de la barba.
Las pestañas, tardan alredededor de 5 años en llegar a la longitud del adulto, las cejas
demoran mucho mas.
Tecnología para el estudio de pelos
a)
Limpieza y eliminación de partículas extrañas
Se emplea solución jabonosa, eter, o solución de carbonato al 10%, luego se
deshidratan unos minutos en alcohol absoluto, finalmente se los pasa por xilol y
se observan en un medio acuoso glicerinado, puede emplearse también el
Bálsamo de Canadá.
Si el pelo fuese muy oscuro es recomendable decolorarlo para una mejor
observación, para ello se emplean soluciones de agua oxigenada, ácido acético,
solución de hipoclorito de sodio, solución alcohólica de cloro, ácido nítrico, se
obtiene buen resulatado con agua oxigenda de 100 volumenes y solución OHNa
combinadas, la decoloración se obtiene en 15 minutos, no modificándose ni la
estructura ni el diámetro.
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b)
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Tinción
El examen microscópico se puede efectuar directamente o previa tinción, las
células cuticulares se pueden teñir con el Gram o sumergirlas en ácido ósmico (5
minutos), lavar y luego se colorea la cepa medular (10 minutos) con soluciones de
eosina y eritrosina.
Otra técnica recomendada es desengrasar el cabello con sol CO3K2 10% u OHNa
1%, luego alcohol y eter y finalmente agua, luego sumergirlo en una solución de
violeta de genciana o violeta de metilo durante unos minutos, se montan con
Bálsamo del Canadá. Mediante esta tinción se colorean las escamas cuticulares,
quedando el resto incoloro.
c)
Diámetro del pelo
La observacion del diámetro del pelo se efectúa realizando cortes transversales
con un micrótomo, previa inclusión del pelo en parafina celoidina. Las
mediciones se efectúan con la combinación de micrómetros objetivos y oculares.
d)
Observación de la forma de la cutícula
Se efectúa un molde sobre un lecho plástico de portaobjetos. Las sustancias que
se utilizan pueden ser: Cefeloidina (30 g.) en acetona (170g.), Acetato de
celulosa, Solución clorofórmica al 10% de plexiglás. La técnica consiste en
generar un lecho de cualquiera de estas soluciones, no endurecida aun, se coloca
suavemente el cabello y se lo deja durante unas horas, luego se lo retira y se lo
observa microscópicamente. Una práctica solución es la utilización de esmalte
de uñas incoloro.
Estructura del pelo
Bajo el punto de vista legal no es de interés un profundo estudio histológico
del pelo, si es de interés algunos caracteres generales que sirven para su estudio,
en un pelo podemos distinguir: la punta, el cuerpo o tallo y el bulbo.
El cuerpo o tallo presenta un aspecto fusiforme, tiene un estrechamiento en la
raíz, luego se ensancha progresivamente y vuelve finalmente a adelgazarse en la
punta.
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En el tallo se distinguen:
a) La cutícula, que está formada por células imbricadas o empizarradas a la
manera de tejas, con las puntas de estas escamas dirigidas hacia la
extremidad libre del pelo. El tipo y aspecto de las escamas del pelo es de
capital importancia en la discriminación de especies e identificación de pelo
humano.
Tipos de cutícula: simple, Conífera, Serrado, Alargado, Dentado, Ovalado,
Achatado y Acuminado.
Visto de perfil un pelo tiene el aspecto superficial escamoso, con las escamas
dirigidas hacia la punta. Se describe como punta al tramo que comprende
entre su extremidad y su diámetro mayor o máximo. La punta puede perder
su agudeza por corte, por fricción o por desilachado en forma de pincel.
b) La Sustancia cortical. Constituida por células unidas por finas fibrillas
de una proteína pseudo cristalina que lleva inclusiones de material
pigmentario. El mayor interés de esta zona lo presenta el pigmento y
disposición, cuya naturaleza bastan para diferenciar gran número de pelos,
en función de su cantidad o su pérdida.
c) La médula, que no siempre existe (falta en el lanugo y pelos fetales, y
aun frecuentemente en pelos femeninos), constituye el cilindro eje del pelo y
sus células están separadas por una red aérea de aspecto variable según las
especies animales, continua, fragmentada, ausente, etc. Ofrece una serie de
datos de interés, por ejemplo interesan la medidas del diámetro total y el
diámetro medular.
Fotomicrografías de aspecto de pigmentación en pelos, el de la izuiqerda es
pelo animal.
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Un diámetro superior a los 160 a 170 micrones permite afirmar su no
procedencia humana.
Pueden encontrarse valores ligeramente inferiores a eso en pelos de barba o
de pubis. El cabello masculino tiene valores entre 80 y 130 micrones, el
femenino es menor, del orden de 90 micrones.
Algunos autores han basado esta situación para diferenciar pelos masculinos
y femeninos, aunque realmente la amplia diversidad de diámetros entre pelos
de uno y otro sexo no permite esta conclusión con certeza.
En cuanto a establecer la edad, solo puedo diferenciarse si se trata de un pelo
fetal, de niño o adulto.
Un dato significativo es establecer el índice medular, el cual se obtiene por el
cociente entre el diámetro de la médula y el diámetro total del pelo. En la
especie humana los índices oscilan entre 0.25 y 0.35 para pelos de pubis,
barba, bigote y pestañas, para el resto es un poco menor 0.25 para hombre y
0.20 para mujer, cuando se encuentra.
Las médulas se clasifican en: continuas, intermitentes y fragmentadas, la mayoría de las
médulas de animales son continuas o intermitentes, la lana de la oveja recuerda más el
cabello humano que el pelo de la mayoría de los animales.
La disposición de las médulas intermitentes, es a menudo muy llamativa y
característica. El cabello humano posee normalmente una médula de tipo fragmentario,
aunque en muchos casos puede estar ausente, y en otros casos, la médula es
prácticamente contínua, pero raramente se encuentra una médula de tipo intermitente.
Los pelos humanos a-medulares son más comunes que los de médula continua. Existe
alguna evidencia de que solamente los pelos que sobrepasan cierto diámetro contienen
médula, y cuando mayor es su diámetro más tiende la médula a ser contínua.
Identificación de la naturaleza del material hallado
En muchas ocasiones distintos tipos de fibras pueden confundirse con pelos. Una prueba
de orientación consiste en quemar una pequeña porción. Las fibras vegetales arden
rápidamente, y dando aroma a pan quemado, en el caso de fibras de origen animal,
queman mas dificultosamente y produciendo el típico olor a cuerno quemado. En el
caso de fibras de origen sintético se aprecia en ocasiones un proceso de fusión sin arder
y con la emisión de gases de olor picante.
Puede intentarse, cuando la cantidad de material disponible es adecuada, algunos
ensayos con reactivos líquidos, así las fibras vegetales son relativamente disueltas en
ácido sulfúrico al 50 %, dicha solución mediante el agregado de unas gotas de solución
alcohólica de naftol arrojando un color violeta oscuro. En el caso de fibrasde origen
animal su disolución es más fácil con hidróxido de sodio al 10 %.
Cuando la cantidad de muestra es escasa conviene efectuar observaciones microscópicas
luego de exponer el material, entre porta y cubre, a la acción de un reactivo complejo,
inicialmente unos segundos con un reactivo A, solución acuosa de yodo y IK, y luego
con un reactivo B, a base de glicerina, agua y ácido sulfúrico.
La técnica es la siguiente: se separan las fibras sobre un portaobjeto, se le adiciona
durante unos segundos una gota del reactivo A, se absorbe el exceso con papel de filtro,
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y luego una gota de reactivo B. La celulosa se tiñe de azul y los elementos lignificados
de amarillo.
Otra reacción propuesta es con un reactivo A, a base de Cloruro de Zinc en agua y un
reactivo B, a base de Lugol como el ya mencionado, con este tratamiento la celulosa se
colorea en rosa o rosa violáceo y los elementos lignificados en amarillo.
Coloración de fibras de hilados y tejidos (Norma Iram 7510)
Fibras
Animales: lana y seda
Vegetales: algodón, lino, cáñamo y
otras fibras pecto celulosas
Vegetales: yute cáñamo de Manila
y otras fibras celulósicas
Artificiales: proteicas
Artificiales: rayón viscoso y
cuproamoniacal
Artificiales: rayón al acetato de
celulosa
Solución de C12Zn
Yodo/yodurano
Amarillo oscuro
Rojo violáceo
(distintas tonalidades)
Amarillo (distintas
tonalidades)
Amarillo oscuro
Azul más o menos
intenso
Amarillo
Solución
de Millon
Rosado
Solución de
Floroglucina
Rosado
rosado
Objetos de pericia relacionados con el estudio de pelos
1) Diagnóstico específico
2) Sexo y lugar del cuerpo de dónde proceden
3) Edad del sujeto de quién proceden
4) Pelos arrancados, rotos, cortados, caídos
5) Procedente de un sujeto vivo o muerto
6) Determinar si son pelos teñidos
7) Determinar si el pelo está decolorado
8) Determinación de raza
9) Individualidad de los pelos
10) Traumatólogía del pelo
11) Grupo sanguíneo Sistema ABO en pelo
12) Enfermedades del pelo
13) Análisis del cabello por reacción neutrónica
14) Investigación de drogas de abuso en pelos
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1) Diagnóstico específico
Debe determinarse si el pelo es humano o no. Del estudio en detalle de las
características diferenciales de las partes constitutivas del pelo humano y de los
animales.
