‫הפקולטה למתמטיקה ולמדעי הטבע‬
‫קרית אדמונד י' ספרא‬
‫המכון לכימיה ומרכז פרקש לתהליכים מושרי – אור‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר‬
‫בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫עבודת גמר לתואר מוסמך במדעי הטבע‬
‫מגיש‪ :‬פבל קום‬
‫בהנחיית פרופ' סנפורד רוכמן‬
‫יולי ‪2011‬‬
‫תקציר‪.‬‬
‫דינמיקה מושרית אור ראשונית של משאבת כלורידים הלורודופסין אשר מיוצרת על ידי ארכיאובקטריון‬
‫)‪ Natronomonas pharaonis (pHR‬נחקרה באמצעות ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה‪ .‬הסכמה הניסיונית‬
‫כללה שלושה פולסים‪ pump :‬נראה‪ dump ,‬אינפרה – אדום ו – ‪ probe‬היפר – ספקטרלי‪ .‬אמדן יעילות‬
‫הריקון של המצב הפלואורסצנטי של החלבון על ידי פולס ‪ dump‬מתקבל ממעקב אחר השינויים הנגרמים על‬
‫ידו לעצמת הבליעה והפליטה של מצב זה‪ ,‬כפונקציה של ההשהיה בינו לבין ה – ‪ .pump‬מעקב אחר הפחתת‬
‫אוכלוסיית מעגל האור של הפיגמנט‪ ,‬הבאה בעקבות ריקון המצב המעורר‪ ,‬נעשה על ידי מדידת ספקטרום הפרש‬
‫בליעה המשויך לתוצר ‪ K‬במעגל האור של הלורודופסין‪.‬‬
‫תוצאות הניסוי מראות כי חתך הפעולה לפליטה מאולצת כמעת קבוע לאורך החיים של המצב‬
‫הפלואורסצנטי‪ .‬תוצאת הדגימה של המצב ‪ K‬מצביעה על כך שהנחתת האוכלוסיה המעוררת על ידי ה – ‪dump‬‬
‫גורמת לירידה פרופורציונית בתפוקת מעגל האור של הפיגמנט‪.‬‬
‫המסקנה המתבקשת היא כי על אף היותה של קינטיקת ההיפוך הפנימי של המצב המעורר של ‪ pHR‬לא‬
‫אקספוננציאלית‪ ,‬מצב זה מורכב מאוכלוסיה מעוררת אחת ויחידה‪ .‬מסקנתנו זו עומדת בניגוד לפרדיגמה אשר‬
‫התגבשה במהלך חקר אירועים מושרי אור ראשוניים של משאבת כלורידים דומה‪ ,‬אשר מקורה באורגניזם אחר‪,‬‬
‫הלורודופסין של )‪ .Halobacterium salinarum (sHR‬לפיה‪ ,‬תוצר ‪ K‬של ‪ sHR‬נוצר מתת – אוכלוסיה‬
‫נפרדת‪ ,‬ראקטיבית‪ ,‬קצרת חיים של המצב המעורר‪ .‬הגילויים שלנו בנוגע לדינמיקת ההיפוך הפנימי ב – ‪pHR‬‬
‫נדונים לאור השארה אשר הועלתה לאחרונה כי דינמיקת ההיפוך הפנימי של המצב המעורר בשתי המשאבות‬
‫היינה זהה‪.‬‬
Abstract.
The primary photochemical dynamics of Hb. pharaonis Halorhodopsin (pHR) are
investigated by femtosecond visible pump near IR dump hyperspectral probe spectroscopy.
The efﬁciency of excited state depletion is deduced from transient changes in absorption,
recorded with and without stimulated emission pumping (SEP), as a function of the dump
delay. The concomitant reduction of photocycle population is assessed by probing the “K”
intermediate difference spectrum.
Results show that the cross section for stimulating emission is nearly constant
throughout the ﬂuorescent state lifetime. Probing “K” demonstrates that dumping produces a
proportionate reduction in photocycle yields. We conclude that, despite its nonexponential
internal conversion (IC) kinetics, the ﬂuorescent state in pHR constitutes a single intermediate
in the photocycle. This contrasts with conclusions drawn from the study of primary events in
the related chloride pump from Hb. Salinarum (sHR), believed to produce the “K”
intermediate from a distinct short-lived subpopulation in the excited state. Our discoveries
concerning internal conversion dynamics in pHR are discussed in light of recent expectations
for similar excited state dynamics in both proteins.
‫תודות‪.‬‬
‫ברצוני להודות לפרופ' סנפורד רוכמן על ההנחיה המסורה‪ ,‬הסו בלנות‪ ,‬והכי חשוב על האפשרות אשר‬
‫ניתנה לי להתנסות בתחום מחקר מרתק תוך כדי הפעלת ציוד עדכני ביותר‪.‬‬
‫לחברי הקבוצה‪ :‬בוריס‪ ,‬מירב‪ ,‬אמיר‪ ,‬איתי‪ ,‬אשרת‪ ,‬ג'ינגי‪ .‬תודה לכם על הרעיונות‪ ,‬ההסברים והתמיכה‬
‫שלכם‪ ,‬וכמובן על ההוי המיוחד של קבוצתנו‪.‬‬
‫למרסלו פרידמן ולאדוארד מסטוב‪ .‬אני מודה לכם על תמיכתכם הטכנית ופתרונותיכם המקוריים‪.‬‬
‫למשפחתי ולחברה שלי אירית‪ .‬תודה לכם על סבלנותכם‪ ,‬תמיכתם ועל זה שהאמנתם בי‪.‬‬
‫תוכן העניינים‪.‬‬
‫מבוא‪1.......................................................................................................................................‬‬
‫רודופסינים ארכיאליים‪1...................................................................................................‬‬
‫מקרה מייצג‪ :‬הרודופסינים של ‪2.....................................… Halobacterium salinarum‬‬
