Práctica 7 : Respiración celular I.- Objetivos Al final del laboratorio el estudiante debe ser capaz de: * Diferenciar entre los distintos tipos de respiración celular. * Determinar la tasa de respiración anaeróbica de un organismo a partir de diferentes sustratos energéticos * Conocer un método para cuantificar la producción de dióxido de carbono durante el proceso de la respiración aneróbica. * Medir la tasa de producción de O2 durante la repiración aeróbica en organismos heterótrofos * Comparar la tasa respiratoria entre organismos en función de su peso corporal II.- Introducción A lo largo de la evolución, los organismos han desarrollado diversas estrategias para capturar, utilizar y almacenar energía libre. En la práctica pasada analizamos el proceso a través del cual organismos autótrofos capturan la energía libre del ambiente. En contraste, los organismos heterótrofos obtienen la energía a partir de la degradación de compuestos orgánicos producido por otros organismos. El proceso de respiración celular comprende una serie de reacciones bioquímicas mediante las cuales la célula degrada las moléculas orgánicas y produce la energía necesaria para realizar sus funciones vitales. Usualmente se usa glucosa como materia prima, la cual se metaboliza a dióxido de carbono y agua, produciéndose energía en forma de ATP, utilizable en las funciones metabólicas. glucosa dióxido de carbono agua La respiración celular incluye una secuencia de etapas metabólicas definidas como: (1) glicólisis, en el citoplasma de la célula, y tanto (2) el ciclo de Krebs y (3) las reacciones de transferencia de electrones (redox) que ocurren en el interior de la mitocondria. Glucosa Durante la glucólisis a partir de una molécula glucólisis - O2 de glucosa, se producen dos moléculas de Piruvato ácido pirúvico (piruvato) y neto, 2 moléculas de ATP. + O2 Acetaldehido mitocondria Acetil-CoA Lactato Ciclo de Krebs Etanol Esta secuencia de pasos puede seguir una ruta diferente en presencia o ausencia de oxígeno. En presencia de O2 (respiración celular aeróbica) cada molécula de piruvato que se generó durante la glicólisis, entra a la mitocondria, se transforma en Acetil-CoA que entra al ciclo de Krebs, y se genera 2ATP, 2 FADH2, 6NADH, y 4CO2. La última secuencia de reacciones de la respiración celular aeróbica, incluye la transferencia de electrones de FADH2 y NADH a una serie de Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 2 proteínas transmembranales (cadena transportadora de electrones) que generan un gradiente de H+ usados para la síntesis de ATP. En ésta fase se producen neto 32 moléculas de ATP. En ausencia de oxígeno (respiración anaeróbica),luego de la glucólisis se lleva a cabo fermentación. Algunas bacterias sólo llevan a cabo fermentación, mientras que la gran mayoría de los organismos (incluidos los humanos) pueden llevar a cabo respiración celular aeróbica y anaeróbica. La fermentación no es tan eficiente ya que sólo produce 2 moléculas de ATP, pero al menos permite obtener energía a partir del piruvato que se produjo en la glucólisis. Hay dos tipos de respiración celular anaeróbica: fermentación láctica y fermentación alcohólica. La fermentación láctica ocurre en algunas bacterias (se utiliza en la industria para la producción de yogurt, crema agria y quesos) y células animales en respuesta a deficiencia de oxígeno durante un ejercicio fuerte y continuo. Por otra parte, la fermentación alcohólica, ocurre en levaduras, ciertos hongos y algunas bacterias, produciéndose CO2 y alcohol etílico (etanol); ambos productos se usan en la producción de pan, cerveza y vino. III.- Procedimiento Durante la sesión de laboratorio se realizarán 2 experimentos que le permitirán conocer algunos aspectos del proceso de fotosíntesis y respiración. Para lograr éste objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesión de laboratorio, realizarán y analizarán un experimento,de acuerdo a las indicaciones del instructor. Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se reúnen para hacer una discusión de los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir sus resultados. Antes de iniciar la recolección de datos plantéese una pregunta de trabajo, y basándose en ésta, diseñe una hipótesis de trabajo y una predicción de sus resultados. Identifique en su hipótesis las variables dependientes e independientes Diseñe un cuadro completo en donde pueda anotar los datos colectados y el análisis realizado. Experimento 1 Respiración anaeróbica PROBLEMA: La levaduras, al igual que muchos organismos heterótrofos, son capaces de metabolizar distintos tipos de azúcares, tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Para ello utilizan tanto mecanismos para el tranpsorte del azúcar al interior celular como enzimas específicas capaces de degradar y metabolizar los enlaces químicos presentes en la molécula. En este ejercicio se estudiará el proceso de fermentación alcohólica que llevan a cabo las levaduras (Saccharomyces cerevisiae). EQUIPO Y MATERIALES SOLUCIONES   Jeringas de 1 ml dH2O Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 3  Cultivo de Levadura (2%)  Soluciones de Glucosa, Fructosa, Sacarosa y Lactosa , al 5% cada una 1. Se le entregará un frasco que contiene un cultivo de levadura al 2% (preparado antes de iniciar el laboratorio). 2. Rotule 2 tubos de ensayo y prepare la mezcla siguiente : Tubo 1: 1 ml de glucosa(5%) y 1 ml de levadura Tubo 2: 1 ml fructosa (5%) y 1 ml de levadura Tubo 3: 1 ml sacarosa (5%) y 1 ml de levadura Tubo 4: 1 ml lactosa (5%) y 1 ml de levadura Tubo 5: 1 ml de dH2O y 1 ml de levadura 3. Utilizando una pipeta Pasteur, llene un tubo de ensayo pequeño con la solución del tubo 1 hasta prácticamente desbordar. Sea cuidadoso de no formar burbujas a lo largo de la columna de solución y no tomar sedimentos del frasco de cultivo. 