Biologie Appliquée
Propriétés électriques de la membrane
plasmique
Le patch clamp
TD3
2015
Stéphanie Sigaut
INSERM U1141
[email protected]
1
Base du potentiel membranaire (1)
la cellule possède la caractéristique d'avoir une polarisation négative par
rapport à l'extérieur : l'intérieur de la cellule est négatif par rapport à l'extérieur.
L’existence de ce potentiel de membrane est universelle aux cellules vivantes.
Les propriétés de la membrane plasmique (bicouches de phospholipides) sont à
l'origine de cette différence de potentiel :
-  L’imperméabilité aux ions : permet de maintenir les différences de
concentration ioniques de part et d'autre de la membrane, et donc un gradient
chimique
-  Une haute résistance électrique : permet de maintenir une différence de
potentiel, donc un gradient électrique
Base du potentiel membranaire (2)
Un déséquilibre ionique entre le milieu intérieur et le milieu extérieur est l’un
des phénomènes à l’origine du potentiel membranaire
Concentration des ions dans les milieux intracellulaires et extracellulaires
Gradient chimique (de concentration )
- Les solutions ioniques des milieux intra et extracellulaire doivent être
électriquement neutre. Elles doivent chacune contenir autant d'anions que de
cations. C'est le principe de l'électroneutralité.
- Le nombre de particules en solution situé de chaque côté de la membrane doit être
le même, quelle que soit la charge de ces particules. C'est l'équilibre osmotique.
- Le gradient chimique de ces ions est maintenu par des pompes consommant de
l’énergie, notamment la pompe sodium-potassium.
Base du potentiel membranaire (3)
A l'état de repos, la perméabilité membranaire au potassium (K+) est 75 plus
élevée qu’au sodium (Na+).
C’est la présence de canaux potassiques ouvert au repos qui permet au
gradient chimique de cet ion de se dissiper par un phénomène de diffusion. Au
repos, Il y a donc une sortie d’ions K+ poussés par le gradient chimique.
Donc dans le milieu intracellulaire les charges négatives se retrouvent en excès :
cela génère un gradient électrique.
Base du potentiel membranaire (4)
Le gradient électrique a tendance à envoyer les charges positives vers l’intérieur
de la cellule et les charges négatives vers l’extérieur
Le gradient chimique a tendance à faire sortir les ions K+ mais est contrebalancé
par le gradient électrique qui s’oppose à cette sortie
Point d’équilibre entre ces 2 forces auquel K+ ne va plus circuler : potentiel
d’inversion de l’ion = potentiel de Nernst
Potentiel d’inversion du K+ = -90mV
Si différence de potentiel au niveau de la membrane est supérieure : K+ sortent
de la cellule
Si différence de potentiel au niveau de la membrane est inférieure (plus
négative) : K+ rentrent dans la cellule
Base du potentiel membranaire (5)
le potentiel de repos d’une cellule se définit comme étant la valeur du voltage
pour laquelle le courant ionique net au niveau de la membrane est nul, c'està-dire que le système est à l’équilibre et ce en l’absence de tout stimulus.
Chez une cellule animale le potentiel de membrane au repos varie entre –20 mV
et –200 mV en fonction de la quantité et du type de canaux ouverts au repos.
Potentiel électrochimique de membrane (1)
Soit une membrane séparant deux compartiments 1 et 2 (contenant des solutions ioniques isotoniques).
Cette membrane est perméable à l'eau et aux cations (+) mais imperméable aux anions (-).
La concentration en anions (-) et en cations (+) est plus élevée dans le compartiment 1 que dans le
compartiment 2.
A. Sous l'influence du gradient de concentration : [C+]1 > [C+]2, les cations, seuls diffusibles, vont passer
du compartiment 1 vers le compartiment 2 (flèches noires).
Ces cations, quittant le compartiment 1, libèrent les charges (-) des anions non diffusibles et créent un
excédent de charges (+) dans le compartiment 2.
B. Le transfert des cations de 1 vers 2 a polarisé la membrane et crée un gradient électrostatique de
2 vers 1, qui tend à s'opposer à la fuite ionique né du gradient de concentration.
Le flux ionique né d'un gradient de concentration est autolimité par le champ électrique qu'il
engendre.
-- > La valeur de la différence de potentiel entre les compartiments 1 et 2 est
donnée par l'équation de Nernst.
Potentiel électrochimique de membrane (2)
ÉQUATION DE NERNST
Eion (Volts) = (R .T / Z . F) . Ln ( [C+]2 / [C+]1)
R est la constante des gaz parfaits = 8,3144621 J/mol-1.K-1
C‘est le produit du nombre d‘Avogadro (nombre d‘entités qui se trouvent
dans une mole) et de la constante de Boltzmann (facteur de proportionnalité
reliant la température d'un système à son énergie thermique)
Elle établit le lien entre température, quantité de matière, pression et volume
T est la température en Kelvin
Z est la charge de l‘ion perméant (avec le signe)
F est la constante de Faraday = 96 485 coulombs.mol-1
C‘est le produit du nombre d‘Avogadro et de la charge élémentaire de
l‘électron
Elle représente la charge globale d‘une mole de charges élémentaires
Ln est le logarithme népérien
Potentiel électrochimique de membrane (2)
ÉQUATION DE NERNST
Eion (Volts) = (R .T / Z . F) . Ln ( [C+]2 / [C+]1)
ATTENTION !
Pour effectuer ces calculs, nous partons, à chaque fois, du principe
que la membrane est perméable à un seul ion et imperméable aux
autres.
Eion = ddp membranaire si un seul ion passe la membrane (en simplifiant on
peut considérer que c’est le cas quand le neurone est au repos où seul le K+
sort de la cellule)
C’est le potentiel d’inversion de l’ion
Soit une membrane neuronale de mammifère (T=37°c) :
T = 37 + 273 = 310 °K
(T° Kelvin = T° Celsius + 273)
R . T / F = (8.314 . 310) / 96 500 = 0.026
ln = 2.3 log10
1 Volt = 1 000 millivolts (mV)
Si, par convention, le milieu extracellulaire est le milieu de référence et que nous
prenions les valeurs des concentrations ioniques extra- ([ion]e) et intracellulaires ([ion]i) :
Eion (mV) = [(1 000 x 0.026 x 2.3) / Z] log10 [ion]e / [ion]i = (60 / Z) log10 [ion]e / [ion]i
Soit une membrane neuronale enregistrer au labo (T=20°c)
Eion (mV) = (58 / Z) log10 [ion]e / [ion]i
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Potentiel électrochimique pour plusieurs
composés ioniques
Si l’on admettait (J. Bernstein, 1902), que la membrane neuronale était sélectivement
perméable aux ions K+, des études plus récentes ont montré que la membrane
neuronale au repos est perméable, à la fois, aux ions K+ et Na+. Il apparaît
simplement, qu'au repos, la conductance membranaire des ions K+ (gK) est 75 fois plus
importante que celle des ions Na+ (gNa).
La valeur du potentiel de membrane à repos est lié :
- à la différence de concentration des ions entre les milieux intracellulaire
et extracellulaire ([conc])
- à la perméabilité de la membrane aux mêmes ions (g)
selon l’équation de Goldman-Hodgkin-Kantz:
Em (mV) = 58 x log10( gK[K+]ext+ gNa[Na+]ext) / (gK[K+]in+ gNa[Na+]in+)
Les cellules excitables
Certaines cellules spécialisées ont la capacité de se dépolariser brutalement quand leur
potentiel de membrane a été dépolarisé au-delà d'une valeur seuil.
Cette dépolarisation est suivie d'une repolarisation. C’est ce qu’on appelle un potentiel
d'action.
Il fait intervenir l'ouverture et la fermeture de canaux ioniques dépendant du potentiel
de membrane.
Ces canaux sont perméable :
-  au sodium ou au calcium (qui induisent la dépolarisation),
-  soit au potassium (qui induisent la repolarisation qui va parfois jusqu'à une légère
hyperpolarisation).