‫חלבון ה – ‪ . pHR‬מבנה ותפקוד‪8.....................................................................................‬‬
‫תהליכים ראשוניים בחלבונים רטינליים ארכיאליים וב – ‪15..................................... RPSB‬‬
‫ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה של הלורודופסין‪ .‬תוצאות מחקרים קודמים‪25.......................‬‬
‫מטרות המחקר ובחירת שיטה ניסיונית‪36...........................................................................‬‬
‫שיטות העבודה והמערכת הניסיונית‪40...........................................................................................‬‬
‫ספקטרוסקופיית בליעה מופרדת זמן בשיטת ‪40....................................… pump – probe‬‬
‫גילוי דינמיקה ויברציונית באמצעות ספקטרוסקופיה אלקטרונית אולטרה מהירה‪42.................‬‬
‫מערכת לייזר מתוצרת עצמית ליצירת פולסי אור אולטרה קצרים‪44.......................................‬‬
‫המרת אור‪50...................................................................................................................‬‬
‫מערך ניסיוני‪54...............................................................................................................‬‬
‫עיבוד נתונים‪56...............................................................................................................‬‬
‫תוצאות‪60..................................................................................................................................‬‬
‫ספקטרה בליעה טרנזיינטיים של ‪60........................................................................ pHR‬‬
‫תוצאות ניסוי ‪62.................................................................................................... SEP‬‬
‫דיון בתוצאות‪ .‬א‪ .‬צורת הטרנזיינטים בזמני השהיה מוקדמים‪65............................................‬‬
‫ב‪ .‬מבנה פס הפליטה המאולצת‪66.....................................................................................‬‬
‫ג‪ .‬דינמיקה ספקטרלית בזמני השהיה מוקדמים‪67................................................................‬‬
‫ד‪ .‬מודולציות פס הפליטה המאולצת‪68..............................................................................‬‬
‫ה‪ .‬דיון בהבדלי התנהגות של יחס הטרנזיינטים בבליעה ובפליטה בתוצאות ניסוי ‪69..… SEP‬‬
‫ו‪ .‬תובנות מניסוי ‪71...........................................................................................… SEP‬‬
‫סיכום‪73........................................................................................................................‬‬
‫ביבליוגרפיה‪75...........................................................................................................................‬‬
‫מבוא‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫רודופסינים ארכיאליים‪.‬‬
‫מחקרנו עוסק בתהליכים מושרי אור‪ ,‬ראשוניים בחלבון רטינלי ארכיאלי‪ .‬חלבונים אלה מהווים מנגנון‬
‫הישרדות הכרחי של אורגניזמים המאכלסים גומחות אקולוגיות אשר מאופיינות על ידי תנאים קיצוניים ‪ .1‬מאז‬
‫גילויים בשנות השבעים של המאה הקודמת ועד היום‪ ,‬הם זוכים להתעניינות ערה מצד חוקרים מתחומים שונים‬
‫של מדעי הטבע‪ .‬עדות לכך היא פרסומם של אלפי מאמרים בהם מוזכר רק אחד מהם‪ ,‬בקטריורודופסין‪ ,‬מקרה‬
‫מייצג של משפחת חלבונים רטינליים ארכיאליים‪ .‬לדעתנו‪ ,‬קריאה של כל אחד מהמאמרים עליו הופכת למעניינת‬
‫יותר אם הקורא מצויד בידע בסיסי מוקדם בתחום‪ ,‬קורא כזה יוכל להצביע על תרומתה של עבודה מסוימת‬
‫למכלול הידע שלנו על בקטריורודופסין וחלבונים רטינליים בכלל‪ .‬אנו מאמינים כי עבודתנו נמנית עם התורמות‬
‫יותר‪ ,‬אך על מנת לאפשר לקורא לגבש דעה משלו‪ ,‬ננסה לספק רקע ביולוגי וספקטרוסקופי רחב ככל הניתן‬
‫במסגרת תזה זו אודות חלבונים מעניינים אלה‪ .‬לאחר מכן‪ ,‬נדון בתהליכים מושרי אור בפיגמנט בו מיקדנו את‬
‫מחקרינו ונציג את המטרות שלו‪.‬‬
‫פיגמנטים המשתייכים למשפחת‬
‫החלבונים הרטינליים עושים שימוש‬
‫במולקולת הרטינל בתור כרומופור לצורך‬
‫קליטת אור השמש המהווה את מקור‬
‫איור ‪ :1‬רטינל בקונפיגורציית ‪ all – trans‬בהלורודופסין המצוי‬
‫לפעילותם‬
‫האנרגיה‬
‫הפוטוכימית‪ .‬בארכיאון ‪ .Halobacterium salinarum‬ניתן לראות את קישור‬
‫בסיס שיף ) ‪ (Schiff base linkage‬לליזין ‪ 242‬של חלבון זה‪.‬‬
‫"רודופסינים" או לפעמים "אופסינים"‪ ,‬הם‬
‫שמות נפוצים נוספים של משפחת חלבונים זאת‪ ,‬הם קרויים כך על שם פיגמנט הרודופסין‪ ,‬המשמש קולטן עצבי‬
‫רגיש לאור המצוי בתאי קנים ברשתית העין של בעלי חיים‪ .‬משותף לכל הרודופסינים הוא מבנה של כלוב הנוצר‬
‫על ידי שבעה סלילי ‪ α‬הטבולים בקרום התא‪ .‬הרטינל )איור ‪ (1‬הקשור קוולנטית לחלבון ממוקם בחלל הפנימי‬
‫של כלוב זה‪ .‬הקישור נעשה באמצעות יצירת בסיס שיף )‪ (Schiff base‬בין הכרומופור לבין שייר אמיני של‬
‫ליזין בסליל ‪) G‬מקובל למספר את הסלילים של הרודופסינים על ידי אותיות לטיניות מ – ‪ A‬עד ‪.2(G‬‬
‫חלבונים רטינליים מתחלקים לשתי תת משפחות‪ .‬החלוקה נעשית על סמך שיוך האורגניזם המייצר‬
‫אותם לעל ממלכה של העולם החי ונתמכת על ידי אנליזת הרצפים הראשוניים שלהם‪ .‬הרודופסינים הארכיאליים‬
‫מרכיבים את תת המשפחה הראשונה‪ .‬אלה התגלו לראשונה בארכיאון )יצורים חד תאיים קדומים אלה ידועים גם‬
‫בשם ארכיאובקטריה‪ ,‬נשתמש בשני השמות לסירוגין( הלופילי ‪ ,Halobacterium salinarum‬אורגניזם‬
‫המשגשג בסביבה דלת חמצן במעיינות מלוחים‪ .‬רודופסינים ארכיאליים מתפקדים כ‪ :‬א( משאבות יונים ממונעות‬
‫על ידי אור‪ ,‬דוגמאות בולטות‪ :‬משאבת פרוטונים בקטריורודופסין ומשאבת יוני כלור הלורודופסין של‬
‫‪ ,Halobacterium salinarum‬ב( קולטנים רגישים לאור‪ :‬למשל סנסורי רודופסינים ‪ I‬ו – ‪ II‬של אותו‬
‫האורגניזם‪ .‬קולטנים רגישים לאור בעיניים של בעלי חיים עילאיים )רודופסינים עילאיים או פשוט פיגמנטי‬
‫הראייה( משתייכים לתת המשפחה השנייה של החלבונים הרטינליים‪.3‬‬
‫הרודופסינים הארכיאליים שונים מהעילאיים‪ ,‬למשל על אף היות הפעילות הפיזיולוגית של הפיגמנטים‬
‫משתי הקבוצות מבוססת על פוטואיזומריזציה של הכרומופור‪ ,‬הקונפיגורציות ההתחלתיות והסופיות של‬
‫הרטינל שונות בשתי תת משפחות‪ .‬ברודופסינים ארכיאליים האיזומריזציה מתרחשת סביב הקשר ‪C13=C14‬‬
‫‪1‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :2‬פו טואיזומריזציה של הכרומופור ברודופסינים ארכיאליים )שמאל( ובפיגמנטי‬
‫הראייה )ימין(‪.‬‬
‫והשינוי הוא מ – ‪ all – trans‬ל – ‪ 13−cis‬ובעילאיים המצב ההתחלתי הוא ‪ 11−cis‬והסופי ‪all – trans‬‬
‫)איור ‪ . 4(2‬בעוד שהדמיון בין חלבונים השייכים לתת משפחה מסוימת הוא מובהק ביותר כאשר בוחנים את‬
‫המבנים השלישוניים‪ ,‬השוני בין רודופסינים ארכיאליים לפיגמנטי הראייה נראה כבר ברמת הסידור של שבעת‬
‫סלילי ‪ , α‬כלומר עבור החלבונים הנ"ל פילוגנטיקה היא הגורם העיקרי המכתיב את המבנה שלהם‪ .‬לאור‬
‫העובדה שהחלבון הנחקר על ידינו‪ ,‬הלורודופסין שמקורו בארכיאון ‪) Natronomonas pharaonis‬מכאן‬
‫והלאה ייקרא ‪ ,(pHR‬משתייך למשפחת הרודופסינים הארכיאליים ונוכח הדמיון המועט בינם לבין הרודופסינים‬
‫העילאיים לא נרחיב דיבור על האחרונים‪.‬‬
‫מקרה מייצג‪ :‬הרודופסינים של ‪.Halobacterium salinarum‬‬
‫ארבעה רודופסינים נמצאו ב – ‪ :Halobacterium salinarum‬בקטריורודופסין‪ ,‬הלורודופסין‬
‫וסנסורי רודופסינים ‪ I‬ו – ‪) II‬איור ‪ . 5(3‬נכון לעכשיו‪ ,‬ארבעת החלבונים האלה הם הנציגים הנחקרים ביותר של‬
‫משפחת הרודופסינים הארכיאליים‪ .‬ארכיאה הלופיליים אחרים מייצרים אחד או יותר הומולוגים של ארבעתם‪.‬‬
‫גילוי של בקטריורודופסין )‪ ,( BR‬משאבת פרוטונים טראנס – ממברנלית של הארכיאון המוזכר לעיל‬
‫על ידי ‪ D. Oesterhelt‬ו – ‪ W. Stoeckenius‬ב – ‪ 1971‬היווה צעד חשוב בהבנת אסטרטגיית הישרדות של‬
‫יצור חד תאי זה בתנאי סביבה היפוקסיים‪ ,‬המגבילים את יכולתו להפיק אנרגיה בנשימה‪ .‬מפל ריכוזים‬
‫אלקטרוכימי של פרוטונים הנופל על הממברנה התאית של הארכיאון‪ ,‬אשר דרוש ליצירת ‪ ,ATP‬מושג במצב‬
‫של חוסר חמצן באמצעות שאיבה של ‪ H+‬על ידי בקטריורודופסין מהציטופלזמה אל מחוץ לתא‪ .‬אור השמש‪,‬‬
‫אשר מנוצל ביעילות רבה על ידי החלבון‪ ,‬מהווה את מקור האנרגיה עבור השאיבה של הפרוטונים נגד מפל‬
‫הריכוזים שלהם ועבור יצירת ‪ ATP‬המתאפשרת בעקבות זאת‪.7,6‬‬
‫משאבת יונים שנייה‪ ,‬המופעלת באמצעות אור‪ ,‬על פני הקרום של ‪ Halobacterium salinarum‬היא‬
‫משאבת כלורידים הלורודופסין )‪ . 8(sHR‬חלבון זה התגלה במהלך חקר זן מהונדס גנטית של הארכיאובקטריון‬
‫הנ"ל‪ ,‬אשר אין לו יכולת לייצר את הבקטריורודופסין‪ .‬קיטוב מושרה אור‪ ,‬לא צפוי‪ ,‬של הממברנה שלו הוליך את‬
‫החוקרים למסקנה ש – ‪ Halobacterium salinarum‬מייצר משאבת יונים טראנס ממברנלית נוספת‪ .‬בהתחלה‬
‫‪2‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :3‬ארבעת הרודופסינים של ‪ Halobacterium salinarum‬משמאל לימין‪:‬‬
