פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
הפקולטה למתמטיקה ולמדעי הטבע
קרית אדמונד י' ספרא
המכון לכימיה ומרכז פרקש לתהליכים מושרי – אור
פענוח אבולוציית המצב המעורר
בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
עבודת גמר לתואר מוסמך במדעי הטבע
מגיש :פבל קום
בהנחיית פרופ' סנפורד רוכמן
יולי 2011
תקציר.
דינמיקה מושרית אור ראשונית של משאבת כלורידים הלורודופסין אשר מיוצרת על ידי ארכיאובקטריון
) Natronomonas pharaonis (pHRנחקרה באמצעות ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה .הסכמה הניסיונית
כללה שלושה פולסים pump :נראה dump ,אינפרה – אדום ו – probeהיפר – ספקטרלי .אמדן יעילות
הריקון של המצב הפלואורסצנטי של החלבון על ידי פולס dumpמתקבל ממעקב אחר השינויים הנגרמים על
ידו לעצמת הבליעה והפליטה של מצב זה ,כפונקציה של ההשהיה בינו לבין ה – .pumpמעקב אחר הפחתת
אוכלוסיית מעגל האור של הפיגמנט ,הבאה בעקבות ריקון המצב המעורר ,נעשה על ידי מדידת ספקטרום הפרש
בליעה המשויך לתוצר Kבמעגל האור של הלורודופסין.
תוצאות הניסוי מראות כי חתך הפעולה לפליטה מאולצת כמעת קבוע לאורך החיים של המצב
הפלואורסצנטי .תוצאת הדגימה של המצב Kמצביעה על כך שהנחתת האוכלוסיה המעוררת על ידי ה – dump
גורמת לירידה פרופורציונית בתפוקת מעגל האור של הפיגמנט.
המסקנה המתבקשת היא כי על אף היותה של קינטיקת ההיפוך הפנימי של המצב המעורר של pHRלא
אקספוננציאלית ,מצב זה מורכב מאוכלוסיה מעוררת אחת ויחידה .מסקנתנו זו עומדת בניגוד לפרדיגמה אשר
התגבשה במהלך חקר אירועים מושרי אור ראשוניים של משאבת כלורידים דומה ,אשר מקורה באורגניזם אחר,
הלורודופסין של ) .Halobacterium salinarum (sHRלפיה ,תוצר Kשל sHRנוצר מתת – אוכלוסיה
נפרדת ,ראקטיבית ,קצרת חיים של המצב המעורר .הגילויים שלנו בנוגע לדינמיקת ההיפוך הפנימי ב – pHR
נדונים לאור השארה אשר הועלתה לאחרונה כי דינמיקת ההיפוך הפנימי של המצב המעורר בשתי המשאבות
היינה זהה.
Abstract.
The primary photochemical dynamics of Hb. pharaonis Halorhodopsin (pHR) are
investigated by femtosecond visible pump near IR dump hyperspectral probe spectroscopy.
The efficiency of excited state depletion is deduced from transient changes in absorption,
recorded with and without stimulated emission pumping (SEP), as a function of the dump
delay. The concomitant reduction of photocycle population is assessed by probing the “K”
intermediate difference spectrum.
Results show that the cross section for stimulating emission is nearly constant
throughout the fluorescent state lifetime. Probing “K” demonstrates that dumping produces a
proportionate reduction in photocycle yields. We conclude that, despite its nonexponential
internal conversion (IC) kinetics, the fluorescent state in pHR constitutes a single intermediate
in the photocycle. This contrasts with conclusions drawn from the study of primary events in
the related chloride pump from Hb. Salinarum (sHR), believed to produce the “K”
intermediate from a distinct short-lived subpopulation in the excited state. Our discoveries
concerning internal conversion dynamics in pHR are discussed in light of recent expectations
for similar excited state dynamics in both proteins.
תודות.
ברצוני להודות לפרופ' סנפורד רוכמן על ההנחיה המסורה ,הסו בלנות ,והכי חשוב על האפשרות אשר
ניתנה לי להתנסות בתחום מחקר מרתק תוך כדי הפעלת ציוד עדכני ביותר.
לחברי הקבוצה :בוריס ,מירב ,אמיר ,איתי ,אשרת ,ג'ינגי .תודה לכם על הרעיונות ,ההסברים והתמיכה
שלכם ,וכמובן על ההוי המיוחד של קבוצתנו.
למרסלו פרידמן ולאדוארד מסטוב .אני מודה לכם על תמיכתכם הטכנית ופתרונותיכם המקוריים.
למשפחתי ולחברה שלי אירית .תודה לכם על סבלנותכם ,תמיכתם ועל זה שהאמנתם בי.
תוכן העניינים.
מבוא1.......................................................................................................................................
רודופסינים ארכיאליים1...................................................................................................
מקרה מייצג :הרודופסינים של 2.....................................… Halobacterium salinarum
חלבון ה – . pHRמבנה ותפקוד8.....................................................................................
תהליכים ראשוניים בחלבונים רטינליים ארכיאליים וב – 15..................................... RPSB
ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה של הלורודופסין .תוצאות מחקרים קודמים25.......................
מטרות המחקר ובחירת שיטה ניסיונית36...........................................................................
שיטות העבודה והמערכת הניסיונית40...........................................................................................
ספקטרוסקופיית בליעה מופרדת זמן בשיטת 40....................................… pump – probe
גילוי דינמיקה ויברציונית באמצעות ספקטרוסקופיה אלקטרונית אולטרה מהירה42.................
מערכת לייזר מתוצרת עצמית ליצירת פולסי אור אולטרה קצרים44.......................................
המרת אור50...................................................................................................................
מערך ניסיוני54...............................................................................................................
עיבוד נתונים56...............................................................................................................
תוצאות60..................................................................................................................................
ספקטרה בליעה טרנזיינטיים של 60........................................................................ pHR
תוצאות ניסוי 62.................................................................................................... SEP
דיון בתוצאות .א .צורת הטרנזיינטים בזמני השהיה מוקדמים65............................................
ב .מבנה פס הפליטה המאולצת66.....................................................................................
ג .דינמיקה ספקטרלית בזמני השהיה מוקדמים67................................................................
ד .מודולציות פס הפליטה המאולצת68..............................................................................
ה .דיון בהבדלי התנהגות של יחס הטרנזיינטים בבליעה ובפליטה בתוצאות ניסוי 69..… SEP
ו .תובנות מניסוי 71...........................................................................................… SEP
סיכום73........................................................................................................................
ביבליוגרפיה75...........................................................................................................................
מבוא
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
רודופסינים ארכיאליים.
מחקרנו עוסק בתהליכים מושרי אור ,ראשוניים בחלבון רטינלי ארכיאלי .חלבונים אלה מהווים מנגנון
הישרדות הכרחי של אורגניזמים המאכלסים גומחות אקולוגיות אשר מאופיינות על ידי תנאים קיצוניים .1מאז
גילויים בשנות השבעים של המאה הקודמת ועד היום ,הם זוכים להתעניינות ערה מצד חוקרים מתחומים שונים
של מדעי הטבע .עדות לכך היא פרסומם של אלפי מאמרים בהם מוזכר רק אחד מהם ,בקטריורודופסין ,מקרה
מייצג של משפחת חלבונים רטינליים ארכיאליים .לדעתנו ,קריאה של כל אחד מהמאמרים עליו הופכת למעניינת
יותר אם הקורא מצויד בידע בסיסי מוקדם בתחום ,קורא כזה יוכל להצביע על תרומתה של עבודה מסוימת
למכלול הידע שלנו על בקטריורודופסין וחלבונים רטינליים בכלל .אנו מאמינים כי עבודתנו נמנית עם התורמות
יותר ,אך על מנת לאפשר לקורא לגבש דעה משלו ,ננסה לספק רקע ביולוגי וספקטרוסקופי רחב ככל הניתן
במסגרת תזה זו אודות חלבונים מעניינים אלה .לאחר מכן ,נדון בתהליכים מושרי אור בפיגמנט בו מיקדנו את
מחקרינו ונציג את המטרות שלו.
פיגמנטים המשתייכים למשפחת
החלבונים הרטינליים עושים שימוש
במולקולת הרטינל בתור כרומופור לצורך
קליטת אור השמש המהווה את מקור
איור :1רטינל בקונפיגורציית all – transבהלורודופסין המצוי
לפעילותם
האנרגיה
הפוטוכימית .בארכיאון .Halobacterium salinarumניתן לראות את קישור
בסיס שיף ) (Schiff base linkageלליזין 242של חלבון זה.
"רודופסינים" או לפעמים "אופסינים" ,הם
שמות נפוצים נוספים של משפחת חלבונים זאת ,הם קרויים כך על שם פיגמנט הרודופסין ,המשמש קולטן עצבי
רגיש לאור המצוי בתאי קנים ברשתית העין של בעלי חיים .משותף לכל הרודופסינים הוא מבנה של כלוב הנוצר
על ידי שבעה סלילי αהטבולים בקרום התא .הרטינל )איור (1הקשור קוולנטית לחלבון ממוקם בחלל הפנימי
של כלוב זה .הקישור נעשה באמצעות יצירת בסיס שיף ) (Schiff baseבין הכרומופור לבין שייר אמיני של
ליזין בסליל ) Gמקובל למספר את הסלילים של הרודופסינים על ידי אותיות לטיניות מ – Aעד .2(G
חלבונים רטינליים מתחלקים לשתי תת משפחות .החלוקה נעשית על סמך שיוך האורגניזם המייצר
אותם לעל ממלכה של העולם החי ונתמכת על ידי אנליזת הרצפים הראשוניים שלהם .הרודופסינים הארכיאליים
מרכיבים את תת המשפחה הראשונה .אלה התגלו לראשונה בארכיאון )יצורים חד תאיים קדומים אלה ידועים גם
בשם ארכיאובקטריה ,נשתמש בשני השמות לסירוגין( הלופילי ,Halobacterium salinarumאורגניזם
המשגשג בסביבה דלת חמצן במעיינות מלוחים .רודופסינים ארכיאליים מתפקדים כ :א( משאבות יונים ממונעות
על ידי אור ,דוגמאות בולטות :משאבת פרוטונים בקטריורודופסין ומשאבת יוני כלור הלורודופסין של
,Halobacterium salinarumב( קולטנים רגישים לאור :למשל סנסורי רודופסינים Iו – IIשל אותו
האורגניזם .קולטנים רגישים לאור בעיניים של בעלי חיים עילאיים )רודופסינים עילאיים או פשוט פיגמנטי
הראייה( משתייכים לתת המשפחה השנייה של החלבונים הרטינליים.3
הרודופסינים הארכיאליים שונים מהעילאיים ,למשל על אף היות הפעילות הפיזיולוגית של הפיגמנטים
משתי הקבוצות מבוססת על פוטואיזומריזציה של הכרומופור ,הקונפיגורציות ההתחלתיות והסופיות של
הרטינל שונות בשתי תת משפחות .ברודופסינים ארכיאליים האיזומריזציה מתרחשת סביב הקשר C13=C14
1
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :2פו טואיזומריזציה של הכרומופור ברודופסינים ארכיאליים )שמאל( ובפיגמנטי
הראייה )ימין(.
והשינוי הוא מ – all – transל – 13−cisובעילאיים המצב ההתחלתי הוא 11−cisוהסופי all – trans
)איור . 4(2בעוד שהדמיון בין חלבונים השייכים לתת משפחה מסוימת הוא מובהק ביותר כאשר בוחנים את
המבנים השלישוניים ,השוני בין רודופסינים ארכיאליים לפיגמנטי הראייה נראה כבר ברמת הסידור של שבעת
סלילי , αכלומר עבור החלבונים הנ"ל פילוגנטיקה היא הגורם העיקרי המכתיב את המבנה שלהם .לאור
העובדה שהחלבון הנחקר על ידינו ,הלורודופסין שמקורו בארכיאון ) Natronomonas pharaonisמכאן
והלאה ייקרא ,(pHRמשתייך למשפחת הרודופסינים הארכיאליים ונוכח הדמיון המועט בינם לבין הרודופסינים
העילאיים לא נרחיב דיבור על האחרונים.
מקרה מייצג :הרודופסינים של .Halobacterium salinarum
ארבעה רודופסינים נמצאו ב – :Halobacterium salinarumבקטריורודופסין ,הלורודופסין
וסנסורי רודופסינים Iו – ) IIאיור . 5(3נכון לעכשיו ,ארבעת החלבונים האלה הם הנציגים הנחקרים ביותר של
משפחת הרודופסינים הארכיאליים .ארכיאה הלופיליים אחרים מייצרים אחד או יותר הומולוגים של ארבעתם.
גילוי של בקטריורודופסין ) ,( BRמשאבת פרוטונים טראנס – ממברנלית של הארכיאון המוזכר לעיל
על ידי D. Oesterheltו – W. Stoeckeniusב – 1971היווה צעד חשוב בהבנת אסטרטגיית הישרדות של
יצור חד תאי זה בתנאי סביבה היפוקסיים ,המגבילים את יכולתו להפיק אנרגיה בנשימה .מפל ריכוזים
אלקטרוכימי של פרוטונים הנופל על הממברנה התאית של הארכיאון ,אשר דרוש ליצירת ,ATPמושג במצב
של חוסר חמצן באמצעות שאיבה של H+על ידי בקטריורודופסין מהציטופלזמה אל מחוץ לתא .אור השמש,
אשר מנוצל ביעילות רבה על ידי החלבון ,מהווה את מקור האנרגיה עבור השאיבה של הפרוטונים נגד מפל
הריכוזים שלהם ועבור יצירת ATPהמתאפשרת בעקבות זאת.7,6
משאבת יונים שנייה ,המופעלת באמצעות אור ,על פני הקרום של Halobacterium salinarumהיא
משאבת כלורידים הלורודופסין ) . 8(sHRחלבון זה התגלה במהלך חקר זן מהונדס גנטית של הארכיאובקטריון
הנ"ל ,אשר אין לו יכולת לייצר את הבקטריורודופסין .קיטוב מושרה אור ,לא צפוי ,של הממברנה שלו הוליך את
החוקרים למסקנה ש – Halobacterium salinarumמייצר משאבת יונים טראנס ממברנלית נוספת .בהתחלה
2
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :3ארבעת הרודופסינים של Halobacterium salinarumמשמאל לימין:
בקטריורודופסין ,הלורודופסין ,סנסורי רודופסינים Iו – .IIכיוון השאיבה של משאבות
היונים מוצג על ידי החצים .סנסורי רודופסינים נראים כאן עם הרכיבים השונים בשרשרת
יצירת הסיגנל .הצבעים המוצגים של הפיגמנטים הם בקירוב הצבעים האמתיים שלהם.
ייחסו למשאבה החדשה את פעולת שאיבת יוני הנתרן מפנים התא החוצה ,בניסיון להסביר את מפל ריכוזים של
Na+שייצרו תאי זן זה באור , 9אך מאוחר יותר הבינו כי המשאבה מעבירה יוני כלור מחוץ לתא פנימה ומפל
ריכוזים של יוני הנתרן הוא תוצאה משנית של פעולה זו .עקב כך ,ניתן למשאבת יונים החדשה השם
הלורודופסין.5
אם גילוי והבנת התפקיד של בקטריורודופסין שפכו אור על דרך התמודדות של הלוארכיאה עם ריכוזים
נמוכים של חמצן ,הרי שמתן התיאור של הפעולה המבוצעת על ידי ההלורודופסין תורם להבנתנו של תופעת
השגשוג של אורגניזמים חד תאיים אלה בתמיסות מלח מרוכזות .על מנת לתת מענה ללחץ אוסמוטי המופעל על
ידי הסביבה ,הלוארכיאה פיתחו מנגנון לוויסותו המבוסס על מעבר יונים פעיל דרך הממברנה ,עד להשוואת
ריכוז המומס ים בתוך התא לזה החיצוני .קטיונים המצויים בסביבה המידית של התאים יחדרו את הממברנה עכב
היווצרות )על ידי פעולת השאיבה של בקטריורודופסין( של מפל ריכוזים של פרוטונים ,יוני אשלגן הידועים
כבעלי כושר חדירה גבוה של הממברנה ,יהוו חלק ניכר מהם .לעומת זאת ,יוני הכלור צריכים להיות מועברים
כנגד אותו הפוטנציאל הנוצר על ידי מעבר הפרוטונים ,לכן ברור כי קיים צורך פיזיולוגי במשאבה אשר תכניסם
לתוך התאים.5
סנסורי רודופסינים הם קולטנים המווסתים תנועה של התא לפי גרדיינט עוצמת אור ומהווים רק חלק
מקומפלקס האיתות שלו שכולל גם חלבונים נוספים Htr I :ו – ) Htr IIאיור .(3קומפלקס זה מפעיל באמצעות
יצירת מפל פוספורילציה את מנגנון התנועה של הארכיאון המבוסס על שוטונים SR I .הוא קולטן המניע את
התא בכוון אור כתום אשר מהווה מקור אנרגיה לשתי המשאבות הטראנס – ממברנליות שלו ,בנוסף ,חלבון זה
מסוגל לייצר דחייה חזקה כלפי אזורים מוארים באור אולטרה סגול קרוב ,המסוכנים לתאים אלה .להבדיל
מבקטריורודופסין ,הלורודופסין ו – SR Iהמיוצרים בתנאים סמי – אנאירוביים ,הפיגמנט SR IIגורם לתגובת
3
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
דחייה כלפי אור כחול בתנאים בהם יש שפע של
חמצן וקיימת סכנה ממשית של נזקים פוטו –
אוקסידטיביים.11,10
לארבעת הפיגמנטים הממברנליים של
H.salinarumיש את אותו כרומופור ,אך בהתאם
לתפקידיהם הפיזיולוגיים ,ספקטרה הבליעה שלהם
במצב יסוד משתנים מאחד לשני :שיא הבליעה של
בקטריורודופסין הוא ב – , 568nmשל
הלורודופסין ב – ,578nmעבור SR Iמקסימום
של ספקטרום הבליעה נמצא ב – 587nmועבור
סנסורי רודופסין IIב – ) 487nmאיור . (4באיור 3
נעשה ניסיון להמחיש את הצבעים האמתיים של
איור :4ספקטרה בליעה של הרודופסינים של H.salinarum
הפיגמנטים .אם נמדוד את ספקטרום הבליעה של
ושל RPSBבמתנול ובפאזה גזית ,במצב יסוד.
הכרומופור המנותק מהחלבון ,ליתר דיוק ,את הספקטרום של RPSB – Retinal Protonated Schiff Base
בסיס שיף של רטינל שעבר פרוטונציה )מולקולה זו משמשת מודל פשוט לחקר השפעת החלבון על דינמיקת
האיזומריזציה של הכרומופור( נגלה כי שיא הבליעה של המולקולה הנ"ל בפאזה גזית הוא ב – .610nm
קישור הכרומופור לחלבון תמיד יגרום להסט ספקטרום הבליעה שלו לכחול ביחס לספקטרום זה בפאזה
הגזית )איור .(4הסט זה נקרא opsin shiftומידתו משתנה מפיגמנט לפיגמנט ,מה שמשקף את היכולת של
האופסין לשלוט בספקטרום הבליעה של הכרומופור שלו ולהתאים אותו לתפקידו הפיזיולוגי .המנגנון העיקרי
באמצעותו נעשה כוונון ספקטרום הבליעה של הכרומופור על ידי חלבון האב הוא שינוי המרחק בין הפרוטון של
בסיס שיף לבין אניון הנגדי שלו .האניון הזה הוא יון הכלור בהלורודופסין וחומצה אמינית טעונה שלילית
באופסינים האחרים של ,H.salinarumבמקרה של בקטריורודופסין זוהי חומצה אספרטית Asp85בסליל
.12Cנציין כי RPSBבמתנול בולע בכחול ב – . 13450nmייצוב מצב היסוד של הכרומופור בתמיסה על ידי
הימצאות של האניון הנגדי במרחק אופטימלי מהפרוטון מעלה בהרבה את האנרגיה הנדרשת לעירור .אי לכך,
מידת ייצוב מצב היסוד של הכרומופור על ידי חלבון האב שלו תשפיע באופן משמעותי על מידת ה – opsin
.14shift
ארבעת האופסינים של H.salinarumמבצעים משימות שונות עבור התא .לפיכך ,ניתן היה לצפות
לשוני מהותי במבנה שלהם ,לפחות באזור האתרים הפעילים .מה הסיכוי לדמיון בין האתרים הפעילים של
משאבת פרוטונים בקטריורודופסין המכוונת כלפי חוץ ומשאבת יוני כלור נפחיים הלורודופסין ,אשר מכוונת
כלפי פנים? מסתבר כי מספיק להחליף את Asp85של בקטריורודופסין בחומצה אמינית בעלת שייר שלא נושא
מטען שלילי על מנת להפוך משאבת פרוטונים זו למשאבת כלורידים מוכוונת פנימה .15המרת פונקציונליות
שכזו בין הרודופסינים של H. salinarumהודגמה על ידי כמה ניסויים :בתנאים של pHחומצי
בקטריורודופסין שואב יוני כלור . 16מספר מוטציות נקודתיות מחליפות את הפונקציה של SR Iלזו של ,17SR II
כמו כן ניתן להפוך סנסורי רודופסין זה למשאבת פרוטונים רק על ידי ניתוקו מתת היחידה Htr Iשל קומפלקס
4
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור : 5השוואה בין האתר הפעיל של הלורודופסין מ – N. pharaonisלבין האתרים הפעילים של
בקטריורודופסין והלורודופסין של .H. salinarumצד שמאל ) (1משווה בין שני ההלורודופסינים .השלד
הפחמני של pHRמוצג בירוק וזה של sHRבצהוב .הכדורים האדומים מסמנים מולקולות מים הקשורות
לשיירים של כיס החלבון של pHRוהצהובים את המים של .sHRצד ימין ) (2עורך השוואה בין כיסי החלבון
של בקטריורודופסין )כחול( מ – H. salinarumוהלורודופסין )ירוק( מ – N. pharaonisרואים כי הכלוריד
נמצא באזור התפוס על ידי חומצה אספרטית מס' 85של בקטריורודופסין .הכדורים האדומים והכחולים
מסמנים מולקולות מים שנמצאות באתר הפעיל של הלורודופסין ובקטריורודופסין בהתאמה.
האיתות .כנראה שאינטראקציות בין הסלילים של SR Iו – Htr Iגורמות לחסימת התעלה הפנימית של .18SR I
קרבה בין ארבעת הרודופסינים של Halobacterium salinarumמתבטאת הן בדמיון במבנה
הרבעוני אשר פוענח בהפרדה טובה מאוד עבורם )לדוגמה 1.5Å :במקרה של בקטריורודופסין ו – 1.8Åעבור
הלורודופסין ( 19,12והן בחזרות הרבות ברצפים הראשוניים ביניהם ובין רודופסינים ארכיאליים בכלל ,במיוחד
באזור האתר הפעיל בקרבת הכרומופור .2קרבה זו מקנה אופי השוואתי למחקרים רבים אשר נעשים על חלבונים
רטינליים ,אפילו אם מקורם באורגניזמים שונים .השוואה בין דינמיקה מושרית אור של שני הלורודופסינים :זה
שמיוצר על ידי ,Natronomonas pharaonisאותו חקרנו ,וזה של H. salinarumיכולה להיות מעניינת.
בין שתי משאבות אלה קיים דמיון מבני לא מבוטל )איור (5אשר מרמז על דמיון גם במנגנוניהן הפוטוכימיים.
מחקר כזה הופך לעוד יותר מעניין אם החוקרים מצליחים לקשר בין הבדלים מבניים מינוריים ביניהם לבין השוני
בדינמיקה.
אירוע ראשוני של הפוטוכימיה של החלבונים הרטינליים הוא איזומריזציה מושרית אור של הכרומופור.
פוטואיזומריזציה של הרטינל בחלבונים אלה מובילה לסדרה של אירועים הכוללים שינויים מבניים שלהם,
התגובה הפוטוכימית מאותחלת בכיס החלבון בו נמצא הרטינל והשינויים העוקבים בחלקי החלבון האחרים
מצומדים לאתר פעיל זה .כפי שאיור 4ממחיש ,ספקטרום הבליעה של הכרומופור מושפע מסביבת החלבון ,לכן
שינויים קונפורמציוניים ,מושרי אור ,של האופסין מזוהים באמצעות שיטות ספקטרוסקופיות במרחב הזמן
כצורונים בעלי חתימות ספקטרליות אופייניות ,אלה הם תוצרי הביניים של התגובה הפוטוכימית של החלבון.
מקסימום של ספקטרום בליעה של תוצר ביניים מסוים יכול להיות מוסט לכחול או לאדום ביחס
לספקטרום התחלתי של הפיגמנט .מכאן שההשפעה של האופסין על ספקטרום הבליעה של הכרומופור שלו,
באמצעות האינטראקציות בין ה – RPSBליון הנגדי ולשיירים הקוטביים באתר הפעיל ,במצב היסוד ובמהלך
הפוטוכימיה ,היא זו המאפשרת את חקר הדינמיקה של הרודופסינים באמצעים ספקטרוסקופיים .תוצרי הביניים
של הפוטוכימיה של חלבונים רטינליים ארכיאליים דועכים באופן ספונטני )בתהליכים תרמיים ,בחשכה( למצב
5
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור ) :6מימין( מעגל האור של . sHRהמספרים בצד ימין למתה בשם של תוצר ביניים כלשהו מציינים את מרכז
ספקטרום הבליעה של צורון זה .רואים כיצד הצעדים הנדרשים על מנת לבצע את פעולת השאיבה משתקפים
בספקטרוסקופיה :איזומריזציה מושרית אור ותרמית של הכרומופור )* Iו – ,(Iשני הצעדים הכוללים קישור וניתוק
כלוריד מהפיגמנט )אלה מסומנים על ידי האות (Tושני צעדים בהם משתנה הנגישות של האתר הפעיל לכלוריד
מהצד החוץ תאי ) (extra cellular – ecלצד הציטופלזמי ובחזרה המסומנים על ידי .Sתחילתו וסופו של מעגל
האור הוא בצורון . HR578מצד שמאל רואים את הספקטרה האבסולוטיים של תוצרי הביניים במעגל האור של
.sHR
היסוד ההתחלתי ,כלומר הפוטוכימיה שלהם מעגלית ולכן שרשרת התגובות מושרית האור של הרודופסינים
הארכיאליים נקראת "מעגל אור" . 20איור 6מציג את סכמת מעגל האור של sHRואת הספקטרה האבסולוטיים
של צורוני הביניים בפוטוכימיה של חלבון זה.21
בין מעגלי האור של הרודופסינים של ,H.salinarumכפי שהם משתקפים בספקטרוסקופיה מופרדת
זמן של חלבונים אלה ,קיים דמיון מסוים ,מה ששוב יכול להעיד על דמיון במנגנונים פוטוכימיים שלהם.
לדוגמה ,מעגלי אור של BR ,SR Iו – SR IIמתאפיינים בכך שבסקלה של פיקושניות נצפה תוצר שספקטרום
הבליעה שלו מוסת לאדום ,שלאחר מכן דועך תרמית במספר שלבים ,תוך שברי המילישנייה ,לתוצר הבולע ב –
UVקרוב .תוצר זה נקרא " " Mבבקטריורודופסין .ההסטה החזקה לכחול של ספקטרום הבליעה של התוצרים
הללו נובעת מדה – פרוטונציה של בסיס שיף בשלב זה של שרשרת התגובות .במצב זה ,סנסורי רודופסינים
מאותתים עקב שינוי אופי האינטראקציה בינם לבין החלבון הממברנלי Htr trasducerשמהווה תת יחידה
בקומפלקס האיתות של הארכיאון )איור . 22(3במשאבת הפרוטונים בקטריורודופסין בשלב היצירה של תוצר M
מתרחש המעבר של הפרוטון מבסיס שיף אל חומצה אספרטית ,Asp85כלומר בשלב זה מתחיל המעבר של
הפרוטון דרך הממברנה.
קל לעקוב אחר מצבים מוסתים לכחול קיצוני אלה גם בשיטות ספקטרוסקופיות מסורתיות ,כגון –
, flash photolysisבשלבים אלה של שרשרת התגובות הפוטוכימית של הרודופסינים הארכיאליים תוצרי
הביניים הם יחסית ארוכי חיים ,לכן חקר מצבי Mהשונים מספק כלי נח ללימוד של הקורלציות בין תכונות
ביוכימיות של חלבונים רטינליים ,הניתנות לשינויי על ידי מוטציות מכוונות ,לפוטו – טרנספורמציות שלהם.
להבדיל ממעגלי האור של בקטריורודופסין SR I ,ו – SR IIמצב דמוי Mלא מופיע בפוטוכימיה של
הלורודופסין בתנאים רגילים .כך מעגל האור של משאבת כלורידים זו משקף שוני מהותי בינה לבין האופסינים
האחרים של .Halobacterium Salinarumבהלורודופסין ,בסיס שיף משמר את הפרוטון שלו במהלך כל
התגובות הקשורות בפעולת המשאבה ,ככל הנראה הפרוטונציה שלו מיוצבת על ידי הנוכחות של המטען
6
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
השלילי של הכלוריד.23
בהמשך ,נציג מספר עבודות העוסקות בדינמיקה מושרית
אור אולטרה מהירה של הלורודופסינים ,רובן נעשו על .sHRהסיבה
לכך פשוטה sHR ,התגלה לפני .pHRבתור הקדמה ,נאמר כאן
מספר מילים על אנרגטיקה של השלב הראשון של המנגנון
הפוטוכימי של ) sHRניתן לראות את הסיכום הגרפי של המנגנון
הנ"ל באיור (7ונתאר כיצד שלב זה משתקף במעגל האור של אופסין
זה.
מצב היסוד ההתחלתי של sHRמאופיין על ידי התפלגות
יציבה של מטענים חלקיים ושלמים באזור האתר הפעיל .אבני הבניין
של התפלגות זו הם החנקן והפרוטון הקשור אליו ,יון הכלור הנגדי
של הקבוצה הפונקציונלית של בסיס שיף ,השיירים של חומצות
האמיניות המרכיבות את החלל הפנימי של הלורודופסין ומולקולות
המים הנמצאות שם .המים יוצרים קשרי מימן עם אותם השיירים ,עם
הכלוריד ועם הפרוטון של בסיס שיף )איור .(5
איזומריזציה מושרית אור של הכרומופור מייצרת התפלגות
איור :7השלבים של הפוטוכימיה של sHR
מסומנים על ידי המספרים .1 :מעבר של מטענים חדשה ,גבוהה באנרגיה מזו ההתחלתית בכ – ,11kcal/mol
הכלוריד באתר הפעיל דרך הרטינל לאחר
הפוטואיזומריזציה שלו .2 .שחרור הכלוריד הכוללת בין היתר נדידת מטען חיובי אל עבר טבעת משושה של
לציטופלזמה .3 .כניסת כלוריד אחר מהצד
החוץ – תאי .החצים מציינים את כוון הרטינל – טבעת βיונון .הקונפיגורציה החדשה הזאת של המטענים
השאיבה של האניון על ידי החלבון.
היא הכוח המניע לניתוקו של הכלוריד מהמיקום ההתחלתי שלו
ולנדידתו הלאה .אנרגיית מול פוטונים במרכז הנראה ) (580nmהיא ,~50kcalהחלבון אוגר כחמישית מסך
האנרגיה של הפוטון המעורר .היתרה מתפזרת כחום .חישובים שנעשו על sHRמראים כי ניצול יעיל יותר של
אנרגיית הפוטון ,כלומר הגבהת המצב 13−cisביותר מ – 11kcal/molלעומת המצב , all – transהיה
גורם להתגברות קצב האיזומריזציה הלא פרודוקטיבית למצב התחלתי ,לכן החלבון מנצל רק חלק קטן מאנרגיית
הפוטון המעורר.
ייתכן כי הפרש האנרגיה בין מצב 13−cisלמצב all – transשל הכרומופור ב – sHRהוא הגורם
העיקרי לכך שהבליעה של הפיגמנט כאשר הכרומופור שלו במצב 13−cisמוסטת לאדום ,ל – ) 600nmעל
מנת לקבוע בוודאות אם הפרש האנרגיה בין שני האיזומרים של הכרומופור במצב יסוד הוא הגורם להסחה
במקרה זה יש צורך במיפוי של משטח הפוטנציאל המעורר כפונקציה של הקו אורדינטות המולקולריות של
הרטינל וסביבת האופסין המידית ,במערכות ביולוגיות גדולות מיפוי כזה הוא משימה מורכבת ( .תוצר ביניים
הבולע סביב ,600nmהוא ,HR600הידוע גם בתור תוצר " "Kבמעגל האור של הלורודופסין.25,24
תוצר בעל שיא בליעה מוסט לאדום ,ביחס למצב היסוד ההתחלתי ,מופיע תוך פיקושניות בודדות
בספקטרה מופרדי זמן של כל הרו דופסינים הארכיאליים .מהירותו של שלב זה מקשה על חקר הדינמיקה
הגרעינית של הכרומופור וסביבת החלבון המידית המתרחשת במהלכו ,אך מעבדתנו מצוידת בכלים ניסיוניים
7
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
אשר מאפשרים זאת .כפי שנראה בהמשך ,בעיית הטופוגרפיה של משטחים אלקטרוניים מעוררים ובעיית
הדינמיקה הגרעינית הניתנת לתיאור במונחים של חבילות גלים המתפתחות על גבי המשטחים הללו ,שזורות
במידה מסוימת זו בזו .אינפורמציה המתקבלת עבור דינמיקה של הכרומופור עשויה לרמוז על טופוגרפיה
אפשרית של המשטח האלקטרוני המעורר ,מצד שני ,ידיעת המבנה של המשטח המעורר כפונקציה של
קואורדינטות נורמליות רלוונטיות לתהליך האיזומריזציה תעזור לנפות תרחישים דינמיים לא סבירים .לפני
שנציג תוצאות מחקרים קודמים אשר עסקו בדינמיקה מושרית אור אולטרה מהירה של הלורודופסינים ונראה
מהי האינפורמציה אשר התקבלה בעבודות הללו כולל הפירושים שלה על ידי קהילת חוקרי ה – ,ultrafast
נתעכב על מה שידוע עד כה על pHRובפרט על ההבדלים בינו לבין "בן דודו" .sHR
חלבון ה – .pHRמבנה ותפקוד.
ארכיאון הלו – אלקלופילי Natronomonas pharaonisמייצר את ההלורודופסין אותו חקרנו.
אורגניזם זה משגשג באגמים מלוחים ובסיסיים ) (soda lakesבאפריקה .טווח pHאופטימלי לגידולו נע סביב
9אך מין זה של הלוארכיאה בודד גם ממקורת מים בסיסיים ביותר ,בעלי pHהמגיע עד . 2611הזהות ברצפים
הראשוניים בין משאבת הכלורידים של N. pharaonisלזאת של H. salinarumמסתכמת ב – 53%כך
שמדובר בשני חלבונים שונים .27ההבדל המעניין בין השניים הוא לאו דווקא ברצף או מבנה שלהם ,אלא במטרה
למענה הם מיוצרים .ל – N. pharaonisאין הומולוג של בקטריורודופסין .מין זה של הלוארכיאה מסתמך על
הלורודופסין לצורך הפקת אנרגיה בתנאים של חוסר חמצן .מנגנון של פוטופוספורילציה של ADPב – N.
pharaonisדומה לזה של H. salinarumומבוסס על מעבר H+לתוך התאים דרך החלק המעוגן בממברנה
של החלבון .ATP synthaseהכוח המניע למעבר פרוטונים דרך הממברנה התאית של N. pharaonisהוא
קיטובה עקב שאיבת יוני כלור על ידי .28pHR
שוני משמעותי נוסף בין שתי משאבות הכלוריד הוא היחס בין איזומרי הציס והטראנס של רטינל .אם
"נדגיר" את sHRבחושך במשך זמן מסוים )סדר גודל של יממה ,תהליך זה נקרא " ("dark adaptationולאחר
מכן נבצע מדידה שמטרתה לגלות מהו אחוז החלבונים עם הכרומופור במצב , all – transנגלה שקרוב ל –
45%מסך החלבונים עונים לדרישה זו .מספר פיגמנטים עם הכרומופור all – transעולה ל – 75%לאחר
חשיפה ממושכת לאור .כשהם חשופים לאור ,חלבונים אלה נמצאים במה שנקרא " ."light adapted stateב –
pHRלעומת זה אחוז החלבונים במצב all – transלא תלוי בתנאי תאורה ועומד על .85%בנוסף ,מצב
13−cisשל pHRלא עובר איזומריזציה מושרית אור להבדיל ממצב 13−cisשל ,sHRמה שמקל על חקר
מעגל האור של .29,23pHR
פענוח המבנה pHRבשיטת פיזור קרני ) Xברזולוציה של 2אנגסטרום( הושלם לאחרונה .30בין היתר
נמצא כי הרטינל קשור לליזין )בדומה למה שקורה ברודופסינים אחרים( Lys256בסליל .Gהשרשרת
הפוליאנית של הרטינל מוקפת ומיוצבת על ידי מספר שיירים ארומטיים .קשר NHשל בסיס שיף מוכוון כלפי
הצד החוץ תאי והפרוטון יוצר קשר מימן עם אחת ממולקולות מים אשר מרכיבות צביר בן שלוש מולקולות
באזור האתר הפעיל .יון הכלור ואחד החמצנים של השייר Asp252יוצרים גם הם אינטראקציות עם בסיס שיף.
שתי קבוצות קוטביות אשר מייצבות את הקישור של הכלוריד לאתרו ההתחלתי בקרבת המטען החיובי של בסיס
8
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
שיף הם ההידרוקסילים של Ser130ושל Thr126בסליל .C
איור 8מציג סיכום גרפי של האתר הפעיל של .pHR
למולקולות המים באתר הפעיל תפקידים בייצוב
מטענים שלמים וחלקיים אשר בונים אותו ,אבל לא רק .כך
למשל המולקולה Wat502יוצרת קשר מימן עם הכלוריד
וברור כי עובדה זו תורמת לייצוב הכלוריד באתר הקישור
שלו ,אבל אם מסתכלים על המולקולה Wat503רואים כי
היא "תופרת " על ידי קשרי מימן שני שיירים קטביים:
Asp252ו – .Arg123תפקיד מבני שמזוהה עם מולקולות
מים שמהוות חלק ממבנה רבעוני של חלבון .מחקרים
איור :8סביבת האתר הפעיל של .pHRהמספרים
האדומים מציינים מרחקים )באנגסטרומים( בין יון אחדים מצבעים על התפלגות מולקולות המים באתר הפעיל
הכלור לבין האטומים השכנים ,הכחולים ממספרים של רודופסינים כגורם הכרחי לצורך אכסון יעיל של אנרגיה
את מולקולות המים .הצד הציטופלזמי נמצא
מלמעלה באיור זה.