Canal medular
Pelos humanos
Red aérea granulosa
Células medulares indivisibles sin
disociación
Índice medular ≤ 0.30
Pelos del vello. Sin médula
Pelos animales
Contenido aéreo más o menos voluminoso
Células medulares aparentes
Índice medular ≥ 0.50
Médula en escalones o moniliforme en los
de vello
Sustancia cortical
Pelos humanos
Forma un grueso manguito
Pigmento en granulaciones homogéneas
muy pequeñas
Pelos animales
Constituye un cilindro hueco bastante delgado
Pigmento en granulaciones irregulares
gruesas, mayores que en el humano
Cutícula
Pelos humanos
Escamas delgadas poco salientes y muy
imbricadas
Pelos animales
Escamas gruesas, salientes y menos imbricadas
que en los humanos
Se acepta que un diámetro total de pelo, superior a 160 micrones, es indicio
significativo de pelo animal. Por las características histológicas y por estudios
comparativos con pelos de colección podrá establecerse la especie animal a la que
pertenece.
2) Sexo y lugar del cuerpo de dónde proceden
Este tema puede resolverse favorablemente cuando se dispone de abundante cantidad de
muestra, de lo contrario prácticamnete sería imposible. El estudio microscópico se basa
en tres elementos: longitud, diámetro y forma de la punta.
El vello se caracteriza por su escasa longitud menor a 1 cm, por su delgadez de 25 a 40
micrones y por la falta de pigmento y canal medular. No presenta ninguna diferencia
regional.
Se ha sugerido la diferenciación de sexo, en función del tenor de azufre del pelo,
mediante reacciones químicas, aprovechando un supuesto mayor tenor en varones , sin
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embargo la superposición de valores del tenor de azufre hallada en ambos sexos genera
un serio cuestionamiento a esta propuesta.
El cuadro a continuación constituye una ligera aproximación como para tener en cuenta,
pero no debe tomarse como concluyente.
Pelos cortados
Diámetro medio < a 80 micrones
Ausencia frecuente de médula
Diámetro medio > a 100 micrones
Cabellos
Pelos de barba
Pelos no cortados
Long. > 8 cm
Long. entre 3 y
8 cm
Long. entre 3 y
8 cm
Long. entre 3 y
8 cm
Long. entre 3 y
8 cm
Long. entre 3 y
8 cm
Pelos
crespos
Pelos
crespos
Pelos lisos
Raíz nudosa
Cabellos
femeninos
Pubis masculino
Raiz delgada
Pubis femenino
Grosor > 100µ
Bigote
Pelos lisos
Grosor < 100µ
Cutícula intacta
Escroto
Pelos lisos
Grosor < 100µ
Cutícula irregular
Labios mayores
Long. ≤ a 3 cm
Extremidad
gastada o en
pincel
Extremidad
gastada o en
pincel
Extremidad
afilada o
aguda
Extremidad
afilada o
aguda
Extremidad
afilada o
aguda
Ausencia de
conducto
medular y
pigmento
Diámetro > 60µ
Pelos del tronco
Diámetro < 60µ
Pelos
extremidades
Long. ≤ a 3 cm
Long. ≤ a 3 cm
Long. ≤ a 3 cm
Long. ≤ a 3 cm
Long.≤ a 1 cm
Forma arqueada
Diámetro > 80µ
Pestaña
femenina
Forma arqueada
Diámetro > 80µ
Pestaña
masculina
Forma sinuosa
Cejas. Pelos
nasales
Diámetro de 5 a
40 µ
Pelos de vello
Una técnica más segura para establecer el sexo del cual proviene el pelo se basa en la tinción
diferencial de los cromosomas sexuales y su observación microscópica, para lo cual es necesario
disponer de células nucleadas las cuales en el pelo son las provenientes de la raíz del mismo.
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Las células queratinizadas provenientes del tallo no poseen núcleo y solamente podría trabajarse
con el ADN mitocondrial.
En la mujer normal los cromosomas sexuales aparecen como un par homólogo de cromosomas
X, uno aparece condensado y puede ser teñido con orceína en medio acético apareciendo como
manchas castaño oscuro sobre el color rosado pálido del citoplasma, conociéndoselo como
corpúsculo de Barr, el número de estos corpúsculos es menor al número de cromosomas X.
La interpretación del resultado es que, si al menos, el 30 % de las células observadas presentan
corpúsculos de Barr, se considera un pelo de origen femenino, por el contrario si es menor, se
supone masculino, debiéndose confirmar mediante la detección del cromosoma Y. en todos los
casos esta interpretación no es sencilla y se aconseja que la realice personal experimentado en el
tema.
El hombre normal tiene un cromosoma X y otro Y, estos últimos tienen gran afinidad para
fluorescer con clorhidrato de quinacrina, cosa que no ocurre en los cromosomas X, lo que
permite la diferenciación, pudiendo observarse los cromosomas Y como manchas fluorescentes
brillantes amarillo verdosas en la interfase del núcleo sobre un fondo verde pálido.
3) Edad del sujeto de quién proceden
En general las especulaciones sobre este tema se hacen en función del diámetro del
pelo, en pelos fetales son menores a 50 micrones, sin médula y carentes de pigmentos.
En los recién nacidos ya puede comenzarse a apreciar canal medular, el desarrollo del
mismo es más precoz en pestañas que en los restantes pelos. Se sugiere un diámetro
mínimo creciente según la edad cronológica la cuál también debe tomarse como
referencia.
12 días
24 micrones
6 meses
37 micrones
18 meses
38 micrones
15 años
55 micrones
adultos
70 micrones
En sujetos ancianos los pelos tienden a disminuir en cantidad y grosor, el diámetro
medio desciende a 55-60 micrones. Otro detalle es la aparición de pigmentógrafos,
células destinadas a la reabsorción del pigmento que aparece en la zona cortical , lo cual
nos demuestra que los pelos proceden de un sujeto que comienza a encanecer lo cual,
como se sabe, es sumamente variable.
4) Pelos arrancados, rotos, cortados, caídos
Los pelos que no han sido cortados terminan en su punta gradual y regularmente que
presenta una formación redondeada por los rozamientos y frotes repetidos, por ej. el
peinado. En algunos casos en cabellos descuidados pueden presentar una extremidad
libre hendida, en forma de escobilla.
Los pelos recientemente cortados siempre terminan en una superficie plana,
perpendicular u oblicua al eje del pelo, de ángulos limpios y vértices agudos. En poco
tiempo, 48 hs, dichos ángulos comienzan a redondearse y esa apariencia roma se
incrementa con el tiempo.
El cabello crece 0.3 a 0.5 mm por día, por lo tanto, puede calcularse por ejemplo el
tiempo transcurrido desde su última afeitada. Erróneamente se ha hablado de un
crecimiento post morten, lo que realmente ocurre es una mayor apariencia de los pelos
debido a la rigidez cadavérica de los músculos erectores y la deshidratación del cadáver.
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El diagnóstico diferencial entre el pelo caído espontáneo y el arrancado violentamente
se hace por el estudio de la extremidad proximal del pleo o raíz. El pelo se halla
implantado en una papilla dérmica que lo nutre, cuando el pelo termina su evolución, la
papilla se deseca y muere,cayendo junto con el folículo piloso ya seco. En el caso del
pelo arrancado es frecuente que por la violencia del acto la papila puede no
desprenderse y aparece el bulbo vacío, sin embargo puede acompañar y el pelo
arrancado puede llevar parte de la vaina.
5) Procedente de un sujeto vivo o muerto
Si han sido recientemente desprendidos del cuerpo o si por el contrario se trata de pelos
procedentes de una peluca. La presencia de bulbos no desecados indica que los pelos
estaban adheridos a la piel pocas horas antes.
Los pelos postizos son siempre más sucios que los cabellos, incluso de los de las
personas poco aseadas, en general fácilmente cubiertos de polvo y otras impurezas, son
quebradizos, frágiles, presentan resquebrajaduras y tienden a decolorarse por la luz.
6) Determinar si son pelos teñidos
Los pelos teñidos tienen un color más uniforme que los de color natural, esta afirmación
no es absoluta y solo puede apreciarse con seguridad si se pueden hacer estudios
comparativos, un segundo detalle quizá más significativo es que a raíz del crecimiento
ya mencionado estos cabellos pueden no estar teñidos en la parte próxima a la raíz.
El número de tintes empleado es ilimitado. Entre las sustancias más empleadas tenemos:
decolorantes, tintas vegetales, tintas de base metálica y tintas orgánicas sintéticas. El
H2O2 es el decolorante más empleado. Entre las tintas orgánicas, a la fenilendiamina se
le atribuye propiedades tóxicas causantes de graves dermatitis.
La luz U.V. es un auxiliar de valor para la identificación de cabellos decolorados y
teñidos, es de interés examinar la diferente fluorescencia entre el tallo del pelo y la
región próxima a la raíz. Generalmente el pelo teñido aparece opaco y los cambios
cromáticos apreciables pueden ayudar para el aspecto pericial.
7) Determinar si el pelo está decolorado
Se somete al pelo a la prueba de infiltración o impregnación con ciertos colorantes, el
más utilizado es un reactivo constituido por una solución de NH3 en alcohol etílico y
una solución de azul de metileno al 1 %.
Se lava el pelo con alcohol, eter y agua, para eliminar grasas y suciedades, sumergir el
pleo en la solución alcalina durante 10 minutos, luego pasarlo por alcohol y previo
secado sumergirlo en la solución de azul de metileno hasta la evaporación de este, se
lava y se observa en el microscopio.
Los pelos sometidos en alguna ocasión al teñido han perdido impermeabilidad y, por lo
tanto, la zona tratada absorberá el azul de metileno.
8) Determinación de raza
Mediante el estudio de la sección trnasversal del pelo, montándolo adecuadamente sobre
parafina o plexiglás y obtenidas por cortes con micrótomo se puede verificar la
goemetría transversal del pleo y en función de eso puede estimarse la raza, así la raza
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caucásica es más o menos circular, la raza amarilla (mongoloide) es triangular y la raza
negra es ovoidea con canal medular excéntrico.
9) Individualidad de los pelos
Establecer si un determinado pelo pertenece a un individuo es un problema de difícil
resolución, con más frecuencia puede lograrse el diagnóstico de no identidad, lo cual en
muchos casos puede ser suficiente.
Para efectuar este estudio deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos:
 Estudiar las sustancias adheridas

Medir el diámetro del pelo

Hallar el índice medular

Estudiar la cutícula

Establecer la comparación colorimétrica

Observar alteraciones patológicas
La comparación colorimétrica se realiza previa decoloración del mechón de cabello con
OHK al 5 % sin pasar los 60° C
10)Traumatología del pelo
Los traumatismos y los agentes físicos y químicos producen alteraciones de valor
forense. La tracción produce la ruptura total o parcial del pelo. Los golpes con
elementos contundentes dejan secuelas, cuya magnitud depende de las condiciones en la
cual fue realizado y especialmente si fue contundido sobre un objeto duro.
El corte con instrumentos filosos o cortantes efectúa un corte en bisel típico, el cual se
va redondeando con el tiempo y tal redondez ofrece datos de interés cronológico.
El calor produce alteraciones micro anatómicas del pelo, marcando estas si el cabello
fue sometido a la llama o al calor radiante. Los pelos comienzan a sufrir alteraciones en
su microestructura hasta los 140° C, a esta temperatura las burbujas aéreas, en la
sustancia medular aumentan de tamaño y estallan, venciendo la resistencia de la
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cutícula, para otros autores este fenómeno se produce a mayor temperatura 200° C. A
los 260° C comienza la carbonización, la que finaliza a 300-400° C.
Los reconocimientos histológicos se pueden efectuar en cabellos calentados hasta 200250° C, pasado lo cual las alteraciones de la carbonización impiden la determinación de
la estructura del tallo piloso. Los agentes químicos (ácidos y álcalis) son bien resistidos
por la estructura del pelo si dicha acción no se prolonga demasiado
11) Grupo sanguíneo Sistema ABO en pelo
En 1966, Yada, determinó el sistema ABO en una muestra de pelo utilizando la técnica
de absorción-elución. Una año más tarde Wynbrandt y Chisum, repiten el intento
presentando su trabajo a la Asociación Criminalística de California, aunque con
resultados no muy satisfactorios. En 1971 los mismos autores mejoran los resultados
trabajando ahora con la técnica de absorción-inhibición. A partir de 1974 Yada
nuevamente presenta con modificaciones su metodología con mejores resultados. En
España, Ruiz de la Cuesta (1980), Romero Polanco (1981) y Rojo y Ruiz de la Cuesta
en 1983 proponen la siguiente técnica:
1) Limpieza del pelo: se lava el pelo agitando durante una hora con detergente
enzimático (Ter A Zyme) a pH 9.5
2) Desengrasado: con eter de petróleo a 60° C durante 30 minutos
3) Fijado: con etanol a 60° C durante 30 minutos
4) Aplastado: con laminador de metales consiguieron una anchura superior a 3
veces su diámetro inicial como indica Yada. Hasta ahora se había realizado con
mortero de ágata. Con el nuevo método se ahorra tiempo y se evita el deterioro
de la muestra. Los pelos así preparados se adhieren a la placa de policarbonato
mediante la disolución del mismo con acetato de celulosa y la inserción de los
pelos mientras el material está fundido.
5) Incubación: con antisueros A y B, título 1/256 a 4° C, durante 12 a 18 hs.
6) Lavado: con 6 cm3 de solución fisiológica a 4 ° C y agitación mediante 5 cm3 de
aire
7) Elución: a 56° C durante 12 minutos
8) Lectura: con suspensión de hematíes lavados al 1/500 en suero albuminado
1/200 tras 15 minutos a 4° C y centrifugación
Con esta técnica se obtuvo un error en el resultado del orden del 8 %
12) Enfermedades del pelo
Tricorrexis nudosa (trichorrehexis nodosa)
Esta enfermedad se traduce en al aparición de hinchazones nodulares a lo largo del tallo,
de lo que resulta que éste tiene tendencia a romperse, en especial, en el lugar de la
hinchazón. En este caso se encuentran varios nódulos blancos grisáceos, en particular,
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sobre el tercio final del pelo. Este se vuelve muy seco y frágil y se rompe al nivel del
nódulo. Si la rotura no atraviesa completamente el nódulo, es como si 2 pinceles
estuvieran en contacto.
Algunos autores han atribuido esta enfermedad a un defecto bioquímico del
metabolismo del ácido arginiosuccinico y adoptado la idea de que un trauma puede
contribuir a la formación de una Tricorrexis nudosa.
Tricoptilosis
Un cabello afectado por esta enfermedad presenta una hinchazón longitudinal debido a
una sequedad anormal que lo hace ramificar en su extremidad distal, o bastante
avanzado el tallo. Puede haber ramificaciones múltiples en la extremidad del cabello o
puede haber una ramificación simple o bifurcación en varios lugares a lo largo del tallo.
Triconudosis
Los cabellos afectados por esta enfermedad se enriedan y hacen nudos. Este género de
enfermedad se debe a fuerzas físicas y mecánicas, producidas por la reacción del peine,
del cepillo o de los dedos que algunas personas tienen la costumbre de pasarse por el
cabello. Para McCarthy, las quemaduras y los lavados efectuados con jabones
demasiado detergentes, contribuyen también a provocar esta enfermedad.
Cabellos de Baynet
Esta enfermedad se caracteriza por un ensanchamiento del pelo en forma de huso de 2 a
3 mm de largo, muy cerca de la extremidad. La parte afectada es más oscura que el resto
de la cabellera.
Monilethrix
Los pelos enfermos presentan nudos elípticos separados por espacios breves y
apretados. Se ve afectado el pelo entero desde la raíz hasta la punta. Los nudos en
general son el doble de largo que los espacios internodales. Los nudos están
constituídos de una envoltura de cutícula espesa y un núcleo cortical delgado. El
Monilethrix es siempre hereditario.
Anomalías en casos de alopecia
En este caso se produce caída parcial, o generalizada de pelos. Cabe distinguir 3 formas
de cabellos atrofiados o muertos:

Cabellos caducos
La raíz de un cabello que padece esta afección está intacta cuando es arrancado y el
cabello tiene siempre una longitud normal. La raíz y la parte del tallo situada
inmediatamente a continuación están netamente atrofiadas.

Cabellos con signos de admiración
En un punto del cabello afectado por este tipo de atrofia, se forma un nudo o
ensanchamiento debido a la disociación de las células corticales en este lugar. De ahí se
sigue una pérdida de la cohesión celular y el cabello se raja longitudinal y
transversalmente, termina por romperse en los lugares que ha perdido fuerza. Así el
cabello afectado por este tipo de anomalías tiene características que indican una
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perturbación de la función pigmentaria, una tendencia a hincharse, a disociarse y por
último a quebrarse en uno o varios puntos.

Cabellos cadáveres
En este caso, las raíces y los bulbos de los cabellos se hacen delgados como hilos y
suelen curvarse en su extremidad inferior. Algunos pueden padecer Tricorrexis en su
parte superior.
Anomalías que toman la forma de una distrofia generalizada que afceta a todas las
pigmentaciones del cuerpo:
Cabellos en torsión
La torsión tiene lugar en el sentido del eje longitudinal del cabello y se observa a
intervalos regulares, lo que produce una alternancia de partes ahusadas oscuras y de
partes ahusadas claras, que presenta alguna analogía con lo que se ve en el Monilethrix.
Cabellos anillados
El cabello que padece esta afección presenta zonas claras y oscuras. Parece entonces
formado de bandas estrechas alternadas, casi anillos, unas pigmentadas y otras blancas.
La anchura de estas bandas varía según los casos. Las partes anilladas deben su origen a
una modificación del envoltorio cortical y no a una modificación o a una hinchazón de
la médula.
La piedra
Osorio fue el primero en descubrir esta enfermedad, que bautizó así a causa de las
concresiones parasitarias que tiene el aspecto de una piedra. Esta enfermedad consiste
en la formación en el pelo de nódulos minúsculos, negros o castaño claros, con la
dureza de una piedra. Pueden encontrarse todo a lo largo del cabello y se sitúan a
menudo a un centímetro del folículo. La raíz no se ve nunca afectada.
Triconudosis
Esta enfermedad se encuentra a menudo en los individuos que sudan mucho
padeciéndola más a menudo los rubios que los morenos. Al examinar los pelos, en
particular de las axilas, se ve que son más gruesos que los normales. Se citan casos en
los que los pelos de las axilas se han vuelto negros. Afeitados estos pelos, pueden verse
las concresiones de parásitos en torno a la tonalidad o a una parte del tallo, incluso hasta
la abertura del folículo. En los otros pelos solo el último tercio está cubierto de varios
nódulos bien separados uno del otro. Las concreciones se adhieren fuertemente al pelo,
en particular cuando están secas. Llegan a dar al pelo 2 o 3 veces su grosor normal. El
tercio central del pelo es la parte más afectada.
Tricofitosis
Es una enfermedad polimorfa, causada por una serie de parásitos criptogámicos de la
misma familia, llamados los tricoptitos. Estos parásitos, se componen de elementos
cortos, de forma casi cúbica y unidos en micelios. Según el aspecto de los parásitos en
los pelos y alrededor, se distinguen los siguientes grupos importantes:
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
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Tricofito endotrix
Constituye un grupo que comprende los parásitos que se encuentran únicamnete en las
sustancias de los pelos a saber:
Tricofito acuminado: en los casos de infecciones muy avanzadas los pelos parecen
estar llenos por completo de una masa de esporas unidas en cadenas y paralelas al eje
longitudinal. En ciertos lugares hay tal cantidad de esporas acumuladas en el pelo que la
cutícula se levanta y el pelo está literalmente a punto de estallar.
Tricofito neo-endotrix: se encuentra en este grupo de parásitos algunos micelios en la
superficie del pelo pero el grupo más importante se halla en el interior del propio pelo.
Tricofito ectotrix: este grupo comprende los parásitos que proliferan en la superficie del
pelo, así como los que alcanzan su sustancia. El grupo se sub divide en microsporones y
megalosporones.

