סוכרים, מלבד היותם נוטריינטים מטבוליים ומרכיבי מבנה, משמשים כגורמי בק
תקציר- סוכרים ,מלבד היותם נוטריינטים מטבוליים ומרכיבי מבנה ,מבקרים מספר רב של תהליכים במהלך חיי הצמח .המנגנון אשר באמצעותו צמחים עילאיים חשים ומגיבים לסוכר אינו ידוע ברובו. הקסוקינאזות מיטוכונדיראליות ) (mtHXKsהינם אנזימים מזרחני גלוקוז אשר בנוסף לתפקידם האנזימתי מבקרים מגוון רחב של תהליכים ביוכימיים והתפתחותיים כדוגמת פוטוסינתזה ,גדילה, ותגובות הורמונליות .בצמחי ארבידופסיס ישנם שני AtHXK1 -mtHXKsו . AtHXK2 -מחקרים קודמים שנעשו בצמחי ארבידופסיס ועגבניה אפיינו את AtHXK1ו AtHXK2 -כאנזימי מפתח בבקרת חישת הסוכר .יחד עם זאת ,לא ידוע באיזה רקמות ובאילו תנאים בקרה זו מתרחשת .בכדי לקבוע באילו רקמות AtHXK1ו AtHXK2 -מתבטאים ,בודדנו את הפרומוטורים שלהם ועקבנו אחר ביטויים בצמחי ארבידופסיס בעזרת הגן המדווח . GUSמתוצאות אנליזת ביטוי הפרומוטורים עולה כי בשלב מוקדם של הנביטה שני הגנים מתבטאים ברוב רקמות הצמחון אך לאחר מכן ביטויים ממודר לרקמות ספציפיות .בצמחים בוגרים שני הפרומוטורים מתבטאים ברקמות ההובלה של איברים מסוימים ,ובאיזורים בהם מסונתז אוקסין :הידטות ) ,( hydathodesטריכומות ,צלקת ועלי לוואי ) -( stipulesאינדיקציה לקשר שבין אוקסין HXK ,והתפתחות מערכת ההובלה .בנוסף ,ביטוי הפרומוטורים בתאים פוטוסינתטיים כדוגמת תאי מזופיל ותאי שמירה מרמז על תפקיד אפשרי של AtHXK1ו AtHXK2 -בבקרת פוטוסינתזה. עובדה מעניינת היא ,שלמרות שחישת סוכר דרך AtHXKsמתווכת על ידי הורמונים שונים ,הוספה חיצונית של סוכרים ) (glucose, sucroseוהורמונים )(absicic acid, salycilic acid, gibrellin מעכבת את ביטוי הגנים AtHXK1ו . AtHXK2 -מתוצאות אלה ניתן להסיק שבחישת הסוכר קיים משוב שלילי שבו הביטוי של AtHXK1ו AtHXK2 -מבוקר בעצמו .הביטוי של AtHXK1ושל AtHXK2מבוקר גם על ידי עקות אביוטיות )יובש ,מלח ,פציעה ,חום וקור( ,עקות ביוטיות - )הדבקה של פתוגנים (Pseudomonas syringae, Salmenella typhimurium and Erwinia ,(carotovoraוהורמני עקה ) .( absicic acid, salycilic acidתוצאות אלה מרמזות כי בנוסף לתפקידיהם השונים mtHXKs ,משמשים כמגן משמעותי כנגד עקות סביבתיות. 1 פרק -1מבוא: 1.1סוכרים: סוכרים מהווים מקור אנרגטי ומבני חשוב לקיום מטבוליזם וליצירת מולקולות מבניות במגוון רחב של יצורים ,החל בחד תאיים )חיידקים ,שמרים( ועד יצורים רב תאיים עילאיים )צמחים ,בע"ח( .בנוסף ,ידוע כי סוכרים ממלאים תפקיד חשוב בבקרה על ביטוי גנים שונים הקשורים למטבוליזם ; תהליכים פיסיולוגים ,מחזור התא ,התפתחות ביצורים פרוקריוטים ואוקריוטים ועוד )Newgard and McGarry, 1995; Ronne, 1995; Saier et al, 1995; Stulke and Hillen, 1999; Hanson, 2000; Rolland .( et al, 2001 1.2מנגנון חישת ובקרת סוכר: בכל היצורים החיים קיים מנגנון רגולטורי מורכב המאפשר להם לחוש את רמת הנוטריינטים ולהתאים את גדילתם והתפתחותם בהתאם .מנגנון חישת הסוכר ) (sugar sensingהינו ביטוי למנגנון רגולטורי המתבטא בקישור הסוכר לחלבון )חיישן( באופן שנוצר סיגנל ) Knight and Gray, 1994, Jang and .(Sheen, 1994; Herbers et al, 1995; Mita et al, 1995; Reynolds and Smith, 1995 באופן כללי ניתן לומר כי תפקיד המנגנון הוא לאפשר קיום מטבוליזם תקין תחת תנאים משתנים אך התפקיד הפיזיולוגי של מנגנון חישת הסוכר משתנה ותלוי בסוג האורגניזם ,הרקמה והתא המסוים בו הוא מתרחש ) . (Rolland, 2001המחקרים הראשונים שאפיינו חיישנים ומסלולים שונים הקשורים למנגנון חישת הסוכר נעשו בשמר .( Rolland et al, 2002 ) Saccharomyces cerevisiae ביצורים רב תאיים מפותחים )כגון צמחים( ,הבנויים מרקמות שונות ,יש צורך במערכת חישה מורכבת בעלת ספציפיות גבוהה עד לרמת התא הבודד .מערכת זו אמורה להתמודד עם שינויים התפתחותיים, פיסיולוגיים וסביבתיים .המנגנון דרכו צמחים עילאיים מזהים ומגיבים לסוכר לא ידוע ברובו .חישת הסוכר והתגובה לסוכר ביצורים רב תאיים כמו צמחים היא ככל הנראה תופעה מורכבת בשל האינטראקציות בין איברי הצמח השונים ובמיוחד בין איברי מקור )המייצרים סוכר( לבין איברי מבלע )הצורכים סוכר( .קיומם של צמחים ,בהיותם יצורים פוטואוטוטרופיים ,תלוי באופן בלעדי בסוכר המיוצר בתהליך הפוטוסינתזה ולכן הסוכר נחקר רבות באשר להשפעתו על תהליכים שונים הקשורים להתפתחות הצמח ועמידותו בפני עקות שונות. בניסוי ביטוי שנערך בעזרת micro arrayנמצא כי 444גנים של ארבידופסיס מעוררים ע"י גלוקוז, ביניהם גנים המעורבים בעקות ביוטיות ואביוטיות ,במסלולים מטבוליים שונים ,בסינתזת הורמונים, בגדילת תאים ועוד ) .( Price et al, 2004כמו כן ,נמצא כי ריכוז גבוה של גלוקוז מבקר תהליכים הקשורים לדיכוי גנים פוטוסינתטיים ) Rook et al, 2006; Schluepmann et al, 2003; Sheen , (1993; Krapp et al, 1990מסלולים הקשורים לבקרת חלוקת התא ,מניעת אפופטוזיס )Kim, et al 2 ,(2006הגנה מפני פתוגנים ) ,( Roitsch, 2004הזדקנות ) Xiao et al., 2000; Pourtau et al., ,(2006פציעה ) ,( Sturm and Chrispeels, 1990בקרת מטבוליזם ) ,( Price et al., 2004מנגנונים התפתחותיים שונים ) (Jang and Sheen, 1997; Stanley, 1971; Pacini, 1996ופעילויות הורמונליות שונות ) Kang, Balibrea et al, 2002005; Zhou et al, 1998; 4 ; Roitsch, 2004, .(Mishra et al, 2009; Kim et al 2002 1.3סוכרים ואנזימים מזרחני סוכרים: בצמחים ידועים שתי קבוצות אנזימים ,המורכבות כל אחת מכמה איזוזימים שונים ,המזרחנות את הסוכרים המטבוליים גלוקוז ופרוקטוז :פרוקטוקינאזות ) (fructokinase -FRKהמזרחנים פרוקטוז בלבד והקסוקינאזות ) ( hexokinase- HXKהמזרחנים גלוקוז ופרוקטוז עם אפיניות גבוהה בשני סדרי גודל לגלוקוז ).(Dai et al., 2002 ) Jang and Sheen (1994היו הראשונים שחשפו את HXKכמתווך העיקרי במנגנון חישת הסוכר בארבידופסיס .במסגרת מחקרם ,פרוטופלסטים שנחשפו לגלוקוז אקסוגני הגיבו באופן אופייני לחישת סוכר המתבטאת בעיכוב ביטוי גנים פוטוסינטתיים ) . (glucose repressionרק כאשר הוסף למדיום הפרוטופלסטים מנוהפטולוז ,מעכב ספציפי של ,HXKבוטל העיכוב .עובדה זו הראתה כי לHXK - חשיבות מכרעת בתיווך התגובה לסוכר ) .( Jang and Sheen, 1994 לאור עובדה זו ביקשו החוקרים לבדוק האם פעילותו הרגולטורית של HXKתלויה בפעילותו הקטליטית כמזרחן סוכר .לשם כך HXK 2,שמרי ,אשר על פי ההנחה שומר על פעילותו הקטליטית בצמח ,בוטא בצמחי מוטנט של ארבידופסיס שאינם מבטאים -( gin2-1 ) AtHXK1בצמחים אלה לא נצפתה כל פעילות רגולטורית .מתוצאה זו הניחו החוקרים שזירחון גלוקוז כשלעצמו אינו מספיק לחישת סוכר ויש צורך בהקסוקינאז האנדוגני כדי לחוש את הסוכר .בנוסף ,נראה כי גם כאשר נפגעה יכולתו הקטליטית של AtHXK1עדיין הייתה תגובה לסוכר ) .( Jang and Sheen, 1997מתוצאות אלו עלה כי AtHXK1הינו אנזים מפתח בתיווך התגובה לסוכר ופעילותו הרגולטורית של האנזים אינה תלויה בפעילותו הקטליטית .הסבר אפשרי למעורבות HXKsבתהליכים שונים בצמח הוא שעצם קשירת הגלוקוז משנה את קונפורמציית האנזים ,שינוי המוביל לאינטראקציה עם חלבונים נוספים והפעלת אפקטורים שונים .הבסיס הביוכימי לאפיון תפקידו הרגולטורי של האנזים נובע מנוכחות אזורים פונקציונלים שונים באנזים הלוקחים חלק בתווך אינטראקציות חלבון-חלבון ) Jeffery, 2004; Chen, .(2007 1.4הקסוקינאזות בצמחים: הקסוקינאזות צמחיות משויכות לשתי קבוצות בהקשר למיקומם התאי - type-A (1:הקסוקינאזות פלסטידיות בעלות - Transit peptideרצף פפטידי של כ 31 -חומצות אמינו המכוון אותן לכלורופלסט. 3 HXKפלסטידי יש חלק במטבוליזם של גלוקוז מיובא הקשור למעגל החומצה השיקמית ) ,( shikimic acid pathwayסינתזת עמילן וסינתזה של מטבוליים משניים ) .( Karve et al, 2008 , type-B (2הקסוקינאזות ,עם עוגן ממברנלי -רצף פפטידי הידרופובי בקצה ה N -טרמינלי )אינו קיים ב HXK -שמרי או אנימלי( אשר ממוקמים בצמידות למיטוכונדריה .העוגן הממברנלי מאפשר ככל הנראה אינטראקציה של האיזוזים הציטוזולי עם הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה ) Kandel-Kfir .(et al, 2006ברוב הצמחים קיימים type-A HXKו type-Bבלבד. בעבודה שנעשתה במעבדתינו הקסוקינאז type-Bמארבידופסיס ) ( AtHXK1בוטא בעודף בצמחי עגבנייה ,עבודה זו הראתה כי ל type-B HXK -מיוחסים תפקידים שונים במנגנון חישת הסוכר )Dai et .(al., 1999עדיין עומדת השאלה לגבי תפקיד הקסוקינאזות פלסטידיות ) ( type-Aומעורבותן במנגנון זה .בארבידופסיס זוהו שלושה איזוזימים של HXKבעלי פעילות קטליטית :שני איזוזימים מסוג , AtHXK1,2 :type- Bואיזוזים אחד מסוג .( Karve, 2008) AtHXK3 :type-Aכמו כן זוהו שלושה איזוזימים אשר אינם פעילים קטליטית אך בעלי הומולוגיה גבוהה לשלושת האיזוזימים האחרים ) .( AtHXKL1-3גם לאיזוזימים אלה מיוחסות פעילויות רגולטוריות הקשורות למנגנון חישת הסוכר ) .( Bernardo et al, 2007; Karve et al, 2009 1.5מעורבות AtHXK1בחישת סוכר בצמחי ארבידופסיס ועגבניה: ,AtHXK1המהווה מודל להבנת תפקיד HXKsבצמח ,נחקר רבות באשר לתפקידו הרגולטורי בחישת הסוכר בארבידופסיס ועגבניה ומעורבותו בתהליכים שונים בצמח ) Moore et al, 2003; Kandel-Kfir .(et al, 2006; Jang and Sheen, 1997 עדות ישירה למעורבות האנזים בתיווך התגובה לסוכר הוצגה ע"י יצירת צמחי ארבידופסיס טרנסגנים בהם הושתק או בוטא בעודף . (Jang and Sheen, 1997) AtHXK1בהשוואה לזן הבר ,נבטי ארבידופסיס טרנסגנים שביטאו בעודף AtHXK1והונבטו במצע אשר הכיל 6%גלוקוז הראו רגישות יתר לגלוקוז שהתבטאה בעיכוב נביטה ; עיכוב התארכות ההיפוקוטיל ,ביטוי נמוך של גנים פוטוסינתתיים ועיכוב בהתפתחות פסיגים .בנוסף ,במוטנטים בגן (gin2-1 ) AtHXK1שהונבטו במצע דומה לא נצפו התופעות שתוארו לעיל .מחקר נוסף שאפיין את תפקיד HXKsבחישת הסוכר( Moore et al,) 2003 הראה כי הארה בעוצמות אור גבוהות גרמו לפגמים בולטים במוטנט gin2-1לעומת זן הבר .לדוגמא העלים של gin2-1נשארו קטנים ,כהים ועם התרחבות תאים מועטת .העובדה שבמהלך ההתפתחות הופיע אותו מספר עלים במוטנט ובזן הבר העידה שלא היה עיכוב בתוכנית ההתפתחות של העלים. הפגמים בגדילה של המוטנט gin2-1הצביעו על כך שלאנזים AtHXK1תפקיד גם בצימוח תקין של הצמח ) . (Moore et al, 2003בשלב הפריחה ,לצמחי gin2-1הייתה מערכת שורשים קטנה ,עלים קטנים מעוכבי הזדקנות ,פטוטרות ותפרחות קצרות ומספר פרחים ותרמילים נמוך ביחס לזן-הבר .כמו-כן המרחק בין טריכומות היה קצר יותר בעלים של המוטנט והצביע על ירידה בהתרחבות התאים .תחת עוצמות אור גבוהות צמחי זן-הבר עברו גדילה מואצת והזדקנות עלים מוקדמת .לסיכום ,תוצאות אלו 4 AtHXK1תפקיד בניצול האור להתפתחות שורשים ,עלים ותפרחות ) Moore . (et al, 2003 תפקיד האנזים AtHXK1נבחן גם במעבדתינו בצמחי עגבניה שביטאו את הגן AtHXK1מארבידופסיס. צמחים שהיו בעלי פעילות הקסוקינאז מוגברת אופיינו בתכולת כלורופיל נמוכה בעלים ; האטת קצב הפוטוסינתזה ,עיכוב צימוח והזדקנות מואצת ) .( Dai et al, 1999כמו כן ,בצמחים אלה משקל הפרי, צבירת עמילן בפירות צעירים ו Total Soluble Solids (TSS) -בפירות בוגרים ירדו כפונקציה של ביטוי . AtHXK1הוצע שהשפעות אלו על יבול הפרי נבעו מהירידה בקצב הפוטוסינתזה ועיכוב הגדילה ) .( Dai et al, 1999לסיכום ,מחקרים אלו מראים כי AtHXK1מהווה גורם מפתח בתווך התגובה לסוכר בהיבט הפסיולוגי -הכוללת עיכוב צימוח ,עיכוב ביטוי גנים פוטוסינתתיים ,ירידה בתכולת כלורופיל והאצת הזדקנות .מאחר ו) AtHXK1 -שמקורו מארבידופסיס( שמר על יכולתו לעורר את התגובה לסוכר בצמחי עגבניה הוצע כי קיימים מסלולי תגובה דומים לסוכר בעגבניה ובארבידופסיס וייתכן שהתפקיד של הקסוקינאז בתיווך התגובה לסוכר שמור בצמחים ). (Dai et al, 1999 1.6מעורבות האנזימים AtHXK1 ,2בתהליכים הורמונאליים: תגובת הצמח לסוכר ,על כל היבטיה ,מתבצעת לרוב דרך בקרה הורמונלית .אפיון צמחי gin2-1הראה כי בצמחים אלה חל עיכוב התפתחותי בשורשים ,תפרחות ,חלוקת והתרחבות תאים -תופעות המרמזות על פגם בפעילות ההורמון אוקסין ) . (Mishra et al, 2009; Moore et al, 2003כאשר נבדק הקשר המולקולרי בין חישת הגלוקוז ופעילות ההורמון ,נמצאו גנים רבים המעורבים בביוסינתזה ,הובלה ,חישה ופעילות האוקסין המבוקרים על ידי גלוקוז ) . (Mishra et al, 2009העובדה כי מוטנטים המעוכבים בחישתם לאוקסין ) ( axr1,axr2,tir1אינם מגיבים לגלוקוז , (Mishra et al, 2009) 6%מרמזת על כך כי צמחי gin2-1פגועים בחישת האוקסין ומייחסת לאנזים AtHXK1תפקיד אפשרי במעבר סיגנל האוקסין. עבודתו של ) Moore et al, (2003הראתה כי ציטוקינים שיחזרו את רגישות נבטי gin2-1ל6% - גלוקוז תוצאה המעידה כי לציטוקינים יש חלק בתיווך חישת הסוכר דרך האנזים . AtHXK1 תהליכי התפתחות וגדילה הינם תהליכים המבוקרים על ידי , ABAהידוע גם כהורמון פעיל במצבי עקה. נמצא כי מוטנטים הפגועים בחישת גלוקוז המתווכת דרך האנזים ( gin1, gin5) AtHXK1פגועים בגנים המעורבים בביוסינתזת .