TEMA 3. AISLAMIENTO, SELECCIÓN,
MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN DE
CEPAS MICROBIANAS
1.- Fuentes para su obtención
2.- Aislamiento y selección de microorganismos
Screening primario
Screening secundario
3.- Mantenimiento y conservación de microorganismos
Objetivos
Técnicas de mantenimiento y conservación
Subcultivo seriado
Desecación
Congelación
Liofilización
4.- Conservación de diferentes grupos microbianos
Algas
Bacterias
Virus
Hongos
_______________
1. FUENTES PARA SU OBTENCIÓN
a. Suelo y agua
b. Fermentaciones naturales (obtener Saccharomyces de la fermentación del vino, o Lactobacillus
del queso)
c. Animales y plantas, en el caso de las vacunas
d. Colecciones internacionales de cultivos tipo
FUENTES VS OBJETIVOS EN BIOTECNOLOGÍA
1. Células microbianas propiamente dichas (SCP, biofertilizantes, vacunas...): agua y suelo, animales y
plantas.
2. Macromoléculas que sintetizan (enzimas, polisacaridos...): fermentaciones naturales, suelos y agua.
3. Productos del metabolismo, primario (compuestos esenciales para su crecimiento) y secundario
(compuestos no esenciales): suelo y agua, fermentaciones naturales.
4. Bioconversiones: suelo y agua.
5. Alimentos (queso, leche fermentada, encurtidos...): fermentaciones naturales.
6. La lixiviación bacteriana de menas: suelo y agua.
7. Tratamiento de residuos y biorremediación: suelo y agua.
2. AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS
A este proceso se le denomina screening, y consta de dos partes:
-Screening primario, buscar microorganismos potencialmente útiles en biotecnología.
-Screening secundario, dentro de estos microorganismos observar cual es más útil (cual crece más rápido, que
producto es mejor...), y luego se modifica este microorganismo.
2.1.- SCREENING PRIMARIO
Primero se realiza una suspensión del 10% de la fuente, generalmente el suelo, de esta forma se separan las
bacterias que estaban unidas a las partículas del suelo y se quedan en la suspensión).
A continuación se realizan diluciones seriadas (1/10) para aislar las colonias y se realiza el recuento para ver
ufc/g. Se aplican técnicas de selección para buscar las colonias que producen la sustancia de interés, hay que ver
que tengan actividad y frente a que, ver cuanto producen para ver si es rentable, e identificar el microorganismo.
SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS
Sembramos el microorganismo en estría en una placa donde hay otro microorganismo contra el que queremos
que actue el antibiótico; ambos van a crecer; si el que hemos sembrado en estría produce antibiótico contra el que
está sembrado en la placa, este no va a crecer alrededor de la estría.
Cuantificación de la producción de antibiótico: Cultivamos ambos microorganismos, el que produce antibiótico y
sobre el que queremos actuar. En el cultivo del productor de antibiótico separamos las células del sobrenadante
de cultivo y nos quedamos con este (por centrifugación), ahi está el antibiótico. Añadimos el antibiótico en la placa
donde habíamos puesto a crecer el microorganismo sobre el que queremos actuar, y alrededor ponemos muestras
crecientes de un antibiótico conocido a concentraciones conocidas, para después, cuando midamos el halo, hacer
una recta de regresión y calcular la cantidad de antibiótico que produce el organismo en proporción a la cantidad
del antibiótico conocido.
SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE FACTORES DE CRECIMIENTO
Ponemos un medio en el que crezca el factor de crecimento que nos interesa. Se coge un microorganismo de
prueba que es auxotrofo (mutante incapaz de crecer en un medio que no contenga un metabolito en concreto ya
que no es capaz de producirlo) y lo colocamos en un medio de cultivo que contenga todos los nutrientes menos el
factor de crecimiento que no puede producir, por tano, el microorganismo no va a crecer. A continuación, los
microorganismos que hemos seleccionado para ver si producen el factor de crecimiento son sembraados en la
placa en estría, si alguno produce esta factor el microorganismo auxotrofo crecerá alrededor de la estría del
microorganismo productor.
Un factor de crecimiento puede ser, por ejemplo, una vitamina.
SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ENZIMAS
Vamos a verlo con las celulasas (hidrolasas que cortan polímeros de glucosa unidos por enlaces β-1,4. La
celulosa se usa en la industria textil y en la elaboración de comprimidos ya que es inerte para los humanos al ser
incapaces de digerirla.