Achorion (favo)
Es el último grupo de parásitos de la familia de los criptogámicos que invaden los pelos.
El pelo está afectado por favus, presenta las características siguientes: burbujas de aire
de dimensiones variables en la superficie del pelo que contiene los micelios; surcos
longitudinales en la sustancia del pelo, en particular en la parte aérea y escasez de los
elementos miceliales y de las esporas. Unos y otras sond e dimensiones muy variables
en un mismo pelo. Los pelos afectados son un poco más frágiles que los pelos normales.
Los pelos enfermos de favo contienen sino relativamente pocos micelios. En la parte
aérea del pelo se encuentran a veces surcos huecos y ligeramente ondulados. Estos
surcos se llenan de micelios y de esporas muertas.
Pediculosis capitis
Se trata de una enfermedad contagiosa de los cabellos, que consiste en una infección
debida al incesto denominado Pediculosis capitis. Este pone gran cantidad de huevos de
forma ovalada que se adhiere fuertemente a los cabellos por medio de secresiones
quitinosas.
El estrechamiento repentino
Según Niyogí esta anomalía puede deberse a alguna enfermedad desconocida. En este
caso el diámetro del pelo disminuye bruscamente.
Otras anomalías
Existen otras anomalías del tallo: la médula doble, índices medulares anormalmente
elevados, raíces deformadas y escamas salientes en el margen cuticular.
13) Análisis del cabello por reactivación neutrónica
Este tipo de análisis se basa en el principio por el cual, en los materiales que son
irradiados en un reactor nuclear u otra fuente de neutrones, algunos de los átomos de la
sustancia son convertidos en isotopos radioactivos:
La reacción proveniente por estos elementos deriva de su energía, y su decaimiento
típico es específico y característico permitiendo identificarlos y cuantificarlos.
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Las principales ventajas de dichos análisis son: su especificidad; su sensibilidad y su
capacidad no destructiva para con el espécimen.
La posibilidad de establecer con cierto grado de certeza la identidad o no de 2 muestras,
se basa en consideraciones puramente estadísticas que según A. Travesi depende de los
siguientes factores:
1. Nº de elementos en razón de trazas, que sea posible analizar
2. Precisión de análisis para cada uno de dichos elementos
3. La magnitud de la variación de la concentración de dichos elementos entre
individuos diferentes
4. La reproducibilidad de la concentración de estos elementos en diferentes
muestras de la misma naturaleza tomadas de un mismo individuo
14) Investigación de drogas de abuso en pelos
En la actualidad se ha propuesto una metodología por la cual puede investigarse en el
cabello la presencia de numerosas drogas de abuso, la ventaja fundamental de la
metodología es que, sumada a su especifidad y no invasividad, el hecho del crecimiento
prácticamente constante del pelo permite establecer con alta aproximación la fecha de
utilización de dichas drogas, sumado al hecho de que abarca un período prolongado de
evaluación solamente limitado por el eventual corte del cabello.
ADN
El camino a la doble hélice
La genética clásica se dedicaba al mecanismo de la herencia: como las unidades
hereditarias se transmiten de una generación a la siguiente y como los cambios de
material hereditario se expresan a los organismos individuales. En la década de 1930 se
plantearon interrogantes nuevos y los genetistas empezaron a explorar la índole del gen:
su estructura, su composición, sus propiedades y su papel en la química interna de los
organismos vivos.
En la década de 1940 muchos investigadores creían que los genes eran proteínas, pero
otros estaban convencidos de que el material hereditario era el ácido
desoxirribonucleico (ADN). Lo importante, aunque no halló amplia aceptación fue que
Avery, en sus experimentos sobre el factor transformador de los neumococos, había
presentado evidencias del papel genético del ADN. La confirmación de la hipótesis de
Avery vino con los estudios sobre bacteriófagos (virus bacterianos) que demostraron
que el material genético del virases ADN y no proteína.
Otro respaldo adicional del papel genético del ADN provino de otros dos conjuntos de
datos 1) Casi todas las células somáticas de una especie dada contienen cantidades
iguales de ADN y 2) Las proporciones de bases nitrogenadas son las mismas en el ADN
de todas las células de una especie dada, pero varían en las distintas especies.
En 1953 Watson y Crick propusieron una estructura para el ADN. Según un modelo, la
molécula de ADN es una hélice de dos cadenas que tiene la forma de una escalera
retorcida. Los dos lados de la escalera consisten en grupos repetidos de un fosfato y un
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azúcar de cinco carbonos (d-oxiribosa). Los “escalones” son bases nitrogenadas
apareadas con enlaces de puente de hidrógeno, una base púrica (dos anillos) apareada
con una base pirimídica (un anillo). Existen cuatro bases: adenina (A), guanina (G),
ambas bases púricas, y timina (T) y citosina (C), bases pirimídicas. (A) sólo puede
aparearse con (T) y (C) solo lo puede hacer con (G). Las cuatro bases con las cuatro
“letras” que se emplean para deletrear el mensaje genético. Las bases apareadas se
hallan unidas como ya se ha dicho por enlaces de hidrógeno, lo que permite la
reversibilidad del proceso de apareamiento y desapareamiento según las circunstancias.
De acuerdo con esta estructura propuesta por Watson y Crack, el papel del ADN como
portador y transmisor de la información genética halló amplia aceptación.
Cuando la molécula de ADN se replica, las dos cadenas se separan al romperse los
enlaces de hidrógeno y cada cadena forma una nueva cadena complementaria con los
nucleótidos disponibles en las células (como trifosfatos). La índole semiconservadora
(se conserva en cadena) de este proceso se confirmó en estudios de isótopos radiactivos.
La replicación del ADN es mediada por enzimas, ADN polimerasas, tal replicación no
sucedería si experimentalmente colocásemos ADN y los precursores suficientes, es
decir, los nucleótidos correspondientes y la energía es aportada por los enlaces fosfato,
pues los nucleótidos son trifosfatos y en la cadena solo queda uno de los mismos.
El código y su traducción
La información genética está codificada en la secuencia de nucleótidos de las moléculas
de ADN y éstas, a su vez, determinan la secuencia de aminoácidos en las moléculas de
proteínas.
La forma en que el ADN se traduce en proteínas se elucidó con considerable detalle en
las células bacterianas. Cada serie de tres nucleótidos a lo largo de una cadena de ADN
es el código del ADN para un aminoácido en particular. La información se transcribe
del ADN a una sola cadena larga de ARN (ácido ribonucleico). Este tipo de molécula de
ARN se conoce como ARN mensajero o ARNm. El ARNm se forma a lo largo de la
cadena 3´ a 5´ del ADN siguiendo el principio de apareamiento de las bases que
sugirieran Watson y Crack. En consecuencia el ARNm es complementario de la cadena
transcripta de ADN.
En las bacterias, incluso mientras se está transcribiendo la cadena de ARNm, su
extremo 5´ se inserta en un ribosoma, estructura compleja que consiste en dos
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subunidades, cada una de ellas constituida por ARN específico y moléculas de proteína.
En el sitio donde el ARNm está en contacto con el ribosoma, unas pequeñas moléculas
de otro tipo de ARN, conocidas como ARN de transferencia (ARNt), que sirven de
adaptadores entre el ARNm y los aminoácidos, se fijan temporariamente a la cadena del
ARNm. Cada molécula de ARNt trae el aminoácido específico que solicita el codón de
ARNm al cual se inserta el ARNt. Así siguiendo la secuencia dictada originariamente
por el ADN, las unidades de aminoácidos se alinean una tras otra y forman una cadena
polipeptídica.
Ya se ha “descifrado” el código genético; es decir, se sabe que el aminoácido es
requerido por un codón de ARNm en particular. De las 64 combinaciones de tripletes
posibles del código de nucleótidos de 4 letras, se identificaron 61 combinaciones con
uno de los 20 aminoácidos que constituyen moléculas proteicas. Los otros tres tripletes
sirven de señales de “detención”, que terminan la síntesis proteica.
En la actualidad a las mutaciones se las define como cambios en la secuencia o cantidad
de nucleótidos del ácido nucleico de una célula u organismo. La mayoría adoptan la
forma de sustituciones de un nucleótido por otro, lo cual puede acarrear el cambio de un
aminoácido como sucede en la hemoglobina de la anemia drepanocítica.
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El cromosoma eucariótico
En los eucariotas, el material genético está empaquetado en cromosomas, los cuales se
tornan visibles al condensarse en la mitosis o meiosis. En los cromosomas condensados
la cromatina adopta la forma de eucromatina, que se halla almacenada en forma laxa, o
de heterocromatina, que está densamente empaquetada. El nucleolo, visible en el núcleo
durante la interfase, consiste en asas de cromatina de cromosomas distintos y en él
ocurre la síntesis de los ribosomas.
El cromosoma eucariótico difiere en muchos sentidos del cromosoma de los procariotas.
Su ADN siempre se asocia con proteínas que representan más de l amitad, en peso, del
cromosoma. La mayoría de estas proteínas son histonas, moléculas relativamente
pequeñas que poseen carga positiva. La molécula de ADN envuelve a los centros de
histonas para formar nucleosomas, unidades de empaquetado básicas del ADN
eucariótico. Existen muchas evidencias que vinculan a la transcripción del ADN con el
grado de condensación de la cromatina.
Los eucariotas tienen mucho más ADN que los procariotas. La cantidad de ADN es
constante en todas las células de una especie dada, pero no concuerda con el tamaño,
complejidad ni posición del organismo en la escala evolutiva. La replicación del ADN
es bidireccional, como en los procariotas, pero con la diferencia de que en cada
cromosoma hay millones de sitios de iniciación de la replicación.
Los estudios de hibridación y secuenciado del ADN revelaron 3 clases de ADN
eucariótico: repeticiones múltiples cortas, dispuestas de manera característica en
tandem; repeticiones más largas, por lo general dispersas por los cromosomas, y ADN
de una sola copia (este último representa el 70% de todo el ADN cromosómico en el ser
humano). Solo un 10% del ADN en realidad codifica proteínas.