( Cheng, 2002; Arenas-Huertero, 2000) ABAצמחים אלה מאופיינים ברמות ABAאנדוגניות נמוכות ובחוסר יכולת לסנתז את ההורמון במצבי עקה .כמו כן ,נמצא כי בצמחי ) gin1הפגוע בסינטזת ,( ABAהוספה של ABAאקסוגני שחזרה את רגישות הצמחים לגלוקוז ) .( Zhou et al, 1998עבודות אלו מעידות כי ABAהינו הורמון נוסף הלוקח חלק משמעותי בחישת הסוכר המתווכת דרך פעילות .AtHXK1 ) Cheng et al, (2002הראה כי קיים קשר אנטגוניסטי בין ההורמון אתילן לבין חישת גלוקוז -מוטנט ברצפטור לאתילן ) ( ctr1המתבטא בתגובת יתר להורמון ,הראה חוסר רגישות לגלוקוז ומוטנט בעל 5 ( ein2היה רגיש לגלוקוז .מאחר ונמצא כי צמחים בעלי מוטציה כפולה ) ( gin1/ein2אינם היו רגישים לגלוקוז ,הוכח הקשר האפיסטטי בין EIN2לגן) GIN1 -הפגוע בסינטזת (ABAהמשתייך למסלול חישת הגלוקוז דרך .( Zhou et al, 1998 ) AtHXK1 1.7מעורבות האנזימים AtHXK1 ,2בעקות ביוטיות ואביוטיות: מחקרים שונים הראו כי AtHXK1,2מבוקרים על ידי עקות אביטיות הן ברמת ביטוי הגן והן ברמת פעילות החלבון .בעבודה שנעשתה על ידי ) Fox et al, (1998נראה כי פעילות HXKsעולה בתגובה לטמפ' נמוכות ולשינוי pHמה שמרמז על קשר אפשרי של HXKsבהתמודדות עם עקות אלה .עבודה נוספת הראתה כי בצמחי ארבידופסיס ביטוי AtHXK1,2עלה גם בעקבות עקות אביוטיות כדוגמת עקת קור,חשיפה לריכוז מלח גבוה ועקה חמצונית ועקות ביוטיות כדוגמת פתוגנים חיידקיים ופטרייתיים .כמו כן ,צמחים אשר ביטאו בעודף AtHXK1,2הציגו עמידות גבוהה יותר לעקות אלה (Sarowar et al, .(2008 HXKs 1.8והזדקנות: הזדקנות ,השלב הסופי בחיי הצמח ,גם הוא תהליך המבוקר ע"י סוכרים ) .( Dai et al, 1999ידוע כי גלוקוז משפיע על הזדקנות עלים אך קיימת מחלוקת לגבי השאלה האם הזדקנות עלים מעוררת ע"י הרעבה לגלוקוז או ע"י הצטברות של גלוקוז ). (Nooden et al, 1997; Hoeberichts et al, 2007 נמצא שבעלים מבוגרים יש הצטברות של גלוקוז וההנחה המקובלת היא שאלו מהווים סיגנל להזדקנות. במחקר שנעשה במעבדתינו ) (Dai et al, 1999נמצא כי צמחים שהיו בעלי פעילות AtHXK1מוגברת אופיינו בהזדקנות מואצת .בכך נחשף תפקיד האנזים AtHXK1בתווך תהליך ההזדקנות על ידי סוכרים. ממצאים אלה אוששו אחר כך גם בצמחי ארבידופסיס ) ( Moore et al, 2003 1.9תפקיד HXKsבתא: לאחרונה פורסמו מספר עבודות המייחסות ל HXKs -תפקידי בקרה שונים בתוך התאKim et al . ) (2006הראו בעבודתם כי בצמחים בהם AtHXK 1הושתק נצפו איזורים עם נמק הנובע מפעילות אפופטוטית )פירוק , DNAשחרור ציטוכרום Cופעילות קספאזות 3ו .(9 -לעומת זאת ,צמחים אשר ביטאו ביתר AtHXK1 ,2היו עמידים יותר ל H202 -ופקטורים המעודדים אפופטוזיס .משערים כי תפקיד האנזימים AtHXK1,2במניעת אפופטוזיס נובע מהיותם מעוגנים לממברנת המיטוכונדריה - אנזימים אלה יוצרים אינטראקציה עם תעלת )voltage-dependent anion channel (VDAC ומונעים את יציאת ציטוכרום Cמן המיטוכונדריה .מספר מחקרים הראו כי ל HXKs -פעילות אנטי אפופטוטית גם ביונקים ) . (Downward, 2003; Birnbaum,2004עבודה נוספת הראתה כי האנזים 6 AtHXKנקשר לסיבי האקטין בתא ובכך יוחס להתהוות רשת האקטין תפקיד בחישת הסוכר התאית ) .( Balasubramanian, 2007בנוסף ,נמצא כי ריכוז גלוקוז גבוה בתא מביא לקשירתו על ידי האנזים , AtHXK1קומפלקס זה ) ( glucose signaling complexנכנס ככל הנראה לגרעין ומבקר ביטוי גנים שונים ) .( Cho et al, 2006; Frommer et al, 2003; Chen, 2007 הממצאים השונים שהוזכרו לעיל המתארים את המעורבות של הקסוקינאז בחישת הסוכר ובמסלולים התפתחותיים שונים מסוכמים בטבלה הבאה. 7 מהמתואר לעיל נובע שהגנים AtHXK1,2מעורבים בתהליכים שונים בצמח כפי שמסוכם בטבלה .יחד עם זאת ,הידע באילו איברים ורקמות מתבטאים גנים אלה מועט ביותר ) .( Jang et al, 1997אנו מניחים 8 AtHXK1ל- AtHXK2בכדי ללמוד על תפקידים ייחודיים אפשריים של כל אחד משני האנזימים. בחינת דפוס ביטוי הגנים AtHXK1,2תיעשה על ידי ביטוי הגן המדווח GUSתחת הפרומוטורים של AtHXK 1,2בצמחי ארבידופסיס טרנסגניים .בנוסף ,נבחן האם הפרומטורים של גנים אלה שמקורם בצמחי ארבידופסיס יקנו דגם ביטוי דומה גם בצמחי עגבניה ,עדות אפשרית לתפקידים דומים בצמחים שונים. 9 מטרות: מטרה כללית: לבודד ולבחון את דפוס הביטוי של הפרומוטורים של AtHXK 1,2במהלך התפתחות ,באברים ובתת רקמות שונים ,ובתגובה לשינויים בתנאי הסביבה ,על ידי שימוש בגן המדווח . GUS מטרות ספציפיות: .1בידוד הפרומוטורים של AtHXK 1,2מתוך DNAגנומי של ארבידופסיס. .2יצירת צמחי ארבידופסיס ועגבניה טרנסגניים המבטאים את הגן המדווח GUSתחת בקרת הפרומוטורים הנ"ל. .3בחינת מיקום ביטוי פרומוטורים אלה בצמחי ארבידופסיס ועגבניה. .4בחינת אופי ביטוי הפרומוטורים בארבידופסיס בשלבי התפתחות שונים. .5בחינת אופי ביטוי הפרומוטורים בארבידופסיס תחת עקות ביוטיות ואביוטיות. .6בחינת אופי ביטוי הפרומוטורים בארבידופסיס תחת הורמונים וסוכרים שונים. 10 פרק -2חומרים ושיטות: 2.1חומר צמחי זרעי עגבנייה ) Solanum lycopersiconששמו המדעי הקודם היה ( Lycopersicon esculentum מקו MP-1התקבלו מהמעבדה של ד"ר מאיר פילובסקי ,מהמחלקה לגנטיקה של צמחים ,המכון לגידולי שדה ,מכון וולקני .צמחי ה MP-1 -הם בעלי יעילות טרנספורמציה גבוהה ומשמשים לצורך יצירה של צמחים טרנסגנים ).( Barg et al., 1997 זרעי ארבידופסיס ) (Arabidopsis thalianaמהקו Columbiaהתקבלו מהמעבדה של ד"ר חיה פרידמן מהמחלקה לאחסון ,מכון וולקני. 2.2מצעי גידול Lactose plates: 1% lactose 0.1%Yeast extract 1.5% Bacto-agar ½ MSxKanamaycin: 2.2 gr/l MS salts 0.8% agar 100mg/l Kanamycin pH 5.8 ½ x MS ½ x Sucrose : 2. 2gr/l MS salts 1.5% sucrose 0.8% agar pH 5.8 MSO (liquid): 4.4gr/l MS salts 3% sucrose pH 5.8 Do: 4.4gr/l MS salts 3% glucose 1mg/l zeatin 11 0.8% agar pH 5.8 D1: 4.4gr/lit MS salts 3% glucose 1mg/l zeatin 0.8% agar 100mg/l kanamycin 300mg/l carbenecelin pH 5.8 MSR: 4.4gr/l MS salts 3% sucrose 1mg/l IBA 0.8% agar 100mg/l kanamycin 300mg/l carbenecelin pH 5.8 LB: 10gr/l tryptone 5gr/l yeast extract 5gr/l NaCl 15gr/l agar 2.3זריעה וגידול 2.3.1זריעה וגידול צמחי עגבנייה הגידול נעשה בחממה בה שררו תנאים מבוקרים של טמפרטורה :מקסימום 30 0Cביום ומינימום 150c בלילה .כשהצמחים הטרנסגנים הגיעו לגובה של 20ס"מ בערך ,הם הועברו לעציצי פלסטיק בנפח 3 ליטרים אשר הכילו תערובת תוצרת חברת "שחם -גבעת עדה" המורכבת 60%כבול 20% ,קלקר ו- 20%ספוג. 12 לאחר השתילה ניתן חומר הדברה סיסטמי -קונפידור בריכוז 0.05%נגד כנימת עש הטבק ,המעבירה את וירוס צהבון האמיר שהינו מזיק קטלני בעגבניות .ההשקיה נעשתה באופן אוטומטי על ידי טפטפות המשקות בקצב של 4ליטר לשעה. 2.3.2זריעה וגידול צמחי ארבידופסיס זרעי הארבידופסיס שנשמרו ב 4 °Cנזרעו ישירות בעציץ של 36cm2המכיל מצע גידול שהינו תערובת תוצרת חברת "שחם – גבעת עדה" המורכבת מכבול ,טוף ,חומרי אוורור ,חומרים סופחי מים ,וחמרי הזנה בשחרור מבוקר .הגידול נעשה בחדר בו שררו תנאים מבוקרים של טמפרטורה קבועה של 22 °C ואורך יום של 16שעות אור ו 8שעות חושך .העציצים המכילים את הזרעים כוסו בנייר נצמד על מנת לשמור על הלחות עד לשלב הצצת עלים אמיתיים בנבט. ההשקיה נעשתה פעמיים בשבוע על ידי הצפת מגש העציצים במים תוך מניעת מצב של מים עומדים. 2.4יצירת צמחי ארבידופסיס ועגבנייה טרנסגנים 2.4.1בידוד הפרומוטורים של הגנים AtHXK1ו AtHXK2באמצעות PCR הפרומוטורים של הגנים AtHXK1ו AtHXK2סונתזו בעזרת התחלים ) 1-4המופיעים בנספח התחלים( באמצעות שיטת ה . PCRתחלים מספר 2ו 4 -תוכננו כך שיכילו אתר הכרה לחיתוך על ידי אנזים החיתוך BamHIבצד ה '. 5 :PCR - Polymerase chain reaction עיקרון השיטה -הכפלת מקטעי dsDNAספציפיים על ידי ריאקציה אנזימטית . in vitroהריאקציה מתבצעת בעזרת שני תחלים המתחברים כל אחד לגדיל המשלים אותו במקום ספציפי ,כך תוחמים את האזור בו מצוי מקטע ה DNA -אותו מעוניינים להגביר .האנזים DNAפולימראז העמיד לחוםTaq - polymeraseויציב בטמפרטורות גבוהות )עד ,( 95 0Cמשתמש ב DNAהחד גדילי לשם סינתזת הגדיל המשלים בין שני התחלים וכך מתבצע שיכפול מקטע ה DNAהספציפי. שיטת ה PCRנעשתה במכשיר ) DNA .PCR (Biometraגנומי שימש כתבנית בריאקציה. שלבי הריאקציה - .1דנטורציה לשם פתיחת גדילי ה dsDNA -בטמפרטורה של 94 0Cלמשך 30שניות. .2הורדת הטמפרטורה בצורה הדרגתית בכדי לאפשר היצמדות של התחלים לתבנית הDNA - בטמפרטורה ספציפית ) .( 58-64 0C .3העלאת הטמפרטורה ל , 72 0C -טמפרטורה המתאימה לאנזים ה , Taq polymerase -למשך הזמן הרצוי בהתאם לאורך תוצר ה PCRכך שלכל 500צמדי בסיסים יש צורך ב 30שניות. 13 חזרה על שלבים 1עד 35 3פעמים. .4אינקובציה בטמפרטורה של 4 0Cעד הוצאת הדוגמאות מהמכשיר. מרכיבי הריאקציה - 1-100ng DNA, 2.5µl 10X buffer, 0.2 mM dNTP's, 0.2-0.5 µM forward/ reverse primers, 1Unit/Kb Taq polymerase, ddH2O . נפח הריאקציה . 25µl - איפיון תוצר ה - PCR תוצרי הריאקציה שהתקבלו הופרדו באלקטרופורציה בג'ל אגרוז , 0.8%בתנאי הרצה של 120Vלמשך 40דקות .בסיום ההרצה הוכנס הג'ל לתמיסה המכילה אטידיום ברומיד ) ,( EtBrחומר הנקשר לגדיל DNAכפול ובעל תכונת זהירה כאשר נחשף ל . U.Vבהמשך הג'ל תועד במצלמת U.Vוהתוצר בגודל המתאים נחתך מהג'ל ונוקה באמצעות )Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega בהתאם להוראות היצרן. התוצר הנקי הוכנס לתוך הפלסמיד pGEMT® -T Easy Vectorבאמצעות pGEMT®-T and pGEMT® -T Easy Vector systems. 2.4.2יצירת הפלסמידים הבינארים המכילים את הפרומוטורם של הגנים AtHXK1ו AtHXK2 - יצירת הפלסמידים pMD1 AtHXK1 pro:GUSוpMD1 AtHXK2 pro:GUS - לשם החדרת הפרומוטור של הגנים AtHXK1ו AtHXK2 -לפלסמידים הבינארים ,בוצעו חיתוכים בפלסמידים הבאים :פלסמיד בינארי pMD1המכיל את הגן , GUSו בפלסמידים pGEMT®-T -easy המכילים את הפרומוטורים של הגנים AtHXK1ו . AtHXK2 -החיתוכים התבצעו באמצעות אנזימי החיתוך EcoRIו ( Fermentas ) BamHIבהתאם להוראות היצרן .יש לציין כי הפלסמיד pMD1 מכיל גן המקנה עמידות לאנטיביוטיקה קנמיצין ). (Kan תוצרי החיתוך הופרדו בג'ל אגרוז 0.8%בתנאי הרצה של 120Vבמשך 40דקות ,הוכנסו לתמיסת EtBrלשם צביעתם ותועדו במצלמת . U.Vהתוצרים המתאימים נחתכו מתוך הג'ל ונוקו באמצעות ) . Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promegaבהמשך התבצעה ליגציה בין תוצרי הניקוי כאשר pMD1המכילים את GUSעברו ליגציה בנפרד עם התוצרים שהכילו את הפרומוטורים של הגנים AtHXK1ו . AtHXK2 -הליגציה התבצעה בעזרת ) T4- Ligase (Promegaבהתאם להוראות היצרן .כל תוצרי הליגציה הוחדרו לתוך חיידקי E.coliקומפטנטים )JM109 (Promega בהתאם להוראות היצרן .החיידקים החשודים כמכילים את הפלסמידים הבינארים גודלו למשך הלילה במצע LBהמכיל 50µg/mlשל האנטיביוטיקה . Kanלמחרת ,הופקו הפלסמידים מתוך הE.coli - בעזרת ) Hi Yield plasmid mini kit (RBCבהתאם להוראות היצרן .תוצרי ה PCRהופרדו בג'ל אגרוז של 1%בתנאי הרצה של 120Vבמשך 40דקות ותועדו במצלמת . U.Vהפלסמידים הנקיים נשלחו לריאקצית ריצוף תוך שימוש בתחלים מספר .1,3 14 בהתאם לתוצאות הריצוף בודדו המושבות המכילות את הפלסמידים הבינאריים השלמים pMD1 :המכיל את הגנים proAtHXK1::GUSו . proAtHXK2::GUS -המושבות גודלו בשנית במצע L.Bהמכיל את האנטיביוטיקה קנמיצין ) (Kanעד ליום למחרת והוקפאו ב -80 °Cעם DMSOלאחסון ארוך טווח. 2.4.3החדרת הפלסמידים הבינארים לתוך Agrobacterium tumefaciens כל אחד מהפלסמידים הבינארים הוחדר לתוך חיידקי Agrobacterium tumefaciensבאמצעות אלקטרופורציה. שלבי האלקטרופורציה - .1הפשרת חיידקי האגרובקטריום מהזן EHA-105בנפח 50µlבקרח ובמקביל קירור של הקיווטות המשמשות לאלקטרופורציה. .2הוספת 2µlשל הפלסמידים לחיידקים וערבוב קל. .3העברת התערובת לקיווטה הקרה והכנסתה למכשיר. .4מתן פולס חשמלי לפי מתח של 1500Vוזרם של . 25mA .5הוצאת הקיווטה מתוך המכשיר והוספה מיידית של 1mlתמיסת LBלתוכה .העברת התמיסה למבחנה סטרילית. .6גידול החיידקים בטמפרטורה של 28 0Cלמשך 4שעות בטלטול של . 200rpm .7זריעת החיידקים על מצע LBהמכיל את האנטיביוטיקה המתאימה קנמיצין ) ( Kanוגידול במשך יומיים עד לקבלת מושבות. 