‫בקטריורודופסין‪ ,‬הלורודופסין‪ ,‬סנסורי רודופסינים ‪ I‬ו – ‪ .II‬כיוון השאיבה של משאבות‬
‫היונים מוצג על ידי החצים‪ .‬סנסורי רודופסינים נראים כאן עם הרכיבים השונים בשרשרת‬
‫יצירת הסיגנל‪ .‬הצבעים המוצגים של הפיגמנטים הם בקירוב הצבעים האמתיים שלהם‪.‬‬
‫ייחסו למשאבה החדשה את פעולת שאיבת יוני הנתרן מפנים התא החוצה‪ ,‬בניסיון להסביר את מפל ריכוזים של‬
‫‪ Na+‬שייצרו תאי זן זה באור‪ , 9‬אך מאוחר יותר הבינו כי המשאבה מעבירה יוני כלור מחוץ לתא פנימה ומפל‬
‫ריכוזים של יוני הנתרן הוא תוצאה משנית של פעולה זו‪ .‬עקב כך‪ ,‬ניתן למשאבת יונים החדשה השם‬
‫הלורודופסין‪.5‬‬
‫אם גילוי והבנת התפקיד של בקטריורודופסין שפכו אור על דרך התמודדות של הלוארכיאה עם ריכוזים‬
‫נמוכים של חמצן‪ ,‬הרי שמתן התיאור של הפעולה המבוצעת על ידי ההלורודופסין תורם להבנתנו של תופעת‬
‫השגשוג של אורגניזמים חד תאיים אלה בתמיסות מלח מרוכזות‪ .‬על מנת לתת מענה ללחץ אוסמוטי המופעל על‬
‫ידי הסביבה‪ ,‬הלוארכיאה פיתחו מנגנון לוויסותו המבוסס על מעבר יונים פעיל דרך הממברנה‪ ,‬עד להשוואת‬
‫ריכוז המומס ים בתוך התא לזה החיצוני‪ .‬קטיונים המצויים בסביבה המידית של התאים יחדרו את הממברנה עכב‬
‫היווצרות )על ידי פעולת השאיבה של בקטריורודופסין( של מפל ריכוזים של פרוטונים‪ ,‬יוני אשלגן הידועים‬
‫כבעלי כושר חדירה גבוה של הממברנה‪ ,‬יהוו חלק ניכר מהם‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬יוני הכלור צריכים להיות מועברים‬
‫כנגד אותו הפוטנציאל הנוצר על ידי מעבר הפרוטונים‪ ,‬לכן ברור כי קיים צורך פיזיולוגי במשאבה אשר תכניסם‬
‫לתוך התאים‪.5‬‬
‫סנסורי רודופסינים הם קולטנים המווסתים תנועה של התא לפי גרדיינט עוצמת אור ומהווים רק חלק‬
‫מקומפלקס האיתות שלו שכולל גם חלבונים נוספים‪ Htr I :‬ו – ‪) Htr II‬איור ‪ .(3‬קומפלקס זה מפעיל באמצעות‬
‫יצירת מפל פוספורילציה את מנגנון התנועה של הארכיאון המבוסס על שוטונים‪ SR I .‬הוא קולטן המניע את‬
‫התא בכוון אור כתום אשר מהווה מקור אנרגיה לשתי המשאבות הטראנס – ממברנליות שלו‪ ,‬בנוסף‪ ,‬חלבון זה‬
‫מסוגל לייצר דחייה חזקה כלפי אזורים מוארים באור אולטרה סגול קרוב‪ ,‬המסוכנים לתאים אלה‪ .‬להבדיל‬
‫מבקטריורודופסין‪ ,‬הלורודופסין ו – ‪ SR I‬המיוצרים בתנאים סמי – אנאירוביים‪ ,‬הפיגמנט ‪ SR II‬גורם לתגובת‬
‫‪3‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫דחייה כלפי אור כחול בתנאים בהם יש שפע של‬
‫חמצן וקיימת סכנה ממשית של נזקים פוטו –‬
‫אוקסידטיביים‪.11,10‬‬
‫לארבעת הפיגמנטים הממברנליים של‬
‫‪ H.salinarum‬יש את אותו כרומופור‪ ,‬אך בהתאם‬
‫לתפקידיהם הפיזיולוגיים‪ ,‬ספקטרה הבליעה שלהם‬
‫במצב יסוד משתנים מאחד לשני‪ :‬שיא הבליעה של‬
‫בקטריורודופסין הוא ב – ‪ , 568nm‬של‬
‫הלורודופסין ב – ‪ ,578nm‬עבור ‪ SR I‬מקסימום‬
‫של ספקטרום הבליעה נמצא ב – ‪ 587nm‬ועבור‬
‫סנסורי רודופסין ‪ II‬ב – ‪) 487nm‬איור ‪ . (4‬באיור ‪3‬‬
‫נעשה ניסיון להמחיש את הצבעים האמתיים של‬
‫איור ‪ :4‬ספקטרה בליעה של הרודופסינים של ‪H.salinarum‬‬
‫הפיגמנטים‪ .‬אם נמדוד את ספקטרום הבליעה של‬
‫ושל ‪ RPSB‬במתנול ובפאזה גזית‪ ,‬במצב יסוד‪.‬‬
‫הכרומופור המנותק מהחלבון‪ ,‬ליתר דיוק‪ ,‬את הספקטרום של ‪RPSB – Retinal Protonated Schiff Base‬‬
‫בסיס שיף של רטינל שעבר פרוטונציה )מולקולה זו משמשת מודל פשוט לחקר השפעת החלבון על דינמיקת‬
‫האיזומריזציה של הכרומופור( נגלה כי שיא הבליעה של המולקולה הנ"ל בפאזה גזית הוא ב – ‪.610nm‬‬
‫קישור הכרומופור לחלבון תמיד יגרום להסט ספקטרום הבליעה שלו לכחול ביחס לספקטרום זה בפאזה‬
‫הגזית )איור ‪ .(4‬הסט זה נקרא ‪ opsin shift‬ומידתו משתנה מפיגמנט לפיגמנט‪ ,‬מה שמשקף את היכולת של‬
‫האופסין לשלוט בספקטרום הבליעה של הכרומופור שלו ולהתאים אותו לתפקידו הפיזיולוגי‪ .‬המנגנון העיקרי‬
‫באמצעותו נעשה כוונון ספקטרום הבליעה של הכרומופור על ידי חלבון האב הוא שינוי המרחק בין הפרוטון של‬
‫בסיס שיף לבין אניון הנגדי שלו‪ .‬האניון הזה הוא יון הכלור בהלורודופסין וחומצה אמינית טעונה שלילית‬
‫באופסינים האחרים של ‪ ,H.salinarum‬במקרה של בקטריורודופסין זוהי חומצה אספרטית ‪ Asp85‬בסליל‬
‫‪ .12C‬נציין כי ‪ RPSB‬במתנול בולע בכחול ב – ‪ . 13450nm‬ייצוב מצב היסוד של הכרומופור בתמיסה על ידי‬
‫הימצאות של האניון הנגדי במרחק אופטימלי מהפרוטון מעלה בהרבה את האנרגיה הנדרשת לעירור‪ .‬אי לכך‪,‬‬
‫מידת ייצוב מצב היסוד של הכרומופור על ידי חלבון האב שלו תשפיע באופן משמעותי על מידת ה – ‪opsin‬‬
‫‪.14shift‬‬
‫ארבעת האופסינים של ‪ H.salinarum‬מבצעים משימות שונות עבור התא‪ .‬לפיכך‪ ,‬ניתן היה לצפות‬