4. Invierta el tubo de ensayo pequeño sobre uno mediano como se muestra en la figura. Debe asegurarse de tener una columna de solución sin burbujas y libre de sedimentos que obstruyan el flujo de solución y gases en el tubo. Anote el tiempo inicial en la columna correspondiente en el cuadro del reporte. 5. Cada 30s mida el volumen de burbujas acumuladas en el tubo utilizando una regla (producción de CO2) como la diferencia entre la lectura real cada 30 segundos y la lectura anterior. Reporte ese volumen en su cuadro de datos 6. Repita el procedimiento (pasos 3-5) con la solución del tubo 2 y las otras soluciones experimentales. Recuerde registrar el tiempo de inicio. 7. Haga una gráfica de la producción de CO2 en función del tiempo, para cada sustrato energético utilizado. Compare sus resultados. Experimento 2 Respiración aeróbica PROBLEMA: En este experimento se determinará en forma cuantitativa la tasa de respiración aeróbica en plantas y animales, midiendo el volumen de O2 consumido. Para ello, se utiliza un respirómetro el cual consiste de un envase ancho de vidrio (tubo de ensayo, erlenmeyer, etc) el cual contiene semillas germinadas o un animal pequeño (invertebrado). Esta cámara cierra herméticamente con un tapón (cámara de respiración), al que se le inserta una pipeta graduada y una entrada de aire (respirador) conectado a una jeringa. En el extremo libre de la pipeta se coloca un colorante líquido al inicio del experimento. En el tiempo, a medida que se reduce (consume) el volumen de O2 en la cámara experimental, el colorante se desplazará a lo largo de la pipeta graduada, permitiendo medir la cantidad de ml de aire consumido en función del tiempo. Es importante mencionar que con este diseño, es necesario eliminar los cambios en el volumen de CO2 que se produce por la respiración. Para ello se coloca en el Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 4 respirómetro una cantidad de KOH (o desecante) el cual reacciona con el CO2 para formar carbonato de potasio en forma sólida CO2 + 2KOH  K2CO3 + H2O Otro parámetro importante de controlar en estos experimentos es la temperatura ya que produce expansión o contracción de los gases. Para minimizar fluctuaciones en la temperatura del ambiente, es importante mantener el respirómetro sumergido en un baño a temperatura ambiente (ver figura) EQUIPO Y MATERIALES SOLUCIONES         Respirómetro Un animal pequeño Semilla de frijoles germinadas Balanza granataria Baño de María Termómetro Azul de metileno dH2O Nota: En éste ejercico se trabajará con animales vivos. Por lo que se les exige a los participantes del curso que manipulen los organismo con mucho cuidado, evitando en todo momento causarle dolor o provocando alguna situación en perjuicio de la vida del animal. Finalmente, es importante no generar ruido extremo durante la toma de datos ya que altera la calidad de sus resultados. 1. En la mesa de laboratorio encontrará 3 respirómetros parcialmente ensamblados. 2. Verifique que las conexiones entre el tapón/jeringa y tapón/pipeta estén selladas herméticamente. 3. Verifique que en el fondo de cada respirómetro haya una capa de algodón absorbente impregnado con una solución de KOH al 15% (se puede sustituir el algodón de KOH colocando algunos pellets de desecante). Esta capa de algodón debe estar cubierta con otra capa de algodón seco no absorbente, para evitar el contacto de la preparación biológica con el KOH odesecante. 4. Dispense una cantidad de frijoles germinados hasta llenar la mitad de uno de los respirómetros. Cuente el número de semillas que colocó en la cámara experimental. Obtenga el peso neto de las semillas. 5. Repita los pasos 4 y 5 con un segundo respirómetro, pero ésta vez coloque unr animal pequeño disponible (anélidos, grillos, cucarachas). termómetro Recuerde obtener el peso del animal antes de introducirlo al respirómetro 6. El tercer respirómetro utilícelo para ensamblar el control (verifique con su instructor si lo ensambló correctamente). pipetas Muestras experimentales masking 7. Cierre cada una de las cámaras tape experimentales con el tapón respectivo. Asegúrese de que la entrada de aire a través de la jeringa (respiradero) queda abierta, permitiendo el flujo de aire hacia la cámara experimental. Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 5 8. Transfiera ambos respirómetros hacia el contenedor de agua. Recuerde verificar que no haya fuga de aire ni entrada de agua en el respirómetro una vez que coloque los organismos vivos en la cámara experimental. 9. Use un gotero para colocar en ambos respirómetros una gota de colorante en el extremo de la pipeta. Asegúrese de apretar suficientemente el bulbo del gotero de forma que la burbuja del colorante se ubique en la región de la pipeta donde pueda leer fácilmente. Esto es muy importante porque usted necesita medir el desplazamiento de la burbuja a lo largo de la pipeta en función del tiempo. 10. Antes de comenzar a tomar sus datos, cierre la entrada de aire con el émbolo de la jeringa. Anote el tiempo y la posición de la burbuja. Anote la temperatura. 11. Mida la posición de la burbuja cada 5 min por espacio de 30 min y repórtelo en su cuadro de datos. 12. Haga una gráfica que permita comparar la tasa respiratoria entre animales y plantas. 13. Determine la tasa respiratoria en cada condición experimental. Exprese sus resultados en ml/min/peso del organismo. Al finalizar el experimento, remueva los respirómetros del baño, desármelos cuidadosamente y lave los restos de colorante Prohibida la reproducción parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA