Plan du cours de Biologie
Plan du cours de Biologie I – Qu’est ce qu’une fonction biologique ? I-1- A l’échelle moléculaire et cellulaire Cours de Thierry Dintinger I-2- A l’échelle d’un organe I-3- A l’échelle d’un organisme II – Caractérisation d’une dysfonction biologique ? Qu’est que la variabilité biologique ? II-1- Comment mesurer une fonction biologique et détecter une dysfonction ? Cellule végétale Cellule animale Microscope électronique Microscope optique Œil nu Les différents niveaux d’observation doigt Épiderme : tissu Organelle bactérie Virus Ribosome Cellule Mitochondrie Poly-ribosomes, complexe protéique Ribosome Structure protéique Atome Protéine globulaire Petite molécule Atome Plan du cours de Biologie I – Qu’est ce qu’une fonction biologique ? I-1- A l’échelle moléculaire et cellulaire Cours de Thierry Dintinger I-2- A l’échelle d’un organe I-3- A l’échelle d’un organisme II – Caractérisation d’une dysfonction biologique ? Qu’est que la variabilité biologique ? II-1- Comment mesurer une fonction biologique et détecter une dysfonction ? II – 1 – 1 – A l’échelle moléculaire et cellulaire La microscopie : observation structurale Cellule végétale Cellule animale Microscope électronique Microscope optique Œil nu Les différents niveaux d’observation doigt Épiderme : tissu Organelle bactérie Virus Ribosome Cellule Mitochondrie Poly-ribosomes, complexe protéique Ribosome Structure protéique Atome Protéine globulaire Petite molécule Atome Les microscopes optiques ou photoniques Microscopie classique Exemples : L’hémogramme ou Numérations-Formule Sanguine (NFS) Objectif = caractériser et quantifier les différentes cellules sanguines ou éléments figurés Globules blancs Neutrophiles Globule blanc basophile Globule blanc éosinophile Globule blanc monocyte Plaquettes Globules rouges Globule blanc (hématies) lymphocyte Exemples : L’hémogramme ou Numérations-Formule Sanguine (NFS) GR = Homme 4,5 à 6.106/mm3 Femme 3,8 à 5,5.106/mm3 GB = 5000 à 10 000 /mm3 Polynucléaires neutrophiles 30 à 70% Polynucléaires éosinophile 0 à 4% Polynucléaires basophiles 0 à 1% Lymphocytes 30 à 40% Monocytes 4 à 8% Plaquettes = 150 000 à 450 000 /mm3 Anomalies de l’hémogramme Plasmodium falciparum = Agent de la malaria ou paludisme Drépanocytose = Anémie à cellules falciformes Hyperleucocytose = Quantité de globules blancs anormale Détection d’anomalies structurales Exemple : Muscles squelettiques dans la Dystrophie de Duchenne Muscle humain sain Muscle humain malade (stade peu avancé) Muscle humain malade Muscle humain malade (stade avancé) (stade très évolué) Les microscopes optiques ou photoniques Microscopie à fluorescence Les microscopes optiques ou photoniques Microscopie confocale Orifice confocale Miroir séparateur de faisceau Tube Photomultiplicateur ou caméra CCD Hors plan focal Dans le plan focal Hors plan focal Les microscopes optiques ou photoniques Microscopie à fluorescence Microscopie confocale Les microscopes électroniques Microscopie électronique à transmission Les microscopes électroniques Microscopie électronique à transmission Exemple : biosynthèse de l’insuline dans les cellules ß des îlots de Langerhans du pancréas Marquage de l’insuline par une bille d’or Condition 1 Condition 2 Les microscopes électroniques Microscopie électronique à balayage Plan du cours de Biologie I – Qu’est ce qu’une fonction biologique ? I-1- A l’échelle moléculaire et cellulaire Cours de Thierry Dintinger I-2- A l’échelle d’un organe I-3- A l’échelle d’un organisme II – Caractérisation d’une dysfonction biologique ? Qu’est que la variabilité biologique ? II-1- Comment mesurer une fonction biologique et détecter une dysfonction ? II – 1 – 1 – A l’échelle moléculaire et cellulaire La microscopie : observation structurale Mesures de fonctions biologiques : exemple de l’activité électrique cellulaire et unitaire La bioélectricité, Historique Mosaïque de Pompéï (100 av J-C) montrant Torpedo torpedo La bioélectricité, Historique = naissance de l’électrophysiologie Galvani en 1791 montre pour la 1ère fois qu’un muscle se contracte lorsque le muscle et le nerf associé sont touchés par un arc de métal La bioélectricité, Historique = naissance de l’électricité Alessandro Volta Organe électrique de la torpille La pile de Volta La bioélectricité, Historique = naissance de l’électrophysiologie 1820 : André-Marie Ampère, Michael Faraday, Jean-Baptiste Biot, etc… : description des premières lois définissant l’électricité 1827 : George Ohm : Loi d’OHM, U = RI . 1840 : Carlo Matteucci : mesure du potentiel de repos à partie d’une section de muscle 1848 : Du Bois Reymond : Potentiel d’action sur un nerf 1868 : Bernstein : L’intérieur et l’extérieur des cellules sont composées d’électrolytes de différentes concentrations séparées par une membrane perméable à ces électrolytes 1888 : Nernst: Lo i d e N e r n s t d o n n a n t l e p o t e n t i e l d ’é q u i l i b r e d ’u n i o n . 1902 : Bernstein : Th é o r i e d e l a m e m b r a n e : le potentiel de repos est dû aux propriétés de la membrane plasmique, l e s c o n c e n t r a t i o n s i o n i q u e s s o n t d i f fé r e n t e s d e p a r t e t d ’a u t r e s d e l a m e m b r a n e , perméabilité au potassium de la membrane au repos 1 9 3 5: microélectrode intracellulaire 1949 : Ling-Gérard : Pr e m iè r e m i c r oé l e c t r o d e d e v e r r e . 1952 : Hodgkin-Huxley :Te c h n i q u e d u v o l t a g e c l a m p 1982 : Neher-Sakmann : Te c h n i q u e d e p a t c h c l a m p , 2000 : Pr i x N o b e l d e Mé d e c i n e . Analogie électron/voiture/ion Phénomène électrique Analogie avec le trafic routier Phénomène ionique Courant électrique : i ou I Quantité de charges portées par des électrons circulants par unité de temps Porteurs de charges = électrons Unité de courant = ampère Trafic routier : Quantité de voitures circulantes par unité de temps Porteurs de charges = voitures Courant ionique: i ou I Quantité de charges (et non d’ions) portées par des ions circulants par unité de temps Porteurs de charges = ions Unité de courant = µA, nA ou pA Résistance : R Obstacle au passage des électrons Unité de résistance = Ohm ou Ω Péage routier : Obstacle au passage voitures Résistance d’un canal ou des canaux : r ou R Obstacle au passage des ions, déterminé par le diamètre du canal ionique et la quantité de canaux présents sur la membrane. Unité de résistance = MΩ ou GΩ Conductance : g = 1/R Facilité avec laquelle les électrons circulent Unité de conductance = Siemens ou S des Conductance d’un canal ou des canaux : γ ou g Capacité à laisser passer les ions à travers la membrane Unité de conductance = µS, nS ou pS Analogie électron/voiture/ion Analogie avec le trafic routier Phénomène électrique Phénomène ionique Potentiel électrique : E (U, V) Quantité de charges accumulées en un point Unité de potentiel = volt ou V Quantité de voiture en un point : Par exemple avant le péage Difficile à estimer Différence de potentiel ou tension : U, V (E) Différence en quantité de charges entre 2 points Unité de potentiel= Volt ou V Différence de quantité de voiture avant et après le péage Différence de potentiel : U, V (E) Différence en quantité de charges entre 2 points entre les faces extra et intracellulaire de la membrane Unité de potentiel = mV Loi d’Ohm : U = RI I = Intensité de courant, ampère, A, µA, nA, pA U = force électromotrice = driving force, mV U = potentiel de mb-potentiel d’équilibreion = (Vm-Eion) R = la résistance, en ohm, Ω, MΩ ou GΩ La membrane plasmique et les concentrations ioniques Ca2+ Na+K Cl- + Membrane plasmique Ca2+ Na+ K+ Cl- [ion] [ion] intracellulaire extracellulaire Na+ K+ Ca2+ Cl- 14 mM 160 mM 100 nM 14 mM 140 mM 3 mM 2 mM 150 mM Notion de potentiel d’équilibre : Loi de Nernst Insertion d’un canal potassique Gradient de [K+] Gradient de [Na+] Gradient de charges Insertion d’un canal sodique Gradient de [K+] Gradient de [Na+] Gradient de charges Gradient de [K+] Gradient de [Na+] Gradient de charges Définition du potentiel de repos K+ + - K+ - P P i 2K+ K+ K+ Pi- P K+ K+ Pi-P-Pi- P ATP 3Na+ + K Iconduction IK+ =Dépend surIdiffusion + gradient chimique Dépend sur gradient électrique Courant potassique global ADP + Pi Notion de potentiel d’équilibre : Equation de Nernst Iion = Courant ionique global Eion = RT Ln ZF Idiffusion Dépend sur gradient chimique [ion]e [ion]i + Iconduction Dépend sur gradient électrique R = constante des gaz parfaits (8,314 J/K/mole) T = Température absolue dans le corps = (273°K + T en °C) F = constante de Faraday (96500 coulons/mole) Z = valence de l ’ion (1 pour K+, Na+ et 2 pour Ca2+, -1 pour Cl-) [ion]e = Ce = concentration externe [ion]i = Ci = concentration interne Ln = 2,3 log10 RT à 20°C si z= 1, 2,3 = 58,2 mV zF [ion]e Eion = 58,2 log [ion]i Valeur de RT/F selon la température Concentrations en ions dans les milieux interne et externe de mammifères et potentiels d’équilibre [ion] intracellulaire Na+ K+ Ca2+ Cl- 14 mM 160 mM 100 nM 14 mM [ion] extracellulaire 140 mM 3 mM 2 mM 150 mM Eion + 58 mV - 100 mV + 232 mV - 60 mV Si Vm-Eion > 0 --> sortie de cations ou entrée d’anions dans la cellule Si Vm-Eion < 0 --> entrée de cations ou sortie d’anions de la cellule Vm = potentiel de membrane Eion = potentiel d’équilibre de l’ion Equation de Goldman-Hodgkin –Katz = estimation mathématique du potentiel de membrane PK [K+]e + PNa [Na+]e + PCl [Cl-]i Vm = RT/F Log PK[K+]i + PNa [Na+]i + PCl [Cl-]e Vm = potentiel de membrane P = coefficient de perméabilité ext gCa gNa gK Dion --> coefficient de diffusion P = ßion . ∆x --> épaisseur de la membrane coefficient de partage de l’ion gCl Cm ECa ENa EK ECl int pompe Na/K pompe calcique Représentation électrique (circuit) équivalent de la membrane plasmique Mesure du potentiel de membrane oscilloscope amplificateur - - - - - Cellule ddp = 0 mV oscilloscope amplificateur - - - - - Cellule ddp = -80 mV Potentiel membranaire de repos Variations du potentiel de membrane ENa = +60 mV 0 mV lorsque le potentiel de membrane se déplace vers des valeurs moins négatives ou positives, la cellule se dépolarise dépolarisation Potentiel de membrane Vm = -70 mV EK = -90 mV hyperpolarisation lorsque le potentiel de membrane se déplace vers des valeurs plus négatives la cellule s’hyperpolarise Mesure du potentiel d’action Condition d’enregistrement : courant imposé ou current clamp Quantité connue de courant injectée dans la cellule --> lecture de la variation du potentiel transmembranaire potentiel d’action microélectrode cellule d’enregistrement V I microélectrode stimulatrice potentiel d’action potentiel électrotonique seuil V I Le potentiel d’action nerveux Exemple de l’axone de calmar V (mV) overshoot ENa+ (environ +60 mV) phase ascendante ou dépolarisation V repos -60 mV EK+ phase descendante ou repolarisation seuil phase d’ hyperpolarisation (environ –90 mV) Autres potentiels d’action Cellule ganglionnaire de rétine de lapin Fibre de purkinje de cœur de chèvre Axone myélinisé de nerf de grenouille Corps cellulaire de cellule de purkinje de cervelet de rat Autres potentiels d’action PA auriculaire PA ventriculaire Mesures de PA dans des neurones ganglionnaires Sujet sain Sujet présentant une altération d’un canal sodique (mutation) Les canaux modulent le potentiel de membrane Le patch-clamp Principe du patch clamp Mesure de courant à travers un canal = courant élémentaire ou unitaire Mesure de courant à travers un canal = courant élémentaire ou unitaire Mesure de courant cellulaire ou macroscopique Mesure de courant à travers un canal = courant élémentaire ou unitaire Courant macroscopique global potentiel de maintien potentiel test dépolarisation 0 mV Potentiel Imposé (mV) -70 mV Courant mesuré (mA, nA ou pA) positif négatif Courants unitaires Courants unitaires : exemple d’analyse 2 états du canal Nbre de mesures Nbre de mesures fermé Courbe de Gauss -5 0 5 10 Amplitude (pA) ouvert -5 0 5 10 Amplitude (pA) Aire état ouvert Aire état fermé P0 = --------------------------------- PF = --------------------------------- Aire état ouvert + Aire état fermé Aire état ouvert + Aire état fermé Recherche thérapeutique : exemple anesthésiques locaux Recherche de dysfonction: exemple d’un canal calcique Contexte pathologique : migraine hémiplégique familiale Crise de migraine associée à des troubles moteurs réversibles, parfois fièvre et coma problème de mutation au niveau d’un canal calcique de type P/Q exprimé dans les neurones du cerveau (cervelet, cortex cérébral, tronc cérébral) Canal calcique exprimé chez un sujet sain Canal calcique muté exprimé chez un sujet malade Moins d’entrée de calcium pour une même stimulation Diminution du seuil d’excitabilité des neurones Moins de libération de neuromédiateurs Altération de la communication/transmission d’informations troubles physiologiques Plan du cours de Biologie I – Qu’est ce qu’une fonction biologique ? I-1- A l’échelle moléculaire et cellulaire Cours de Thierry Dintinger I-2- A l’échelle d’un organe I-3- A l’échelle d’un organisme II – Caractérisation d’une dysfonction biologique ? Qu’est que la variabilité biologique ? II-1- Comment mesurer une fonction biologique et détecter une dysfonction ? II – 1 – 1 – A l’échelle moléculaire et cellulaire La microscopie : observation structurale Mesures de fonctions biologiques : exemple de l’activité électrique cellulaire et unitaire exemple de l’activité enzymatique : colorimétrie et chimioluminescence Mesure d’une activité enzymatique : application au dosage de la glycémie Glucose oxydase Glucose (4-amino phénazone + phénol) Acide Gluconique Principe de la spectrométrie ε Absorbance (A) ou Densité Optique (DO) : A = log Io/I Transmission T = I/Io et donc : A = log Io/I = -log T I0: intensité d’un faisceau lumineux monochromatique incident (λ, longueur d’onde en nm) I1: intensité du faisceau lumineux monochromatique sortant (λ, longueur d’onde en nm) c: concentration de la solution inconnue (mol. L-1) l: trajet optique (généralement 1 cm) ε: coefficient d’extinction molaire de la substance (L. mol-1. cm-1) Relation de Beer-Lambert : DOλ = ελ.l.C La DO mesurée à une longueur d’onde donnée est - proportionnelle à la concentration du produit (ou des produits) présents dans la solution qui absorbent la lumière à cette longueur d’onde - proportionnelle à la longueur du trajet optique (distance sur laquelle la lumière traverse la solution). ε : coefficient d’extinction molaire d’un produit pur en solution. ε rend compte de la capacité du produit à absorber la lumière, à la longueur d’onde λ. (unité : M-1 cm-1) Principe de la spectrométrie (2) Domaine UV-visible de la spectrophotométrie Principe de la spectrométrie (3) Spectrophotomètre source lumineuse à spectre continu : • lampe à filament de tungstène utilisable entre 300 nm et 1 100 nm, • lampe à décharge dans le deutérium, utilisable en UV entre 190 nm et 350 nm. La bandelette de dépistage de troubles de la fonction rénale Estimation colorimétrique dans les urines du taux de - Glucose - Corps cétonique - Globules blanc - Nitrites - Protéines - Hémoglobine - Bilirubine - Etc… = Evaluation biochimique de la fonctionnalité de certains organes Mesure d’une molécule biologique par chimioluminescence Péroxydase + catalyseur de réaction Péroxyde d’hydrogène Luminol Lumière bleue Luminol oxydé Chimioluminescence : application en criminologie Empreinte Plan du cours de Biologie I – Qu’est ce qu’une fonction biologique ? I-1- A l’échelle moléculaire et cellulaire Cours de Thierry Dintinger I-2- A l’échelle d’un organe I-3- A l’échelle d’un organisme II – Caractérisation d’une dysfonction biologique ? Qu’est que la variabilité biologique ? II-1- Comment mesurer une fonction biologique et détecter une dysfonction ? II – 1 – 1 – A l’échelle moléculaire et cellulaire La microscopie : observation structurale Mesures de fonctions biologiques : exemple de l’activité électrique cellulaire et unitaire exemple de l’activité enzymatique : colorimétrie et chimioluminescence exemple d’interaction moléculaire Bioluminescence : l’aequorine, première sonde calcique Aequoria victoria Bioluminescence : l’aequorine, première sonde calcique Fluorescence : la Green fluorescent protein (GFP) Apoaequorin Coelentazine Ca2+ Photon (470 nm) Photon (509 nm) Coelentéramide GFP Sonde fluorescente et mesure des variations de [Ca2+]i dans des neurones Les cellules ont été chargées par du Fluo-3 et une stimulation locale est effectuée par du KCL 55 mM (flèche) Sonde fluorescente et mesure des variations de [Ca2+]i dans des cellules acineuses pancréatique La cellule est stimulée par de la sérotonine (3 nM) --> vague calcique qui se propage du pôle basal vers le pôle apical Les cellules ont été chargées par du Fluo-3 et observées en microscopie confocale Marquage des protéines à la GFP : principe Condition normale Génie génétique : incorporation du gène codant pour la GFP Marquage des protéines à la GFP : observations cellulaire et subcellulaire Marquage de différentes protéines et visualisation de leur devenir au cours de la mitose Visualisation du transport des vésicules le long de l’axone Marquage des protéines à la GFP : observations sur des organismes entiers et vivants Extraction de différentes molécules fluorescentes à partir des Identification de types cellulaires neuronales par marquage spécifiques Identification de structures cellulaires par marquage spécifiques Plan du cours de Biologie I – Qu’est ce qu’une fonction biologique ? I-1- A l’échelle moléculaire et cellulaire Cours de Thierry Dintinger I-2- A l’échelle d’un organe I-3- A l’échelle d’un organisme II – Caractérisation d’une dysfonction biologique ? Qu’est que la variabilité biologique ? II-1- Comment mesurer une fonction biologique et détecter une dysfonction ? II – 1 – 1 – A l’échelle moléculaire et cellulaire La microscopie : observation structurale Mesures de fonctions biologiques : exemple de l’activité électrique cellulaire et unitaire exemple de l’activité enzymatique : colorimétrie et chimioluminescence exemple d’interaction moléculaire : bioluminescence et fluorescence II – 1 – 2 – A l’échelle d’un organe
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