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T M
2S330
PcG
m 3
FONDO TESIS
24265
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO
SELECCION Y EVALUACION DE CEPAS NATIVAS DE
Bacillus
thuringiensis CONTRA Heliothie zea
y Spodoptera exigua (Hübner).
(Boddie)
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN MICROBIOLOGIA
PRESENTA
GUILLERMO JOSE GUTIERREZ CASTILLO
COMISION-DE TESIS
M.C. LUIS J. GALAN-WONG
PRESIDENTE
M.C.LILIA H. MORALES-RAMOS
VOCAL
MONTERREY, NUEVO LEON
MARZO DE 1993.
UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
DIVISION DE ESTUDIOS DE POSGRADO
SELECCION Y EVALUACION DE CEPAS NATIVAS DE
Bacillus
thuringiensis CONTRA Heliothis zea
y Spodoptera exigua (Hübner).
(Boddie)
TESIS
PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS
CON ESPECIALIDAD EN MICROBIOLOGIA
PRESENTA
GUILLERMO JOSE GUTIERREZ CASTILLO
M.C. LUIS J. GALAN-WONG
DIRECTOR-TESIS
DRA. CRISTINA RODRIGUEZ-PADILLA
CODIRECTOR
DEDICATORIA
A mis padres
Guillermo Gutiérrez Gutiérrez
Ana Castillo Guardado
Por su comprensión y apoyo, permitiéndome alcanzar una
meta mas que me he trazado.
A mis hermanas
Yamilette
Maribel
Por compartir conmigo la felicidad de alcanzar una
meta.
A mi sobrino
Victor Hugo
Por los momentos agradables <iue me ha brindado.
A mi esposa Emperatriz Lugo Villalta
Con mucho amor
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi agradecimiento a las siguientes personas, por sus
valiosas aportaciones necesarias para la culminación de este
trabajo.
Al M.C. Luis J. Galán Wong, director de tésis, un profundo
agradecimiento por su acertada dirección y su valiosa asesoría
aportadas en la realización de este trabajo.
A la Dra. Cristina Rodríguez Padilla, co-directora de tésis, por su
asesoría, revisión de este trabajo y por formar parte de la
comisión de tésis.
A la M.C. Lilia H. Morales Ramos, por la revisión de este trabajo
y por formar parte de la comisión de tésis.
Al Ing. Edgar Reyes Meló, compañero de maestría, con especial
reconocimiento por su ayuda y apoyo en todo momento.
A mis compañeros .de maestría Angeles, Guadalupe, Emma.
A todas aquellas personas que de una manera u otra hacieron posible
la realización del presente trabajo.
INDICE
Páginas
ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS Y CUADROS
RESUMEN
I.-
II.-
i
ii
iii
INTRODUCCION
1
HIPOTESIS
4
ANTECEDENTES
6
III.- MATERIALES Y METODOS
28
3.1 Aislamiento de cepas nativas
28
3.2 identificación serológica de las cepas
29
3.3 Selección de cepas
34
3.4 Medios de cultivo
38
3.5 Experimentos a nivel planta piloto
41
IV.-
RESULTADOS Y DISCUSION
45
V. -
CONCLUS IONES
55
VI.-
LITERATURA CITADA
57
ABREVIATURAS
KDa
mg
1
DLS0
ÜIP
EMP
TCA
S
a
5
mi
U.F.C.
g
r .p.m.
°C
col.
KLa
WM
v/v
ppm
atm.
R
Kg
SSF
LRM
DNS
rim
nA
CL
ln
%
Kilodaltones
miligramos
litros
Dosis Letal Media
Unidades Internacionales de Potencia
Embden-Meyerhoff-Pamas
Tricarboxílico
Beta
Alfa
Delta
mililitro
Unidades Formadoras de Colonia
gramo
Revoluciones por minuto
Grados centígrado
Co1aboradores
Microgramo
coeficiente de transferencia de oxígeno
Volumen-Volumen-Masa
Volumen-volumen
Partes por millón
Atmósfera
Marca registrada
Kilogramos
Solución salina formalinizada
Líquido de remojo de maíz
Dinitrosalicílico
nanómetros
nanoamperios
Concentración de Oxígeno Disuelto
Logaritmo natural
porciento
LISTA DE FIGURAS Y CUADROS
FIGURA 1. Tiempo de fermentación y esporas viables, cepa CNPVBt-12,
en cinco medios de cultivo.
FIGURA 2. Comparación del % de mortalidad de Spodoptera exigua y
Heliothis zea cepa CNPVBt-12, en 5 medios de cultivo.
FIGURA 3. Cinética de crecimiento y consumo de azúcares
Bacillus thuringiensis, cepa CNPVBt-12, medio I.
de
FIGURA 4. Cinética de crecimiento y consumo de azúcares
Bacillus thuringiensis, cepa CNPVBt-12, medio II.
de
FIGURA 5. Cinética de crecimiento y consumo de azúcares
Bacillus thuringiensis, cepa CNPVBt-12, medio III.
de
FIGURA 6. Cinética de crecimiento y consumo de azúcares
Bacillus thuringiensis, cepa CNPVBt-12, medio IV.
de
FIGURA 7, Cinética de crecimiento y consumo de azúcares
Bacillus thuringiensis, cepa CNPVBt-12, medio V.
de
FIGURA 8. Cinética de crecimiento
de
Bacillus thuringiensis
agitación 300 r.p.m., aereación 0.5 W M .
FIGURA 9. Cinética de crecimiento
de
Bacillus thuringiensis
agitación 400 r.p.m., aereación 0.5 W M .
FIGURA 10.Cinética de crecimiento
de
Bacillus thuringiensis
agitación 500 r.p.m., aereación 0.5 W M .
FIGURA 11.Cinética de crecimiento
de
Bacillus thuringiensis
agitación 400 r.p.m., aereación 1 W M .
FIGURA 12.Cinética de crecimiento
de
Bacillus thuringiensis
agitación 500 r.p.m., aereación 1 W M .
FIGURA 13.Cinética de crecimiento
de
Bacillus thuringiensis
agitación 600 r.p.m., aereación 1 W M .
FIGURA 14.KLa en función de
a 0 .5 W M y 1 W M .
la agitación a nivel planta piloto
CUADRO 1. Origen
de
los
doce
Bacillus thuringiensis.
CUADRO 2. Identificación
serológica
Bacillus thuringiensis.
aislamientos
de
12
de
cepas
de
CUADRO 3. Saturación del antisuero 3a3b (HD-1) con el antígeno
3a(HD-4) cruzado con las 12 cepas nativas.
CUADRO 4. Producción
del
complejo
espora-cristal
bioensayos de selección de cepas.
para
los
CUADRO 5. Bioensayos preliminares de las doce cepas nativas contra
Heliothis zea.
CUADRO 6. Bioensayos preliminares de las doce cepas nativas contra
Spodoptera exigua.
CUADRO 7. Dosis Letal Media en |ig/ml de
CNPVBt-12 contra Heliothis zea.
CUADRO 8. Dosis Letal Media
Heliothis zea.
en
la cepa seleccionada
fig/ml del estándar(HD-1) contra
CUADRO 9. Dosis Letal Media en |4.g/ml de la cepa seleccionada
CNPVBt-12 contra Spodoptera exigua.
CUADRO lO.Dósis Letal Media
Spodoptera exigua.
en
¿ig/ml del estándar(HD-1) contra
CUADRO 11. Análisis de varianza para el % de
Heliothis zea en 5 medios de cultivo.
Mortalidad
de
CUADRO 12. % de mortalidad del insecto-blanco Heliothis zea con la
8-endotoxina de la cepa CNPVBt-12, medio II, bajo
diferentes tratamientos.
CUADRO 13. Evaluación de los tratamientos (aereación/agitación)
através de diferentes parámetros de fermentación.
»
RESUMEN
Se aislaron 12 cepas de Bacillus thuringiensis a partir de
muestras de suelo
recolectadas en diferentes regiones de
Nicaragua. De acuerdo a la identificación serológica,
las
cepas se identificaron como B. thuringiensis var. kurstaki,
serotipo
3a3b.
La
selección
de
cepas
se
efectuó
con
el
criterio de toxicidad. La mejor cepa resultó ser CNPVBt-12
contra los insectos blancos Seliothis zea y Spodoptera exigua.
Contra H.zea presentó una DLS0 de 119.05 |ig/ml. ? las Unidades
Internacionales de Potencia
(UIP) por mg de muestra fueron
18,373. Contra S.exigua presentó una DLS0 de 179.85. Las UIP
fueron
14,577.
En este
trabajo
se evaluaron
5 medios de
cultivo con melaza como única fuente de carbono, utilizando la
cepa seleccionada CNPVBt-12. El medio II elaborado con melaza
de caña, harina de pescado, harina de soya, líquido de remojo
de maíz y levadura, resultó ser el mejor de acuerdo a los
parámetros;
tiempo
de
fermentación,
cantidad
de
esporas
viables y toxicidad. Al analizar la toxicidad de los extractos
finales obtenidos de B. thuringiensis CNPVBt-12 del medio II se
encontró una toxicidad para H.zea
(84.24%).
De
los
(93.16%) y para S.exigua
tratamientos
de
combinaciones
aereación/agitación que se evaluaron en termentadores de 40
litros de capacidad total, con el medio y cepa seleccionados,
la mejor combinación fue de 600 r.p.m./l W M , en la cual la
ii i
fermentación duró 2 6 horas, un rendimiento de
18 g/1 de
esporas-cristales, determinando un KLa de 237 H'1 resultó el
óptimo
para
la
reproducibilidad
de
extractos recuperados en esta escala,
contra H.zea a 500 ng/ml.
la
toxicidad
en
los
la cual fue de 80%
I.INTRODUCCION
La
lucha
química
contra
los
insectos
resulta
cada vez más
complicada y en ocasiones hasta decepcionante, principalmente a
causa
de
los
fenómenos
de
resistencia
a
los
plaguicidas
químicos,por lo que el hombre ha buscado alternativas al uso de
estos. En efecto, en 1948, 14 especies nocivas eran resistentes
a un insecticida, en 1969 eran 229 y en 1984, se contaba con más
de 447. La conprensión de este fenómeno de consecuencias graves
sobre los costos de producción agrícola y sobre la salud
ha
llevado a la implementación del control biológico.(44).
Jean Deacon (1984), define el Control Biológico como la práctica
o el proceso en el cual los efectos no deseables de un organismo
son reducidos por medio de otro organismo que no es la plaga, la
planta
hospedera
o
el
hombre".(12).
El
Control
Microbiano
representa una rama del control biológico de insectos-plaga.(4).
Los agentes microbianos de control biológico son organismos
que se encuentran en la naturaleza e incluyen: virus, bacterias,
hongos, protozoarios y nematodos.(12) .
Actualmente de alrededor de 300 bacterias entomopatógenas, la más
importante
desde el punto
de vista
comercial
es el
género
Bacillus de los cuales sólo cuatro han sido estudiados como
insecticidas:
Bacillus
popilliae,
Bacillus
moritai,
Bacillus
sphericus
y
Bacillus
thuríngiensis,
ésta
última
representa el microorganismo entomopatógeno de mayor producción
y
distribución
en
aproximadamente
2.3
el
mundo(12) .
millones
de
Kg.
Hoy
de
día
se
utilizan
bioinsecticidas
de
Bacillus thuríngiensis anualmente, para el control de plagas
agrícolas y forestales principalmente.(37).
Es importante señalar los daños que causa el "gusano soldado de
la
remolacha"
Spoóoptera exigua
(Hübner)
en
los
diferentes
cultivos, principalmente en el maíz, sorgo, algodonero, tabaco,
evitando
el desarrollo
destruye totalmente
de
las plantas
y
algunas veces
las
(46) . Por otro lado, el "gusano elotero"
Heliothis zea (Boddie), es seriamente dañino al jitomate, tabaco
y maíz, en las plantas del algodón, sólo un gusano puede consumir
el interior de las bellotas de toda una rama.(46).
B. thuríngiensis
es
una
bacteria
grampositiva,
formadora
de
esporas, saprófita del suelo y facultativa parásita de insectos,
la cual se caracteriza por la formación de un cuerpo parasporal
protéico durante la esporulación. Estos cristales son liberados
al exterior después de la lisis de la pared celular.(32,35).
Hay tres factores que significarán un aumento <áe su uso en el
futuro, éstos son:
La
mayor
parte
de
las
plagas-insectos
han
desarrollado
resistencia a varias clases de insecticidas químicos.
- El costo social asociado con el uso de estos agentes, los
efectos negativos en la salud y el daño al medio ambiente se han
incrementado.
- El costo directo para desarrollar y producir un insecticida
químico
derivado
de
petroquímicos
también
han
aumentado
rápidamente.(55).
Muchos reportes de investigación han cubierto diferentes aspectos
relacionados a B. thuringiensis, tales como genética, metabolismo,
toxinas, etc., sin embargo muy poco se ha enfocado a los procesos
de
fermentación
y
desarrollo
de
tecnología,
para
su
producción.(30) .
Consideramos
de
importancia
estudiar
el
comportamiento
y
selección de cepas nativas de B.thuringiensis, propagadas en
diferentes medios de fermentación, así como el efecto que ejercen
dichos medios sobre la toxicidad de la S-endotoxina producida
hacia insectos Lepidópteros de importancia agrícola.
En base a lo anteriormente expuesto en el Centro Nacional de
Protección Vegetal del Ministerio de Agricultura y Ganadería en
Managua, Nicaragua se implemento un proyecto de investigación
para el desarrollo de una tecnología propia para la producción
de bioinsecticida a partir de B.thuringiensis.
HIPOTESIS
Se pueden recuperar y seleccionar cepas nativas de
Bacillus thuringiensis de suelos de Nicaragua con una
buena
actividad
Spodoptera
exigua.
tóxica
contra
Heliothis
zea
y
Para la realización de este trabajo nos planteamos los siguientes
objetivos:
1-
identificación
serológica
de
cepas
nativas
de
Bacillus thuringiensis aisladas de suelos de Nicaragua.
2- Seleccionar la cepa mas tóxica contra los insectos blancos
Seliothis zea
y Spodoptera exigua.
3- Optimizar las condiciones para la producción de 5-endotoxina
con la cepa seleccionada en diferentes medios de cultivo a nivel
de laboratorio y planta piloto.
ORIGINALIDAD
Identificación
y
selección
de
las
primeras
cepas
de
Bacillus thutingiensis aisladas de suelo de Nicaragua, como parte
de un desarrollo biotecnológico que resuelva problemas básicos
y aplicados para Nicaragua en el campo de Bioinsecticidas.
II. ANTECEDENTES
2.1 . ASPECTOS GENERALES DE Bacillus thuríngiensíe.
2.1.1. AISLAMIENTO, IDENTIFICACION Y CLASIFICACION.
El primer aislamiento de B. thuringiensis fue de larvas enfermas
del gusano de la seda Bombyx mori en 1902. En 1915 investigadores
japoneses demostraron que solamente cultivos esporulados eran
tóxicos a las larvas de éste insecto por eso sugirieron que la
rápida toxicidad observada era debido a alguna toxina. En el
mismo
año
Berliner
aisló
una
cepa
asignándole
el
nombre
thuringiensis por la provincia de thuringia de las larvas de la
palomita
de
la
harina
del
mediterráneo
Anagasta
kuheniella.(40,49).
A partir de 1950 otros investigadores aislaron de varios insectos
otras bacterias cristalíferas. Bacillus anduzae fue aislada por
Vago en 1952 a partir de Bombyx mori, Bacillus dendrolimus fue
aislado de Dendrolimus sibericus por Talalaev en 1956. Bacillus
cereus var. galleriae fue aislada de la palomilla de la cera,
descrita y aislada por Isakova en 1958. Bacillus entomocidus var.
suhtoxicus
y
Bacillus
entomocidus
var.
entomocidus
aisladas a partir de Plodia interpunctella
fueron
y Aphonia gulaxris
respectivamente por Steinhaus en 1951.(54).
Aunque el descubrimiento de B. thuringiensis
primera
parte del
siglo veinte,
su
tomó lugar en la
desarrollo
como
control
biológico de insectos-plagas fue lenta, particularmente debido
a
una
larga
y
permanente
confusión
entre
las
diferentes
variedades. El primer intento importante para diferenciar y
clasificar las primeras cepas aisladas fue hecho por Heimpel y
Angus, 1958, usando carácteres morfológicos y bioquímicos.(55).
La introdución de serovariedades basadas en flagelos y
H-antígenos
(De Barjac y Bonnefoi 1962) y estudios extra de
bioquímica
facilitaron
que
claramente
distinguidas.
éstas
Todas
cepas
las
aisladas
cepas
fueran
aisladas
más
fueron
identificadas como H-serotipos de una especie B. thuringiensis.
El método de aglutinación flagelar ha probado ser hasta la fecha
el más sensible, específico y rápido.(De Barjac 1981). En 1968
se creó el Centro Internacional de Control Biológico en París,
Francia.(13,15,16).
Un mayor avance ocurrió cuando Dulmage aisló la cepa de
B.thuringiensis clave HD-1 var. kurstaki. Esta cepa presentó 16
veces más potencia que la var.
thuringiensis contra Heliotis
virescens una de las mayores plagas en algunos cultivos de los
E.U.A.. Así en un período de pocos años todo E.U.A. utilizaba la
cepa HD-1.{19)El siguiente gran avance ocurrió en 1976 con el descubrimiento
de la variedad israelensis, que tiene gran toxicidad para los
mosquitos (Diptera) y mosca negra (Simulidae) (14) . También es de
importancia el aislamiento de las variedades llamadas tenebrionis
y san diego, que tienen el mismo H-antígeno de la serovariedad
morrisojii (H8a8b) de la cual difieren por su patogenicidad a las
larvas de Coleóptera.(16,33,39).
Krywienczyk,
Dulmage y Fast
1978, demostraron
que un mismo
serotipo puede tener diferente toxicidad contra varias especies
de insectos. Ellos probaron que B.thuringiensis var. kurstaki
(serotipo 3ab) , tiene diferente toxicidad contra los insectos
plagas T.ni y H.virescens. Ellos suguieren que el serotipo 3ab
puede ser separado en dos subgrupos (patovariedades) designados
como k-1 y k-73.(41).
Rodríguez y col. 1990, descubrieron una nueva subespecie, con una
única forma triangular del cuerpo parasporal cristalino, la cual
fue nombrada subesp. neoleonensis. Esta cepa fue aislada del
suelo
colectado en Guanajuato, un estado del centro de México
e identificada en la Universidad Autónoma de Nuevo León, México,
también Rodríguez y Galán en 1988, aislaron e identificaron una
nueva
cepa
de
B.thuringiensis
la
cual
fue
designada
como
subespecie mexicanensis.(16,53).
La actual colección internacional de cepas de
aisladas
de
diferentes
países
asciende
a
B.thuringiensis
1600
las
cuales
pertenecen a 34 serovariedades incluidos 27 subgrupos antigénicos
y 7 subgrupos. (16) . En la tabla 1 se muestra la clasificación de
B. thuringiensis.
2.1.2. HABITAT DE B.thuringiensís.
Esta bacteria es un parásito facultativo de insectos, así como
un saprofito en el suelo. En condiciones adversas sus endosporas
pueden permanecer en vida latente por años, al encontrarse en un
medio ambiente propicio como el cuerpo de un insecto, medios de
cultivo, etc., ocurre la germinación de las esporas que da lugar
a una multiplicación activa de células vegetativas que presentan
exigencias nutricionales. Como el cuerpo de un insecto es un
sistema cerrado, con el paso del tiempo se suscitan una serie de
2.1.3 MORFOLOGIA CELULAR
El organismo es un miembro del grupo I del género Bacillus, el
cual también incluye B. subtilis, B. licheniformis, B.megaterium,
B.cereus
y
B.anthracis.
Está
muy
relacionado
a
B.cereus,
distinguible solamente por la presencia de un cuerpo parasporal
y
por los antígenos flagelares.(55).
Las células vegetativas son bacilos gram-positivos, 2 a 5 x 1 Jim,
con
flagelos
perítrieos,
se
divide
por
fisión
binaria
y
frecuentemente forma cadenas. Un cristal bipiramidal parasporal
es formado durante la esporulación.(55).
2.1.4 TOXINAS PRODUCIDAS POR B.thuringiensis.
Hay 7 diferentes toxinas descritas en cepas de B.thuringiensis,
las de mayor producción con actividad insecticida son:
- a- exotoxina, llamada también lecitinasa o fosfolipasa C.
- 6- exotoxina, conocida como factor mosca.
- 8- endotoxina, el cristal parasporal protéico.(49).
0C-EXOTOXINA.
Esta
toxina
termolábil,
es también
la
cual
formada por
se
acumula
B. cereus. Es una en'zima
durante
el
crecimiento
exponencial, es capaz de lisar muchos tipos de células. Parece
que aumenta la acción de las otras toxinas. Fuella primer toxina
aislada. Tiene 23 Kilodaltones (KDa).(34,55).
Debido a que el fosfolípido lecitina de la membrana celular es
usado a menudo como sustrato, este tipo de enzimas se denominan
lecitinasas o fosfolipasas.(7).
g-EXOTOXINA
También conocida como "factor mosca" es una toxina termoestable
secretada
por
algunas
variedades
durante
el
crecimiento
exponencial, B.thuringiensis produce cerca de 50 mg/l.(55). Es
derivada de Adenosina, soluble en agua, la cual actúa como un
inhibidor de nucleotidasa. Es altamente tóxica para moscas y
otros insectos, bloqueando la mitosis celular. Es un potente
inhibidor
de
ADN-dependiente
de
ARN-polimerasa
en
células
bacterianas y de mamíferos. En células sanguíneas de humanos, ha
sido demostrado que incrementa las aberraciones cromosomales.
Descubierta por Burgerjon, Heimpel y Angus.(31,34).
5-ENDOTOXIMA
Es una protoxina formada durante los estadios III y V de la
esporulación. El cristal parasporal está compuesto de subunidades
glicoprotéicas ( 5 % de carbohidratos y el resto proteína). El
azúcar está compuesto de hexosas neutrales (glucosa y mañosa, 38%
y 1.8% respectivamente del peso seco del cristal). Los azúcares
están unidos a la serina y treonina. Cada subunidad tiene un peso
molecular de cerca de 134,000 daltones. El porcentaje aproximado
de aminoácidos presentes en la 5-endotoxina (hay que señalar que
estos varían entre subespecies): Aspártico 11%; Glutámico 12%;
Leucina 9%; Arginina 8%; Fenilalanina 6%; Tirosina 6%; Treonina
5%; Serina 5%; Prolina 5%; Valina 5%. La formación de enlaces
cruzados S-S, hacen más insoluble el cristal.(32).
La protoxina es moderadamente termoestable. La toxina cristalina
es soluble e hidrolizada a pH mayor a 9. Todas las especies de
insectos poseen un jugo intestinal alkalino, el cual disuelve la
protoxina.
Las
proteasas
alkalinas
del
insecto
entonces
hidrolizan la protoxina a fragmentos tóxicos.(31,55).
Todos
los
cristales
de
B. thuringiensis
específicos
para
Lepidópteros contienen proteínas de 130 a 140 KDa, las cuáles
pueden ser agrupadas en tres tipos según el peso molecular de la
protoxina.(34) .
Tipo A: El cristal está constituido de protoxinas de 130 a 133
KDa, los cuáles son procesados por tripsina a toxinas de 60 KDa.
Tipo B: La protoxina de 140 KDa genera un fragmento tóxico de 55
KDa.
Tipo C: La protoxina de 135 KDa genera un fragmento tóxico de 63
KDa. El fragmento tóxico está localizado en la unidad N-terminal
de la protoxina. La toxina reacciona con la membrana de las
células epiteliales del intestino, las cuales consecuentemente
se hinchan y lisan causando aventualmente la muerte del insecto.
(34) .
B. thuringiensis subspecie israelensis tiene 3 proteínas, las
cuáles tienen un peso molecular de 28, 70 y 135 KDa, cada una es
inmunológicamente diferente. Las proteínas son desdobladas por
tripsina de la siguiente forma: La proteína de 28 KDa genera
fragmentos tóxicos de 26, 25, 23 y 22 KDa. La proteína de 70 KDa
genera un fragmento tóxico de 38 KDa. La proteína de 135 KDa
genera
fragmentos
solubilizada
posee
tóxicos
dos
de
94, 72, y
actividades
65 KDa.
biológicas;
La
toxina
larvicida
y
citolítica general(hemolítica). La actividad hemolítica reside
en la proteína de 28 KDa.(34 .
El cristal de B.thuringiensis variedad israelensis contiene una
amplia variedad de proteínas, mientras el cristal de la mayoría
de las otras cepas consiste de una proteína de 130 a 140 KDa
exclusivamente.(2).
Han sido propuestas varias hipótesis en los eventos toxicológicos
relacionados a la acción de la toxina del cristal parasporal.
Ninguno ha
sido probado. Estos
incluyen:
Separación de
las
células del intestino y su desunión de la membrana; el incremento
en la actividad de secresión de las células epiteliales del
intestino;
incremento
en
la permeabilidad
de
la
pared
del
intestino a iones de sodio, con una lenta velocidad de entrada
de la glucosa en la hemolinfa; parálisis del intestino y alguna
parálisis general del cuerpo.(2).
El modo de acción de
la toxina
en general
es que produce
parálisis intestinal, lo cual provoca una falta de alimentación
y lesiones que favorecen el crecimiento y la proliferación del
bacilo, con ello resulta una septicemia como la principal causa
de muerte de la larva que ocurre entre las 24 y 96 horas después
de haber ingerido la mezcla de esporas y cristales.(10) .
2.1.5. ACTIVIDAD INSECTICIDA Y BIOENSAYOS CON B.thuringiensis
Antes
de
1970,
los
productos
de
B.thuringiensis
eran
estandarizados en base al conteo de esporas y su potencia medida
en términos de DLS0, esto es, que dosis mataba el 50% de las
larvas de una especie dada de insectos. Luego se demostró que no
había
correlación entre la DL50 y
el número de esporas.
La
Estandarización Industrial fue originalmente un estricto problema
regional y cada fábrica registraba su producto en su país. Así
en diferentes países se desarrollaron métodos de bioensayos
utilizando diferentes estándares y diferentes insectos blancos.
Obviamente cada fabricante teóricamente podía usar su propia
preparación
estándar
y
producir
un
producto
de
constante
calidad.(23,26).
Muchos patólogos de insectos sugirieron bioensayos alternativos,
pero no fue hasta 1971 que Dulmage y col. desarrollaron un método
de bioensayo que permitía estandarizar
las formulaciones de
compañías de diferentes países.(25,55).
En
los
Estados
Unidos,
el
valor
de
16,000
Unidades
Internacionales de Potencia(UIP) /mg de extracto, para el estándar
HD-l-S-1971 se determinó experimentalmente, comparándolo con el
E-61(Francia) en bioensayo contra el insecto-blanco
»
T.ni Hb.. El valor 16,000 UIP fue sin embargo, arbitrario y se
estableció
experimentalmente
lo
siguiente:
que
HD-l-S-1971
(serotipo 3a,3b) fue 18 veces más activo que E-61 (serotipo 1)
contra T.ni. La comparación que se hizo entre las dos unidades
es válida solamente para este insecto.(9,23).