Les cellules excitables sont:
- les neurones
- les myocytes ou cellules musculaires cardiaques
- les cellules musculaires squelettiques striées
Exercice n°1
Une expérience menée avec l’équipement montré dans le schéma a permis
de mettre en évidence l’existence d’un potentiel de membrane au repos.
La différence de courant enregistré entre l’intérieur et l’ extérieur de la
cellule est de environ -70 mV (variation entre -20 mV et -200
mV en fonction du type cellulaire).
1. Comment pouvez vous expliquer cette distribution différente de charges
électriques (responsable de la tension électrique) entre le milieu intra et extra
cellulaire?
2. Comment le potentiel de membrane à repos est maintenu?
3. Peut-il y avoir des modifications du potentiel de membrane? Dans quelles
circonstances?
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Exercice n°1
Une expérience menée avec l’équipement montré dans le schéma a permis de mettre
en évidence l’existence d’un potentiel de membrane au repos. La différence de
courant enregistré entre l’intérieur et l’ extérieur de la cellule est de environ -70 mV
(variation entre -20 mV et -200
mV en fonction du type cellulaire).
1. Comment pouvez vous expliquer cette distribution différente de charges
électriques (responsable de la tension électrique) entre le milieu intra et extra
cellulaire?
La concentration ionique est différente de part et d’autre de la membrane. Au repos la membrane est
perméable à certains ions et notamment au potassium. Cela entraine une fuite de K+ vers l’extérieur
de la cellule qui induit une séparation de charges et donc une différence de potentiel de part et d’autre
de la membrane.
2. Comment le potentiel de membrane à repos est maintenu?
Grace à la pompes la pompe NA/K
3. Peut-il y avoir des modifications du potentiel de membrane? Dans quelles
circonstances?
Modification de la Température ou lors d’un potentiel d’action
Exercice n°2
Calculez le potentiel de membrane au repos d’une cellule qui baigne dans
un liquide physiologique (voir schéma), si la membrane cellulaire était :
a.  imperméable aux ions
b.  perméable à un seul ion à la fois (dans ce cas la perméabilité (g) soit
toujours égale à 1);
c. perméable au Na+ et au K+ (mais pas aux autres ions) avec gNa = 0.1 et gK
=1.
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Exercice n°2
Calculez le potentiel de membrane à repos d’une cellule qui baigne dans un liquide
physiologique (voir schéma), si la membrane cellulaire était
T°C = 20°C
a. imperméable aux ions Em= 0mV
b. Perméable à un seul ions à la fois (donc la perméabilité est forcement =1)
Na+ : Em = 58/1 log (145/12)= 67,7
K+ : Em = 58/1 log (4/155)= -92,1
Cl-: Em = 58/-1 log (123/4,2)= -85
Ca2+: Em = 58/2 log (1,5/10-7)= 208
c. perméable au Na+ et au K+ (mais pas aux autres ions) avec gNa = 0.01 et gK =1.
Em = 58 log 10 (( 0,01x145) +4) / ((12x0,01)+155)
= -53,8 mV
Le Patch clamp
L’enregistrement local ou « patch clamp » est une technique qui permet l’étude
(entre autres ) de canaux ioniques, dont l’ouverture peut être déclenchée par
une variation du voltage ou la liaison d’une petite molécule (ligand).
Neher et Sakmann, 1976-1981 (Prix Noble de Physiologie 1991)
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Le Patch clamp
Lors des enregistrements en patch clamp,
on mesure le courant qui traverse toute la
membrane ou un morceau de membrane à
un potentiel donné.
Pour ceci, le potentiel de la membrane
(Vm) est maintenu à une valeur fixée par
l'expérimentateur (Vc pour commande).
On dit alors que le potentiel de la
membrane est imposé Vc.
L'expérience de patch clamp la plus
courante consiste à imposer des sauts de
potentiel à la membrane et à enregistrer le
courant qui traverse la membrane à travers
les canaux ouverts par ce saut de potentiel.
Cette technique est dite « patch clamp » avec voltage imposé.
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L’enregistrement local
Application d’un voltage
Enregistrement du courant électrique qui
traverse le canal ouvert (convention)
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L’enregistrement local
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Exercice n°3
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Exercice n°3
ouverture
1.