‫לשוני מהותי במבנה שלהם‪ ,‬לפחות באזור האתרים הפעילים‪ .‬מה הסיכוי לדמיון בין האתרים הפעילים של‬
‫משאבת פרוטונים בקטריורודופסין המכוונת כלפי חוץ ומשאבת יוני כלור נפחיים הלורודופסין‪ ,‬אשר מכוונת‬
‫כלפי פנים? מסתבר כי מספיק להחליף את ‪ Asp85‬של בקטריורודופסין בחומצה אמינית בעלת שייר שלא נושא‬
‫מטען שלילי על מנת להפוך משאבת פרוטונים זו למשאבת כלורידים מוכוונת פנימה‪ .15‬המרת פונקציונליות‬
‫שכזו בין הרודופסינים של ‪ H. salinarum‬הודגמה על ידי כמה ניסויים‪ :‬בתנאים של ‪ pH‬חומצי‬
‫בקטריורודופסין שואב יוני כלור‪ . 16‬מספר מוטציות נקודתיות מחליפות את הפונקציה של ‪ SR I‬לזו של ‪,17SR II‬‬
‫כמו כן ניתן להפוך סנסורי רודופסין זה למשאבת פרוטונים רק על ידי ניתוקו מתת היחידה ‪ Htr I‬של קומפלקס‬
‫‪4‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ : 5‬השוואה בין האתר הפעיל של הלורודופסין מ – ‪ N. pharaonis‬לבין האתרים הפעילים של‬
‫בקטריורודופסין והלורודופסין של ‪ .H. salinarum‬צד שמאל )‪ (1‬משווה בין שני ההלורודופסינים‪ .‬השלד‬
‫הפחמני של ‪ pHR‬מוצג בירוק וזה של ‪ sHR‬בצהוב‪ .‬הכדורים האדומים מסמנים מולקולות מים הקשורות‬
‫לשיירים של כיס החלבון של ‪ pHR‬והצהובים את המים של ‪ .sHR‬צד ימין )‪ (2‬עורך השוואה בין כיסי החלבון‬
‫של בקטריורודופסין )כחול( מ – ‪ H. salinarum‬והלורודופסין )ירוק( מ – ‪ N. pharaonis‬רואים כי הכלוריד‬
‫נמצא באזור התפוס על ידי חומצה אספרטית מס' ‪ 85‬של בקטריורודופסין‪ .‬הכדורים האדומים והכחולים‬
‫מסמנים מולקולות מים שנמצאות באתר הפעיל של הלורודופסין ובקטריורודופסין בהתאמה‪.‬‬
‫האיתות‪ .‬כנראה שאינטראקציות בין הסלילים של ‪ SR I‬ו – ‪ Htr I‬גורמות לחסימת התעלה הפנימית של ‪.18SR I‬‬
‫קרבה בין ארבעת הרודופסינים של ‪ Halobacterium salinarum‬מתבטאת הן בדמיון במבנה‬
‫הרבעוני אשר פוענח בהפרדה טובה מאוד עבורם )לדוגמה‪ 1.5Å :‬במקרה של בקטריורודופסין ו – ‪ 1.8Å‬עבור‬
‫הלורודופסין‪ ( 19,12‬והן בחזרות הרבות ברצפים הראשוניים ביניהם ובין רודופסינים ארכיאליים בכלל‪ ,‬במיוחד‬
‫באזור האתר הפעיל בקרבת הכרומופור‪ .2‬קרבה זו מקנה אופי השוואתי למחקרים רבים אשר נעשים על חלבונים‬
‫רטינליים‪ ,‬אפילו אם מקורם באורגניזמים שונים‪ .‬השוואה בין דינמיקה מושרית אור של שני הלורודופסינים‪ :‬זה‬
‫שמיוצר על ידי ‪ ,Natronomonas pharaonis‬אותו חקרנו‪ ,‬וזה של ‪ H. salinarum‬יכולה להיות מעניינת‪.‬‬
‫בין שתי משאבות אלה קיים דמיון מבני לא מבוטל )איור ‪ (5‬אשר מרמז על דמיון גם במנגנוניהן הפוטוכימיים‪.‬‬
‫מחקר כזה הופך לעוד יותר מעניין אם החוקרים מצליחים לקשר בין הבדלים מבניים מינוריים ביניהם לבין השוני‬
‫בדינמיקה‪.‬‬
‫אירוע ראשוני של הפוטוכימיה של החלבונים הרטינליים הוא איזומריזציה מושרית אור של הכרומופור‪.‬‬
‫פוטואיזומריזציה של הרטינל בחלבונים אלה מובילה לסדרה של אירועים הכוללים שינויים מבניים שלהם‪,‬‬
‫התגובה הפוטוכימית מאותחלת בכיס החלבון בו נמצא הרטינל והשינויים העוקבים בחלקי החלבון האחרים‬
‫מצומדים לאתר פעיל זה‪ .‬כפי שאיור ‪ 4‬ממחיש‪ ,‬ספקטרום הבליעה של הכרומופור מושפע מסביבת החלבון‪ ,‬לכן‬
‫שינויים קונפורמציוניים‪ ,‬מושרי אור‪ ,‬של האופסין מזוהים באמצעות שיטות ספקטרוסקופיות במרחב הזמן‬
‫כצורונים בעלי חתימות ספקטרליות אופייניות‪ ,‬אלה הם תוצרי הביניים של התגובה הפוטוכימית של החלבון‪.‬‬
‫מקסימום של ספקטרום בליעה של תוצר ביניים מסוים יכול להיות מוסט לכחול או לאדום ביחס‬
‫לספקטרום התחלתי של הפיגמנט‪ .‬מכאן שההשפעה של האופסין על ספקטרום הבליעה של הכרומופור שלו‪,‬‬
‫באמצעות האינטראקציות בין ה – ‪ RPSB‬ליון הנגדי ולשיירים הקוטביים באתר הפעיל‪ ,‬במצב היסוד ובמהלך‬
‫הפוטוכימיה‪ ,‬היא זו המאפשרת את חקר הדינמיקה של הרודופסינים באמצעים ספקטרוסקופיים‪ .‬תוצרי הביניים‬
‫של הפוטוכימיה של חלבונים רטינליים ארכיאליים דועכים באופן ספונטני )בתהליכים תרמיים‪ ,‬בחשכה( למצב‬
‫‪5‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪) :6‬מימין( מעגל האור של ‪ . sHR‬המספרים בצד ימין למתה בשם של תוצר ביניים כלשהו מציינים את מרכז‬
‫ספקטרום הבליעה של צורון זה‪ .‬רואים כיצד הצעדים הנדרשים על מנת לבצע את פעולת השאיבה משתקפים‬
‫בספקטרוסקופיה‪ :‬איזומריזציה מושרית אור ותרמית של הכרומופור )*‪ I‬ו – ‪ ,(I‬שני הצעדים הכוללים קישור וניתוק‬
‫כלוריד מהפיגמנט )אלה מסומנים על ידי האות ‪ (T‬ושני צעדים בהם משתנה הנגישות של האתר הפעיל לכלוריד‬
‫מהצד החוץ תאי )‪ (extra cellular – ec‬לצד הציטופלזמי ובחזרה המסומנים על ידי ‪ .S‬תחילתו וסופו של מעגל‬
‫האור הוא בצורון ‪ . HR578‬מצד שמאל רואים את הספקטרה האבסולוטיים של תוצרי הביניים במעגל האור של‬
‫‪.sHR‬‬
‫היסוד ההתחלתי‪ ,‬כלומר הפוטוכימיה שלהם מעגלית ולכן שרשרת התגובות מושרית האור של הרודופסינים‬
‫הארכיאליים נקראת "מעגל אור"‪ . 20‬איור ‪ 6‬מציג את סכמת מעגל האור של ‪ sHR‬ואת הספקטרה האבסולוטיים‬
‫של צורוני הביניים בפוטוכימיה של חלבון זה‪.21‬‬
‫בין מעגלי האור של הרודופסינים של ‪ ,H.salinarum‬כפי שהם משתקפים בספקטרוסקופיה מופרדת‬
‫זמן של חלבונים אלה‪ ,‬קיים דמיון מסוים‪ ,‬מה ששוב יכול להעיד על דמיון במנגנונים פוטוכימיים שלהם‪.‬‬
‫לדוגמה‪ ,‬מעגלי אור של ‪ BR ,SR I‬ו – ‪ SR II‬מתאפיינים בכך שבסקלה של פיקושניות נצפה תוצר שספקטרום‬
‫הבליעה שלו מוסת לאדום‪ ,‬שלאחר מכן דועך תרמית במספר שלבים‪ ,‬תוך שברי המילישנייה‪ ,‬לתוצר הבולע ב –‬
‫‪ UV‬קרוב‪ .‬תוצר זה נקרא "‪ " M‬בבקטריורודופסין‪ .‬ההסטה החזקה לכחול של ספקטרום הבליעה של התוצרים‬
‫הללו נובעת מדה – פרוטונציה של בסיס שיף בשלב זה של שרשרת התגובות‪ .‬במצב זה‪ ,‬סנסורי רודופסינים‬
‫מאותתים עקב שינוי אופי האינטראקציה בינם לבין החלבון הממברנלי ‪ Htr trasducer‬שמהווה תת יחידה‬
‫בקומפלקס האיתות של הארכיאון )איור ‪ . 22(3‬במשאבת הפרוטונים בקטריורודופסין בשלב היצירה של תוצר ‪M‬‬
‫מתרחש המעבר של הפרוטון מבסיס שיף אל חומצה אספרטית ‪ ,Asp85‬כלומר בשלב זה מתחיל המעבר של‬
‫הפרוטון דרך הממברנה‪.‬‬
‫קל לעקוב אחר מצבים מוסתים לכחול קיצוני אלה גם בשיטות ספקטרוסקופיות מסורתיות‪ ,‬כגון –‬
‫‪ , flash photolysis‬בשלבים אלה של שרשרת התגובות הפוטוכימית של הרודופסינים הארכיאליים תוצרי‬
‫הביניים הם יחסית ארוכי חיים‪ ,‬לכן חקר מצבי ‪ M‬השונים מספק כלי נח ללימוד של הקורלציות בין תכונות‬
‫ביוכימיות של חלבונים רטינליים‪ ,‬הניתנות לשינויי על ידי מוטציות מכוונות‪ ,‬לפוטו – טרנספורמציות שלהם‪.‬‬
‫להבדיל ממעגלי האור של בקטריורודופסין‪ SR I ,‬ו – ‪ SR II‬מצב דמוי ‪ M‬לא מופיע בפוטוכימיה של‬
‫הלורודופסין בתנאים רגילים‪ .‬כך מעגל האור של משאבת כלורידים זו משקף שוני מהותי בינה לבין האופסינים‬
‫האחרים של ‪ .Halobacterium Salinarum‬בהלורודופסין‪ ,‬בסיס שיף משמר את הפרוטון שלו במהלך כל‬
‫התגובות הקשורות בפעולת המשאבה‪ ,‬ככל הנראה הפרוטונציה שלו מיוצבת על ידי הנוכחות של המטען‬
‫‪6‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫השלילי של הכלוריד‪.23‬‬
‫בהמשך‪ ,‬נציג מספר עבודות העוסקות בדינמיקה מושרית‬
‫אור אולטרה מהירה של הלורודופסינים‪ ,‬רובן נעשו על ‪ .sHR‬הסיבה‬
‫לכך פשוטה‪ sHR ,‬התגלה לפני ‪ .pHR‬בתור הקדמה‪ ,‬נאמר כאן‬
‫מספר מילים על אנרגטיקה של השלב הראשון של המנגנון‬
‫הפוטוכימי של ‪) sHR‬ניתן לראות את הסיכום הגרפי של המנגנון‬
‫הנ"ל באיור ‪ (7‬ונתאר כיצד שלב זה משתקף במעגל האור של אופסין‬
‫זה‪.‬‬
‫מצב היסוד ההתחלתי של ‪ sHR‬מאופיין על ידי התפלגות‬
‫יציבה של מטענים חלקיים ושלמים באזור האתר הפעיל‪ .‬אבני הבניין‬
‫של התפלגות זו הם החנקן והפרוטון הקשור אליו‪ ,‬יון הכלור הנגדי‬
‫של הקבוצה הפונקציונלית של בסיס שיף‪ ,‬השיירים של חומצות‬
‫האמיניות המרכיבות את החלל הפנימי של הלורודופסין ומולקולות‬
‫המים הנמצאות שם‪ .‬המים יוצרים קשרי מימן עם אותם השיירים‪ ,‬עם‬
‫הכלוריד ועם הפרוטון של בסיס שיף )איור ‪.(5‬‬
‫איזומריזציה מושרית אור של הכרומופור מייצרת התפלגות‬
‫איור ‪ :7‬השלבים של הפוטוכימיה של ‪sHR‬‬
‫מסומנים על ידי המספרים‪ .1 :‬מעבר של מטענים חדשה‪ ,‬גבוהה באנרגיה מזו ההתחלתית בכ – ‪,11kcal/mol‬‬
‫הכלוריד באתר הפעיל דרך הרטינל לאחר‬
‫הפוטואיזומריזציה שלו‪ .2 .‬שחרור הכלוריד הכוללת בין היתר נדידת מטען חיובי אל עבר טבעת משושה של‬
‫לציטופלזמה‪ .3 .‬כניסת כלוריד אחר מהצד‬
‫החוץ – תאי‪ .‬החצים מציינים את כוון הרטינל – טבעת ‪ β‬יונון‪ .‬הקונפיגורציה החדשה הזאת של המטענים‬
‫השאיבה של האניון על ידי החלבון‪.‬‬
‫היא הכוח המניע לניתוקו של הכלוריד מהמיקום ההתחלתי שלו‬
‫ולנדידתו הלאה‪ .‬אנרגיית מול פוטונים במרכז הנראה )‪ (580nm‬היא ‪ ,~50kcal‬החלבון אוגר כחמישית מסך‬
‫האנרגיה של הפוטון המעורר‪ .‬היתרה מתפזרת כחום‪ .‬חישובים שנעשו על ‪ sHR‬מראים כי ניצול יעיל יותר של‬
‫אנרגיית הפוטון‪ ,‬כלומר הגבהת המצב ‪ 13−cis‬ביותר מ – ‪ 11kcal/mol‬לעומת המצב ‪ , all – trans‬היה‬
‫גורם להתגברות קצב האיזומריזציה הלא פרודוקטיבית למצב התחלתי‪ ,‬לכן החלבון מנצל רק חלק קטן מאנרגיית‬
‫הפוטון המעורר‪.‬‬
‫ייתכן כי הפרש האנרגיה בין מצב ‪ 13−cis‬למצב ‪ all – trans‬של הכרומופור ב – ‪ sHR‬הוא הגורם‬