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Genética humana
El número diploide de cromosomas humanos es 46, de los cuales 44 son autosomas y 2
cromosomas sexuales. El sexo heterogamético es el masculino. Cariotipo es la
representación gráfica de un juego de cromosomas. Para preparar el cariotipo se aparean
los cromosomas metafísicos homólogos y estos, a su vez, se agrupan de acuerdo con su
tamaño. Los cromosomas no homólogos de tamaño y forma similares pueden
distinguirse con técnicas de coloración que revelan el bandeado cromosómico. Se
hicieron mapas cromosómicos recurriendo a técnicas de hibridación celular y también
con sondas de ácidos nucleicos radiactivos.
Las anormalidades cromosómicas visibles comprenden cromosomas extras (por lo
general originados en la disyunción, es decir, falta de separación de dos homólogos en
el momento de la meiosis), translocaciones y delecciones. El síndrome de Down figura
entre los trastornos asociados con un cromosoma extra, puede deberse a la nodisyunción o, con menos frecuencia a translocación. También pueden ocurrir
cromosomas sexuales extras por no disyunción: a menudo, aunque no siempre, esto se
asocia con esterilidad y retardo mental.
La aniridia y el tumor de Wilms son defectos asociados con la delección de una pequeña
región del cromosoma 11. En la actualidad se detectan muchos defectos genéticos en el
feto haciendo amniocentesis, que es la recolección de células fetales del líquido
amniótico.
Los defectos genéticos expresados en los varones pero transmitidos por las mujeres se
deben a alelos recesivos mutantes situados en el cromosoma X. En los seres humanos
tales características ligadas al sexo comprenden ceguera para los colores y hemofilia.
Muchas enfermedades genéticas obedecen a deficiencias o defectos en enzimas y otras
proteínas críticas. A su vez, estas deficiencias y defectos se deben a mutaciones en los
alelos que codifican a las proteínas. Tales enfermedades por lo general solo se
manifiestan en el homocigoto y comprenden fenilcetonuria, enfermedad de Tay Sachs,
anemia drepanocítica y varias más vinculadas con variaciones en las moléculas de
hemoglobina.
Las técnicas de ADN recombinante ofrecen medios nuevos para hacer el diagnóstico
precoz en las enfermedades hereditarias y también se emplean para tratar de producir
proteínas biológicamente importantes. Es probable que en el futuro sean importantes
para tratar enfermedades hereditarias humanas.
Introducción al ADN y su utilización en el ámbito forense
En 1985, Jeffreys y cols, describían un método de identificación individual que
denominaron ADN fingerprinting o huella genética que prometía ser la solución
definitiva al análisis de la diversidad humana desde la Medicina Legal, tanto en
investigación biológica de la paternidad como en Criminalística.
En 1992, el US National Research Council (NRC) confirmaba con rotundidad la validez
de las técnicas de identificación individual basadas en la prueba del ADN y establecía
unas guías de actuación.
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Análisis de polimorfismos de ADN en Medicina Legal y Forense
Los fundamentos de las técnicas de análisis de polimorfismos ADN en Medicina
Forense se basan en dos hechos trascendentales y elementales que se deducen del
modelo de doble hélice, propuesto ya en 1953 por Watson y Crick. Estos son:
1. Principio de complementariedad entre bases
2. Desnaturalización y renaturalización del ADN
El ADN es un polímero constituido por un limitado número de monómeros. Los
monómeros son nucleótidos que consisten en una base nitrogenada, un azúcar
(desoxiribosa) y un grupo fosfato.
Las bases nitrogenadas son las purinas: adenina (A) y guanina (G) y las pirimidinas:
timina (T) y citosina (C). Los nucleótidos están ligados por medio de enlaces
fosfodiester formando una cadena de la que protruyen las bases que se emparejan con
las bases de otra cadena nucleotídica por medio de puentes de hidrógeno. El proceso de
emparejamiento entre bases no es al azar. La adenina y la timina siempre se reconocen y
se unen en forma específica, lo mismo que ocurre entre la guanina y la citosina. De tal
manera que la secuencia de bases de una cadena de ADN determina siempre la de su
cadena complementaria.
Por otro lado, la exposición a determinadas temperaturas o a un ambiente alcalino
provoca la abolición de los puentes de hidrógeno entre las bases y la separación de las
dos hebras del ADN. Esta situación es reversible, y cuando cesan esas condiciones, se
vuelve a establecer de nuevo la asociación entre las cadenas que se unen otra vez según
el principio de complementariedad entre sus bases.
En una hebra de ADN puede existir una enorme cantidad de secuencias nucleotídicas
diferentes. Por ej. si se consideran únicamente 10 posiciones en la cadena, cada una de
las cuales pudiera ser ocupada por cualquiera de los 4 nucleótidos, el número de
combinaciones posibles sería 410, o sea 1.048.576.
La cantidad total de material genético del ser humano consiste en 3 billones de
nucleótidos, aproximadamente. En este ADN existe información para un total estimado
de unos 100.000 genes, que constituyen sólo entre un 5 y un 10% del genoma.
El ADN expresivo o codificante, a pesar de ser el más interesante desde el punto de
vista médico, posee poca variabilidad entre las personas, con la excepción de ciertas
regiones, como la que informa para el sistema HLA. El resto del ADN, hasta el 80-95%,
se ha denominado “basura” (“junk”), porque no es transcripto a ARN y no codifica para
ningún gen en particular, aunque parece poseer otras funciones biológicas muy
importantes. Curiosamente, este ADN no expresivo, e injustamente denominado
“basura”, es tremendamente polimórfico y variable entre los individuos, por lo que
posee una utilidad extraordinaria en Medicina Legal. Además tiene la ventaja de
representar, como se ha visto, la mayor parte del genoma humano, por lo que se ha
convertido en una gran fuente de marcadores genéticos.
Se estima que aproximadamente la mitad del ADN no codificante es ADN repetitivo y,
aunque gran parte del mismo es extremadamente polimórfico por diversos motivos, el
ADN más utilizado con fines forenses hasta la fecha es el ADN repetido en tándem y,
dentro de él el ADN minisatélite y microsatélite.
La variabilidad genética observable en el ADN de los distintos individuos se puede
investigar experimentalmente por diversos procedimientos. En Genética Forense los
más habituales pueden clasificarse en dos grandes grupos desde una perspectiva
histórica. Estos son: procedimientos clásicos o de análisis por sondas multilocus (MLP)
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y unilocus (SLP) (DNA fingerprinting y DNA profiling respectivamente) y
procedimientos basados en el uso de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR.
Las sondas son polinucleótidos de longitud variable que de acuerdo a su propia
secuencia buscaran sectores en el ADN a analizar de modo de hibridizarse en función de
la complementariedad respectiva. Cuando se habla de sondas multilocus significa que la
hibridización puede realizarse en cualquier cromosoma, en el caso de unilocus la
hibridación se producirá en un cromosoma específico. En función de lo cual el perfil
obtenido con sondas multilocus es realmente complejo, mientras en el obtenido con
sondas unilocus es mucho más sencillo.
Esa variabilidad o polimorfismos, que estas técnicas detectan en el ADN presente en las
células de una persona puede residir:
 En la secuencia de bases específica de una determinada región de ADN que
muestra diferencias o variaciones de una persona a otras. Este es el caso de la
región control del ADN (ADNmit) y la que codifica para el sistema HLA en
ADN nuclear.
Los polimorfismos de este tipo se denominan polimorfismos de secuencia.
 En la longitud de los fragmentos de ADN que aparecen tras someter éste a la
acción de una enzima de restricción que corta las cadenas de ese ácido nucleico
en puntos concretos, sitios de restricción, originando trozos o fragmentos de
ADN de distinto tamaño. La longitud de esos fragmentos varía entre las
personas y el patrón de fragmentos es característico para cada individuo, porque
también lo es la localización de los sitios de restricción.
Los polimorfismos de este tipos e denominan polimorfismos de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP, restriction fragment length polymorphisms).
Este tipo de polimorfismos es el que más se utilizó inicialmente con fines forenses,
analizando ADN repetitivo y concretamente ADN minisatélite. Posteriormente, el
polimorfismo del ADN repetitivo minisatélite se analizaría con más éxito por medio de
la técnica de PCR.
Los loci mini y microsatélite pertenecen a la categoría de los números variables de
repeticiones en tándem (VNTR, variable number of tándem repeats), que consisten en
repeticiones en tándem de una secuencia específica, siendo el número de esas
repeticiones diferente de unos individuos a otros. Precisamente de esas “diferencias”
interindividuales deriva su interés y utilidad en Medicina Legal. Las unidades de
repetición de los microsatélites son muy pequeñas (2-5pb), por lo que se denominan
también secuencias cortas repetidas en tándem (STR, Short Tandem Repeats), mientras
que en los casos de minisatélites la unidad de repetición es mayor (10-80pb).
Procedimientos clásicos
Análisis por MLP (sondas multilocus), DNA fingerprinting y análisis por SLP (sonda
unilocus) DNA profiling
Estos procedimientos responden a un conjunto de técnicas, ya clásicas, de estudio de
RFLP con las que se obtiene el patrón de fragmentos de ADN característico de cada
individuo gracias al uso de enzimas de restricción y de sondas marcadas. Las sondas son
pequeños segmentos de ADN de cadena simple que se marcan radioactivamente por ej.
con P32 o por procedimientos no isotópicos y que se utilizan para la identificación de
fragmentos de ADN.
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Se inician con el aislamiento o extracción del ADN del fluido (sangre, semen, etc) o
tejido que se haya enviado para análisis. Una vez obtenido el ácido nucleico, este es
clivado o sometido a la acción de una enzima de restricción que lo fragmentará en
pequeños trozos. Los fragmentos de ADN producidos se someten a electroforesis sobre
gel de agarosa para conseguir una separación de los mismos de acuerdo con su tamaño y
su PM. Lógicamente los que sean más pequeños se moverán más deprisa que los más
grandes dentro del campo eléctrico, facilitando así la identificación de los mismos.