2.4.4מבחן לזיהוי חיידקי Agrobacterium tumefaciensונוכחות הגן GUSבהם עקב העובדה שמושבות חיידקי האגרובקטריום נראות לעתים כמו מושבות חיידקי E.coliיש צורך לבדוק שאכן התקבלו חיידקי . Agrobacterium tumefaciens החיידקים מהמושבות הנבחרות גודלו בצלחות Lactoseבטמפרטורה של 28 0Cלמשך יומיים. החיידקים כוסו בריאגנט בנדיקט ) (Benedictולאחר כשעה רק המושבות שהינן חיידקי אגרובקטריום נצבעו בצהוב. Benedict's reagent: 17.3g Sodium citrate 100g Na2CO3 17.4g CuSO4(11.3%) 5H2O 15 בנוסף ,נוכחות הגן GUSנבדקה במושבות שהתקבלו על ידי ריאקצית PCRבהתאם לכתוב בסעיף R .2.4.1תוצרי ה PCRהופרדו בג'ל אגרוז של 1%בתנאי הרצה של 120Vבמשך 40דקות בסיום ההרצה הג'ל נצבע בתמיסת EtBrותועד במצלמת . U.V המושבות שיצאו חיוביות גודלו בשנית במצע L.Bהמכיל את האנטיביוטיקה קנמיצין Kanעד ליום למחרת והוקפאו ב -80°cעם DMSOלאחסון ארוך טווח. 2.4.5טרנספורמציה לצמחי ארבידופסיס מזן Columbia טרנספורמציה לצמחי הארבידופסיס נעשתה על פי הפרוטוקול המוצג במאמר Clough and Bent, ) . (1998צמחי הארבידופסיס גודלו בחדר בו שררו תנאים מבוקרים של טמפרטורה קבועה של 22 °C ואורך יום של 16שעות אור ו 8שעות חושך .הצמחים נשתלו בצפיפות של 3צמחים לעציץ של 36cm2 המכיל מצע גידול שהינו תערובת תוצרת חברת "שחם – גבעת עדה" המורכבת מכבול ,טוף ,חומרי אוורור ,חומרים סופחי מים ,וחמרי הזנה בשחרור מבוקר .יש להשתמש בשמונה עציצים לטרנספורמציה של פלסמיד אחד .לשם קבלת יעילות גבוהה של הטרנספורמציה יש להפר את השלטון הקודקודי על ידי גיזום התפרחות הראשונות שהתקבלו בצמח כדי לקבל כמה שיותר ניצנים .לאחר כ 8ימים מהגיזום הצמחים היו מוכנים לטרנספורמציה כאשר הם מכילים תפרחות בגובה . 1-10cm שלבי הטרנספורמציה - .1גידול של שני הסוגים של חיידקי ה Agrobacterium -המכילים כל אחד את הפלסמיד הבינארי במצע . LBהמצע המכיל את האנטיביוטיקות Kan 50µg/mlו 100µg/ml -ריפאמפיצין )(Rif הספציפית לגידול אגרובקטריום .החיידקים גודלו בטמפרטורה של 28 °Cעד לשלב לוגריתמי . .2סרכוז החיידקים במהירות 6000rpmלמשך 5דקות. .3הרחפת החיידקים ב 100ml Infiltration mediaולאחר מכן הוספת 400ml Infiltration media לתמיסת החיידקים. .4הצפת העציץ במים וטבילתו במהופך בתמיסה בדגש על הטבעת הניצנים למשך 30שניות. .5הוצאת הצמחים מהתמיסה וספיגת השאריות במהופך על חיתול. .6סידור על מגש כאשר העציצים שוכבים על הצד וכיסוי בניילון נצמד לשמירה על לחות. .7העברה לחדר הגידול עד למחרת. .8העמדת העציצים במגש והשקיה סדירה למשך שבועיים עד שהתרמילים יבשים. בהמשך נאספו הזרעים לאחר ייבוש הצמחים למשך שבועיים על המגש .הזרעים הופרדו מחלקי הצמח המיותרים ויובשו שבועיים נוספים בתוך צלחות פטרי בטמפרטורת החדר. Infiltration media: 10mM MgCL2 5% Sucrose 16 )0.044µM BAP (Benzylamino purine 0.05% Silwet סטריליזציה יבשה של הזרעים: לפני זריעתם בצלחות הסלקציה יש להעביר את הזרעים סטריליזציה למניעת התפתחות פתוגנים. שלבי הסטריליזציה - .1חלוקת הזרעים למבחנות אפנדורף 2mlבנפח של . 30µl .2במנדף כימי -הכנסת המבחנות לתוך מיכל המכיל כוס כימית ובה 100ml 10% Sodium hypochloriteו . 4ml 100% HCl .3אטימת המיכל ואינקובציה למשך שעתיים. .4הוצאת המבחנות להוד סטרילי. סלקציה של הזרעים הטרנסגנים: הזרעים נזרעו בצלחות ½ MSהמכילות את האנטיביוטיקה קנמיצין בריכוז של . 50µg/ml הצלחות הועברו ל 4°cלמשך 4ימים לשם ורניליזציה. לאחר כשבועיים הנבטים המכילים את הטרנסגן זוהו כבעלי עלים ירוקים ושורשים מפותחים בניגוד לנבטים שאינם מכילים את הטרנסגן אשר התנוונו ומתו במשך הגידול. הצמחים החשודים כטרנסגנים נשתלו בעציצים והועברו לחדר הגידול להמשך הגידול בהתאם לכתוב בסעיף .2.3.2 2.4.6טרנספורמציה לצמחי עגבנייה MP-1עם חיידקי Agrobacterium tumefaciens טרנספורמציה לצמחי העגבנייה MP-1נעשתה על פי הפרוטוקול המוצג במאמר של McCormick ) .(1991זרעי עגבנייה חוטאו בעזרת 20%אקונומיקה למשך 30דקות .לאחר מכן הזרעים נזרעו במג'נטות על גבי המצע ½ x MS ½ x Sucroseוגודלו בחדר גידול ,בתנאים סטריליים של 26 0C ואורך יום של 16שעות אור ו 8 -שעות לילה למשך 8-10יום .הפסיגים של העגבניות נחתכו אופקית במצע נוזלי של MSOוהונחו כאשר צידם העליון כלפי מטה על גבי צלחות פטרי המכילות מצע D0 שאינו מכיל אנטיביוטיקה .הצלחות הועברו לחדר הגידול למשך הלילה .למחרת ,לכל צלחת הוספו 7ml של תמיסת חיידקי Agrobacteriumהמכילים את הפלסמידים הבינאריםpMD1 pro : AtHXK1:GUSו , pMD1 pro AtHXK2:GUS -האנטיביוטיקה המתאימה 100µg/ml Kanו- ) . 100mM Acetosyringone (Sigmaהחיידקים נמהלו ל . O.D = 0.3לאחר אינקובציה של שעתיים ,נשאבה תמיסת החיידקים מהצלחות והצלחות הועברו לחדר הגידול למשך יומיים. הפסיגים הועברו לצלחות פטרי המכילות מצע , D1אשר מכיל את האנטיביוטיקות 100µg/ml Kan ) 300µg/ml Carbenycilin (Carbו 100µg/ml -של הציטוקינין Zeatinלצורך תחילת צימוח של קאלוס בשלב הראשון ונוף בהמשך .הצלחות נשמרו בחדר הגידול ,כאשר אחת ל 10 -ימים הועברו הקאלוסים לצלחות עם מצע D1טרי ,לשם מניעת התפתחות זיהומים. 17 בשלב בו נוצרו צמחונים ,הם הועברו למצע MSRלצורך פיתוח מערכת שורשים ראשונית .לאחר מספר שבועות ,הצמחונים הועברו למצע של אדמה רטובה לשם התקשחות .בשלב זה ,הצמחים נבדקו לנוכחות הטרנסגן בהתאם לכתוב בסעיף . 2.4.7צמחים שנמצאו כמכילים את הטרנסגן הועברו לחממה להמשך גידול בהתאם לכתוב בסעיף .2.3.1 2.4.7בדיקת נוכחות הגן GUSבצמחי הארבידופסיס ו GUS -בצמחי העגבנייה מאחר ונצפה כי פעילות הפרומוטורים של AtHXK1ו AtHXK2 -תהיה גבוהה בעלים ,עלים מצמחי הארבידופסיס ועגבניה החשודים כטרנסגנים נבדקו על ידי צביעה היסטוכימית לנוכחות הגן , GUSזאת לצורך קביעתם כטרנסגנים. 2.4.8זריעה וגידול נבטי ארבידופסיס טרנסגנים זרעי ארבידופסיס טרנסגנים הונבטו על מצע ½MS x Kanamaycinבצלחות פטרי עגולות ) 15mm x (90mmוגודלו למשך 3שבועות ,עד לשלב הצצת עלים אמיתיים בנבט .הגידול נעשה בחדר בו שררו תנאים מבוקרים של טמפרטורה קבועה של 22 °Cואורך יום של 12שעות אור ו 12 -שעות חושך. הצלחות כוסו בפרפין בכדי למנוע חדירת מזהמים. 2.5צביעה היסטוכימית של האיברים מצמחי הארבידופסיס והעגבנייה הטרנסגנים למעקב אחר הגן GUS הגן ( GUS ) β-glucuronidaseשאוחה לפרומוטורים AtHXK1ו AtHXK2 -הינו גן מדווח אשר ביטויו המוכוון על ידי הפרומוטור ניתן לאיתור על ידי ריאקציה עם סובסטרט ספציפי .כאשר מוסיפים את הסובסטרט (X-Gluc) 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronideלרקמת הצמח תוצר הריאקציה עם חלבון ה GUSהינו צבע כחול .באמצעות צביעה היסטוכימית זו ניתן ללמוד על פעילותו הספציפית של הפרומוטור בצמח ). (Jefferson et al., 1987 שלבי הצביעה ההיסטוכימית- .1חיתוך האיבר הצמחי שאותו מעוניינים לבדוק. .2העברה למבחנה המכילה X-Gluc Bufferכך שתכסה את האיבר. .3הכנסה של המבחנה לואקום למשך 3-5דקות. .4אינקובציה ב 37 °Cלמשך 24-48שעות. .5הוצאת הנוזל והוספת 70%אתנול. 18 X-Gluc Buffer: 50mM NaPO4 0.1mM K3Fe(SCN)6 0.1mM K4Fe(SCN)6 1mM EDTA 0.75mg/ml X-Gluc 20% MeOH pH=7 בכדי לבדוק באילו איברים ישנה פעילות של GUSנדגמו איברים שונים מהצמחים הטרנסגנים המכילים את הגן GUSתחת בקרת הפרומוטורים של AtHXK1ו , AtHXK2 -ונצבעו היסטוכימית לפי הפרוטוקול שלעיל .בנוסף נדגמו אותם האיברים מצמחי זן הבר המשמשים כביקורת שלילית לשם השוואה. האיברים שנדגמו ונבדקו מצמחי הארבידופסיס הטרנסגנים הינם :גבעולים ,תפרחות המכילות פרחים, תרמילים מתפתחים ובשלים ,זרעים מתפתחים ובשלים ,נבטים בני 14יום ,צמח בן 45יום ,שורשים צעירים,ניצנים ,עלים מצמחים צעירים וזקנים משושנת העלים בתחתית )מקור( ומהחלק העליון הצמוד לגבעול )מבלע(. האיברים שנדגמו ונבדקו מצמחי העגבנייה הטרנסגנים הם :תפרחות המכילות פרחים ,פרות ירוקים, עלעלים קודקודי צמיחה וגבעולים. 2.6בחינת השפעת טיפולים שונים על ביטוי הפרומוטורים – ביטוי הפרומוטורים נבדק תחת השפעת הורמונים ,סוכרים ועקות אביוטיות .לשם כך גודלו 88נבטים טרנסגניים )כמתואר בסעיף (2.7.2המכילים proAtHXK1::GUSו 88 -נבטים טרנסגנים המכילים . proAtHXK2::GUSמכל קו טרנסגני הוכנסו הנבטים ל 21-מבחנות 4) 50 mlחזרות לכל טיפול( המכילות 30mlמים ) (pH=7.5וטיפול מסוים .מבחנה ובה מים מזוקקים פעמיים ) ( ddwללא טיפול שימשה כקבוצת ביקורת .הטיפולים אשר השפעתם נבדקה במהלך הניסוי היו: סוכריםSucrose 2%, Glucose1%/ 6%, Sorbitol 1%/6%, Trehalose 40mM and : Trehalose + Validamycin 100μM. Indole Botiric Acid 2μM, Zeatin 4.5μM, Salycilic acid 100μM, Absicic acidהורמונים : 20μM, and Gibrelic acid 100μM. עקות אביוטיות : .NaCl 200mעל מנת לבדוק השפעת עקת חום על ביטוי הפרומוטורים ,מבחנה טולטלה באינקובטור בטמפ' של . 43°Cבכדי לבדוק השפעת עקת קור על ביטוי הפרומוטורים המבחנה הוכנסה למקרר ) (4 °Cלמשך 4שעות. 19 המבחנות המכילות את הטיפולים השונים והנבטים טולטלו למשך 4שעות במהירות .200 rpm לאחר 4שעות התבצעה צביעה היסטוכימית כדלקמן: .1העברת הנבטים ממבחנת הטיפול לבקבוקון פלסטיק המכיל .X-Gluc Buffer 3ml .3הכנסה של המבחנה לואקום למשך 3-5דקות. .4אינקובציה ב 37 °Cלמשך 4שעות. .5הוצאת הנוזל והוספת 70%אתנול. • ביטוי הפרומוטורים נבחן גם בהשפעת ההורמון הגזי אתילן .לשם כך מכל קו טרנסגני גודלו 12 צמחים ב 3 -עציצים ) 4צמחים בעציץ( למשך 3שבועות .לאחר פרק זמן זה ,שני עציצים הועברו למשך לילה לתאים מועשרים באתילן בריכוז של 1ו . 10ppm -קבוצה נוספת אשר הועברה לתא שאינו מועשר באתילן שימשה כקבוצת ביקורת להערכת השפעת האתילן על ביטוי הפרומוטורים .לאחר מכן הצמחים עברו צביעה היסטוכימית של GUSכמפורט לעיל. 2.7ביטוי הפרומוטורים AtHXK1ו AtHXK2 -ביובש– ביטוי הפרומוטורים AtHXK1ו AtHXK2 -נבדק בצמחים בוגרים כתגובה לעקת יובש .לשם כך גודלו 40צמחי ארבידופסיס במשך 45יום )כמתואר בסעיף (2.3.2וחולקו ל 8 -קבוצות טיפול ) 5חזרות בכל קבוצה( 4 .קבוצות הושקו לכל אורך הניסוי ושימשו כקבוצות ביקורת .ל 4 -קבוצות הופסקה אספקת המים באופן מוחלט .לאחר 3,6,9,14ימים נלקחה קבוצת צמחים ועברה צביעה היסטוכימית של GUS באופן הבא: .1קבוצת הצמחים נוקתה משאריות האדמה והוכנסה למבחנת זכוכית בנפח של 100mlהמכילה .X-Gluc Buffer .2הכנסה של המבחנה לואקום למשך 3-5דקות. .3אינקובציה ב 37 ° Cלמשך 24שעות. .4הוצאת הנוזל והוספת 70%אתנול. .5תיעוד של תהליך הצביעה התבצע באמצעות שולחן אור ומצלמה דיגיטלית מדגםCanon - .PowerShot A650 IS 2.8ביטוי הפרומוטורים בעקבות פציעה מכאנית- על מנת לבדוק את ביטוי הפרומוטורים בעקבות פציעה מכאנית ,גודלו 10צמחי ארבידופסיס )מכל טרנספורמציה( במשך 4 5יום )כמתואר בסעיף (2.3.2וחולקו ל 2 -קבוצות .בקבוצות אלה נשברו הצמחים במספר מוקדים לאורך הגבעול והעלים .מיד לאחר שבירת הצמחים התבצעה צביעה היסטוכימית )כמתואר בסעיף ) .(.2. 7בכדי לבחון האם קיים קשר ישיר בין הפציעה המכאנית לביטוי הפרומוטורים וסינתזת , GUSמיד לאחר הפציעה הוסף למבחנה שהכילה קבוצת צמחים שבורים ציקלוהקסמיד בריכוז 20 200 mg/lהידוע כמעכב סינתזת חלבונים .קבוצה זו שימשה כביקורת לבחינת סינתזת חלבון GUS חדש כתוצאה מהפציעה. כמו כן ,מכל אחד מקבוצות הטיפול נלקחו מקטעי גבעול )באורך של 3ס"מ( על מנת לבצע חתכי רוחב ולבדוק ביטוי GUSבצינורות הובלה. 2.8.1חיתוך גבעולים באמצעות ויברטום- קיבוע המקטעים -המקטעים קובעו על ידי הכנסתם לג'ל אגרוז )במצב נוזלי( בריכוז .6%לאחר הקרשות הג'ל נחתכו קוביות המכילות את מקטעי הגבעולים .הקוביות הודבקו לקוביות פלסטיק לשם ייצובם במכשיר . VIBRATOME 1000 plus Sectioning Systemלאחר ייצובם מקטעי הגבעול נחתכו לפרוסות רוחב בעובי של . 60μm 2.9ביטוי הפרומוטורים בנוכחות פתוגן- ביטוי הפרומוטורים נבדק כחלק מתגובת הצמח לפתוגנים Pseudomonas syringaeוSalmenella - typhimuriumו. Erwinia carotovora - הכנת חיידקים לעבודה: .1החיידקים גודלו O.Nבטלטול במהירות ) 37 oC 150 rpmהחיידקים נלקחו ממושבה(. החיידקים נשטפו פעמיים עם SDWע"י צנטריפוגציה ב 2,700 g -ל 10-דקות .לאחר מכן משקע החיידקים הורחף ב 10-מ"ל .SDW O.D. .2של מדיום החיידקים נמדד באורך גל של 600 nmוהותאם )ע"י מיהול( לקבלת .OD =1 מהלך הניסוי: 8 .1אינקובציה :הוספת 10 CFU/mlחיידקים למבחנה עם צמח ארבידופסיס לאינקובציה של 4 שעות מול מקור אור. .2לאחר האינקובציה עם חיידקים צמחי הארבידופסיס עברו פעמיים שטיפה כפי שתואר לעיל למשך דקה. .3צמחי הארבידופסיס עברו צביעה היסטוכימית כמתואר בסעיף .2.6 .4תיעוד של תהליך הצביעה התבצע באמצעות שולחן אור ומצלמה דיגיטלית מדגםCanon - .PowerShot A650 IS נספח תחלים: 1. proAtHXK1 fw: GGGTCGACATCATTAG 2. proAtHXK1+BamHI rev: CGCGGATCCGATTCCGATCGCAAAA 3. proAtHXK2 fw: AGCTCATCTCATGTTGCAGCA 4. proAtHXK2 rev+BamHI: CGCGGATCCTTTCTCCCTCGCCCAATTC 21 : תוצאות- 3 פרק :AtHXK1,2 אלמנטים רגולטוריים בפרומוטורים של3.1 בתכנון השיבוט של רצפי הפרומוטורים נבדקה תחילה נוכחות מסגרות קריאה אפשריות במעלה קודון באנליזת. על מנת לנסות לתחום את אורכו של הפרומוטור, AtHXK1,2 ( שלATG ) התחלת התרגום לא נמצאו מסגרות קריאה אפשריות ואורך רצף הפרומוטור שבודד היהproAtHXK1 הרצף של 60-100- נמצאו מספר מסגרות קריאה )באורך של כAtHXK2 באנליזת הרצף במעלה הגן.2056bp ששובט הוגבלproAtHXK2 ולכן אורךATG - במעלה ה1500bp -ח"א( של חלבונים לא ידועים כ רצפי הנוקלאוטידים של הפרומוטורים נבדקו במטרה לאתר מוטיבים העשויים לרמז על.1132 bp -ל לשם כך נעשה חיפוש של. ועל תהליכים בהם מעורבים אנזימים אלה,בקרת הביטוי של גנים אלה בכדי. (Higo et al., 1999) PLACE אלמנטים צמחיים ברצף הפרומוטורים על ידי השימוש במאגר n להעריך את תדירות הופעת האלמנטים בפרומוטור חושב הסיכוי ההסתברותי להופעת אלמנט בעל אורך- n) 1: 4n x אורך הפרומוטורx 100 = סיכוי הופעת האלמנט בפרומוטור:בסיסים באופן הבא נמצאו מספר אלמנטים הקשורים לתגובה לסוכרproAtHXK1 באנליזת הרצף של.(האלמנט המקושר לבקרה על התפתחות עצהACAAAGA האלמנט הרגולטורי-ולתהליכים התפתחותיים בגדיל המשלים, בנוסף.(3% משנית מופיע פעם אחת בגדיל החיובי )סיכוי הופעתו בפרומוטור הוא - מופיע פעם אחת אלמנט רגולטורי נוסף השכיח בפרומוטורים של גנים המבוקרים על ידי סוכרוז המצוי בגנים המבוקריםTTATCC האלמנט, כמו כן.(0.78% )סיכוי הופעתו הואAATACTAAT פעמים על הגדיל המשלים )סיכוי הופעתו3 על ידי סוכר ומקושר להתפתחות ניצנים חיקיים מופיע .(12.6% בפרומוטור הוא : proAtHXK1 רצף 5'GGGTCGACATCATTAGTCTCCTCTAATTGTTGTTCGAAAATTAATGCTCAACTTTTAATGTATGTACTAATTGATTATAAACA TTATATTAGTGTTTGAAATCACCTTAAATCGATAGATAGAAAAATCATTAAAGTTTTTTCACGTCTAGCATTTATCAACAACACAC ATCTGCAACATTTTAGCCGCTCCACAATGTAGTCCGTTCCGGTTTTTATACATGGTTCCGGTTTCATCCAAATTTTTACAGTTATT AATAGTTTATGAATACTTGAACAAAATTAAACTATAGTAAAAAAAAAAAAAAGTTTCTCTAAGATTTTGCTATTGTTCGATTAACT TTTCCA(CTCTG)ATTCTTTGGATTGGGTTCTTAACAGAAAAACAAATACGTGATGGTAATCCTCTCTCAGTTTTTACCATCGGAA AATGAATTTTTATGATGTCGTCAAATATCGAACATGCGGTAATAATCAGAGACATGCATTGCTATTAGTATTTCGTTTCCCCACCT ATATTTTGGTCAAAAGCAAACGTGTGGGGGTATACATACCTTTTCTTTCATGTAATGATACATGCTTTTTATTTGTATATAAATAT AATTATATTATATGATATCTAGAGTATCTAAATTTATTCAGTGATCTTCTTAATCAAAGGTTAATCATATCAAAACAACATTAGTG AACTGGATTGGGACCACTAATGAGTTGAAATAAGTTACCAGCTATTTCTTCTAATATCTGATAAATACTACTATTAGTCATAAGAA CAACAATTAGAATTAATAATATTCGTAACCATAATTGAGAGTTGACTTGTAAAGAAAAAAAAAAGTTATCTGATGTACTCAGGAAC TATTGCAAAAATACTATAAGAGCACAATTTAAAGATTGATTAGATTTTTTAAAAATGAGATAATGGAGAATCTAATGATGCAGAAA TTGTTGTTCCCACACGGACATACAATATGATAGTGTATTACTTTTTTGATTATAATCCGTTGGAAGAAGATTTTATCAAAACATCA AAAATTTAAGACTTGTAAGACCTCTAAGAAAATAATTTAATATCATTGTTCAACATGTATATAGTGTAAGTACTAAGTACACCCTG TAACCCTATTAGTAATCTTGACTACCTTTTTTTAATAGCAAATTTGGTTGTAAATTTGCTATATTAATAATGGGCTTGGTATAGAT TTTATTTTAGAAGGTCCATTACTTTCAATTGGAGTAAATGAACCGACTTTAAAGACTTTTAACTCAGGCCTTAATGTTACACAATA GAATAACATTATGACCCGGCCCAAATAAGTCGTCAGATCCAGTAAGCGTGCGACCAAACTATTTGTTTCTTACCATCGATATAAAC TTTAATGATTTTATACAAATTGAATAACATATTTATACAAATTGAATAATGATATGGATAATCCCTTTTATCTAAACAAAAAGAAG TGGATAATCCACATCATATTTGTCTGTAAATTATTTGTTTTAGTTATCTACTGATAAAAACATTGTTTATCTATATTATTTTATAT TATGTAGAGCCATTATCTCTTACGATTGAGCATTTTTAATCTTCTGACAGAAAAAATGCTAAGAATTAAAAGGACAAAGAAAAAAG AATGTGCAATTATCATGTGGTTGATTAGAGGTTTGAGAATGATTGGTGCTACCAGAAACTTAGGTGGAGAAAAGGATAAAAACCGA TATTA AATTAGACAAAAGGTTAATTTCGTCATTTCAACAGATTC CCACTTCTTGTTTTGTTTTTCCATACTTTACGGACA AGAACGAGAGAAGCTCTCGCTTACGTGGTTTCTACACTGTTTTTGACGAACCCACCAAGCTCGAGTAGATCGGTATTAGATCCATC TTAGGTTTCTCTAATTTCTCTCAATTCACTCCAAAATTTTGATTATTTCTTCTTTCTGGCTTGTCAATTTTAGTCATTTGTAATCC TTGCTTTTGCGATCGGAATCGTAAAAATCCGATCTTTCTTTTAGATTCGTTTTGTTTTTGATTCCAAATCGGAAAAATG 3' האיזור הלא. אשר שימש בבניית הפלסמיד שהוחדר לצמחים הטרנסגניםAtHXK1 רצף הנוקליאוטידים של הפרומוטור: 2 איור , ATTAGTATT רצף הנוקליאוטידים. קודון התחלת התרגום22 המסומן בסוף הרצף בקו תחתי הינוATG -מתורגם צבוע בסגול ו . רצפי פרומוטור שמורים מסומנים בהדגשה. ירוק וצהוב בהתאמה, מסומנים באדוםTTATCC - וACAAAGAA . TATTCT האלמנט הרגולטורי- נמצאו על הגדיל החיובי שני אלמנטיםproAtHXK2 באנליזת רצף ומופיע פעמיים )סיכוי הופעתו פעמיים ברצף הפרומוטורphotosystem II אלמנט זה מקושר למערכת המקושר לבקרת גנים המתבטאיםTAACTG אלמנט נוסף הנמצא ברצף הפרומוטור הינו.(7.6% הוא אלמנט זה נמצא פעמיים על רצף הפרומוטור )סיכוי הופעתו בפרומוטור דומה לאלמנט.בעקת יובש .(הקודם : proAtHXK2 רצף 5'AGCTCATCTCATGTTGCAGCACTATTGGTGTCTCGAACTTTAGTTGCTTAACTGTTATGTATGCTTCTATTTTTTTCTTTCGT GCTTTCTGTATGTCATTTGTAGCAGTGGTTTTTTTGGCCTTTGTAGCCTCTTTGATGTACTTGTTGAACCATTTCTCCATTGTTGG AGAGTAGAATCATTTATAAAAAGCTAGTTTGACCAAAAAAAAAAGATCCCACTGATTTTGCCAATACCAAATTTTACTATTCCCAA TTAACTGTACCAAGCAATATCTTTTTGGTTTGTAACATAATTTTGGCAAAGTTTCGACATGTATCAAACTATCAATCAAATTTGCG ATACTGATTTCTATATATAGTTTCAATTTTATTTGGATATCACAAATAAAAACTAAAAGTGGGTTGAAGAATTTACGAAATAATTA ACATAATTTTGGTCGGCGCTGACCATAATAATTAATAAATTGCGTCTTTTAGCTCTTAAGTATAGTCAAACGTTAATTTTTTTTAG TAAAGCAAAAGACGTGTCAAAGTCAAACTAACTAAAATTAGATGTTCTCATATACTGATATACAATCATATTTTTAATTATGAAAC TATATTGCGTCGTTGACAAAAAAAAAAACTTAGATTGCATCAATAATGGTTATTCTTACAAAAAAAAACCCGTTAATAAATGATAT AAAACAAATGAAAAATTAAAAAATTCGATATCATAAATTCATGATATTCTCTTTTACTCTTTTAGTAATTAGATCTCCGAATAATA GGTCA AATAATCGTTTACTAAAAACGTCCTCCACAAAATTCGGCAAGTAAAAGACCAAAACCAAATCTCTTCAG ATTTCGTA ACTTCACACTAATTCCATAACCATACATAAAAACAAACAAAAAAACAAATCCTGCGAGAAAAATCCCAAAAAATCAATAATTTAAA AGACA ACACAGAGCTTGCTTACGTGTTCTCCAAATTTTGTATACATTATTTTCACAAAACCAG TCACTTTCCATAGTTTAC TTCCTCAACAACTAGATCCATCATCTCTAGCGTTCTTAAAGTTTCCAACTTTTTTTTTTATTAATTTGGGCCAACTTTTTTTGGTT TGAGAATTGGGCGAGGGAGAAAGATG 3' האיזור הלא. אשר שימש בבניית הפלסמיד שהוחדר לצמחים הטרנסגניםAtHXK2 רצף הנוקליאוטידים של הפרומוטור: 3 איור - וTAACTG רצף הנוקליאוטידים. המסומן בקו תחתי בסוף הרצף הינו קודון התחלת התרגוםATG -מתורגם צבוע בסגול ו . רצפי פרומוטור שמורים מסומן בהדגשה. מסומנים בירוק כהה ובורוד בהתאמהTATTCT בשלבי התפתחות שונים שלproAtHXK2 - וproAtHXK1 דפוס ביטוי הפרומוטורים3.2 :הצמח הינה אמצעי המאפשר לבחון באילוGUS (β-glucuronidase) שיטת איחוי פרומוטור רצוי לגן המדווח ובאילו תנאים מתבטא הפרומוטור באופן שמאפשר אולי להקיש על, באילו תאים ורקמות,איברים . (Jefferson et al., 1987) תהליכים בהם מעורב הגן .שימוש בכלי זה עשוי לאתר באילו איזורים בצמח ובאילו שלבים ההתפתחותיים מתבטאים הפרומוטורים מאוחים לגןAtHXK2 - וAtHXK1 למטרה זו יצרתי פלסמידים בינאריים עם הפרומוטור של הגנים פלסמידים בינארים אלה הוחדרו לצמחי ארבידופסיס מהזן.( proAtHXK1,2::GUS ) GUS מכל. באמצעות טרנספורמציה על ידי חיידקי אגרובקטריוםMP- 1 ולצמחי עגבניה מהסוגColumbia .טרנספורמציה התקבלו שישה צמחי ארבידופסיס בלתי תלויים וארבעה צמחי עגבניה בלתי תלויים באמצעות צמחים אלה בדקנו על ידי צביעה.הצמחים הועברו לחדרי הגידול לשם גדילה והמשך בדיקתם הצביעה ההיסטוכימית התבצעה על ידי.היסטוכימית באילו רקמות ובאילו תנאים מתבטאים הפרומוטורים שעות וקבלת צבע כחול במקום בו4 למשך, X-Gluc ,GUS הדגרת רקמות הצמח עם הסובסטרט של . שימש כביקורת שליליתwild type צמח ה.יש ביטוי של הגן 23 ביטוי הפרומוטורים ברקמות נבחן בשלבי התפתחות שונים – לאורך תהליך הנביטה ,בנבט בוגר )לפני הצצת העלים האמיתיים( ,בשושנת עלים ובצמח בוגר בעל תרמילים בשלים .כבר בתחילת תהליך הנביטה ניתן להבחין כי ביטוי הפרומוטורים ייחודי-מאחר ו proAtHXK2::GUS -מתבטא בשורשון עוד לפני הצצתו מהזרע כבר 24שעות לאחר הזריעה ואילו proAtHXK1::GUSמתבטא בשורשון רק כ 48שעות לאחר הזריעה ,לאחר הצצת השורשון 72שעות לאחר הזריעה שני הפרומוטורים מתבטאים בשורשון אך לא בקצה המריסטמטי שלו .בזמן הצצת הפסיגים ) 96שעות לאחר הזריעה( proAtHXK1::GUSמתבטא בעיקר בשורשון בעוד proAtHXK2::GUSמתבטא גם בהיפוקוטיל ובפסיגים .בהמשך התפתחות הנבט ,בנבטים בוגרים יותר )בני כשבוע( ביטוי הפרומוטורים מתמקד בעיקר בשורש ובמערכות ההובלה של הפסיג -איור .4 B Post sowing: A B איור ( A) : 4דפוס ביטוי הפרומוטורים במהלך תהליך הנביטה )לאורך 120שעות( .כל 24שעות נלקחו זרעים מונבטים לשם צביעה היסטוכימית ב ( B) .GUS -אנליזת הביטוי התבצעה גם בנבטים טרנסגנים בני שבוע. באנליזה שנעשתה על צמח צעיר )בן שבועיים( ניתן לראות כי proAtHXK1::GUSמתבטא בעיקר בעלים צעירים ואילו proAtHXK2::GUSמתבטא בעיקר בעלים בוגרים )איור . (5Aכמוכן בצמחי ארבידופסיס בוגרים )בני 6שבועות( ניתן לראות כי שני הפרומוטורים מתבטאים בעיקר בעלים ,כאשר proAtHXK1::GUSמתבטא ברמה גבוהה בעלים צעירים ואילו וביטוי proAtHXK2::GUSגבוה יותר בעלים בוגרים ) איור . (5B B A איור : 5דפוס ביטוי הפרומוטורים בשושנת עלים של צמחי ארבידופסיס טרנסגנים )בני שבועיים() (A ובצמחים בוגרים )בני 6שבועות( ) .( B 24 3.3דפוס ביטוי הפרומוטורים באיזורים שונים של צמח בוגר )בן 6שבועות(: ביטוי הפרומוטורים נבחן באברי הצמח השונים ,ברקמות ותת רקמות שונות – 3.3.1אנליזת ביטוי הפרומוטורים בפרחים -ניתן להבחין כי רמת ביטוי proAtHXK2::GUSהינה גבוהה במיוחד בניצן צעיר של תפרחת )איור .(6 Aבתפרחות בוגרות ניתן לראות כי רמת ביטוי שני הפרומוטורים גבוהה ברקמות החיבור )מסומן בחץ( ובפרחים בוגרים )איור .( 6B A B איור : 6דפוס ביטוי הפרומוטורים בתפרחות צעירות ) ( Aובוגרות ) .( B בהסתכלות על אברי הפרח השונים )איור ( 7ניתן להבחין כי שני הפרומוטורים מתבטאים ברמה גבוהה בצלקת ) ,( Sאבקנים ) ( Pובזיר ) .( Fיחד עם זאת נראה כי ביטוי proAtHXK1::GUSגבוה גם בעלי הגביע ) ( SEוברקמת ההזנה של גרגרי האבקה במאבק )טפתום( ) .( A איור : 7דפוס ביטוי הפרומוטורים בחלקי S הפרח השונים. A F 25 P 3.3.2ביטוי הפרומוטורים בתרמילים בוגרים- כפי שניתן לראות באיור , 8ביטוי שני הפרומוטורים הינו גבוה ברקמת החיבור של התרמיל ) ( Aוביטוי proAtHXK1::GUSאף גבוה בצינורות ההובלה של מעטפת התרמיל ) .( B B A איור : 8דפוס ביטוי הפרומוטורים בתרמילים בוגרים. 3.3.3אנליזת ביטוי הפרומוטורים ב– shoot apical meristem (SAM) - איור : 9דפוס ביטוי הפרומוטורים ב. SAM - 3.3.4אנליזת ביטוי הפרומוטורים בעלים- מבחינה תת רקמתית של עלים צעירים ניתן להבחין כי הפרומוטורים מתבטאים באיזור עלי הלוואי המכונים ) stipulesאיור , 10Aמסומנים בחץ( ,אזורים הידועים כאתרים ראשוניים לסינתזת האוקסין בעלה .ניתן לראות כי proAtHXK2::GUSמתבטא ב stipules -של נבטים ואילו 26 proAtHXK::GUS1מתבטא ב stipules -בשלבים בוגרים יותר )בשושנת עלים בוגרים( .כמוכן, עולה כי ביטוי הפרומוטורים הינו בעיקר בצינורות ההובלה ובאזורי מפגש צינורות ההובלה בהיקף העלה )איור ,10Bמסומן בחץ( ,אזורים אלה ,המכונים , hydathodesמשמשים אף הם אתרים לסינתזת אוקסין המכוונת את התפתחות צינורות ההובלה .בעלים בוגרים נשמר הביטוי הגבוה של הפרומוטורים בצינורות ההובלה ובהידטות ,בנוסף ניתן להבחין כי רמת הביטוי של proAtHXK2::GUSהינה גבוהה גם בכל העלה )איור .( 10C A B C איור : 10דפוס ביטוי הפרומוטורים בתת רקמות עלה בוגר. מאנליזת הביטוי בעלים בוגרים עולה כי הן proAtHXK1::GUSוהן proAtHXK2::GUS -מתבטאים ברמה גבוהה בתאי מזופיל )איור -(1 1 27 איור : 11דפוס ביטוי הפרומוטורים בתאי מזופיל של עלה בוגר. כמו כן ,מאנליזת ביטוי הפרומוטורים ניתן להבחין כי הן proAtHXK1::GUSוהן- proAtHXK2::GUSמתבטאים בטריכומות proAtHXK1::GUS .מתבטא בכל הטריכומה אך בעיקר בבסיסה )איור -( 12 איור : 12דפוס ביטוי הפרומוטורים בטריכומות של עלה בוגר. ביטוי הפרומוטורים נבדק גם בפיוניות הנמצאות בעלים ובפטוטרת .ניתן לראות באיור 13כי proAtHXK1::GUSמתבטא פיוניות שבעלה ואילו proAtHXK2::GUSמתבטא הן בפיוניות שבעלה והן בפיוניות שבפטוטרת העלה. איור : 13אנליזת ביטוי הפרומוטורים בפיוניות של עלה בוגר ובפטוטרת. 28 3.3.5אנליזת ביטוי הפרמומוטורים בשורשים -אנליזת ביטוי הפרומוטורים בשורשים )איור (14 מראה כי שני הפרומוטורים מתבטאים ברמה גבוהה הן בקצה השורש ) ( Root capוהן באזור ההתארכות ) .( Cell elongation zoneיחד עם זאת ,נראה כי הפרומוטורים אינם מתבטאים באיזור המריסטמתי של השורש ) ( Cell divisionהמתאפיין בחלוקה מאסיבית של תאים. proAtHXK2 proAtHXK1 3 2 3 3 3 wt 2 2 2 2 1 1 1 1 איור : 14דפוס ביטוי הפרומוטורים בתת רקמות השורש. 