באופסין לאחר בליעת הפוטון.31
מולקולת מים Wat503מתחילה שרשרת ארוכה של קשרי מימן הנמשכת הלאה מ – Arg123ומגיעה
עד הצד החוץ תאי ש ל האופסין .רשת זו של קשרי מימן מוצגת באיור .9מהצד החוץ תאי של השייר של
Arg123ישנו חלל גדול המכיל צביר של שש מולקולות מים ) Wat505עד .(Wat510החלל הזה נסגר על ידי
השייר של Glu234אשר בתורו מתקשר לרשת ארוכה נוספת של קשרי מימן הנמשכת עד His173הנמצא בצד
החוץ תאי של החלבון .רשת זו בנויה על ידי Arg176בסליל ,Fהשייר של His100היושבת על לולאה בין
הסלילים Bו – ) Cלולאת (BCושתי מולקולות מים ) Wat511ו – .(Wat512
ארבעת השיירים הקוטביים הנראים באיור (Arg123, Arg176, Glu234, His100) 9אשר ממוקמים
בין אתר הקישור של הכלוריד לבין הצד של החלבון הפונה אל מחוץ לתא נשמרים לחלוטין בין כל ההומולוגים
של הלורודופסין הידועים עד כה . 27קרוב לוודאי כי רשת קשרי המימן הנפרשת על ידי השיירים הללו ועל ידי
מולקולות המים הנראות באיורים 8ו – 9מתפקדת כמסלול ראשי לכניסת האניונים אל החלבון מהתווך החוץ –
תאי .השערה זו מחוזקת על ידי התוצאות של ניסוי בו
הוחלפה החומצה האמינית His95של sHRבאלאנין
)חומצה זו אנלוגית ל – His100של .(pHRיכולת השאיבה
של כלורידים של חלבונים ששונו באופן זה נפגעה מאוד.32
החצי הציטופלזמי של התעלה הפנימית של pHR
מכיל מעט חומצות אמיניות הידרופיליות .בצד זה של תעלת
החלבון נמצאת מולקולת מים אחת בלבד .זוהי המולקולה
Wat501המקיימת אינטראקציות עם ה – NHהאינדולי של
,Trp222ההידרוקסיל של Thr218והקרבוניל של השרשרת
הראשית השייך ל – .Ala255על אף שקיים מיקרו – חלל
איור :9רשת קשרי מימן בצד החוץ תאי של
גדול בין השיירים ההידרופיליים של ) Lys256הקושר את התעלה הפנימית של .pHR
9
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :10הצד הציטופלזמי של התעלה הפנימית של
.pHRרואים את מולקולת המים ,Wat501 ,היחידה
שמאכלסת צד זה של התעלה.
הרטינל( ו – Thr71הוא לא מאוכלס על ידי מולקולות
מים .חללים נוספים בחצי הציטופלזמי של התעלה של
pHRמוקפים על ידי שיירים הידרופוביים אשר יוצרים
מחסום אנרגיה גבוה למעבר של יון הכלור הטעון שלילית
)איור .(10
אם מסתכלים על החלבון מהצד הציטופלזמי,
מבחוץ ,רואים כי הלולאות בין הסלילים של החלבון
מתקפלות פנימה מכסות את הסלילים הללו ויוצרות מאין
פקק .כך הפוליפפטיד ה – Cטרמינלי אשר מקופל לסליל
קצר והלולאה בין הסלילים Aו – Bמחפים על הסלילים
A, B, Cו – .Gהלולאה בין הסלילים Cו – Dוחלק
מסליל Eאשר מכופף פנימה ,מכסים את השטח מעל
לסלילים D, Eו – .F
מבנה זה של מכסה הנוצר על ידי לולאות בין הסלילים קיים גם בצד החוץ תאי של החלבון ,רק ששם
הוא מורכב יותר וכולל את הלולאה הארוכה בין הסלילים Bו – Cואת הסליל ') Aאיור .(11סליל קצר זה הוא
מאין תוספת לסליל Aשל pHRומהווה אלמנט מבנה ייחודי להלורודופסין זה .השיירים ההידרופוביים של
הסלילים A, B, D, Fו – Gיוצרים אינטראקציות עם שיירים הידרופוביים של לולאת BCושל סליל ה – '.A
לעומת זה ,השיירים הקוטביים של המבנים הללו מכוונים החוצה וחשופים לתווך החוץ – תאי .הרשת הזאת של
אינטראקציות הידרופוביות תוך – מולקולריות יוצרת מאין מכסה הידרופובי בצד החוץ – תאי של החלבון.
ייתכן כי מטרת הכיסוי ההידרופובי היא למנוע חילוף מהיר של אניונים בין התווך החוץ – תאי לבין האתר
הפעיל של .pHRמשמעות העדר סליל ' Aב – ,sHRוהעובדה כי הלולאה בין הסלילים Bו – Cשל חלבון זה
קצרה ב – 10חומצות אמיניות מזו של pHRהיא של – sHRאין מבנה המזכיר את המכסה ההידרופובי בצד
החוץ – תאי של . pHRקיים כנראה שוני מהותי בין שתי המשאבות במנגנוני הבאת כלורידים מהתווך החוץ –
תאי אל התעלה הפנימית של האופסין .כפי
שנראה בהמשך ,שוני זה משתקף במעגלי האור
של הפיגמנטים הללו.
מבנה של כיס החלבון ליד אתר
הקישור של הרטינל נשמר בין pHRל –
,sHRרואים זאת היטב באיור .5כל השיירים
הבאים במגע עם השרשרת הפוליאנית של
הרטינל נמצאים באותם המקומות בדיוק
במודלים המבניים שלהם .המרחק בין הכלוריד
באתר הקישור הראשי שלו לבין בסיס שיף
איור :11המכסה ההידרופובי של pHRבצד החוץ – תאי .המורכב
נשמר גם הוא .קיים שוני במיקומן של שלושת מהסליל הקצר ' Aוהלולאה הארוכה בין הסלילים Bו – .C
10
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
מולקולות המים באתר הפעיל וישנה קורלציה בין הקונפורמציה
של תריאונין ) Thr126ב – pHRו – Thr111ב – (sHR
היושב באמצע סליל Cלסידור הזה של מולקולות המים .בעוד
שההידרוקסיל של Thr126של pHRמכוון אל עבר יון הכלור ,ה
– OHשל Thr111ב – sHRפונה החוצה ובונה קשר מימן עם
הקרבוקסיל של חומצת שומן ,palmitateאשר קשורה לצד
החיצוני של אחד הסלילים של .sHRבכוחו של השוני העדין
הזה בין כיסי החלבון של שני ההלורודופסינים ,להסביר מדוע
האפיניות של הכלוריד לאתר הקישור הראשי של pHRגבוהה
יותר מאשר לאתר הקישור הראשי שלו ב – .sHRקבועי
הדיסוציאציה של כלוריד שדווחו עבור pHRו – sHRהם ~1ו
– ~10mMבהתאמה.35,34,33
איור :12למעלה רואים את הקרוטנואיד
ממצא מפתיע אודות pHRהוא שחלבון זה קושר אליו
בקטריורוברין ,הכרומופור הנוסף של .pHR
למתה מוצג ספקטרום הבליעה של pHRמצדו החיצוני כרומופור נוסף ,הבולע בנראה ומקנה צבע אדום
כשהחלבון במצבו הטבעי ,ז"א קשור
לממברנה ) (membrane bound formשל של יין לממברנות המכילות את האופסין הנ"ל )איור .(12מדובר
.N. pharaonis
בקרוטנואיד בקטריורוברין ) ,(bacterioruberinעל אף
הימצאות קרוטנואיד זה בממברנות של Halobacterium salinarumלא דווח על היקשרותו לרודופסינים
של הארכיאון הנ"ל.
הבליעה של הכרומופור הנוסף מושפעת מצפיפות האכלוס של אתר הקישור הראשי של pHRעל ידי
כלוריד ולכן הוצע כי קיימות אינטראקציות חזקות בין החלבון לבין בקטריורוברין .36הקישור בין החלבון לבין
בקטריורוברין לא קוולנטי כמו במקרה של הרטינל .ניתן להפריד ביניהם באמצעות שטיפה של pHR
בדטרגנטים שונים .קשרי מימן בין ההידרוקסילים של הקרוטנואיד לבין קבוצות קוטביות של שני חלבונים
סמוכים מעגנים אותו לשני החלבונים בו זמנית ובכך הקרוטנואיד מסייע ביצירת המבנה הרבעוני של החלבון
שהוא יחידה טרימרית המורכבת משלושה הלורודופסינים )איור .(13הטרימרים האלה מוחזקים יחד על ידי
אינטראקציות נוספות בין המונומרים ,בנוסף לאלה הנתרמים על ידי בקטריורוברין כך שהמבנה הרבעוני הזה,
אשר נצפה בחקר גבישים מלאכותיים של pHRבאמצעות דיפרקציית קרני ,Xכנראה דומה מאוד למבנה
הטבעי של חלבון זה בתנאים פיזיולוגיים.30,37
טרימרים דומים של BRבונים גבישים הקסגונליים ,דו ממדיים על פני הממברנות של
Halobacterium salinarumגבישים אלה ידועים בתור הממברנה הסגולה ) (purple membraneשל
ארכיאון זה . 19,38,6במקרה של בקטריורודופסין פוספוליפיד מסוים ממלא את התפקיד של בקטריורוברין ,כנראה
שמדובר ב – diphytanylglycerolאבל יש גם מועמדים אפשריים אחרים לתפקיד זה .39מכאן שקשירה של
כרומופור נוסף לא הכרחית לייצוב של מבנים רבעוניים של רודופסינים ארכיאליים.
נשאלת השאלה מדוע הלורודופסין של N. pharaonisורודופסינים ארכיאליים אחרים קושרים
כרומופורים שונים בנוסף לרטינל? במחקר אשר התבצע לא מזמן במעבדתנו על משאבת פרוטונים ממונעת אור
11
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
קסנטורודופסין ) (Xanthorhodopsinהמיוצרת על ידי
בקטריה הלופילית Salinibacter ruberעקבו I. Gdorו –
J. Zhuבזמן אמת אחר מעבר אנרגיה בין אנטנת הקרוטנואיד
שלה ,סליניקסנטין ) ,(salinixanthinלרטינל .מחקר זה היה
בין הראשונים מסוגו לעקוב אחר מעבר אנרגיה בין שני
כרומופורים בחלבון ,המתרחש בסקלה של עשרות
פמטושניות . 40האם קיים מעבר אנרגיה דומה בין בקטריורוברין
של pHRלבין הרטינל של חלבון זה? מחקר שיאפשר לענות
על שאלה זו תרם נעשה ובינתיים אין הוכחות לכך ש – pHR
משתמש בקרוטנואיד שלו בתור אנטנה לצורך איסוף אור יעיל
ותיעול הבא בעקבות כך של האנרגיה הנקצרת לרטינל .ייתכן
והתפקידים של בקטריורוברין הם להגן על החלבונים מפני
נזקים של קרינה אולטרה – סגולה ו/או וויסות של קצב שאיבת
יונים .האפשרות השנייה מוצעת בעקבות גילוי ההשפעה של
פוטנציאל הממברנה של H. salinarumעל ספקטרום הבליעה
איור :13טרימר של .pHRמבט מהצד
של בקטריורוברין כשהוא קשור לחלבון.41
הציטופלזמי של הממברנה .קצה של מולקולת
בקטריורוברין נראה בצהוב ,קרוב ליון הכלור.
בקטריורודופסין ו – pHRדומים לא רק בזה שהם הקרבה בין השניים מרמזת על מידה לא
מתפקדים בתור מחוללי אנרגיה בתנאים היפוקסיים עבור מבוטלת של אינטראקציה ביניהם.
האורגניזמים המייצרים אותם .המבנה של האתר הפעיל נשמר ברובו בין שתי המשאבות הנ"ל ) איור .(5יון
הכלור ב – pHRתופס את המקום של הקרבוקסיל של Asp85בבקטריורודופסין .מכאן שהתפלגות המטענים
סביב הרטינל בשני חלבונים אלה היינה זהה למעשה .מיקום של שלושת מולקולות המים באתר הפעיל נשמר גם
הוא .הצד הציטופלזמי של התעלה הפנימית של שני החלבונים הללו נשמר זהה למעט החומצה Asp96אשר
מתפקדת כ – donorשל פרוטונים לבסיס שיף שעבר דה – פרוטונציה בשלב המעבר M→Nבמעגל האור של
.BRחומצה זו מוחלפת ב – Ala137ב – .pHRמיקרו חלל בין הקרבוניל של השרשרת הראשית של Lys256
של pHRלבין השייר של Thr71של חלבון זה )זהו Thr46בבקטריורודופסין( קיים גם ב – .BR
דמיון זה בין האתרים הפעילים והחצי הציטופלזמי של התעלות הפנימיות של BRו – pHRוהעובדה
כי ניתן להפוך הלורודופסין למשאבת פרוטונים מוכוונת פנימה בנוכחות ) N3-כאשר ההנחה היא כי יון האזיד
מתפקד כ – acceptorשל פרוטונים וגורם לדה – פרוטונציה של בסיס שיף בהלורודופסינים (42מאפשרים
להניח את הדבר הבא לגבי המנגנון של :pHRבמהלך שאיבה של כלוריד על ידי pHRמתרחשת כניסה ויציאה
של פרוטונים מהצד הציטופלזמי של חלבון זה .בניגוד למה שקורה ב – BRהפרוטונים לא עוברים את
הממברנה דרך ההלורודופסין ,אלא נעצרים בחצי הציטופלזמי של התעלה ופוגשים שם את יון הכלור לאחר
שהוא עוזב את אתר הקישור הראשי שלו ועובר לחצי הציטופלזמי של התעלה הפנימית ,בעקבות
הפוטואיזומריזציה של הרטינל .כך נוצרת מולקולה של חומצה הידרוכלורית ניטרלית ,בעלת מסיסות גבוהה
יותר בסביבה ההידרופובית של חצי התעלה הציטופלזמי של .pHRמנגנון זה מסוכם באיור .3014נציין כי יש
12
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :14צד שמאל ) (aמציג חתך אורכי של pHRכאשר החלק העליון בתמונה מציג את
חצי התעלה הציטופלזמי .צד ימין ) (bמסכם את מנגנון שאיבת כלוריד של .pHR
צורך ליישב מודל זה עם העדר ביטוי לאפקט איזוטופי בקינטיקת הפוטוכימיה של pHRבהחלפת תמיסה
מימית רגילה במים כבדים .אפקט זה מובהק במקרה של .43BR
חקר נרחב של מעגל האור של pHRנעשה בעבודותיהם של G. Váróו – J. K. Lanyiמ –
. 44,231995החוקרים העלו השערה כי מעגל האור של חלבון זה מורכב משישה צורוני ביניים:
K ⇔ L ⇔ N ⇔O ⇔ HR ' HR
לא ניתן להבדיל באמצעים ספקטרוסקופיים בנראה בין התוצרים המאוחרים HRו – ' ,HRהוספתו של
הצורון ' HRנדרשת על מנת לקבל התאמה טובה של דעיכת הספקטרה המזוהים עם התוצרים המאוחרים של
הפוטוכימיה של .pHRבסכמות מאוחרות יותר מחלקים את שלב Lלשני שלבים L1 ,ו – .L2גם במקרה זה,
הוספה של עוד צורון משפרת במעט את ההתאמה . 46,45החוקרים הראו כי זמן ההופעה וריכוז מרבי של תוצרים
מאוחרים של מעגל האור )החל מ – (Nמושפע מריכוז יוני כלור .ממצאי ניסויים של Váróו – Lanyiמוצגים
באיור .15
בניסויים מאוחרים יותר נעשה ניסיון לעקוב אחר תנועת מטענים בתוך החלבונים במהלך מעגל האור
על ידי מדידת התגובה הפוטואלקטרית שלהם .ניסויים אלה עזרו לזהות את השלבים של שחרור הכלוריד
לציטופלזמה )שלב המעבר (N → Oוכניסה של כלוריד מהצד החוץ תאי )' .47(O → HRכמה עבודות הוקדשו
למדידת תדרי וויברציה של קבוצות פונקציונליות שונות במהלך שלבים מוקדמים של מעגל האור של הפיגמנט.
כך מדדו החוקרים M. Shibataו – H. Kandoriאת תדר N – Hשל בסיס שיף והסיקו כי בשלב Kקיים
קשר מימן בין הפרוטון של בסיס שיף לבין הכלוריד ,בעוד שבמצב יסוד התחלתי מולקולת מים מהווה
acceptorשל קשר זה .במצב L1משתחזר קשר המימן בין מולקולת המים לבין הפרוטון של בסיס שיף ,מה
שמשאיר בתורו את יון הכלור ללא קשרי מימן ,המשמעות היא שסביבת הכלוריד הופכת להיות פחות קוטבית ב
– L1וזה לטענת החוקרים מהווה את אחד הגורמים לניתוקו מאתר הקישור הראשי שלו .חוקרים מקבוצה זו
הראו גם כי בשלב L2מתרחשת דה – פרוטונציה של ) Glu234איור (9והם העלו השערה כי הופעה של מטען
שלילי בחצי החוץ – תאי של התעלה הפנימית של החלבון מונעת מהכלוריד להיפלט בחזרה אל מחוץ לתא.48,31
13
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :15מעגל האור של . pHRתוצרי הביניים של הפוטוכימיה של הפיגמנט מוצגים בשורה התחתונה .צד ימני
עליון מציג את הספקטרה האבסולוטיים שלהם .הפנל התחתון מימין מציג את הריכוזים של תוצרי הביניים בסקלת
זמנים לוגריתמית .משמאל מוצגים ספקטרה הפרש בליעה בנראה החל מזמן של 100nsעד עשירית השניה.
הבדל עיקרי בין מעגלי האור של pHRו – sHRהוא בשלבים המאוחרים שלהם ,בעצמת המאפיינים
הספקטרליים של צורון Oהמופיע בשני המעגלים .תוצר מאוחר בעל מרכז ספקטרום בליעה מוסט ל – 640nm
במעגל האור של sHRנתרם כנראה על ידי פוטוכימיה של פיגמנטים בעלי קונפיגורציה 13−cisשל
הרטינל .49,23לעומת זה ,צורון Oהוא במידה רבה של וודאות חלק מפוטוכימיה של pHRבעל כרומופור
בקונפיגורציה התחלתית , all – transאחרי הכל ,לא דווח על מדידה של מעגל אור של פיגמנטים עם הרטינל
במצב 13−cisשל .29pHRנציין כי הצורון Oמצטבר במעגל אור של פיגמנט זה בריכוז נמוך יחסית של יוני
כלור .כמעט ולא רואים אותו כאשר ריכוז NaClבתמיסה המכילה את החלבונים קרוב לריכוז המאפיין תנאי
מחייה טבעיים של ) N. pharaonisבערך .23(4Mהסיבה לכך היא ככל הנראה קינטית .דעיכת המאפיינים
הספקטרליים של תוצר Oשל מעגל האור של pHRמשקפת תהליך של כניסת כלוריד מהתווך החוץ תאי אל
התעלה הפנימית של האופסין .47כניסה זו צפויה להיות אטית ב – ,pHRבמיוחד בריכוזים נמוכים של כלוריד,
בגלל אותו מחסום אנרגיה הנובע מנוכחות הכיסוי ההידרופובי הבנוי על ידי לולאת BCארוכה והסליל ' .Aב –
sHRאין "מכסה הידרופובי" בצד החוץ תאי של החלבון ,כניסת יון כלור לתעלה פנימית של חלבון זה מהירה,
ככל הנראה ,גם בריכוזים נמוכים של כלוריד ולכן תוצר דמוי Oשל pHRלא מצטבר במעגל אור של חלבון זה
)הכוונה למעגל אור שתחילתו באיזומר מרחבי all – transשל הכרומופור.(30
נתמקד כעת בשלב המעניין אותנו של מעגל האור של ,pHRשלב יצירת .Kאולם ,לפני שנסקור
עבודות העוסקות בתהליכים ראשוניים בהלורודופסינים ,ברצוננו להציג מאפיינים משותפים מעניינים של
14
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
תהליכים מושרי אור ראשוניים בחלבונים רטינליים ארכיאליים ,כפי שהם משתקפים בספקטרוסקופיה מופרדת
זמן אולטרה – מהירה שלהם .עיקר הדוגמאות יילקחו משפע המחקרים אשר נעשו על .BRמאפיינים רבים של
פוטוכימיה אולטרה מהירה של BRמופיעים גם ברודופסינים ארכיאליים אחרים .עובדה זו לא צריכה להפתיע
נוכח כל מה שנאמר עד כה.
תהליכים ראשוניים בחלבונים רטינליים ארכיאליים וב – .RPSB
מהי המוטיבציה שלנו לחקור תהליכים מושרי אור ראשוניים ב – ?pHRנתחיל מציון עובדה חשובה
בנוגע לפוטוכימיה של הלורודופסינים וחלבונים רטינליים בכלל .לא כל אירוע של בליעת פוטון על ידי האופסין
מביא לאיזומריזציה של הרטינל .היעילות הקוונטית לאיזומריזציה של הכרומופור של sHRהיא 0.3וזו של
pHRעומדת על – . 0.5היעילות הקוונטית הגבוהה ביותר אשר דווחה עד כה עבור חלבון רטינלי ארכיאלי
מתקרבת ל – 0.65והיא של . 52,51,50BRסך היעילות הקוונטית לאיזומריזציה סביב קשר כפול כלשהו של
RPSB all – transבתמיסה היא ~ 0.2ומתוך אותן המולקולות העוברות איזומריזציה רק כ – 8%עוברות
אותה סביב הקשר . 54,53 C13=C14החלבון מייעל משמעותית את תהליך האיזומריזציה סביב קשר זה וחוסם
אותו לחלוטין סביב הקשרים הכפולים האחרים של הרטינל.
משמעות של יעילות קוונטית קטנה מ – 1לאיזומריזציה היא שרק חלק מאוכלוסיה מעוררת של
רודופסין ארכיאלי מגיע בסופו של דבר לאזור קואורדינטות מולקולריות המגדיר את מצב היסוד של האיזומר
. 13−cisהחלק הנותר לעולם יחזור למצב היסוד בקונפיגורציה המקורית .ממוצע של מספר יונים העוברים את
הממברנה התאית חלקי מספר פוטונים הנבלעים על ידי הפיגמנט ,כלומר היעילות הסופית של כל התהליך,
קרובה ליעילות קוונטית לאיזומריזציה של הכרומופור .אי לכך ,השלב הראשון של מעגל האור של
הלורודופסינים ואופסינים ארכיאליים אחרים הוא שלב ייחודי אשר קובע את היעילות של החלבונים הללו
בביצוע עבודתם .ניתן אפילו לומר כי בשלב זה הפוטוכימיה של הפיגמנטים האלה מתחילה ונגמרת כי המרת
אנרגיית פוטון לאנרגיה כימית ואגירתה מתרחשות אך ורק בשלב יצירת התוצר Kשל מעגל האור.
אין אנו מנסים לרמוז כי השלבים המאוחרים יותר של מעגל האור של הלורודופסין פחות מעניינים
ופחות ראויים למחקר .מלהיב יהיה לגלות כיצד הכלוריד "מדלג " מעל הרטינל שעבר איזומריזציה ומה המהלך
שלו בתעלה הפנימית של החלבון .אנחנו יודעים כי שלב הבא אחרי יצירת התוצר Kבמעגל האור של sHR
מלווה בבניית בליעה בירוק ) λmax = 520nmהיא הבליעה המקסימלית של התוצר " "Lשל מעגל האור של
חלבון זה( .אולם ,המסלול המדויק של הכלוריד בתעלה הפנימית של sHRידוע בינתיים רק מחישובים
תאורטיים וניתן רק לשער כי בשלב זה חלה התחדשות של אינטראקציות בין הכלוריד לבין הפרוטון של בסיס
שיף אשר תוצאתה היא הסחת בליעת התוצר Lלכחול .25יחד עם זאת ,השלבים המאוחרים במעגלי האור של
חלבונים אלה נחקרו יותר כי הם אטיים יותר .אם ב כל הרודופסינים הארכיאליים תהליך החזרה של האוכלוסיה
המעוררת למצב יסוד בקונפיגורציה זו או אחרת של הרטינל הוא אולטרה מהיר ולוקח פיקושניות בודדות ,אז
בשלב Kהפיגמנטים נשארים סטטיים ננושניות רבות .השלבים הבאים אטיים אף יותר ,לשרשרת התגובות
הפוטוכימית של הלורודופסין לוקח כ – 15מילישניות להסתיים .למעשה ,החל משלב Kוהלאה ניתן לחקור את
מעגל האור של האופסינים הארכיאליים בתנאים קריאוגניים בשיטות של פיזור קרני Xאו אלקטרונים.55
15
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :16רצף מושרה אור של תגובות אולטרה מהירות של בקטריורודופסין.
מחקרנו הנוכחי מתמקד בשלב הראשון של מעגל האור של .pHRפיגמנט זה אינו שונה מרודופסינים
ארכיאליים אחרים בכך שדה – אקסיטציה של האוכלוסיה המעוררת והאיזומריזציה סביב הקשר C13=C14
של הכרומופור שלו מתרחשים תוך פיקושניות בודדות . 56סקלת זמנים זו נגישה למעבדות קרני רנטגן בודדות
בעולם ,לרוב מדובר במתקני מחקר לאומיים . 57לעומת זה ,כמו במעבדתנו כך גם במעבדות רבות אחרות ,מידע
לגבי התנהגות של מאפיינים ספקטרליים טרנזיינטיים של מצב אלקטרוני מעורר של מולקולות מושג באופן
שגרתי על ידי הפעלת טכניקות שונות של ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה .תנאי הכרחי להבנה של פרטי מנגנון
ההמרה של אנרגיית אור לאנרגיה כימית ועל הדרך שבה החלבון אוגר אותה ומונע את בריחתה לסביבה הוא
מעקב בזמן אמת אחר התהליכים הללו .תנאי זה מתקיים בהפעלת שיטות ניסיוניות שלנו.58
במשך שלושים שנות מחקר של בקטריורודופסין באמצעות לייזרים אולטרה מהירים התגבשה סכמה
המוצגת באיור 16אשר מסכמת את המתרחש בחלבון זה במהלך הפיקושניות הראשונות מרגע העירור.
מאפיינים רבים שלה רלוונטיים לצורך מתן תיאור של אירועים ראשוניים בחלבונים רטינליים אחרים כמו
הלורודופסין או סנסורי רודופסינים .85,99,59נסביר את הנראה בה .לאחר עירור הכרומופור של BRמתרחשת
רלקסציה אולטרה מהירה של המצב המעורר הראשוני שלו )זהו מצב .Franck – Condonבסכמה הנדונה הוא
מסומן על ידי * .(BRרלקסציה זו מובילה למצב המעורר ,Iאו בשמו האחר "מצב פלואורסצנטי" של
בקטריורודופסין .מאפיינים ספקטרליים של Iמופעים בסקלה של עשרות פמטושניות לאחר שלב ספקטרלי
דינמי בו מאפיינים ספקטרליים התחלתיים של * BRמוסטים ,הבליעה לכחול והפליטה המאולצת לאדום .שלב
דינמי זה בספקטרום מופרד זמן של
בקטריורודופסין נמשך מספר עשרות
פמטושניות .ספקטרום ההפרש )נעמוד
על משמעות מדויקת של מונח זה
בחלק המוקדש לשיטות הניסיוניות
שלנו( של מצב Iשל BRמאופיין על
ידי סיגנל שלילי הנובע מפליטה
מאולצת בעלת שיא באינפרה אדום
קרוב ,ב – .900nmכמו כן ,בצד
הכחול של הספקטרום הנראה מופיע
סיגנל חיובי הנובע מבליעת המצב
איור :17ספק טרום הפרש בליעה מופרד זמן של בקטריורודופסין.
ציר האלקטרוני המעורר בעל שיא סביב
הצבעים )לפי הסרגל המצורף( הוא ציר של בליעה דיפרנציאלית ,שני
הצירים הרגילים הם ציר אורכי הגל וציר הזמן ,לפי הסימון.
) 460nmאיור .(17מאפייני Iדועכים
16
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
באופן מוסכם בכל אורכי הגל תוך פיקושניה אחת וספקטרום התוצר ,Jשבו הכרומופור נמצא במצב יסוד
אלקטרוני בקונפיגורציה 13−cisעולה סביב .625nmרלקסציה ויברציונית של הכרומופור ושל סביבת
החלבון מובילה בסופו של דבר למצב קוואזי – סטציונרי ) Kמרכז בליעתו של צורון זה ב – .60,123(610nm
שאלה אשר מעסיקה רבים מקהילת חוקרי הרודופסינים הארכיאליים עוסקת בדינמיקה מולקולרית של
הכרומופור המעורר במהלך האיזומריזציה .מבין כל דרגות החופש הויברציוניות שלו ,אשר מעורבות בתהליך
זה ,מהן החשובות יותר? תוצאות של ניסויים אשר נעשו על BRבאמצע שנות ה – 80הוסברו במונחים של
פרופיל אנרגיה פוטנציאלית כפונקציה של קואורדינטת הראקציה ,היא קואורדינטת פיתול )ליתר דיוק זווית דה
– הידרלית( סביב הקשר העובר איזומריזציה ,קרי . 61 C13=C14עם שיפור הפרדת זמנים של הניסויים בתחום
הנראה של הספקטרום ופיתוח שיטות ניסיוניות חדשות כגון ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה באינפרה אדום
)ספקטרוסקופיה ויברציונית אולטרה מהירה( וספקטרוסקופיית ראמן מהירה ואולטרה מהירה ,התקבלו תוצאות
אשר מעידות כי העירור האלקטרוני גורם לאקטיבציה של אופני תנודה נוספים של הכרומופור ,אלה הן ויברציות
גבוהות תדר כגון מתיחת C=Cו – , C−Cניעור ) (rockingשל מתיל ואופן תנודה הנתרם על ידי יציאת
מימן ממישור מולקולרי ) .(Hydrogen out of Plain, HOOP, vibrationמעורבות תדר מתיחת קשר
C=Cכפול מצומד בתהליך האיזומריזציה מעידה על התארכות השלד הפחמני של הכרומופור במצבו המעורר
וקונסיסטנטית עם העובדה שהמצב האלקטרוני בפוליאן מצומד העובר איזומריזציה סביב אחד מהקשרים
הכפולים שלו חייב לקבל אופי של אורביטל אנטי קושר )המעבר האלקטרוני המוליד את הדינמיקה הגרעינית
המדוברת הוא *.66,65,64,63,62(π → π
תיאור פשוט של תהליך האיזומריזציה של הכרומופור ברודופסינים ארכיאליים בעקבות גילויים אלה
הוא מודל שתי רמות שני אופנים .העירור ממקם חלק מאוכלוסיית מצב היסוד )רמה אלקטרונית ראשונה( על גבי
המשטח האלקטרוני המעורר )הרמה השנייה( .משם חבילת גלים הויברציונית מתפתחת לאורך קואורדינטת
מתיחת השלד הפחמני ולאורך קואורדינטת פיתול נמוכת תדר .עקב הבדל גדול בתדרים עצמיים בין שני אופני
תנודה אלה 170cm-1 ,עבור הפיתול לעומת 1550cm-1 – 1500עבור המתיחה ,121,66האבולוציה של חבילת
הגלים לאורך כל אחת מהקואורדינטות מתרחשת בסקלות זמנים מופרדות .פיתול הכרומופור המעורר
בבקטריורודופסין מוביל באופן טבעי לאיזומריזציה תוך פיקושניה אחת בערך ,מאידך ,התפתחות חבילת הגלים
לאורך הקואורדינטה השנייה ,מתיחת , C=Cמתרחשת תוך כ – 50fsוביטויה של התפתחות זו בספקטרום
מופרד זמן של BRהוא הסט רציף של פסי הבליעה והפליטה המאולצת .בהתייחס לסכמה המוצגת באיור 16
מדובר בשלב .68,67BR* → I
חשיבות אופני תנודה אלה לתהליך האיזומריזציה של הכרומופור ברודופסינים ארכיאליים נתמכת על
ידי תוצאות של עבודות תאורטיות לפיהן התקדמות לאורך שתי קואורדינטות מולקולריות אלה מוליכה את
חבילת הגלים הויברציונית על משטח אלקטרוני עליון אל עבר אזור שבו הוא נחתך עם המשטח התחתון .67אזורי
חיתוך כאלה של משטחי פוטנציאל בעלי אותה סימטריה מרחבית וסימטרית ספין )רק משטחי סינגלט מעורבים
בפוטופיזיקה של רטינל ברודופסינים ארכיאליים( נקראים חתכים קוניים.Conical Intersections – CI's :
במילים אחרות ,מדובר בסט של נקודות במרחב הגאומטריה המולקולרית בהן משטחי הפוטנציאל מנוונים.
ממדיות של מרחב החיתוך במערכת מולקולרית בעלת nדרגות חופש ויברציוניות היא .n – 2אי לכך ,במערכת
17
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
דו ממדית המשטחים יחתכו בנקודה אחת ,גאומטריה מולקולרית אחת.
משטחי הפוטנציאל של מערכת דו ממדית כזאת ייראו כמו שני חרוטים
)קונוסים( הפוכים שקדקודיהם נפגשים בנקודת החיתוך )זוהי הצורה
האופיינית של יו – יו סיני ,(diaboloמכאן השם חתך קוני )איור .(18
דה – אקסיטציה )חזרה אל משטח היסוד האלקטרוני( לא
רדיאטיבית של מולקולות מעוררות דרך חתכים קוניים היא מקרה פרטי של
תופעה הנקרית היפוך פנימי ) .(internal conversionמושג זה מתייחס
למעבר לא אדיאבטי של אוכלוסיה מרמה אלקטרונית גבוהה לרמה נמוכה
איור :18חתך קוני פשוט בין שני יותר דרך חתך קוני בין שתי הרמות .דיסיפציה מלאה או חלקית של אנרגיית
משטחי פוטנציאל אלקטרוניים
במערכת המתוארת על ידי שתי הפוטון לסביבה מתרחשת תוך כדי מעבר כזה .לשני המשטחים
קואורדינטות.
האלקטרוניים אותה סימטריית ספין במקרה של היפוך פנימי ,למעבר בין
משטח טריפלטי לסינגלטי ולהפך קוראם חציה בין מערכתית ) .(inter system crossingמכאן והלאה נקרא
לתהליך חזרת האוכלוסיה המעוררת אל משטח היסוד בחלבונים רטינליים בשמו ,ההיפוך הפנימי.69
חישובים מצבעים על כך שהגאומטריה המולקולרית של RPSBשבה משטחי הפוטנציאל
האלקטרוניים S0ו – S1נחתכים מתאפיינת בזווית פיתול קרובה ל – ◦ 90סביב קשר הכפול המיועד
לאיזומריזציה .לא ברור עד כמה זה נכון עבור כרומופור בתוך סביבת החלבון .מה שבטוח הוא שבהגעת
האוכלוסיה המעוררת של בקטריורודופסין אל אזור החתך הקוני ) (CIויותר מדויק בעת ההיפוך הפנימי עצמו,
התגובה הפוטוכימית מתפצלת לשני ערוצים ,כפי שניתן לראות בסכמה המוצגת באיור .16כ – 65%
מהמולקולות המעוררות יוצרים את התוצר Jואילו 35%הנותרות חוזרות אל מצב היסוד המקורי ,בו הכרומופור
נמצא בקונפיגורציה .71,70,67 all – trans
נדגים כיצד האירועים האלה משתקפים בספקטרוסקופיה אולטרה מהירה .איור 19מציג דעיכות של
פליטה מאולצת באורכי גל אופייניים של בקטריורודופסין,
pHRו – RPSBמעוררים אלקטרונית )הגרף המוצג כאן
עבור BRמהווה חתך אורכי ,באורך גל קרוב ל – ,900nm
של הספקטרום באיור .(17הפליטה המאולצת כפונקציה של
הזמן הנראית באיור 19נמדדה במעבדתנו בשיטת – pump
,probeעליה נפרט בחלק הניסיוני .עוצמת הפליטה
המאולצת פרופורציונית לריכוז המולקולות המעוררות,
כלומר מהירות הדעיכה שלה משקפת במקרה זה את
קינטיקת ההיפוך הפנימי .איזו אינפורמציה מתקבלת ישירות
משלושת העקומות הנ"ל? בתור התחלה ,אכן רואים כי
איור :19פליטה מאולצת כפונקציה של הזמן,
ההיפוך הפנימי בשני החלבונים הרטינליים מהיר מאוד ,הוא באורכי גל מייצגים ,של בקטריורודופסין )אדום(
הלורודופסין )שחור( ו – ) RPSBכחול( .הפליטה של
מתרחש בסקלה של פיקושניות .שנית ,רואים כי מהירותו
שלושת הצורונים המעוררים מנורמלת לפי
שונה עבור שני הפיגמנטים .תהליך זה מהיר יותר המקסימום.
18
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
בבקטריורודופסין מאשר בהלורודופסין ומהירותו גבוהה יותר בשני החלבונים מאשר ב – RPSBבתמיסה )אם
כי ההבדל בין pHRלבין RPSBלא משמעותי( .מכאן ניתן ללמוד כי לחלבון יכולת שליטה גם על מהירות
ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה של הרטינל בנוסף ליכולתו לשלוט על ספקטרום הבליעה.
בשנים האחרונות מחקר של רודופסינים ארכיאליים באמצעות שיטות ספקטרוסקופיות אולטרה מהירות
מתמקד יותר בנושא האינטראקציה של הכרומופור עם החלבון .השאלות המרכזיות עליהן החוקרים מנסים
להשיג תשובות הן :כיצד החלבון מבצע את התפקיד הקטליטי שלו בתגובת איזומריזציה מושרית אור של
הכרומופור? איך החלבון מתעל את האנרגיה החופשית הנותרת של הפוטון המעורר ,מונע את בריחתה לסביבה
ובסופו של דבר אוגר אותה כאנרגיה כימית? האם ניתן לפרק את השפעת החלבון למרכיבים שלה? כלומר האם
יש קשר בין הסלקטיביות של האיזומריזציה לבין מהירות ההיפוך הפנימי ולבין היעילות הקוונטית שלה? לבסוף
באיזה שוני מבני בין האתרים הפעילים של הרודופסינים הארכיאליים ניתן לתלות את ההבדלים ביניהם ביעילות
הקוונטית לאיזומריזציה ובמהירות ההיפוך הפנימי? ברור לנו כי בשלב ראשון אולטרה מהיר של מעגל האור של
חלבונים אלה לשוני מבני בסביבה המידית של הכרומופור תהיה השפעה מכרעת בקביעת מהירות ההיפוך
הפנימי .חלקים מרוחקים יותר של החלבון "ירגישו" את העירור בזמנים מאוחרים יותר ולכן השפעתם תתן את
אותותיה בשלבים מאוחרים יותר של מעגל האור .אי לכך ,לא ניתן להפריד בין בעיית המבנה של האתרים
הפעילים לבין בעיית דינמיקה מושרית אור ראשונית בחקר חלבונים אלה.
התקדמות מסוימת בהבנת המנגנון האנזימטי של סביבת החלבון בתהליך הפוטו – איזומריזציה של
הרטינל בבקטריורודופסין הושגה לא מזמן .מחקרים רבים הראו שתנאי מקדים הכרחי לכך שתהליך ההיפוך
הפנימי בחלבון זה יהיה מהיר )עם קבוע דעיכה של (0.5psהוא דה – פרוטונציה של השייר הקרבוקסילי של
.Asp85למוטציות מסוימות יש השפעה על ערך pKaשל חומצה זו ,לכן מוטציות אלה ישפיעו במידה לא
מבוטלת על קצב ההיפוך הפנימי .כך למשל החלפת Arg82של בקטריורודופסין בחומצה אמינית ניטרלית גורם
להאטה משמעותית בקצב ההיפוך הפנימי של הכרומופור המעורר .72ייתכן והחלפת Asp85של
בקטריורודופסין ביון הכלור בהלורודופסינים הוא הגורם העיקרי לכך שקצב ההיפוך הפנימי איטי יותר
במשאבות הכלוריד .ראויה לציון העובדה כי קצב תהליך זה בהלורודופסינים מואט עוד יותר כאשר מחליפים
את הכלוריד באניונים של הלוגנים פחות אלקטרושליליים ,ברומיד ויודיד .תרם נעשה ניסוי הבודק את השפעת
החלפה של כלוריד בפלואוריד על קינטיקת ההיפוך הפנימי.56
ניתן לתת הסבר לסלקטיביות של פוטו – איזומריזציה של הכרומופור סביב הקשר C13=C14
באופסין לעומת ריבוי התוצרים של תגובה זו במקרה של RPSBבתמיסה במונחים של הפרעות סטריות
הנגרמות לרטינל על ידי סביבת החלבון .ככל הנראה ,הפרעות אלה אחראיות גם לשינוי דרסטי של תדר תנודת
הפיתול בעת הכנסת הכרומופור לחלבון .כפי שכבר אמר נו ,תדר תנודה זו עומד על 170cm-1עבור החלבון אך
ערכו יורד ל – 120cm-1בלבד עבור RPSBבתמיסה . 121נחשוב לרגע על הטופוגרפיה של חתכים חד ממדיים
של משטח הפוטנציאל האלקטרוני המעורר לאורך קואורדינטות ראקציה עבור איזומריזציה של הכרומופור
סביב קשרים בין פחמנים אחרים בשרשרת הפוליאנית שלו ,לא . C13=C14הגיוני יהיה למצוא מחסומי
פוטנציאל על גבי המשטח המעורר אשר מפרידים בין האוכלוסיה הפלואורסצנטית לבין חתכים קוניים
רלוונטיים עבור איזומריזציות סביב קשרים אלה .הפרעות סטריות לרטינל על ידי השיירים הבונים את האתר
19
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :20שני המודלים המקובלים לתיאור השל ב הראשוני בפוטוכימיה של בקטריורודופסין.