A=canal NA+ voltage-dépendant : il s’agit d’un courant entrant de charge + . Le canal se referme et s’inactive malgré
que l’on continue à imposer une dépolarisation à la membrane.
B=canal K+ voltage dépendant rectificateur : courant sortant de charge +. L’ouverture du canal est différé et sa
fermeture se produit lorsque la dépolarisation s’arrête.
2. Temps d’ouverture et de fermeture sont différents. Les courants sont en sens opposé.
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Exercice n°3
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Exercice n°3
D’après la fig. A et B,S
C’est canaux présente une
période réfractaire : les
canaux sont inactivables
même si la dépolarisation
continue.
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Exercice n°4
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Exercice n°4
La figure B montre que le courant entrant de sodium perdure durant toute la
dépolarisation. En présence de cette toxine l’inactivation des canaux sodiques est
inhibée.
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Exercice n°5
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Exercice n°5
Vm (mv)
a.
Période A = Période C : gna = 1 et gk = 100
Em = 58 log 10 (( 1x120) +(100x2,5) / ((1x10)+(100x140))
= -91 mV
Periode B : gna = 10000 et gk = 100
Tps (ms
Em = 58 log 10 (( 10000x120) +(100x2,5) / ((10000x10)+(100x140))
=59 mV
A
B
C
Exercice n°5
c. Lorsque la perméabilité au Na+ diminue, une augmentation de 10 fois
de la perméabilité au K+ est mise en évidence pendant 20 ms.
Comment pouvez-vous expliquer cette observation?
d. Modifiez le schéma de la perméabilité aux ions en fonction du temps.
e. Modifiez aussi, par conséquence, le schéma du potentiel de membrane
(Em) en fonction du temps.
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Exercice n°5
c. Lorsque la perméabilité au Na+ diminue, une augmentation de 10 fois de la
perméabilité au K+ est mise en évidence pendant 20 ms.
Comment pouvez-vous expliquer cette observation?
d. Modifiez le schéma de la perméabilité aux ions en fonction du temps.
e. Modifiez aussi, par conséquence, le schéma du potentiel de membrane (Em) en
fonction du temps.
c. dans ce cas gNa=1 et gk= 1000, de ce fait durant la période C’ de 20ms, gna = 10000 et gk = 100
Em = 58 log 10 (( 1x120) +(1000x2,5) / ((1x10)+(1000x140))
= -100 mV
Vm (mv)
+ 59
103
Tps (ms)
-91
-100
A
B
C
Exercice n°6
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Exercice n°6
1.Indiquez quel est le canal analysé : sodium (Na+) ou potassium (K+)?
Justifier la réponse.
2.Indiquez l’état du canal en figure 1a et 1b et la direction du flux des ions
3.Décrivez à l’aide de la figure 1c l’état des canaux sauvage, mutant en
absence ou en présence du peptide synthétique, au cours de l’expérience.
4.Quel est la conclusion que vous pouvez extraire de cette étude ?
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Exercice n°6
1.Indiquez quel est le canal analysé : sodium (Na+) ou potassium (K+)? Justifier la réponse.
Après la dépolarisation de la membrane nous observons un courant sortant. Du fait des
concentrations intracellulaires et extracellulaire de potassium et de sodium de part et d’autre de la
membrane des neurones, il s’agit d’un courant potassique. Le canal analysé ici est un canal
potassique.
2.Indiquez l’état du canal en figure 1a et 1b et la direction du flux des ions
1a. Canal ouvert
1b. Canal fermé
3.Décrivez à l’aide de la figure 1c l’état des canaux sauvage, mutant en absence ou en présence du
peptide synthétique, au cours de l’expérience.
Canal sauvage : La dépolarisation induit l’ouverture du cana puis rapidement la fermeture de ce canal
Canal mutant : Après la dépolarisation le canal reste ouvert
Canal mutant + peptide synthétique : En présence du peptide la fermeture plus lente
4.Quel est la conclusion que vous pouvez extraire de cette étude ?
La région Nter contrôle la durée d’ouverture du canal.