2.2. PARAMETROS DE FERMENTACION.
2.2.1 METABOLISMO
B. thuringiensis es una bacteria quimioheterótrof*, la cual oxida
aeróbicamente
orgánicos,
al
los carbohidratos para
ser oxidados
convertirlos
en
ácidos
forman dióxido de carbono.
Este
organismo exibe un complejo metabolismo, el cual inicialmente
emplea la ruta Embden-Meyerhoff-Pamas (EMP) , convirtiéndose a
un
modificado
del
ciclo
del
Acido
Tricarboxílico
(TCA)
al
comienzo de la esporulación.(55).
El modelo metabólico puede ser descrito como trifásico:
crecimiento exponencial, transición y esporulación.
2.2.1.1 FASE DE CRECIMIENTO EXPONENCIAL (TROPOFASE).
El catabolismo de azúcares simples ocurre en un 93 a un 100 % por
la ruta EMP y de 0 a 7 % por la ruta fosfato-pentosa. Los
metabolitos intermediarios formados son piruvato, acetato y poliS-OH-butirato, principalmentelos los dos últimos.(55).
Bajos niveles de amilasa son formados durante la parte media y
alta de la fase logarítmica de crecimiento. La cantidad formada
depende
marcadamente
de
la
variedad
bacteriana,
pero
es
independiente de la concentración de almidón y glucosa. Para el
aislado HD-1 de la var. kurst&kí, la enzima tiene un pH óptimo
de 6 y se requiere calcio y manganeso para una máxima actividad.
(63) .
El nitrógeno es asimilado como amonio o aminoácidos, los cuáles
son transaminados o desaminados para producir los aminoácidos
requeridos por la célula. Durante el crecimiento exponencial, la
formación
de
exoproteasa
es
normalmente
reprimida
por
la
presencia de iones amonio. Una mezcla de aminoácidos suprime la
formación de exoproteasa. (28).
Las a-amilasas hidrolizan enlaces alfa-1,4 del almidón. Parece
probable que su única función es para degradar los polímeros en
el medio y así suplir a la bacteria con una fuente asimilable de
nutrientes.(50).
La máxima síntesis de enzimas extracelulares normalmente ocurre
antes
de
la
esporulación
en
la
parte
tardía
de
la
fase
exponencial y la parte temprana de la fase de crecimiento. (50) .
2.2.1.2
FASE
DE
TRANSICION
Cerca de la mitad de la fase logarítmica, cuando los azúcares
simples han sido consumidos aproximadamente a la mitad, enzimas
del ciclo TCA son formados.
Durante la fase de transición, el acetato, piruvato y poli-S-OHbutirato son catabolizados vía el ciclo modificado TCA, por otro
lado
la
actividad
proporción
del
de
la
ruta
catabolismo
de
EMP
decrese
estos
baja,
sin embargo cantidades
aminoácidos
están
presentes
el
La
orgánicos
es
significativas
de
ácidos
marcadamente
en
lentamente.
medio.
En
este
caso,
aminoácidos tales como glutamato, aspartato y alanina son también
catabolizados,
sirviendo
como
fuente
de
carbón
y
nitrógeno.(8,65).
2.2.1.3.
FASE DE
ESPORULACION
Aproximadamente 3 horas después de comenzada la fase estacionaria
(entre los estadios II y III de la esporulación), comienza la
formación del cristal parasporal. Al mismo tiempo, la membrana
parasporal es completada y la producción de exoproteasas decrece
marcadamente. La síntesis completa de la endotoxina precede la
maduración de la espora por cerca de 2 horas.(55) .
Durante la formación de la espora y el cristal, el metabolismo
-'.).• i l • > • .'
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"i'-r y . 1
del rompimiento de las proteínas de la célula y el medio. Estos
son usados para la síntesis de proteínas y son fuente de energía
y carbón. Las proteínas de la espora tienden a derivarse de la
hidrólisis de las proteínas de la célula vegetativa, mientras que
las proteínas del cristal tienden a incorporarse más aminoácidos
derivados del medio.(47,65),
La masa de las esporas es por lo menos 15% de la masa previa de
la célula vegetativa y el cristal es cerca de 12.5 a 17% de la
misma. Una buena producción de esporas es de 5 a 10 x 109 /
mi.(55).
2.2.2. CONDICIONES DE CRECIMIENTO.
El rango de temperatura de crecimiento de B. thuringiensis es de
20 a 42°C, pero el crecimiento en los límites de este rango,
generalmente resulta en pérdida de la producción de endotoxina.
La producción óptima de endotoxina ocurre de 28 a 30°C; sin
embargo el crecimiento es lento a 28°C. La temperatura normal de
fermentación es así 30°C.(55).
El crecimiento ocurre en el rango de pH 5.6 a 8.5. El pH inicial
es 6.8 a 7.2, típicamente decrese a 5.8, ya que es liberado
acetato, cuando éste es consumido aumenta a 7.5 a 8.0 (55).
Muchas variedades son capaces de utilizar las siguientes fuentes
de carbón: glucosa, fructosa, almidón, maltosa, ribosa, glicerol,
ácidos orgánicos, glutamato y otros posibles aminoácidos, sin
embargo, la ausencia de carbohidratos metabolizables se reporta
que resulta en una defectuosa esporulación.(47).
El oxígeno es requerido para el crecimiento, el nitrato es
también capaz de actuar como aceptor de electrones.(55).
Los medios comerciales han usado fuentes de nitrógeno complejas
como: harina de maíz, licor de maíz, harina de pescado, harina
de semilla de algodón, caseína, etc.. Los medios son algunas
veces suplementados con extracto de levadura y/o peptona. La
omisión de estos suplementos influye en la esporulación y reduce
la producción de 8-endotoxina. (55).
2.2.3. MEDIOS DE CULTIVO
Para la producción de cristales se han desarrollado una gran
variedad de medios de fermentación, sintéticos, semisintéticos,
hasta
medios
de
cultivo
a base
de productos
completamente
naturales. Un medio mínimo que soporta un abundante crecimiento,
esporulación y formación de cristal es descrito por Nickerson y
Bulla como sigue (todas las cantidades son gramos por litro en
agua destilada) : MgS04.7H20, 0.3; MnS04.H20, 0.05; CaCl2, 0.08;
ZnS04. 7H20, 0.005; CuS04.5H20, 0.005; FeS04.7H20, 0.0005; K2HP04 ,
0.5; (NH4)2S04, 2; Glucosa, 1; y glutamato, aspartato o citrato,
2. El trabajo de Rajalakshmi y Shethna demostró que el medio
glucosa-sales minerales y alguna cantidad de aspartato, arginina,
glicina, prolina, asparagina, metionina, glutamina o cistina
soporta el crecimiento.(48, 52) .
Dubois 1968, describe un procedimiento lote de laboratorio para
la producción de B. thuringiensis usando un medio base de:
Glucosa, 2; Bacto peptona(Difco) , 2; (NH4)2S04, 3; K2HP04, 17.4;
MgS04, 0.03; CaCl.H.O, 0.018; FeS04.7H20, 0.0075; CuS04. 5H20,
0.075; ZnSC^. 7 H O, 0.075; MnS04.4H?0, 0.04.(18).
En 1969, Pendleton, describe un exitoso medio a base de: harina
de pescado 2%, harina de almidón 1%, CaC03 0.1%, Niacina 0.001%,
y una mezcla de sales.(49).
Para 1970, Dulmage reportó el aislamiento de B. thuringiensis HD-1
var. kurstaki, la cual produce en fermentaciones altos niveles
de 8-endotoxina, utilizando un medio que contiene: triptona,
10.0; dextrosa, 5.0; almidón, 5.0; extracto de levadura, 2.0;
K2HP04, 1.0; y KH2P04, 1.0, recomendando el uso de substratos
baratos como son: harina de semilla de algodón, 10.0; y harina
de soya, 15%(19). En el mismo año reportó también la producción
del
complejo
espora
S-endotoxina
para
doce
variedades
de
B.thuringiensis en dos medios de fermentación basándose uno en:
triptona, 10.0; dextrosa, 5.0; almidón de maíz, 5.0; extracto de
levadura, 2.0; K2HP04, 1.0; KH2P04, 1.0; y el otro en harina de
semilla de algodón, 10.0; bacto peptona, 2.0; dextrosa, 15.0;
extracto de levadura, 2.0; MgS04.7H20,
0.3; FeS04. 7H20, 0.02;
ZnS04.7H20, 0.02; y CaC03 , 1.0; obteniéndose resultados de una
gran variabilidad en la actividad tóxica de las preparaciones
derivados de los medios y al medir la actividad por bioensayos,
ésta no correspondía con la cuenta de esporas, ni con el rango
de crecimiento del organismo, concluyendo que la toxicidad de
éstas preparaciones varía no sólo con la cepa aislada, sino
también con el medio de fermentación usado.(21).
Más
tarde,
endotoxina
en
de
1971
16
Dulmage,
aislados
de
recuperó
complejos
B.thuringiensis
espora-8-
var.
alesti
(serotipo 3a) y de dos aislados de B. thuringiensis var. kurstaki
(serotipo 3a3b) cultivados en tres medios de fermentación a base
de sales minerales y variabilidad en la fuente de carbono y
nitrógeno tal como: triptona, proflo, harina nutrisoya, almidón
de maíz, extracto de levadura y bactopeptona. Demostró que la
cantidad
de
8-endotoxina producida
por
los
aislados
varía
ampliamente dependiendo del aislado y medio sobre el cual crece,
así la actividad insecticida de preparaciones de B.thuringiensis
no puede ser estimada por serotipos, ya que algunos aislados del
mismo serotipo produjeron diferentes actividades insecticidas,
cuando se cultivaron en medios diferentes.(22).
Así mismo en 1973, Dulmage y de Barjac desarrollaron la
fermentación de un nuevo aislado de B.thuringiensis HD-187 e
identificado
como serotipo 5
(5a,5b) el
cual produce
altos
rendimientos de 8-endotoxina, muy superiores a los aislados
anteriormente ensayados, cultivándolo en tres medios de
fermentación 1ro.: el B-4 el cual contiene harina de semilla de
algodón al 1%, el 2do. : el B-4b al 2% y el 3ro. : el B-8 al 2% mas
líquido de remojo de maíz al 1.0%, todos con peptona al 0.2%;
glucosa
1.5%;
extracto
de
levadura
0.2% y
sales
minerales
obtuvieron una actividad de 2,000 x 106 UIP por litro de caldo
cosechado y el producto tenía una potencia de 200 x lOVmg. (24) .
Scherrer
y
col.
1973,
observaron
que
un
incremento
en
la
concentración de glucosa aumenta las inclusiones cristalinas con
un alto contenido proteico y actividad insecticida. La máxima
producción
de
delta-endotoxina
fué
obtenida
en
un
medio
semisintético con una concentración de glucosa de 6 a 8 g/1. (57) .
Goldberg, Sueh, Battat y Klein 1980, optimizaron un medio para
la producción del complejo espora-8-endotoxina de B. thuringiensis
a escala piloto (con dos termentadores de 500 1. cada uno) con:
glucosa, 30; peptona de soya, 2.0; extracto de levadura, 4.5;
líquido de remojo de maíz, 5.0 ml(76 % de sólidos); KC1, 3.0;
(NH4)2S04,
3.0;
H3P04,
7.0; MgS04,
2.0;
CaCl2
-H20
,
0.036;
FeSOj. 7H20, 0.0135; CuS04.5H20, 0.075; ZnS04.7H20, 0.075; MnSo4.4H20
0.04; por cada 1000 mi de agua destilada a 32°C con aireación de
0.3 W M ,
agitación de 120 a 160 r.p.m., pH
6.2 a 7.4 con
producción de 4 x 109 U.F.C./ml. en 60 horas aproximadamente. (30)
Couch y Ross 1980, recomendaron el uso de productos naturales
como fuentes de nitrógeno, tales como: harina de pescado, harina
de semilla de algodón, líquido de remojo de maíz, harina de soya,
levadura autolizada y caseína. Las fuentes de carbono incluyen:
productos de maíz hidrolizados, almidón y dextrosa, las cuáles
son adecuadas para disminuir costos de mercado.(10).
En 1981. Luthy y Ebersold, desarrollaron un medio complejo basado
en ingredientes baratos, con la siguiente composición
(g/1):
harina de soya, 35; almidón de maiz, 12.5; extracto de malta,
2.0; K2HP04. 2H20, 1.3; MgS04.7H20,
0.2; CaCl2.2H20,
0.08; MnS04
• 7H20, 0.08; el pH se ajustó a 7.2 y con menos de 48 horas de
incubación lograron una esporulación total.(42).
Solama y col. 1981, proponen el uso de varios
subproductos
industriales
de
y
agrícolas,
incluyendo
algunos
los
ya
mencionados y otros como: levadura de forraje, sangre de res,
subproductos secos de aves, suero de queso, así como semillas de
leguminosas incluyendo: habas, garbansos, judías, cacahuates y
lentejas, todos incorporados a un medio base conteniendo(g/l):
glucosa, 6.0; extracto de levadura, 2.0; K2HP04, 4.3; CaC03, 2.0;
y sales minerales en una concentración de 2%, para investigar su
potenciales en mantener la producción de los complejos espora-8endotoxina de dos variedades kurstaki y entomocídus de
B.thuringiensis, encontrando que la producción de esporas en
estos subproductos, fueron diferentes de acuerdo a la variedad
de B.thuringiensis probada, haciendo notar que en las mezclas de
estos productos con levadura de forraje, siempre resultaron más
altas las cuentas de esporas y productos finales para ambas
variedades, cuando se agregaba sangre de res, indicando que estos
subproductos fueron también eficientes en mantener la biosíntesis
de S-endotoxina con
apreciable actividad
insecticida
contra
H.armígera. Además los resultados indican que las leguminosas,
soportan altas producciones de esporas , para cada variedad
probada.(59).