Cuando la separación electroforética concluye, los fragmentos del gel se transfieren e
inmovilizan en una membrana de nailon por un proceso conocido como Southern
Blotting. En este punto se suele realizar la separación de la doble cadena de ADN (de la
que se componen los distintos fragmentos) en dos hebras simples por un procedimiento
de desnaturalización. Con ello se pretende conseguir cadenas simples de ácido nucleico
que puedan unirse total o parcialmente a cualquier pieza de ADN unicatenario que
presente una secuencia complementaria (sonda). En definitiva, el objetivo que se
persigue es que se unan a una sonda específica, proceso que se denomina hibridación.
Sea cual sea el tipo de sonda con la que se trabaje, ésta siempre se acoplará con
determinados fragmentos de ADN, de los separados por electroforesis, siguiendo el
principio de complementariedad de bases. En esto se basan los distintos métodos que
existen para la detección de fragmentos; es decir, en la aplicación de sondas marcadas
que permitan la visualización del patrón o perfil de fragmentos del ADN característico
de un individuo.
Para conseguir ese resultado, la membrana de nailon, que contenía los fragmentos de
ADN separados por electroforesis, se sumerge en una solución en la que está la sonda,
de tal manera que los fragmentos de secuencia complementaria se unirán a ella. La
visualización de estos fragmentos se puede realizar por medio de una autorradiografía y
el patrón resultante puede ser evaluado de visu o por un analizador de imágenes.
Este método de diagnóstico de la individualidad biológica consiste básicamente en una
técnica comparativa, al igual que ocurre con cualquier otro en Genética Forense. El
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perfil de ADN que se ha obtenido de una muestra biológica, recogida en el lugar del
crimen, se compara con el que muestra el sospechoso. Ese perfil es característico de
cada individuo, y no varía aunque provenga de vestigios biológicos de distinta
naturaleza, como sangre, semen, pelo, tejidos, etc. Por lo tanto, si dos perfiles o patrones
son coincidentes es tremendamente probable que provenga del mismo individuo, y si no
es así se puede establecer, con toda seguridad, que no procedan del mismo sujeto.
El análisis por sondas multilocus fu el que Jeffreys y cols. describieron en 1985 y
denominaron DNA Fingerprinting o “huella genética” por su capacidad de
individualizar. Sin embargo este análisis que abrió tantas expectativas inicialmente, ha
tenido una utilización escasa en la práctica porque era muy difícil su estandarización, así
como la creación de bancos de datos, y también a serios problemas de interpretación
bioestadística de los resultados.
Posteriormente se han desarrollado sistemas de RFLP que producen patrones mucho
más sencillos y fáciles de interpretar. Las sondas que utilizan reconocen secuencias
repetitivas o VNTR ubicadas en un locus único dentro de cromosomas homólogos, por
lo que se les denominó sondas unilocus. El sondaje unilocus requiere condiciones de
hibridación especiales (muy rigurosas).
Cuando un ADN genómico cortado con enzimas de restricción se analiza con una sonda
unilocus se detectarán hasta un máximo de dos alelos por individuo, uno procedente del
cromosoma materno y otro procedente del cromosoma paterno. Si un individuo hereda
fragmentos de igual longitud de sus padres entonces sólo será visible una banda
(homocigoto).
Es estudio con una única sonda unilocus no permite la individualización de un sujeto a
partir de un espécimen de ADN. Se necesitan varias sondas para conseguir el mismo
poder de individualización que proporcionaba un único análisis multilocus. De esta
forma resulta un procedimiento que reúne las ventajas de ambos sistemas: simplicidad
de patrones y gran poder discriminativo.
Marcadores moleculares
Considerando la gran cantidad de información que contiene el genoma, podemos
visualizar su potencial para identificación humana. En particular la prueba de ADN se
realiza analizando secuencias del genoma muy variables, es decir, que entre los
individuos de una población puede tener diferentes formas alternas denominadas alelos.
Estas secuencias permiten diferenciar a un individuo de otro y, al heredarse de padres a
hijos, también permite establecer relaciones biológicas de parentesco, por lo que se les
conoce como marcadores genéticos o marcadores moleculares (por estar en la molécula
de ADN). Cabe señalar que para cada marcador una persona tendrá dos alelos, uno
materno y otro paterno, y a dicha combinación de alelos que recibimos de nuestros
padres se le denomina genotipo.
Específicamente las secuencias o marcadores para realizar una prueba de ADN se
caracteriza por tener repeticiones cortas en tándem, y son ampliamente conocidos por
sus siglas en inglés STRs (short tándem repeats) o microsatélites. A lo largo del genoma
se encuentran miles de STRs que pueden ser usados como marcadores moleculares.
Como su nombre lo dice, los STRs se componen de secuencias cortas repetidas, por
ejemplo GATA, formando diversos alelos que se nombran por el número de veces que
se encuentre la secuencia repetida; por ejemplo, el alelo 6 presentará seis veces la
secuencia (por ej. GATA,GATA,GATA,GATA,GATA,GATA), y en una población
podrían existir los alelos 6,7,8,9,10,11,12,13,14, etc.
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El par de alelos o genotipo para cada marcador STR (por ej. 6/9), permite diferenciarlo
o relacionarlo con otras personas. Cuando la persona dos alelos diferentes (uno materno
y uno paterno), se dice que su genotipo es heterocigoto; mientras que, cuando tiene un
solo alelo se asume que recibió el mismo alelo de ambos padres, y se dice que su
genotipo es homocigoto para el SRTs en cuestión.
En una pareja de heterocigotos para alelos diferentes se pueden generar cuatro genotipos
distintos en sus hijos, lo que permite diferenciar individuos estrechamente relacionados
como los hermanos.
Un perfil de ADN, que también suele llamarse huella genética, se genera obteniendo los
genotipos de varios STRs, formando un código que presumiblemente puede llegar a ser
único e irrepetible (6/9, 12/16, 17/21, 22/23, etc.).
Uso de los marcadores STRs para identificación humana. Los genotipos permiten
establecer las relaciones de parentesco y diferenciar a un individuo de otro. De una
pareja de heterocigotos se generan múltiples genotipos en sus hijos.
Técnica para obtener perfil de ADN
La forma de obtener perfil de ADN se basa en generar millones de copias o amplificar
las secuencias del genoma que permiten diferenciar individuos, en este caso los
marcadores STRs. Esta técnica permite replicar al ADN in vitro, y se conoce
ampliamente por sus siglas en inglés como PCR (polymerase chain reaction).
La PCR se realiza por ciclos de temperatura en los que básicamente suceden los
siguientes tres pasos en cada ciclo:
1) Desnaturalización, por calor se abren las cadenas de ADN
2) Alineamiento de secuencias cortas conocidas como primers, que delimitan las
regiones que se van a replicar, y
3) Extensión, formándose cadenas nuevas de ADN por acción de la Taq
polimerasa, una enzima termoestable capaz de añadir nucleótidos a los extremos
de los primers.
En cada ciclo de PCR se duplica la secuencia de interés (STRs), por lo que en solo 25
ciclos teóricamente habrá millones de copias, a lo que se conoce como “amplificado”, lo
que facilitará enormemente su análisis posterior.
Para el análisis post-PCR hay que recordar que los alelos STRs se diferencian por el
número de veces que se repite una secuencia, esto significa que el tamaño o longitud va
a ser diferente de un alelo de otro.
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Para ver estas diferencias se emplea la electroforesis, técnica para separar moléculas en
una superficie de soporte (gel) por acción de un campo eléctrico en base a la carga y
tamaño de la molécula; las más pequeñas corren más rápido mientras las grandes se van
retrasando.
Amplificación exponencial de una secuencia de ADN por ciclos de temperatura por la
técnica PCR.
Amplificación de STRs y detección por
electroforesis en geles verticales de
poliacrilamida en un caso forense. Nótese
que el perfil de ADN de la mancha de
sangre en ropa del sospechoso es igual al
de la víctima.
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Para ello simultáneamente se someten a electroforesis muestras con fragmentos de
tamaño conocido, también llamados marcadores de peso molecular o estándar de
tamaño, y/o una mezcla de los diferentes alelos posibles para los STRs que se están
analizando, y que se conoce como escalera alélica o ladder; con lo que resulta
relativamente sencillo definir los alelos/genotipos y posteriormente el perfil genético de
una persona.
La electroforesis en una prueba de ADN se realiza de dos formas:
1) Por geles verticales de poliacrilamida, técnica que ha caído francamente en
desuso, y
2) Electroforesis capilar (EC), cuyo proceso es más preciso y automatizado, por lo
que constituye el método de elección en los laboratorios de genética forense en
el mundo.
Finalmente, para observar el ADN amplificado (STRs) y sometido a electroforesis es
necesario teñirlo; existen métodos tradicionales como la tinción con nitrato de plata de
los geles de poliacrilamida, o más sofisticados que involucran la detección de
fluorescencia añadida durante la PCR y que se detecta en sistemas automatizados de
electroforesis capilar.
Los amplificadores deben someterse a electroforesis capilar, es decir, este proceso se
hace a través de un tubo dl tamaño de un capilar relleno de un polímero, donde bajo el
mismo principio de separación por la carga y tamaño de la molécula, los amplificados
se van separando al aplicar corriente eléctrica. Para este fin se usan analizadores
genéticos, que de forma automatizada carga la muestra en el capilar para luego aplicar
voltaje. De esta forma se separan los STRs hasta llegar a una ventana donde pasa un
rayo laser que convierte esa luz en impulsos eléctricos que, con ayuda de un software,
se representan gráficamente en un electroferograma.
Representación de los pasos que involucra el análisis de fragmentos de ADN por
electroforesis capilar (EC).
Cabe señalar que la longitud de onda de las diferentes fluorescencias puede
superponerse y su registro se logra mediante el hecho de cuánto se superpongan cada
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uno de los colores, a lo que se denomina matriz. Durante el análisis del
electroferograma para definir el perfil de ADN es muy importante que simultáneamente
se corra en la EC una escalera alélica (ladder) con todos los alelos STRs, lo que por
comparación directa se facilita enormemente la asignación correcta de los alelos,
genotipos, y finalmente perfil de ADN del individuo.
Cabe señalar que todo este proceso dura alrededor de 30 minutos por muestra,
facilitando enormemente esta labor. Una vez realizada la electroforesis capilar se
observa el perfil de ADN de un individuo en un electroferograma, donde los picos de
acuerdo a su color y posición nos indican los alelos (genotipo) que tiene la persona para
cada STR. Si un individuo presenta uno o dos picos (alelos), indica que su genotipo es
homocigoto o heterocigoto, respectivamente, para el STR en cuestión.
Electroferograma del perfil genético de un individuo. El tamaño en nucleótidos (pb) y
nombre del STR se muestra en la parte superior de cada carril. Debajo de cada pico se
indican los alelos del individuo. Para amelogenina (A) se observa solo un pico y una X
(mujer, XX).
El cromosoma Y en las identificaciones de rastros de interés forense y en el rastreo
de línea paterna
El complemento cromosómico humano está compuesto por 46 elementos organizados
en 23 pares. De estos, 22 son semejantes en hombres y mujeres, y cada par presenta
igual morfología denominándose “cromosomas autosómicos” o “autosomas”. El par
restante, llamado “par sexual”, tiene características diferenciales dependiendo del sexo
considerado.
Los individuos de sexo femenino normales presentan el par sexual constituido por dos
elementos homólogos con morfología semejante. En cambio en los hombres, el par
correspondiente posee elementos disímiles, formado por un cromosoma metacéntrico
mediano y un pequeño cromosoma acrocéntrico. El primero denominado cromosoma X
es el elemento presente en doble dosis en las mujeres, en tanto que el segundo, sólo
presente en los varones, es el denominado cromosoma Y.
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En el proceso de formación de células germinales femeninas sólo podrás generarse
gametos que contengan el cromosoma X como elemento sexual, por tanto la mujer
cederá a su descendencia obligatoriamente un cromosoma X. El varón, en cambio,
podrá generar dos tipos de espermatozoides que diferirían en cuanto a la presencia de un
cromosoma X o un cromosoma Y además de los 22 elementos autosómicos. Será, por
tanto, el hombre, quién determine el sexo en su descendencia, dependiendo de si el
espermatozoide aporta un cromosoma X (descendencia femenina) o cromosoma Y
(descendencia masculina).
Debido a que en la mujer el par sexual está formado por dos elementos de morfología
semejante, todos los genes y secuencias presentes estarán en condición diploide y, por
tanto, si los dos alelos de un locus determinado son idénticos, la portadora será
homocigota, si los alelos difieren su condición será heterocigota, al menos en el locus
referido. En el hombre, tanto el cromosoma X como el Y se encuentran como elementos
únicos, siendo su condición hemicigótica.
En el cromosoma Y existen secuencias polimórficas cuya variabilidad se refleja en
variantes de longitud, como es el caso de los microsatélites y los minisatélites, en lo que
las unidades de repetición pueden variar tanto en número como en secuencia. Además
de estas, existen otras variantes como las de inserción/delección y también simples
sustituciones nucleotídicas.
Los polimorfismos presentes en este cromosoma proporcionan una herramienta
adicional en las metodologías de la identificación humana. En particular, los
microsatélites híper variables han contribuido en gran medida en este campo debido al
gran número de tales marcadores disponibles, los que han sido validados en el ámbito
forense internacional.
La posibilidad de determinar vínculos de filiación en ausencia del progenitor, la
investigación de identidad y sexo en desastres en masa y la identificación de
responsables de violación tanto hétero como homosexual constituyen algunos de los
campos de aplicación forense de los marcadores de microsatélites del cromosoma Y.
Los marcadores posibles de trabajar con cromosomas Y tienen gran capacidad
discriminativa, pero presentan la limitación de que todos los individuos de la misma
línea paterna compartirán idéntica información de estos haptotipos, por lo cual no será
posible desvincular individuos vinculados por vía paterna de la posible existencia de
vínculo de parentesco o filiación, ni tampoco descartar al hermano de un sospechoso si
sólo se analizan marcadores presentes en este cromosoma. Puede por lo tanto concluirse
que estos marcadores son de enorme utilidad en la investigación de identidad, pero
deberán ser, en todos los casos, evaluados juntamente con marcadores autosómicos.
ADN Mitocondrial en Genética Forense
En las células de los organismos superiores, existen unas formaciones denominadas
mitocondrias que son auténticas generadoras de energía necesaria para el buen
funcionamiento de la célula, pero además dichas formaciones están provistas de un
patrimonio genético propio, el ADN mitocondrial. A diferencia del ADN nuclear que
forma largas fibras, constituidas cada una de ellas por una doble hélice, y que codifican
aproximadamente 100.000 genes, el ADNmt que representa el 1 al 2% del ADN celular,
se presenta en pequeños anillos de doble filamento, codificando 37 genes. El ADNmt
codifica aproximadamente el 10% de las proteínas constitutivas de las mitocondrias, por
consiguiente, para un buen funcionamiento de estas se necesita una buena cooperación
entre el ADN nuclear y el ADNmt.
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El ADNmt no tiene nada en especial que lo diferencie en cuanto a su composición
química con el nuclear, sin embargo posee un código genético propio, su organización
es diferente pues solo el 10% de su totalidad es no codificante. Su genoma es haploide
debido a que su herencia es estrictamente materna, por lo que no está sometido a
procesos de recombinación, característica muy importante desde el punto de vista de los
estudios filogenéticos. Al mismo tiempo, la herencia uniparental imposibilita su
utilización para realizar estudios de investigación biológica de paternidad.
Este ADN que se encuentra entre las moléculas de ADN más pequeñas, con una
longitud de 16.569pb ha sido completamente secuenciado por Anderson y cols. en 1981.
Así mismo, se han asignado a todos los genes mitocondriales sus funciones y sus
productos génicos, incluyendo 13 proteínas.
Las dos hebras de ADNmt tienen una distribución asimétrica de guanina y citosina, lo
que genera una hebra pesada (H) y una ligera (L). Cada hebra es transcripta por un
promotor localizado en la región control, la región más interesante desde el punto de
vista forense, es la de replicación de la cadena H, dado que es una región hipervariable y
lo suficientemente pequeña para poder ser utilizada en PCR.
Debido a su alta variabilidad, la región control es la que normalmente se analiza, tanto
para estudios antropológicos como para genética forense. Mide aproximadamente
1.100pb y forma parte del 10% del ADNmt no expresivo. Es una región no codificante
y se subdivide en dos regiones de aproximadamente el mismo tamaño (400pb), la región
HVI y HVII.
El ADN nuclear puede proporcionar mucha más información que el ADNmt debido a la
cantidad de sistemas polimórficos que se pueden estudiar, como por ejemplo los
microsatélites (STR). Sin embargo en muchas ocasiones, su estudio se hace totalmente
imposible debido a la cantidad insuficiente de material para analizar o al grado de
degradación de este.
La utilización del ADNmt se debe restringir a aquellos casos donde no se pueda realizar
un estudio a través del ADN nuclear o en aquellos casos en que el ADNmt pudiera
proporcionar información adicional.
En algunos casos como muestras de pelos sin bulbos, un vestigio bastante común en la
pericia forense, tan sólo se puede llevar a cabo el análisis del ADNmt. El abordaje
estadístico de los resultados del ADNmt es complejo y las estimas de frecuencias tan
sólo se podrán llevar a cabo en el futuro con obtención de amplias bases de datos.
En genética forense el ADNmt ofrece importantes ventajas. Por un lado, la
amplificación es mucho más fácil debido a que existe un gran número de moléculas de
ADNmt por célula, por lo que podemos obtener mayor cantidad de producto de PCR de
muestras muy pequeñas. Además, debido a que es menos propenso a la degradación que
el ADN nuclear, se evitan errores de la polimerasa durante la amplificación provocados
por la degradación del ADN original.
Así pues, las muestras más idóneas para el abordaje a través del ADNmt son aquellas
muestras biológicas que, debido a su pequeño tamaño o posible degradación, no puedan
ser analizados por medio de polimorfismos de ADN nuclear. La identificación de restos
antiguos o restos cadavéricos procedente de grandes catástrofes, como los accidentes
aéreos (normalmente piezas dentarias o huesos), y la identificación de vestigios de
Criminalística, como pelos sin bulbo o manchas biológicas de escaso tamaño
parcialmente degradadas, son las aplicaciones más importantes que este tipo de ADN
tiene en el campo de la genética forense.
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Extracción de ADN en muestras forenses
Es fundamental tener en cuenta el criterio de elección de un método de extracción u
otro, no es solamente su rendimiento en cuanto a cantidad de ADN sino su éxito en la
amplificación, dos funciones que no siempre se correlacionan.
El método más simple es añadir las células sustrato de la amplificación directamente a
la mezcla de reacción, la lisis celular se produce en el primer paso del calentamiento
para la desnaturalización, quedando así el ADN libre y accesible a la polimerasa. Sin
embargo cuando se sobrepasa un cierto número de células, el rendimiento del producto
amplificado empieza a declinar debido a la acumulación de restos celulares y de
inhibidores. Esto hace necesario establecer ciertas condiciones que permitan extraer el
ADN a partir de un número elevado de células, preservando con ellos la actividad de la
taq-polimerasa.
En general, los métodos de digestión de muestras biológicas suelen hacer uso de
detergentes para solubilizar componentes celulares, y de enzimas proteolíticas, para
digerir proteínas, principalmente histonas, que de otra forma permanecerían fuertemente
ligadas al ADN, dificultando su extracción.