3.4דפוס ביטוי הפרומוטורים תחת השפעת סוכרים שונים: על מנת לאפיין את התפקיד החישתי של AtHXK1ו AtHXK2 -בתגובה לסוכרים שונים נבחן דפוס ביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -בהשפעת הסוכרים גלוקוז ,סוכרוז וטרהלוז )איור .(15כפי שהוזכר בפרק המבוא ,לסוכרים אלה תפקידים שונים בחישת הסוכר בצמח .כביקורת אוסמוטית נבחנה השפעת הסוכר סורביטול על ביטוי הפרומוטורים .סורביטול הינו סוכר בעל אוסמולריות דומה לזו של גלוקוז אך אינו משתתף במנגנון חישת הסוכר בצמח. ניתן לראות כי גלוקוז וסורביטול בריכוז 6%עיכבו את ביטוי הפרומוטורים בצורה משמעותית .לכן ניתן להעריך כי עיכוב הפרומוטורים על ידי ריכוז גבוה של סוכרים נובע מאפקט אוסמולרי ולא חישתי .כמו כן ,ניתן להבחין כי לריכוז נמוך של סוכרים )סוכרוז ,2%גלוקוז 1%וטרהלוז המתפרק לגלוקוז ופרוקטוז( יש אפקט חיובי על ביטוי . proAtHXK2::GUSכמו כן ניתן לראות כי הוספה של ולדמיצין )מעכב את פירוק הטרהלוז( בנוכחות טרהלוז מעכבת את ביטוי שני הפרומוטורים -תוצאה זו מתיישבת עם תוצאות קודמות שהתקבלו במעבדתינו אשר הראו כי טרהלוז מעכב ביטוי הקסוקינאזות מעגבניה )לא פורסמו(. 29 איור :15נבטי ארבידופסיס טרנסגנים הושרו בטילטול למשך 4שעות בתמיסה אשר הכילהGlucose 1,6% : (Glu) 1,6%, Sucrose (Suc) 2%, Sorbitol (Sorb), Trehalose (Tre) 40mMוTrehalose ( Tre+Val) - + Valydamycin .80µMשימשו כביקורת להערכת אפקט הטיפול על ביטוי הפרומוטורים מכל טיפול נלקחו 4 נבטים לצביעה היסטוכימית ב.GUS - 3.5דפוס ביטוי הפרומוטורים תחת השפעת עוצמות אור שונות: כפי שתואר לעיל HXKs ,ממלאים תפקיד מרכזי ומורכב בבקרת הפוטוסינתזה ולכן פעילותם מבוקרת על ידי האור .בכדי לבחון האם גם ביטוי HXKsמבוקר על ידי האור ,ביטוי proAtHXK1::GUSו- proAtHXK2::GUSנבחן בהשפעת עוצמות אור שונות .כפי שניתן לראות באיור 16לא נצפה כל הבדל ברמת הביטוי של הפרומוטורים תחת עוצמות האור השונות. איור :16נבטי ארבידופסיס טרנסגנים אשר הכילו את הגן GUSמאוחה לפרומוטורים proAtHXK1::GUSו- proAtHXK2::GUSנחשפו למשך 4שעות ל 3 -עוצמות אור שונות .בנוסף ,מכל טרנסגן קבוצת נבטים גודלה במשך 24שעות בחושך מוחלט .לאחר מכן בוצעה צביעה היסטוכימית ב. GUS - 30 3.6דפוס ביטוי הפרומוטורים תחת השפעת הורמונים שונים ומלח: מאחר וידוע כי HXKsמעורבים במערכות סיגנלים הורמונאליות ,נבדקה השפעת הורמונים שונים על ביטוי proAtHXK1::GUSו . proAtHXK2::GUS -ביטוי הפרומוטורים נבחן בהשפעת הורמוני עקה שונים Salicylic acid (SA) 200µM - ,Absicic acid (ABA) 20µM,בהשפעת הורמוני גדילה Zeatin Gibrellin (GA) 100µM ,(ZE) 4.5µM, -ומלח .NaCl 200mM -כפי שניתן לראות באיור 17ביטוי שני הפרומוטורים נמוך במיוחד בפסיגים בהשפעת ABA,SA,GA,ו. NaCl - בנוסף ,ניתן להבחין כי ביטוי הפרומוטורים מעוכב באופן מוחלט על ידי SAבכל חלקי הנבט .כמוכן, ניתן להבחין כי ZEמעודד את ביטוי proAtHXK1::GUSבפסיג. איור :17ביטוי הפרומוטורים נבחן תחת הורמונים שונים ומלח באופן דומה לניסוי שתואר באיור .15 ביטוי הפרומוטורים נבדק גם בהשפעת ההורמון אוקסין ) ( indole butyric acid- IBAבריכוז . 5 pM ניתן לראות כי מתן IBAעודד ביטוי proAtHXK1::GUSבפרימורדית העלים ואת ביטוי proAtHXK2::GUSב -עלי הלוואי )איור .(18 31 איור :18ביטוי הפרומוטורים בהשפעת אוקסין חיצוני- אופן ביצוע הניסוי זהה לניסוי שתואר באיור .15 ביטוי הפרומוטורים בצמחים צעירים נבדק גם בהשפעת ההורמון אתילן .כפי שניתן לראות באיור 19 נראה כי מתן אתילן בריכוז של 10 ppmהגביר את ביטוי הפרומוטורים בעלים )יש לסייג תוצאות אלה מאחר וביטוי הפרומוטורים בצמחי הביקורת היה נמוך מהצפוי(. איור -19צמחי ארבידופסיס טרנסגנים בני 3שבועות הושרות למשך הלילה באוירה נטולת אתילן )צמחי ביקורת( ובאוירה מועשרת באתילן בריכוז של 1ו- .10ppmלאחר מכן הצמחים עברו צביעה היסטוכימית ב. GUS - 3.7דפוס ביטוי הפרומוטורים תחת עקות שונות: כפי שהוזכר בפרק המבוא ,פעילות HXKsנקשרת לא מעט לעקות שונות .לכן ,דפוס ביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -נבחן תחת השפעת עקות שונות- 3.7.1עקת חום וקור ביטוי הפרומוטורים נבדק בהשפעת טמפ' קיצון .כפי שניתן לראות באיור ,20הן טמפ' נמוכה ) (4º Cוהן טמפ' גבוהה ) (43º Cעיכבו את ביטוי proAtHXK2::GUSבפסיג .יחד עם זאת ,נראה כי תחת עקת חום ישנה עליה בביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -בגבעול .בנוסף ,ניתן להבחין כי עקת חום גורמת לעליה בביטוי proAtHXK1::GUSבפרימורדיה של העלה. 32 איור :20נבטי ארבידופסיס טרנסגנים עברו אינקובציה ב ddw -בטמפרטורה של 4º Cו- .43º Cלאחר מבכן הנבטים עברו צביעה היסטוכימית ב. GUS - 3.7.2עקת יובש: ביטוי הפרומוטורים נבדק גם לאורך עקת יובש .לשם כך הופסקה השקיית צמחי ארבידופסיס טרנסגנים וביטוי הפרומוטורים נבחן בצמח השלם לאחר תקופות יובש של 9 ,6 ,3ו 14-יום. כפי שניתן לראות באיור 21Aלאורך תקופת ההתייבשות עוצמת ביטוי proAtHXK1::GUSבעלים הלכה וקטנה- 33 A איור :21צמחי ארבידופסיס טרנסגנים בני 4שבועות גודלו בתנאים סטנדרטיים למעט השקיה .אחרי 3,6,9ו14- יום ללא השקיה נלקחו קבוצות של 4צמחים לצביעה היסטוכימית ב. GUS - כביקורת נלקחו צמחים טרנסגנים מושקים. אנליזת ביטוי proAtHXK2::GUSבעקת יובש )איור ( 21Bמראה כי בנוסף לירידה בביטוי הפרומוטור בעלים ,לאחר 9ימי יובש ישנה אינדוקציה של הפרומוטור בתרמילים ולאחר תקופת יובש של 14יום ישנה אינדוקציה נוספת של הפרומוטור לאורך הגבעול- B * * * ניתן לראות כי בתרמיל של צמח אשר עבר עקת יובש במשך 9ימים לפחותproAtHXK2::GUS , מתבטא בכל רקמות התרמיל למעט הזרע. 34 3.7.3פציעה מכאנית: כחלק מאנליזת ביטוי הפרומוטורים תחת עקות שונות ביטוי הפרומוטורים נבדק גם בעקבות פציעה מכאנית .לשם כך צמחי ארבידופסיס בוגרים נשברו במספר מוקדים לאורך הגבעול ולאחר מכן עברו צביעה היסטוכימית .ציקלוהקסמיד )מעכב סינתזת חלבונים( שימש כאמצעי ביקורת לבחון האם צביעת GUSמקורה בסינתזה חדשה של האנזים או בכניסה מוגברת של הסובסטראט לרקמה בעקבות הפציעה. ניתן לראות באיור 22כי פציעה מכאנית גורמת לאינדוקציית שני הפרומוטורים ,אולם לא בנוכחות ציקלוהקסמיד ,כלומר העליה בביטוי לא נובעת מכניסה מוגברת של הסובסטראט אלא מביטוי מוגבר של הפרומוטורים. איור : 22צמחי ארבידופסיס בוגרים נשברו במספר מוקדים לאורך הגבעול ולאחר מכן עברו צביעה היסטוכימית של . GUS טיפול בציקלוהקסמיד )מעכב סינתזת חלבונים( שימש כביקורת להערכת סינתזת חלבון GUSחדש בעקבות הפציעה. 3.7.4הדבקה פתוגנית: מאחר ונמצא כי ל HXKs -יש תפקיד בהגנת הצמח מפני פתוגנים שונים ,ולאור העובדה כי האנזים AtHXK1נחקר במעבדתינו כמבקר את מפתח הפיוניות ,ביטוי הפרומוטורים נבדק גם כנגד הדבקה פתוגנית של Salmenella typhimurium , Pseudomonas syringaeו- Erwinia carotovora - פתוגנים החודרים לצמח דרך הפיוניות .כפי שניתן לראות באיור 23Aבצמחים אשר נחשפו במשך שעתיים לפתוגנים Salmenella typhimuriumו Erwinia carotovora -רמת ביטוי 35 proAtHXK1::GUSירדה משמעותית .יחד עם זאת ,לאחר 4שעות חשיפה רמת ביטוי הפרומוטור ירדה משמעותית עם כל הפתוגנים. )(A איור - 23צמחי ארבידופסיס בני 3 שבועות הושרו במשך 4 שעות ובסמוך למקור אור ב ddw -עם הפתוגנים Pseudomonas ,syringae Salmenella typhimuriumו- .Erwinia .carotovoraכביקורת, צמחי הארבידופסיס הושרו ב ddw -ללא חיידקים .לאחר מכן, הצמחים עברו צביעה היסטוכימית ב. GUS - באנליזת ביטוי שנעשתה על צמחים אשר הכילו proAtHXK2::GUSניתן לראות כי לאחר שעתיים של חשיפה לפתוגנים רמת ביטוי הפרומוטור ירדה באופן ניכר רק בעקבות חשיפה לErwinia - .carotovoraיחד עם זאת ,רמת הביטוי של הפרומוטור ירדה משמעותית בעקבות חשיפה של 4שעות כנגד כל הפתוגנים ) .( 23B )(B 3.8דפוס ביטוי הפרומוטורים בצמח עגבניה: פעילות הפרומטורים )שמקורם מצמחי ארבידופסיס( נבדקה גם בצמחי עגבניה בכדי לבחון האם בקרת פעילות הפרומוטורים של הקסוקינאזות שמורה בין צמחים שונים .באיור 24ישנה סקירה של האיברים 36 proAtHXK1::GUSמתבטא בפריקפ של פרי בשל. איור -24צמחי עגבניה טרנסגנים ) proAtHXK1::GUSו ( proAtHXK2::GUS -עברו צביעה היסטוכימית ב - GUSעל מנת לאפיין את דפוס ביטוי הפרומוטורים בצמח העגבניה. 37 38 טבלת סיכום דפוס ביטוי proAtHXK1ו proAtHXK2 -באזורים שונים – A טבלת סיכום דפוס ביטוי proAtHXK1ו proAtHXK2 -תחת טיפולים שונים – B איור -26סיכום ביטוי הפרומוטורים באיזורים שונים ) ( Aותחת טיפולים שונים ) .( B 39 פרק -4דיון ומסקנות: 4.1השוואת אנליזת ביטוי proAtHXK1ו proAtHXK2 -לאנליזות ביטוי AtHXK1,2אחרות הקיימות בסיפרות : למרות ששיטת איחוי פרומוטורים לגן מדווח ) ( GUSבוחנת את פעילות הפרומוטורים ולא את רמת ה / mRNAחלבון ברקמה ,שיטה זומדויקת ויעילה יותר משיטות אחרות של אנליזות ביטוי ,בזיהוי מיקום ביטוי הגן .דפוס ביטוי AtHXK1ו AtHXK2 -נבחן לראשונה בשיטת Northernעל ידי Jang et al ) . (1997מאחר וקיימים שישה איזוזימים של הקסוקינאזות בארבידופסיס והיברידיזציה המתבצעת בשיטה זו היא בין cDNAבאורך מלא ) (~2 kbpל , mRNA -קיים חשש כי תתרחש היברידיזציה לא ספציפית בין cDNAשל איזוזימים שונים .כמו כן ,באנליזת ה Northern -לא נעשתה כל אבחנה בין אברים שונים ורקמות ותת רקמות שונות .אכן ,ישנן לא מעט אי התאמות בין תוצאות אנליזת ביטוי הגנים לפי שיטה זו )איור (27לתוצאות אנליזת ביטוי - proAtHXK1,2::GUS • על פי תוצאות ה Northern -עולה כי AtHXK1מתבטא ברמה גבוהה בשושנת העלים ) ( Rosetteו AtHXK2 -מתבטא ברמה נמוכה .אך לא נעשתה כל אבחנה בין עלים בוגרים וצעירים .אבחנה זו בעלת חשיבות מכיוון שמתוצאות אנליזת ביטוי הפרומוטורים עולה כי דפוס ביטויים שונה בעלים צעירים ומבוגרים )איור .(5 • אנליזת ה Northern -הציגה ביטוי גבוה של שני הגנים בשורש ) ,( Rootאך לא נעשתה אבחנה בביטוי הגנים בתת רקמות השורש -על פי אנליזת ביטוי הפרומוטורים עולה כי ביטויים גבוה אך ורק באזור ההתארכות ובקצה השורש ,בעוד שביטוים נמוך מאד בחלק המריסטמטי )איור .(14 • על פי אנליזת ה Northern -ביטויים בגבעול גבוה ,ואילו מאנליזת ביטוי הפרומוטורים בעבודה זו נראה כי ביטויים בגבעול נמוך . • אנליזת ה Northern -הראתה כי ביטוי הגנים גבוה בפרחים ) ( Flowerאך אין התייחסות פרטנית לגבי חלקי הפרח השונים והאם מדובר בפרחים בוגרים או צעירים -מתוצאות אנליזת ביטוי הפרומוטורים עולה כי ביטוים גבוה רק בפרחים בוגרים ובמיוחד בצלקת ,זיר ואבקנים )איור .(7 • על פי תוצאות ה Northern -נראה כי ביטוי הגנים גבוה בתרמילים ) ( Siliqueאך באנליזת ביטוי הפרומוטורים נראה כי ביטויים בתרמילים נמוך. Affymetrixהינה שיטה נוספת לבחינת דפוס ביטוי גנים -בשיטה זו ישנה היברידיזציה של מקטעי mRNA קצרים למקטעי DNAבאורך 11-20 bpהמסודרים על 40 שבב .דיוק השיטה רב יותר מאנליזת Northernמכיוון שההיברידיזציה מתבצעת בין מקטעים קצרים יותר .במסגרת שיטה זו נבחן ביטוי AtHXK1ו AtHXK2 -בשלבי התפתחות שונים ובאברים שונים )איור ,(28 Aאך מכיוון שבחינת הביטוי לא נעשתה ברקמות ותת רקמות ,גם שיטה זו הינה פחות מדויקת מאנליזת ביטוי . proAtHXK1,2::GUSיחד עם זאת ,אפיון דפוס ביטוי הגנים בשיטה זו דומה יותר לאפיון דפוס ביטוי - proAtHXK1,2::GUS בדומה לאנליזת ביטוי הפרומוטורים ,גם בשיטת Affymetrixנמצא כי ביטוי הגנים בנבטים הינו גבוה. יחד עם זאת ,שיטה זו אינה מתייחסת באופן ספציפי לחלקי הנבט השונים .כמוכן ,בשיטה זו ישנה הבחנה בין שושנת עלים צעירה לבוגרת באופן הדומה לדפוס ביטוי הפרומוטורים -ביטוי AtHXK1עולה בעלים צעירים ויורד בעלים בוגרים בעוד שדפוס ביטוי AtHXK2בעלים הפוך .בנוסף ,גם באנליזת הביטוי של AtHXK1בפרחים חסרה אבחנה ספציפית של חלקי הפרח השונים .ההשוואה המעניינת ביותר הינה בתרמילים בשלים -על פי אנליזת ביטוי הגנים לפי שיטת Affymetrixנראה כי ביטוי AtHXK1 בתרמילים נמוך בעוד שביטוי AtHXK2גבוה .יחד עם זאת ,אנליזת ביטוי הפרומוטורים הראתה כי רק לאחר ייבוש ממושך של לפחות 9ימים ביטוי proAtHXK2עולה באופן משמעותי ) .( 28Bהשוואה זו תומכת בהשערה לפיה ל AtHXK2 -יש תפקיד בהבשלה מזורזת של התרמיל תחת עקת יובש. A )*( B * * איור ( A ) -28אנליזת ביטוי לגנים AtHXKו AtHXK2 -על פי שיטת Affymetrixכפי שפורסמה באתר- -( B ) . www.genevestigator.comביטוי proAtHXK1,2::GUSבתרמילים של צמחים טרנסגנים מושקים ) ( controlוצמחים שעברו ייבוש במשך 9ימים. 41 4.2אנליזת ביטוי הפרומוטורים בשלבי התפתחות שונים מרמזת על תפקידים שונים של AtHXK1ו: AtHXK2 - תהליך הנביטה בצמח מאופיין בחלוקת תאים אינטנסיבית והתמיינות של רקמה מריסטמטית .