Wakisaka
y
col.
1982,
reportaron altos
rendimientos
de
8-
endotoxina en un medio que contenía 330 ng de potasio por mi.,
en cambio un medio deficiente de potasio, condujo a la formación
de gránulos de ácido poli-B-hidroxibutírico. que son inactivos
al gusano de seda. Al suplementar un medio deficiente de potasio
con 0.1 % de KH2P04, KCl, -KN03 y acetato de potasio, condujo a la
formación de 8-endotoxina. Esto sugiere que el potasio juega un
papel importante en aislados de B.thuringiensis subesp. kurstaki
y aizawi para la esporulación y formación del cristal.(65).
Medrano y col. 1990, obtuvieron un bioinsecticida utilizando 3
termentadores (planta piloto), con 9 litros de capacidad de
trabajo, utilizaron el siguiente medio: melaza de caña de
azúcar(45 % de azúcares reductores), 0.1 %; harina de soya, 2.0
%; líquido de remojo de maíz, 3.0 %; CaCo3, 0.10 %. Durante el
proceso fueron medidos diferentes parámetros de fermentación,
tales como: demanda de oxígeno, coeficiente de transferencia de
oxígeno, KLa, número de esporas, consumo de azúcares reductores,
y otros, variando la proporción de aireación (WM) , agitación
(r.p.m.), tamaño del inoculo (% V/V), etc.(45).
Podemos señalar en base a lo anterior que existe la factibilidad
de utilizar una amplia variedad de subproductos agroindustriales
de
fácil
disponibilidad
y
bajo
costo
en
los
medios
de
fermentación de este microorganismo, para economizar los costos
del
producto
sin
que
disminuya
la
toxicidad
de
la
cepa
seleccionada. Por lo tanto se requiere de una selección adecuada
de la concentración y tipo de fuente de carbono y nitrógeno que
nos asegure un buen proceso de esporulación con la producción
respectiva de la S-endotoxina en el producto final.
Para el crecimiento de B. thuringiensis se requiere ademas de los
nutrientes, el oxígeno. En los procesos de fermentación aeróbicos
uno de los aspectos más críticos es la transferencia
de oxígeno al caldo de fermentación, debido principalmente a la
baja solubilidad del oxígeno en el agua (aproximadamente 7 ppm
a 1 atm.), La demanda de oxígeno de un proceso de fermentación
es satisfecha normalmente mediante aereación y agitación del
caldo de fermentación, sin embargo la productividad de la mayoría
de las fermentaciones está limitada por la diponibilidad del
oxígeno. (60). En la literatura existe publicada una cantidad
mínima de ejemplos prácticos para el escalamiento de reactores
a nivel planta piloto e industrial. La medición del coeficiente
de transferencia de oxígeno (KLa) es conocido como uno de los
criterios mas
(escalamiento),
adecuados para
ademas
el paso de una
permite
evaluar
escala
la
a
otra
capacidad
de
transferencia de oxígeno de un bioreactor determinado. El KLa
varía durante la fermentación por varias razones, entre ellas por
el aumento de la viscosidad, los problemas de espuma y el aumento
de la concentración celular.(51).
2.3 PRODUCCION COMERCIAL DE B.thuringiensis
B. thuringiensis var. thuringiensis fue el organismo uti 1 i zado
para toda la producción comercial de bioinsecticidas a nivel
mundial hasta 1970.(55),
La primer producción comercial de B. thuringiensis comenzó en
Francia por 1938, bajo el nombre comercial de
u
Sporeine Ru , la
cuál utilizaba una fermentación semisólida.(55).
También en Estados Unidos en 1957, la compañía Pacific Yeast
Products
creó
B. thuringiensis
las
primeras
con
el
nombre
preparaciones
de
comerciales
"thuricideRu.
En
1959,
de
la
compañía Nutrile Products Inc. ingresó al mercado con su producto
"Biotrol*".
No
obstante
los usos
de
éstos productos
fueron
limitados por ser de baja actividad y por no contar con cepas de
alta potencia y la estandarización adecuada.(5).
Un considerable trabajo técnico se desarrolló en ésta área de
1960 a 1969, durante el cual se registraron 8 patentes. De estos
procesos, siete fueron en fermentación sumergida.(55).
La
producción
comercial
de
B.thuringiensis
var.
israelensis
comenzó en 1980 a 1981 por éstas compañías y una fábrica
francesa. En los años 1981-1982, la producción mundial fue 1.6
a 2.3 millones de kg por año, con una producción en Estados
Unidos de cerca de 680 mil kg por año y una producción en la URSS
de cerca de 910 mil kg. por año.(55) . En China se produjeron 732
mil Kg. de bioinsecticidas de B.thuringiensis en 1989, para el
control
de
insectos
trasmisores
de
enfermedades
y
plagas
agrícolas.(62). En la actualidad los productos comerciales de
B.thuringiensis son producidos en varios países, principalmente
Francia, E.U.A., y Rusia. El uso de esporas y
cristales de
B.thuringiensis para el control de plagas se ha incrementado
gracias al desarrollo de nuevas y potentes formulaciones.(5). En
la
tabla
2
se
muestran
algunos
bioinsecticidas
de
B.thuringiensis.
El mercado actual de los agentes de control biológico representa
el 2 % del mercado total de insecticidas que asciende a 4
billones de dólares.(11).
Tabla 1. Clasificación de cepas de Bacillus
Serovar.
Abrev.
1
2
3
thuringiensis
f initinrus
alesti
THU
FINALE
3a3b
4a4b
4a4c
5a5b
kurstaki
sotto
kenyae
galleriae
KUR
SOT
KEN
GAL
5a5c
6
7
8a8b
8a8c
8b8d
canadensis
entomocidus
aizawai
morrisoni
ostriniae
nigeriensis
CAN
ENT
AIZ
MOR
OST
NIG
9
10
llallb
Halle
12
13
14
15
16
17
18
19
20a20b
20a20c
tolworthi
darmstadiensis
toumanoffi
kyushuensis
thomosoni
pakistani
israelensis
dakota
indiana
tohokuensis
k umamo t o en s i s
tochigiensis
yunnanensis
pondicheriensis
TOL
DAR
TOU
KYU
THO
PAK
ISR
DAK
IND
TOH
KUM
TOC
YUN
PON
21
22
23
24
colmeri
shandongi ens i s
japonensis
neoleonensis
COL
SHA
JAP
NEO
25
26
27
coreanensis
silo
mexicanensis
COR
SILO
MEX
í-antg.
thuringiensis.
Primera descripción
Berliner, 1915; Heimpel y Angus,1958;
Heimpel y Angus, 1958;
Toumanoff y Vago,1951; Heimpel y
Angus, 1958.
de Barjac y Lemille, 1970;
Ishiwata, 1905; Heimpel y Angus,1958;
Bonnefoi y de Barjac, 1963;
Shvetsova, 1959; de Barjac y
Bonnefoi, 1962;
de Barjac y Bonnefoi, 1972;
Heimpel y Angus, 1958;
Bonnefoi y de Barjac, 1963;
Bonnefoi y de Barjac
Gaixin, Ketian, Minghus y Wingmin, 1975;
de Barjac, Frachon, Rajagopalan y Cosmao,
no publicado.
Norris, 1964; de Barjac y Bonnefoi, 1968;
Krieg, de Barjac y Bonnefoi, 1968;
Krieg, 1969; •
Obba y.Aizawa, 1979; *
de Barjac y Thopson, 1970;
de Barjac, Cosmao, Shalk y Viviani, 1977;
de Barjac, 1978;
De Lucca, Simonson y Larson, 1979;
De Lucca, Simonson y Larson, 1979;
Ohba, Aizawa y Shimizu, 1981;
Ohba, Ono, Aizawa y Iwanami, 1981;
Ohba, Ono, Aizawa y Iwanami, 1981;
Wan-Yu, Qi-fang, Xue-Ping y You-Wei, 1979;
de Barjac, Frachon, Rajagopalan y Cosmao,
no publicado.
De Lucca, Palmgren y de Barjac, 1984;
Ying, Jie y Xichang, 1986;
Ohba y Aizawa, 1986;
Rodríguez-Padilla, Galan-Wong, de Barjac,
Dulmage, Taméz-Guerra y Román-Calderón,
1988;
de Barjac y Lee, no publicado.
de Barjac y Lecated, no publicado.
Rodríguez-Padilla y Galán-Wong, 1988;
N.B. tipo no móvil: wuhanensis WUH Hubei Inst. Microbiol. 1976.
Tomado de: de Barjac y Franchon 199 0.(15).
TABLA 2. BIOINSECTICIDAS DE Bacillus thuringiensis.
BACTERIA
Bacillus
thuringiensis
Endotoxins
NOMBRE COMERCIAL
Dipel
Thuricide
Biotrol
Agritrol
Bakthane
Parasporin
Certan
Bactospeine
Leptox
Bug-Time
Plantibac
Sporeine
Entobacterin 3
Dendrobac i11ine
BiospQr
Bathurin
Baktukal
Dipel
Insektin
Exotoxina
Toxobakterin
Eksotoksin
var.israelensis Vectobac
Teknar
Bact irnos
PRODUCTOR O COMPAÑIA
Abbott labs.
Sandoz, Inc.
Nutrilite Prods.Inc.
Merk & Co.
Rohm & Haas
Grain Proc.lab.
Sandoz,Inc.
Biochem.Prod. S.A.
Biochem.Prod. S.A.
Biochem.Prod. S.A.
Procida
L.I.B.E.C.
Glavmikrobioprom
Glavmikrobioprom
Farbwerbe-Hoechst
Chemapol-Biokrma
Serm Zavod Kalanov.
Bajo Lie. de Abbott
Glavmikrobioprom
Glavmikrobioprom
Glavmikrobioprom
Abbott labs.
Sandoz, Inc.
Biochem.Prod.S.A.
PAIS
U.S.A.
U.S.A.
U.S.A.
U.S.A.
U.S.A.
U.S.A.
U.S.A.
Francia
Francia
Francia
Francia
Francia
Rusia
Rusia
Alemania
Checoslo.
Yugoeslav.
Bulgaria
Rusia
Rusia
Rusia
U.S.A.
U.S.A.
Francia
III.MATERIALES Y METODOS
3.1 AISLAMIENTO DE CEPAS NATIVAS
3.1.1 AISLAMIENTO DE MUESTRAS DE SUELO.
Las cepas de B.thuringiensis se obtuvieron con el siguiente
método: Se recolectaron muestras de suelo aproximadamente de 200
g.de diferentes regiones del país.Un gramo representativo de cada
muestra de suelo, fue puesto en tubos de ensayo con 9 ml.de agua
estéril, estos se pasteurizaron a temperatura
60-80 °C. durante
20 minutos, luego se realizó una dilución en serie para obtener
10s - 107
tomando del tubo anterior un mi el cual se agregó al
siguiente tubo con 9 mi. de agua estéril y agitando el tubo en
el vortex cada vez antes de tomar el mi. con la pipeta. Del
último tubo se tomó siempre con la pipeta y se colocó
por 0.1
mi. en 4 platos Petri con agar nutritivo. Los platos Petri
inoculados se mantuvieron 24 horas en incubación a 30°C. Después
del tiempo de incubación se hicieron frotis de cada una de las
colonias que crecieron en la caja, seleccionando a las que
mostraban
esporulación.
A
las
24
horas
se
repitió
el
procedimiento del inciso anterior, hasta seleccionar solamente
colonias típicas con producción de esporas y cristales. Las
colonias
esporuladas
y
productoras
de
cristales
fueron
resembradas rayando cajas Petri con agar nutritivo por triplicado
y se incubaron a 30°C, se repitió la tinción, cada 24 horas,
hasta observar la esporulación y producción de cristales. Las
colonias productoras de esporas y cristales obtenidas
fueron
resembradas por duplicado en tubos de ensayo ccn tapón de rosca,
conteniendo agar nutritivo y se pusieron en incubación a 30°C.
Cada 24 horas se tomó una muestra con una asa de cada tubo y se
realizó tinción simple. Los tubos con cultivos puros
fueron
guardados
2-4°C,
en
refrigeración
a
una
temperatura
de
realizándose resiembras trimestrales de reactivación bajo las
mismas condiciones.(38).
3.1.2 OBSERVACION MORFOLOGICA DE LAS CEPAS.
Las
características
morfológicas
observadas
fueron
las
siguientes: forma, elevación, margen, superficie, consistencia
y color.
3.2 IDENTIFICACION SEROLOGICA DE LAS CEPAS.
La metodología que se utilizó para la identificación serológica
de las cepas fue propuesta por H. de Barjac 1962.(13).
3.2.1 PRODUCCION DEL ANTIGENO.
Preparación del antígeno
"H" flagelar de las doce cepas de
estudio, el cual se realizó de la siguiente manera: Primero se
activaron las cepas en tubos de ensayo 13 x 100
con tapón de
rosca con 5 mi. de Caldo Nutritivo, el cual se inoculó con una
asada de las bacterias que estaban en los tubos de ensayo con
agar inclinado,
se dejó 24 horas hasta que se formó en la
superficie una capita de B. thuringiensis de la cual, se tomó una
asada para inocular los matraces de 500 mi. con 100 mi. de Caldo
Nutritivo. Se incubó en agitación rotatoria a 300 r.p.m., 30°C.
por 15-18 horas. Con un 2 % de este cultivo se inoculó un segundo
matraz, manteniéndose a 30°C., 300 r.p.m. por 5-8 horas, luego
durante el desarrollo exponencial, con dos asadas se inoculó un
tubo Craige con Caldo Nutritivo, con 0.2 % de agar y se incubaron
a 30°C.por 15-18 horas. El procedimiento se repitió transfiriendo
dos asadas del
horas,a
tubo anterior a un segundo tubo Craige, por 12-14
30°C. Se inocularon por duplicado matraces de 500 mi.
con 100 mi de Caldo Nutritivo con dos asadas de las células que
están en el segundo tubo Craige, incubándolo en agitación a 300
r.p.m. por 5-8 horas. En ésta fase se detuvo el crecimiento
vegetativo con Solución Salina Formalinizada(SSF),
añadiendo
aproximadamente 100 mi.a cada matraz y refrigerándose un mínimo
de 12 horas, a una temperatura de 4°C. Se concentró el paquete
celular
centrifugando
a
300
r.p.m
por
15 minutos
a
una
temperatura de 5-ro°C, se decantó el sobrenadante, se lavó
con
100 mi de SSF, resuspendiendo suavemente el paquete celular. Se
centrifugó nuevamente baja las mismas condiciones y se
cosechó
el paquete celular con 10 mi. de SSF.(15).
Concluida la preparación del antígeno "H" flagelar, a partir de
este se prepararon los antígenos diluidos a una concentración
semejante al tubo No.3 del Nefelómetro de McFarland. Este método
se basa en la comparación visual de la turbidez de una suspensión
de bacterias, con una escala preestablecida obteniéndose una
indicación probable de la concentración de células bacterianas
existentes en la suspensión. Es un método comparativo que está
basado en la relación de diferentes concentraciones de BaCl2 1%
en H2S04 1 % a una concentración de bacterias por cm3. (4)
3.2.2. PRODUCCION DE ANTISUEROS.
Los antisueros se prepararon en conejos a partir del antígeno "H"
flagelar.
El
antígeno
n
H"
se
diluyó
con
SSF
hasta
una
concentración correspondiente al tubo No.3 del Nefelómetro de
McFarland. Se procedió a la inmunización de los conejos, bajo el
siguiente protocolo.(15).
TIEMPO
DOSIS
VIA
1
día 0
0.5 mi
intravenosa
2
día 4
1.0 mi
intravenosa
3
día 8
2.0 mi
intravenosa
4
día 12
3.0 mi
INYECCION
sangrado
día 19
intravenosa
vena central
de la oreja
punción
cardíaca
El título de aglutinación se revisó 7 días después de la
última inyección (día 19). Se tomó una muestra de sangre de
conejo (4-5 mi) después de la última inyección. Esta se dejó
coagular 37°C. por 30-60 minutos, centrifugándose posteriormente
a 2000
r.p m. por 15 minutos, se separó el suero para su
titulación. Si el título de anticuerpos era superior a 5120 se
pocedía a sangrar
al conejo; en caso de ser menor; el conejo se
sometía a una reinmunización a partir de la inyección No.3. Se
revisó el título de anticuerpos hasta que éste se había elevado.
El antisuero colectado se distribuyó asépticamente en airtpulas de
1 mi. selladas y guardadas a -2 0°C. Merthiolate de sodio se
agregó al suero para mejorar el almacenamiento.(15).
3.2.3 TITULACION DE ANTISUEROS.
El título de aglutinación se define como la mayor dilución del
suero que dá lugar a una aglutinación como regla general, este
título se evalúa con margen de una dilución y sólo dá una idea
semicuantitativa de la cantidad de anticuerpos presentes. El
procedimiento fué el siguiente: Se enumeró una serie de tubos de
13 x 100 del 1 al 10
colocando en ellos 0.5 mi. de SSF, excepto
en el primero, al que se le agregó 0.9 mi. de SSF. Se realizaron
las diluciones al doble del antisuero de la
siguiente manera:
0.1 mi. de antisuero se añadió al primer tubo para obtener una
dilución 1:10 y se tomó de ella 0.5
mi. que se pasó al segundo
tubo, obteniéndose la dilución 1:20 y así sucesivamente hasta el
tubo 10 correspondiente a la dilución 1:5120. De cada dilución
se tomó 0.1 mi. que se colocó en otra
después
serie de tubos, se agregó
0.9 mi. de antígeno homólogo el cual estaba
concentración
similar
al
tubo
No .3
del
a
una
Nefelómetro
de
McFarland. Se colocó un testigo negativo del antígeno con 0.9
ml.de
éste y 0.1 mi. de SSF, procediendo de la misma manera para
el testigo negativo del antisuero. Se incubaron los tubos en baño
de agua a 37°C. por espacio de 2 horas. Se realizó la lectura del
título,
siendo
éste
el
último
tubo
donde
se
presentó
aglutinación.(15).
»
3.2.4 IDENTIFICACION SEROLOGICA.
El
método
de
identificación
serológica
por
reacciones
de
aglutinación consta de dos partes consecutivas: determinación de
P-S-tividad y determinación del título (15) . Esco se llevó a cabo
haciendo reaccionar cada uno de los antisueros de las cepas de
referencia internacional con los doce antígenos de las cepas a
identificar.
3-2.4.1 PRUEBAS PARA REACCIONES POSITIVAS.
A partir del antisuero de la cepa de referencia internacional se
prepararon diluciones de 1:10, 1:20
y 1:40. De cada una de las
diluciones se tomó 0.1 mi. colocándose en otra serie de tubos y
agregando 0.9 mi. del antígeno de la cepa a identificar que fue
diluido
simultáneamente
al
tubo
No. 3
del
Nefelómetro
de
McFarland. Se colocó un testigo para el antígeno (0.1 mi. de SSF
+ 0.9
mi. de antígeno) . Se incubaron los tubos en baño de agua
a 37°C por 24 horas,
una reacción positiva
fue cuando se
presentó un contenido claro de un tubo en el fondo del cual había
un
sedimento
flocular,
que
fácilmente
se
podía
dispersar
agitándolo.(15).
3.2.4.2 MEDICION DEL TITULO.
El
H-antisuero
que
reaccionó
positivamente
se
preparó
en
diluciones al doble hasta la dilución 1:5120. Luego 0.1 mi. de
cada dilución se colocó en tubos con pipetas de precisión y se
agregó 0.9 mi. de la suspensión de células diluidas del antígeno.
Se incluyó un control con SSF. Se colocó también un testigo
pos i t i vo con el ant í geno homólogo al ant i suero, que tuvo como
finalidad servir de patrón para comparar la reacción de los
antígenos heterólogos ya que en caso de tratarse de la misma cepa
el título sería idéntico al que se presentaría con el antígeno
homólogo.(15).
3.2.4.3 TECNICA DE SATURACION CRUZADA, PARA DETERMINAR EL
SÜBFACTOR ANTIGENICO.
Se produjo bastante antígeno (a) para poder saturar el antisuero
(ab) y dejar libre los subfactores (b) en el suero. El antígeno
se colocó a una concentración 1:10 con el antisuero. Se dejaron
incubar por 2 horas a 37°C.. Se centrifugó a 3000 r.p.m. por 10
minutos para que se precipitaran los aglutinados y con una pipeta
Pasteur
se
recuperó
el
sobrenadante.
Al antisuero
saturado
(sobrenadante) se le determinó el título con el antígeno de los
subfactores (ab) y con el antígeno del subfactor (a). Luego se
procedió a cruzarlos con las cepas a identificar.(15).
3.3 SELECCION DE CEPAS.
Se realizó
en base a la toxicidad por medio
utilizando
los
insectos
blancos:
H.zea
y
de bioensayos
S.exigua.
La
metodología consistió en activar las cepas, cultivarlas y extraer
el
complejo
espora-cristal
con
el
cual
se
realizaron
los
bioensayos.
3.3.1 ACTIVACION DE LAS CEPAS.
Todas las cepas se produjeron en el mismo medio de cultivo y con
iguales condiciones. Se sembró en tubos con agar nutritivo y se
incubaron por 24 horas a 37°C.. Posteriormente.se tomaron dos
asadas para inocular
un matraz de 250 mi. con el medio de
cultivo: Melaza 20g., Harina de soya 20g., Líquido de Remojo de
Maíz 10g., CaC03 O.lg., Agua Destilada 1000 mi.. Los matraces se
colocaron en un agitador giratorio a 300 r.p.m., a ^ "t°C. por 1418 horas.
Después se tomó 0.5 mi. para inocular un segundo matraz con el
mismo medio y con los mismos parámetros de fermentación por 24-36
horas, hasta que el cultivo formó un 90 % de esporas y cristales.
Al término de la fermentación se realizó la extracción del
complejo espora-cristal.(64,27).
3.4.2 EXTRACCION DEL COMPLEJO ESPORA-CRISTAL.
Para obtener el complejo espora-cristal se utilizó el método de
coprecipitación acetona-lactosa propuesto por Dulmage 1970.
Después de conprobar que el 80% de los cristales estaban libres
se procedió a centrifugar, se ajustó el pH a 7 y se centrifugó
a
5000
r.p.m. durante
30 minutos a
4°C. Posteriormente
el
sedimento se resuspendió en solución de lactosa al 5% en un
volumen
correspondiente
fermentación,
agitándose
al
10%
por
30
del
volumen
minutos
original
hasta
de
la
homogenizar
completamente, se le agregó posteriormente cinco volúmenes de
acetona, se agitó nuevamente por 30 minutos, se reposó 15 minutos
y se filtró al vacío en papel filtro Watman # 1. Se dejó secar
durante toda la noche y se molió en un mortero hasta obtener un
polvo muy fino, el cual'se utilizó en los bioensayos.(20).
3.3.3 BIOENSAYOS.
Para
realizar
los bioensayos
se siguió el procedimiento
de
bioensayos reportado por Dulmage 1976, para determinar la DLS0
se realizó lo siguiente: Se preparó una dilución madre al 1%
(10,000 ppm), para hacer las diluciones de cada muestra, en una
solución amortiguadora fosfato-salina pH 7.0, así como las de una
preparación estandard HD-l-S-1971, de potencia marcada como 16000
Unidades Internacionales de Potencia (UIP) /mg. Cada dilución se
homogenizó en una licuadora y esto se introdujo en la dieta
artificial
de
Harina
de
Soya,
para
completar
100 mi
y
se
distribuyó en 20 recipientes de plástico; después de lo cual, se
infestaron con una larva del primer estadio utilizando un pincel.
Se utilizaron 20 larvas por dilución, dejándose igual cantidad
de
larvas
como
control
en
las
cuales
se
agregó
solamente
regulador de la dieta. El total de recipientes fueron incubados
a 30°C y una humedad relativa de 50 %; después de 7 días de
incubación,
entonces
los
se
recipientes
observó
el
se
removieron
porcentaje
de
del
muerte
incubador
para
y
cada
dilución.(25) .
3.3.4 BIOENSAYOS DE PRUEBA.
Los
bioensayos
toxicidad
preliminares
aproximada,
se
para
determinar
realizaron
con
el
las
margen
de
siguientes
características: Dos dosis iniciales de 50 ^g/ml y 500 jig/ml del
complejo espora-cristal en la dieta, con cada una de las cepas.
Se utilizaron
20
larvas
del primer
estadio,
se
hicieron
3
repeticiones y se colocó un testigo para cada repetición y cada
dosis.(25).
3.3.5 DETERMINACION DE LA DLS0.
Después
que
seleccionó
se
la
realizaron
cepa
de
los
bioensayos
B.thuríngiensis que
preliminares
resultó
con
se
una
mortalidad mayor al 50%, se utilizaron siete concentraciones,
DIETA DE HARINA DE SOYA.
Harina de soya
Germen de trigo
Sal Wetsson
Sacarosa
Ac. Sèrbico
Metil-p-hidroxibenzoato
Ac. ascòrbico
Agar-agar
Cloruro de colina(15%)
Formaldehido(10%)
Ac. acético(25%)
Solución vitamínica
Agua destilada
80
g/l.
36
g/l.
12
g/1.
13
g/1.
1
g/l.
2. 2 g/1.
4..8 g/l.
15
g/1.
6..6 ml/l.
5
ml/l.
13 .3 ml/l.
ml/l.
4
1000 mi.
Solución vitamínica.
Pantotetato de calcio
Niacinamida
Riboflavina
Ac. fólico
Tiamina
Piridoxina
Biotina
Vit. B-12
Volumen aforado a 1000 mi,
12
g/1.
3
g/1.
3
g/1.
3
g/1.
1.5.g/1.
1.5 g/1.
0.12g/l.
25 mi.
para calcular la DL50-(25). La DL-50 y las UIP de la cepa
seleccionada se calculó de la siguiente manera: Se obtuvo el
porcentaje de mortalidad corregido para cada
dosis. Se utilizó la fórmula de
Mc= Mo
-
100 -
repetición en cada
Abbott (1925).
Mt x 100
Mt
Me- % de Mortalidad corregido.
Mt- % de Mortalidad del testigo.
Mo- % de Mortalidad observada.
Se calculó la media de estos porcentajes corregidos y la DL50 por
medio
del
análisis
determinando
los
estadístico
límites
de
Probit
confianza
(Finley
D.J.
superior
e
1971),
inferior
calculados teóricamente através de una línea de regresión (29) .
Por medio de la siguiente fórmula se calculó las UIP.(25).
Potencia de la = DL^
muestra(Ul/mg)
UI
del
STD
DLS0 de la muestra
x
Potencia del
STD(UI/mg.).
- Unidades Internacionales.
DL50 - Dosis Letal Media.
STD
- Estándar con una Potencia de 16000
Ul/mg.muestra.
3.4 MEDIOS DE CULTIVO.
3.4.1 SELECCION DE MEDIOS D E
CULTIVO.
Luego que se seleccionó la cepa más tóxica, esta se dejó crecer
en 5 diferentes medios de cultivo, cuya composición en gramos por
.'tro se muestra en la siguiente tabla.
TABLA 3.-
Composición de varios medios de cultivo con
melaza
como única fuente de carbono, que se probaron
para
la producción del complejo insecticida espora-cristal por B.thuringiensis.
CANTIDAD EN GRAMOS/LITRO
INGREDIENTES
MEDIOS
I
XI
III
IV
V
20
20
20
20
20
0
10
20
20
10
Harina de Soya
20
10
20
20
10
L.R.M.
10
10
10
10
6
6
Melaza
Harina de Pescado
Levadura
0 .1
CaC03
0.1
0.1
0.1
0
Agua destilada a un litro.
L.R.M.- Líquido de Remojo de Maíz.
3.4.2 CONDICIONES DE FERMENTACION.
Todas las fermentaciones para seleccionar el medio de cultivo se
efectuaron a nivel de matraz Erlenmeyer de 250 mi, que contenían
50 mi de medio de
cultivo que se esterilizaron a 15 libras de
presión por 15 minutos. Los matraces se inocularon con una asada
de un cultivo puro de bacterias crecidas en agar
nutritivo
inclinado de 24 horas. Se colocaron en un agitador a 300 r.p.m.
por 24 horas a 30°C. Una segunda serie de matraces se inocularon
con el 0.5 %
(V/V) del volumen total de fermentación y
mantuvieron bajo las mismas condiciones.(64).
se
3.4.3 CINETICA DE FERMENTACION.
Durante el transcurso de la fermentación se tomaron muestras de
2 mi. cada
6 horas y se realizaron
los siguientes
métodos
directos e indirectos, para el monitoreo de la cinética:
- Consumo de azúcares.- Las muestras tomadas se
centrifugaron
a 3000 r.p.m./15 min. y del sobrenadante se determinaron los
azúcares reductores. Para la determinación de azúcares
utilizó el método DNS, el
se
cual está basado en la intensidad del
color formado por la reación de 3,5 dinitrosalicílico con
el
azúcar,
es
el
cual presenta
un máximo
de
absorvancia
que
determinado colorimétricamente a 540 nm. (61) .
- Conteo del número de células viables.- El método que se utilizó
para
determinar el número total de células viables se realizó
en placas con agar nutritivo.(6).
- Determinación del pH.- Se tomó un mi de muestra del cultivo
al cual se le agregó 15 mi. de agua destilada ajustada a pH
7.0
y se midió el pH en un potenciómetro.(6).
- Cuenta de esporas viables.- De los extractos finales se tomó
50 mg y
se dis t r ibuy eron homogéneament e en
50 mi
de
agua
destilada estéril, esta solución se pasteurizó a 65°C., durante
10 min. y se procedió a efectuar diluciones desde 10"7 hasta
10"9, de las cuales se deposita 1 mi.en una caja estéril la que
se le añadió 15 mi de agar nutritivo estéril a pH 7.0 incubándose
posteriormente durante 24 "horas a 37°c..(6) .
- Actividad tóxica.- Las esporas y cristales producidos en
la
fermentación fueron recuperados por el método de Coprecipitación
Acetona-Lactosa, descrito por Dulmage (1970) , se pesó el extracto
obtenido. Con los extractos se realizaron los bioensayos con la
metodología antes descrita.(25).
3.5 EXPERIMENTOS A NIVEL PLANTA PILOTO.
Los resultados que se obtuvieron a nivel de matraces Erlenmeyer
se extrapolaron a nivel de termentador
de 40 litros de volumen
total. En estos experimentos se utilizó la cepa seleccionada y
el medio
óptimo
con
15
litros
de voloumen
de
trabajo.
El
Fermentador que se utilizó fué Giovanola P40, con circulación
interna.
Este
fermentador
esta
diseñado
para
mejorar
transferencia de oxígeno, para esto se dispone de un
(tubo de circulación). El medio de fermentación es
la
cilindro
arrastrado
de abajo hacia arriba de la cuba y cae en el cilindro. La masa
del fluido en movimiento arrastra las burbujas de gas, esto
permite aumentar el tiempo de permanencia de la masa líquida y
por
lo
tanto
mejora
características
la
técnicas
transferencia
del
de
Fermentador
oxígeno.
Giovanola
Algunas
P40:
Es
controlado por computadora; está diseñado para llevar un óptimo
control del proceso, ya que cuenta con mediciones estándares de:
r.p.m., T, pH, aereación, nivel de espuma. Tiene unas dimensiones
de
diámetro-altura = 1:2.1, una velocidad máxima de 1500 r.p.m.
y una aereación máxima de 2 W M . La regulación automática del pH
está entre 2-12.
3.5.1 OPTIMIZACION DE LAS CONDICIONES DE FERMENTACION.
A
nivel
de
fermentador
se
optimizaron
las
condiciones
de
fermentación con la cepa seleccionada y el medio seleccionado.
El diseño experimental fué completamente al azar, con un diseño
de tratamiento factorial 2x2 con prolongación a F2, lo cual da
los siguientes tratamientos:
TABLA 4.
Diferentes combinaciones de la aereación y agitación
para observar su efecto en la cinética microbiana de
Bacillus thuringiensis.
PARAMETROS
En
TRATAMIENTOS
I
II
III
IV
V
VI
AGITACION
300
400
500
400
500
600
AEREACION
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.
todas
las
fermentaciones
se
mantuvieron
constantes
las
siguientes condiciones: temperatura 30°C., pH- 7.0, inoculo
1 % (V/V), volumen de trabajo 15 litros
3.5.2 CINETICA DE CRECIMIENTO.
Del fermentador se tomaron muestras de 20 mi cada 4 horas para
determinar:
consumo de azúcares,
conteo de
células
viables
(UFC/ml) , cuenta viable de esporas, la toxicidad se determinó por
medio
de bioensayos
con
la metodología
antes
descrita.
producción se determinó por el peso en gramos del
La
complejo
espora-cristal por litro de fermento. Los criterios para definir,
que condiciones de fermentación son las mejores- fueron: Tiempo
de duración de la fermentación, Toxicidad, y cantidad de esporacristal (peso) .(64) .
3.5.3 MEDICION DEL COEFICIENTE VOLUMETRICO DE TRANSFERENCIA DE
OXIGENO (^a) .
Para cada tratamiento de agitación y aereación se calculó el
coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno antes de
inocular el medio de cultivo en el termentador. Para la medición
del KLa se utilizó el método por sondas polarográficas (Scriban
1985)(56). Con la señal que proporcionan fue posible medir y
registrar en forma continua la concentración de oxígeno disuelto
o más exactamente la tensión de oxígeno. El electrodo de oxígeno
suministra (con una tensión de polarización aplicada) una pequeña
corriente eléctrica (de 1 a 100 nA) con intensidad proporcional
a la presión parcial del oxígeno en solución. La cabeza del
electrodo cuenta con un ánodo de Plat;a, un
cátodo de Platino y
un electrolito entre ambos. Para separar este electrolito del
medio en que se quiere medir, este está separado por una membrana
delgada de teflón, permeable para gases en solución. La punta del
electrodo está compuesta por un cuerpo de vidrio, al cual se
plega la membrana. Antes de comenzar con la medición del KLa, se
calibró el electrodo de oxígeno bajo condiciones de fermentación
(temperatura, agitación, medio de cultivo) dentro del bioreactor
y se acomodó el electrodo durante 24 horas en el bioreactor
cargado antes de la calibración.(56) . Con la ayuda de esta sonda
(electrodo de oxígeno) se llevó
acabo la medición del KLa por el
método estático (Scriban 1985). El método se condujo en el medio
de cultivo en ausencia de células. Nos permitió determinar el
valor del KLa en las condiciones en las que se efectuarían las
fermentaciones.(56).
Después que se saturó el medio de cultivo con oxígeno disuelto,
se detuvo la aereación y se inyectó nitrógeno en
el medio. La
concentración de oxígeno disuelto disminuyó y su tendencia fue
hacia cero. Luego se reemprendió la inyección de aire en las
condiciones de producción en que se probaron. La concentración
de oxígeno disuelto (CL) aumentó y la forma en que aumentaba
dependía la capacidad de transferencia del dispositivo en las
condiciones (aereación-agitación) que se experimentaron.(52) .
El valor de KLa de la curva de variación de CL en función
del
tiempo se dedujo de la gráfica. Se obtuvo una línea recta en una
parte de la gráfica. De esta parte se calculó la pendiente de la
línea, la que es igual al KLa con unidades de S"1(l/s), las cuales
se convirtieron a unidades Hr"1, multiplicándolas por 3600.(56) .
IV. RESULTADOS Y DISCUSION
4.X. AISLAMIENTO DE LAS CEPAS.
A partir de muestras de suelo, recolectadas en diferentes regiones
de Nicaragua se aislaron 12 cepas formadoras de espora y cristal,
de acuerdo al criterio de Heimpel 1963, estas cepas pertenecen a
B. thuringiensís, se les asignó la clave CNPV-Bt del 1 al 12. El
lugar de recolección o procedencia y el cultivo del cual fueron
aisladas se muestra en el cuadro 1. En la observación microscópica,
las cepas en general presentaron características similares: células
de forma bacilar con flagelos perítrieos en cadenas cortas, cristal
en forma bipiramidal y espora ovalada en posición terminal. En su
morfologia
macroscópica
las
características
fueron
similares,
presentándose colonias de forma irregular, con excepción de las
cepas CNPVBt-2 y CNPVBt-12 con forma circular, elevación plana con
borde lobulado con filamentos, color crema, consistencia blanda,
sin pigmentación, en agar nutritivo, 37°C., por 24 horas.
4.2. IDENTIFICACION SER0L06ICA.
Siguiendo la metodología propuesta por de H. de Barjac 1981, al
poner a reaccionar cada uno de los antisueros de las cepas de
referencia internacional con los doce antígenos de las cepas a
identificar,
éstos
últimos
dieron
reación
positiva
con
los
antisueros de las cepas HD-4, correspondientes a la serovariedad
alesti y HD-21 correspondiente a la serovariedad kurstaki, Los
resultados se muestran en el cuadro 2. Por lo tanto, se procedió a
determinar el subfactor antigénico con la técnica de saturación
cruzada, lo que dió, que todas las cepas fueran identificadas como
pertenecientes al serotipo 3a3b var. kurstaki. En nuestro trabajo
el 100% de las cepas nativas identificadas pertenecen a la var.
kurstaki, mientras que De Lucca y col. 1981 reportan un 37% del
total
de
cepas
recuperadas
del
suelo
en
Estados
Unidos
pertenecientes a esta variedad (17). En el cuadro 3 se presentan
los resultados de la saturación del antisuero 3a3b (HD-21)con el
antígeno 3a (HD-4) cruzado con las doce cepas nativas.
4.3. SELECION DE CEPAS.
En el cuadro 4, se muestran las cantidades en g./l. del complejo
espora-cristal para cada una de las cepas recuperadas -del medio de
cultivo por el método acetona-lactosa. Las fermentaciones duraron
48 horas, a éste tiempo se observó al microscopio y habían sido
liberadas más del 90 % de las esporas y cristales.
4.3.2. BIOENSAYOS.
Con
los
extractos
obtenidos
se
montaron
los
preliminares contra los insectos blancos H. zea y
bioensayos
S.exigua. Se
encontró que la cepa CNPVBt-12 fue la mejor con una media de los
porcentajes de mortalidad corregidos de 46.41 % para 50 |ig/ml y
96.49% para 500 jig/ml con una desviación estancferd de 7.44 y 6.08
respectivamente, contra el insecto blanco H. zea. El resto de las
cepas presentaron un porcentaje de mortalidad menor al 30 % con
ambas concentraciones. Los resultados se muestran en el cuadro 5.
En el cuadro 6, se presentan los porcentajes de mortalidad, donde
se observa que la cepa con una mejor actividad fue también la cepa
CNPVBt-12 contra S.exigua, con un 39.73 % y 71.93 % de mortalidad
en las dosis 50 |i.g/ml y 500 ^lg/ml respectivamente. La toxicidad en
porciento de mortalidad contra los dos insectos-blancos fue muy
baja en la mayoría de las cepas. La cepa CNPVBt-12 presentó mayor
toxicidad contra el insecto blanco H.zea que contra S.exigua. Por
esta razón en base a los resultados obtenidos en los bioensayos
preliminares se seleccionó la cepa CNPVBt-12, que demostró una
superior toxicidad al resto de las cepas para los dos insectos
blancos. Una vez seleccionada la cepa por su toxicidad contra H.zea
y S. exigua se procedió con el mismo extracto a determinar la DLS0
y
las Unidades
Internacionales de Potencia
(UXP/mg). Para los
bioensayos con H.zea se escogió como dosis menor 30 jig/ml y dosis
mayor 500 [lg/ml. Contra S. exigua quedaron las dosis menor 40 |ig/ml
y. dosis mayor 700 |ig/ml. El criterio que se utilizó para determinar
éstas dosis es el % de mortalidad en los ensayos preliminares. En
el cuadro 7 se muestran los datos para determinar la DL50 de la cepa
seleccionada CNPVBt-12 contra el insecto blanco H.zea, la cual
resultó
de
119.05
jig/oil,
los
límites
de
confianza
para
una
probabilidad fija de 5 % fueron: límite inferior 102.28; límite
superior 138.56. La DL90 fue de 415.17 |xg/ml.
En el cuadro 8 se presentan los resultados para determinar la DLS0
del estándar HD-1 contra el insecto blanco H.zea. La DLS0 fue de
136.70 jlg/ml, los límites de confianza para una probabilidad fija
de 5 % fueron: límite inferior 118.45 y límite superior de 157.77.
La DL90 fue 475.2 9 Ug/ml.
En el cuadro 9 se registran los datos de los bioensayos de la cepa
CNPVBt-12 contra el insecto blanco S. exigua, para determinar que la
DLS0 fue de
179.85 p.g/ml con un límite de confianza
inferior
(probabilidad 5 %) de 151.53 y el superior de 213.46375 y una DL90
de 869.43 fig/ml.
En el cuadro 10 se aprecian los datos de los bioensayos del
estándar (HD-1) contra el insecto blanco S.exigua, resultando una
DLS0 de 163.86 jlg/ml con límites de confianza al 5% de probabilidad
de 140.85 y 190.63 para el inferior y superior respectivamente, con
una DL90 de 596.03 ng/ml.
Utilizando
la
fórmula
previamente
citada
se
determinaron
las
Unidades Internacionales de Potencia. Para la cepa CNPVBt-12 contra
H.zea resultó ser de 18,373 UlP/mg. Contra S.exigua fue de 14,577
UlP/mg.
Al
igual
que
los
bioensayos
preliminares
la
cepa
seleccionada CNPVBt-12, presentó mayor toxicidad contra H.zea que
contra S. exigua. La cepa presentó 2373 UlP/mg de extracto mas que
el estándar HD-1 contra el insecto blanco H.zea, con respecto al
insecto blanco S. exigua presentó 1823 UlP/mg de extracto menos que
el estándar HD-1. Estos resultados concuerdan con lo publicado por
Krywienczyk
et
al
1978,
los cuales demostraron
que un
mismo
serotipo puede tener diferente toxicidad contra varias especies de
insectos. Ellos sugieren que el serotipo 3a3b puede ser separado en
dos subgrupos (patovariedades) designados como K-l y K-73, contra
T.ni
y
H.virescens
respectivamente. (41) .
Esto
también
se
confirmapor lo publicado por Jaquet en 1987 en donde encuentra
deferente actividad específica del cristal protéico entre cepas de
B.thuringiensis de la misma subespecie kurstaki. (36) . Es importante
señalar que las cepas al ser evaluadas deben ser del mayor número
posible para poder encontrar y seleccionar al menos una cepa con
capacidad entomopatógena hacia los insectos blancos de importancia
agrícola.
4.4 MEDIOS DE CULTIVO.
Después que se selecionó la cepa más tóxica contra los insectos
blanco H.zea y S. exigua se procedió a la selección del medio de
cultivo.
En la figura 1 se observa que el tiempo de fermentación (liberación
del 90 % de las esporas) en los medios II y IV fue de 36 horas, en
el resto fue de 48 horas. En la misma figura se observa el ln del
número de esporas viables, el cual fue mayor en los medios II, IV
Y V.
En la figura 2 se muestra el % de mortalidad de S. exigua y H.zea
con la cepa seleccionada CNPVBt-12 en los 5 medios de cultivo. La
mayor mortalidad contra los dos insectos blancos se presentó en el
medio II. Para determinar el % de mortalidad se escogió la dosis
500 ng/ml.
En el cuadro 11 se muestra el Análisis de Varianza y la prueba de
rango múltiple de Duncan, para los bioensayos con H.zea la cual dió
los siguientes resultados: el mejor medio para cultivar la cepa
CNPVBt-12 con respecto al % de mortalidad fue el medio II, aunque
no hay diferencia significativa con los medios IV y V, siendo
significativamente diferente de los medios I y III. El Análisis de
Varianza
con
respecto al insecto blanco
S.exigua, no detectó
diferencia.
En las condiciones de fermentación descritas
graficaron
anteriormente
se
las cinéticas de crecimiento con los datos que se
obtuvieron de las fermentaciones de la cepa seleccionada CNPVBt-12
en los 5 medios de cult ivo. Los ingredientes de los medios de
cultivo se muestran en la tabla 3.
En la figura 3 se muestra la cinética de crecimiento de la cepa
CNPVBt-12
en el medio I. La
fase de crecimiento
logarítmico
comienza a las 12 horas de iniciada la fermentación,
la cual
concluye a las 24 horas. El punto máximo en. la curva esta entre
las24 horas y 30 horas con una cantidad de células UFC/ml. de 6.68
x 108. El consumo de azúcares comienza con el crecimiento de la
cepa, continuando hasta casi agotarse a las 36 horas, la liberación
del 90 % de las esporas se dió a las 48 horas.
Figura 4, se presenta la cinética de crecimiento de la cepa CNPVBt12 en el medio
II. La cepa comienza
su fase de
crecimiento
logarítmico a las 6 horas, concluyendo ésta fase a las 18 horas,
con un punto máximo a ésta hora, con 8.84 x 108 células-ÜFC, el
consumo de azúcares comienza con el crecimiento de la cepa,
concluyendo a las 30 horas, la liberación casi total de esporas se
da a las 36 horas.
Figura 5, en la cinética de crecimiento de la cepa CNPVBt-12 en el
medio III se observa lo siguiente: la cepa comienza a crecer
logarítmicamente a las 6 horas concluyendo ésta fase a las 18 horas
con 5.36 x 10® células-UFC, aunque la fase estacionaria se alarga
desde ésta hora hasta las 48 horas, que fue cuando hubo un 90 % de
liberación de esporas. En la línea que muestra el consumo de
azúcares se aprecia que el consumo baja marcadamente hasta que
finaliza la fase logarítmica, manteniéndose luego estable, hasta
casi agotarse después de las 42 horas.
La figura 6 nos muestra la cinética de crecimiento y el consumo
de'azúcares en el medio IV. El crecimiento exponencial comienza a
las 6 horas, concluyendo a las 18 horas con una cantidad de
células-UFC de 5.5 x 108, las cuales liberaron sus esporas en un 90
% a las 36 horas. En la figura 7 se muestra un comportamiento
similar de la cepa CNPVBt-12 en el medio V al del medio IV. El
punto máximo en la curva de crecimiento fue de 5.4 x 10a célulasUFC.
En base a los resultados obtenidos con los parámetros; tiempo de
fermentación, cantidad de esporas viables y % de mortalidad, el
medio de cultivo que mejor se comportó fue el medio II.
Estos resultados coinciden con lo reportado por Dulmage 1971,
quién demostró que la cantidad de 8-endotoxina producida por los
aislados, varía ampliamente dependiendo del aislado y medio de
1020091320
51
cultivo sobre el cual crece, algunos aislados del mismo serotipo
producen diferentes actividades insecticidas, cuando se cultivan en
medios diferentes.(22).
4.5 EXPERIMENTOS A NIVEL PLANTA PILOTO. BIOREACTOR GIOVANOLA P40.
Con
la
cepa
seleccionado
seleccionada
se
realizaron
CNPVBt-12
los
y
el
experimentos
medio
a
de
nivel
cultivo
planta
semipiloto.
En la figura 8 se presenta la cinética de crecimiento de la cepa
seleccionada CNPVBt-12, con agitación 300 r.p.m. y aereación 0.5
WM.
La fermentación duró 48 horas, comenzando el crecimiento
logarítmico a las 12 horas, con un punto máximo en la curva de
crecimiento de 15 x 108 células-UFC. El consumo de azúcares comenzó
a decrecer antes de las 16 horas y llega casi a cero a las 40
horas.
El tratamiento de agitación/aereación 400 r.p.m./0.5 W M , figura 9,
presentó un mejor comportamiento. La fermentación duró 42 horas y
el crecimiento exponencial comenzó a las 8 horas, con un punto
máximo de 15 x 108 células-UFC. La curva de consumo de azúcares
decrece marcadamente a partir de las 12 horas y se mantiene muy
baja hasta el final de la fermentación.
En la figura 10, se observa el crecimiento de la cepa CNPVBt-12, en
el tramiento
500 r.p.m. /0.5 W M ,
comenzando *a las
8 horas
y
concluyendo la fermentación a las 36 horas. El punto máximo en la
curva de crecimiento fue 1.9 x 108 células-UFC.
En la figura 11, se muestra la cinética que se obtuvo en el
tratamiento 400 r.p.m. y 1 W M . La fase logarítmica comienza a las
8 horas. La fermentación duró 38 horas. Con un punto máximo de 17
x 108 células-UFC. En la tratamiento 500 r.p.m./I W M , figura 12,
el crecimiento exponencial comienza a las 4 horas, durando la
fermentación 4 horas menos que la anterior.
En la figura 13, se observa el mejor crecimiento de la cepa CNPVBt12, comenzando la fase exponencial a las 4 horas y concluyendo la
fermentación a las 26 horas. El punto máximo de la curva fue de 45
x 108 células-UFC.
La medición del KLa
(Hr_1) , para las diferentes tratamientos de
agitación-aereación, se muestran en la fig.14. Se observa que en
general el coheficiente de transferencia de'oxígeno fue mayor a 1
W M . La tendencia a los dos niveles de aereación es a ser mayor el
KLa
a medida que aumenta la agitación.
En el cuadro 12, se observa que la toxicidad de la cepa CNPVBt-12
se ve afectada por el nivel de transferencia de oxígeno. La mayor
toxicidad se presentó en el tratamiento VI, que corresponde a la
combinación 600 r.p.m./I W M .
A medida que se aumenta la tranferencia de oxígeno se aumenta la
toxicidad. Tomando en cuenta los datos de la tabla 13 se puede
decir
que
al
haber
una
mayor
disponibilidad
de
oxígeno
la
producción del complejo espora-cristal es mayor, infiriendo esto
también en la toxicidad. En el mismo cuadro se presentan también
los datos obtenidos de la medición de diferentes parámetros de
fermentación,
los
que
tuvieron una
relación
directa
con
los
tratamientos que se experimentaron. En general el mejor tratamiento
(aereación/agitación) fue 600 r.p.m./l.O W M , en el cual el tiempo
de fermentación fue 26 horas, con un rendimiento de 18 g. de
esporas cristales por litro de medio de cultivo, un KLa de 237.98Hr"
1
y una toxicidad de 80 % contra H.zea a 500 jxg/ml.
De los datos presentados en esta investigación, observamos que
conforme aumentan la r.p.m. y la aereación ( por ende la velocidad
de transferencia de oxígeno) aumentan: el K^a, esporas-cristales,
UFC/ml y la cuenta de esporas viables/ml total. Esto concuerda con
lo reportado con la literatura por Luthy et al
sugieren
que el crecimiento y
esporalación
(38) , quienes
del organismo
son
maximizados por altos niveles de aereación a temperaturas de 28 a
32 °C. Asi mismo el tiempo de fermentación es reducido de 48 horas
a 26 horas en la combinación 600 r.p.m./l.O W M , esto es debido
principalmente a el aumento en la velocidad de transferencia de
oxígeno, lo cual nos indica que el sistema tiene limitación por
oxígeno. De lo observado en nuestros datos vemos que hay una
relación directa entre KLa y los diferentes parámetros evaluados.
V.CONCLUSIONES.
1.- Se aislaron 12 cepas de B.thuringiensis, a partir de muestras
de suelo recolectadas en diferentes regiones de Nicaragua, a las
que se les asignó la clave CNPVBt del 1 al 12.
2.- De acuerdo a las observaciones macroscópicas, microscópicas y
la
identificación
serológica,
las
doce
cepas
nativas,
se
identificaron como B.thuringiensis var. kurstaki, serotipo 3a3b.
3. -
La
cepa
CNPVBt-12,
fue
la mejor
con
una
media
de
los
porcentajes de mortalidad corregido de 46.41% para 50 p.g/ml y
96.49% para 500 ng/ml, contra el insecto blanco H.zea.
4.- La cepa CNPVBt-12, también fue la mejor con una media de los
porcentajes de mortalidad corregidos de 39.73 para 50 ^ig/ml y
71.93% de mortalidad para 500 jig/ml contra
el
insecto blanco
5.exigua.
5.- La cepa CNPVBt-12 presentó mejor toxicidad contra el insecto
blanco H.zea que contra S.exigua.
6.- La DLS0 de la cepa CNPVBt-12 contra el insecto blanco H.zea,
resultó ser de 119.04838 ppm. Las Unidades
Internacionales de
Potencia utilizando el estandard (HD-1), fueron: 18373 UlP/mg.
7.- La DL50 de la cepa CNPVBt-12 contra el insecto blanco S. exigua
resultó ser de: 179.85091 ppm. Las Unidades Internacionales de
Potencia en este caso fueron: 14577 UlP/mg.
8.- En base a los resultados obtenidos con los parámetros: tiempo
de fermentación, cantidad de esporas viables y % de mortalidad, el
medio de cultivo que mejor se comportó fue el medio II el cual
contiene los siguientes
ingredientes: Melaza 20 g.; Harina de
pescado 10 g.; Harina de soya 10 g.; Líquido de remojo de maíz 10
g.; levadura 6 g.? CaCo3 0.1 g., todos en gramos por litro de medio
de cultivo.
9.- El mejor tratamiento fue la combinación aereación/agitación
600 r.p .m. /I W M ,
en la cual la fermentación duró 26 horas, se
obtuvo un alto rendimiento de 18 gramos de esporas-cristales por
litro de medio de cultivo, un KLa de 237.98 Hr"1 y una toxicidad de
80 % contra H.zea a 500 jig/ml.
10.- El rendimiento de la cepa seleccionada CNPVBt-12 en gramos de
esporas y cristales por litro de medio de cultivo aumentan conforme
la tranferencia de oxígeno (KLa) es mayor.
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CUADRO 1.
DRI6EN DE LOS DOCE AISLAMIENTOS DE
Bacillus thuringiensis
CLAVE
FECHA DE REAISLAHIENTO
LU6M DE RECOLECCION
0 PROCEDENCIA
CNPV fi.t. 1
23.06.87
La Paltera, Diria»ba
Carazo
CNPV B . t . 2
13.07.87
La Trinidad, Diriatba
Carazo
CNPV B . t . 3
13.07.87
La Trinidad, Dir iatóa
Carazo
CNPV B . t . 4
13.07.87
C m B.t. 5
13.07.87
La Trinidad, Diriaiba
Carazo
Loia Negra, La Concha
Carazo
CNPV B . t . 6
23.07.87
CNPV B . t . 7
23.07.87
CNPV B . t . 8
23.07.87
Chaguitillo, Sébaco
Hatagalpa
Chaguitillo, Sébaco
flatagalpa
San Benito, Sébaco
CNPV B . t . 9
27.07.87
Hatagalpa
Caipos Azules, Carazo
c m B . t . 10
17.07.87
El fiurrfi, Lein
CKPV B . t . 11
31.08.87
Sta. Ursula, Rivas
CNPV B . t . 12
31.W.87
Sta. Lucia, Chontales
CUADRO 2.