Para detectar las celulasas tenemos que añadir al medio el compuesto que nos interese, en este caso celulosa
(si fueran amilasas añadiríamos almidón), se siembran los microorganismos aislados en estría, que crecen y
sintetizan las celulasas que degradan la celulosa, esto no se puede observar, asi que se añade un colorante que
se une específicamente a la celulosa, el rojo Congo que se añade sobre la placa y esta se tiñe de rojo menos en
las zonas donde el microorganismo que ha producido celulasas, ya que el rojo congo no tiene entonces sustrato al
que unirse.
En la industria es fundamental el proceso de selección, que nos permite rastrear miles de microorganismos para
encontrar el que nos interesa.
2.2.- SCREENING SECUNDARIO
Para conseguir pasar el microorganismo de la escala piloto a la escala industrial tenemos que:
-diseñar medios de cultivo a escala industrial
-realizar una mejora genética de las cepas obtenidas
-desarrollar los sistemas de producción industrial (como vamos a poder separarlo de los demás productos q se
van a obtener-purificación y almacenamiento
-hacer un análisis económico final
3. MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN DE CEPAS MICROBIANAS
El mantenimiento implica cortos períodos de tiempo (días), y la conservación, largos peridoso de tiempo (años).
Para conservar y mantener una bacteria tenemos que:
1-Mantener los cultivos viables a lo largo del tiempo
2-Mantener los cultivos puros, sin contaminaciones
3-Mantener los cultivos estables (genéticamente inalterable)
Hay que evitar que el microorganismo se duplique para que no se produzcan modificaciones en el DNA), para
ello vamos a modificar la temperatura, bajándola (a temperaturas altas las enzimas funcionan mejor, su
temperatura óptima es elevada) ya que asi su metabolismo está muy ralentizado (a -20ºC las bacterias no se
dividen ya que el agua no está en estado liquido).
TÉCNICAS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN
1. Subcultivo seriado: es un método válido para el mantenimiento; consiste en resesembrar el microorganismo
cada cierto tiempo en su medio adecuado, según la temperatura se va a mantener más o menos tiempo:
-Tª ambiente (24ºC), durante 7-15 días, luego hay que refrescarlos, darles agua
-Tª frigorífico (4ºC), durante 1-3 meses
2. Desecación: consiste en eliminar el agua evaporándola; es un método válido para microorganismos
esporulados que aguantan las altas temperaturas. Puede ser desecación en:
-En suelo, arena, silicagel
-En papel de filtro
-Líquida (D-Drying), aplicando vacío, en desuso
-En bolitas de alginato
-En sal
3. Congelación: algunos factores afectan a la viabilidad y estabilidad de este proceso:
- Edad de las células
- Velocidad de congelación y descongelación
- Temperatura de almacenamiento
- Agentes crioprotectores, que son sustancias que favorecen que las células no se rompan en el proceso, ya
que al congelar, el agua que está en el citoplasma se convierte en cristales que pueden romper la membrana,
estos agentes evitan la formación de cristales de hielo
Para la congelación se usan 3 temperaturas, -30º (congelador de frigorífico), -70ºC (nieve carbónica-anhídrido
carbónico en estado sólido) y -196ºC (nitrógeno líquido). Generalmente se usan -70º ya que a -30ºC se forman
eutécticos.
4. Liofilización: se elimina el agua congelando y sublimando por el vacío. Hay ciertos factores que influyen en la
viabilidad y estabilidad de este método:
- Los crioprotectores
- El tipo de microorganismo
- El número de células
- La temperatura de sublimación (a mayor vacío, menor temperatura)
- Grado de deshidratación alcanzado
- Atmósfera del tubo (se echa nitrógeno para eliminar el oxígeno en la ampolla y se cierra, así no queda agua
y se cierra herméticamente, la atmosfera que queda es nitrógeno, un gas inerte)
-condiciones de almacenamiento (se suele usar el frigorífico).
4. CONSERVACIÓN DE DIFERENTES GRUPOS MICROBIANOS
Con cada grupo de microorganismos se suelen usar diferentes técnicas:
Algas: subcultivo, desecación, congelación
Bacterias: congelación, liofilización (sobre todo al transportarlas), desecación
Hongos: desecación (suelen ser esporulados), liofilización
Virus: congelación
Micoplasma: liofilización, congelación
Líneas celulares: subcultivo, congelación
En estos tres últimos se suele usar la congelación por nitrógeno al no tener pared celular.