משמאל מוצג מודל שתי רמות ) (Aומימין מודל שלוש רמות ).(B
הפעיל ,אותן הזכרנו לעיל ,הם הגורם למחסומים.
נוכחות מחסום על S1עשויה להשרות תלות של מהירות תהליך ההיפוך הפנימי של הכרומופור המעורר
בטמפרטורה אינטרה מולקולרית שלו .אם נמתח לרגע אנלוגיה בין ההיפוך הפנימי לתהליכים משופעלים תרמית
במצב יסוד ,אז משיקולים תאורטיים פשוטים אשר מבוססים על חילוץ קבועי קצב ממשוואת ארהניוס ניתן
להראות שעל מנת לכפות סלקטיביות על פוטו – איזומריזציה של הרטינל ,על האופסין להנמיך את מחסום
הפוטנציאל לאורך ערוץ התגובה הרצוי בכ – 4kJ mol-1לעומת ערוצים אחרים )מכיוון שאין לנו אמדן
המקדמים הפרה אקספוננציאליים הנחנו שהם שווים עבור כל הערוצים( .אמצעי שליטה פשוט זה יבטיח בסופה
של התגובה יחס של 100:1לטובת האיזומר הרצוי .אי לכך ,הסלקטיביות ומהירות ההיפוך הפנימי הן ככל
הנראה השפעות חלבון נפרדות ,אשר תלותן מוטלת בספק .בעוד שהסלקטיביות תלויה בהפרש גבהי המחסומים
לאורך ערוצי האיזומריזציה השונים ,קצבה בערוץ האיזומריזציה המוביל לתוצר , 13−cisבטמפרטורה נתונה
של ,300Kיהיה תלוי אך ורק בגובה אבסולוטי של מחסום זה.
נוכחות מחסום פוטנציאל בדרכה של אוכלוסיה מעוררת אל עבר החתך הקוני המתעל אותה לאזור
קואורדינטות מולקולריות המגדיר את הצורון 13−cisעל המשטח התחתון עומד בסתירה להגיון .מדוע
שיהיה שם מחסום כזה? משמעות הקיום שלו היא האטה בקצב התגובה המתרחשת בערוץ הרצוי! כנראה
שמדובר בתכונה אינהרנטית של הכרומופור )במצב התחלתי .( all – transהחלבון יכול לרכך את מחסום
הפוטנציאל )היפוך פנימי בבקטריורודופסין מהיר יותר מאשר ב – RPSBבתמיסה ,איור (19אך אינו יכול
לבטל אותו לחלוטין .מחסום כזה יכול לנבוע מנוכחות של חתך קוני של המשטח המעורר S1עם משטח
פוטנציאל מעורר גבוה יותר . 86,102,60הצורך בהוספת רמה מעוררת נוספת למודל שתי רמות של ) BRוהפיכת
מודל זה למודל שלוש רמות( נובע מכישלון מודל פשוט זה במתן הסבר לאספקטים מסוימים של תהליך ההיפוך
הפנימי בבקטריורודופסין .לפי מודל שתי רמות ,משטח פוטנציאל מעורר הוא ראקטיבי לאורך קואורדינטת
האיזומריזציה .משטח כזה "ידחוף" את הרטינל המעורר אשר נמצא בקונפיגורציה all – transבכוון התוצר,
לאורך מסלול חופשי ממחסומים .כלומר ,רטינל במצבו האלקטרוני המעורר צובר מתח בקשר C13=C14
שלו .ניתן לדמות אותו לקפיץ שעון מתוח .האנרגיה האגורה בקפיץ מוציאה את האיזומריזציה אל הפועל ) איור
.(20
20
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
תנאי שהתקיימותו הייתה מחזקת באופן משמעותי
את הטענות על נכונות מודל שתי רמות הוא הסט
דינמי רציף לאדום של ספקטרום הפלואורסנציה עם
התקדמות הקונפורמציה של הכרומופור המעורר
לאורך קואורדינטת הראקציה אל עבר המצב
. 13−cisהתבוננות מדוקדקת בספקטרום הפרש
בליעה מופרד זמן של בקטריורודופסין )כגון זה
המוצג באיור (17מגלה כי השלב הדינמי שבו פסי
הבליעה והפליטה של המצב המעורר של הכרומופור
מראים הסטים רציפים אינו נמשך מעבר ל – 100fs
מרגע העירור .123בזמן זה )שלב Br Franck−Condon → I
איור :21מנגנוני איזומריזציה סביב קשר כפול .למעלה ) (Aבסכמה המוצגת באיור ,(16מתפתחים מאפיינים
היפוך סביב קשר כפול אחד ) .One Bond Flip (OBF
באמצע )" (Bדוושת האופניים" ) .Bicycle Pedal (BPספקטרליים של המצב הפלואורסצנטי .Iלאחר שלב
למתה ) (Cמנגנון "היפוך חישוק" ).Hula Twist (HT
דינמי התחלתי קצר זה בהתפתחות ספקטרום ההפרש
של BRמעורר ,פסי הבליעה והפליטה המאולצת אשר מזוהים עם המצב Iנשארים מקובעים לתחומי אורכי הגל
שלהם ולא מראים שום דינמיקה נוספת.
יש לציין כי שלב דינמי ראשוני של התפתחות הספקטרום אינו יכול לשקף את תהליך האיזומריזציה.
מדובר בזמן קצר מדי עבור השלמת תנועת פיתול אטית יחסית של הרטינל סביב הקשר המיועד .תוצאות של
ניסוי אשר נעשה במעבדתנו )ויתואר בפרוט בהמשך( מוכיחות באופן חד משמעי כי האיזומריזציה חייבת
להתרחש בשלב המעבר . I → Jלפי ממצאי ניסוי זה ,חתך המשטח האלקטרוני המעורר של BRלפי
קואורדינטת האיזומריזציה של הכרומופור הוא בעל אופי קושר ולא ראקטיבי )כפי שהוצע במודל שתי רמות(
והגאומטריה של הכרומופור המעורר בבקטריורודופסין קרובה לזו של המגיב .86משמעות הדבר היא שקיים
קושי לנטר בזמן אמת את תהליך ההיפוך הפנימי בבקטריורודופסין וברודופסינים ארכיאליים אחרים .דילוג של
אוכלוסיה מעוררת חמה מעל המחסום המפריד אותה מהחתך הקוני )ומנהור שלה דרכו( מתבצע בקלות
ובמהירות לעומת תהליך זה במקרה של אוכלוסיה קרה .בגדול ,לא מדובר בתהליך קוהרנטי והפיכתו לכזה,
במטרה לאפשר חקר שלו בנוחות באמצעות הכלים העומדים לרשותנו ,תצריך גישה ניסיונית מורכבת.
ברור לנו שאיזומריזציה של הכרומופור בתוך החלבון מתרחשת בסביבה מופרעת סטרית ,זאת להבדיל
מאיזומריזציה של RPSBבתמיסה .לכן נצפה שיהיה שוני כלשהו בין מנגנוניה בשני מקרים אלה .תפיסה
מקובלת לגבי מנגנון האיזומריזציה של פוליאנים בתמיסה היא סיבוב של קשר כפול אחד ) איור 21חלק עליון(.
פרדיגמה זו בעייתית במקרה של פוליאנים העוברים איזומריזציה במדיום קפוא או בכיס חלבון הדוק .היפוך
סביב קשר כפול אחד מצריך את הנפח המקסימלי עבור התגובה והנפח הזה פשוט אינו זמין בסביבה הדוקה.
פוטו – איזומריזציה של רטינל ברודופסינים ארכיאליים מתרחשת בסקלת זמנים שבה האתר הפעיל של החלבון
אינו מספיק להתארגן מחדש ועל ידי כך לספק את הנפח הנדרש לאיזומריזציה לפי תרחיש זה .אולם,
האיזומריזציה עדיין מתרחשת בחלבונים ובמדיה "קפואים" אחרים .כיצד ,אם כן ,התהליך יוצא אל הפועל?
21
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
שני מנגנונים "משמרי נפח" הוצעו עבור איזומריזציה סביב קשר כפול בסביבה הדוקה .הראשון הוא
מנגנון דוושת האופניים המתואר בחלקו האמצעי של איור .7321לפי מודל זה שני קשרים כפולים מתהפכים
באופן מוסכם אחד אחרי השני .במודל זה ,סידור מחדש של השלד הפוליאני מצריך סיבוב של ◦ 180של שתי
יחידות C− Hבלבד ולא של חצי מולקולה כפי שמוצע במודל היפוך סביב קשר כפול אחד .אי לכך,
איזומריזציה לפי מנגנון זה דורשת פחות נפח .לפי מודל זה ,בליעה של פוטון יחיד על ידי הכרומופור תביא
לאיזומריזציה של שני קשרים כפולים שלו וזאת לא התוצאה בפועל .חישובים מראים כי שינוי קונפורמציה
במנגנון דוושת אופניים יכול להתרחש סביב שני קשרים יחידים ,במצב יסוד .מודל שני לאיזומריזציה משמרת
נפח הוא מודל היפוך חישוק – .74Hula Twist HTמנגנון זה מוצג בחלקו התחתון של איור .21לפי מודל זה
איזומריזציה מאותחלת על ידי היפוך יחידת C−Hאחת בלבד .שימור הנפח במקרה זה הוא מקסימלי ומכיוון
שבשלב ההתחלתי של התהליך סידור מחדש של השלד הפוליאני הוא מקומי ומינורי ,איזומריזציה המתרחשת
לפי מודל זה יכולה להיות מהירה מאוד .כפי שכבר אמרנו ,נכון להיום לא ידוע מהו התרחיש הדינמי הנכון עבור
איזומריזציה של הרטינל ברודופסינים ארכיאליים .גילוי המנגנון הנכון מהווה את אחת המטרות החשובות של
מחקר תהליכים מושרי אור אולטרה מהירים בחלבונים אלה.
בעת העירור האלקטרוני הכרומופור עובר שינוי מומנט דיפול גדול ,מסדר גודל של ,15Dזאת כי
בעקבות העירור מתרחשת תזוזה של מטען חיובי מבסיס שיף אל עבר טבעת βיונון .זרימה זו של מטען נחזתה
בעבודות תאורטיות ואומתה בסופו של דבר בניסויים . 76,75ככל הנראה ,קיים קשר סיבתי בין מעבר המטען בזמן
העירור לבין אופנים ויברציוניים המעורבים בתהליך האיזומריזציה .במיוחד ,תנועת הפיתול של השלד הפוליאני
של הרטינל יכולה להסתייע בהצטברות של מטענים מנוגדים בקצוות השונים של המולקולה .חישוב ab initio
שנעשה לא מזמן מראה כי מומנט הדיפול עולה בזוויות דהידרליות גדולות של הקשר .77 C13=C14הסבר
פשטני לכך הוא שתנועת הפיתול משבשת את החיבור בין שני קצוות המולקולה ובכך עוזרת למקם את
המטענים .כלומר תנועת הפיתול מייצבת את מומנט הדיפול אשר מסייע לה לצבור אמפליטודה .השערת הקשר
בין שינוי מומנט הדיפול של הכרומופור לבין הדינמיקה
המובילה לאיזומריזציה שלו נתמכת בעובדה שהוכחה
ניסיונית :ללא קיטוב של הרטינל אין לבקטריורודופסין
מעגל אור .ממצא זה עולה מעבודות שנעשו על פיגמנטים
בהם הרטינל הוחלף בכרומופורים מלאכותיים אשר לא
עוברים שינוי מומנט דיפול גדול בעת העירור.78
ננסה כעת לכמת את תהליך ההיפוך הפנימי
במערכות אלה ולצורך זה נתאים פונקציות דעיכה
אקספוננציאליות לחלקים הדועכים של העקומות באיור
.19מהר מאוד נגלה את שכבר גילו חוקרים בתחום :לא איור :22התאמה בי אקספוננציאלית של דעיכת
הפליטה המאולצת ב – .pHRהקו השחור מראה את
ניתן להשיג התאמות מונו – אקספוננציאליות סבירות הפליטה המאולצת ,האדום הוא ההתאמה הניתנת על
ידי סכום של הרכיב המהיר )ירוק( והרכיב האיטי
באף אחד מהמקרים .כך הדעיכה של המצב האלקטרוני )כחול( קבועי הדעיכה המהיר והאיטי הם 2ו – 4.4ps
המעורר בהלורודופסין ,כפי שהיא משתקפת בהעלמות בהתאמה ,באורך גל זה.
22
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
הפליטה המאולצת שלו ,היא טרי אקספוננציאלית .בזמנים מוקדמים עקומת הדעיכה מותאמת בצורה טובה על
ידי סכום של שלושה אקספוננטים עם קבועי דעיכה של 2ps ,0.22ps :ו – ) 4.5psתוצאות שלנו( .איור 22מציג
התאמה בי אקספוננציאלית ,עם שני הרכיבים האטיים ,של הפליטה המאולצת של פיגמנט זה .רכיב מהיר נדרש
על מנת להתאים בצורה טובה אזורים ספקטרליים אחרים .גם במקרה של RPSBבתמיסה התאמה טובה
מתקבלת על ידי סכום של שלשה אקספוננטים עם הקבועים הבאים ,100fs ,1 – 2ps :ו – 4עד .82,81,80,79,137ps
עבור בקטריורודופסין דווח על דעיכה טרי אקספוננציאלית עם הקבועים 90fs – 60 ,0.9ps – 0.6ו – 13ps – 9
עוד בשלבים מוקדמים של מחקר אולטרה מהיר של חלבון זה.102,83
הראינו כאן רק שני מקרים מייצגים של דינמיקה לא אקספוננציאלית של היפוך פנימי ברודופסינים
ארכיאליים ,אך זהו ממצא שכיח במשפחת חלבונים זו .40,85,84הגור מים למולטי אקספוננציאליות אינם ידועים
והוצעו מספר מודלים בניסיון להסביר אותה .מקור הקושי במתן הסבר ממצה לתופעת הדעיכה המולטי –
אקספוננציאלית של המאפיינים הספקטרליים של המצב הפלואורסצנטי בחלבונים רטינליים ארכיאליים הוא
במורכבות של מולקולות ביולוגיות גדולות אלה .חישוב הטופוגרפיה המדויקת של משטחי הפוטנציאל
האלקטרוניים המעורבים בפוטוכימיה שלהן ,כפונקציה של הקואורדינטות המולקולריות של הכרומופור וסביבת
האופסין ,אינו פשוט .לאור חוסר ידיעת הטופוגרפיה של S1ניתן להציע מודלים שונים בניסיון להסביר את
הדינמיקה הלא אקספוננציאלית של היפוך הפנימי של הכרומופור המעורר ,כל מודל יתאים לתוואי אחר של
המשטח העליון .אחת מהמטרות היותר שכיחות של ניסויים כגון אלה הנעשים במעבדתנו על רודופסינים
ארכיאליים היא קבלת רמזים אודות הטופוגרפיה של המשטח האלקטרוני המעורר שלהם .87,86רמזים אלה יעזרו
לנו בסופו של דבר לשפוט לטובת מודל זה או אחר .להלן מספר הסברים מקובלים למולטי אקספוננציאליות של
תהליך ההיפוך הפנימי ברודופסינים ארכיאליים וב – .RPSB
מפתה לפרש את הדעיכה המו לטי – אקספוננציאלית כביטוי לקיום צורונים מעוררים שונים )כאלה
שניתן להבחין ביניהם( .כל צורון דועך בקצב אופייני לו .אם קיימים שלושה צורונים מעוררים כאלה במקרה של
) BRכמספר רכיבי הדעיכה( הגיוני לצפות כי הללו ניתנים להבדלה על סמך ספקטרה בליעה ו/או פליטה שלהם.
לדוגמה ,אם הצורונים נבדלים על ידי ספקטרה בליעה שלהם נצפה כי הבליעה של כלל האוכלוסיה המעוררת
תעבור הסחה עם הזמן כאשר מספר הצורונים הדועכים מהר יתמעט והאוכלוסייה המעוררת הנותרת תורכב
ברובה מצורונים הדועכים לאט .אם ננסה ליישם מודל זה על ,BRנגלה כי לא ניתן להבחין בין הצורונים
המעוררים השונים על סמך המאפיינים הספקטרליים שלהם .האמפליטודה היחסית של רכיבי הדעיכה השונים
זהה על פני תחום תדרים רחב בנראה וספקטרה הפרש בליעה של BRב – 1psוב – 0.2psזהים למעשה ,עד
כדי הכפלה בקבוע שלא תלוי באורך גל .אם אכן קיימים צורונים מעוררים שונים של בקטריורודופסין הם חייבים
להיות אקוויוולנטיים מבחינה ספקטרוסקופית ,הן בבליעה והן בפליטה.
דינמיקה לא אקספוננציאלית של היפוך פנימי ברודופסינים ארכיאליים יכולה להיגרם על ידי הטרוגניות
קונפורמציונית של האופסין .סביבת האתר הפעיל יכולה ברגע נתון לאכלס תת – רמה קונפורמציונית מסוימת
בעוד שחלבונים אחרים באוסף מאכלסים תת רמות אחרות .המעבר בין המצבים הקונפורמציוניים השונים
משופעל ת רמית ומתבצע בקלות בטמפרטורת החדר .מכיוון שלסביבת החלבון השפעה ניכרת על הפוטוכימיה
של הרטינל ,בכוחו של שוני קונפורמציוני עדין בין האתרים הפעילים של החלבונים באוסף לעמוד מאחורי
23
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
הקצבים השונים של ההיפוך הפנימי אשר נצפים בניסוי.
מודל דיפוזיוני .מודל זה מניח כי לא קיים מחסום בין אזור של משטח הפוטנציאל המעורר בו ממוקמת
חבילת הגלים הוויברציונית על ידי פולס ה – pumpלבין האזור של החתך הקוני בין המשטח המעורר למשטח
התחתון ,כלומר הוא תולדה של מודל שתי רמות אלקטרוניות אשר מתואר בחלקו השמאלי של איור .20המודל
הדיפוזיוני מסביר קצב התחלתי גבוה של ההיפוך הפנימי על ידי תנועה התחלתית מכוונת של האוכלוסיה
המעוררת אל עבר החתך הקוני .בהגעת חבילת הגלים אל מינימום של המשטח המעורר )אזור החתך הקוני(
התנועה המכוונת ההתחלתית שלה הופכת להיות רנדומלית והחבילה מתרחבת ועוברת דיפוזיה .בשלב זה קצב
ההיפוך הפנימי מואט בשל איבוד ההכוונה של התנועה של חבילת הגלים הויברציונית.90,89,88
מודל הקירור הויברציוני הוא מודל המניח קיום מחסום בדרכה של חבילת הגלים הויברציונית אל החתך
הקוני .הצבת מחסום פוטנציאל קטן אשר יוצר מינימום מקומי על המשטח המעורר ומעקב את האוכלוסיה
המעוררת ,תגרום לקצב ההיפוך הפנימי שלה להיות תלוי טמפרטורה .בהתחלה הטמפרטורה האינטרה –
מולקולרית עשויה להיות גבוהה כתלות בעודף האנרגיה של הפוטון המעורר .אוכלוסיה חמה כזאת יכולה
להתגבר ביתר קלות על המחסום וקצב ההיפוך הפנימי ההתחלתי יהיה גבוה .כעבור זמן ,האוכלוסייה תתקרר
ובעקבות כך קצב מעבר המחסום יקטן ,מה שיקטין בתורו את קצב ההיפוך הפנימי.
שכלול של מודל קירור ויב רציוני פשוט הוצע בעבודה תאורטית אשר פורסמה על ידי Olivucci
וקולגות .הם בחנו את תהליך הפוטואיזומריזציה 11−cis → all −transשל ,RPSBתהליך המתרחש
בפיגמנטי ראייה .החוקרים הצליחו להראות באמצעות בניית מודל של דינמיקה גרעינית על גבי משטח
פוטנציאל אלקטרוני מעורר ,במערכת קואורדינטות מולקולריות דו ממדית פשוטה ביותר ,הכוללת את
קואורדינטת המתיחה של השלד הפוליאני של הרטינל ואת קואורדינטת הפיתול סביב הקשר המיועד
לאיזומריזציה ,כי דינמיקת ההיפוך הפנימי במערכת מודל זו תהיה בי אקספוננציאלית רק באותם המקרים בהם
קיים מינימום מקומי על המשטח המעורר .במקרים בהם למשטח הפוטנציאל האלקטרוני המעורר אין מינימום
מקומי ,כלומר אין מחסום שמפריד בין חבילת גלים ויברציונית אשר ממוקמת על המשטח העליון בעת העירור
לבין החתך הקוני ,לדינמיקת ההיפוך הפנימי יהיה אופי מונו – אקספוננציאלי מובהק .ההסבר שניתן על ידי
החוקרים לתוצאות הסימולציה שלהם הוא שהמחסום הקטן על גבי S1בורר מסלולים של חבילת הגלים
הויברציונית .ישנם מסלולים מסוימים אשר עוקפים את המחסום ואחרים ,לעומתם ,לא .אוכלוסיה שעקפה את
המחסום תגיע מהר יחסית לאזור החתך הקוני ,כתוצאה מכך ,היפוך פנימי שלה יהיה מהיר .החלק הנוטר
מחבילת הגלים הויברציונית ההתחלתית ייעצר על ידי המחסום .שארית חבילת גלים זו תעבור דיפוזיה המלווה
על ידי קירור ויברציוני של האוכלוסיה המרכיבה אותה .אוכלוסיה עצורה זו תעבור היפוך פנימי משופעל תרמית
ו/או תתמנהר דרך המחסום הנמוך .קצב ההיפוך הפנימי שלה יהיה נמוך יחסית.91
מודל אחרון שנבחן הוא מודל ריבוי אוכלוסיות .מודל זה הוא מעין גרסה מוגמרת של מודל ריבוי
צורונים מעוררים .לפיו ,קיימות מספר אוכלוסיות מעוררות שונות .כל אחת מהאוכלוסיות נמצאת באזור מוגדר
ומבודד של המשטח המעורר ומגיעה לשם בעקבות פיצול של האוכלוסייה המעוררת הראשונית .מידת
הראקטיביות של כל אחת מאוכלוסיות אלה שונה .כך ישנן טענות כי ב – RPSBמעורר בתמיסה כל אחת
מהאוכלוסיות הללו מובילה לתוצר מסוים ,כלומר איזומר מסוים של הרטינל מתקבל מכל אחת
24
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
מהאוכלוסיות . 93,92,82מודל זה היה המודל המקובל להסביר את המתרחש ב – .sHRלפיו ,קיימות שתי
אוכלוסיות מעוררות של פיגמנט זה ,איזומר 13−cisשל הכרומופור מתקבל מאוכלוסיה המעוררת הדועכת
מהר ,היא האוכלוסיה הראקטיבית .אוכלוסיה זו מובילה גם בחזרה למגיב ,כלומר היעילות הקוונטית של
האיזומריזציה של מולקולות מעוררות השייכות לאוכלוסיה זו קטנה מ – .1האוכלוסיה הדועכת לאט היא
אוכלוסיה לא ראקטיבית החוזרת כולה אל המגיבים .נציג בחלק הבא את הממצעים הניסיוניים אשר הוליכו
חוקרים למסקנה זאת.
ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה של הלורודופסין .תוצאות מחקרים קודמים.
מחקרים ראשונים שיישמו את
שיטות ) pump – probeעקרונותיה
מפורטים בחלק הניסיוני( על sHR
הושלמו כעבור זמן לא רב אחרי הגילוי של
פיגמנט זה ואפיונו כמשאבת כלורידים.
העבודה הראשונה בנושא היא של
Polland,
Oesterhelt,
Zinth
וקולגות .94המאמר שלהם מ – 1985מסכם
תוצאות של ניסוי pump – probe
הנעשה על .sHRבין היתר ,מוצגים בו איור :23ספקטרום הבליעה והפליטה
ספקטרה steady stateשל חלבון זה .אורכי הגל של פולסי .probe
של .sHRהחצים מסמנים את
מדידת מקדם הבליעה ב – 578nmנותנת . 5×10 4 M −1 cm−1ספקטרום הפליטה של הפיגמנט )איור (23
מוסט בכ – 4000cm-1ביחס לספקטרום הבליעה ) (Stokes shiftוהיעילות הקוונטית לפלואורסנציה נמדדה:
. =5± 2×10−4ההפרדה הזמנית הניתנת על ידי הקרוס קורלציה ) (cross – correlationשל ה – pump
) ( λ max =540 nmעם ה – ) probeהחצים באיור 23מצבעים על ארבעת אורכי גל בהם נעשתה הדגימה( הייתה
איור :24הפרש צפיפות אופטית כנגד הזמן ב -
646nmשל .sHRהכוון החיובי של הציר האנכי מסמן
עלייה בצפיפות האופטית של הדגם שבמקרה הנ"ל
מתפרשת כבליעה של תוצר ראשון במעגל האור אשר
נמצא במצב יסוד אלקטרוני ,הוא .sHR600
קצת יותר טובה מ – .5ps
הניסוי חשף בליעה של תוצר המוסטת לאדום
ביחס לבליעתו של ,sHR578זאת ניתן לראות מהגרף
העולה באיור 24המציין שינוי בצפיפות האופטית של
הדגם כפונקציה של הזמן באורך גל של .646nmלחלק
החיובי של הגרף ניתן להתאים אקספוננט דועך ,וקבוע
הדעיכה הנותן את ההתאמה הטובה ביותר הוא .5ps
מנתונים באורכי גל אחרים מתקבל כי המצב המעורר
הראשוני גם הוא דועך אקספוננציאלית עם אותו קבוע.
מכיוון שההתאמה הטובה ביותר לזמן עליית
התוצר המוסט לאדום) sHR600 ,תוצר " ,("Kהייתה על
25
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :25שני המודלים המסבירים את הממצעים הניסיוניים .המודל הראשון ) (Iמניח שבליעת
התוצר אכן נבנית אקספוננציאלית עם הקבוע .5psהמודל השני ) (IIלוקח בחשבון את הגבלת
ההפרדה הזמנית ומציע קיום של שתי אוכלוסיות שונות במצב המעורר ,האחת דועכת
אקספוננציאלית למצב התחלתי עם הקבוע 5psוהשנייה מובילה מהר יותר לתוצר .K
גבול הרזולוציה הזמנית של הניסוי ,החוקרים הסתייגו והציעו שני מודלים אפשריים להתפתחות המצב
האלקטרוני המעורר של . sHRהמודל הראשון תקף עבור סיטואציה שבה המצב המעורר אכן דועך
אקספוננציאלית עם הקבוע של 5psומצב Kמופיע באותו קצב בדיוק .זהו מודל קינטי פשוט ,המסוכם בחלק
השמאלי של איור .25המצב המעורר הראשוני ,S1 ,עובר היפוך פנימי שבמהלכו מתרחשת התפצלות ,חלק
מהאוכלוסייה המעוררת חוזרת למצב היסוד בקונפיגורציה all – transוחלק שני עובר איזומריזציה ומגיע
למצב יסוד בקונפיגורציה . 13−cisהמודל השני )איור ,25חלק ימין( מתאר סיטואציה שבה התוצר Kמופיע
מהר יותר ממה שרזולוציית זמנים בניסוי זה מאפשרת לראות .במודל זה שתי אוכלוסיות שונות קיימות בו זמנית
במצב המעורר ,האחת S1דועכת עם קבוע > 5psומובילה בסופו של דבר לתוצר ,Kוהשנייה ' ,S1מתפתחת
איור :26ספקטרום ההפרש של sHRכפונקציה של ההשהיה בין ה – pumpל – .probeהאזור
הספקטרלי בין 540ל – 620nmלא מוצג .אזור זה חופף עם בליעת מצב היסוד ונשלט על ידי
סיגנל שלילי הנובע מהעדר אוכלוסייה במצב היסוד עקב עירורה .מכחול לאורכי גל אלה רואים
סיגנל חיובי המיוחס לבליעת המצב המעורר ,מאדום ל – 620nmרואים סיגנל שלילי ,זוהי פליטה
מאולצת מהמצב המעורר .סיגנל חיובי העולה עם ההשהיה סביב 645nmנגרם על ידי התוצר .K
26
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :27הפרשי צפיפות אופטית כנגד הזמן ב – ,720nmסיגנל שלילי באורך גל זה
מיוחס לפליטה מאולצת של המצב המעורר ,Iוב – ,645nmבאורך גל זה נצפית
הבליעה של התוצר .Kרואים כי הפליטה המאולצת של Iממשיכה לדעוך )עם קבוע
של (2.3psאחרי שהבליעה של התוצר נבנתה.
מהראשונה ודועכת אקספוננציאלית עם הקבוע 5psלמצב היסוד ההתחלתי .all – transהחוקרים מציינים כי
התנאים בהם נעשה הניסוי אינם מאפשרים לשפוט לטובת מודל זה או אחר.
סדרה של עבודות על sHRנעשתה בתחילת שנות התשעים על ידי H. Kandoriוקולגות במטרה
לחקור תהליכים ראשוניים בהלורודופסין כחלבון מייצג של משפחת הרודופסינים הארכיאליים .97,96,95ספקטרום
של המצב המעורר של sHRאופיין לראשונה ,ובין היתר נמצא שבליעתו מוסטת לכחול, max =516nm ,
ביחס לספקטרום הבליעה של מצב היסוד .החוקרים התאימו קבוע דעיכה של 2.3psלמאפיינים הספקטרליים
של המצב המעורר )מצב " "Iשל , sHRאיור (26והפעם ההפרדה הזמנית המדווחת ,0.6ps ,לא היוותה גורם
מגביל בקביעת קבוע הזמן של הדעיכה .העבודות האלה הראו שהעלייה של בליעת התוצר Kבאזור 645nm
מהירה יותר מהדעיכה של ספקטרום ההפרש של מצב ) Iאיור .(27לטענת החוקרים ,עלייה מהירה כזאת אינה
יכולה להיות מוסברת על ידי מודל פשוט כגון זה הנראה בחלקו השמאלי של איור .25לפי המודל המוצע על
ידם התוצר Kמתפתח ישירות מהאוכלוסיה המעוררת הראשונית ,אוכלוסיית אזור Franck – Condonשל
משטח פוטנציאל אלקטרוני מעורר ,טרם דעיכתה לאזור המגדיר את מצב .Iלטענתם ,מצב Iשהם גילו ואפיינו
אינו חלק ממעגל האור של .sHRהמודל שהוצע על ידי Kandoriמסוכם באיור .28
התקדמות משמעותית בשנות ה – 90של אמצעים
ושיטות בתחום הספקטרוסקופיה האולטרה מהירה אפשרה
חקר של חלבונים רטינליים בתחומים ספקטרליים רחבים
ובהפרדה זמנית משופרת .במחקר שנעשה על sHRב – 1995
על ידי Zinthוקולגות בהפרדת זמנים של 100fsנמצא כי
ההתאמה המונו – אקספוננציאלית הטובה ביותר )עם קבוע
דעיכה של (3.6psלמאפיינים הספקטרליים של המצב
הפלואורסצנטי ,Iמניבה תוצאות אשר מראות סטייה הן בזמני איור :28במודל המתואר כאן מצב Kנוצר
השהייה )בין pumpל – (probeהקצרים והן בארוכים )איור ישירות מהאוכלוסייה המעוררת באזור – Franck
,Condonהתגובה מתרחשת לאורך קואורדינטה
29חלק שמאלי( . 98לאחר שלא הצליחו להתאים אקספוננט רוטציונית של הקשר C13 = C14בפחות
מפיקושנייה אחת .מצב Iבסכמה זאת )*(hR
יחיד ,ניסו החוקרים התאמה מולטי אקספוננציאלית והראו כי מיוצר כתוצאה מתהליך רלקסציה במצב המעורר.
קבוע הדעיכה עבור צורון זה – .2.3ps
ניתן לקבל התאמה בי אקספוננציאלית טובה עבור דעיכת
27
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :29בצד שמאל נראים הפרשי צפיפות אופטית בארבעה אורכי גל probeמייצגים .הסיגנל החיובי
ב – 465nmמיוחס לבליעת המצב המעורר .Iהסיגנל השלילי ב – ,578nmמרכז פס הבליעה של מצב
היסוד ,נגרם מה – photobleachingשל מצב יסוד )העדר אוכלוסייה( .סיגנל שלילי ב – 884nmהוא
בליעה של המצב המעורר וב – 687nmבליעת התוצר הולכת ונבנית בסקלה של פיקושניות .הנקודות
מראות באילו השהיות בין ה – pumpל – probeספקטרום ההפרש נדגם .קווים מקוטעים מראים את
ההתאמה המונו אקספוננציאלית הטובה ביותר עם הקבוע של ,3.6psהקווים הרציפים מראים את
ההתאמה הבי אקספוננציאלית עם הקבועים של 1.5nmו – 8.5nmבכל אורכי הגל חוץ מב 687nm -
שם נדרש רכיב אקספוננציאלי נוסף של 0.17psעל מנת לקבל התאמה טובה בזמני ההשהיה הקצרים.
בחלק הימני של האיור נראים ספקטרה המזוהים עם הדעיכות האקספוננציאליות השונות – .DASחלק
dשל האיור בצד ימין משווה את האמפליטודות של ה – .DASאמפליטודות של הרכיבים האטיים
פרופורציוניות בכל התחום הספקטרלי הנמדד חוץ מב 550 -עד .700nmה – DASהמהיר מופיע רק
בין 600ל – .700nm
ספקטרום ההפרש של ,Iעם קבועי הדעיכה של 1.5ו – ,8.5psכמו כן ,נמצא כי בתחום ספקטרלי מ – 550עד
700nmמופיע רכיב אשר דועך הרבה יותר מהר ,עם קבוע של .0.17psמידע חדש זה אודות דינמיקת תהליך
ההיפוך הפנימי ב – sHRדרש התייחסות .מה המשמעות של דינמיקה מולטי אקספוננציאלית במקרה זה? האם
ניתן לייחס את הדעיכות השונות לתהליכים שונים או שמה מדובר בפאזות שונות של אותו תהליך? בהנחה
שמולטי אקספוננציאליות משקפת תהליכים שונים של חזרת האוכלוסייה המעוררת אל המשטח התחתון האם
מדובר בתהליכים מקבילים או עוקבים?
על מנת לענות על חלק מהשאלות הנ"ל החוקרים ביצעו מיפוי ספקטרלי של רכיבי הדעיכה וקיבלו
שורה של ספקטראות המזוהים עם רכיבי הדעיכה השונים ,אלה נקראים DAS – Decay Associated
,Spectraהם מוצגים בחציו הימני של איור ) 29הסבר מפורט לשיטת ההתאמה הגלובלית אשר מניבה את ה –
DASמופיע בחלק הניסיוני( .ה חוקרים מבאים שני הסברים אפשריים לדעתם למולטי אקספוננציאליות של
דינמיקת ההיפוך הפנימי .שני ההסברים מבוססים על הנחת קיום אוכלוסיות מעוררות שונות:
.Iקיימת אי הומוגניות במצב היסוד של ההלורודופסין ,כלומר הדגם מכיל שתי אוכלוסיות במצב היסוד
הנבדלות זו מזו ,לאחר עירורן ,בקצבי ההיפוך הפנימי ובתכונות ספקטרליות של המצב המעורר
28
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
)החוקרים מצבעים על השוני של שני ה – DAS
באזור של .(650nm
.IIמתרחש פיצול מוקדם ,מהיר מאזור – Franck
Condonשל המשטח המעורר לשתי
אוכלוסיות מעוררות שונות ,התהליך המהיר הזה
הוא המייצר את הדעיכה עם הקבוע של .0.17ps
אחת משתי האוכלוסיות הנוצרות על המשטח
הפוטנציאל העליון היא אוכלוסיה ראקטיבית
העוברת בחלקה היפוך פנימי אל עבר התוצר K
ובחלקה השני ,בחזרה אל המגיבים .האוכלוסיה
השנייה לא ראקטיבית לחלוטין ועוברת היפוך
פנימי בכוון המגיב באזור אחר של משטח
הפוטנציאל המעורר.
המודל השני )סיכומו מוצג באיור (30מתייחס
גם ליעילות קוונטית נמוכה של .sHRשני הפיצולים של
האוכלוסייה המעוררת הראשונית של הלורודופסין בדרך איור :30חלק עליון של איור זה מציג דיאגרמת רמות
אפשרית עבור התהליכים הראשוניים ב – .sHRחלק
אל התוצר מורידים את הניצולת הקוונטית .הפיצול
תחתון מראה באופן סכמתי את משטחי הפוטנציאל
הראשון ,המהיר מאזור FCשל המשטח העליון מחלק )התחתון ,S0והעליון (S1כפונקציה של קואורדינטות
הראקציה .שני הערוצים האפשריים של דעיכת המצב
את האוכלוסייה המעוררת באופן שווה בין הערוץ המעורר הראשוני נמצאים לאורך הקואורדינטות
הרלוונטיות .המקור המולקולרי של שני ערוצי תגובה
הראקטיבי והלא ראקטיבי והפיצול השני בעת ההיפוך
יכול להיות הטרוגניות שלה או פיצול של האוכלוסייה
הפנימי של האוכלוסייה הראקטיבית גורם לאבדן של עוד המעוררת הראשונית לשתי אוכלוסיות שונות במשטח
המעורר.
40%מהתוצר ,בחישוב הכולל ,רק 30%מהמולקולות
המעוררות עוברות איזומריזציה.
החוקרים נמנעו מלהגיד איזו מבין שתי האוכלוסיות היא ראקטיבית ואיזו לא .הטענה בעד כך
שהאוכלוסייה הדועכת לאט ,עם הקבוע של ,8.5psהיא המובילה לתוצר Kנתמכת על ידי השוני של ה – DAS
באזור הספקטרלי של בליעת מצב היסוד ובליעת התוצר .אם האוכלוסיה האיטית היא ראקטיבית הרי שנצפה
שהאמפליטודה שלה באזור הבליעה של המגיב תהיה קטנה יותר ובאזור הספקטרלי שבו התוצר בולע שם
האמפליטודה תהיה גדולה יותר וזאת כי האוכלוסיה הראקטיבית מובילה ברובה לתוצר ולא למגיב .ה – DAS
של 8.5psמתנהג בדיוק כך ,רואים זאת בחלקו הימני התחתון של איור .29מצד שני ,משיקולים תאורטיים
פשוטים ניתן לצפות כי האוכלוסייה הראקטיבית עוברת היפוך פנימי דרך חתך קוני של משטחי הפוטנציאל,
כלומר באזור שבו שני המשטחים מתקרבים ,באזורים כאלה קצב ההיפוך הפנימי צפוי להיות מהיר יותר .לפי כך
האוכלוסייה הדועכת מהר צריכה להיות זאת שמובילה לתוצר.
בעבודה של T. Kobayashiמ – 1997ישנה התייחסות לצורת פס הפליטה המאולצת .99פס זה מתחיל
לצבור אמפליטודה בערך ב – 650nmומסתיים באינפרה אדום קרוב .באיור 26הספקטרה הטרנזיינטיים
29
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
נקטעים באזור ה – 780nmונראה כי פס
הפליטה דועך שם ,אך Kobayashi
מציג נתונים בתחום אורכי גל רחב יותר
ומראה כי ישנם שני שיאים לפליטה
מאולצת ,האחד ב – 730nmוהשני ב –
,860nmהשיאים מופרדים על ידי
מינימום הנופל סביב ) 780nmאיור .(31
לטענתו שני השיאים הללו שייכים
לאותה פליטה ,הנגרמת על ידי אותו
מעבר ,זאת כי שניהם דועכים בדיוק
באותו קצב.