IDENTIFICACION SEROLOSICA DE 12 CEPAS
DE Sacillus thuringiensis NATIVAS
DE NICARAGUA
Anti suero
antlgwio
H0-2f 1
thuringiensis
Hfi-3i 2
fiflitiaus
H M ; 3a
aUsti
HB-21; 3a3b
fcurstaki
CNPV B . t . 1
—
—
1-1280
1-1280
CNPV B.t. 2
—
—
1-1280
1-1280
ClffV B . t , 3
—
—
1-1280
H280
CNPV B.t. 4
—
—
1-1280
1-1280
CtffV B . t . 5
—
—
1-1280
1-1280
CNPV B.t. 6
—
—
1-1280
1-1280
CNPV B.t. 7
—
—
1-1280
1-1280
—
1-1280
1-1280
CNPV B.t. 8
ClffV B.t. 9
—
—
1-1280
1-1280
CHPV B . t . 1 tí
—
—
1-1280
1-1280
CNPV B . t . 11
—
—
1-12W
1-Í2B0
CNPV B . t . 12
—
—
1-1280
1-1280
HM
—
—
1-1280
1-1280.
HD-21
—
—
1-1280
1-1280
-
CUADRO 3. SATURACION DEL ANTISUERO 3a3b (HD-21) CON EL
ANTI GENO 3a (HD-4) CRUZADO CON LAS 12 CEPAS NATIVAS.
CEPAS
NATIVAS
HD-21(antisuero)
Saturado con
HD-4(antígeno)
CNPVBt-1
320
CNPVBt-2
320
CNPVBt-3
320
CNPVBt-4
320
CNPVBt-5
320
CNPVBt-6
320
CNPVBt-7
320
CNPVBt-8
320
CNPVBt-9
320
CNPVBt-10
320
CNPVBt-11
320
CNPVBt-12
320
HD-21
320
HD-4
80
CUADRO 4. PRODUCCION DEL COMPLEJO ESPORA-CRISTAL PARA
LOS BIOENSAYOS DE SELECCION DE CEPAS.
CEPA
g/1.
CNPVBt-1
14.22
CNPVBt-2
9.87
CNPVBt-3
10.61
CNPVBt-4
11.43
CNPVBt-5
10.0
CNPVBt-6
11.27
CNPVBt-7
13.07
CNPVBt-8
10.84
CNPVBt-9
11.39
CNPVBt-10
12.38
CNPVBt-11
11.79
CNPVBt-12
16.67
CUADRO 7. DOSIS LETAL MEDIA EN ¿ig/ml DE LA CEPA
SELECCIONADA CNPVBt-12 CONTRA Beliotbis zea.
Dosis
30
50
80
125
200
320
500
x'
(n)
(nM)
(PMC)
(Ye)
60
60
60
60
60
60
60
60
8
13
22
36
46
50
55
4
0.07143
0.16071
0.32143
0.57143
0.75000
0.82143
0.91071
3.53448
4.00851
4.53672
5.17966
5.67419
5.92073
6.34538
1.477
1.698
1.903
2.097
2.301
2.505
2.699
test.
X'
n
nM
PMC
Ye
test.
-
log. dosis.
Número de insectos tratados.
Número de muertos.
Proporción de Mortalidad Corregida.
Probit de la Proporcion Afectada.
Testigo.
Regresión lineal:
x'-» X ; Ye - Y
a = 0 .09637
b = 2 .36237
Dosis
DL 5 0
DL 9 0
119.05
415.17
L.C .1.
1 0 2 . 28
L.C.S.
138.56
L.C.I. - Límite de Confianza Inferior.
L.C.S. - Límite de Confianza Superior.
Análisis estadístico Probit con un 95% de
confianza.
!
CUADRO 6. BIOENSAYOS PRELIMINARES DE LAS DOCE CEPAS
NATIVAS CONTRA Spodoptera exigua.
CEPAS
CNPVBt -1
CNPVBt -2
CNPVBt -3
CNPVBt -4
CNPVBt -5
CNPVBt -6
CNPVBt -7
CNPVBt -8
CNPVBt -9
CNPVBt -10
CNPVBt -11
CNPVBt -12*
*
DOSIS
|Xg/ml
% M
X
5.18
50
8.77
500
15.44
50
500
28.06
10.26
50
500
19.30
50
8.51
24.56
500
50
12.19
28.06
500
10.53
50
14.04
500
50
20.79
500
29.98
5.17
50
8.77
500
50 • 17.10
500
35.08
50
8.42
500
29.82
50
17.19
28.07
500
39.73
50
500
71.93
<5
5.27
6.08
4.74
6.07
4.88
3.04
7.70
3.04
6.23
6.07
5.27
3.04-"
5.66
8.04
5.26
3.04
10.44
3.04
10.37
6.07
10.81
3.03
11.30
9.98
% M - porciento de mortalidad,
a - desviación estándar.
* - cepa seleccionada.
CUADRO 5. BIOENSAYOS PRELIMINARES DE LAS DOCE CEPAS
NATIVAS CONTRA Heliothis zea
CEPAS
CNPVBt-1
CNPVBt-2
CNPVBt-3
CNPVBt-4
CNPVBt-5
CNPVBt-6
CNPVBt-7
CNPVBt-8
CNPVBt-9
CNPVBt-10
CNPVBt-11
CNPVBt-12*
DOSIS
Jig/ml
% M
X
C
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
50
500
8.60
8.60
3.42
6.84
21.86
24.12
17.28
27.55
3.42
10.26
3.33
13.77
15.53
24.12
22.46
15.26
10.44
10.35
12.10
20.61
10.35
20.70
46.41
96.49
2.90
2.90
2.96
2.73
9.75
7.93
8.41
2.12
2 .96
4.88
5.77
2.84
0.46
2.74
3.39
13.03
9.19
5.27
8.10
4.62
5.27
5.30
7.44
6.08
% M - porciento de mortalidad,
a - desviación estándar.
* - cepa seleccionada.
CUADRO 7. DOSIS LETAL MEDIA EN |ig/ml DE LA CEPA
SELECCIONADA CNPVBt-12 CONTRA Heliothís zea.
Dosis
X'
(n)
(nM)
(PMC)
(Ye)
30
50
80
125
200
320
500
test.
1.477
1.698
1.903
2 .097
2.301
2.505
2.699
60
60
60
60
60
60
60
60
8
13
22
36
46
50
55
4
0.07143
0.16071
0.32143
0.57143
0.75000
0.82143
0.91071
3.53448
4.00851
4.53672
5.17966
5.67419
5.92073
6.34538
X'
n
nM
PMC
Ye
test
•
-
log . dosis
Número de insectos tratados.
Número de muertos.
Proporción de Mortalidad Corregida.
Próbit de la Proporción Afectada.
Testigo.
Regresión lineal:
x'-* X ; Ye - Y
a = 0 .09637
b = 2 .36237
DL50
DL 90
Dosis
119. 05
415. 17
L.C .1.
102.28
L.C.S.
138.56
—
L.C.I. - Límite de Confianza Inferior.
L.C.S. - Límite de Confianza Superior.
Análisis estadístico Probit con un 95% de
confianza.
CUADRO 8. DOSIS LETAL MEDIA EN [Lg/xal DEL
ESTANDAR (HD-1) CONTRA Belíothiff zea.
Dosis
x'
(n)
(nM)
(PMC)
(Ye)
30
50
80
125
200
320
500
test.
1.477
1.698
1.903
2.097
2.301
2.505
2.699
60
60
60
60
60
60
6060
7
11
20
26
37
49
57
2
0.08621
0.15517
0.31034
0.41379
0.60345
0.81034
0.94828
3.63528
3.98552
4.50554
4.78259
5.26186
5.87904
6.62871
X'
n
nM
PMC
Ye
test .
-
log. dosis.
Número de insectos tratados.
Número de muertos.
Proporción de Mortalidad Corregida.
Próbit de la Proporción Afectada.
Testigo.
Regresión lineal:
X ; Ye -* Y
a = -0.05791
b = 2.36818
DL50
DL 9 0
Dosis
136.71
415.29
L.C . 1 .
118. 45
L.C.S.
157.77
—
L.C.I. - Límite de Confianza Inferior.
L.C.S. - Límite de Confianza Superior.
Análisis estadístico Probit con un 95% de
confianza.
CUADRO 9. DOSIS LETAL MEDIA EN ¿ig/ml DE LA CEPA
SELECCIONADA CNPVBt-12 CONTRA Spodoptera exigua.
Dosis
X'
(n)
(nM)
(PMC)
(Ye)
40
65
105
170
275
445
700
test.
1.602
1.812
2.021
2.230
2.439
2.648
2.845
60
60
60
60
60
60
60
60
7
12
26
33
37
40
56
2
0.08621
0.17241
0.41379
0.53448
0.60345
0.65517
0.93103
3.63528
4.05541
4.78259
5.08633
5.26186
5.39888
6.48383
X'
n
nM
PMC
Ye
test
•
-
log . dósis.
Número de insectos tratados.
Número de muertos.
Proporción de Mortalidad Corregida.
Próbit de la Proporción Afectada.
Testigo.
Regresión lineal:
X ; Ye •» Y
a = 0 .77699
b = 1 .87281
DL S 0
DL 9 0
Dósis
179. 851
869. 430
L.C .1.
151. 53
L.C.S.
213.463
L.C.I. - Límite de Confianza Inferior.
L.C.S. - Límite de Confianza Superior.
Análisis estadístico Probit con un 95% de
confianza.
r
CUADRO 10. DOSIS LETAL MEDIA EN |ig/ml DEL
ESTANDAR (HD-1) CONTRA Spoáoptera exigua.
Dósis
40
65
105
170
275
445
700
x'
(n)
(nM)
(PMC)
(Ye)
60
60
60
60
60
60
60
60
10
13
21
32
38
53
57
0.12281
0.17544
0.31579
0.50877
0.61404
0.87719
0.94737
3.83884
1.602
1.812
2.021
2.230
2.439
2.648
2.845
test.
X'
n
nM
PMC
Ye
test .
-
4.06720
4.52091
5.02193
5.28942
6.16116
6.62021
3
log. dosis.
Número de insectos tratados.
Número de muertos.
Proporción de Mortalidad Corregida.
Próbit de la Proporción Afectada.
Testigo.
Regresión lineal:
x' X ; Ye -* Y
a = -0.06083
b = 2.28534
Dosis
DL50
DL90
163.86
596.03
L.C.I.
140.85
L.C.S.
190.62
L.C.I. - Límite de Confianza Inferior.
L.C.S. - Límite de Confianza Superior.
Análisis estadístico Probit con un 95% de
confianza.
f
CUADRO 11. ANALISIS DB VARIANZA PARA BL % DE MORTALIDAD
DB Heliothie zea EN 5 MEDIOS DE CULTIVO.
g.l.
tratamientos
error
total
S.C.
C.M.
16,521.73
905.73
17,427.46
5
12
17
3,304.35
75.48
F
43.77
PRUEBA DE RANGO MULTIPLE DE DUNCAN (p< 0.05)
PARA LAS MEDIA DE ANDEVA
Tratamientos
II
V
IV
I
III
I
II
III
89.47
89.47
73.68
78.95
68.42
95
90
85
65
55
95
70
85
85
80
Media de la
Mortalidad
93.16 ab
83.16 be
81.23 be
76.32 c
67.81 c
* Las medias seguidas de diferentes letras son
significativamente diferentes.
CUADRO 12. % DE MORTALIDAD DEL INSECTO BLANCO Heliothis zea
CON LA 8-ENDOTOXINA DE LA CEPA CNPVBt-12
MEDIO II, BAJO DIFERENTES TRATAMIENTOS.
R E P E T I C I O N E S
tratam
dosis
(HG/ml)
1 ra.
M
%(c)
2 da.
M
3 ra.
%(c)
M
%{c)
X
a
I
500
5/20
25
5/20
25
6/20
30
26.67
2.89
II
500
7/20
35
6/20
30
8/20
40
35.00
5.00
III
500
9/20
45
9/20
45
8/20
40
43.33
2.89
IV
500
7/20
35
5/20
25
8/20
40
33.33
7.64
V
500
13/20
65 10/20
50 12/20
60
58.33
7.64
VI
500
17/20
85 16/20
80 15/20
75
80.00
5.00
0/20
0
0.00
0.00
test.
0/20
0
0/20
0
CUADRO 13. EVALUACION DE LOS TRATAMIENTOS (AEREACION\AGITACION)
A TRAVES DE DIFERENTES PARAMETROS DE FERMENTACION
tratamien. tiempo
(rpm/WM)
(h)
KLa
esporas
viables
UFC/ml
P. e/c
(g/1)
(300/0 .5)
48
h.
61 .01
4 .7
X
10®
16
X
10®
5 .35
(400/0 .5)
42 h.
79 .33
7 .8
X
108
15
X
10®
6 .87
(500/0 .5)
36
h.
122 .02
1 .9
X
108
19
X
10®
10 .20
(400/1 -0)
38
h.
89 .37
2 .8
X
108
17
X
10a
7 .30
(500/1 -0)
32 h.
168 .68
3 .4
X
109
27
X
108
13 .10
(600/1 .0)
26 h.
237 .98
3 .9
X
10*
45
X
108
18 .00
P.e/c - Peso en gramos de esporas y cristales/litro de
medio de cultivo.