מאחר וביטוי proAtHXK2::GUSהינו גבוה בכל חלקי הנבט לאורך כל תהליך הנביטה )איור (4 Aניתן לשער כי תפקיד AtHXK2הינו מטבולי ונועד לספק את הצרכים האנרגטיים של רקמה זו .יחד עם זאת ,דפוס ביטוי proAtHXK1::GUSבתהליך הנביטה יותר ספציפי ומתמקד בעיקר בגבעול ובשורש .דפוס זה יכול לרמז על תפקיד אפשרי של AtHXK1בחלוקת התא באיברים אלה .בנבט בוגר ,ביטוי הפרומוטורים מתמקד במערכות ההובלה בפסיג ובשורש )איור ( 4Bומעיד על קשר אפשרי של האנזימים לתפקוד מערכת ההובלה באיברים אלה .בשושנת עלים של צמח צעיר proAtHXK1::GUSמתבטא בעיקר בעלים צעירים )אברי מבלע( ולכן ייתכן ולאנזים זה תפקיד התפתחותי בעלה בצמח. 4.3אנליזת ביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -בהשפעת סוכרים שונים מלמדת על בקרה מטבולית של הסוכרים על פעילות הפרומוטורים: באנליזת הרצף של proAtHXK1::GUSנמצאו האלמנטים AATACTAATוTTATCC - המקושרים לגנים המבוקרים על ידי סוכרים -קיימת האפשרות כי אלמנטים אלה מרמזים על בקרה של סוכרים על ביטוי . AtHXK1מאנליזת ביטוי proAtHXK1::GUSבהשפעת סוכרים שונים )איור (15 עולה כי מתן גלוקוז ) 1ו ( 6% -וסוכרוז מעכבים את ביטוי הפרומוטור .אך ,כאשר בוחנים את ההשפעה האוסמוטית ,ניתן לראות בבירור כי גם לסורביטול בריכוזים דומים יש השפעה זהה ולכן ניתן להסיק שבקרת ביטוי הפרומוטורים נבעה מהשפעה אוסמוטית ולא בקרתית. כמו כן ,עיכוב הפרומוטורים על ידי טרהלוז +ולידמיצין )המונעת את פירוק הטרהלוז לגלוקוז ופרוקטוז( מרמז על התפקיד המטבולי של - AtHXK1,2ידוע כי טרהלוז ,אשר נוצר כאשר רמת הסוכרים בתא גבוהה ,מונע יציאה של סוכר מן הפלסטידות ובכך מהווה חיישן למצב הסוכר בתא .נוכחות טרהלוז "מאותתת" לתא כי אין צורך בזירחון הקסוזות על ידי . HXKלכן ,מתן של טרהלוז +ולידמיצין מתאפיין בירידה בביטוי הפרומוטורים .עדות נוספת לכך שטרהלוז מעכב ביטוי HXKנמצא במעבדתינו על ידי אנליזת qPCRשהראתה כי בצמחי עגבניה )מזן (MP-1ביטוי הקסוקינאזות SlHXK2,3,4עוכב על ידי טרהלוז. יחד עם זאת ,ניתן לראות כי ביטוי proAtHXK2::GUSעלה בעקבות מתן ריכוז סוכר נמוך )גלוקוז 1%ו -סוכרוז (2%ועוכב באופן מוחלט בעקבות מתן גלוקוז -6%דפוס ביטוי זה מרמז על בקרה של גלוקוז וסוכרוז על ביטוי ) AtHXK2בניגוד לתחזית על סמך אנליזת רצף הפרומוטור כי העיכוב יתרחש על .( AtHXK1 42 4.4ביטוי הפרומוטורים ברקמות ותת רקמות של הפרח מרמז כי לאנזימים AtHXK1ו- AtHXK2תפקיד בהתפתחות הפרח: באנליזת ביטוי של אברי הפרח )איור 6ו (7 -והתרמיל )איור (8ניתן לראות כי שני הפרומוטורים מתבטאים ברמה גבוהה ברקמות החיבור )מסומן בחץ( .המורכבת מתאים מתים ומזדקנים .מאחר וידוע כי אוקסין הינו אנטגוניסט לתהליכי הזדקנות ) ( Noh and Amasino, 1999ניתן לשער כי ביטוי ספציפי של הפרומוטורים ברקמה זו יכול להעיד על תפקיד האנזימים AtHXK1ו AtHXK2 -בתהליכי הזדקנות המתווכים בחלקם על ידי אוקסין .מאחר וידוע כי אספקת סוכרים הינה חיונית להתפתחות תקינה של הפרחים ויצירת אברי רביה פוריים ) (Stanley, 1971; Pacini, 1996ולאור העובדה כי שני הפרומוטורים מתבטאים באופן ספציפי באיברים שונים )אבקנים ,צלקת ועלי הגביע( ניתן לשער כי לאנזימים AtHXK1ו AtHXK2 -תפקיד בהתפתחות הפרח )ידון בהמשך( .העובדה כי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -אינם מתבטאים בפרחים מתפתחים ,מרמזת כי ייתכן ול- AtHXKsיש תפקיד בשלבים מאוחרים בהתפתחות הפרח. 4.5ביטוי הפרומוטורים בצינורות ההובלה ובאתרים של סינתזת אוקסין מרמז על תפקיד AtHXK1ו AtHXK2 -בהתפתחות מערכת ההובלה: באנליזת הרצף של proAtHXK1::GUSנמצא האלמנט ACAAAGA ,הנקשר להתפתחות עצה משנית .אלמנט זה הינו עדות ראשונית המרמז על תפקיד האנזים AtHXK1בהתפתחות מערכות ההובלה .כמו כן ,כפי שהוזכר בסעיף ,4.2מתוצאות אנליזת ביטוי הפרומוטורים עולה כי ,הן proAtHXK1::GUSוהן proAtHXK2::GUS -מתבטאים במערכת ההובלה כבר בשלבים המוקדמים של התפתחות הצמח )בפסיג -איור .(4ביטוי זה נשמר לאורך התפתחות הצמח במערכת ההובלה של העלה הבוגר )איור .(10 B,Cבנוסף ,הפרומוטורים מתבטאים במערכות ההובלה שבעלי הגביע )איור (7 ונראה כי proAtHXK1::GUSאף מתבטא במערכת ההובלה של מעטפת התרמיל ) .(8 Bהעובדה כי קיים ביטוי גבוה של הפרומוטורים במערכת ההובלה לאורך שלבי ההתפתחות השונים ובאברי הצמח השונים יכולה לרמז על תפקיד מרכזי של האנזימים AtHXK1ו AtHXK2 -בתפקוד והתפתחות מערכת ההובלה בצמח .יתר על כן ,תוצאות אנליזת ביטוי הפרומוטורים מרמזות כי תפקיד זה מערב פעילות הורמונלית של אוקסין .אוקסין ,הורמון הידוע כמבקר התארכות טרכיאות מיוצר באיזורים שונים בצמח כדוגמת תאי לוואי ) ( stipulesוהידטות ) .( Aloni, 2004 ) ( hydathodsאיור 29מתאר את המתאם שבין נוכחות האוקסין וביטוי proAtHXKsבשני שלבי התפתחות שונים -בעלי הלוואי )איור ( 29Aובהידטות )איור .( 29B 43 B C R. Aloni 2004 A איור - A -29תיאור סכמטי של התפתחות עלי הלוואי וההידטות בעלה כאתרים מרכזיים לסיתנתזת אוקסין - B .ביטוי מייצג של הפרומוטורים בעלי הלוואי וההידטות ) ) ( Cמסומנים בחץ(. איתור אתרים אלה ואחרים בהם מיוצר ומצטבר אוקסין נעשה בעזרת אנליזת ביטוי של הפרומוטור DR5 )פרומוטור המגיב לאוקסין( מאוחה לגן .( Aloni, 2004 ) GUSבאיור 29ניתן לראות כי דפוס ביטוי DR5::GUSדומה מאד לדפוס ביטוי proAtHXK1,2::GUSבהידטות ובצלקת וביטוי proAtHXK2::GUSבבסיס הטריכומה .איזורים אלה אופיינו כאתרים משניים לסינתזת והצטברות אוקסין. איור -30השוואה בין דפוס ביטוי )(Aloni 2004 proAtHXK1,2::GUS לדפוס ביטוי DR5::GUSבהידטות, צלקת ,וטריכומות המהווים אתרים לסינתזת אוקסין. ביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -באזורים אלה מרמז על תפקיד אפשרי של AtHXK1,2במסלול העברת סיגנל האוקסין .כמו כן ,העובדה כי proAtHXK1::GUSמתבטא במריסטמה האפיקלית ) ) ( SAMאיור ,(9אזור נוסף הידוע כאתר מרכזי לסינתזת האוקסין ,מרמזת כי ל- AtHXK1תפקיד ספציפי בהעברת סיגנל האוקסין באיזור זה .יתר על כן ,מאחר וביטוי הפרומוטורים עוכב במתן ) GAאיור ,(17הידוע כאנטגוניסט לפעילות האוקסין )להורמון זה יש תפקיד בעיבוי והבשלת טרכיאות( ) ,( Aloni, 1979ניתן לשער כי האיזון העדין בפעילות הורמונים אלה הוא המבקר את ההתפתחות מערכות ההובלה בצמח .כמו כן ,בנבטי ארבידופסיס טרנסגנים 44 ( proAtHXK1,2::GUSאשר נחשפו לאוקסין )איור ,(18ביטוי proAtHXK1::GUSעלה בקודקוד הצמיחה של העלה )אתר סינתזה נוסף של אוקסין( וביטוי proAtHXK2::GUSאף התגבר באיזור עלי הלוואי -תוצאה זו יכולה לרמז כי כל אחד מהאנזימים AtHXK1ו AtHXK2 -נוטל חלק ייחודי במסלול מעבר סיגנל האוקסין .עליה בביטוי AtHXK1ו AtHXK2 -בתגובה לאוקסין יכולה להעיד על משוב חיובי של מסלול העברת סיגנל האוקסין דרך .AtHXKs 4.6עליה בביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -בעקבות פציעה מכאנית ועקת חום מהווה רמז נוסף לקשר שבין AtHXKsואוקסין: ל HXKs -ישנה חשיבות מטבולית רבה בהתמודדות הצמח בפני פציעה מכאנית מאחר וכאשר הצמח נפגע )מכאנית ,התקפה פתוגנית וכו'( התאים הפגועים מאיצים את פעילותם המטבולית בכדי לאפשר התחדשות רקמה בריאה ) .( Klotz et al, 2005יחד עם זאת ,יתכן כי תפקיד AtHXK1ו AtHXK2 -בהתמודדות הצמח מתבטא בבקרת פעילות פקטורים שונים כדוגמת חומצה ג'סמונית .כמוכן ,ידוע כי אוקסין מצטבר באיזור הפציעה ואחראי על התחדשות קסילם באיזור ) .( Alloni, 2004לכן ,ייתכן כי עליה בביטוי הפרומוטורים נגרמת עקב הצטברות האוקסין כחלק מתפקיד האנזימים AtHXK1וAtHXK2 - בהתארגנות מחודשת של צינורות הובלה .בנוסף ,ידוע כי רמות האוקסין ורגישותו בצמח עולים בתגובה לחום כחלק משמירה על התפתחות תקינה של הצמח ) .( Kaplinsky NJ, 2009לכן ,ניתן לשער כי עליה בביטוי proAtHXK1::GUSבקודקוד הצמיחה בתגובה לעקת חום )איור (20נובעת מעליה בסינתזת האוקסין המביאה לעליה בביטוי , proAtHXK1::GUSכחלק ממסלול מעבר סיגנל ההורמון. 4.7ביטוי proAtHXK1ו proAtHXK2 -בפיוניות מרמז על תפקיד מרכזי בבקרת הובלת מים והתמודדות הצמח כנגד פתוגנים: מחקרים שונים הראו כי תפקוד הפיוניות מהווה חלק ממנגנון בקרה האחראי על האיזון העדין שבין קצב הדיות לקצב קיבוע הפחמן ומטבוליזם הסוכר בצמח . ; Kang et al., 2007;) (Lu,1997במחקרים שנעשו במעבדתינו נמצא כי ביטוי AtHXK1בצמחי עגבניה גורם להקטנת הטרנספירציה דרך ירידה במפתח ובמוליכות הפיוניות .כמו כן ,נמצא כי סוכרוז גורם לסגירת פיוניות מוגברת בצמחים המבטאים ביתר AtHXK1.באנליזת ביטוי שנעשתה על צמחים אלה נמצא כי ישנה עליה ברמות הביטוי של גנים המעורבים בביוסינתזה של , ABAהורמון הידוע כמבקר את מפתח הפיוניות (Assmann, 1993; Taiz ).and Zeiger, 1998 העובדה כי proAtHXK1::GUSמתבטא בפיוניות שבעלה ו proAtHXK2::GUS -ובפטוטרת )איור (13מחזקת את ההשערה לפיה ייתכן ורמות גבוהות של סוכרוז באפופלסט של הפיוניות גורמות לעליה בביטוי של הקסוקינאז בתוך תאי השמירה )ו\או בתאי המזופיל הסמוכים( המביאה להגברה במעבר הסיגנאל שגורם לעליה ברמות ה ABA -ולסגירת הפיוניות .מאנליזת ביטוי הפרומוטורים ,בתת רקמות 45 AtHXK1הינו מרכיב בשרשרת הבקרה על הולכת המים בצמח והעובדה כי הוא פעיל במטבוליזם סוכרי מעלה את האפשרות שהוא מהווה צומת בבקרת האינטגרציה בין טרנספירציה ופוטוסינתזה .לצד ביטוי הפרומוטורים בפיוניות ,ביטוי הפרומוטורים בתאים פוטוסינתטיים נוספים כדוגמת תאי מזופיל )איור (11מהווה רמז נוסף לתפקיד האנזימים AtHXK1, 2בבקרת תהליך הפוטוסינתזה .כמו כן ,באנליזת הרצף של ) proAtHXK2::GUSאיור (3 נמצא האלמנט TATTCTהמשויך למערכת – photosystemIIנוכחות אלמנט זה מהווה עדות נוספת המרמזת על תפקיד אפשרי של AtHXK2בבקרת המערכת הפוטוסינטתית. הדבקה פתוגנית - פתוגנזה של פתוגנים צמחיים רבים מתאפיינת בראש ובראשונה בחדירת הפתוגן דרך פתח הפיוניות ) . (Lee et al, 1999; Melotto et al, 2006נמצא כי טיב האינטרקציה שבין הפתוגן לפונדקאי הצמחי תלוי בתכולת המים וריכוז הסוכרים בעלה ולכן הורדת רמת הלחות והסוכר מעכבת את חדירת הפתוגן לצמח ושגשוגו .בכדי שהצמח ישרה ייבוש מכוון של העלה ויקטין את רמת הסוכרים בתאי המזופיל, נדרשת בקרה משותפת על פעילות המערכת הוסקולרית וקצב הדיות והפוטוסינתזה. מלבד , ABAישנם הורמונים נוספים כגון אוקסין וחומצה סליצילית המבקרים את סגירת הפיוניות - פעילות משולבת של הורמונים אלה )במיוחד SAו ( ABA -מבקרת את מפתח הפיוניות בתגובה לפתוגן ) ( Acharya 2009כאשר נבדקה השפעת ABAו SA -על ביטוי הפרומוטורים בנבטים טרנסגנים נמצא כי שני ההורמונים עיכבו בצורה מוחלטת את ביטוי proAtHXK1::GUSו- ) proAtHXK2::GUSאיור .(17תוצאה זו מרמזת כי קיים בקרה של הורמונים אלה על ביטוי AtHXK1,2ופעילות ההורמונים ממוקמת במורד פעילות . AtHXK1,2מאחר ונמצא כי פתוגנים שונים החודרים דרך הפיוניות עיכבו את ביטוי proAtHXK1::GUSו) proAtHXK2::GUS -איור (23 ניתן לשער כי עיכוב ביטוי AtHXK1ו AtHXK2 -על ידי הפתוגן מאפשר את חדירתו דרך הפיוניות בקלות .בנוסף ,עיכוב ביטוי AtHXK1ו AtHXK2 -מאפשר לפתוגן לאחר חדירתו להתבסס בתוך הרקמה באמצעות שיבוש בקרת מאזן ייצור הסוכר ורמת הלחות בעלה. 4.8דפוס ביטוי proAtHXK1ו proAtHXK2 -בעקת חום יובש מלמד על תפקידם בהתמודדות הצמח בפני עקה זו: עדות ראשונית לקשר שבין HXKsלעקת יובש ניתן למצוא מקיום האלמנט TAACTGברצף -proAtHXK2::GUSאלמנט זה מקושר לגנים המתבטאים ביובש ולכן מרמז על תפקיד אפשרי של האנזים AtHXK2בהתמודדות עם עקה זו .הסבר אפשרי לעליה בביטוי proAtHXK2::GUS בתרמילים כ 9 -ימים לאחר התחלת תקופת היובש )איור ( 21Bיכול לנבוע מהצטברות פחמימות מסיסות באברי מבלע המקנה לצמח אדפטציה טובה יותר בפני עקה זו . (Xue 2008) .כמו כן ,ירידה בביטוי הפרומוטורים בעלה לאורך תקופת היובש יכולה לנבוע מעליה בפעילות ההורמון ABAהידוע כהורמון 46 ) .( Outlaw 2003; Gaff, 1971ירידה בביטוי הפרומוטורים בעלים יכולה אף לנבוע מעיכוב תהליך הפוטוסיתזה ,עיכוב אופייני בעקות כגון יובש וחום .מאחר וידוע ,כי כתוצאה מירידת קצב הפוטוסינתזה הצמח פונה לניצול מאגרי סוכר הקיימים בגבעול ) (Blum, 1998ניתן לשער כי עליה בביטוי proAtHXK2::GUSבגבעול לאחר 14ימי יובש ,ועליה בביטוי שני הפרומוטורים בהיפוקוטיל כתוצאה מעקת חום )איור (19מרמזת כי לאנזימים AtHXK1ו AtHXK2 -יש תפקיד בניצול סוכרים אלה. 4.9ביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -באיברים שונים יכול לרמז על תפקיד AtHXK1,2בהובלת המים במעלה מערכת ההובלה: נשאלת השאלה כיצד חומרים המסונתזים בשורשים )כדוגמת ציטוקינין( מצליחים להתגבר על כוח הגרביטציה ולהתפשט במעלה הצמח R. Alloni (2005) .תיאר במאמרו כיצד ציטוקינין ,המסונתז בשורש )איבר בעל פוטנציאל מים גבוה( ,עולה במעלה הצמח בעזרת תנועת המים ומתפשט לאורך החלקים השונים .