איור :31ספקטרה הפרש בליעה של sHRמעבודתו של .Kobayashi
את
מסביר
Kobayashi
רואים את המבנה של הפליטה המאולצת בעלת שני השיאים ב – 730וב
המינימום סביב 780nmעל ידי חפיפה
– .860nm
בתחום אורכי גל זה של סיגנל שלילי הנובע מפליטה מאולצת עם סיגנל חיובי הנגרם על ידי בליעה של
הפיגמנטים המעוררים )איור 32מציג מודל של צורת ספקטרום הפרש בליעה המתקבלת בעקבות חפיפה כזאת(.
מכיוון שהפליטה והבליעה דועכים אקספוננציאלית עם אותו קבוע ) Kobayashiמסתפק בהתאמות מונו
אקספוננציאליות( ,הוא מייחס את שני המאפיינים הספקטרליים הנ"ל למעברים המערבים את אותה האוכלוסיה,
היא אוכלוסיית , S1המצב האלקטרוני המעורר הראשון .חפיפה זו של בליעה ופליטה באורכי גל ארוכים מ –
650nmקיימת גם ב – pHRויש לכך השלכות חשובות לגבי האופן בו הניסוי שלנו התבצע .מכל מקו ם ,בנושא
של דינמיקת המצב המעורר של הלורודופסין לא היה ל – Kobayashiהרבה מה להוסיף ,הוא ראה כי הבליעה
של התוצר Kמופיעה מהר יותר מההיעלמות של מאפיינים ספקטרליים של המצב המעורר ובכך שחזר למעשה
את התוצאות של Kandoriוקולגות ,תוך כדי אימוץ המודל אשר הוצע על ידם .אך בכל זאת ,ההפרדה הזמנית
שלו הייתה טובה יותר )בערך (250fsוהוא הצליח לכסות תחום רחב יותר של אורכי גל בשיטת הגילוי שלו.
מידע משלים אודות דינמיקה מבנית של צורונים המשתתפים בתגובה פוטוכימית ניתן לקבל משיטות
של ספקטרוסקופיה ויברציונית מופרדת זמן .ניסוי שבו sHRעורר בנראה ונדגם באינפרה אדום נעשה ב – 2005
על ידי F. Petersו – .100R. Diller
הרעיון היה לחקות אחר דינמיקה
ויברציונית של הכרומופור במצב
מעורר באופן ישיר ,בהפרדת זמנים
טובה .כמו בתחום הנראה ,שיטת
pump – probeבאינפרה אדום
מייצרת ספקטרה הפרש צפיפות
אופטית של הדגם עם פולס המעורר
איור :32הדגמה של צורת ספקטרום הפרש בליעה שהיא תולדה של
ובלעדיו ,בתחום הספקטרלי הרצוי ב – חפיפה בין פליטה לבליעה של המצב המעורר.
30
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
.IRבספקטרה אלה סיגנל חיובי נובע
ממעברים ויברציוניים במצב מעורר וסיגנל
שלילי יכול להתפרש כפליטה מאולצת
המזוהה עם מעבר ויברציוני על המשטח
המעורר או כ – photobleachהנגרם על ידי
העדר אוכלוסיה במצב יסוד.
ספקטרום כזה נראה באיור .33פולס קצר
ועצמתי בעל רוחב של כ – 100fsבחצי
הגובה ,ממורכז סביב 570nmמעורר את
הדגם שלאחר מכן נדגם על ידי פולס קצר,
איור :33ספקטראות הפרש צפיפות אופטית ,בזמני ההשהייה אורכו 160fsבחצי הגובה ,בעל רוחב
השונים בין ה – pumpל – probeבאזור של טביעות אצבע של ספקטרלי של 100cm-1ב – .mid IRהפרדה
הספקטרום הוויברציוני.
זמנית מינימלית של ניסוי זה הניתנת על ידי
פונקציית תגובת המכשור ) (Instrument Response Function – IRFהייתה בערך .220fs
אזור ספקטרלי בין 1100ל 1600cm-1מעניין כי פסים ויברציוניים הנגרמים על ידי מתיחות של הקשר
) C – Cהמצומדת לכיפוף ( C – Hוהקשר האתילני הכפול C=Cמופיעים שם וכבר ציינו כי תהליך
האיזומריזציה מערב קואורדינטות מולקולריות אלה .סיגנל שלילי סביב 1203ו – 1167cm-1בספקטרה באיור
33נגרם על ידי bleachשל מצב יסוד .סיגנל חיובי העולה תוך פיקושניות בודדות סביב 1195cm-1מעיד על
האיזומריזציה ,זהו תדר מתיחת קשר , C – Cמצומד לכיפוף , C – Hשל התוצר .K
גם כאן ניתן לפרק את הספקטרום הטרנזיינטי לספקטרה של רכיבי הדעיכה ,ההתאמה הבי
אקספוננציאלית מניבה שני זמני דעיכה אופייניים 1.8 ± 0.1 :ו – , 6.9 ± 0.5psשני קבועים אלה קרובים דיים
לקבועי הדעיכה של המצב המעורר האלקטרוני Iשראינו קודם בעבודתם של Arltו – .Oesterheltלהבדיל
מהתוצאות המוצגות בעבודה ההיא ,יש הבדלים משמעותיים בין ה – DASהשונים ,כפי שרואים באיור .34
באזור מ – 1140עד ) 1240cm-1איור 34חלק שמאל( לספקטרום המזוהה עם הדעיכה של 6.9psאמפליטודה
גדולה באזורים של בליעת התוצר בעוד שספקטרום הדועך תוך 1.8psמראה אמפליטודה משמעותית דווקא
באזור של . 1195cm-1המשמעות היא שהמאפיינים הספקטרליים של התוצר נבנים עם הקבוע של .1.8psהאזור
איור :34ספקטרה מזוהים עם קבועי דעיכה באזורים ספקטרליים של "טביעות אצבע" )שמאל( ומתיחת קשר אתילני
)אמצע( של הכרומופור ב – . sHRמימין :המודל שהציעו החוקרים ,בו קבוע הדעיכה הקטן מבין השניים משוייך לדעיכת
האוכלוסייה הראקטיבית.
31
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
הספקטרלי שבו מופיע פס הבליעה הנגרם על ידי המתיחה האתילנית , C=Cבסביבת ) 1530cm-1איור 34
באמצע( מראה אותה מגמה .גם שם ה – DASהדועך מהר ,עם קבוע של ,2.2psהוא בעל משרעת גדולה יותר
באזור של בליעת התוצר ,ב – .1512cm-1
לאור העובדה שהתוצאות של ניסוי בו הדגימה מתבצעת באינפרה אדום מראים דינמיקה בי
אקספוננציאלית של תהליך ההיפוך הפנימי ובכך הם קונסיסטנטיים עם התוצאות בנראה שראינו בניסוי קודם,
החוקרים מאמצים את מודל הקיום של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות ,שרק אחת מהן מובילה לתוצר .בניגוד
לתוצאות הניסוי בנראה המראות שוני מינורי בין שני ה – DASולכן לא מאפשרות קביעה חד משמעית של
זמני הדעיכה של האוכלוסיות השונות ,הניסוי באינפרה אדום מציג DASשונים מאוד ,והעובדה שהדעיכה
המהירה בונה את התוצר ,מאפשרת במסגרת מודל שתי האוכלוסיות ייחוס של הדעיכה המהירה לאוכלוסיה
הריאקטיבית )איור 34חלק ימין(.
בשנת 2008הגיע תורו של pHRלקבל את מנת תשומת הלב שלו מקהילת חוקרי ה – .ultrafast
במחקר שנערך על ידי Takumi Nakamuraמקבוצתו של Tahei Taharaנבדקה תלות של קינטיקת ההיפוך
הפנימי של פיגמנט זה במצבו המעורר ביון ההליד המועבר על ידו .56יכולתו של pHRלשאוב אניונים אחרים
בנוסף לכלור הייתה ידועה זה מכבר והשפעת סוג האניון על שלבים מאוחרים של מעגל האור נחקרה על ידי
מספר קבוצות.101,42,35
עבודתו של Nakamuraנעשתה בעקבות ממצאים מעניינים שעלו ממחקר של M. Shibataאשר בדק
תלות של תדר המתיחה של קשר N – Dשל רטינל )שעבר דיוטרציה( ב – pHRבהליד הנשאב .31תלות זו
נבדקה במצב יסוד התחלתי all −transובמצב .Kהבדיקה עבור מצב Kנעשתה באמצעות הקפאת הפיגמנט
בשלב זה של מעגל האור שלו .ממצאי ניסוי זה מרוכזים בטבלה הבאה:
pHR – Cl- pHR – Br- pHR – I2458cm-1
2480cm-1
2488cm-1
Initial ground state.
2427cm-1
2375cm-1
2338cm-1
K state.
רואים כי במצב יסוד התחלתי תדר מתיחת N – Dקטן עם הגדלת הרדיוס והמסה של ההליד המועבר .במצב
Kהמגמה היא הפוכה.
תוצאות אלה מעידות על החלשות תלוית הליד של קשר מימן בין הפרוטון של בסיס שיף לצורונים
בסביבתו ,בין מצב ההתחלתי של הכרומופור למצב 13 – cisשלו .על פי האינטרפרטציה של החוקרים ,במצב
all – transקיים קשר מימן בין הפרוטון של בסיס שיף למולקולת מים כפי שרואים באיור ,35ואילו במצב K
הקשר המימני הוא בין הפרוטון להליד .התלות של תדר מתיחת הקשר N – Dבהליד מעידה על מידת
ההשפעה של רדיוס ההליד על שדה הכח של הכרומופור .אין המסה של ההליד צפויה להשפיע על תדר המתיחה
של הקשר כלשהו בכרומופור בשלב מוקדם זה של מעגל האור וזאת כי ההליד נשאר קשור במקומו ההתחלתי
במהלכה של האיזומריזציה והרבה זמן לאחר סיומה .באופן טבעי מעניין לחקור את ההשפעה של סוג ההליד על
דינמיקת תהליך ההיפוך הפנימי של הכרומופור בתקווה שמחקר כזה יספק מידע חדש אודות המנגנון שלו .זאת
הייתה המוטיבציה עבור המחקר של .Nakamura
32
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
החוקרים דווחו הפרדת זמנים של 30fsעבור הניסוי זה כך
שלא הייתה להם שום בעיה לחקות אחר דינמיקה של רכיבים
ספקטרליים מהירים מאוד ,למשל הם מדווחים על רכיב של
בליעת המצב המעורר )מעבר ( S 1 → S nהעולה עם הקבוע של
.50fsעליה מהירה זאת נראית גם בפליטה המאולצת של המצב
המעורר .לטענתם ,הרכיב הזה משקף ריקון של אוכלוסיית
Franck – Condonראשונית ,הממוקמת על המשטח המעורר
על ידי פולס ה – .pumpבעבודה תאורטית שנעשתה על ידי
Massimo Olivucciעל RPSBריקון אזור F – Cשל
המשטח S1של מולקולה זו לאחר עירורה נעשה לאורך
איור :35שינוי בקשר מימן בין
מצב יסוד קואורדינטה של התארכות כלל הקשרים בין הפחמנים בשרשרת
התחלתי לבין מצב Kברטינל של .pHR
הפוליאנית )לא רק קשר C = Cספציפי שעובר איזומריזציה(.91
קרוב לוודאי כי גם ב – pHRמדובר בתנועה של חבילת הגלים הויברציונית על המשטח המעורר לאורך אותה
קואורדינטה .בנוסף ,אכן נצפתה תלות של דינאמיקת ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה בסוג ההליד.
הלורודופסין עורר על ידי פולס pumpשהספקטרום שלו נראה בכתום באיור .36הדגימה נעשתה
בארבעה אורכי גל שונים אשר מכסים את המאפיינים הספקטרליים החשובים של המצב המעורר 490nm :ידגום
את בליעתו ,הדגימה ב – 560nmתראה את ההתנהגות של photobleachשל מצב יסוד כפונקציה של הזמן
והדגימה באדום ,690nm ,נעשית על מנת לבדוק התנהגות של הפליטה המאולצת של pHRמעורר .על מנת
לראות את הופעת התוצר Kבמעגל האור של פיגמנט זה החוקרים דגמו ב – .650nmבחירה של אורכי גל עבור
פולסי הדגימה בניסוי זה מעידה כי החוקרים ציפו
שספקטרום הטרנזיינטי של pHRיזכיר מקרוב את
זה של .sHR
תחילה ,נדגמה ההתנהגות הספקטרלית של
pHR-Clכפונקציה של השהיית ה – probeלעומת ה – ,pumpבאורכי הגל הנ"ל .איור 37
מסכם ממצאי בדיקה זו .דעיכת הבליעה והפליטה
של המצב המעורר משוחזרת טוב על ידי התאמה בי
– אקספוננציאלית עם הקבועים2 =1.4±0.2ps :
ו – 3=4.5±0.2psכזכור בזמנים המוקדמים
נדרש קבוע נוסף. 1=50fs :
בשלב זה של עבודתם החוקרים מאמצים
את מודל שתי האוכלוסיות אשר הוצע כהסבר
למולטי – אקספוננציאליות של תהליך ההיפוך
הפנימי ב – .sHRאינטרפרטציה של תוצאות
איור :36ספקטרה רלוונטיים לניסוי של .Nakamuraבחלקו
העליון של האיור רואים את ספקטראות הבליעה של pHR
הקושר הלידים שונים במצב יסוד ,ספקטרום פולס ה –
pumpנראה בכתום .בחלק התחתון של האיור רואים את
ספקטרה של פולסי ה – .probe
33
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :37הפרשי צפיפות אופטית בין pHR-Cl-מעורר לצורון זה במצב יסוד בארבעת אורכי
גל probeהנראים באיור .36בליעת מצב מעורר נראית ב – ,490nmפליטתו המאולצת ב
– ,690nmקרוב למרכז ספקטרום הבליעה של pHR-Cl-במצב יסוד ב – 560nmרואים
bleachשל מצב יסוד .סיגנל המיוחס ל – Kעולה סביב .650nmהקו השחור מראה את
ההתאמה הבי אקספוננציאלית.
הניסוי שלהם ,המראות תלות של דינמיקת ההיפוך הפנימי בסוג ההליד ,נשענת על ההנחה כי מודל שתי
האוכלוסיות ,הראקטיבית אשר דועכת מהר והלא ראקטיבית הדועכת לאט ,מתאר נכון את המתרחש ב – pHR
מעורר .התלות המוזכרת לעיל מתבטאת בראש ובראשונה בקבועים τ2ו – .τ3ההתאמה הבי – אקספוננציאלית
הטובה ביותר מניבה את הקבועים:
pHR – I-
pHR – Br-
pHR – Cl-
2.2ps
1.6ps
1.4ps
τ2
6.3ps
4.6ps
4.5ps
τ3
לא נצפתה תלות של הקבוע τ1בסוג ההליד.
התוצאות מראות כי הגדלת רדיוס ההליד מגדילה את .τ2מכיוון שקבוע זה משקף את תהליך
האיזומריזציה על פי מודל שתי האוכלוסיות ,מסקנת החוקרים היא שככל שמגדילים את הרדיוס של האניון
האיזומריזציה מואטת .לפי אינטרפרטציה שלהם ,ממצא זה קונסיסטנטי עם ההשפעה של רדיוס ההליד על תדר
מתיחת קשר N – Dאשר נצפתה לפני כן .החוקרים מפרשים השפעה זו כמשיכה הולכת ומתחזקת של הפרוטון
של בסיס שיף במצב all −transאל ההליד עם הגדלת הרדיוס שלו .המשיכה החזקה מאטה את ההיפוך
הפנימי .הקבוע τ3מייצג חזרה של אוכלוסיה לא ראקטיבית אל משטח הפוטנציאל של מצב יסוד .מכיוון שאין
בתהליך זה שום שינוי גאומטרי של הכרומופור ,תלות של קבוע זה בסוג ההליד תמוהה בעיני החוקרים ,הם לא
נותנים הסבר משכנע לממצא זה ולמעשה לא דנים בו.
34
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
הניצולת הקוונטית הכוללת לאיזומריזציה של
הכרומופור גדלה עם הגדלת רדיוס ההליד .כך מפרשים
החוקרים את התנהגות הסיגנל ב – ) 650nmאיור .(38
באורך גל זה הסיגנל החיובי נתרם על ידי בליעה של
התוצר .Kבזמני השהיה ארוכים סיגנל זה הכי עצמתי
במקרה של pHR-I-והכי חלש עבור .pHR-Cl-יש
צורך ליישב פרשנות זאת עם קצבי האיזומריזציה
המשתקפים ב – .τ2לפי מודל מעברים של Landauו
– Zenerהסתברות למעבר באזור של חיתוך עקומות
איור :38הפרשי צפיפות אופטית של ) ,pHR-Br-גרף
ירוק( ) pHR-Cl-אדום( ו – ) pHR-I-כחול( .באורך גל פוטנציאל תגדל ככל שמהירות התנועה של הגרעינים
של 650nmבו עולה סיגנל חיובי המיוחס
לבליעת– )הנתונה על ידי (τ2-1תגדל .החוקרים מיישבים סתירה זו
התוצר .Kהקווים השחורים מראים את ההתאמה הבי
אקספוננציאלית עבור כל אחד מהטרנזיינטים.
על ידי טענה כי חייב להיות משהו שמאט את קצב
ההיפוך הפנימי ולא משפיע על היעילות לאיזומריזציה .לצורך זה הם מניחים קיום מחסום פוטנציאל על המשטח
העליון .מחסום כזה יכול להאט את קצב ההיפוך הפנימי של pHRמעורר במידה שונה עבור כל אחד מההלידים
כי גובהו יכול להיות תלוי במשתנה זה .אחרי ההתגברות של
האוכלוסיה המעוררת על המחסום ,היעילות של האיזומריזציה
הנקבעת על ידי הטופוגרפיה של אזור החתך הקוני שוב תהיה תלויה
בהליד ויכול להיות מצב שבו היא תהיה גבוהה יותר דווקא במקרה
של .pHR-I-קיום מחסום פוטנציאל על המשטח המעורר במקרה
של BRהוכח הלכה למעשה על ידי Ruhmanולא מן הנמנע
שבחלבונים קרובים אלה הטופוגרפיה של המשטח המעורר תהיה
דומה .מודל המוצע על ידי Nakamuraמסוכם באיור .39
עד כאן סיכמנו את מצב התקדמות המחקר של תהליכים
ראשוניים בשני ההלורודופסינים .כפי שהראינו ,פריטי אינפורמציה
חדשים אודות חלבונים אלה מתווספים בכל אחת מהעבודות והפזל
רחוק מלהיות מושלם .השאלה שאנחנו שאלנו את עצמנו כאשר
ניגשנו לחקר pHRהיא עד כמה מודל שתי האוכלוסיות מבוסס
איור :39המודלים המתארים את דינמיקת
עבור הלורודופסינים? מנקודת ראות שלנו ,מודל זה לא בוסס באופן ההיפוך הפנימי של הכרומופור ב – pHR
מעורר .חלק עליון ) (aמודל ללא המחסום.
המספק את הדעת עבור .sHRלא נעשו מספיק מחקרים המעמידים חלק תחתון ) (bמודל המניח קיום מחסום
שמוצע על ידי . Nakamuraסימונים S1r :ו
אותו במבחן .הנחת נכונות מודל זה עבור pHRואינטרפרטציה של
– S1nrהאוכלוסיה הראקטיבית והלא
תוצאות ניסיוניות על סמך הנחה זו כפי שראינו בעבודה של ראקטיבית בהתאמה .קבוע התהליך המהיר
– τ1מתייחס לריקון ההתחלתי של
Nakamuraתמוהה בעיננו ,כמו שאמרנו ,מדובר בשני חלבונים אוכלוסיית .FCהקבוע τ2משקף את קצב
האיזומריזציה והקבוע האיטי τ3את קצב
שונים ומה שעשוי להיות נכון עבור אחד מהם לא בהכרח יהיה נכון החזרה של האוכלוסיה הלא ראקטיבית אל
המשטח התחתון.
עבור השני .הגענו לשלב בו ניתן לנסח את מטרות המחקר שלנו.
35
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
מטרות המחקר ובחירת שיטה ניסיונית.
• מטרתנו הראשונה היא לאפיין את הדינמיקה האולטרה מהירה של ההיפוך הפנימי של pHRמעורר
בתחום ספקטרלי רחב ,באור נראה .הדגימה שלנו תתבצע בכל אורכי הגל מ – 420עד 830nmבאופן
סימולטני .זאת נעשה על מנת להשלים את המידע החסר אודות הספקטרום הטרנזיינטי של פיגמנט זה.
דגימה כזו של pHRמעורר ברזולוציית זמנים של עשרות פמטושניות ,האופיינית למחקרים הנעשים
במעבדתנו על רודופסינים ארכיאליים ,לא בוצעה עד כה.
יתרון של דגימה רחבת תדר ,או בשמה האחר דגימה היפרספקטרלית ,על פני דגימה באו רכי גל נבחרים
באזורים בהם צפויים להופיע מאפיינים ספקטרליים של צורון המעניין אותנו נעוץ בעובדה כי אין ביכולתה של
דגימה בתדרים בודדים לאפיין דינמיקה ספקטרלית .לא נוכל לדעת מתוך הסתכלות על הפרש בליעה כפונקציה
של זמן הדגימה באורך גל בודד האם בזמן מסוים שיא הסיגנל הנצפה הוסט לתדרים גבוהים או נמוכים יותר.
מגבלה נוספת של דגימה בתחום ספקטרלי צר היא שאפס סיגנל יכול לנבוע מביטול הדדי הנובע מחפיפת סיגנל
חיובי עם שלילי בתחום צר זה .הסתכלות על אורך גל נבחר המראה אפס סיגנל כפונקציה של הזמן יכולה
להוליך את החוקרים למסקנה שגויה לגבי תחום תדרים רחב סביב אורך הגל הנדגם והיא ששום דבר מעניין לא
קורה שם .ראינו כבר שחפיפה כזאת של בליעה ופליטה קיימת בתחום בין 650ל – 800nmב – ,sHRוצפי
לראותה גם ב – pHRהוא סביר ביותר.
• המטרה השנייה היא העמדה במבחן של מודל קיום בו זמני של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות של
, pHRכאשר היעד האולטימטיבי מבחינתנו הוא פענוח התפתחותו של המצב המעורר של פיגמנט זה.
את הבדיקה הזאת נעשה באמצעות השיטה שנקרית .Stimulated Emission Pumping – SEP
יתרונה הוא בכך שהיא מאפשרת בדיקה ישירה של נכונות מודל שתי האוכלוסיות ,כך שהתוצאות שהיא
מניבה אינן מתפרשות לשני פנים.
עוצמת שיטה זו הודגמה במעבדתנו ב – 2001במחקר אשר עסק בשלב ראשון של מעגל האור של
בקטריורודופסין . 86באותו זמן מספר שאלות הנוגעות בפוטוכימיה מוקדמת של BRהיו פתוחות .בתור התחלה
לא היה ברור אם המצב האלקטרוני המעורר ) S1המצב הפלואורסצנטי( מהווה שלב ראשון במעגל האור )הוא
שלב " (" I460או שמא מדובר באוכלוסיה מעוררת לא ראקטיבית שלא מובילה לתוצרים מאוחרים במעגל אור של
פיגמנט זה .מודלים אשר שילבו את I460במעגל האור נתמכו על ידי תוצאות ניסיוניות שהשוו תהליכים מושרי
אור ראשוניים בבקטריורודופסין טבעי ובפיגמנט מהונדס אשר החליפו את הכרומופור שלו ברטינל שבו הקשר
C13=C14לא יכול לעבור איזומריזציה עקב נעילתו בטבעת מחומשת של אטומי פחמן .הדינמיקה של BR
נעול וטבעי התפצלה בשלב של דעיכת מצב פלואורסצנטי בעל מאפיינים ספקטרליים זהים בשניהם .הפיגמנט
הטבעי המשיך את מעגל האור והניב את התוצר Kואילו בפיגמנט הנעול דעיכת המצב המעורר הייתה הרבה
יותר איטית ,עם קבוע של 20psלעומת 0.5psבטבעי ,כמו כן ,לא נצפה שום תוצר עם בליעה מוסטת לאדום
במקרה שלו .תוצאות של ניסוי זה רמזו על כך שהדעיכה מ – Iל – Kמשקפת את שלב האיזומריזציה של
הרטינל ב – .BR
כפי שראינו כבר ,ספקטרום ההפרש של I460של BRדועך אך לא משתנה .בין החוקרים שאימצו את
המודל המשלב את המצב הפלואורסצנטי במעגל האור התעוררו חילוקי דעות בנוגע לפרשנויות של סטציונריות
36
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
המאפיינים הספקטרליים של מצב זה .חוקרים אחדים ראו באי התפתחות ספקטרלית של I460הוכחה לכך
שמדובר במצב לכל דבר ,בעל מבנה ואנרגיה מוגדרים ואחרים לעומתם היו סבורים כי הדעיכה של המצב
הפלואורסצנטי משקפת התפתחות של האוכלוסיה המעוררת על גבי משטח פוטנציאל ללא מחסום ,בדרכה אל
אזור החתך הקוני .לטענתם ,ההתפתחות הנ"ל מאופיינת על ידי השתנות של חתכי הפעולה לבליעה ופליטה של
האוכלוסיה המעוררת ולכן לא נכון יהיה לפרש את הדעיכה של המאפיינים הספקטרליים של I460כתהליך אשר
מצביע רק על חזרה של האוכלוסיה המעוררת אל משטח פוטנציאל אלקטרוני תחתון בקונפיגורציה זו או אחרת
של הרטינל.
ניסויי pump – probeברזולוציית זמנים של פמטושניות לא סיפקו תשובות ישירות וחד משמעיות
לשאלות אלה .לכן Ruhmanוקולגות יישמו שיטה המבוססת על שלושה פולסיםpump – dump – probe :
כאשר התפקיד של הפולס הנוסף הוא לגרום ל – ) Stimulated Emission Pumping (SEPשל האוכלוסיה
המעוררת .הכוונה היא להעברה אימפולסיבית של חלק מאוכלוסיה זו בחזרה אל משטח אלקטרוני יסודי על ידי
פולס dumpעצמתי אשר מאלץ פיגמנטים מעוררים לפלוט פוטונים באנרגיה המתאימה למרווח בין S0ל – ,S1
כפונקציה של הקואורדינטות הגרעיניות.
שיטת שלושת הפולסים יכולה לספק תשובות לשאלות לגבי התפתחות של המצב המעורר של BR
באופן הבא .נניח כי הדעיכה עם הקבוע של 0.5psשל המצב הפלואורסצנטי משקפת התפתחות רציפה של
האוכלוסיה המעוררת המלווה על ידי הפחתה אקספוננציאלית של חתך הפעולה לפליטה ובליעה של אוכלוסיה
זו .במקרה כזה אחוז האוכלוסיה המעוררת המועבר על ידי ה – dumpאל המשטח האלקטרוני התחתון צפוי
לקטון עם הדעיכה של המאפיינים הספקטרליים של .I460במקרה שבו מודל "קינטי" מתאר נכון את התפתחות
האוכלוסיה המעוררת ,כלומר האוכלוסיה הזאת איננה מתפתחת אלא עצורה בקונפיגורציה ספציפית אשר
מאופיינת על ידי מבנה לא משתנה וחתכי פעולה קבועים לפליטה ובליעה )במקרה כזה הדעיכה של ספקטרום
ההפרש של I460מתפרשת רק כהפחתה אקספוננציאלית של ריכוז צורון זה( נצפה לכך שהסתברות לאלץ פליטה
על ידי פולס ה – dumpתהיה קבועה ולא תלויה בהשהיה בינו לבין ה – .pumpאי לכך ,ביצוע SEP
בהשהיות שונות בין ה – pumpל – ) dumpכלומר בשלבי חיים שונים של האוכלוסיה המעוררת( עשוי לעזור
להחליט איזה מהמודלים מתאים יותר לתיאור תהליכים מושרי אור ראשוניים ב – .BRבנוסף ,גישה ניסיונית זו
בשילוב עם הערכה איכותנית של השפעת ה – dumpingשל האוכלוסיה המעוררת על הופעת תוצרים
מאוחרים יותר של מעגל האור )למשל (Kיכולה לספק תשובה לשאלת מיקום המצב הפלואורסצנטי במעגל
האור של בקטריורודופסין.
החוקרים עוררו את הבקטריורודופסין עם פולסים ממורכזים סביב 535nmודגמו בשני אורכי גל 900 :ו
– ) 650nmאיור ,40חלק עליון( .הדגימה ב – 900nmנועדה לבחון את השפעת SEPעל האוכלוסיה
הפלואורסצנטית ואילו הדגימה ב – 650nmבוחנת האם ובאיזו מידה ה – dumpingמשפיע על תוצר Kשל
מעגל האור .אורך גל מרכזי של פולסי dumpבניסוי זה היה .1070nmהתרחקות ממרכז פס הפליטה המאולצת
של BRסביב 900nmאל אינפרה אדום עמוק יותר נועדה להוציא את ספקטרום של פולס ה – dumpמאזור
החפיפה של הפליטה עם הבליעה .מקור הטענה כי קיימת חפיפה כזאת בספקטרום הפרש בליעה של
בקטריורודופסין הוא עבודתם של Anfinrud, Hassonו – Gaiמשנת .1021996כפי שראינו קודם,
37
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :40תוצאות הניסוי של Ruhmanו – .Hou
החלק העליון מציג את ספקטרום הבליעה של מצב
היסוד של ,BRאת ספקטרום הפרש בליעה של I460
בהשהיה של 200fsבין pumpל – probeואת
ספקטרה של הפולסים .החלק האמצעי מציג את
הפרש הבליעה כפונקציה של ההשהיה בין ה –
pumpל – probeבאורך גל של .900nmהגרף
המוכנס הקטן מציג את היחס בין הטרנזיינטים
באורך גל זה ,עם ובלי ה – dumpבהשהיות שונות
בינו לבין ה – .pumpהחלק התחתון של איור זה
מציג את הפרש בליעה ב – 900nmעם dumping
בזמנים מוקדמים ובגרף הקטן ,את הפרש צפיפות
אופטית ב – .650nmבאורך גל זה צפויה עליית
סיגנל חיובי אשר נגרם על ידי הופעת התוצר .K
Kobayashiמצא חפיפה דומה באזור הפליטה המאולצת
של ,sHRהיא נצפתה במעבדתנו ב – RPSBולא מן הנמנע
שהיא קיימת גם בחלבונים רטינליים אחרים.103
החלק האמצעי של איור 40מראה את השפעת
SEPבהשהיות שונות בין ה – pumpל – dumpעל
האוכלוסיה הפלואורסצנטית .תוצאות של סריקת הפליטה
המעוררת ללא dumpingמוצגות כ – .referenceהגרף
הקטן בפינה ימנית עליונה מציג את היחס בין טרנזיינט ה –
referenceלבין טרנזיינטים שהתקבלו עם ה – .dumping
נסכם את תוצאות ניסוי זה .עבור השהיות SEP
הגדולות מ – ~200fsחלקי הטרנזיינטים שלאחר ה –
dumpingנופלים אחד על השני )הגרפים של יחס
הטרנזיינטים זהים ,בגבול הרעש ,ללא תלות בתזמון ה –
SEPבטווח של השהיות בין 200ל – .(1000fsלעומת זה,
במקרה שבו הפולס האינפרה אדום מגיע מוקדם יותר פחות
אוכלוסיה מעוררת מועברת אל המשטח התחתון .התוצאות
הללו מספקות אינדיקציה ברורה לכך שהמודל הקינטי מתאר
טוב יותר מהמודל הדינמי את המתרחש בחלבון המעורר.
לאחר זמן קצר שבו האוכלוסיה הפלואורסצנטית עוברת
שינוי דינמי ,ההסתברות ל – dumpingנשארת קבועה כל
עוד קיימת אוכלוסיה זו .תוצאות אלה צפויות רק במקרה שבו
האנרגיה והמבנה של הפיגמנטים המעוררים מוגדרים ולא
משתנים במהלך החיים של המצב .I460
האם מעבר האוכלוסיה המעוררת למשטח התחתון
על ידי ה – dumpמשפיע על ריכוז התוצר Kבמעגל האור
של ?BRהתשובה היא כן ,רואים זאת בברור בחלק התחתון
של איור 40אשר מציג טרנזיינטים ב – 650nmבגרף הקטן
בפינה ימנית עליונה .באורך גל זה צפוי להופיע סיגנל חיובי
הנגרם על ידי הבליעה של ) Kהסיגנל הזה מוצג כאן עם סימן
הפוך ,אך אין זה משנה ,מה שמעניין בתוצאות אלה זה
ההשפעה של ה – SEPעל האמפליטודה של הטרנזיינט ב –
.(650nmקורלציה בין ה – dumpingשל I460לבין הקטנת
האמפליטודה של Kמצדיקה באופן חד משמעי את מיקום
המצב הפלואורסצנטי בסכמת מעגל האור של
38
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
בקטריורודופסין .יותר מזה ,השבר של האוכלוסיה המורחקת ממעגל האור ,המחושב מיחס הטרנזיינטים ב –
900וב – 650nmזהה לחלוטין .מכאן ששום חלק מאוכלוסיה מעוררת אשר מועברת על ידי ה – dumpבחזרה
למצב יסוד לא עובר איזומריזציה תוך כדי .אי לכך ,ניתן לומר בוודאות כי הקואורדינטות הגרעיניות שמגדירות
את I460דומות מאוד לקואורדינטות של מצב היסוד ההתחלתי all −transומצד שני ,שונות מאוד מאלה
המאפיינות את האזור של החתך הקוני בין S1ל – ,S0דרכו הפיגמנטים המעוררים מאכלסים בחזרה את מצב
היסוד בקונפיגורציה all −transו – 13−cisשל הכרומופור.
בניסיון להסביר את האופי הסטציונרי של האוכלוסיה המעוררת בבקטריורודופסין Ruhmanוקולגות
מעלים השערה כי קיים מחסום על S1בין האזור שמגדיר את I460לבין קונפיגורציה שבה משטח פוטנציאל זה
נחתך עם .S0מחסום כזה לא יאפשר שינוי מבני של המצב הפלואורסצנטי ויגרום להצטברות שלו .מולקולות
מעוררות עשויות להתגבר על המחסום באמצעות אקטיבציה תרמית ,אם כי במקרה זה קצב ההיעלמות של I460
צפוי להיות תלוי טמפרטורה וניסויים אשר נעשו על מנת לבדוק קיום תלות מסוג זה לא הניבו תוצאות
חיוביות . 104יחד עם זאת ,תאוריית מחסום העוצר את התפתחות האוכלוסיה הפלואורסצנטית ב – ,BRהנגרם על
ידי avoided crossingשל המשטח S1עם משטח פוטנציאל נוסף ,השוכן מעליו ,קיבלה חיזוק משמעותי
בעקבות פרסום תוצאות ניסוי שלושה פולסים על בקטריורודופסין .מודל זה אומץ גם עבור רודופסינים
ארכיאליים אחרים .ראינו כי Nakamuraבעבודתו מ – 2008מצטט את ממצאי המחקר של Ruhmanומאמץ
את השערת המחסום על מנת לתאר את דינמיקת המצב המעורר ב – ) pHRאיור 39חלק תחתון(.
כיצד הפעלת שיטת שלושת הפולסים יכולה לענות על שאלת קיום שתי אוכלוסיות מעוררות שונות של
? pHRאם אכן קיימות שתי אוכלוסיות ורק אחת מהן )זאת שדועכת מהר( מובילה לתוצר הרי שלביצוע SEP
לא תהיה השפעה על מעגל האור בהשהיות ארוכות בין ה – pumpל – ,dumpכלומר בשלבים מאוחרים של
חיי המצב המעורר ,בהם לא נותרה כמעט אוכלוסיה ראקטיבית על .S1בהשהיות קצרות לעומת זה ,נצפה
להפחתה משמעותית של אוכלוסיית מעגל האור בעקבות dumpingשל האוכלוסיה המעוררת הראקטיבית.
בנוסף ,אם שתי האוכלוסיות המעוררות אכן שונות ,לא סביר שחתך הפעולה לפליטה מאולצת זהה לשתיהן .לכן
אחוז האוכלוסיה המעוררת המועברת למשטח תחתון צפוי להיות תלוי בהשהיה בין ה – pumpל – ,dump
שלא כמו במקרה של .BR
הצלחת טכניקת SEPבמקרה של BRוכמות המידע החדש אודות התפתחות המצב המעורר של חלבון
זה אשר התקבל עקב הפעלתה ,גרמה לנו לאופטימיות באשר ליכולתה לתרום לפענוח תהליכים מושרי אור
ראשוניים בהלורודופסין של .Natronomonas pharaonisנראה בהמשך כי האופטימיות שלנו הייתה
מוצדקת.
39
שיטות העבודה והמערכת הניסיונית
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
ספקטרוסקופיית בליעה מופרדת זמן בשיטת .pump – probe
על מנת לעמוד ביעדים שהצבנו לעצמנו במחקר הנוכחי ,נרצה בתור התחלה לעקוב אחר התפתחות
בזמן של מאפיינים ספקטרליים של פיגמנטים מעוררים .שיטות ספקטרוסקופיות מסורתיות במרחב התדר
מוגבלות ביכולתן למדוד ספקטרה של צורונים טרנזיינטיים קצרי חיים כי ריכוזם בתנאי תאורה קבועים בכל רגע
נתון הוא זניח .פנייה לספקטרוסקופיה במרחב הזמן היא הבחירה הטבעית של ניסיונאי המבקש לחקור דינמיקה
של תהליכים פוטוכימיים/פוטופיזיקליים מהירים .הנ"ל מעמידה לרשותו שלל שיטות וכלים לחקר תהליכים
דינמיים המתרחשים בסקלות זמנים שונות .למשל ,ניתן למדוד פלואורסנציה של הלורודופסינים המעוררים על
ידי הבזק אור קצר ,באמצעות מצלמה מהירה ) .(streak cameraמגרעתה של שיטת מדידה זו היא תלותה
במהירות הגלאי .קיימות היום מצלמות מהירות מספיק על מנת לנטר אירועים המתרחשים בסקלה של מאות
פמטושניות ,אך אלה לא בשימוש במעבדתנו .שיטת
pump – probeהיא גרסה עדכנית של Flash
,photolysisהמבוססת על פולסי אור של לייזרים
באורך של פיקו – פמטושניות .כפי שנראה בהמשך,
יתרון שיטה זאת הוא בכך שההפרדה הזמנית שהיא
מאפשרת לא תלויה במהירות התגובה של מכשירי
המדידה ובימינו מגיעה לפמטושניות בודדות באופן
איור :41סכמת ניסוי pump – probeבסיסי.
שגרתי.106,105
סכמה טיפוסית של ניסוי pump - probeמוצגת באיור .41פולס ראשון הוא פולס pumpעצמתי,
רזונטיבי עם מעבר אלקטרוני או ויברציוני של צורוני הדגם .תפקידו לאתחל תגובה פוטוכימית או לחלופין
לגרום לאכלוס מוגבר של רמות אנרגיה מעוררות של מולקולות/אטומי הדגם .פולס probeהוא פולס שני
בסכמה ניסיונית זו .הוא יכול להיות חלש בהרבה מפולס ה – ,pumpבמקרה כזה אין ביכולתו לגרום לשינוי
משמעותי באכלוס רמות האנרגיה של הדגם .עצמתו לאחר המעבר בדגם נמדדת על ידי גלאי לא מהיר ,כפונקציה
של ההשהיה בינו לבין ה – . pumpסריקת פרמטר ניסיוני זה מתאפשרת הודות לשליטתנו על הפרש הדרכים
האופטיות בין ה – pumpל – .probe
להלן תיאור מתמטי בסיסי של ניסוי .107pump-probeנתעלם לבינתיים מהתלות של הפולסים וגדלים
מדידים בניסוי באורך גל ,נתאר את התנהגות הסיגנל כפונקציה של הזמן ,באורך גל כלשהו .ניקח סיטואציה
שבה הדגם מואר על ידי שני הבזקי אור עוקבים :פולס pumpאשר מרוכז סביב זמן , I pump t=I 1 t ,t = 0
ופולס probeהמושהה לעומתו בזמן . I probe t= I 2 t− , τשינוי של מקדם בליעה אופטי לינארי,α ,
עקב חשיפת הדגם ל – pumpיהיה
t
(1) t = ∫ I 1 t ' At −t ' d t ' =I 1 t∗At .
∞−
הסימן * משמעותו קונוולוציה ) (convolutionו – ) A(tהיא תגובת הדגם לעירור אימפולסיבי ,קביעתה היא
לרוב המטרה של הניסוי .בעקבות המעבר דרך הדוגמה )לפני מעבר ה – (pumpפולס ה – probeמוחלש לפי
חוק Beer – Lambert
40
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
(2) I probe =I 0, probe t exp −0 d .
האות dמסמנת את עובי הדגם .ה – pumpמשפיע על מקדם הבליעה ,לכן לאחר מעברו בדגם עוצמת ה –
probeתיחלש לפי
(3) I probe , with pump =I 0, probe t exp −0 t d .
השינוי בעוצמת ה – probeהנגרם על ידי מעבר ה – pumpבדגם הוא לפיכך
(4) I probe t=I 0, probe t exp −0 d exp − t d −1 ≈−I 0, probe t exp−0 d t d .
כאשר אנו מניחים כי ההפרעה הנגרמת על ידי ה – pumpקטנה . d ≪1 ,נבצע אינטגרציה לפי זמן על
העצמה על מנת לחשב את השינוי באנרגיית ה – probeהנגרם על ידי מעבר ה – pumpבדגם
't
∞
∞
(5) E probe =∫ I probe t ' dt '=k ∫ I 2 t '− dt ' ∫ I 1 t ' ' At '−t ' ' dt ' ' .
∞−
∞−
∞−
כלומר
(6) Δ E probe (τ)=k I 2 (t )⊗[ I 1 (t)∗A(t) ] .
משמעות הסימון היא קרוס – קורלציה ) .(cross - correlationעל ידי מעבר משתנים ניתן לשכתב את
המשוואה האחרונה ולקבל אותה בצורתה האחרת
(7) E probe = At∗[ I 1 t I 2 t ]= At ∗C t .
הגדרנו:
∞
' (8) C t = ∫ I 1 t ' I 2 tt ' dt
∞−
קרוס – קורלציה של פרופילי העצמה של ה – pumpוה – .probeהסיגנל הנמדד בניסוי מסוג זה הוא לפיכך
ניתן על ידי קונוולוציה של תגובת המערכת עם הקרוס – קורלציה של ה – pumpעם ה – .probeמשוואה 7
ממחישה את הצורך בפולסים קצרים מאוד על מנת לעקוב אחר דינמיקה אולטרה מהירה של תהליכים מושרי
אור .כל אותם התהליכים המתרחשים תוך פרק זמן קצר בהרבה מזמן הקרוס – קורלציה בין ה – pumpל –
probeימוצעו ולא יופרדו בסכמה ניסיונית זו.
דרך אחת לזקק מתוך העצמה הנמדדת של ה – probeאת המידע אודות האבולוציה של המערכת
הנגרמת על ידי הפולס המעורר ,היא מדידת השינוי של צפיפות האופטית של הדגם ,כפונקציה של ההשהיה בין
שני הפולסים הללו .צפיפות אופטית מוגדרת:
(9) OD =−log 10 I /I 0 .
החזרנו את התלות באורך גל על מנת להמחיש את האו פי ההיפרספקטרלי של הדגימה בניסויים שלנו .השינוי
בצפיפות האופטית ,הנגרם על ידי ה – pumpיהיה
)
( )
)I probe , no pump (λ , t
I
)(λ , t
−log 10 probe , with pump
)I 0, probe ( λ , t
)I 0, probe (λ , t
(
(10) Δ OD (λ , t)=OD with pump −OD no pump =log 10
כאשר tמסמנת כאן השהיה בין pumpל – .probeמדידתו מחדש של הגודל I 0, probe ,t עבור כל נקודת
השהיה בין ה – pumpל – probeושמירתו במשוואות נעשית מסיבות טכניות .היא עוזרת לצמצם את הרעש
41
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
הנגרם על ידי הפלקטואציות בעצמת ה – .probe
הסיגנל הנמדד ,ΔOD ,תלוי בהשהיה בין ה –
pumpל – probeובאורך גל של ה – .probeבכל
אורך גל הגודל הזה יכול להיבנות מחפיפה של תרומות
של מספר מעברים ספקטרליים השקולים על ידי חתכי
הפעולה שלהם .איור 42מראה סכמה של רמות אנרגיה
של מערכת מולקולרית .מעברים אלקטרוניים הגורמים
לסיגנלים הניתנים למדידה בניסוי pump – probe
מיוצגים על ידי חצים.
אכלוס מוגבר של רמות אנרגיה מעוררות על ידי ה
איור :42דיאגרמת רמות אנרגיה של מערכת
מולקולרית המציגה סיגנלים אשר יכולים להימדד – pumpיגרום לכך שפולס probeיבלע בחלקו על ידי
בניסוי .pump-probe
מולקולות מעוררות .במקרה זה השינוי בצפיפות
האופטית של הדגם יהיה חיובי וסימן הסיגנל בתחום ספקטרלי המאפיין את בליעת המצב המעורר יהיה בהתאם
חיובי .מולקולות מעוררות יכולות לדעוך למצב יסוד תוך כדי פליטה של פוטון .פליטה זו יכולה להיות מאולצת
על ידי ה – ,probeלכן נצפה להגברת העצמה של ה – probeבתחום אורכי גל שבו מתרחשת פליטה של
המצב המעורר .הגבר ה – probeמשמעותו הקטנת הצפיפות האופטית של הדגם בתדרים אלה ,הסיגנל הנובע
מפליטה מאולצת יהיה לפיכך שלילי .לא כל סיגנל שלילי שיימדד משמעותו פליטה מאולצת של המצב המעורר.
פולס pumpמקטין את אוכלוסיית מצב היסוד ,מכאן שצפיפות האופטית של הדגם באורך גל המאפיין את
בליעת מצב היסוד תקטן לאחר חשיפתו ל – .pumpשינוי שלילי של צפיפות האופטית של הדגם בתחום
ספקטרלי שבו מתרחשת בליעת מצב היסוד נקרא .ground state photobleachingעד כה מיינו את
הסיגנלים הנגרמים על ידי מעברים בין רמות האנרגיה השונות של הצורון המקורי של הדגם .פוטוכימיה הנגרמת
על ידי ה – pumpתייצר צורונים חדשים ,אלה יבלעו באורכי גל אופייניים להם וסיגנלים נוספים יופיעו.
חפיפת סיגנלים הנובעים ממעברים שונים ,בתחומים ספקטרליים רחבים ,בדרך כלל מקשה על פענוח
ספקטרום הפרש בליעה טרנזיינטי .102,99 Δ OD(λ , t) ,שיטות ספקטרוסקופיות אשר מבוססות על פלואורסנציה
מאפשרות בידוד סיגנלים הנובעים ממצב מעורר בלבד ,אך שיטות אלה נופלות מספקטרוסקופיית בליעה
טרנזיינטית בשיטת pump – probeבהפרדה הזמנית שלהם ובפשטות הביצוע .אי לכך ,שיטת – pump
probeהיא השיטה המועדפת עלינו לחקר דינמיקה אולטרה מהירה של תגובות פוטוכימיות.
גילוי דינמיקה ויברציונית באמצעות ספקטרוסקופיה אלקטרונית אולטרה מהירה.
עירור של מולקולה על ידי קרינה רחבת פס ,ממשטח אלקטרוני יסודי ) (S0לאחד המשטחים הקושרים
הגבוהים ) ,( Snמוליד חלוקה מסוימת של אוכלוסיה ברמות ויברציוניות של אותו המשטח המעורר .התנאי לכך
שהאוכלוסיה המעוררת תתחלק בין מספר רמות הוא שוני בין גאומטריות מולקולריות בשווי משקל של שני
המצבים האלקטרוניים .מקדמי ,Franck – Condonכלומר סכום אינטגרלי חפיפה של פונקציות גל
ויברציוניות של משטח יסוד אלקטרוני )הסכימה היא על הרמות הויברציוניות המאוכלסות של משטח היסוד( עם
42
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
פונקציית גל ויברציונית רלוונטית של המשטח המעורר ,קובעים מה תהיה מידת האכלוס של רמה ויברציונית של
מצב אלקטרוני מעורר ביחס לרמות אחרות שלו .ספקטרום ה – pumpבניסויי ultrafastנדרש להיות רחב
תדר ,הרי שבין רוחב הפולס במרחב התדר לבין משכו המינימלי מתקיים קשר של טרנספורם פורייה .לכן המעבר
ממשטח יסוד למשטח מעורר ,הנגרם על ידי ה – pumpיהיה מעבר מהסוג המתואר ,קרי מעבר ויברוני אשר
מערב מספר רמות ויברציוניות של ה – manifoldהעליון.
השאלה המתבקשת היא מהן ההשלכות של אורך הפולס המעורר על האופי של אותה התפלגות
אוכלוסיה לפי רמות ויברציוניות של המצב האלקטרוני העליון המיוצרת על ידו? תשובה לשאלה זו תלויה
במשך פולס ה – , τ pump , pumpביחס לזמן המחזור של ויברציה של המולקולה המעוררת . T vibration ,אם
מתקיים תנאי האימפולסיביות , τ pump <T vibration ,אזי לחבילת גלים ויברציונית אשר ממוקמת על משטח
פוטנציאל אלקטרוני מעורר על ידי ה – pumpיהיה אופי לא סטציונרי ,ויברציות של אוסף המולקולות
המעוררות יהיו מתואמות מופע .למעבר אימפולסיבי של אוכלוסיה ממצב יסוד אלקטרוני לאחד המצבים
המעוררים יש השלכות גם על המתרחש במשטח היסוד .הפולס המעורר "שורף חור דינמי" בחבילת הגלים
הויברציונית הסטציונרית )בהתחלה( של מצב היסוד .חבילת הגלים ה"מחוררת" הזו ניתנת למעשה על ידי
סופרפוזיציה של מצבים ויברציוניים ,היא לא סטציונרית ומתפתחת בזמן לפי ההמילטוניאן של משטח היסוד.
ההתפתחות שלה קוהרנטית במונחי האוסף המולקולרי.
הופעה של coherencesויברציוניים במצב יסוד של מולקולות בעקבות אינטראקציה שלהן עם פולס
אור קצר יכולה להתרחש גם ללא עירור אלקטרוני .תנאי האימפולסיביות צריך להתקיים גם במקרה זה ,משך ה –
pumpצריך להיות קצר יותר מזמן מחזור של ויברציה של מולקולה במצב יסוד אלקטרוני שלה .מנגנון היצירה
של ה – coherencesבמקרה זה מבוסס על אינטראקציית אור – חומר המערבת שלושה פוטונים ונקרא )
.Impulsive Stimulated Raman Scattering (ISRSבגבול האימפולסיבי של תהליך ראמן מאולץ
ויברציות של מולקולות אשר גורמות לפיזור ,Stokesכלומר אלה הקולטות אנרגיה בשיעור קוונטום ויברציוני
אחד משדה הקרינה )לייזר( ,יהיו מתואמות מופע .שלושה פוטונים משתתפים בתהליך פיזור ראמן מאולץ ,כאשר
הפרש האנרגיות של הפוטון ה"נבלע" לפוטון מתפזר שווה בגודלו לקוונטום ויברציוני אחד של מולקולה .פוטון
ראשון "מעורר" את המולקולה לרמה וירטואלית )תכף נתייחס למקרה של פיזור ראמן רזונטיבי( ,פוטון שני
מאלץ פליטה מרמה זו לרמה ויברציונית מעוררת שלה והפוטון השלישי הוא הפוטון ה"נפלט" .במקרה בו
הפולס המעורר רחב תדר ,שני הפוטונים המאלץ וה"נבלע" ,זמינים ומצויים בשדה הקרינה.
במקרה בו השדה המעורר מכיל תדרים רזונטיביים עם מעבר S 0 → S nשל מולקולה מדברים על
תהליך של פיזור ראמן רזונטיבי מאולץResonant Impulsive Stimulated Raman Scattering ) :
.(RISRSניתן להבין תהליך זה במונחי ISRSכאשר הרמה הוירטואלית מוחלפת ברמה אלקטרונית אמתית
של המולקולה .אוכלוסיה מועברת ל – Snעל ידי פוטון ראשון ומונחתת בחזרה לרמה ויברציונית מעוררת
ראשונה של S0על ידי פוטון שני ,תוך כדי פליטת פוטון שלישי הזהה לשני .בגבול העירור הרזונטיבי כל המעבר
הזה מתרחש בסקלת זמנים שבה הגרעינים אינם מספיקים לזוז .כתוצאה מאינטראקציה של המולקולה עם שדה
הקרינה נוצרת חבילת גלים לא סטציונרית קוהרנטית על גבי משטח אלקטרוני תחתון שלה .תנודות חבילה זו
יהיו מתואמות פאזה בין המולקולות המרכיבות את האוסף המגיב לשדה הלייזר .ההבדל בין ISRSל –
43
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
RISRSהוא שבמהלך אינטראקציה עם שדה קרינה רזונטיבי ,מספר כזה או אחר של מולקולות יעוררו .מכאן
שיש צורך להתחשב בזה שה – coherencesבמצב יסוד במקרה הרזונטיבי ייתרמו גם על ידי מעבר אוכלוסיה
אימפולסיבי וגם על ידי פיזור ראמן מאולץ.109,108
אוסף מולקולות הרוטטות תוך כדי שמירת קשר פאזה לא יישאר במצב זה לנצח .לכל התופעות
הקוהרנטיות זמן אופייני של איבוד קשר מופע ) (dephasingולתוצאה של תהליך זה קוראים .decoherence
הסיבות ל – dephasingהן דעיכה של המולקולות המעוררות למצב היסוד הויברציוני )מעבר אנרגיה לדרגות
חופש אחרות( וחלוקה מחדש של אנרגיה בין מולקולות מעוררות ויברציונית )פיזורים אלסטיים( .זמן
dephasingויברציוני אופייני לפאזות מעובות הוא פיקושניות בודדות.
ספקטרוסקופיה ויברציונית אימפולסיבית ) Impulsive Vibrational Spectroscopy (IVSהיא
שיטה ניסיונית אשר הוצעה ככלי אשר מסוגל לפענח דינמיקה ויברציונית של מולקולות מעוררות אלקטרונית .110
שיטה זו מבוססת על יכולת לגלות את אותם ה – coherencesהמיוצרים על ידי ה – .pumpניקח מקרה של
בליעה/פליטה של מצב מעורר כלשהו בתור דוגמה .חבילת גלים ויברציונית לא סטציונרית המבצעת תנועה
מחזורית )האופיינית למצבים קוהרנטיים( סביב מצב שווי המשקל של קואורדינטה נורמלית מסוימת Q0על גבי
משטח מעורר תופיע ותיעלם באופן מחזורי ,בתדר האוסצילציה שלה ,מחלון Franck – Condonלבליעה או
פליטה המוגדר על ידי תחום מסוים של אורכי גל של ה – .probeבעקבות כך ,צפיפות האופטית של הדגם
תשתנה באופן מחזורי כפונקציה של זמן ההשהיה )ושל אורך גל כמובן( ועצמת ה – probeהנמדדת תשתנה גם
היא .תדר המודולציה של עצמת ה – probeיהיה זהה לתדר האוסצילציה של חבילת הגלים בקצוות פס
הבליעה/פליטה וכפול מתדר האוסצילציה שלה במרכז הפס .כמו כן ,יהיה הפרש מופע של πבין המודולציות
בשני הקצוות של הפס .המגבלה של IVSהיא שעירור אלקטרוני אימפולסיבי מסוגל לייצר coherencesגם
על המשטח האלקטרוני המעורר וגם על משטח היסוד ומודולציות בעצמת ה – probeיכולות לנבוע
מהדינמיקה הויברציונית על שני המשטחים הללו ,ברגע שה – probeמצמד את שניהם .מכאן ששיוך דינמיקה
ויברציונית למצב אלקטרוני מסוים הוא לא פשוט ומצריך מלאכת מחשבת.
מערכת לייזר מתוצרת עצמית ליצירת פולסי אור אולטרה קצרים.
משכם המינימלי של פולסי אור ממקור פועם צר פס יהיה מוגבל על ידי רוחבו ,ניתן להיווכח בזאת על
ידי מיפוי הספקטרום של אותו המקור לזמן הבזק מינימלי על ידי טרנספורם פורייה .נניח כי המקור מתאפיין
בספקטרום גאוסי ממורכז סביב ω0ובעל רוחב Δ ωבחצי הגובה )(FWHM
.
}
])[−(ω−ω0 )2 4 ln( 2
(Δ ω)2
{
(11) E (ω)= Aexp
הטרנספורם למרחב הזמן נותן את )E (t
.
}
(Δ ω)2
+i ω0 t
] )[ 16 ln( 2
{
(12) E (t)=B exp −t 2
מכאן שהקשר בין הרוחב הספקטרלי של הפולס , Δ ω ,לבין המשך המינימלי שלו בזמן) Δ t ,כאשר גם כאן
הכוונה היא ל – FWHMשל פונקציית המעטפת של השדה בזמן( ,ניתן על ידי
44
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
(13) Δ ω(Δ t) E=8ln (2) .
מכיוון שהערך הנמדד הוא עצמת הפולס , I ( t) ,ולא השדה החשמלי ,נקשר בין הרוחב הספקטרלי לבין משך
הזמן שבו העצמה הנמדדת של פולס גאוסי מכווץ גבוהה ממחצית העצמה המקסימלית שלו
) Δ ω(Δ t) I =4 ln( 2) (14או )Δ ν (Δ t) I =0.4413 (15
על מנת לייצר פולס גאוסי באורך 20fsרוחב מינימלי של ספקטרום המקור צריך להיות 2.21×1013 Hzמה
שמתורגם ל – FWHMשל 46nmעבור ספקטרום ממורכז סביב .790nm
ספקטרום רחב של המקור הוא תנאי הכרחי אך לא
מספיק ליצירת פולסים אולטרה קצרים .מקור אור רחב פס
ללא קשר מופע מוגדר בין רכיבים ספקטרליים שלו יהיה
רציף בזמן ולא פולסי )שמש( .על מנת ליצור פולסי אור
אולטרה קצרים יש צורך במקור אשר מתאפיין ברוחב פס
מספיק וגם בקשר פאזה מוגדר בין רכיבים ספקטרליים שלו
איור :43תוצאה של mode - lockingהיא מופע )רכיבי פורייה(.
מוגדר וקבוע של אופני הלייזר ביחס אחד לשני.
אופן הפעלה של לייזר שבו מושג הפרש פאזה
קבוע בין אופנים אורכיים שלו נקרא "נעילת אופנים" ) mode – lockingאיור .111(43דרך אחת ,פשוטה
יחסית" ,לנעול" את האופנים האורכיים של לייזר היא על ידי הוספת אלמנט אופטי פסיבי בין מראות הקצה של
ה – . cavityתפקידו של אלמנט זה הוא להקשיח את תנאי המהוד באופן כזה שתוצאת הסופרפוזיציה של
האופנים שלו תהיה פולס עצמתי יחיד המסתובב הלוך ושוב בין מראות הקצה של המהוד .אלמנט זה נקרא
"בולען מתרווה" ) .( saturable absorberהוא עשוי מחומר בעל תכונות בליעה לא לינאריות אשר גורמות לו
להעביר אור בעצמות רגעיות גבוהות ,המאפיינות לייזר נעול אופנים ולבלוע אור בעוצמות נמוכות המיוצרות על
ידו באופן הפעלה רציף ) .(continuous waveברגע שמהוד המכיל בולען מתרווה עבר אופטימיזציה ויכול
לתמוך בכל האופנים הרלוונטיים אשר בונים את הפולס הקצר )בדרך כלל אופטימיזציה של המהוד ל – mode
lockingגורמת ללזירה רציפה להיות לא יציבה( ,הפרעה בצורת הזזה קדימה ואחורה של אחת ממראות הקצה
מקריסה את הלייזר למצב .mode – locked
לייזר הפמטושניות במערכת הניסיונית שלנו מבוסס על אפקט נעילת אופנים עצמית – self mode
lockingבתווך לוזר עצמו שהוא גביש קורונדום מאלח בטיטניום Ti:Al2O3 :הנשאב על ידי לייזר
Nd:YVOמסחרי ,מוכפל תדר )הספקו 3.7Wב – .112(532nmמדובר בלייזר ארבע רמות ,התווך הלוזר שלו
עונה על דרישת רוחב פס בזכות ספקטרום gainרחב ) ,1000nm – 650ממורכז סביב ,(790nmכמו כן הוא
מתאפיין בהולכת חום טובה ולכן עמיד לאורך זמן בעוצמת שאיבה גבוהה .אפקט נעילת האופנים העצמית של
לייזר Ti:sapphireהתגלה בשנות ה – 90ומאז לייזרים אלה הם האמצעי הנפוץ ביותר בעולם ליצירת פולסי
אור אולטרה קצרים .בסיס הפעולה של נעילת אופנים שלו הוא מודולציה מרחבית של אינדקס השבירה של
הגביש על ידי שדה אור עצמתי ,ספציפית .Optical Kerr Effectעצמה של קרן לייזר אשר נשלטת על ידי
אופן מרחבי TEM00דועכת גאוסית אם התרחקות ממרכזה .אי לכך ,אינדקס השבירה של הגביש יהיה גבוה
באזור מרכז קרן כזאת ונמוך בשוליה .אפקטיבית ,תיווצר עדשה ) (Kerr – lensבדרכה של קרן עצמתית בתוך
45
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :44סכמת אוסצילטור Ti:sapphireבמערכת שלנו.
הגביש והיא מתפקדת בתור האלמנט אשר משנה את תנאי המהוד לטובת ה – .mode lockingניתן לגרום
לעדשת Kerrכזאת לתפקד בתור סוג של בולען מתרווה על ידי הוספת חריר קטן ) (apertureסמוך לגביש,
החריר יחסום קרן רציפה ,לא ממוקדת ויעביר קרן ממוקדת של לייזר Ti:sapphireנעול אופנים .שיטת נעילת
אופנים זו נקראת .Hard aperture Kerr – lens mode lockingמאידך ,אפשר לתכנן את המהוד באופן
כזה שקרן לא ממוקדת בתוך הגביש לא תחפוף טוב את האזור הנשאב ולכן לא תוגבר ,כמו שנעשה במערכת
שלנו ).(Soft aperture Kerr – lens mode locking
האוסצילטור שלנו מוצג גרפית באיור .44הוא מתבסס על תכנון מקורי של Asakiוקולגות .113תפקיד
זוג מנסרות קוורץ בתוך ה – cavityהוא לפצות על נפיצה )דיספרסיה( של הפולס הנגרמת לו תוך כדי מעברו
בגביש .הגביש עצמו חתוך בזווית Brewsterכלפי הקרן ,בדרך זו שדה חשמלי של הפולסים המתקבלים
מקוטב מישורית במקביל לשולחן האופטי והאיבודים עקב החזרת הקרן מהפן הקדמי של הגביש ממוזערים.
המכשיר הנ"ל מפיק פולסים באורך של כ – 20fsממורכזים סביב 790nmבתדר של ~86MHzהנקבע על ידי
התדר שבו הפולס המסתובב הלוך ושוב בתוך המהוד פוגע ב – output couplerאשר מצמד 10%ממנו
החוצה .סך העצמה של הקרן המופקת היא בערך ,0.5Wמה שנותן .5nJ/pulseאנרגיה של פולס יחיד קטנה
מדי לרוב האפליקציות שלנו )אנרגיה גבוהה של פולסים נדרשת לצורך הגבר פרמטרי ,כלומר הגבר הפולסים
תוך כדי שינוי הספקטרום שלהם ,עליו נדבר בהמשך( ולכן יש צורך להגביר את ה – outputשל האוסצילטור.
ההגבר נעשה בשיטת .Chirped Pulse Amplificationשיטת ה – CPAמאפשרת הגבר של עצמת
הפולס עד חמישה סדרי גודל מבלי לגרום נזק לאלמנטים אופטיים רגישים העומדים בדרכה של הקרן .106שלב
ראשון בסכמת הגבר זו הוא פרישת הפולס ,באופן הפיך ,לאורך של כ – 100psבחצי הגובה על ידי הפרדה בזמן
של הרכיבים הספקטרליים שלו ,כלומר באמצעות הכנסה מכוונת של דיספרסיה .ניתן להשיג זאת על ידי העברה
של הפולס דרך תווך דיספרסיבי )כזה שמקדם השבירה שלו תלוי אורך גל ,נתעלם כאן בתלות אינדקס השבירה
בעצמת האור( .אפקט של תווך דיספרסיבי על פולס קצר העובר בו מודגם על ידי איור .45יש כאן שתי נקודות
איור chirp :45חיובי הנגרם לפולס קצר לאחר מעברו בתווך דיספרסיבי.
46
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
ראויות לציון ( 1 :מרכז הפולס מושהה ביחס לפולס העובר באוויר ,אפקט זה נקרא group delayוהוא משהה
אך לא מרחיב את הפולס ( 2 ,לרוב ,תווך דיספרסיבי ישרה תלות מסוימת של תדר הפולס בזמן ,תלות זאת נקראת
" " chirpועבור פולס מכווץ אשר נמתח בזמן בעקבות מעברו בזכוכית היא באה לידי ביטוי בכך שהתדר של הגל
הנושא של הפולס משתנה בזמן מנמוך לגבוה ) chirpחיובי( .במושגים של גלי קול פולס כזה נשמע כמו ציוץ
של ציפור וזהו המקור למונח chirpבהקשר זה.
תיאור מתמטי של השפעת ה – chirpעל הפולס מתחיל במתן ביטוי לתלות של הפאזה בתדר .את
הפאזה ניתן לפתח לטור טיילור סביב התדר המרכזי ω0של הפולס
3
( ω−ω 0) +... .
) (
ω=ω 0
1 ∂3 ϕ
6 ∂ ω3
) (
2
( ω−ω0 ) +
ω=ω 0
1 ∂2 ϕ
2 ∂ω 2
בהנחה שהתלות שלה בתדר לא חריפה .האיבר
0
0
) (
( ω−ω 0 )+
ω=ω 0
∂ϕ
∂ω
(16) ϕ=ϕ0 +
( ∂ϕ/∂ ω )ω=ωנקרא ,group delayהאיבר
( ∂2 ϕ/∂ω 2) ω=ωהוא ) group delay dispersion (GDDוהנגזרות מסדרים גבוהים יותר הם דיספרסיה
מסדר שלישי רבעי ) (TOD, FODוכך הלאה .נשתמש במונחים האלה בהמשך.
נוח לנתח את השפעת הפאזה הספקטרלית על הפולס בזמן תוך כדי התייחסות לכל איבר בנפרד .ברור
שלהוספת איבר קבוע לפאזה לא תהיה השפעה על רוחב הפולס בזמן ,הוספתו אקוויוולנטית להכפלת כל הביטוי
בקבוע קומפלקסי.
).
−a 2 t 2
+i ϕ0+it ω 0
2
])
(
+i ϕ0 = B exp
−(ω−ω 0)2
2a 2
( [
(17) F.T. A exp
נכניס את ה – ϕ1=( ∂ ϕ/∂ ω )ω=ω ,group delayונקבל
0
.
)
(
])
−a 2 (t+ϕ1)2
+i ϕ1 (ω−ω0 ) =B exp
+it ω0
2
−(ω−ω 0)2
2a 2
( [
(18) F.T. A exp
רואים הסט של כל הפולס בזמן ללא הרחבה ,כיוון ההסט תלוי בסימן של .φ1שלב הבא הוא בדיקת ההשפעה
של GDD
])
) =E (t
.
))
2
)+i ϕ2 (ω−ω 0
(
1
)+i t ω 0+ arctan ( 2 a 2 ϕ2
2
( [
(
( (
−(ω−ω0)2
2a 2
F.T. A exp
) −( at)2 1+2 i a 2 ϕ2
)
2
2
)2 1+4 (a ϕ2
)(19
E (t)=B exp
הביטוי המלא יתקבל כאשר נוסיף את ה – group delayואת הפאזה הקבועה .רואים שרוחב פונקציית מעטפת
שדה חשמלי בזמן הוא כעת
.
)(1+4 a 4 ϕ22) 8 ln( 2
a2
מכיוון ש – ) ) a 2=(Δ ω)2 /( 8ln( 2נקבל
47
√
= (20) ( Δ t )E , new
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
2
.
)
(
√
2
)
2
)8 ln (2
2
)8 ln( 2
+4 ((Δ ω)ϕ2 ) = ( ( Δ t )E , old ) +4 ϕ22
Δω
( Δ t ) E ,old
(√
=(21) ( Δ t )E , new=2 ( Δ t )I , new
אפקט ה – GDDעל רוחב הפולס הסופי כפונקציה של רוחבו ההתחלתי הוא כדלהלן :ככל שהרוחב ההתחלתי
של הפולס גדול יותר האיבר השני מתחת לשורש במשוואה האחרונה נהיה קטן יותר ובגבול ∞ → (Δ t)old
מקבלים . (Δ t)new =(Δ t)oldבגבול השני , (Δ t)old → 0 ,התנהגות הרוחב הסופי של הפולס תהיה
. (Δ t)new =16 ln (2) ϕ2 /( Δ t )oldכמו כן ,אם נסתכל על משוואה מס' 19נראה באקספוננט איבר מרוכב
מתכונתי ל – . t 2זהו האיבר אשר מבטא תלות לינארית של תדר הפולס בזמן ,כלומר הוא הגורם ל – .chirp
הסימן של φ2יקבע אם ה – chirpיהיה חיובי או שלילי.
הארכת פולסים באמצעות מעבר הקרן בתווך דיספרסיבי היא לא ברירת המחדל בסכמת ה – ,CPA
סדרים גבוהים של דיספרסיה המוכנסים ל – ) φ(ωשל הפולס בדרך זו יקנו תלות מורכבת של תדר גל הנושא
שלו בזמן .הרבה יותר פשוט להפריד מרחבית את הרכיבים הספקטרליים של הפולס ולגרום להם לעבור דרך
אופטית שונה באוויר .ניתן בקלות לעשות זאת על ידי זוג סריגים ,כפי שמוצג באיור 46המסכם את שיטת ה –
.CPAלרוב ,לאחר מתיחת הפולסים השלב הבא בסכמת ההגבר הוא הנמכת תדירות ה – ,pulse trainזאת כי
אין לנו אפשרות וצורך מעשי להגביר את כל 86מיליון פולסים המיוצרים על ידי האוסצילטור בשנייה .לאחר
הדילול ,הפולסים מוגברים ובסוף מכווצים בחזרה.
פורש הפולסים במערכת שלנו )המוצג סכמטית באיור (47מבוסס על ארבע פגיעות של הפולס בסריג
יחיד ) ( 1200 lines /mmכאשר מטרת שתי הפגיעות הראשונות היא למתוח את הפולס בזמן ושתיים האחרונות
מתקנות את הדיספרסיה המרחבית אשר מוכנסת בפגיעות הראשונות .בנוסף הפורש מכיל מראה פרבולית בעלת
אורך מוקד של 61cmושתי מראות זהב מישוריות )מראות עם ציפוי זהב יעילות במיוחד בהחזרת אור אינפרה
אדום קרוב( .מטרת תכנון זה של הפורש היא להכריח את אורכי הגל הקצרים של הפולס לעבור דרך אופטית
ארוכה יותר )משמעות הפרש בין דרכים אופטיות של 10cmבאוויר עבור תדרי הקצה של הפולס גאוסי מכווץ
היא מתיחתו ליותר מ – 100psבחצי גובהו(.
איור Chirped Pulse Amplification :46
48
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :47פורש הפולסים ) .(stretcher
הנמכת תדר ה – outputשל לייזר פמטושניות שלנו נעשית ב – single pulse selectorתפקיד
מכשיר זה ,כפי ששמו מרמז ,הוא לבודד פולס יחיד ליחידת זמן מתוך ה – pulse trainהצפוף המופק
מהאוסצילטור .שיטת בחירת הפולס היחיד מתבססת על היכולת שלנו לשנות את קיטובו באמצעות העברתו דרך
גביש אלקטרו – אופטי ) .(Pockel's cellהגביש מתפקד כלוחית חצי גל ) ( λ /2 waveplateהודות ל –
birefringenceשלו ,המושרה על ידי שדה חשמלי חיצוני .הקיטוב של הפולס משתנה ב – 90°בעוברו דרך
הגביש ועקב כך הוא לא נחסם על ידי מקטב המוצב בפתח היציאה מה – .Pockel's cellעל מנת שבורר
הפולסים לא יהפוך את הקיטוב שלהם לצמיתות ,לוחית גל נוספת הופכת את הקיטוב של ה – pulse trainטרם
כניסתו לבורר ,בדרך זו הקיטוב של הפולס הנבחר לא משתנה .הפעלת מתח בתדר רצוי על הגביש ובמשך זמן
המאפשר היפוך קיטוב של פולס יחיד בכל הפעלה תקבע את תדר ה – .outputלצורך הניסוי שלנו התדר הונמך
מ – 86MHzל – .460Hz
פרישה בזמן ודילול ה – pulse trainמאפשרים את ההגברה של הפולסים הנבחרים .מגבר מהסוג
המשמש אותנו נקרא Multipass amplifierזאת כי ההגבר מתבצע תוך כדי מספר מעברים של הפולס בתוך
גביש ) Ti:sapphireתשעה מעברים במגבר שלנו( ,המשמש תווך gainלצורך ההגבר .בחירה של
Ti:sapphireלמטרה זו היא טבעית ,יש לו רוויית הגבר גבוהה וזמן אחסון ארוך של האוכלוסיה הלוזרת.
הגביש של המגבר נשאב על ידי לייזר Nd:Yagפועם ) (Q – switchedאשר מופעל בתדר ה – pulse train
המופק מבורר הפולסים ) .(460Hzפעימה אחת של הלייזר השואב נמשכת כ – ,200nsזמן הדרוש לפולס יחיד
להשלים תשעה מעברים בתוך הגביש .תשעת המעברים הללו מגבירים את הפולס לרמת רוויה ואין טעם להעביר
אותו בגביש פעמים נוספות .לקראת המעבר העשירי הפולס נקטף על ידי מראה ) איור (48ונזרק החוצה
מהמגבר .תפקיד המסכה המורכבת מסדרה של חרירים עגולים ,דרכם נאלץ הפולס לעבור בכל אחד מהמעברים
איור .Multipass – amplifier arrangement :48
49
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :49מכווצי פולסים .מימין :מכווץ מבוסס פריזמות של האו סצילטור .משמאל :מכווץ מבוסס סריגים ,שלב אחרון
בסכמת CPAשלנו.
שלו ,הוא לשמור על גודל מוקד קבוע בתוך הגביש בכל אחד מהם )גודל מוקד של קרן לייזר גאוסית תלוי בזווית
ההתכנסות של הקרן ,זווית התכנסות קטנה יותר משמעותה מוקד גדול יותר( .האנרגיה הסופית של הפולסים
לאחר ההגברה )ביציאה מה – (compressorהיא ) 0.3mJ/pulseבניסוי שלנו(.114
לאחר ההגבר יש צורך לכווץ בחזרה את הפולסים הפרושים .הכיווץ נעשה באמצעות שני סריגים )בעלי
( 1200 lines /mmהמוצבים באופן כזה שמאלץ רכיבים ספקטרליים אדומים של הפולס לעבור דרך אופטית
ארוכה יותר )איור ,(49כך שהמערך הזה מיועד להכניס chirpשלילי לפולסים אשר עוברים דרכו )במידה והם
מכווצים מלכתחילה( .המרחק בין הסריגים הוא פרמטר שאנחנו שולטים עליו ובכך ביכולתנו להקנות הפרש
דרכים יחסי שונה בין אורכי גל הכחולים לאדומים של הפולס .מכאן שיכולת שינוי המרחק בין הסריגים
משמעותה שליטה במידת הכיווץ של הפולס .הנתון הסופי לאחר ה – CPAשל רוחב במחצית הגובה של
פרופיל העצמה של הפולסים בזמן הוא .~ 30fsנציין כי קיימים פורשים וגם מכווצים של פולסים מבוססים על
זוג פריזמות )שתי הפריזמות באוסצילטור מתפקדות כמכווץ( .אופן הפעולה במקרה זה מבוסס על מתן הפרש
דרכים אופטיות לרכיבים ספקטרליים של הפולס במנסרות עצמן )איור ,49חלק ימין( ולכן ה – chirpשנגרם
לפולס בעקבות מעבר בפורש מנסרות יהיה שונה ,הפריזמות מכניסות יותר TODמ – GDDלפאזת פולס
הממורכז סביב 800nmולכן זוג סריגים לא יכווץ ביעילות פולס אשר נפרש על ידי זוג פריזמות .לעומת זה,
שילוב של סריגים ופריזמות בשלב הכיווץ בסכמת ה – CPAיכול להיות יעיל מאוד.106
המרת אור.
בתנאים רגילים אינטראקציה בין חומר לקרינה ניתנת לתיאור במונחים של אינדקס שבירה לינארי .רק
עם המצאת הלייזר בשנות השישים מקורות אור הגיעו לעצמות המסוגלות לגרום לסטייה ניתנת למדידה של
תגובת תווך דיאלקטרי מהתנהגות לינארית ולהכריחה להיות תלויה בעצמת הקרינה .לייזרים נעולי אופנים
מייצרים שטפים רגעיים העולים בסדרי גודל רבים על אלה של המקורות הקוהרנטיים הרציפים ,כלומר לצורך
מתן תיאור של תוצאת אינטראקציה של פולס אולטרה – קצר של לייזר כזה עם חומר הפנייה לאופטיקה לא
לינארית היא הכרחית .בתחום זה נהוג לתאר את התגובה של החומר לאור באמצעות פרישה של הפולריזציה
שלו )צפיפות מומנטי דיפול מושרים/קבועים ליחידת נפח( לטור טיילור של חזקות השדה המשרה
50
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
)(1
)(2
)(3
(22) P i /ϵ0=∑ χ ij E j+∑ χ ijk E j E k +∑ χ ijkl E j E k E l +... .
jk
jkl
j
קירוב זה ייפול בשדות חזקים מאוד ,המשתווים בגודלם לשדות האינטרינזיים של אטומי התווך .המקדמים ) χ(n
מתייחסים לטנזורי הסוספטיביליות החשמלית של החומר עבור תהליכים לא לינאריים )תהליכים רב פוטוניים(
מסדר .nאיבר הסוספטיביליות מסדר שני , χ(2 ) ,עומד מאחורי תופעות כמו ,Pockel's effectיישור אופטי )
,(Optical Rectificationוהכפלת תדר ) (Second Harmonic Generation – SHGואילו איבר מסדר
שלישי , χ(3) ,מייצר את אפקט ,Kerrאת אפקט Ramanואת המודולציה העצמית של הפאזה ) Self Phase
( Modulation SPMשל פולס אולטרה – קצר עצמתי ,אפקט המרחיב מאוד את ספקטרום של הפולס הידוע
גם כ"יצירת אור לבן" ).(super continuum generation
יכולת הקרן המוגברת של לייזר Ti:sapphireנעול אופנים לחולל תגובה לא לינארית בחומר בו היא
עוברת מאפשרת את המרת הספקטרום שלה .לצרכים שלנו ההמרה היא הכרחית ,לרודופסינים ארכיאליים
ספקטרה בליעה אופייניים הנמצאים מחוץ לתחום פס ה – gainשל האוסצילטור )ספקטרה אלה מוצגים באיור
.( 4אי לכך ,לא נוכל לעורר את החלבונים הללו ישירות באמצעות ה – outputשל הלייזר שלנו .שיטה
ורסטילית ביותר שבה השתמשנו לצורך שינוי ספקטרום הפולסים שלנו מאזור 800nmלאזור 570nmנקראת
הגבר אופטי פרמטרי ) ,Optical Parametric Amplification (OPAבנוסף השתמשנו ביצירת אור לבן
ובהכפלת תדר פשוטה ,אותה נתאר כעת.