‫העיקרי לכך שהבליעה של הפיגמנט כאשר הכרומופור שלו במצב ‪ 13−cis‬מוסטת לאדום‪ ,‬ל – ‪) 600nm‬על‬
‫מנת לקבוע בוודאות אם הפרש האנרגיה בין שני האיזומרים של הכרומופור במצב יסוד הוא הגורם להסחה‬
‫במקרה זה יש צורך במיפוי של משטח הפוטנציאל המעורר כפונקציה של הקו אורדינטות המולקולריות של‬
‫הרטינל וסביבת האופסין המידית‪ ,‬במערכות ביולוגיות גדולות מיפוי כזה הוא משימה מורכבת (‪ .‬תוצר ביניים‬
‫הבולע סביב ‪ ,600nm‬הוא ‪ ,HR600‬הידוע גם בתור תוצר "‪ "K‬במעגל האור של הלורודופסין‪.25,24‬‬
‫תוצר בעל שיא בליעה מוסט לאדום‪ ,‬ביחס למצב היסוד ההתחלתי‪ ,‬מופיע תוך פיקושניות בודדות‬
‫בספקטרה מופרדי זמן של כל הרו דופסינים הארכיאליים‪ .‬מהירותו של שלב זה מקשה על חקר הדינמיקה‬
‫הגרעינית של הכרומופור וסביבת החלבון המידית המתרחשת במהלכו‪ ,‬אך מעבדתנו מצוידת בכלים ניסיוניים‬
‫‪7‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫אשר מאפשרים זאת‪ .‬כפי שנראה בהמשך‪ ,‬בעיית הטופוגרפיה של משטחים אלקטרוניים מעוררים ובעיית‬
‫הדינמיקה הגרעינית הניתנת לתיאור במונחים של חבילות גלים המתפתחות על גבי המשטחים הללו‪ ,‬שזורות‬
‫במידה מסוימת זו בזו‪ .‬אינפורמציה המתקבלת עבור דינמיקה של הכרומופור עשויה לרמוז על טופוגרפיה‬
‫אפשרית של המשטח האלקטרוני המעורר‪ ,‬מצד שני‪ ,‬ידיעת המבנה של המשטח המעורר כפונקציה של‬
‫קואורדינטות נורמליות רלוונטיות לתהליך האיזומריזציה תעזור לנפות תרחישים דינמיים לא סבירים‪ .‬לפני‬
‫שנציג תוצאות מחקרים קודמים אשר עסקו בדינמיקה מושרית אור אולטרה מהירה של הלורודופסינים ונראה‬
‫מהי האינפורמציה אשר התקבלה בעבודות הללו כולל הפירושים שלה על ידי קהילת חוקרי ה – ‪,ultrafast‬‬
‫נתעכב על מה שידוע עד כה על ‪ pHR‬ובפרט על ההבדלים בינו לבין "בן דודו" ‪.sHR‬‬
‫חלבון ה – ‪ .pHR‬מבנה ותפקוד‪.‬‬
‫ארכיאון הלו – אלקלופילי ‪ Natronomonas pharaonis‬מייצר את ההלורודופסין אותו חקרנו‪.‬‬
‫אורגניזם זה משגשג באגמים מלוחים ובסיסיים )‪ (soda lakes‬באפריקה‪ .‬טווח ‪ pH‬אופטימלי לגידולו נע סביב‬
‫‪ 9‬אך מין זה של הלוארכיאה בודד גם ממקורת מים בסיסיים ביותר‪ ,‬בעלי ‪ pH‬המגיע עד ‪ . 2611‬הזהות ברצפים‬
‫הראשוניים בין משאבת הכלורידים של ‪ N. pharaonis‬לזאת של ‪ H. salinarum‬מסתכמת ב – ‪ 53%‬כך‬
‫שמדובר בשני חלבונים שונים‪ .27‬ההבדל המעניין בין השניים הוא לאו דווקא ברצף או מבנה שלהם‪ ,‬אלא במטרה‬
‫למענה הם מיוצרים‪ .‬ל – ‪ N. pharaonis‬אין הומולוג של בקטריורודופסין‪ .‬מין זה של הלוארכיאה מסתמך על‬
‫הלורודופסין לצורך הפקת אנרגיה בתנאים של חוסר חמצן‪ .‬מנגנון של פוטופוספורילציה של ‪ ADP‬ב – ‪N.‬‬
‫‪ pharaonis‬דומה לזה של ‪ H. salinarum‬ומבוסס על מעבר ‪ H+‬לתוך התאים דרך החלק המעוגן בממברנה‬
‫של החלבון ‪ .ATP synthase‬הכוח המניע למעבר פרוטונים דרך הממברנה התאית של ‪ N. pharaonis‬הוא‬
‫קיטובה עקב שאיבת יוני כלור על ידי ‪.28pHR‬‬
‫שוני משמעותי נוסף בין שתי משאבות הכלוריד הוא היחס בין איזומרי הציס והטראנס של רטינל‪ .‬אם‬
‫"נדגיר" את ‪ sHR‬בחושך במשך זמן מסוים )סדר גודל של יממה‪ ,‬תהליך זה נקרא "‪ ("dark adaptation‬ולאחר‬
‫מכן נבצע מדידה שמטרתה לגלות מהו אחוז החלבונים עם הכרומופור במצב ‪ , all – trans‬נגלה שקרוב ל –‬
‫‪ 45%‬מסך החלבונים עונים לדרישה זו‪ .‬מספר פיגמנטים עם הכרומופור ‪ all – trans‬עולה ל – ‪ 75%‬לאחר‬
‫חשיפה ממושכת לאור‪ .‬כשהם חשופים לאור‪ ,‬חלבונים אלה נמצאים במה שנקרא " ‪ ."light adapted state‬ב –‬
‫‪ pHR‬לעומת זה אחוז החלבונים במצב ‪ all – trans‬לא תלוי בתנאי תאורה ועומד על ‪ .85%‬בנוסף‪ ,‬מצב‬
‫‪ 13−cis‬של ‪ pHR‬לא עובר איזומריזציה מושרית אור להבדיל ממצב ‪ 13−cis‬של ‪ ,sHR‬מה שמקל על חקר‬
‫מעגל האור של ‪.29,23pHR‬‬
‫פענוח המבנה ‪ pHR‬בשיטת פיזור קרני ‪) X‬ברזולוציה של ‪ 2‬אנגסטרום( הושלם לאחרונה‪ .30‬בין היתר‬
‫נמצא כי הרטינל קשור לליזין )בדומה למה שקורה ברודופסינים אחרים( ‪ Lys256‬בסליל ‪ .G‬השרשרת‬
‫הפוליאנית של הרטינל מוקפת ומיוצבת על ידי מספר שיירים ארומטיים‪ .‬קשר ‪ NH‬של בסיס שיף מוכוון כלפי‬
‫הצד החוץ תאי והפרוטון יוצר קשר מימן עם אחת ממולקולות מים אשר מרכיבות צביר בן שלוש מולקולות‬
‫באזור האתר הפעיל‪ .‬יון הכלור ואחד החמצנים של השייר ‪ Asp252‬יוצרים גם הם אינטראקציות עם בסיס שיף‪.‬‬
‫שתי קבוצות קוטביות אשר מייצבות את הקישור של הכלוריד לאתרו ההתחלתי בקרבת המטען החיובי של בסיס‬
‫‪8‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫שיף הם ההידרוקסילים של ‪ Ser130‬ושל ‪ Thr126‬בסליל ‪.C‬‬