במהלך התפשטותו ,הציטוקינין מבקר תהליכים התפתחותיים שונים על ידי אינטראקציה עם הורמונים שונים כדוגמת אוקסין .בסופו של דבר הציטוקינין מצטבר באיברים אפיקלים בהם קצב הטרנספירציה גבוה ופוטנציאל המים נמוך .איברים אלה מספקים את הכוח המניע לתנועת עמוד המים במעלה הצמח .אפיון ואיתור האיברים התבצע על ידי אפיון האיזורים בהם מצטבר הציטוקינין )בסוף תהליך ההתפשטות( .לשם כך) proARR5 ,פרומוטור המשופעל על ידי ציטוקינין( אוחה לGUS - ) ( proARR5::GUSלשם יצירת צמחי ארבידופסיס טרנסגנים ,דפוס ביטויו הפרומוטור אופיין בדומה לאפיון דפוס ביטויו . proAtHXK1 ,2 ::GUSבין האברים שזוהו ככוח המניע של תנועת המים :פרחים בוגרים ,הידטות ,פיוניות וטריכומות .מאחר ודפוס ביטוי proARR5::GUSדמה במידה רבה לדפוס ביטוי , proAtHXK1 ,2 ::GUSייתכן ול AtHXK1 -ו AtHXK2 -יש חלק בבקרת הובלת המים בצמח ,בנוסף לתפקיד אפשרי בהתפתחות מערכת ההובלה. איור 31מתאר בצורה סכמטית את מנגנון הובלת הציטוקינין במעלה הצמח בעזרת האיברים שהוזכרו לעיל ובהם התבטאו - proAtHXK1 ,2 ::GUS איור - 31מסלול תנועת המומסים בצמח המתחיל בשורשים ומסתיים באיזורים בהם הדיות גבוה. זרימת מים * תהליכים התפתחותיים 47 4.10עליה בביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -בהשפעת ריכוז גבוה של אתילן מרמזת על התפקיד בקרתי של AtHXK1,2במסלול מעבר סיגנל ההורמון: עבודה שנעשתה על ידי Zhou et al, 1998הראתה כי במוטנטים הפגועים ביכולת חישת הסוכר דרך ( gin1) AtHXK1התרחשה ביוסינתזה קבועה של אתילן ומעבר סיגנל ההורמון היה קבוע .בנוסף, לאור העובדה כי מוטנטים שהראו חוסר רגישות לאתילן ) ( etr1הראו רגישות מוגברת לגלוקוז ,נטען כי קיים קשר אנטגוניסטי בין חישת סוכר דרך AtHXK1לבין חישת אתילן .מסלולי החישה תוארו במאמר כפי שמוצג באיור הבא- למרות פעילותם האנטגוניסטית של אתילן ו , AtHXK1 -נמצא כי ריכוז גבוה של אתילן ) (10 ppmהעלה את ביטוי הפרומוטורים )איור .(19לפיכך ,ייתכן ו- AtHXK1,2מהווים חלק ממסלול בקרה עצמי של האתילן כאשר ריכוזו בתא גבוה )מסומן בכחול(. איור -32אינטרקצית מסלולי חישת האתילן והסוכר. 4.11אנליזת ביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -בתגובה לעוצמות אור שונות מרמזת כי תגובת הצמח לאור המתווכת דרך AtHXK1אינה מבוקרת ברמת תרגום הגן: חשיבות AtHXK1בניצול האור להתפתחות תקינה של אברי הצמח )שורשים ,עלים ותפרחות( הוכחה בעבודתו של ) .Moore et al ( 2003בנוסף HXKs ,נקשרים לתהליכי הזדקנות בצמח ,תהליכים הנגרמים בחלקם בעקבות עוצמות אור גבוהות ) . (Diaz et al., 2005; Pourtau et al., 2006לפיכך, ביטוי הפרומוטורים נבדק בהשפעת עוצמות אור גבוהות )איור (16על מנת לבחון האם פעילות AtHXK1,2המבוקרת על ידי האור ,מבוקרת ברמת תרגום הגן או ברמת פעילות האנזים .מכיוון שביטוי הפרומוטורים לא השתנה בתגובה לעוצמות האור השונות ,ניתן להסיק כי תיווך תגובת הצמח לאור נעשית דרך פעילות האנזימים AtHXK1,2ולא דרך ביטוי . AtHXK1,2 48 4.12עיכוב ביטוי proAtHXK1::GUSו proAtHXK2::GUS -תחת השפעת עקות אביוטיות מרמז על תפקיד האנזימים בהתמודדות הצמח עם עקות אלה: מנגנון חישת הסוכר בצמח נקשר רבות כחלק מתגובת הצמח לתנאי סביבה שונים .לכן ,ביטוי הפרומוטורים נבדק תחת עקות ביוטיות ואביוטיות -עיכוב ביטויים בתגובה לעקה ביוטית )פתוגנים( ואביוטית )יובש( נידון כחלק ממנגנונים שונים בצמח .יחד עם זאת ,עיכוב ביטוי הפרומוטורים בתגובה לריכוז מלח גבוה ) - NaCl 200mMאיור ,(17עיכוב ביטויים בפסיג בתגובה לעקות חום וקור ) ,4º C ) (43º Cאיור (20מרמז כי ל AtHXK1,2 -יש תפקיד רחב ומורכב בתגובת הצמח לעקות אלה .על פי תוצאות אנליזת הפרומוטורים קשה לאפיין את המנגנון דרכו האנזימים AtHXK1,2מגיבים לעקות ביוטיות ,אך ייתכן כי מנגנון זה מתווך בחלקו דרך בקרה הורמונאלית של הורמוני עקה )לדוגמאABA - או .( SA רשימת ספרות: Acharya BR, Assmann SM. (2009). Hormone interactions in stomatal function. Plant Mol Biol.69. 451-62 Aloni, R., Tollier, MT., Monties, B. (1990). The role of auxin and gibberellin in Controlling Lignin Formation in Primary Phloem Fibers and in Xylem of Coleus blumei Stems. Plant Physiol. 94, 1743-1747. 49 Aloni, R . (1979). Role of auxin and gibberellin in differentiation of primary phloem fibers . Plant Physiol. 63:609-14. Aloni R. (2004) The induction of vascular tissue by auxin. In: Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action! PJ Davies (ed), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, Boston, London. pp 471-492 Aloni R, Langhans M, Aloni E, Dreieicher E, Ullrich CI. (2005). Root-synthesized cytokinin in Arabidopsis is distributed in the shoot by the transpiration stream. J Exp bot.56. 1535-44. Avonce, N., Leyman, B., Mascorro-Gallardo, JO., Van Dijck, P., Thevelein, JM., Iturriaga, G. (2007). The Arabidopsis trehalose-6-P synthase AtTPS1 gene is a regulator of glucose, abscisic acid, and stress signaling. Plant Physiol. 144, 3-5. Balasubramanian, R., Karve, A., Kandasamy, M., Meagher,RB., Moore, B. (2007). A role for F-actin in hexokinase-mediated glucose signaling. Plant Physiol. 145, 1423-34. Balibrea Lara, M.E., Gonzalez Garcia, M.C., Fatima, T., Ehness, R., Lee, T.K., Proels, R., Tanner, W., and Roitsch, T. (2004). Extracellular invertase is an essential component of cytokinin-mediated delay of senescence. Plant Cell 16, 1276-1287. Bernardo, SM., Gray, KA., Todd, RB., Cheetham, BF., Katz, ME. (2007). Characterization of regulatory non-catalytic hexokinases in Aspergillus nidulans. Mol Genet Genomics. 277, 519-32. Blum A. (1998). Improving wheat grain filling under stress by stem reserve mobilisation. Euphytica. 100, 77–83. Bowles, D., Keegstra, K., Raikhel, N. (2002). A multigene family of glycosyltransferases in a model plant, Arabidopsis thaliana. Biochem Soc Trans. 30, 301-6. Cárdenas, ML., Cornish-Bowden, A., Ureta, T. (1998). Evolution and regulatory role of the hexokinases. Biochim Biophys Acta. 1401, 242-64. Chen, JG. (2007). Sweet sensor, surprising partners. Sci STKE. 373, pe7 Cho, Y.H., Yoo, S.D., and Sheen, J. (2006). Regulatory functions of nuclear hexokinase1 complex in glucose signaling. Cell 127, 579-589. 50 Claeyssen, E., Wally, O., Matton, DP., Morse, D., Rivoal, J. (2006). Cloning, expression, purification, and properties of a putative plasma membrane hexokinase from Solanum chacoense. Protein Expr Purif. 47, 329-39. Contento, AL., Kim, SJ., Bassham, DC. (2004). Transcriptome profiling of the response of Arabidopsis suspension culture cells to Suc starvation. Plant Physiol. 135, 2330-47. Dai, N., Schaffer, A., Petreikov, M., Shahak, Y., Giller, Y., Ratner, K., Levine, A., and Granot, D. (1999). Overexpression of Arabidopsis hexokinase in tomato plants inhibits growth, reduces photosynthesis, and induces rapid senescence. Plant Cell 11, 1253-1266. da-Silva, W.S., Rezende, G.L., and Galina, A. (2001). Subcellular distribution and kinetic properties of cytosolic and non-cytosolic hexokinases in maize seedling roots: implications for hexose phosphorylation. J Exp Bot 52, 1191-1201. Dekkers, BJ., Schuurmans, JA., Smeekens, SC. (2008) Interaction between sugar and abscisic acid signalling during early seedling development in Arabidopsis. Plant Mol Biol. 67, 151-67. Diaz, C., Purdy, S., Christ, A., Morot-Gaudry, J.F., Wingler, A., and MasclauxDaubresse, C. (2005). Characterization of markers to determine the extent and variability of leaf senescence in Arabidopsis. A metabolic profiling approach. Plant Physiol 138, 898-908. Dry, I.B., Nash, D., and Wiskish, T.J. (1983). The mitochondrial localization of hexokinase in pea leaves. Planta 158, 152-156. Eastmond, P.J., van Dijken, A.J., Spielman, M., Kerr, A., Tissier, A.F., Dickinson, H.G., Jones, J.D., Smeekens, S.C., and Graham, I.A. (2002). Trehalose-6-phosphate synthase 1, which catalyses the first step in trehalose synthesis, is essential for Arabidopsis embryo maturation. Plant J 29, 225-235. Frommer, WB., Schulze, WX., Lalonde, S. (2003). Plant science. Hexokinase, Jack of-all-trades. Science. 300, 332-6. Fox, TC., Green, BJ., Kennedy, RA., Rumpho, ME. (1998). Changes in hexokinase activity in echinochloa phyllopogon and echinochloa crus-pavonis in response to abiotic stress. Plant Physiol. 118, 1403-9. 51 Giege, P., Heazlewood, J.L., Roessner-Tunali, U., Millar, A.H., Fernie, A.R., Leaver, C.J., and Sweetlove, L.J. (2003). Enzymes of glycolysis are functionally associated with the mitochondrion in Arabidopsis cells. Plant Cell 15, 2140-2151. Giegé, P., Sweetlove, LJ., Cognat, V., Leaver, CJ. (2005). Coordination of nuclear and mitochondrial genome expression during mitochondrial biogenesis in Arabidopsis. Plant Cell. 17, 1497-512. Hanson, R.W. (2000). Nutrient control of gene transcription. J Biol Chem 275, 30747. Hare, PD., Cress, WA., van Staden, J. (1998). Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant Cell Environ. 21, 54– 535. Herbers, K., Mönke, G., Badur, R., Sonnewald, U. (1995). A simplified procedure for the subtractive cDNA cloning of photoassimilate-responding genes: isolation of cDNAs encoding a new class of pathogenesis-related proteins. Plant Mol Biol. 29, 1027-38. Heyer, AG., Raap, M., Schroeer, B., Marty, B., Willmitzer, L. (2004). Cell wall invertase expression at the apical meristem alters floral, architectural, and reproductive traits in Arabidopsis thaliana. Plant J. 39, 161-9. Hoeberichts, FA., van Doorn, WG., Vorst, O., Hall, RD., van Wordragen,. MF. (2007). Sucrose prevents up-regulation of senescence-associated genes in carnation petals. J Exp Bot. 58, 2873-85. Jang, J.C., and Sheen, J. (1994). Sugar sensing in higher plants. Plant Cell 6, 16651679. Jang, J.C., and Sheen, J. (1997). Sugar sensing in higher plants. Trends Plant Sci 2, 208-214. Jang, J.-C., Leon, P., Zhou, L., and Sheen, J. (1997). Hexokinase as a sugar sensor in higher plants. Plant Cell 9, 5-19. Jeffery, CJ. (2004). Molecular mechanisms for multitasking: recent crystal structures of moonlighting proteins. Curr Opin Struct Biol. 14, 663-8. Ju, HW., Koh, EJ., Kim, SH., Kim, KI., Lee, H., Hong, SW. (2009). Glucosamine causes overproduction of reactive oxygen species, leading to repression of hypocotyl elongation through a hexokinase-mediated mechanism in Arabidopsis. J Plant Physiol. 166, 203-12. 52 Kandel-Kfir, M., Damari-Weissler, H., German, M.A., Gidoni, D., Mett, A., Belausov, E., Petreikov, M., Adir, N., and Granot, D. (2006). Two newly identified membrane-associated and plastidic tomato HXKs: characteristics, predicted structure and intracellular localization. Planta 224, 1341-1352. Kang, J., Dengler, N. (2002). Cell cycling frequency and expression of the homeobox gene ATHB-8 during leaf vein development in Arabidopsis. Planta. 216, 212-9.Kang Y, Outlaw WH Jr, Fiore GB, Riddle KA. (2007). Guard cell apoplastic photosynthate accumulation corresponds to a phloem-loading mechanism. J Exp Bot. 58, 4061-70 Kaplinsky NJ. (2009). Temperature compensation of auxin dependent developmental patterning. Plant Signal Behav. 12, Epub, ahead of print. Karrer, EE., Rodriguez, RL. (1992). Metabolic regulation of rice alpha-amylase and sucrose synthase genes in planta. Plant J. 4, 517-23. Karve, A., Rauh, BL., Xia, X., Kandasamy, M., Meagher, RB., Sheen, J., Moore, BD. (2008). Expression and evolutionary features of the hexokinase gene family in Arabidopsis. Planta. 