כפי שאמרנו ,דרישה בסיסית להכפלת תדר היא הופעה של איבר מתכונתי לריבוע השדה בביטוי עבור
הפולריזציה .איבר זה מתאפס בחומרים סימטריים ביחס לפעולת האינוורסיה ,בפרט בחומרים איזוטרופיים.
פעולה האינוורסיה משנה את כוון השדה החשמלי ב – ,180°כלומר ) ⃗
, ⃗E →(−Eמשמעות היפוך השדה היא
שכל האברים מסדר זוגי בביטוי עבור Pמשמרים סימן ואלה מסדר אי זוגי משנים סימן .בעקבות היפוך השדה
בחומר סימטרי ביחס לאינוורסיה הפולריזציה הכוללת חייבת להתהפך גם היא ,כלומר צריך להתקיים
) . ⃗P →(− ⃗Pאם נדרוש זאת ונכפיל את כל הטור ב – ) (−1נקבל שהאברים הזוגיים משמרים סימן ,ביחס
למצב ההתחלתי ,והאי זוגיים משנים אותו .על מנת שיתקיים כנדרש ) ⃗P →(− ⃗Pהאברים הזוגיים צריכים
להתאפס .המשמעות של זה היא שהכפלת תדר אפשרית רק בסוג מסוים של גבישים לא לינאריים .בניסוי שלנו
השתמשנו בגביש β BaBO4הידוע יותר תחת ראשי התיבות שלו .BBO ,חומר זה שקוף בנראה ,לא סימטרי
ביחס לאינוורסיה והמקדם ) χ(2שלו גדול יחסית )זהו חומר בעל אינדקס שבירה שונה עבור שלושה צירים
אופטיים ,אבל עבור שניים מהצירים ההפרש בין האינדקסים אינו גדול כך שאפקטיבית מדובר בחומר
.(birefringent
נח להסתכל על תהליך הכפלת התדר כעל תהליך המתרחש בשני שלבים .תחילה השדה החיצוני E1בעל
תדר ωמשרה פולריזציה ) ( P 2 ∝ E 12לא לינארית בתדר כפול ובשלב השני הדיפולים )הרציאניים ,קלסיים(
המתנדנדים המושרים קורנים לפי משוואות מאכסוול ופולטים אור בתדר .2ωהפאזה והאמפליטודה של השדה
המאלץ מוגדרים היטב בכל נקודה בגביש בזמן נתון וכך גם הפאזה היחסית של הדיפולים המושרים .על מנת
שתתקבל קרן מוכפלת ביציאה מהגביש יש צורך בכך שהדיפולים המושרים יקרנו בהפרש פאזה נכון ,אחרת
51
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
השדה המוכפל יתאבך באופן הורס .דרישה זו נקראת phase matchingוהיא קריטית עבור תהליך ה – .SHG
במקרה של אור הניתן לתיאור על ידי גלים מישוריים המתקדמים בתווך דיאלקטרי בכוון מסוים )יהי זה הכוון
החיובי של ציר ( zובתנאי שפונקציית מעטפת השדה החשמלי של אור זה משתנה לאט ,קל לתרגם את דרישת ה
– phase matchingלביטוי מתמטי פשוט ,אם כי הפיתוח ארוך יחסית .115ניתן להראות כי עצמת האור
המוכפל תקיים
2
.
)
(
)sin(Δ k L/ 2
∝ (23) I
Δ k L /2
פונקציית ה – sincהנ"ל תופיע גם עבור מקרה של פולס אור בעל מעטפת גאוסית של השדה .הגודל
Δ k =2 k ω−k 2 ωנקרא vector mismatchו – Lהוא עובי התווך הלא לינארי .מקסימום של פונקציית ה –
sincמתקבל עבור .Δk = 0חומרים אופטיים רגילים הם דיספרסיביים ולכן הגודל Δkבדרך כלל לא מתאפס:
) ) , Δ k =( 2 ω/c ) ( n( ω)−n (2 ωעבור זכוכית למשל גודל זה יהיה קטן מ – ,0בתחום הנראה של
הספקטרום.
התאמת פאזה מושלמת מתאפשרת בגבישים ביריפרינג'יים .בחומרים אלה אינדקס שבירה תלוי לא רק
באורך גל של האור אלה גם בקיטובו ביחס לצירי הגביש .נדגים באמצעות גביש ביריפרינג'י אוניאקסיאלי )בעל
ציר אופטי מיוחד יחיד ,נקרא לו ציר .( cעל מנת לתאר התקדמות של אור בגביש כזה יש צורך בפירוק וקטור
השדה החשמלי לפי הצירים של הגביש .רכיב שדה המקוטב במישור המאונך לציר המיוחד יישבר לפי אינדקס
רגיל ) (ordinaryשל הגביש . no ,וקטור שיישאר לאחר ההפחתה של הרכיב המקוטב במישור המאונך ,יכיל
רכיב מקביל לציר cשל הגביש .האינדקס הרלוונטי לגביו יהיה תלוי בזווית בין כוון ההתקדמות של השדה
המקורי )אשר מוגדר על ידי וקטור Poyntingשלו( לבין ציר c
2
2
) () (
.
1
sinθ
cos θ
=
+
)(24
2
)n o (λ
)[ neff (θ , λ)] ne (λ
כאשר neffהוא אינדקס שבירה אפקטיבי θ ,היא הזוית בין ציר cלכוון ההתקדמות ההתחלתי של השדה ו – ne
הוא אינדקס שבירה מיוחד של הגביש ,המתקבל עבור קרן שהשדה החשמלי שלה מקוטב במקביל לציר c
)במקרה זה .( θ=π/2 ,הגביש שהשתמשנו בו ,BBO ,משתייך ל – negative birefringent crystals
עבורם .ne(ω) < no(ω) :אם נתחשב בדיספרסיה של הגביש ,הרי שחייבת להיות זוית θmכך ש:
) . n eff (θ m , λ)=no (θ m , 2 λנציב דרישה זו במשוואה 24ונקבל
.
no ( 2 λ)−2−no ( λ)−2
ne (λ )−2−n o (λ)−2
2
= )(25) (sin θ m
מכאן ש – phase matchingמושלם ב – BBOמתקבל כאשר קיטוב הקרן המוכפלת מאונך לקיטוב
הקרן המשרה את הפולריזציה .הכפלת תדר מסוג כזה ,כלומר חיבור שני פוטונים מקוטבים במקביל לקבלת
פוטון שלישי בעל תדר כפול וקיטוב מאונך לזה של שני הפוטונים ההתחלתיים נקרא .type I SHGעל מנת
להפחית איבודים להחזרה מהפן הקדמי ולמנוע דיספרסיה כרומטית ,הגבישים נחתכים בצורה כזו שהקרן
המקורית פוגעת בהם בניצב ,כל חיתוך מבטיח phase matchingלתחום צר יחסית של אורכי גל.
המרת אור מסוג אחר מתקבלת בתווך סימטרי ביחס לפעולת האינוורסיה ולכן חייבת להגרם על ידי
52
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
נוכחות של ) χ(3במשוואת הפולריזציה )אנו מזניחים איברים מסדרים אי זוגיים גבוהים יותר( .מדובר בתופעת
ה – SPMהשימושית מאוד לצורך הרחבת ספקטרום הפולס .116תנועה של פולס אולטרה קצר ,עצמתי בתווך
דיאלקטרי משנה את אינדקס השבירה של המדיום בזמן באמצעות אפקט .Kerrהאינדקס המשתנה יגרום בתורו
להסט פאזה של הפולס ,מה שבסופו של דבר יוביל לשינוי הספקטרום של הפולס .נדגים זאת באמצעות
משוואות .העצמה כפונקציה של הזמן של פולס גאוסי אולטרה קצר נתונה על ידיI (t)= I 0 exp(−t 2 / τ2 ) :
ואינדקס השבירה של החומר כאשר אפקט Kerrנלקח בחשבון יהיה
(26) n=n 0+(3 χ(3) /8 n 0)∣ E⃗ω∣2=n0+n2 I .
אם התקדמות הפולס בתווך העצמה של האור בנקודה מסוימת של התווך עולה ויורדת לאחר שהפולס עובר
אותה .אינדקס השבירה ישתנה לפי המשוואה
(
)
−2 t I 0
) dn( I
dI
=n2 =n2
exp (−t 2 /τ 2 ) .
2
dt
dt
τ
)(27
השתנות של אינדקס השבירה בזמן מסיטה את פאזה הרגעית
2π L
n0+n 2 I 0 exp (−t 2 /τ 2 )) .
(
λ0
(28) ϕ(t)=ω0 t −
במשוואה האחרונה λ0ו – ω0הוא אורך גל ותדר הנושא של הפולס בוואקום ו – Lהוא המרחק אותו עבר
הפולס בחומר .הסט פאזה גורר הסט תדר .התדר הרגעי נתון על ידי
4 π L n2 I 0
)d ϕ(t
) 2 π L dn( I
=ω 0−
=ω0+
⋅t exp(−t 2 / τ2 ) .
2
dt
λ0
dt
λ0 τ
(
)
=)(29) ω( t
איור 50מציג את התדר הרגעי של הפולס כפונקציה של הזמן ,לפי משוואה .29רואים שקדמת הפולס
מוסטת לתדרים נמוכים ,זאת אומרת לאדום ואילו זנב הפולס מוסט לכחול .מכאן שהספקטרום של הפולס מכיל
כעת תדרים חדשים שלא היו כוללים בו מלכתחילה .הסט של מרכז הפולס מתקבל על ידי פיתוח לטור טיילור
של ) ω(tסביב t = 0והוא בקירוב טוב לינארי:
.
איור Self phase modulation : 50של פולס אור
אולטרה קצר עצמתי בעוברו בתווך דיאלקטרי
סימטרי ביחס לאינוורסיה.
)
4 π L n2 I 0
λ0 τ2
(
⋅(30) ω( t)=ω 0+t
מכאן שבנוסף להרחבה ספקטרלית סימטרית אפקט ה –
SPMישרה על הפולס chirpלינארי )בקירוב( ,מצד שני
אין כאן הרחבה בזמן של מעטפת הפולס .דיספרסיה רגילה
)תלות של אינדקס שבירה לינארי בתדר( ,אם היא קיימת,
תרחיב את הפולס גם בזמן.
שיטה מתוחכמת יותר להמרת אור ואחרונה שנדון
בה מאפשרת שליטה באורך גל של האור המתקבל .היא
נקרית הגבר אופטי פרמטריOptical Parametric ) ,
.115Amplification (OPAהמגבר שלנו הוא מכשיר
53
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
מסחרי של , Quantronixהוא פועל בשיטת הגבר של סופר – פלואורסנציה פרמטרית אשר מיוצרת בגביש
BBOעל ידי פולס מוגבר של .Ti:sapphireשמו Traveling – wave OPA of Superfluorescence
.TOPASמכשיר ה – TOPASמאפשר המרת פולסים ממורכזים סביב 790nmשל האוסצילטור לפולסים
קצרים בתחום אורכי גל רחב .2580nm – 450
המונח סופר – פלואורסנציה בא לציין כי העצמה של הפליטה הספונטנית במקרה זה מתכונתית למספר
הצורונים הפולטים בריבוע ,כלומר האופי של הפליטה הוא קוהרנטי .במקרה שלנו ,הפולריזציה אשר מייצרת את
הפליטה היא מראש מתואמת פאזה )קיים דיפול מקרוסקופי בתווך הפולט( בזכות הקוהרנטיות של האור המשרה
)יש הקוראים לסופר – פלואורסנציה מסוג זה ,(superradianceאך במקרים אחרים סופר – פלואורסנציה
יכולה להתרחש גם עקב עירור לא קוהרנטי .נציין כי תהליך יצירת הקרינה הפרמטרית הוא לא תהודתי ,כלומר
אין כאן פליטה ספונטנית/מאולצת של אוכלוסיה מעוררת .אי לכך ,השם פיזור פרמטרי ) parametric
(scatteringמתאים יותר לתיאור התופעה.
לצורך פשטות התיאור נחלק את תהליך ההגבר הפרמטרי לשני שלבים .השלב הראשון הוא יצירת פיזור
פרמטרי ראשוני חלש אשר נקרא .seedבשלב זה פולס קצר ועצמתי של האוסצילטור בתדר
ω1=2 π ν 1=2.4⋅1015 Hzמתחלק בגביש לא לינארי לשני פולסים תוך כדי שימור תנע ואנרגיה ,במילים
אחרות ,תדרים ווקטורי גל של שני הפולסים מקיימים . k⃗2 +k⃗3= k⃗1 , ω2 +ω3=ω 1 :ב – TOPASשלנו
התווך הלא לינארי בו הפיצול מתרחש הוא גביש BBOכלומר איבר של פולריזציה המתכונתי לריבוע השדה
מנוצל לצורך הפקת פיזור פרמטרי .כמו במקרה של ה – SHGשתיארנו ,כך גם עבור יצירת פיזור פרמטרי ,תנאי
ה – ( n 1 ω1 =n 2 ω 2+n 3 ω 3 ) phase matchingצריך להתקיים על מנת שתתאפשר זרימת אנרגיה מקרן ה –
boosterבתדר ω1לקרן ה – signalוה – idlerבתדרים ω2ו – ω3בהתאמה .אי לכך ,שליטה בזווית גביש
ה – BBOביחס לקרן boosterמאפשרת בחירה של תדרי ה – signalוה – .idlerבמסגרת אלקטרודינמיקה
קלסית לא ניתן לתת הסבר להופעת התדרים ω2ו – ,ω3בתנאים היפותטיים של .0Kמקור הפוטונים האלה
במודל הקוונטי הוא רעש פרמטרי ראשוני ,כלומר פלקטואציות של שדה הוואקום .ברגע שפיזור פרמטרי מייצר
פוטונים ראשונים ,ניתן להסתכל על המשך התהליך כעל הגבר של קרינה קיימת ,כלומר תהליך הפיזור הופך
להיות מאולץ .שלב יצירת ה – seedב – TOPASנעשה תוך כדי שלושה מעברים משותפים בהם קרן
boosterחלשה חופפת את קרן seedבתוך הגביש .ה – seedעצמו נוצר כבר במעבר הראשון כך שתפקידם
של שני המעברים הבאים הוא לעצב את ה – seedולשפר את הקוהרנטיות שלו.
שלב הגבר ה – seedהוא שלב שני בסכמת ההגבר הפרמטרי .השיטה שבה הדבר נעשה ב – TOPAS
היא חפיפה של ה – signalעם קרן boosterחזקה פעמיים נוספות ,תוך כדי ניפוי של ה – idlerלפני כל
חפיפה .בשלב ההגברה הפוטונים של ה – signalמאלצים את הפוטונים של ה – boosterלהתפזר ובכך
מייצרים בחזרה את קרן ה – .idlerהניפוי של ה – idlerבכל אחד משלבי ההגברה הכרחי ,בלעדיו הקרן
המופקת מה – TOPASהופכת להיות מאוד לא יציבה .לאחר חלוקת הפוטונים של ה – boosterניתן לעשות
מניפולציות נוספות למשל להכפיל את תדר ה – signal/idlerאו לייצר תדר סכום של שניהם )הכפלת תדר היא
מקרה פרטי של יצירת תדר סכום של שני פוטונים(.
54
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
מערך ניסיוני.
איור 51מציג סכמתית את עיקר המערך הניסיוני שלנו .פלט Ti:sapphireמוגבר )פולסים באורך 30fs
במחצית גובהם ,בעלי מרכז ספקטרום ב – ,790nmבאנרגיה של ~0.5mJלפולס ,בתדר pulse trainשל
,450Hzמחולק על ידי beam splitterלשני קרניים שוות הספק .הקרן הראשונה שואבת את ה – TOPAS
לצורך יצירת signalבתדר .1.15µmקרן אינפרה אדומה זו מחולקת בתורה לשתיים על ידי splitterנוסף
וחלק ממנה מוכפל תדר ל – 580nmבגביש BBOבעובי .0.25mmהקרן המוכפלת תשמש כ – .pumpפולסי
ה – pumpמכווצים על ידי זוג פריזמות )לא מוצגות באיור (51על מנת לתקן chirpהנצבר על ידם בעקבות
מעבר בעדשות וב – .BBOהשארית האינפרה אדומה הלא מוכפלת משמשת .dumpהנחנו כי ביצוע
dumpingב – 1.15µmלא יגרום ל – repumpשל האוכלוסיה המעוררת ,אורך גל מרכזי של ה – dump
שלנו מספיק רחוק מאזור החפיפה של פליטה ובליעה של מצב מעורר המתוארת על ידי Kobayashiבעבודתו
על .99sHRפולסי probeרחבי תדר התקבלו באמצעות מיקוד של חלק מפלט הלייזר אשר לא נוצל ב –
TOPASלתוך לוחית sapphireבעובי 2.5mmלצורך יצירת אור לבן .קרן זו פוצלה גם היא וחלק ממנה
שימש קרן ) referenceמשוואה .(10אורך הדרכים האופטיות של קרני pump, dumpו – probeהיה שווה
)איור 51לא ממחיש עובדה זו( על מנת להבטיח הגעה של שלושת הפולסים לדגם בסמיכות .כוון עדין של
הדרכים נעשו באמצעות delay linesאשר מסומנים R.Rבאיור .51
פולסי pump, dumpו – probeזהי קיטוב מוקדו לתא שהכיל את הדגם .עוביו של התא היה
0.5mmועובי דפנות הזכוכית שלו ) (crown – glassהיה .0.15mmפולסי ה – probeמוקדו לתוך נקודה
בקוטר ,0.1mmואילו מיקוד ה – pumpוה – dumpהיה פחות חזק ,שני הפולסים הללו מוקדו לכדי
.0.2mmמדידת שטף ה – pumpהניבה תוצאה של 6.5×10 14 photons /cm2ועוצמת הסיגנל הנמדד הייתה
לינארית עם השטף עד לערך זה .מדידה מדויקת של שטף ה – dumpהייתה בעייתית מבחינתנו ,זאת עקב
מגבלה של כושר הגילוי של אמצעים שעמדו לרשותנו בזמן הניסוי בתחום אורכי גל של ה – ) dumpממדידה
באמצעות מד עצמה חומני גס אנו מעריכים כי שטף ה – dumpבניסויינו היה .( 5×1015 photons /cm2
בדקנו ולא מצאנו שום השפעה של פולס ה – dumpעל pHRבמצב יסוד .על מנת לחדש את הדגם בין שני
איור :51החלק השמאלי מציג האופן סכמטי את המערך הניסיוני שלנו .פרטים לא חיוניים להצגה הושמטו בכוונה.
ספקטרה של ה – pumpוה – dumpמוצגים בחלק הימני של האיור על רקע ספקטרום הבליעה של pHRבמצב יסוד.
55
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
פולסי pumpעוקבים דאגנו לסירקולציה תמידית שלו באמצעות משאבת מזרק ,בקצב הנדרש .לאחר המעבר
בדגם פולסי probeיחד עם פולסי ) referenceאלה לא עוברים בדגם( נאספו לתוך סיבים אופטיים והוסעו
לתוך ספקטרוגרף בעל שני מערכים של דיודות 512 ,דיודות בכל מערך .מתוך ארבעה ספקטרה של צפיפות
אופטית המתקבלים לכל השהיה ) tכל אחד מהם הוא ממוצע של אלפי פולסים( ,ספקטרום יחיד של )ΔOD(t
מחושב על פי משוואה .10
אופן הכנת דגם החלבון היה כדלהלן :תאי E. coliמהונדסים גנטית ) (BL21 strainגודלו
בטמפרטורה של 37°Cעל גבי מצע מזין עם תוספת של 50mg/mLשל אנטיביוטיקה ) (kanamycinבמיכל
תסיסה בנפח .10Lבמהלך הגדילה של התאים הוספו למצע 10µMשל רטינל all – transו – 0.5mMשל
.IPTGחומר זה משמש טריגר לתחילת שעתוק של אופרון ,lacפעולה זו מקנה את היכולת של מטבוליזם של
לקטוז לתאי . E. coliלאחר דגירה של ארבע שעות התאים נאספו והוקפאו בטמפרטורה של -20°Cעל מנת
לגרום לפירוק של דופן וקרום התא .בשלב הבא התאים השבורים הופשרו והוכן מהם תרחיף )בעל pH 7על ידי
הוספת בופר ( HOCH 2)3 CNH 2−HClהידוע בשמו המקוצר (Tris-HClשרכיביו הופרדו בסופו של דבר
על ידי צנטריפוגציה .לאחר מכן המשקע הורחף בבופר Sאשר מבוסס על 50mMשל חומצת )(MES
. 2−( N −morpholino )ethanesulfonic acidבנוסף לחומצת MESבופר זה מכיל NaClבריכוז ,0.5M
דטרגנט ) n–dodecyl–β–D–maltoside (DMהמרכיב – 0.5%מהתמיסה ו – imidazoleבריכוז ,5mM
הבופר שומר על pHקבוע של התמיסה בסביבות .6ההרחפה נעשתה באמצעות ערבוב של 12שעות
בטמפרטורה של . 4°Cבשלב הבא התרחיף שוב עבר צנטריפוגציה והפעם חלק ששקע הורחק .התרחיף מעל
המשקע נאסף והועבר דרך קולנת הפרדה מבוססת .Ni-NTA agaroseשרף הקולנה נשטף באופן אינטנסיבי
על ידי בופר ) Wהזהה לבופר Sאבל מכיל רק (DM 0.06%לאחר מכן ריכוז ה – imidazoleהוגדל ל –
100mMעל מנת להרחיק חלבונים שנקשרו למצע הקולונה באופן לא ספציפי .בשלב הבא pHRהוצא
מהקולונה על ידי הזרמת בופר Eבעל pH 7.8והרכב0.5M NaCl, 50mM Tris-HCl, 0.3M imidazole :
ו – .DM 0.06%הבופר הסופי ששימש לייצוב החלבון היה בעל pH 7ודומה בהרכבו לבופר Eאך לא הכיל
imidazoleוריכוז המלח בו הוקטן ל – .0.3M
נציין כאן עובדה חשובה .אופן ההכנה של הדגם שלנו לא אפשר את היקשרות של קרוטנואיד
בקטריורוברין לחלבון .קרוטנואידים מצויים באופן טבעי בממברנות של ארכיאה ,אך לא בממברנות של
בקטריה .לכן תוצאה של ביטוי הגן המקודד ל – pHRב – E. coliהיא חלבון עם כרומופור אחד בלבד,
הרטינל .אי לכך ,חקר יחסי הגומלין של שני הכרומופורים של pHRלא התאפשר ,עקב מגבלות הדגם.
עיבוד נתונים.
שלב ראשון של עיבוד התוצאות שלנו הוא תיקון הדיספרסיה של ה – .probeציינו כבר כי לצורך
קבלת רזולוציית זמנים טובה בניסויי pump-probeיש צורך בערך FWHMקטן של פונקציית הקרוס –
קורלציה בין ה – pumpל – .probeהוספת פולס dumpלסכמה הניסיונית גורמת לרזולוציית הזמנים להיות
תלויה בקרוס קורלציה של שלושת הפולסים )אם כי לפעמים ניתן להזניח את ה – ,pumpבמיוחד אם הוא קצר
ביחס לשני הפולסים האחרים וההשהיה בינו לבין ה – dumpארוכה מספיק ומאפשרת שיכוך של תהליכים
56
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
מהירים( .על מנת לקצר את משך הפולסים אנחנו משתמשים בשיטות כיווץ שונות )כך למשל ה – pumpשלנו
מכווץ על ידי זוג פריזמות( אך במקרים מסוימים ,הכיווץ לא מתאפשר מסיבות טכניות .פולס probeבניסויינו
מופק על ידי יצירת אור לבן ב – sapphireתוך כדי ניצול SPMשל פולס מוגבר של האוסצילטור .כיווץ יעיל
של אור לבן כזה דורש שילוב של אמצעים ,הסיבה לכך היא הספקטרום הרחב שלו .במקרה זה הכיווץ יחליש
משמעותית את העצמה הסופית של הפולס ,לצורך המחשה ,לאחר ארבע פגיעות בזוג סריגים הפולס יכול לאבד
יותר מ – 3/4מהאנרגיה שלו ואם בנוסף לכך נדרש מעבר בפריזמות ואמצעים אחרים )כגון מראה מתעוותת או
( chirp mirrorsאזי בסוף העצמה של הפולס המכווץ דועכת לכעשירית עד חמישית מהערך ההתחלתי.
מכיוון שאין אנו רוצים להגדיל את הרעש על חשבון סיגנל בתוצאות שלנו אנחנו לא מכווצים את ה –
probeומתקנים את הדיספרסיה שלו באמצעות מניפולציות מתמטיות של התוצאות .בחלק של התוצאות נציג
את ה – scansשלנו כמפה ,ערך הפרש צפיפות אופטית ייוצג כפונקציה של אורך גל וזמן השהיה בין ה –
pumpל – probeעל ידי צבעים שונים .דיספרסיה של ה – probeמשתקפת בתוצאות בכך שעליית
אמפליטודת הסיגנל מ – 0באורכי גל כחולים מתרחשת בזמני השהיה מוקדמים יותר .אין זה אומר של – probe
שלנו chirpשלילי ,אחרי הכל ,מתן ההשהיה בין ה – pumpל – probeמתבצע על ידי הארכת הדרך
האופטית של ה – , probeלכן כששני הפולסים יתחילו לחפוף בזמן בתוך הדגם ה – pumpיתפוס בהתחלה
את ה"זנב" של ה – , probeכלומר את אורכי גל הכחולים שלו ,מה שמסביר את העובדה שהסיגנל מתחיל
להופיע בכחול.
תיקון הדיספרסיה של ה – probeמתבצע באופן הבא :אנו מחליפים את הדגם בתא בתמיסת בופר
נקייה שלו )הדגם החדש מכיל את כל הרכיבים שלו חוץ מהחלבון עצמו( ומריצים על תמיסה זו ניסוי – pump
probeשעשינו לפני זה על הדגם שהכיל את החלבון .בדרך זו אנו מחסירים את תרומת הצורונים הפעילים
אופטית מהסיגנל המתקבל .לכאורה ,ניתן היה לצפות שלא נראה סיגנל כלל במצב זה ,אך תהליכים רב פוטוניים
עדיין מתרחשים ולכן scanכזה יראה סיגנל הנובע מה – ) Cross Phase Modulation (CPMבין ה –
pumpל – .probeתהליך זה דומה ל – SPMומתרחש עקב שינוי אינדקס השבירה של התווך על ידי ה –
pumpעבור ה – . probeסיגנל זה יראה בקירוב ראשון כגאוסיאן )כפונקציה של הזמן( ויופיע בזמנים
מוקדמים בצד הכחול של הספקטרום ובמאוחרים באדום .לעקומת הדיספרסיה כפונקציה של אורך גל הנקבעת
על ידי השיאים של אותם גאוסיאנים נתאים פולינום מסדר נמוך ונשתמש בערכים שלו על מנת להסיט את
הנתונים של ה – scanהכולל את הצורונים הפעילים כך שעקומת הדיספרסיה תתיישר .תיקון זה מאפשר קביעה
מדויקת של זמן תחילת העלייה של הסיגנל באורך גל מסוים וניתוח דינמיקה/קינטיקה נצפית של הדגם ללא
חשש שהיא נובעת מדיספרסיה של ה – .probe
דרך פשוטה לאפיין את התפתחות בזמן של ספקטרה הפרש בליעה טרנזיינטיים של צורון פעיל אופטית
מסוים היא להתאים את ) ΔOD(tבכל אורך גל לסכום של סט מצומצם של פונקציות אקספוננציאליות דועכות
בזמן .משמעות של "סט מצומצם" במקרה זה היא שההתאמה עבור כל אורך גל נעשית רק באמצעות שינוי
המקדמים של האקספוננטים )המרכיבים את אותו סט( בסופרפוזיציה .יש כאן הנחה כי ההתנהגות של הספקטרה
הטרנזיינטיים בזמן היא אחידה על פני טווח רחב של תדרים ,כלומר מה שאנחנו מחפשים זה את ההתנהגות
הגלובלית בזמן של ה – .dataסוג כזה של התאמה נקרא התאמה גלובלית .117תוצאה של ניתוח כזה היא מספר
57
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
ספקטרה ,כמספר האקספוננטים בסט ,הדועכים בזמן באופן מונו – אקספוננציאלי .כל אחד מספקטרה אלה
מזוהה עם רכיב דעיכה יחיד ולכן נקרא Decay Associated Spectrumאו .DASכל ה – DASבעלי
אמפליטודה מקסימלית בזמן t = 0והסיגנל OD , tבכל נקודת זמן ובכל אורך גל הוא סופרפוזיציה של
ה – :DAS
(31) Δ OD (t ,ω)=Δ OD 0 (ω)+∑ Δ OD i (ω)exp (−t/ τ i) .
i
האיבר ) Δ OD 0 (ωהוא פונקציית ) δשל הזמן( והכנסתו נדרשת לצורך תיאור של סיגנל הנובע מ – CPMבין
ה – pumpל – . probeבנוסף ,על מנת לתאר את העליה של הסיגנל ,כל אחד מהאקספוננטים וגם האיבר
) Δ OD 0 (ωהם convolutedעם פונקציית תגובת המערכת ) .Instrument Response Function (IRF
בניסוי שלנו ה – IRFהיא פשוט קרוס – קורלציה של שלושת הפולסים.
התאמה גלובלית לא מתאימה לאפיון התנהגות דינמית של הספקטרה ,כמו למשל הסט בזמן של פס
בליעה/פליטה מסוים .על מנת לקבל התאמה להתנהגות דינמית יש צורך בסט אינסופי של אקספוננטים .אי לכך,
שיטה זו טובה מאוד לניתוח הקינטיקה של OD , tואינה מתאימה כלל לזיקוק הדינמיקה מתוך הנתונים.
למרות מוגבלותה של שיטת ההתאמה הגלובלית היא כלי אנליטי נח לצרכים שלנו כי שלב דינמי באבולוציה
ספקטרלית של רודופסינים ארכיאליים הוא יחסית קצר ולאחר כמה מאות פמטושניות מרגע העירור התנהגות של
הספקטרום היא קינטית לחלוטין ,הפסים המזוהים עם מעברים נשארים מעוגנים באזור ספקטרלי מסוים ולא
"מטיילים" בתחום התדר.
התאמה סימולטנית של התפתחות בזמן של הטרנזיינטים בכל אורכי הגל היא אפשרית אך לרוב ניתן
לצמצם באופן דרסטי את ממד מטריצת הנתונים ) mאורכי גל על nנקודות זמן( ,כך שהאינפורמציה אודות
האבולוציה של הספקטרה תשמר והרעש יורחק .שיטה שבה הדבר מושג נקראת ) Singular Value
.118Decomposition (SVDשיטה זו מפרקת את מטריצת m×nהמקורית למכפלה של שלוש מטריצות:
)M =U ΣV † (32
כאשר Uהיא מטריצה m×mאוניטרית V† ,היא ) conjugate transposeצימוד הרמיטי( של מטריצת V
אוניטרית שהיא ) n×nשתי המטריצות הנ"ל יכולות להיות מרוכבות( ו – Σהיא מטריצה m×nעם ערכים
ממשיים אי שליליים על האלכסון הראשי .הערכים Σi,iנקראים ערכים סינגולריים של .Mוקטורי העמודות mו
– nשל Uו – Vנקראים וקטורים סינגולריים שמאליים וימניים של Mבהתאמה .שיטת ה – SVDהיא הכללה
של תהליך הלכסון על מטריצות שאינן ניתנות ללכסון ,בפרט מטריצות , m×nכאשר m≠nבמובן זה
שהווקטורים הסינגולריים השמאליים של Mהם וקטורים עצמיים של † MMוהימניים ,של . M † Mהערכים
הסינגולריים של Σהשונים מ – 0הם שורשים ריבועיים של הערכים העצמיים של † MMאו . M † M
הערכים הסינגולריים של Mנותנים בעצם את המשקל של המכפלה הווקטורית של העמודות של ,U
שבמקרה שלנו מהוות פונקציות של סיגנל כתלות בזמן ההשהיה ,בשורות של † ,Vשהם הספקטרה .אם נסדר את
את שלושת המטריצות באופן כזה שהערכים הסינגולריים של Σקטנים באופן מונוטוני עם ההתקדמות לאורך
האלכסון הראשי אזי נוכל לצמצם את מטריצה Mהמקורית על ידי כך שנזניח מכפלות בעלות משקלים נמוכים
)מעשית זה פשוט אומר להחליף את הערכים הסינגולריים שלהם באפסים במטריצה Σולבצע את המכפלה
58
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
לקבלת מטריצה ' Mחדשה( .פעולה זו לא רק מאפשרת ניקוי רעש ממטריצת הנתונים ,היא גם מקלה על תהליך
ההתאמה הגלובלית .מספר מצומצם של וקטורי העמודות של Uאוגר בתוכו את כל האינפורמציה המעניינת
אודות האבולוציה הספקטרלית של הנתונים שלנו ולכן מספיק להתאים סט של אקספוננטים רק לוקטורים הללו
על מנת לאפיין את ההתפתחות של הספקטרה בזמן.
ניתוח גלובלי של הספקטרום שכולל צמצום על ידי SVDיכול להוביל לכך שלא נבחין בהתנהגות
מחזורית שלו בזמן .אמפליטודת תנודות של הטרנזיינטים המשקפת דינמיקה ויברציונית של הדגם עשויה להיות
קטנה .על מנת להוציא אינפורמציה זו מה – dataשלנו יש צורך בפירוק ממד הזמן שלו לרכיבי פורייה .בניתוח
מסוג זה אנו מעוניינים לנפות החוצה דווקא את הדעיכה המונוטונית של הסיגנל ,זאת נעשה על ידי החסרה של
התאמה מולטי אקספוננציאלית )שקיבלנו לפני כן( מטרנזיינטים בכל אורכי הגל .את השארית שנקבל נחתוך
בזמנים רלוונטיים לזמן dephasingויברציוני אופייני של הדגם .במקרה שלנו נקח קטע של הספקטרה בין 200
ל – 2000fsמתחילת העלייה של הסיגנל .הזמנים המאוחרים יותר לא מעניינים מבחינת ניתוח ויברציוני בגלל ה
– decoherenceשל תיאום פאזה התחלתי של האוסף וזמנים מוקדמים יותר מראים עלייה מהירה של סיגנל,
השתנות מהירה כזאת של הטרנזיינט יכולה להכניס ארטפקטים לטרנספורם פורייה .תוצאה של ניתוח כזה היא
מיפוי של רכיבי פורייה לפי אורך גל ,מפת ) Discrete Fourier Transform (DFTשמתקבלת מראה על
איזה פס רוכבות ויברציות בתדר מסוים ,כלומר בעזרתה ניתן לצמצם את מספר משטחי הפוטנציאל המעורבים ל
– 2המקושרים על ידי אותו מעבר ספקטרלי .ניתן גם לנתח את מבנה הפאזות של מודולציות הטרנזיינטים ,כפי
שציינו קודם נצפה להפרש פאזה של πבין מודולציות בקצוות המנוגדים של הפס .על ידי כך לתחום את הפס
ולהפריד אותו מפסים ספקטרליים אחרים איתם הוא חופף.
59
תוצאות
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
ספקטרה בליעה טרנזיינטיים של .pHR
איור 52מציג ספקטרה הפרש בליעה טרנזיינטיים של pHRכמפה .הציר האופקי הוא ציר אורכי גל
והציר האנכי הוא ציר הזמן .הצבעים במפה מציינים את עצמת הסיגנל ,לפי סרגל הצבעים המצורף .הספקטרום
הנ"ל נמדד בניסוי pump – probeפשוט ,פולס ה – dumpהאינפרה אדום לא נכלל בשלב זה בסכמה
הניסיונית .מטרת ניסוי זה הייתה לקבל ספקטרום טרנזיינטי באיכות טובה על מנת שנוכל להשוות אליו את
תוצאות ניסויי pump – dump – probeבחקירתנו את השפעת הפולס האינפרה אדום על האוכלוסיה
המעוררת ועל תוצר " " Kשל מעגל האור .אך כפי שכבר אמרנו ,לא פורסמו למיטב ידיעתנו תוצאות ניסוי
pump – hyperspectral probeעל pHRברזולוציית זמן של הניסוי שלנו ,לכן נתאר בקצרה את מה
שרואים באיור .52
איור :52ספקטרום הפרש בליעה טרנזיינטי של pHRבזמנים מ – −0.2psעד
15psלאחר תיקון הדיספרסיה של פולס ה – ) probeתיקון GDD group delay
.(dispersion
הצד הכחול של הספקטרום נשלט על ידי בליעה של המצב המעורר ,S1שיאה ב – .475nmפס בליעה
זה מוסט לכחול בזמנים המוקדמים וחופף חלקית את ה – bleachשל מצב יסוד אשר מייצר סיגנל שלילי באזור
של .580nm – 570מצדו האדום של פס ה – ground state bleachמופיעה פליטה מאולצת של מצב מעורר
אשר מחולקת לשני שיאים ,סביב 720ו – .830nmכל ה מאפיינים הספקטרליים של המצב המעורר דועכים תוך
כ – 20psומשאירים ספקטרום הפרש בליעה בין המצב ההתחלתי לבין מצב .Kזהו הספקטרום השחור החלש
בגרף הראשון מימין באיור .53ספקטרום כחול באותו הגרף מראה הגדלה של הנ"ל פי .8רואים בו סיגנל חיובי
מאדום ל – bleachשל מצב יסוד המשקף הסט קל לאדום של פס הבליעה של תוצר Kבמעגל האור של pHR
לעומת מצב יסוד התחלתי.
כמו בעבודות קודמות על הלורודופסין ,כך גם בעבודתנו ,אפיון ההתפתחות בזמן של הספקטרום
60
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :53אבולוציה של המאפיינים הספקטרליים של המצב המעורר S1של .pHRשלושת הגרפים מציגים הפרש
צפיפות אופטית כפונקציה של אורך הגל בזמנים שונים ומהווים חתכים רוחביים של הספקטרום הטרנזיינטי באיור 52כל
שלושת הגרפים מציגים בנוסף את בליעת מצב היסוד של pHRבירוק .באמצעותה ניתן בקלות לאתר את הסיגנל השלילי
הנובע מה – photobleachingשל מצב היסוד .גרף 3מציג בצבע כחול את ספקטרום ההפרש ב 30ps -מוכפל ב – .8
הטרנזיינטי של pHRנעשה באמצעות התאמה גלובלית שלו לאחר ניקויו על ידי ,SVDלמודל קינטי המניח
קיום החל מזמן t = 0של כל הצורונים אשר תורמים לספקטרה ההפרש ) .(parallel kinetic modelחמישה
DASהספיקו על מנת לקבל התאמה טובה :ספקטרום קבוע שלא דועך בסקלת הזמנים של הניסוי שלנו,
שלושה ספקטרה אשר דועכים אקספוננציאלית עם הקבועים 2 ,0.22ו – 5psוספקטרום המתנהג כמו פונקציית
δבזמן ומתאר את תרומת ה – CPMבין ה – pumpל – probeלסיגנל .הכנסתו של DASזה נדרשת לצורך
קבלת התאמה טובה בזמנים המוקדמים .כל DASמהווה קונוולוציה של תגובת המערכת עם פונקציה גאוסית
בעלת רוחב של 70fsבחצי הגובה ,היא פונקציית תגובת המכשור ) . (IRFאיור 54מציג את חמשת ה – .DAS
ניתן לראות כי שלושת ה – DASהדועכים עם קבועי זמן סופיים כמעט חופפים בקצוות הספקטרום אבל שונים
באזור של הסיגנל החיובי הנובע מהופעת פס הבליעה של התוצר .K
התבוננות מקרוב על החלק האדום של הספקטרום באזור של פס הפליטה המאולצת חושפת מודולציה
מחזורית דועכת של אמפליטודת הטרנזיינטים
באורכי גל ) 830nm – 670איור .(55מודולציה
זו קונסיסטנטית עם קיום ויברציות נמוכות תדר
של הכרומופור במצב אלקטרוני מעורר
הנובעות מתנועה קוהרנטית של חבילת גלים
ויברציונית אשר ממוקמת על המשטח העליון
במהלך העירור האימפולסיבי .מודולציות
נמוכות תדר הרוכבות על טרנזיינטים באזור פס
הפליטה המאולצת דווחו עבור BRועבור
RPSBבתמיסה .במקרה של BRתדר
הוויברציה הוא 170cm-1ועבור RPSBתדר זה
נמוך יותר ועומד על .120cm-1בשני המקרים
איור DAS :54המתקבלים על ידי התאמה גלובלית של
ספקטרום המוצג באיור 52עם סופרפוזיציה של פונקציות דעיכה האלה הוויברציה האחראית למודולציית
אקספוננציאליות בעלות קבועי דעיכה המוצגים בגרף.