La enzima proteolítica de uso más extendido es la proteinasa K, que se inactiva por
calor, con lo cual luego de su acción el calentamiento necesario en la primera etapa de
la PCR será suficiente para inactivar la enzima y evitar su acción sobre la taqpolimerasa.
El proceso de digestión de la muestra suele ir seguido de otros pasos de purificación
para retirar del extracto proteínas residuales, componentes de membrana y sobre todo
posibles inhibidores de la PCR.
Muestras de Sangre
Aunque la hemoglobina es un conocido inhibidor de la taq-polimerasa no son
requeridos protocolos especiales. Bastan 3-5ul de sangre fresca o manchas de unos
3mm2, de donde se pueden obtener cómodamente 200ng de ADN. Las muestras de
sangre líquidas procedentes de cadáveres, degradada o contaminada, pueden ocasionar
problemas si el secado es lento pues los fenómenos de putrefacción han avanzado. Es
por ello que se prefiere la utilización de pequeñas manchas las cuales por su diminuto
tamaño han secado rápidamente evitándose el fenómeno putrefactivo.
Muestras de Semen
El estudio de restos de semen como evidencia en casos de agresión sexual es, junto con
el de vestigios sanguíneos, el tipo de análisis más solicitados en laboratorios de biología
forense. Antes de la aplicación de las técnicas con ADN, los estudios con este material
tenían grandes limitaciones, incluso con la posibilidad de mezclado con fluidos de la
víctima que podrían enmascarar resultados en la identificación de proteínas como
enzimas e incluso del agrupamiento ABO.
Actualmente muchas de esas limitaciones se han superado aunque por supuesto que la
tecnología tiene sus propias limitaciones. Una de sus mayores ventajas es que ofrece la
posibilidad de resolver las mezclas de semen aun en presencia de otros fluidos
biológicos procedentes de la víctima (fluidos vaginales, sangre o saliva), gracias a un
método de extracción conocido como “lisis diferencial”, se basa en la resistencia de los
espermatozoides a la lisis con detergente y proteínasa K en ausencia de un agente
reductor. En un primer paso se produce la ruptura de las células epiteliales, pero no de
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los espermatozoides, que pueden recuperarse por centrifugación. En el sobrenadante de
esa primera digestión queda el ADN procedente de la víctima. El precipitado
conteniendo los espermatozoides íntegros convenientemente tratado aportaría el ADN
del agresor.
Esta técnica no resuelve el problema cuando el agresor es un sujeto azoospérmico pues
en este caso la cantidad de ADN que puede recuperarse es mucho menor y proveniente
solo de las células y leucocitos presentes en el semen del agresor, aproximadamente la
cantidad recuperable será del orden del 6% de la posible en un sujeto espérmico.
Recientemente el estudio de evidencias en casos de agresión sexual, en partículas
aquellas que se presentan en cantidades trazas, se ha beneficiado mucho de la
incorporación en las baterías de tipificación de microsatélites específicos del
cromosoma Y. estos Y-STR incrementan notablemente el índice de éxitos en la
identificación del componente masculino en mezcla de fluidos biológicos hombre/mujer
en lo que la lisis diferencial es inútil o en aquellas en las que sea de alto riesgo su
aplicación.
Muestras de Saliva
En los últimos años, debido al notable incremento de las técnicas utilizadas, con el
consiguiente requerimiento de contar con menor cantidad de ADN, aumentando el éxito
en muestras con cantidades trazas de material biológico, tales como sellos, sobres,
colillas, mordazas, huellas de mordeduras, manchas en ropa, etc. Cada vez se extiende
más su utilización en casos de Criminalística o de estudios de paternidad.
Si se compara con la venopuntura, la toma de saliva con la ayuda de un hisopo resulta
un método no invasivo, ni doloroso, ni traumático, de fácil recogida en recién nacidos y
no implica el riesgo de vertido o rotura de los tubos conteniendo la sangre. Si bien en
ensayos realizados con hisopos bucales con muestras de saliva, se obtuvo un promedio
de 9ug de ADN, utilizando extracción orgánica y precipitación con etanol, esta
recuperación queda bastante lejos de a obtenida en casos reales con muestras como las
mencionadas arriba.
En general se trabaja con muestras tan exiguas, en las que a menudo solo pueden
obtenerse unos pocos nanogramos de ADN, es aconsejable el uso de sistemas
“multiplex”, en los que se obtendrá información simultánea de varios marcadores con
una sola amplificación.
Muestra de Pelos
En ocasiones, unos pelos son la única evidencia que permite establecer una conexión
entre un agresor y la víctima o al menos con el lugar de los hechos. Cabellos o vellos de
cualquier origen corporal son recogidos en la escena del delito, sobre la víctima, en las
prendas, etc. Pero como también es una muestra ubicua y, en el caso de los cabellos, el
ritmo normal de caída en un sujeto normal es de 80 a 100 diarios y, aunque la decisión
de la importancia de una evidencia, habitualmente no es incumbencia del laboratorio,
sería muy importante no considerar en los estudios nada más que aquellos pelos que
estén incuestionablemente relacionados con el delito.
El pelo es una muestra delicada, posiblemente la que presenta mayor índice de fracasos;
una de las razones puede encontrarse en el elevado contenido en melaninas solubles,
potentes inhibidores de las ADN polimerasas y que se forman espontáneamente por
contacto con el aire, en los pelos oscuros y se ve favorecida de más, por los tratamientos
de decoloración con agua. Su análisis es laborioso ya que se requiere un exhaustivo
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análisis morfológico, sobre todo si se trata de una muestra abundante, para hacer un
cribado previo que los clasifique y ordene por su semejanza o sus diferencias.
Sólo los pelos provistos de raíz y vaina son útiles para el análisis de ADN nuclear, si no
la presentan, deberá estudiarse ADN mitocondrial. No hay que olvidar que analizados
uno a uno, o agrupados si es posible, los pelos son siempre muestra única que se
destruye en el proceso de extracción. Sólo se dispone de los nanogramos de ADN que
se hayan obtenido del primer y definitivo análisis. Los primeros en realizar la
individualización de un único pelo humano, fueron Higuchi y cols. las raíces de los
pelos arrancados, sobre todo si son recientes no ofrecen demasiados problemas y
pueden ser extraídos con una técnica especial con fenol cloroformo o con un buffer
especifico para pelos, adicionado de un detergente no iónico como el Laureth-10.
Aunque un pelo con raíz puede contener teóricamente 5ug de ADN, no suelen extraerse
más de 200ng. No ocurre lo mismo con los pelos caídos, normalmente en fase
telogénica, carente de raíz o con muy escaso resto, de los que pueden extraerse como
máximo alrededor de 10ng de ADN y de los que es frecuente no obtener resultados.
Es difícil establecer una correlación entre la técnica de extracción, su eficiencia y el
éxito de tipificación.
Otros tipos de muestras
Otros tipos de muestras, menos habituales, pero que también se contemplan desde la
óptica del diagnóstico de individualización son: orina, heces, secreciones nasales, uñas
y, en general, cualquier vestigio que pueda contener células de las que podría extraer el
ADN.
La identificación de muestras de orina suele estar relacionada con el control de consumo
de drogas en determinados trabajos o como dopaje en el deporte, que puede conllevar
un intento fraudulento de sustitución de muestras. El rendimiento del ADN en orina
depende de su procedencia y de la demora entre su recogida y el análisis. La orina de
mujer es habitualmente más rica en material celular porque se contamina con células del
epitelio vaginal, obteniéndose habitualmente un rendimiento 5 veces superior al de la
orina del hombre. En cuanto al tiempo transcurrido se ha determinado caídas de hasta 3
veces entre orinas recientemente obtenidas y conservadas en freezer durante una
semana. En 20ml de orina fresca pueden obtenerse 800ng de ADN, sin embargo en una
mantenida 24 horas a 4 grados y partiendo de 50ml el valor obtenido fue de 230ng.
En la individualización de muestras de heces, su escasísimo rendimiento en la
extracción de ADN hace infructuoso el análisis de STR, pero puede abordarse el
problema por estudio del ADN mitocondrial. Se ha conseguido amplificar con éxito la
región HVI partiendo de 10mg de heces frescas, usando bolas magnetizadas para aislar
y purificar el ADN.
En uñas, es posible obtener información directamente de un fragmento de estas, para lo
que es necesario digerir un mínimo de 9mg de uña para poder llevar a cabo la
amplificación. Habitualmente el interés de estas muestras se centra en los restos que
pudieran permanecer adheridos a las uñas si se produjeron arañazos o heridas en el
transcurso del ataque violento. En este caso la recuperación de las partículas de piel o
células sanguíneas será función directa de la profundidad de la herida producida, por lo
que no puede generalizarse nada sobre el rendimiento en la extracción del ADN.
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Consideraciones sobre el valor probatorio de los estudios de ADN
El ADN, ácido desoxirribonucleico, encierra en su molécula de doble hélice la
información genética de cada individuo. La policía recoge en el lugar del crimen las
huellas biológicas, como partículas de piel, pelos, semen o sangre, y analiza su ADN.
Después compara el análisis con el ADN del presunto criminal. Si coinciden, es una
prueba de su culpabilidad.
La probabilidad de que dos personas tengan idéntico perfil genético es de 1 por 3
billones. Al respecto representan al respecto un problema tan solo los gemelos
procedentes del mismo óvulo cuyo perfil genético coincide.
A excepción de los gemelos, no existen dos personas con un ADN idéntico y así podría
darse por descartada la eventualidad de que a raíz de un análisis del ADN pueda ser
inculpada una persona inocente.
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BIBLIOGRAFÍA
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Manual de Criminalística. Carlos A. Guzmán. 2006
Manual de Química Forense. Patricia M. Caro y cols. 2007
Apuntes de Química III. Carlos A. Palacios. 2007
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