228, 411-25. Kim, M., Lim, JH., Ahn, CS., Park, K., Kim, GT., Kim, WT., Pai, HS. (2006). Mitochondria-associated hexokinases play a role in the control of programmed cell death in Nicotiana benthamiana. Plant Cell. 18, 2341-55. Kim, S., Kang, JY., Cho, DI., Park, JH., Kim, SY. (2005). ABF2, an ABREbinding bZIP factor, is an essential component of glucose signaling and its overexpression affects multiple stress tolerance. Plant J. 43, 467. Karen L. Klotz, Fernando L. Fingerb and Marc D. Andersonc. (2005). Wounding increases glycolytic but not soluble sucrolytic activities in stored sugarbeet root. Posth Biol and Technol. 41, 48-55Knight, JS., Gray, JC. (1994). Expression of genes encoding the tobacco chloroplast phosphate translocator is not lightregulated and is repressed by sucrose. Mol Gen Genet. 242, 586-94. Kuser, PR., Krauchenco, S., Antunes, OA., Polikarpov, I. (2000). The high resolution crystal structure of yeast hexokinase PII with the correct primary sequence provides new insights into its mechanism of action. J Biol Chem. 276, :20803. Krapp, A., Hofmann, B., Schafer, C., and Stitt, M. (1993). Regulation of the expression of rbcS and other photosynthetic genes by carbohydrates: a mechanism for the 'sink regulation' of photosynthesis. Plant J 3, 817-828. 53 Lara, ME., Garcia, MC., Fatima, T., Ehness, R., Lee, TK., Proels, R., Tanner, W., Roitsch, T. ( 2004). Extracellular invertase is an essential component of cytokinin-mediated delay of senescence. Plant Cell. 16, 1276-87. Mattsson, J., Ckurshumova, W., Berleth, T. (2003). Auxin signaling in Arabidopsis leaf vascular development. Plant Physiol. 131, 1327-39. Mishra, BS., Singh, M., Aggrawal, P., Laxmi, A. (2009). Glucose and auxin signaling interaction in controlling Arabidopsis thaliana seedlings root growth and development. PLoS One. 4, Epub. Mita, S., Suzuki-Fujii, K., Nakamura, K. (1995). Sugar-inducible expression of a gene for beta-amylase in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 107, 895-904. Moore, B., Zhou, L., Rolland, F., Hall, Q., Cheng, W.H., Liu, Y.X., Hwang, I., Jones, T., and Sheen, J. (2003). Role of the Arabidopsis glucose sensor HXK1 in nutrient, light, and hormonal signaling. Science 300, 332-336. Newgard, C.B., and McGarry, J.D. (1995). Metabolic coupling factors in pancreatic beta-cell signal transduction. Annu Rev Biochem 64, 689-719. Neuhaus, HE., Emes, MJ. (2000). Nonphotosynthetic metabolism in plastids. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 51, 111-140. Noh, SY and Amansino, MR. (1999). Identification of a promoter region responsible for the senescence-specific expression of SAG12. Plant Mol Biol. 41, 181- 194. Nooden, L.D., Guiamet, J.J., and John, I. (1997). Senescence mechanisms. Physiol Plantarum 101, 746 –753. Pacini, E. (1996). Types and meaning of pollen carbohydrate reserves. Sex. Plant Reprod. 9, 362-366. Pego, J.V., Weisbeek, P.J., and Smeekens, S.C. (1999). Mannose inhibits Arabidopsis germination via a hexokinase-mediated step. Plant Physiol 119, 10171023. Pourtau, N., Jennings, R., Pelzer, E., Pallas, J., and Wingler, A. (2006). Effect of sugar-induced senescence on gene expression and implications for the regulation of senescence in Arabidopsis. Planta 224, 556-568. Price, J., Laxmi, A., St Martin, S.K., and Jang, J.C. (2004). Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. Plant Cell 16, 2128-2150. 54 Reynolds, SJ., Smith, SM. (1995). Regulation of expression of the cucumber isocitrate lyase gene in cotyledons upon seed germination and by sucrose. Plant Mol Biol. 29, 885-96. Roitsch, T. (1999). Source-sink regulation by sugar and stress. Curr Opin Plant Biol. 2, 198-206. Roitsch, T., González, MC. (2004). Function and regulation of plant invertases: sweet sensations. Trends Plant Sci. 9, 606-13. Roldán, M., Gómez-Mena, C., Ruiz-García, L., Salinas, J., Martínez-Zapater, JM. (1999). Sucrose availability on the aerial part of the plant promotes morphogenesis and flowering of Arabidopsis in the dark. Plant J. 5, 581-90. Rolland, F., Baena-Gonzalez, E., and Sheen, J. (2006). Sugar sensing and signaling in plants: Conserved and novel mechanisms. Annu Rev Plant Biol 57, 675-709. Rolland, F., Wanke, V., Cauwenberg, L., Ma, P., Boles, E., Vanoni, M., de Winde, J.H., Thevelein, J.M., and Winderickx, J. (2001). The role of hexose transport and phosphorylation in cAMP signalling in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res 1, 33-45. Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, JM. (2002). Glucose-sensing and signalling mechanisms in yeast. FEMS Yeast Res. 2, 183-201. Ronne, H. (1995). Glucose repression in fungi. Trends Genet 11, 12-17. Sarowar, S., Lee, JY., Ahn, ER., Pai, HS. (2008). A Role of hexokinases in plant resistance to oxidative stress and pathogen infection. Journal of Plant Biology. 51, 341-346. Rook, F., Hadingham, SA., Li, Y., Bevan, MW. (2006). Sugar and ABA response pathways and the control of gene expression. Plant Cell Environ. 29, 426-34. Saier, M.H., Jr., Chauvaux, S., Deutscher, J., Reizer, J., and Ye, J.J. (1995). Protein phosphorylation and regulation of carbon metabolism in gram- negative versus gram-positive bacteria. Trends Biochem Sci 20, 267-271. Salzman, RA., Tikhonova, I., Bordelon, BP., Hasegawa, PM., Bressan, RA. (1998). Coordinate accumulation of antifungal proteins and hexoses constitutes a developmentally controlled defense response during fruit ripening in grape. Plant Physiol. 117, 465-72. Sarowar ,S., Kim, YJ., Kim, KD., Hwang, BK., Ok, SH., Shin, JS. (2009). Overexpression of lipid transfer protein (LTP) genes enhances resistance to plant 55 pathogens and LTP functions in long-distance systemic signaling in tobacco. Plant Cell Rep. 28, 419-27. Schluepmann, H., Pellny, T., van Dijken, A., Smeekens, S., Paul, M. (2003). Trehalose 6-phosphate is indispensable for carbohydrate utilization and growth in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 6849-54. Schluepmann, H., van Dijken, A., Aghdasi, M., Wobbes, B., Paul, M., Smeekens, S. (2004). Trehalose mediated growth inhibition of Arabidopsis seedlings is due to trehalose-6-phosphate accumulation. Plant Physiol. 135, 879-90. Sheen, J. (1990). Metabolic repression of transcription in higher plants. Plant Cell 2, 1027-1038. Smeekens, S. (2000). Sugar-induced signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol 51, 49-81. Stanley, R. (1971). Pollen chemistry and tube growth. Heslop- Harrison J., ed. Pollen: development and phsiology. London: Butterworths, 131-155. Stulke, J., and Hillen, W. (1999). Carbon catabolite repression in bacteria. Curr Opin Microbiol 2, 195-201. Sturm, A., Chrispeels, MJ. (1990). cDNA cloning of carrot extracellular betafructosidase and its expression in response to wounding and bacterial infection. Plant Cell. 2, 1107-19. Thomashow, MF. (1999). Plant cold acclimation: Freezing tolerance genes and Regulatory Mechanisms. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 50, 571-599. Toufighi, K., Brady, SM., Austin, R., Ly, E., Provart, NJ. (2005). The botany array Resource: e-Northerns, expression angling, and promoter analyses. Plant J. 43,153-63. van Dijken, AJ., Schluepmann, H., Smeekens, SC. (2004). Arabidopsis trehalose-6phosphate synthase 1 is essential for normal vegetative growth and transition to flowering. Plant Physiol 135, 969-77. Wanner, LA., Junttila, O. (1999). Cold-induced freezing tolerance in Arabidopsis. Plant Physiol. 120, 391-400. Weber, H., Borisjuk, L., and Wobus, U. (2005). Molecular physiology of legume seed development. Annu Rev Plant Biol 56, 253-279. 56 Wingler, A., Fritzius, T., Wiemken, A., Boller, T., Aeschbacher, RA. (2000). Trehalose induces the ADP-glucose pyrophosphorylase gene, ApL3, and starch synthesis in Arabidopsis. Plant Physiol. 124, 105-14. Xiao, W., Sheen, J., and Jang, J.C. (2000). The role of hexokinase in plant sugar signal transduction and growth and development. Plant Mol Biol 44, 451-461. Yamamoto, Y.T., Prata, R.T.N., Williamson, J.D., Weddington, M., and Pharr, D.M. (2000). Formation of a hexokinase complex is associated with changes in energy utilization in celery organs and cells. Physiol Plantarum 110, 28-37. Zhou, L., Jang, J.C., Jones, T.L., and Sheen, J. (1998). Glucose and ethylene signal transduction crosstalk revealed by an Arabidopsis glucose-insensitive mutant. P Natl Acad Sci USA 95, 10294-10299. 57 Abstract: Sugars are not only essential metabolic nutrients and structural components; they also serve as major regulators of many processes throughout the life cycle of the plant. The mechanisms by which higher plants recognize and respond to sugars are largely unknown. Mitochondria-associated hexokinases (mtHXKs) catalyze hexose phosphorylation and regulate a wide range of biochemical and developmental pathways such as photosynthesis, growth and hormonal response. Arabidopsis plants have two mtHXKs- AtHXK1 and AtHXK2. Previous studies that were conducted in Arabidopsis and tomato plants have revealed AtHXK1 and AtHXK2 as key regulators in sugar signaling in Arabidopsis and in tomato plants. However, the specific tissues and conditions under which AtHXK1 and AtHXK2 regulation takes place are not yet known. To determine in which tissues and under which conditions each one is expressed, we isolated the promoters of both AtHXK1 and AtHXK2 and followed their expression in Arabidopsis plants using GUS as a reporter gene. Our results indicate that both genes are expressed in most tissues emerging seedlings, but their expression is confined later on to specific tissues. In mature plants both promoters are expressed in vascular tissues of specific organs and in auxin producing organs such as hydathodes, trichome, stigma and stipules, indicating a link between auxin, HXK and vascular development. Moreover, expression of the promoters' in photosynthetic cells, such as mesophyl and gaurd cells implicate a possible role of AtHXK1 and AtHXK2 in photosyntesis regulation. Interestingly, while sugar sensing by AtHXKs is mediated by several hormones, both sugars (glucose, sucrose) and hormones (absicic acid, salycilic acid, gibrellin) added extraneously inhibit expression of AtHXK1 and AtHXK2 genes, suggesting that sugar sensing involves feedback inhibition. These results indicate that the two Arabidopsis mtHXKs not only mediate sugar sensing by regulating expression of other genes, but are themselves regulated in that context. Lastly, both AtHXK1 and AtHXK2 expression are regulated by abiotic stress (drought, salt, wounding, heat and cold shock), biotic pathogens infections (Pseudomonas syringae, Salmenella 58 typhimurium and Erwinia carotovora) and stress hormones (absicic acid, salycilic acid). These results implicates that mtHXKs also serves as a major protectant against environmental stresses. 59
© Copyright 2024