הטרנזיינטים באזור הפליטה המאולצת יוחסה
61
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
איור :55בפנלים השמאליים נראים שאריות ) (residualsשל הטרנזיינטים באורכי גל ) 728כחול עליון( ו – 810nm
)כחול תחתון( לאחר הפחתת התאמה פולינומיאלית של הדעיכות שלהם .כמו כן מוצגים אותם ה – residualsלאחר
סינונם מרעש בעל תדר גבוה )בירוק( .בפנל הימני רואים מפת DFTשל החלק האדום של הספקטרום המכסה אזור של
פס הפליטה.
לתנועת פיתול המערבת חלקים גדולים של השלד המולקולרי של הרטינל .121,120,119אם המודולציות באזור
הפליטה ב – dataשלנו משקפות את אותה הויברציה ,הרי שתנועה מולקולרית זו אטית יותר ב – pHRמאשר
ב – BRו – .RPSBכפי שרואים במפת ה – ) DFT (Discrete Fourier Transformבפנל הימני באיור 55
ויברציה זו מאפננת את הטרנזיינטים ב – 830nm – 670בתדר של כ – 90cm-1בלבד .השארית האוסצילטורית
משנה סימן במעבר מ – 728ל – 810nmנשים לב כי אורכי גל אלה נמצאים בקצוות מנוגדים של פס הפליטה
המאולצת של . pHRנדון בהמשך מדוע נכון יותר לייחס את הוויברציות הנ"ל למצב מעורר ולא למצב יסוד.
תוצאות ניסוי .SEP
פולסי dumpהמקוטבים במקביל ל – pumpו – probeהוספו לסכמה הניסיונית בשני ניסויים
שונים .מטרת הראשון הייתה לבחון את השפעת ה – dumpעל האוכלוסייה המעוררת ,כתלות בהשהיה בינו
לבין ה – .pumpהשני נועד לבדוק האם ,ובאיזו מידה ה – dumpingבזמנים השונים משנה את אוכלוסיית
מעגל האור .הבדיקה הנ"ל נעשית באמצעות מעקב אחר שינויים בבליעת התוצר Kהנגרמים על ידי הפולס
האינפרה אדום ,בזמנים מאוחרים של ) 30psכלומר לאחר שההיפוך הפנימי של הרטינל המעורר הסתיים( .שני
ניסויים אלה אנלוגיים לניסוי על בקטריורודופסין אשר בוצע במעבדתנו ב – 2001ותואר בהרחבה במבוא .איור
56מסכם את תוצאות הניסוי הראשון .האיור מראה טרנזיינטים ממוצעים מפס הבליעה )המיצוע הוא על תחום
אורכי גל מ – 470עד (480nmוהפליטה ) (833nm – 823וכמו כן ,חלקים מתאימים ממוצעים של ספקטרום ה
– referenceמאיור . 52הגרפים הקטנים המוכנסים מציגים את היחס בין הטרנזיינטים הממוצעים עם ובלי
.dumpingנסכם את הממצעים של ניסוי זה:
•
ניתן להבחין בכך שלאחר המתנה מתאימה חלקי הטרנזיינטים לאחר ה – dumpחופפים )בגבול
הרעש( עבור כל ההדעכות ,ללא שום תלות בזמן ההדעכה.
62
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
• ההדעכה המוקדמת ב – 0.75psגורמת
לריקון פחות חזק של האוכלוסייה
המעוררת ,רואים את זה הכי טוב בקפיצה
קטנה יותר באמפליטודה של הטרנזיינט
האדום ב – .475nm
• התבוננות מדוקדקת יותר חושפת
הבדלים בין אפקט ה – dumpעל
הטרנזיינטים של הפליטה לאלה של
הבליעה .בטרנזיינטים של פליטה רואים כי
ה – dumpגורם ל"נפילת יתר" של
אמפליטודת הטרנזיינט אשר נצברת בחזרה
פמטושניות.
מאות
כמה
במהלך
בטרנזיינטים של הבליעה לעומת זה רואים
אפקט מתון יותר ובעל סימן הפוך ,כלומר
האמפליטודה ממשיכה לקטון כמה מאות
פמטושניות לאחר ה – .dump
• מידת נפילת האמפליטודה בבליעה
ובפליטה זהה .יחס בין חלקי הטרנזיינטים
לאחר ה – dumpל טרנזיינט ללא ה –
dumpבשני המקרים הוא בסביבות ה –
איור :56תוצאות ניסויי pump – dump – probeבשני אורכי גל
המייצגים בליעה ) (475nmופליטה ) (825nmשל מצב מעורר S1
,0.75כלומר כ – 25%מהאוכלוסייה
של .pHRהטרנזיינטים מראים תוצאות של dumpingבזמנים
שונים בשטף קבוע של פולס ה – .dumpכמו כן ניתן לראות את
המעוררת הוחזרה למצב יסוד על ידי פולס
תוצאות הניסוי ללא הדעכה )גרף שחור( בשני הפנלים .הפנלים
ה – .dump
הקטנים מראים יחס בין הטרנזיינט ללא ה – dumpלזה עם ה –
dumpבהשהיות שונות בין ה – pumpלפולס האינפרה אדום.
אי תלות של הסתברות הריקון של
האוכלוסייה המעוררת בהשהיה בין ה – pumpל – dumpנצפתה גם עבור .BRבמקרה ההוא אי התלות
יוחסה לכך שהאוכלוסייה המעוררת לא עוברת שינוי דינמי במהלך זמן החיים שלה .מספר המולקולות
המעוררות משתנה אך המולקולות עצמן לא עוברות שינוי . 86על מנת שנוכל לענות על השאלה האם הסבר כזה
מתאים לממצאים של הניסוי שלנו נצטרך תחילה לראות כיצד ה – dumpingבזמנים השונים במהלך החיים
של אוכלוסייה המעוררת משפיע על הבליעה של התוצר .Kספקטרה הפרש של התוצר נמדדו בזמני השהיה
מאוחרים בין ה – pumpל – ,probeב – .30psספקטרום אחד כזה נראה בפנל 3באיור .53הורדת
האוכלוסייה המעוררת על ידי הפולס באינפרה אדום אל משטח היסוד מתבטאת בהקטנת האמפליטודה של
הספקטרום הנ"ל .האמפליטודה מוקטנת באותו פקטור בכל אורכי הגל ,בגבול הרעש ,כך שספקטרום ההפרש
עם ה – dumpמתכנתי לאותו הספקטרום ללא ה – .dumpממצא ניסיוני זו נלקח בתור הבסיס לחישוב שבר
האוכלוסייה שהופחת ממעגל האור .עבור שמונה השהיות SEPאשר פורשות יותר מפעמיים את זמן החיים של
63
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
המצב המעורר ,S1נמדד ספקטרום ההפרש של התוצר Kב – .30psעבור שמונת הספקטרה חושב שבר
ההפחתה על פי הנוסחה הפשוטה הבאה
.
)∣∑ (∣dumped difference spectrum@ 30 ps
depletion fraction=1− λ
)∣∑ (∣difference spectrum @30 ps , no dump
)(32
λ
איור 57מציג את התוצאה ,כפונקציה של ההשהיה בין ה – pumpל – dumpעל רקע גרף המתאר את
הדעיכה הבי אקספוננציאלית של פליטת האוכלוסיה המעוררת בערכה המוחלט .הגרף הקטן בפינה הימנית
העליונה מציג שני ספקטרה הפרש של Kעם ובלי ,dumpingכאשר הספקטרום עם הפולס האינפרה אדום
נמדד עבור ההשהיה הקצרה ביותר ,0.75ps ,בינו לבין הפולס המעורר.
איור :57שבר ההפחתה מאוכלוסיית Kכפונקציה של השהיית ה –
SEPמוצג על רקע טרנזיינט של הפליטה המאולצת ב – 830nm
בערכו המו חלט ,באותה סקלת זמנים .אמפליטודת הטרנזיינט
מתכונתית לריכוז המצבים המעוררים .הגרף הקטן בפינה ימנית
עליונה מראה את השפעת הפולס האינפרה אדום ב – 0.75psעל
הספקטרום ההפרש של התוצר Kב – .30ps
להלן הממצאים:
•
ניתן "לקצר" את מעגל האור לאורך כל זמן החיים של אוכלוסיה מעוררת .S1
•
מידת ההנחתה של אוכלוסיית מעגל האור ,כפי שזאת באה לידי ביטוי בהקטנה הנגרמת על ידי ה –
dumpשל אמפליטודת הספקטרום של התוצר , Kמתכונתית לריכוז החלבונים המעוררים ברגע ה -
,dumpingבגבול האי דיוק של הניסוי שלנו.
64
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
דיון בתוצאות .א .צורת הטרנזיינטים בזמני השהיה מוקדמים.
ספקטרה בליעה טרנזיינטיים המוצגים באיור 52מזכירים את אלה של sHRאשר פורסמו על ידי
Kandoriב – 1992ו – Kobayashiב – ,1998לרבות האמפליטודה היחסית של פסי בליעה ופליטה והצורה
ה"דו דבשתית" של פס הפליטה המאולצת )איורים 26ו – .(31זמני הדעיכה של המאפיינים הספקטרליים של
המצב המעורר S1אשר התקבלו מהתאמה גלובלית של הנתונים שלנו מהירים מאלה של sHRודומים מאוד
לאלה שפורסמו על ידי Nakamuraעבור .56pHR
היבט אחד של תוצאות שלנו לא נצפה בעבודה ההיא .מדובר בדעיכה מאוד מהירה ) ,(~200fsלא
אקספוננציאלית של בליעת המצב המעורר סביב ) 470nmאיור 58פנל שמאלי מציג נתונים שהתקבלו בניסוי
שלנו ,בשטפי pumpשונים .טרנזיינט אשר התקבל באורך גל probeשל 490nmעל ידי Nakamuraוקולגות
נראה באדום בפנל ימני של איור זה .כפי ששמים לב ,אין לו רכיב דעיכה מהיר בזמנים המוקדמים( .מכיוון
שהדוגמאות אקוויוולנטיות ,מקור השוני הוא כנראה בייחוד אינטראקציית ה – pumpעם הדגם בכל אחד משני
הניסויים.
שני מאפיינים של ה – pumpעשויים ליצור את ההבדלים בין שני הסטים של ה – :dataעוצמת
הפולס ואורך הגל המרכזי שלו .מכיוון שבניסוי שלנו רצינו למדוד בדיוק מספיק טוב הפרשי אמפליטודה קטנים
הנגרמים על ידי ה – dumpשל ספקטרה חלשים של התוצר ,היינו חייבים להגדיל את שטף ה – pumpעל מנת
להפיק יותר אוכלוסיה מעוררת אשר תגיב בחלקה לתת את התוצר .Kיותר אוכלוסיה מעוררת משמעותה יותר
תוצר ,אך נדרש שטף pumpגבוה יותר על מנת לייצרה .שטף גבוה יותר יעלה את הסיכוי לבליעה דו – פוטונית
אשר עלולה לעוות את הדינמיקה הספקטרלית ,ובין היתר לגרום להופעה של דעיכה חדה לא אקספוננציאלית
בזמנים המוקדמים.
על מנת לוודא כי אין השפעת בליעה דו פוטונית על ערכי קבועי הדעיכה אשר קיבלנו מההתאמה
הגלובלית לספקטרה הטרנזיינטיים שלנו בדקנו את התנהגות האמפליטודה של הטרנזיינטים ב – 470nm
כפונקציה של עוצמת העירור .פנל שמאלי של איור 58מציג את התוצאה .ניתן לראות כי היחס בין חלקי
הטרנזיינטים המתקבלים בעוצמות של ( 6.5×10 14 photons /cm2 ) 20μWו – 40μWלבין טרנזיינט
איור :58השוואה בין דינמיקה ספקטרלית בזמנים מוקדמים בעבודה של ) Nakamuraימין( ובעבודתנו )שמאל( .הפנל
השמאלי מציג את הטרנזיינט ב – 470nmהמתקבל בעוצמות pumpשונות .הגרף המוכנס הקטן מראה את היחס בין
הטרנזיינטים בזמנים מ – 250fsעד .2.5ps
65
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
המתקבל בעצמה של 10μWנשאר קבוע )בגבול הרעש( מ – 250fsעד .2.5psמכאן שהתרומה של דינמיקה
ספקטרלית אשר נובעת מבליעה דו – פוטונית של הדגם זניחה אפילו בעוצמות הגבוהות של .40μWנציין כי
הניסויים בוצעו בעוצמת pumpשלא עולה על ,20μWלמען הסר כל ספק .כמו כן ,בכל ניסויי SEPה –
dumpingנעשה לאחר הפאזה הדינמית אשר מערבת את הדעיכה הלא אקספוננציאלית המהירה .מקור השוני
בין הנתונים שלנו לבין אלה של Nakamuraיכול להיות נעוץ באורכי גל pumpשונים בשני הניסויים .ה –
pumpשלנו היה כחול יותר 570nm ,מול 610nmבניסוי שלהם ,אך זוהי השערה שטרם נבדקה.
ב .מבנה פס הפליטה המאולצת.
את מבנה פס הפליטה המאולצת באזור של >650nmאנו מייחסים לתוצאה של חפיפת בליעה של
המצב המעורר עם פליטה שלו .חפיפה כזו הוצעה לראשונה על ידי P. A. Anfinrud, K. C. Hasson, F.
Gaiבעבודתם מ – , 1996כהסבר לשיא המוסת לאדום של פליטה מאולצת של בקטריורודופסין ,לעומת שיא
הפלואורסנציה של חלבון זה ) בבקטריורודופסין אמנם לא רואים מבנה "דו דבשתי" של הפליטה המאולצת ,אבל
גם שם יש עדויות לחפיפה של פליטה מאולצת ובליעה באורכי גל . 102(1000nm – 600מאוחר יותר רעיון זה
אומץ על ידי O. Bismuthלצורך מתן הסבר לשני השיאים הנפרדים של הפליטה המאולצת של .103RPSBגם
במקרה זה השיקול המרכזי לאימוץ השערת החפיפה היה חוסר ההתאמה של ספקטרום הפליטה המאולצת עם
ספקטרום הפלואורסנציה .הצורה הנקייה מחפיפות של פס הפליטה המאולצת צריכה לשחזר את הצורה של פס
הפלואורס נציה ,ניתן לגזור את פס הפליטה המאולצת מהפלואורסנציה על ידי הכפלתה בפקטור .ν2ספקטרה
פלואורסנציה של RPSBבממסים שונים אשר נלקחו מהמאמר של G. Zgrablićנראים בחלקו השמאלי של
איור . 8259כמו כן ,האיור הנ"ל מציג ספקטרה הפרש בליעה טרנזיינטיים מתוצאות המחקר של O. Bismuth
)חלק ימני( .רואים כי לפליטה המאולצת שני שיאים ב – 670וב – .900nmמנגד ,הפלואורסנציה בעלת שיא
יחיד ב – 600עד ,700nmכתלות בממס.
איור :59השוואה בין ספקטרה בליעה טרנזייניים של RPSBמהעבודה של O. Bismuth
)ימין( לספקטרה פלואורסנציה במצב עמיד של מולקולה זאת ,בממסים שונים אשר פורסמו
על ידי ) G. Zgrablićשמאל ,ספקטרה פלוארסנציה הם האדומים יותר .הכחולים מציגים את
הבליעה( .לפליטה המאולצת שני שיאים ב – 670וב – .900nmלפלואורסנציה שיא יחיד
באזור .700nm – 600
66
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
ניסויי פלואורסנציה מופרדת זמן אולטרה מהירה של pHRתרם נעשו .כמו כן ,לא מצאנו ולא מדדנו
ספקטרום פלואורסנציה במצב עמיד של חלבון זה .ספקטרום כזה עבור sHRפורסם ,ניתן לראות אותו באיור
. 23מהשוואה של ספקטרום זה עם הנתונים של הבליעה הטרנזיינטית של אותו החלבון מהעבודות של
Kobayashiעולה חוסר ההתאמה כמו עבור .RPSBפלואורסנציה של sHRבעלת שיא יחיד ב – 690nm
ואילו לפליטה המאולצת שני שיאים ב – 725ו – .850nmעל מנת לקבוע אם קיימת חפיפה של פליטה מאולצת
ובליעה באזור ספקטרלי >650nmבספקטרה הפרש בליעה טרנזייניים של pHRצריך לבחון את ספקטרום
פלואורסנציה של חלבון זה .אולם ,חפיפה כזאת קיימת בוודאות ב – BR, RPSBוב – sHRמה שמחזק את
הטענה שהדבר נכון גם עבור .pHR
בהינתן והחפיפה אכן קיימת ב – pHRאזי הסיבה לכך שפולס ה – dumpשלנו אדום כל כך ברורה
לחלוטין .תוצאת dumpingלתוך פס הפליטה המאולצת באזור של החפיפה היא בין היתר שאיבת האוכלוסיה
המעוררת אל רמות מעוררות גבוהות יותר ) .(Snאנחנו לא מעוניינים בכך כי לא ניתן לדעת אם אוכלוסיה
מעוררת על משטחי פוטנציאל גבוהים תוביל לתוצר או תחזור אל המגיבים .אין אנו יודעים בוודאות על קיום
אזור ספקטרלי "בטוח" ל – dumpingבהקשר זה ב – ,pHRאך ידוע כי הפליטה המאולצת של RPSB
מעורר נמשכת לאינפרה אדום קרוב ודועכת סופית באזור של ,1300nmכמו כן באזור של 1200nmהפליטה של
RPSBלא מראה שום מבנה העשוי לרמוז על חפיפתה עם בליעה .122לפיכך ,בחירת אזור ספקטרלי זה עבור ה –
dumpשלנו הגיונית .מצד אחד התרחקנו מספיק מאזור החפיפה ומצד שני ,ב – 1150nmהאמפליטודה
הספקטרלית של הפליטה המאולצת של pHRמעורר עודנה משמעותית.
ג .דינמיקה ספקטרלית בזמני השהיה מוקדמים.
פס הבליעה של המצב המעורר הממורכז סביב 470nmומיוחס למעברים S1 → Snמוסט לכחול
במאות פמטושניות ראשונות מזמן העירור .מאידך ,קשה לראות הסט של פס הפליטה המאולצת באורכי גל
>650nmהנגרם על ידי המעבר מהמצב המעורר S1אל מצב יסוד ) (S1 → S0בזמנים המוקדמים .ממצא זה
מעניין בהתחשב בעובדה כי אותה אוכלוסייה מעוררת משתתפת בשני המעברים .נציין כי הסט של פלואורסנציה
איור :60הסט לאדום של פלואורסנציה טרנזיינטית של ) RPSBפנל ימין( ושל ) BRפנל שמאל(
במאות פמטושניות ראשונות מרגע העירור .הקו בספקטרה של BRמסמן את הזמן של מקסימום
הפלואורסנציה באורך גל מסוים.
67
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
טרנזיינטית לאדום בסקלה של מאות פמטושניות נצפה עבור BRו – RPSBבמתאנול )איור .(60אך כמו
במקרה של , pHRהסטים של פליטה מאולצת לא נראים בספקטרה בליעה טרנזיינטיים של אותם צורונים.
החוקרים B. Schmidt, C. Sobottaוקולגות אשר ראו לראשונה את ההסט לאדום של פלואורסנציה
טרנזיינטית של בקטריורודופסין )החלק השמאלי של איור 60מציג את התוצאות שלהם( מסבירים אותו במונחים
של הסט Stokesדינמי אשר נובע מתנועה של חבילת גלים ויברציונית על משטח פוטנציאל מעורר דוחה אל
עבר החתך הקוני . 123אולם ,קיימים הסברים אחרים לתופעה .הצגנו עדויות מוצקות לכך שאזור – Franck
Condonשל משטח הפוטנציאל האלקטרוני S1של רודופסינים ארכיאליים יכול להיות די שטוח ומופרד
מהחתכים הקוניים על ידי מחסום .86במקרה זה הסט Stokesדינמי יכול להיגרם על ידי התארגנות מחדש של
שיירי האתר הפעיל של החלבון בעקבות עירור הכרומופור במקרה של BRו – pHRאו רלקסציה דיאלקטרית
של הממס במקרה של . 82RPSBהסט לאדום של פליטה מאולצת יכול להיות מוסווה על ידי הסט לכחול של
הבליעה החופפת אותה ,לכן לא מן הנמנע שהסט פס הפליטה המאולצת של pHRמעורר קיים אך קשה להבחין
בו.
ד .מודולציות פס הפליטה המאולצת.
את מודולציות פס הפליטה המאולצת של pHRאשר נצפו בניסוי שלנו ניתן לייחס במידה רבה של
וודאות לוויברציות פיתול נמוכות תדר ,מעוררות קוהרנטית על המשטח S1של הכרומופור .כפי שציינו בחלק
הניסיוני ,מודולציות כאלה יכולת להיגרם על ידי דינמיקה על המשטח היסודי .אולם ,בעבודתם של Zgrablićו
– Haakeמ – ,2007מודולציות בתדר ~120cm-1נמצאו רוכבות על פס הפלואורסנציה של RPSB
בתמיסה . 119אי לכך ,הטענה כי ניתן לייחס את אפנון פס הפליטה המאולצת ברודופסינים ארכיאליים לוויברציות
של המצב המעורר מקבלת חיזוק משמעותי .תדר של מודולציות אלה ב – pHRנמוך יחסית לתדרים המזוקקים
מפס הפליטה ב – BRו – ) RPSBהתדרים הם 170ו – 120cm-1בהתאמה( .זהו ממצא ניסיוני מעניין לאור
ההסבר אשר ניתן לתדר גבוה יותר של ויברציית פיתול של הכרומופור המעורר בבקטריורודופסין לעומת
RPSBבתמיסה .בעבודה של Bixue Houמ – 2003נטען כי העלאת תדר וויברציה זו של הרטינל כאשר הוא
נמצא בתוך החלבון נגרמת על ידי כוחות המופעלים על הכרומופור על ידי סביבת האתר הפעיל במהלך
איזומריזציה מושרית אור שלו .לטענת החוקרים ,כוחות אלה הם האחראיים להגברת קצב ההיפוך הפנימי של
הרטינל וכפיית הסטריאוסלקטיביות של האיזומריזציה של הכרומופור בבקטריורודופסין .121לפי ההסבר הנ"ל
התדר הנמוך יחסית אפילו ל – RPSBבתמיסה של וויברציה זו ב – pHRנובע מריכוך עקומת הפוטנציאל
כפונקציה של קואורדינטת הפיתול עם הכנסת הכרומופור לאתר הפעיל של חלבון האב .נציין כי בסימולציה של
דינמיקה מושרית אור ראשונית של sHRאשר נעשתה בשנת 2009על ידי C. Pfistererוקולגות הוצע כי
עקומת הפוטנציאל אשר מכתיבה את תנועת הפיתול של הכרומופור סביב הקשר C13=C14שטוחה יותר
במצב Kמאשר במצב יסוד התחלתי . 24 all – transנכון לעכשיו תרם התפרסם מחקר תאורטי שיעזור להחליט
האם זה יכול להיות נכון גם עבור המצב המעורר של הלורודופסינים.
68
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
ה .דיון בהבדלי התנהגות של יחס הטרנזיינטים בבליעה ובפליטה בתוצאות ניסוי .SEP
לאחר אפיון אבולוציה ספקטרלית של pHRמעורר ,דינמיקה מולקולרית מושרית אור המולידה אותה
נחקרת על ידי בחינת ההשפעה של פולסי dumpאינפרה אדומים ב – 1.15µmעל ספקטרה הפרש טרנזיינטיים
של הפיגמנט .מההסתכלות על הגרף המציג את היחס
.
)
∆OD (t )dump
∆OD (t)no dump
(
=) (33) R(t
בפנלים הקטנים של איור , 56הן בפס הבליעה והן בפס הפליטה ,ברור כי כל עוד קיימת אוכלוסיה מעוררת ניתן
להחזיר אותה למשטח פוטנציאל של מצב יסוד על ידי פולסי ה – .dumpיתרה מכך ,הטרנזיינטים בשני
האזורים הספקטרליים הללו מדגימים כי שבר ההפרש של צפיפות האופטית ומכאן שבר האוכלוסיה המעוררת
המוחזר למשטח התחתון לא תלוי בהשהיה בין ה – pumpל – .dumpזאת אנו לומדים מההתקרבות
האסימפטוטית של ) R(tלאותו הערך ללא שום תלות בהשהיית ה – .dump
מאפיין אחד של היחס ) R(tשהוא תלוי אורך גל ,הוא כוון ההתקרבות של עקומות אלה לערך
האסימפטוטי שלהן .יחסי הטרנזיינטים בפס הפליטה המאולצת שואפים לערך האסימפטוטי מלמתה ,כלומר
היחס ) R(tגדל בסקלה של כמה מאות פמטושניות לאחר ה – .dumpingלעומת זה ,בפס הבליעה הערך
ההתחלתי של יחס הטרנזיינטים מעט גדול יותר מהערך האסימפטוטי והעקומות מת קרבות אליו מלמעלה.
היבנות מחדש של אמפליטודת טרנזיינטים בפסי פליטה מאולצת נצפתה במספר ניסויי SEPעם רזולוציית זמן
טובה שנעשו על מולקולות אורגניות גדולות .125,124למיטב ידיעתנו ,התנהגות כגון זאת הנראית בניסוי שלנו
בטרנזיינטים של בליעה ,בעקבות מעבר פולס dumpבדגם ,לא דווחה נכון להיום.
תופעה של הפחתה התחלתית והשחזור הבא בעקבותיה של פליטה מאולצת לאחר ה – SEPהוסברה
בעבר על ידי כך שהפולס הנוסף לסכמה הניסיונית ) dumpבמקרה שלנו( מעביר אוכלוסיה באופן אימפולסיבי.
הוא מייצר חבילות גלים ויברציוניות על משטח הפוטנציאל אליו הוא מעביר אוכלוסיה מ – .S1זהו המשטח
היסודי במקרה שהפולס הנוסף מבצע , dumpingכמו בניסוי שלנו .משמעות נוספת של העברה אימפולסיבית
של אוכלוסיה על ידי ה – dumpהיא שריפה של חור ממוקם בחבילת הגלים על .S1נזכור כי משטחי
הפוטנציאל המצומדים על ידי שלושת הפולסים pump/dump/probeהם פונקציות של קואורדינטות אינטרה
ואינטר מולקולריות .במילים אחרות ,מדובר ביצירה אימפולסיבית על ידי ה – dumpשל העדר מקומי של
אוכלוסיה מעוררת על משטח פוטנציאל רב ממדי S1ועודף מקומי של אוכלוסיה על ,S0בקואורדינטות
מולקולריות בהן ה – dumpמצמד את שני המשטחים ,היסודי והמעורר.
בניסוי SEPשבו הספקטרום של ה – dumpחופף באופן חלקי או מלא את זה של ה – probeחבילת
גלים ממוקמת אשר תופיע על S0בעקבות ה – dumpingתתרום באופן מיידי לבליעה של ה – probeמה
שיראה במדידה כהגדלת הצפיפות האופטית של הדגם בתחום אורכי גל המרכיבים את ספקטרום ה – dump
)נראה תוספת של סיגנל חיובי באורכי גל אלה( .בו בזמן ,החור הנפער בעקבות ה – dumpingעל ,S1
בקואורדינטות מולקולריות אופטימליות לצימוד בין S1לבין S0על ידי ה – ,dumpיפחית את הפליטה
המאולצת באזור אורכי גל של ה – ) dumpפחות סיגנל שלילי( .דינמיקה הנגרמת על ידי ה – dumpבמצב
יסוד תשפיע רק על הפליטה המאולצת ואילו בכוחו של החור הקוהרנטי הנפער ב – S1להשפיע גם על הפליטה
69
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
וגם על הבליעה של האוכלוסיה המעוררת )איור .(61
החור על S1וחבילת הגלים על S0הנוצרים על ידי ה – dumpהם בטוח לא סטציונריים ,אי לכך,
השחזור החלקי של הפליטה המופחתת על ידי ה – SEPהגיוני ונובע מעזיבת המבנים הקוהרנטיים את חלון
Franck – Condonהמוגדר על ידי אורכי הגל של ה – dumpו/או איבוד קשר מופע של האוכלוסיה
המולקולרית המרכיבה את הקונסטרוקציות הללו.
בניסוי שלנו אורך גל מרכזי של ה – dumpהיה באזור 1160nm – 1150רחוק מתחום אורכי הגל
המכוסה על ידי ה – .probeנובע מכך שקואורדינטות מולקולריות בהן ה – dumpמאלץ חזק את המעבר
S 1 → S 0שונות מאלה בהן המשטחים הללו מצומדים על ידי ה – .probeכמו כן ,אין לנו סיבה להניח כי
בליעת המצב המעורר מתרחשת בקואורדינטות המוגדרות על ידי ספקטרום ה – .dumpאילו זה היה המצב,
הגיוני היה לצפות כי עצמת הבליעה תופחת ביתר ותשתחזר לאחר מכן ,כלומר טרנזיינטים של הבליעה היו
מתנהגים כמו אלה של הפליטה )איור .(61אולם ,התנהגותם הפוכה.
ייתכן כי ההתקרבות מלמעלה בטרנזיינטים של הבליעה של היחס ) R(tהנראית בניסוי שלנו מלמדת על
דיפוזיה מהירה מאוד ,בסקלה של מאות פמטושניות ,של החור הקוהרנטי המיוצר על ידי ה – dumpעל .S1
הרחקה התחלתית של אוכלוסיה מעוררת על ידי הפולס האינפרה אדום שלנו מתבצעת כאמור באזור ספציפי של
קואורדינטות מולקולריות .אזור זה הוא לא נקודה מתמטית ,הספקטרום של ה – dumpהוא אחרי הכל בעל
רוחב סופי .לכן ההרחקה מתרחשת בעדיפות באזור הצימוד האופטימלי ,אבל גם אזורים אחרים יכולים להיות
מושפעים ,במילים אחרות ,החור הנפער על S1הוא יחסית רחב .הנפילה הראשונית בטרנזיינטים של הבליעה
מעידה במקרה זה על הרחקת אוכלוסיה על ידי ה – dumpמ – .S1הרחקה זו מתבצעת באופן מועדף
איור :61הצגה סכמטית של ניסוי .SEPאנו מבאים כאן בתור דוגמה מקרה פשוט שבו :א .משטחי הפוטנציאל ) S0, S1ו
– ( Snהם פונקציות של קואורדינטה נורמלית אחת בלבד ,ב .הצימוד בין שלושת המשטחים המוצגים כאן על ידי פולסי
probeו – dumpהוא באותה נקודה על קואורדינטה .Qחבילת הגלים הויברציונית על גבי S1מיוצגת על ידי העקומה
הכתומה ,אוכלוסיית מצב היסוד לא מוצגת .החצים מייצגים את פולס ה – .probeהפנלים ,2 , 1ו – 3מציגים שלבים
בניסוי (1 :זמן מה אחרי ה – pumpקיימת על משטח S1אוכלוסיה מעוררת .אוכלוסיה זו בולעת בכחול ופליטתה
מאולצת על ידי ה – probeבאדום (2 .מיד לאחר ה – .dumpingחלק מאוכלוסיית S1מועבר על ידי ה – dump
למשטח פוטנציאל יסודי .מעבר האוכלוסיה הוא אימפולסיבי ולכן נוצרים על גבי המשטחים S1ו – S0מבנים קוהרנטיים
לא סטציונריים ,חור דינמי על S1וחבילת גלים דינמית על .S0מיד לאחר ה – dumpingהאוכלוסיה שהועברה למשטח
היסודי תבלע באותו אורך גל שבו ה – probeמאלץ פליטה של האוכלוסיה המעוררת על S1ובכך יתווסף סיגנל חיובי
הנובע מבליעת האוכלוסיה החדשה על S0לסיגנל שלילי הנובע מהפליטה המאולצת .כתוצאה מכך נראה הפחתה של
הסיגנל השלילי .כמו כן ,החור הנפער בחבילת הגלים על S1יפחית הן את הבליעה של אוכלוסיה זו והן את הפליטה
המאולצת שלה (3 .כעבור מספיק זמן לאחר ה – dumpהמבנים הקוהרנטיים עוזבים את חלון F – Cו/או עוברים
דיפוזיה .האוכלוסיה על S1בנקודת הצימוד משתחזרת באופן חלקי מה שיגרום לשחזור חלקי של עצמת הבליעה של
האוכלוסיה המעוררת ושל עצמת הפליטה המאולצת שלה.
70
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
בקואורדינטות שונות מאלו בהן מתרחשת בליעה של המצב המעורר .הנפילה הנוספת שבאה לידי ביטוי
בהתקרבות מלמעלה של יחס הטרנזיינטים ) R(tמרמזת על התרחבות )דיפוזיה( של אותו חוסר אוכלוסיה מקומי
והגעתו לאזור הקואורדינטות האופטימלי לבליעה ,ליתר דיוק ,מדובר בדיפוזיה של אוכלוסיה של כרומופורים
אשר נמצאת בגאומטריה מולקולרית אופטימלית לצימוד בין S1ל – Snעל ידי ה – probeלאזור של חוסר
האוכלוסיה )החור( אשר ייצר פולס ה – .dump
הסבר זה של התנהגות של הטרנזיינטים של הבליעה לא חייב להתנגש במה שרואים בפליטה .יכול
להיות כי במקרה של הפליטה אזורי קואורדינטות לצימוד אופטימלי בין S1ל – S0על ידי ה – dumpוה –
probeפחות רחוקים אחד מהשני מאשר במקרה של הבליעה .הגאומטריה המולקולרית יכולה להיות די דומה.
כלומר התנהגות של ) R(tאשר מזכירה את זו הנגרמת במקרה הפשוט שבו ספקטרה ה – dumpוה – probe
חופפים )התנהגות זו מנותחת באיור (61לא צריכה להפתיע .בכל אופן ,מעניין יהיה לבדוק כיצד תשתנה מגמת
היחס של הטרנזיינטים של הפליטה ובליעה כפונקציה של משך ואורך גל מרכזי של ה – .dumpאינפורמציה
שתתקבל בניסוי כזה עשויה להיות שימושית לצורך מיפוי משטחי הפוטנציאל האלקטרוניים המעורבים
בספקטרוסקופיה ופוטוכימיה של חלבונים רטינליים ארכיאליים.
ו .תובנות מניסוי .SEP
אי השתנות עם הזמן של חתך הפעולה לפליטה מאולצת על ידי הפולסים האינפרה אדומים של כלל
האוכלוסיה המעוררת העולה מממצאי הניסוי המסוכמים באיור 56כבר מרמזת על כך שהמאפיינים הספקטרליים
של S1שייכים לאוכלוסיה מעוררת אחת בלבד .לדעתנו ,תגובה זהה לחלוטין של שתי אוכלוסיות מעוררות
שונות לפולסי ה – dumpלא סבירה .אך אין ממצאים אלה מהווים ראיה ישירה לאי קיום שתי אוכלוסיות S1
שונות .ניתן להגיע למסקנה זאת רק על ידי מעקב אחר אמפליטודת ספקטרום ההפרש של Kעם ובלי
.dumpingהתוצאות המסוכמות באיור 57מראות כי האוכלוסיה המונחתת לא רק מורחקת ממעגל האור ,אלה
גם שניתן "לקצר" את המעגל בכל שלב בו עדיין קיימת אוכלוסיית .S1בנוסף לכך ,מידת הקצר הנגרם ,כלומר
שבר האוכלוסיה המורחקת בדרך ל – ,Kפרופורציוני לשארית הפיגמנטים המעוררים .המסקנה ברורה .כל
השלבים של ההיפוך הפנימי של הכרומופור המעורר ב – pHRיכולים להביא לאיזומריזציה באותה מידה.
במחקר SEPקודם שנעשה במעבדתנו על בקטריורודופסין הממצאים הניסיוניים היו דומים .86שבר
האוכלוסיה שהורד בחזרה ל – S0על ידי ה – dumpלא היה תלוי בשלב ההיפוך הפנימי שלה ,האוכלוסיה
המונחתת לא הופיעה כתוצר מאוחר של מעגל האור ולא הראתה שום סימנים של פעילות ביולוגית .בניסיון
להסביר את ממצאי ניסוי על BRנטען כי הפלואורסנציה מתרחשת מקונפיגורציות מעוררות הנמצאות הרחק
מחיתוך העקומות דרכו מתבצע ההיפוך הפנימי למצב היסוד .תרם הגעתה לחתך הקוני האוכלוסיה המעוררת
חייבת להתגבר על מחסום פוטנציאל על S1אשר מפריד בין אזור FCלחתכים קוניים על משטח זה .הנחת קיום
מחסום כזה על המשטח המעורר של pHRנעשתה בעבר על ידי Nakamuraותוצאות מחקרינו מחזקות טענה
זו.
על מנת ליישב מסקנות אלה עם עלייה מהירה של סיגנל חיובי סביב ,645nmאותה פירש Kandori
בעבודות שלו על sHRכאינדיקציה לכך ש – Kנוצר במהלך ההיפוך הפנימי של האוכלוסיה המעוררת קצרת
71
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
החיים ועם האמפליטודה הגדולה יותר באזור
640nmשל ה – DASהדועך עם הקבוע 2.0ps
מממצאי הניסוי שלנו ,נציג כאן תוצאות עבודתנו על
בקטריורודופסינים מהונדסים .תוצאות אלה טרם
איור :62כרומופור נעול של חלבון רטינלי ארכיאלי.
פורסמו .מדובר בחלבונים אשר הוכנס לתוכם רטינל all – transשבו הקשר C13=C14נעול בתוך טבעת
מחומשת של אטומי פחמן )איור .( 62הכרומופור בבקטריורודופסין כזה לא יכול לעבור איזומריזציה סביב
הקשר הנעול ואי לכך ,אין לבקטריורודופסינים מהונדסים כאלה מעגל אור .בין היתר לא נצפה לראות שום תוצר
אשר ניתן לייחס אותו לבליעה של פיגמנטים עם צבען במצב . 13−cisניתוח ספקטרה בליעה טרנזיינטיים של
פיגמנט כזה הוא קל יחסית כי את כל הסיגנלים החיוביים ניתן לייחס לעודף בליעה של המצב המעורר " "Iואת
השליליים לעודף פליטה שלו או ל – bleachשל מצב יסוד.
ממצא מעניין ביותר ,בנוגע לעבודתנו על ,pHRהעולה מנתונים אלה הוא הופעת סיגנל חיובי ב – BR
נעול סביב ,670nmלא רחוק מבליעת התוצר Kאשר נבנית סביב 640nm – 630בבקטריורודופסין לא נעול
)איור .(63אם להתחשב בעובדה כי ה – bleachשל מצב יסוד של בקטריורודופסין נעול מוסט לאדום בכ –
20nmביחס ל – BRרגיל אזי הסיגנל החיובי של הפיגמנט הנעול מופיע באותו אזור ביחס ל – bleachשבו
אמור לצוץ פס הבליעה של התוצר . Kמכיוון שאין אנו מצפים להופעה של בליעת תוצר ב – BRנעול ,הסיגנל
החיובי יכול להיות מיוחס רק לעודף בליעה של המצב המעורר .נעקוב אחר דינמיקת התפתחות הסיגנלים
בספקטרה של בקטריורודופסין נעול בפנל ימני עליון של איור . 63פס הבליעה של המצב המעורר באזור
<550nmנע לכחול בזמנים המוקדמים )עד .(100fsכמו ב – ,pHRכך גם כאן ,קשה להבחין בתזוזה של פס
הפליטה המאולצת בסקלת זמנים זו אבל הופעת עודף בליעה של מצב מעורר ב – ,670nmבזמן שכל הבליעה
איור :63השוואה בין דינמיקה ספקטרלית אולטרה מהירה של בקטריורודופסין ) wild typeשמאל( לבין פיגמנט
מלאכותי עם הכרומופור הנעול )ימין( .צבעים של הספקטרה מציינים זמני מדידה לפי המפתח המצורף.
72
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
הנ"ל זזה לכחול ,יכולה להיות מוסברת על ידי תנועה סימולטנית של פס הפליטה לאדום.
המסקנה המתבקשת מתוצאות אלה היא שייחוס חד משמעי של סיגנל חיובי העולה בזמנים מוקדמים
מאדום ל – bleachשל מצב יסוד ברודופסינים ארכיאליים לתוצר של מעגל אור שבו הרטינל בקונפיגורציה
13−cisלא יהיה מוצדק .שינויים דינמיים ב – S1שלא בהכרח קיים קשר בינם לבין היווצרות התוצר יכולים
לגרום להופעה מהירה של סיגנל חיובי באזור הספקטרלי בו התוצר בולע .אי לכך ,אינטרפרטציה של העלייה
המהירה של סיגנל חיובי ב – 650nm – 640בספקטרה בליעה טרנזיינטיים של pHRולדעתנו גם באלה של
,sHRכיצירת התוצר Kמאוכלוסיה קצרת החיים מבין השתיים הקיימות על – ,S1שנויה במחלוקת.
מעניינת בהקשר זה תמונה העולה מהשוואת ה – DASהדועכים אקספוננציאלית שהתאמנו לספקטרה
הפרש בליעה טרנזיינטיים של .pHRהנ"ל שונים בעיקר באזור של בליעת התוצר Kוה – bleachשל מצב
יסוד .אם נאמץ לרגע את הגישה אשר הנחתה את חוקרי דינמיקה ספקטרלית אולטרה מהירה של sHRונחשוב
על שני ה – DASהדועכים עם הקבועים של 2ו – 5psכעל תרומות של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות
לספקטרה בליעה טרנזיינטיים ,הרי שמשמעות שוני האמפליטודות של שני ה – DASבאזור בליעת התוצר K
תהיה עליית פס הבליעה שלו בקצב ההיפוך הפנימי של אוכלוסיה קצרת החיים .הצעד הבא המתבקש במסגרת
פרדיגמת שתי האוכלוסיות הוא לשער כי האוכלוסיה הדועכת מהר היא הראקטיבית ואילו האיטית היא הלא
ריאקטיבית ודועכת חזרה אל המגיבים .כפי שראינו ,פירוש כזה של דינמיקה ספקטרלית של pHRלא יהיה נכון
אם קיימת תרומה של בליעת מצב מעורר באורך גל של 640nmבו אמורה להופיע בליעת התוצר .אי לכך ,אין
להסתפק רק ב – DASעל מנת להצדיק או להפריך מודל של דינמיקה מושרית אור של רודופסינים ארכיאליים.
למעשה ,האסטרטגיה הניסיונית שלנו פותחה במיוחד על מנת להעמיד במבחן פרשנויות קודמות של מידע
ניסיוני באמצעות שיטה המסתמכת על ראיות ישירות ולפיכך ,בניסיוננו להסביר את העומד מאחורי דינמיקת
ההיפוך הפנימי של pHRאנו נותנים יותר אמון בתוצאות .SEP
סיכום.
במקרה של pHRהקינטיקה הלא אקספוננציאלית של ההיפוך הפנימי והעלייה המהירה של בליעה
סביב 640nmאינם משקפים קיום בו זמני של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות שרק אחת מהן ריאקטיבית .אין
אנו מנסים לומר כי לא תתכן תגובה של פיגמנטים מעוררים בחזרה אל המגיבים ,סך הכל היעילות הקוונטית
המדווחת של pHRהיא 0.5ולא . 1מכל מקום ,התגובה החוזרת יכולה להתרחש כתוצאה מפיצול בעת הדעיכה
של האוכלוסיה המעוררת אל מצב יסוד בנקודת החתך הקוני.
כפי שמוסכם עבור בקטריורודופסין שגם הוא מראה קינטיקה לא אקספוננציאלית של היפוך פנימי ,כך
גם במקרה של הלורודופסין של Natronomonas pharaonisאותו חקרנו ,המצב המעורר S1מורכב
מאוכלוסיה מעוררת אחת בלבד .מאפייני הדעיכה של מצב זה ובין היתר היות דעיכה זו מולטי אקספוננציאלית
נובעים מתהליכים אחרים ,למשל מרלקסציה ויברציונית של הכרומופור המעורר .ברור כי לא בהכרח ניתן
להשליך מסקנות אלה על משאבת הכלורידים השנייה .sHR ,פוטוכימיה של חלבון זה יכולה להיות שונה .אחרי
הכל דינמיקה מושרית אור של המשאבה הזאת ולא של pHRנדגמה על ידי פולסים אולטרה מהירים במרכז
האינפרה אדום ,מחקר שהראה כי הפסים הויברציוניים המשויכים לתוצר מופיעים תוך שבר מזמן החיים של
73
פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים
המצב המעורר .אף על פי כן ,המידע המחקרי הרחב בתחום הספקטרוסקופיה האולטרה מהירה של משפחת
הרודופסינים הארכיאליים והקרבה הלא מבוטלת בין חברי המשפחה הנ"ל ,יכולים באותה מידה לרמוז על
קבילות מסכנות אלה לצורך בניית מודל של דינמיקת המצב המעורר עבור רבים מהם .ייתכן כי הדינמיקה הזאת
כלל לא בעלת אופי מקבילי כפי שמוצע עבור ,sHRבכל החלבונים הללו .מחקר משלים של pHRבמרכז
האינפרה אדום או לחליפין מחקר כגון זה המוצג כאן של דינמיקת המצב המעורר של ,sHRעשוי לשפוך אור
על התעלומה הזאת.
74
ביבליוגרפיה
1 Oren, Aharon. Halophilic Microorganisms and their Environments. Dordrecht: Kluwer Academic, 2002.
2 Spudich, John L., Chii-Shen Yang, Kwang-Hwan Jung, and Elena N. Spudich. "Retinylidene Proteins: Structures
and Functions from Archaea to Humans." Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16 (2000): 395 – 392.
3 Terakita, Akihisa. "The Opsins." Genome Biology 6.3 (2005): Article 213.
4 Dugave, Christophe., ed. cis – trans Isomerization in Biochemistry. Weinheim: 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH &
Co. KGaA, 2006.
5 Stoeckenius, Walther. "The Rhodopsin-Like Pigments of Halobacteria: Light-Energy and Signal Transducers in an
Archaebacterium." Trends in Biochemical Sciences 58.6 (1985): 483 – 486.
6 Oesterhelt, Dieter., Walther Stoeckenius. "Rhodopsin-Like Protein from the Purple Membrane of Halobacterium
Halobium." Nature New Biology 233 (1971): 149 – 152.
7 Oesterhelt, Dieter., and Walther Stoeckenius. "Functions of a New Photoreceptor Membrane." Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 70.10 (1973): 2853 – 2857.
8 Lanyi, Janos K. "Halorhodopsin: a Light-Driven Chloride Ion Pump." Annual Review of Biophysics and
Biophysical Chemistry 15 (1986): 11 – 28.
9 MacDonald, Russell E., Richard V. Greene, Robert D. Clark, and Edward V. Lindley. "Characterization of the LightDriven Sodium Pump of Halobacterium Halobium. Consequences of Sodium Efflux as the Primary Light-Driven
Event." The Journal of Biological Chemistry 254.23 (1979): 11831 – 11838.
10 Takahashi, Tetsuo., Hiroaki Tomioka, Naoki Kamo and Yonosuke Kobatake. "A Photosystem Other than PS370 Also
Mediates the Negative Phototaxis of Halobacterium Halobium." FEMS Microbiology Letters 28 (1985): 161 – 164.
11 Bogomolni, Roberto A., and John L. Spudich. "Identification of a Third Rhodopsin-Like Pigment in Phototactic
Halobacterium Halobium." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79 (1982): 6250 – 6254.
12 Kolbe, Michael., Hüseyin Besir, Lars-Oliver Essen, and Dieter Oesterhelt. "Structure of the Light-Driven Chloride
Pump Halorhodopsin at 1.8Å Resolution." Science 288 (2000) 1390 – 1396.
13 Kandori, Hideki., and Hiroyuki Sasabe. "Excited-State Dynamics of a Protonated Schiff Base of all-Trans Retinal in
Methanol Probed by Femtosecond Fluorescence Measurement." Chemical Physics Letters 216.1 – 2 (1993) 126 –
172.
14 Rajput, Jyoti., Dennis B. Rahbek, Lars H. Andersen, Amiram Hirshfeld, Mordechai Sheves, Piero Alto, Giorgio
Orlandi, and Marco Garavelli. "Probing and Modeling the Absorption of Retinal Protein Chromophores in Vacuo."
Angewandte Chemie International Edition 49 (2010) 1790 – 1793.
15 Sasaki, Jun., Leonid S. Brown, Young-Shin Chon, Hideki Kandori, Akio Maeda, Richard Needleman, Janos K.
Lanyi. "Conversion of Bacteriorhodopsin into a Chloride Ion Pump." Science 269 (1995) 73 – 75.
16 Dér, A., S. Száraz, R. Tóth-Boconádi, Zs. Tokaji, L. Keszthelyi, and W. Stoeckenius. "Alternative Translocation of
Protons and Halide Ions by Bacteriorhodopsin." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88 (1991): 4751 – 4755.
17 Olson, Karl D., Xue-Nong Zhang, and John L. Spudich. "Residue Replacements of Buried Aspartyl and Related
Residues in Sensory Rhodopsin I: D201N Produces Inverted Phototaxis Signals." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92
(1995): 3185 – 3189.
18 Bogomolni, R. A., W. Stoeckenius, I. Szundi, E. Perozo, K. D. Olson, and J. L. Spudich. "Removal of Transducer
Htr I Allows Electrogenic Proton Translocation by Sensory Rhodopsin I." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994):
10188 – 10192.
19 Luecke, Hartmut., Brigitte Schobert, Hans-Thomas Richter, Jean-Philippe Cartailler, and Janos K. Lanyi. "Structure
of Bacteriorhodopsin at 1.55Å Resolution." Journal of Molecular Biology 291 (1999) 899 – 911.
20 Lozier, Richard H., Roberto A. Bogomolni, and Walther Stoeckenius. "Bacteriorhodopsin: a Light-Driven Proton
Pump in Halobacterium Halobium." Biophysical Journal 15.9 (1975) 955 – 962.
21 Tittor, J., D. Oesterhelt, R. Maurer, H. Desel, and R. Uhl. "The Photochemical Cycle of Halorhodopsin: Absolute
Spectra of Intermediates Obtained by Flash Photolysis and Fast Difference Spectra Measurements." Biophysical
Journal 52.6 (1987) 999 – 1006.
22 Hoff, Wouter D., Kwang-Hwan Jung, and John L. Spudich. "Molecular Mechanism of Photosignaling by Archaeal
Sensory Rhodopsins." Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 (1997): 223 – 258.
23 Váró, György., Leonid S. Brown, Jun Sasaki, Hideki Kandori, Akio Maeda, Richard Needleman, and Janos K.
Lanyi. "Light-Driven Chloride Ion Transport by Halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis. 1. The
Photochemical Cycle." Biochemistry 34 (1995): 14490 – 14499.
24 Pfisterer, Christoph., Andreea Gruia, and Stefan Fischer. "The Mechanism of Photo-energy Storage in the
Halorhodopsin Chloride Pump." The Journal of Biological Chemistry 284 (2009): 13562 – 13569.
25 Gruia, Andreea D., Ana-Nicoleta Bondar, Jeremy C. Smith, and Stefan Fischer. "Mechanism of a Molecular Valve in
the Halorhodopsin Chloride Pump." Structure 13 (2005): 617 – 627.
26 Schäfer, Günter., Martin Engelhard, and Volker Müller. "Bioenergetics of the Archaea." Microbiology and Molecular
Biology Reviews 63.3 (1999) 570 – 620.
27 Mukohata, Yasuo., Kunio Ihara, Takeshi Tamura, and Yasuo Sugiyama. "Halobacterial Rhodopsins." Journal of
Biochemistry 125.4 (1999) 649 – 657.
28 Falb, Michaela., Friedhelm Pfeiffer, Peter Palm, Karin Rodewald, Volker Hickmann, Jörg Tittor, and Dieter
Oesterhelt. "Living with Two Extremes: Conclusions from the Genome Sequence of Natronomonas pharaonis."
Genome Research 15 (2005) 1336 – 1343.
29 Zimányi, Lászlo., and Janos K Lanyi. "Fourier Transform Raman Study of Retinal Isomeric Composition and
Equilibration in Halorhodopsin." Journal of Physical Chemistry B 101 (1997): 1930 – 1933.
30 Kouyama, Tsutomu., Soun Kanada, Yuu Takeguchi, Akihiro Narusawa, Midori Murakami, and Kunio Ihara. "Crystal
Structure of the Light-Driven Chloride Pump Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis." Journal of Molecular
Biology 369.3 (2010): 564 – 579.
31 Shibata, Mikihiro., Norikazu Muneda, Takanori Sasaki, Kazumi Shimono, Naoki Kamo, Makoto Demura, Hideki
Kandori. "Hydrogen-Bonding Alterations of the Protonated Schiff Base and Water Molecule in the Chloride Pump
of Natronobacterium pharaonis." Biochemistry 44 (2005): 12279 – 12286.
32 Otomo, Jun. "Anion Selectivity and Pumping Mechanism of Halorhodopsin." Biophysical Journal 56 (1995) 137 –
141.
33 Schobert, Brigitte., Janos K. Lanyi, and Dieter Oesterhelt. "Effects of Anion Binding on the Deprotonation
Reactions of Halorhodopsin." The Journal of Biological Chemistry 261.6 (1986): 2690 – 2696.
34 Duschl, Albert., Janos K. Lanyi, Lászlo Zimányi. "Properties and Photochemistry of a Halorhodopsin from the
Haloalkalophile, Natronobacterium pharaonis." The Journal of Biological Chemistry 265.3 (1990): 1261 – 1267.
35 Scharf, Birgit., and Martin Engelhard. "Blue Halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis: Wavelength
Regulation by Anions." Biochemistry 33 (1994): 6387 – 6393.
36 Ihara, Kunio., Akihiro Narusawa, Keita Maruyama, Masashi Takeguchi, Tsutomu Kouyama. "A Halorhodopsin –
Overproducing Mutant Isolated from an Extremely Haloalkaliphilic Archaeon Natronomonas pharaonis." FEBS
Letters 582.19 (2008): 2931 – 2936.
37 Sasaki, Takanori., Megumi Kubo, Takashi Kikukawa, Masakatsu Kamiya, Tomoyasu Aizawa, Keiichi Kawano,
Naoki Kamo, and Makoto Demura. "Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis Forms a Trimer Even in the
Presence of a Detergent, Dodecyl – b – D – maltoside." Photochemistry and Photobiology 85.1 (2009): 130 – 136.
38 Hampp, Norbert. "Bacteriorhodopsin as a Photochromic Retinal Protein for Optical Memories." Chemical Reviews
100.5 (2000): 1755 − 1776.
39 Sato, Hidenori., Kazuki Takeda, Koji Tani, Tomoya Hino, Tetsuji Okada, Masayoshi Nakasako, Nobuo Kamiya, and
Tsutomu Kouyama. "Specific Lipid – Protein Interactions in a Novel Honeycomb Lattice Structure of
Bacteriorhodopsin." Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 55.7 (1999): 1251 – 1256.
40 Zhu, Jingyi., Itay Gdor, Elena Smolensky, Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman.
"Photoselective Ultrafast Investigation of Xanthorhodopsin and Its Carotenoid Antenna Salinixanthin." Journal of
Physical Chemistry B 114 (2010): 3038 – 3045.
41 Seki, Shun Ichi., Hiroyuki Sasabe, and Hiroaki Tomioka. "Voltage – Dependent Absorbance Change of Carotenoids
in Halophilic Archaebacteria." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1284.1 (1996): 79 – 85.
42 Váró, György., Leonid S. Brown, Richard Needleman, and Janos K. Lanyi. "Proton Transport by Halorhodopsin."
Biochemistry 35 (1996): 6604 – 6611.
43 Szakács, Juliánna., Melinda Lakatos, Constanta Ganea, and György Váró. "The Kinetics of the Photochemical
Reaction Cycle of Deuterated Bacteriorhodopsin and Pharaonis Halorhodopsin." Romanian Journal of Biophysics
15.1 – 2 (2005): 79 – 84.
44 Váró, György., Richard Needleman, and Janos K. Lanyi. "Light – Driven Chloride Ion Transport by Halorhodopsin
from Natronobacterium pharaonis. 2. Chloride Release and Uptake, Protein Conformation Change, and
Thermodynamics." Biochemistry 34 (1995): 14500 – 14507.
45 Chizhov, Igor., and Martin Engelhard. "Temperature and Halide Dependence of the Photocycle of Halorhodopsin
from Natronobacterium pharaonis." Biophysical Journal 81.3 (2001) 1600 – 1612.
46 Essen, Lars – Oliver. "Halorhodopsin: Light – Driven Ion Pumping Made Simple?" Current Opinion in Structural
Biology 12.4 (2002) 516 – 522.
47 Ludmann, Krisztina., Grazyna Ibron, Janos K. Lanyi, and György Váró. "Charge Motions During the Photocycle of
pharaonis Halorhodopsin." Biophysical Journal 78.2 (2000) 959 – 966.
48 Shibata, Mikihiro., Yuko Saito, Makoto Demura, Hideki Kandori. "Deprotonation of Glu234 During the Photocycle
of Natronomonas pharaonis Halorhodopsin." Chemical Physics Letters 432.4 – 6 (2006) 545 – 547.
49 Ames, James B., Jan Raap, Johan Lugtenburg, and Richard A. Mathies. "Resonance Raman Study of Halorhodopsin
Photocycle Kinetics, Chromophore Structure, and Chloride – Pumping Mechanism." Biochemistry 31 (1992): 12546
– 12554.
50 Oesterhelt, D., P. Hegemann, and J. Tittor. "The Photocycle of the Chloride Pump Halorhodopsin. II: Quantum
Yields and a Kinetic Model." The EMBO Journal 4.9 (1985): 2351 – 2356.
51 Losi, Aba., Ansgar A. Wegener, Martin Engelhard, and Silvia E. Braslavsky. "Thermodynamics of the Early Steps in
the Photocycle of Natronobacterium pharaonis Halorhodopsin. Influence of Medium and of Anion Substitution."
Photochemistry and Photobiology 74.3 (2001): 495 – 503.
52 Tittor, Jörg., and Dieter Oesterhelt. "The Quantum Yield of Bacteriorhodopsin." FEBS Letters 263.2 (1990): 269 –
273.
53 Becker, Ralph S., Kenn Freedman. "A Comprehensive Investigation of the Mechanism and Photophysics of
Isomerization of a Protonated and Unprotonated Schiff Base of 11 – Cis – Retinal." Journal of the American
Chemical Society 107.6 (1985) 1477 – 1485.
54 Koyama, Yasushi., Keishi Kubo, Mika Komori, Haruo Yasuda, and Yumiko Mukai. "Effect of Protonation on the
Isomerization Properties of N – butylamine Schiff Base of Isomeric Retinal as Revealed by Direct HPLC Analyses:
Selection of Isomerization Pathways by Retinal Proteins." Photochemistry and Photobiology 54.3 (1991): 433 – 443.
55 Edman, Karl., Peter Nollert, Antoine Royant, Hassan Belrhali, Eva Pebay-Peyroula, Janos Hajdu, Richard Neutze, &
Ehud M. Landau. "High-Resolution X-Ray Structure of an Early Intermediate in the Bacteriorhodopsin Photocycle."
Nature 401 (1999): 822 – 826.
56 Nakamura, Takumi., Satoshi Takeuchi, Mikihiro Shibata, Makoto Demura, Hideki Kandori, and Tahei Tahara.
"Ultrafast Pump Probe Study of the Primary Photoreaction Process in pharaonis Halorhodopsin: Halide Ion
Dependence and Isomerization Dynamics." Journal of Physical Chemistry B 112 (2008): 12795 – 12800.
57 McNeil, Brian. "First Light from Hard X-Ray Laser." Nature Photonics 3 (2009): 375 – 377.
58 Zewail, Ahmed H. "Atomic – Scale Dynamics of Chemical Bond Using Ultrafast Lasers (Nobel Lecture)."
Angewandte Chemie International Edition 39 (2000) 2586 – 2631.
59 Briand, Julien., Jérémie Léonard, and Stefan Haacke. "Ultrafast Photo – Induced Reaction Dynamics in
Bacteriorhodopsin and its Trp Mutants." Journal of Optics 12.8 (2010) 084004.
60 Gai, Feng., K. C. Hasson, J. Cooper McDonald, Philip A. Anfinrud. "Chemical Dynamics in Proteins: The
Photoisomerization of Retinal in Bacteriorhodopsin." Science 279 (1998) 1886 – 1891.
61 Mathies, Richard A., C. H. Brito Cruz, Walter T. Polard, and Charles V. Shank. "Direct Observation of the
Femtosecond Excited – State Cis – Trans Isomerization In Bacteriorhodopsin." Science 240 (1988) 777 – 779.
62 Doig, Stephen J., Philip J. Reid, and Richard A. Mathies. "Pikosecond Time – Resolved Resonance Raman
Spectroscopy of Bacteriorhodopdn's J, K, and KL Intermediates." Journal of Physical Chemistry 95 (1991): 6372 –
6379.
63 Atkinson, G. H., L. Ujj, and Yidong Zhou. "Vibrational Spectrum of the J – 625 Intermediate in the Room
Temperature Bacteriorhodopsin Photocycle." Journal of Physical Chemistry A 104 (1999): 4130 – 4139.
64 Song, Li., and M. A. El – Sayed. "Primary Step in Bacteriorhodopsin Photosynthesis: Bond Stretch Rather than
Angle Twist of Its Retinal Excited – State Structure." Journal of the American Chemical Society 120.34 (1998) 8889
– 8890.
65 Ujj, L., Yidong Zhou, M. Sheves, M. Ottolenghi, S. Ruhman, and G. H. Atkinson. "Vibrational Spectrum of a
Picosecond Intermediate in the Artificial BR5.12 Photoreaction: Picosecond Time – Resolved CARS of T5.12."
Journal of the American Chemical Society 122.1 (2000) 96 – 106.
66 Shim, Sangdeok., Jyotishman Dasgupta, and Richard A. Mathies. "Femtosecond Time – Resolved Stimulated
Raman Reveals the Birth of Bacteriorhodopsin’s J and K Intermediates." Journal of the American Chemical Society
131.22 (2009) 7592 – 7597.
67 Garavelli, Marco., Fabrizia Negri, and Massimo Olivucci. "Initial Excited – State Relaxation of the Isolated 11 – cis
Protonated Schiff Base of Retinal: Evidence for in – Plane Motion from ab Initio Quantum Chemical Simulation of
the Resonance Raman Spectrum." Journal of the American Chemical Society 121.5 (1999) 1023 – 1029.
68 González – Luque, Remedios., Marco Garavelli, Fernando Bernardi, Manuela Merchán, Michael A. Robb and
Massimo Olivucci. "Computational Evidence in Favor of a Two – State, Two – Mode Model of the Retinal
Chromophore Photoisomerization." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97.17 (2000): 9379 – 9384.
69 Yarkony, David R. "Diabolical Conical Intersections." Reviews of Modern Physics 68.4 (1996): 985 – 1013.
70 Garavelli, Marco., Thom Vreven, Paolo Celani, Fernando Bernardi, Michael A. Robb, and Massimo Olivucci.
"Photoisomerization Path for a Realistic Retinal Chromophore Model: The Nonatetraeniminium Cation." Journal of
the American Chemical Society 120.6 (1998) 1258 – 1288.
71 Levine, Benjamin G., and Todd J. Martínez. "Isomerization Through Conical Intersections." Annual Review of
Physical Chemistry 58 (2007) 613 – 634.
72 Heyne, Karsten., Johannes Herbst, Barbara Dominguez – Herradon, Ulrike Alexiev, and Rolf Diller. "Reaction
Control in Bacteriorhodopsin: Impact of Arg82 and Asp85 on the Fast Retinal Isomerization, Studied in the Second
Site Revertant Arg82Ala/Gly231Cys and Various Purple and Blue Forms of Bacteriorhodopsin." Journal of Physical
Chemistry B 104 (2000): 6053 – 6058.
73 Dugave, Christophe., and Luc Demange. "Cis − Trans Isomerization of Organic Molecules and Biomolecules:
Implications and Applications." Chemical Reviews 103.7 (2003): 2475 – 2532.
74 Liu, Robert S. H. "Photoisomerization by Hula – Twist: A Fundamental Supramolecular Photochemical Reaction."
Accounts of Chemical Research 34.7 (2001) 555 – 562.
75 Mathies, Rich., and Lubert Stryer. "Retinal Has a Highly Dipolar Vertically Excited Singlet State: Implications for
Vision." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73.7 (1976): 2169 – 2173.
76 Cembran, Alessandro., Fernando Bernardi, Massimo Olivucci, and Marco Garavelli. "The Retinal
Chromophore/Chloride Ion Pair: Structure of the Photoisomerization Path and Interplay of Charge Transfer and
Covalent States." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 102.18 (2005): 6255 – 6260.
77 De Vico, Luca., Christopher S. Page, Marco Garavelli, Fernando Bernardi, Riccardo Basosi, and Massimo Olivucci.
"Reaction Path Analysis of the "Tunable" Photoisomerization Selectivity of Free and Locked Retinal
Chromophores." Journal of the American Chemical Society 124.15 (2002) 4124 – 4134.
78 Zadok, Uri., Artium Khatchatouriants, Aaron Lewis, Michael Ottolenghi, and Mordechai Sheves. "Light – Induced
Charge Redistribution in the Retinal Chromophore Is Required for Initiating the Bacteriorhodopsin Photocycle."
Journal of the American Chemical Society 124.40 (2002) 11844 – 11845.
79 Hamm, P., M. Zurek, T. Röschinger, H. Patzelt, D. Oesterhelt, W. Zinth. "Femtosecond Spectroscopy of the
Photoisomerisation of the Protonated Schiff Base of All – Trans Retinal." Chemical Physics Letters 263.5 (1996)
613 – 621.
80 Hamm, P., M. Zurek, T. Röschinger, H. Patzelt, D. Oesterhelt, W. Zinth. "Subpicosecond Infrared Spectroscopy on
the Photoisomerisation of the Protonated Schiff Base of All – Trans Retinal." Chemical Physics Letters 268.1 – 2
(1997) 180 – 186.
81 Hou, B., N. Friedman, S. Ruhman, M. Sheves, and M. Ottolenghi. "Ultrafast Spectroscopy of the Protonated Schiff
Bases of Free and C13=C14 Locked Retinals." Journal of Physical Chemistry B 105 (2001): 7042 – 7048.
82 Zgrablić, Goran., Kislon Voïtchovsky, Maik Kindermann, Stefan Haacke, and Majed Chergui. "Ultrafast Excited
State Dynamics of the Protonated Schiff Base of All – trans Retinal in Solvents." Biophysical Journal 88 (2005)
2779 – 2788.
83 Du, Mei., and Graham R. Fleming. "Femtosecond Time – Resolved Fluorescence Spectroscopy of
Bacteriorhodopsin: Direct Observation of Excited State Dynamics in the Primary Step of the Proton Pump Cycle."
Biophysical Chemistry 48.2 (1993): 101 – 111.
84 Diller, Rolf., Ruth Jakober, Christian Schumann, Frank Peters, Johann P. Klare, and Martin Engelhard. "The trans –
cis Isomerization Reaction Dynamics in Sensory Rhodopsin II by Femtosecond Time – Resolved Midinfrared
Spectroscopy: Chromophore and Protein Dynamics." Biopolymers 82.4 (2006): 358 – 362.
85 Lutz, I., A. Sieg, A. A. Wegener, M. Engelhard, I. Boche, M. Otsuka, D. Oesterhelt, J. Wachtveitl, and W. Zinth.
"Primary Reactions of Sensory Rhodopsins." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98.3 (2001): 962 – 967.
86 Ruhman, Sanford., Bixue Hou, Noga Friedman, Michael Ottolenghi, and Mordechai Sheves. "Following Evolution
of Bacteriorhodopsin in Its Reactive Excited State via Stimulated Emission Pumping." Journal of the American
Chemical Society 124.30 (2002) 8854 – 8858.
87 Rupenyan, Alisa., Ivo H. M. van Stokkum, Jos C. Arents, Rienk van Grondelle, Klaas J. Hellingwerf, and Marie
Louise Groot. "Reaction Pathways of Photoexcited Retinal in Proteorhodopsin Studied by Pump – Dump – Probe
Spectroscopy." Journal of Physical Chemistry B 113 (2009): 16251 – 16256.
88 Agmon, Noam., and Ronnie Kosloff. "Dynamics of Two – Dimensional Diffusional Barrier Crossing." Journal of
Physical Chemistry 92 (1987): 1988 – 1996.
89 Bagchi, Biman., and Graham R. Fleming. "Dynamics of Activationless Reactions in Solution." Journal of Physical
Chemistry 94 (1990): 9 – 20.
90 Åberg, U., E. Åkesson, J. - L. Alvarez, I. Fedchenia, and V. Sundström. "Femtosecond Spectral Evolution
Monitoring the Bond – Twisting Event in Barrierless Isomerization In Solution." Chemical Physics 183 (1994) 269
– 288.
91 Olivucci, Massimo., Alessandro Lami, and Fabrizio Santoro. "A Tiny Excited – State Barrier Can Induce a
Multiexponential Decay of the Retinal Chromophore: A Quantum Dynamics Investigation." Angewandte Chemie
International Edition 44 (2005) 5118 – 5121.
92 Zgrablić, Goran. "Solvent Effects on the Ultrafast Dynamics of the Retinal Chromophore of Bacteriorhodopsin."
Ph.D. Dissertation.
93 Zgrablić, Goran., Stefan Haacke, and Majed Chergui. "Heterogeneity and Relaxation Dynamics of the Photoexcited
Retinal Schiff Base Cation in Solution." Journal of Physical Chemistry B 113 (2009): 4384 – 4393.
94 Polland, H.J., M.A. Franz, W. Zinth, W. Kaiser, P. Hegemann, and D. Oesterhelt. "Picosecond Events in the
Photochemical Cycle of the Light – Driven Chloride – Pump Halorhodopsin." Biophysical Journal 47.1 (1985) 55 –
59.
95 Kandori, Hideki., Keitaro Yoshihara, Hiroaki Tomioka, and Hiroyuki Sasabe. "Subpicosecond Transient Absorption
Spectrum of the Excited State of a Retinal Protein, Halorhodopsin." Chemical Physics Letters 187.6 (1991) 579 –
582.
96 Kandori, Hideki., Keitaro Yoshihara, Hiroaki Tomioka, and Hiroyuki Sasabe. "Primary Photochemical Events in
Haiorhodopsin Studied by Subpicosecond Time – Resolved Spectroscopy." Journal of Physical Chemistry 96
(1992): 6066 – 6071.
97 Kandori, Hideki., Keitaro Yoshihara, Hiroaki Tomioka, Hiroyuki Sasabe, and Yoshinori Shichida. "Comparative
Study of Primary Photochemical Events of two Retinal Proteins, Bacteriorhodopsin and Halorhodopsin, by Use of
Subpicosecond Time – Resolved Spectroscopy." Chemical Physics Letters 211.4 – 5 (1993) 385 – 391.
98 Arlt, T., S. Schmidt, W. Zinth, U. Haupts, D. Oesterhelt. "The Initial Reaction Dynamics of the Light – Driven
Chloride Pump Halorhodopsin." Chemical Physics Letters 241.5 – 6 (1995) 559 – 565.
99 Kobayashi, Takayoshi., Mijong Kim, Makoto Taiji, Tatsuo Iwasa, Masashi Nakagawa, and Motoyuki Tsuda.
"Femtosecond Spectroscopy of Halorhodopsin and Rhodopsin in a Broad Spectral Range of 400 – 1000 nm."
Journal of Physical Chemistry B 102 (1998): 272 – 280.
100 Peters, Frank., Johannes Herbst, Jörg Tittor, Dieter Oesterhelt, and Rolf Diller. "Primary Reaction Dynamics of
Halorhodopsin, Observed by Sub – Picosecond IR – Vibrational Spectroscopy." Chemical Physics 323 (2006) 109 –
116.
101 Mevorat – Kaplan, Keren., Vlad Brumfeld, Martin Engelhard, and Mordechai Sheves. "Effect of Anions on the
Photocycle of Halorhodopsin. Substitution of Chloride with Formate Anion." Biochemistry 44 (2005): 14231 –
14237.
102 Hasson, K. C., Feng Gai, and Philip A. Anfinrud. "The Photoisomerization of Retinal in Bacteriorhodopsin:
Experimental Evidence for a Three – State Model." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93 (1996): 15124 – 15129.
103 Bismuth, Oshrat., Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "Photochemical Dynamics of all –
Trans Retinal Protonated Schiff – Base in Solution: Excitation Wavelength Dependence." Chemical Physics 341
(2007) 267 – 275.
104 Logunov, S. L., T. M. Masciangioli, V. F. Kamalov, and M. A. El – Sayed. "Low – Temperature Retinal
Photoisomerization Dynamics in Bacteriorhodopsin." Journal of Physical Chemistry B 102 (1998): 2303 – 2306.
105 Dantus, Marcos., and Peter Gross. "Ultrafast Spectroscopy." in Encyclopedia of Applied Physics 1998. Volume 22.
WILEY-VCH. pages 431 – 456.
106 Reid, Gavin D., and Klaas Wynne. "Ultrafast Laser Technology and Spectroscopy." in Encyclopedia of Analytical
Chemistry R. A. Meyers (Ed.) pages 13644 – 13670. 1998. Volume 22. JohnWiley & Sons Ltd, Chichester, 2000.
107 Cerullo, Giulio., Cristian Manzoni, Larry Lüer, and Dario Polli. "Time – Resolved Methods in Biophysics. 4.
Broadband Pump – Probe Spectroscopy System with Sub – 20 fs Temporal Resolution for the Study of Energy
Transfer Processes in Photosynthesis." Photochemical & Photobiological Sciences 6 (2007): 135 – 144.
108 Hartke, B., R. Kosloff and S. Ruhman. "Large Amplitude Ground State Vibrational Coherence Induced by
Impulsive Absorption in CsI. A Computer Simulation." Chemical Physics Letters 158.3 – 4 (1989) 238 – 244.
109 Banin, Uri., Allon Bartana, Sanford Ruhman, and Ronnie Kosloff. "Impulsive Excitation of Coherent Vibrational
Motion Ground Surface Dynamics Induced by Intense Short Pulses." Journal of Chemical Physics 101.10 (1994)
8461 – 8481.
110 Dhar, Lisa., John A. Rogers, and Keith A. Nelson. "Time – Resolved Vibrational Spectroscopy in the Impulsive
Limit." Chemical Reviews 94.1 (1994): 157 − 193.
111 Mocker, Hans W., and R. J. Collins. "Mode Competition and Self – Locking Effects in a Q – Switched Ruby Laser."
Applied Physics Letters 7 (1965): 270 − 273.
112 Spence, D. E., P. N. Kean, and W. Sibbett. "60 – fsec Pulse Generation From a Self – Mode – Locked Ti:sapphire
Laser." Optics Letters 16.1 (1991): 42 − 44.
113 Asaki, Melanie T., Chung – Po Huang, Dennis Garvey, Jianping Zhou, Henry C. Kapteyn, and Margaret M.
Murnane. "Generation of 11 fs Pulses from a Self – Mode – Locked Ti:sapphire Laser." Optics Letters 18.12 (1993):
977 − 979.
114 Backus, S., J. Peatross, C. P. Huang, M. M. Murnane, and H. C. Kapteyn. "Ti:sapphire Amplifier Producing
Millijoule – Level, 21 fs Pulses At 1 Khz." Optics Letters 20.19 (1995): 2000 − 2002.
115 Yariv, Amnon., and Pochi Yeh. Optical Waves in Crystals. Propagation and Control of Laser Radiation. John Willey
& Sons, Inc. 1984. Ch. 12.
116 Boyd, Robert W. Nonlinear Optics (second edition) Academic Press. 2003. Ch. 7.
117 van Stokkum, Ivo H.M., Delmar S. Larsen, and Rienk van Grondelle. "Global and Target Analysis of Time –
Resolved Spectra." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics 1657.2 – 3 (2004): 82 – 104.
118 Golub, G., and W. Kahan. "Calculating the Singular Values and Pseudo – Inverse of a Matrix." Journal of the
Society for Industrial and Applied Mathematics: Series B, Numerical Analysis 2.2 (1965): 205 – 224.
119 Zgrablić, Goran., Stefan Haacke, and Majed Chergui. "Vibrational Coherences of the Protonated Schiff Base of all
– Trans Retinal in Solution." Chemical Physics 338 (2007) 168 – 174.
120 Kahan, Anat., Omer Nahmias, Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "Following Photoinduced
Dynamics in Bacteriorhodopsin with 7fs Impulsive Vibrational Spectroscopy." Journal of the American Chemical
Society 129.3 (2007) 537 – 546.
121 Hou, Bixue., Noga Friedman, Michael Ottolenghi, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "Comparing
Photoinduced Vibrational Coherences in Bacteriorhodopsin and in Native and Locked Retinal Protonated Schiff
Bases." Chemical Physics Letters 381.5 – 6 (2003) 549 – 555.
122 Loevsky, Boris., Amir Wand, Oshrat Bismuth, Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "A New
Spectral Window on Retinal Protein Photochemistry." Journal of the American Chemical Society 133.6 (2011) 1626
– 1629.
123 Schmidt, B., C. Sobotta, B. Heinz, S. Laimgruber, M. Braun, and P. Gilch. "Excited – State Dynamics of
Bacteriorhodopsin Probed by Broadband Femtosecond Fluorescence Spectroscopy." Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) - Bioenergetics 1706.1 – 2 (2005): 165 – 173.
124 Gai, Feng., J. Cooper McDonald, and Philip A. Anfinrud. "Pump – Dump – Probe Spectroscopy of
Bacteriorhodosin: Evidence for a Near – IR Excited State Absorbance." Journal of the American Chemical Society
119.26 (1997) 6201 – 6202.
125 Loring, Roger F., Yi Jing Yan, and Shaul Mukamel. "Time – Resolved Fluorescence and Hole – Burning Line
Shapes of Solvated Molecules: Longitudinal Dielectric Relaxation and Vibrational Dynamics." Journal of Chemical
Physics 87.10 (1987) 5840 – 5857.
© Copyright 2024