‫איור ‪ 8‬מציג סיכום גרפי של האתר הפעיל של ‪.pHR‬‬
‫למולקולות המים באתר הפעיל תפקידים בייצוב‬
‫מטענים שלמים וחלקיים אשר בונים אותו‪ ,‬אבל לא רק‪ .‬כך‬
‫למשל המולקולה ‪ Wat502‬יוצרת קשר מימן עם הכלוריד‬
‫וברור כי עובדה זו תורמת לייצוב הכלוריד באתר הקישור‬
‫שלו‪ ,‬אבל אם מסתכלים על המולקולה ‪ Wat503‬רואים כי‬
‫היא "תופרת " על ידי קשרי מימן שני שיירים קטביים‪:‬‬
‫‪ Asp252‬ו – ‪ .Arg123‬תפקיד מבני שמזוהה עם מולקולות‬
‫מים שמהוות חלק ממבנה רבעוני של חלבון‪ .‬מחקרים‬
‫איור ‪ :8‬סביבת האתר הפעיל של ‪ .pHR‬המספרים‬
‫האדומים מציינים מרחקים )באנגסטרומים( בין יון אחדים מצבעים על התפלגות מולקולות המים באתר הפעיל‬
‫הכלור לבין האטומים השכנים‪ ,‬הכחולים ממספרים של רודופסינים כגורם הכרחי לצורך אכסון יעיל של אנרגיה‬
‫את מולקולות המים‪ .‬הצד הציטופלזמי נמצא‬
‫מלמעלה באיור זה‪.‬‬
‫באופסין לאחר בליעת הפוטון‪.31‬‬
‫מולקולת מים ‪ Wat503‬מתחילה שרשרת ארוכה של קשרי מימן הנמשכת הלאה מ – ‪ Arg123‬ומגיעה‬
‫עד הצד החוץ תאי ש ל האופסין‪ .‬רשת זו של קשרי מימן מוצגת באיור ‪ .9‬מהצד החוץ תאי של השייר של‬
‫‪ Arg123‬ישנו חלל גדול המכיל צביר של שש מולקולות מים )‪ Wat505‬עד ‪ .(Wat510‬החלל הזה נסגר על ידי‬
‫השייר של ‪ Glu234‬אשר בתורו מתקשר לרשת ארוכה נוספת של קשרי מימן הנמשכת עד ‪ His173‬הנמצא בצד‬
‫החוץ תאי של החלבון‪ .‬רשת זו בנויה על ידי ‪ Arg176‬בסליל ‪ ,F‬השייר של ‪ His100‬היושבת על לולאה בין‬
‫הסלילים ‪ B‬ו – ‪) C‬לולאת ‪ (BC‬ושתי מולקולות מים )‪ Wat511‬ו – ‪.(Wat512‬‬
‫ארבעת השיירים הקוטביים הנראים באיור ‪ (Arg123, Arg176, Glu234, His100) 9‬אשר ממוקמים‬
‫בין אתר הקישור של הכלוריד לבין הצד של החלבון הפונה אל מחוץ לתא נשמרים לחלוטין בין כל ההומולוגים‬
‫של הלורודופסין הידועים עד כה‪ . 27‬קרוב לוודאי כי רשת קשרי המימן הנפרשת על ידי השיירים הללו ועל ידי‬
‫מולקולות המים הנראות באיורים ‪ 8‬ו – ‪ 9‬מתפקדת כמסלול ראשי לכניסת האניונים אל החלבון מהתווך החוץ –‬
‫תאי‪ .‬השערה זו מחוזקת על ידי התוצאות של ניסוי בו‬
‫הוחלפה החומצה האמינית ‪ His95‬של ‪ sHR‬באלאנין‬
‫)חומצה זו אנלוגית ל – ‪ His100‬של ‪ .(pHR‬יכולת השאיבה‬
‫של כלורידים של חלבונים ששונו באופן זה נפגעה מאוד‪.32‬‬
‫החצי הציטופלזמי של התעלה הפנימית של ‪pHR‬‬
‫מכיל מעט חומצות אמיניות הידרופיליות‪ .‬בצד זה של תעלת‬
‫החלבון נמצאת מולקולת מים אחת בלבד‪ .‬זוהי המולקולה‬
‫‪ Wat501‬המקיימת אינטראקציות עם ה – ‪ NH‬האינדולי של‬
‫‪ ,Trp222‬ההידרוקסיל של ‪ Thr218‬והקרבוניל של השרשרת‬
‫הראשית השייך ל – ‪ .Ala255‬על אף שקיים מיקרו – חלל‬
‫איור ‪ :9‬רשת קשרי מימן בצד החוץ תאי של‬
‫גדול בין השיירים ההידרופיליים של ‪) Lys256‬הקושר את התעלה הפנימית של ‪.pHR‬‬
‫‪9‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :10‬הצד הציטופלזמי של התעלה הפנימית של‬
‫‪ .pHR‬רואים את מולקולת המים‪ ,Wat501 ,‬היחידה‬
‫שמאכלסת צד זה של התעלה‪.‬‬
‫הרטינל( ו – ‪ Thr71‬הוא לא מאוכלס על ידי מולקולות‬
‫מים‪ .‬חללים נוספים בחצי הציטופלזמי של התעלה של‬
‫‪ pHR‬מוקפים על ידי שיירים הידרופוביים אשר יוצרים‬
‫מחסום אנרגיה גבוה למעבר של יון הכלור הטעון שלילית‬
‫)איור ‪.(10‬‬
‫אם מסתכלים על החלבון מהצד הציטופלזמי‪,‬‬
‫מבחוץ‪ ,‬רואים כי הלולאות בין הסלילים של החלבון‬
‫מתקפלות פנימה מכסות את הסלילים הללו ויוצרות מאין‬
‫פקק‪ .‬כך הפוליפפטיד ה – ‪ C‬טרמינלי אשר מקופל לסליל‬
‫קצר והלולאה בין הסלילים ‪ A‬ו – ‪ B‬מחפים על הסלילים‬
‫‪ A, B, C‬ו – ‪ .G‬הלולאה בין הסלילים ‪ C‬ו – ‪ D‬וחלק‬
‫מסליל ‪ E‬אשר מכופף פנימה‪ ,‬מכסים את השטח מעל‬
‫לסלילים ‪ D, E‬ו – ‪.F‬‬
‫מבנה זה של מכסה הנוצר על ידי לולאות בין הסלילים קיים גם בצד החוץ תאי של החלבון‪ ,‬רק ששם‬
‫הוא מורכב יותר וכולל את הלולאה הארוכה בין הסלילים ‪ B‬ו – ‪ C‬ואת הסליל '‪) A‬איור ‪ .(11‬סליל קצר זה הוא‬
‫מאין תוספת לסליל ‪ A‬של ‪ pHR‬ומהווה אלמנט מבנה ייחודי להלורודופסין זה‪ .‬השיירים ההידרופוביים של‬
‫הסלילים ‪ A, B, D, F‬ו – ‪ G‬יוצרים אינטראקציות עם שיירים הידרופוביים של לולאת ‪ BC‬ושל סליל ה – '‪.A‬‬
‫לעומת זה‪ ,‬השיירים הקוטביים של המבנים הללו מכוונים החוצה וחשופים לתווך החוץ – תאי‪ .‬הרשת הזאת של‬
‫אינטראקציות הידרופוביות תוך – מולקולריות יוצרת מאין מכסה הידרופובי בצד החוץ – תאי של החלבון‪.‬‬
‫ייתכן כי מטרת הכיסוי ההידרופובי היא למנוע חילוף מהיר של אניונים בין התווך החוץ – תאי לבין האתר‬
‫הפעיל של ‪ .pHR‬משמעות העדר סליל '‪ A‬ב – ‪ ,sHR‬והעובדה כי הלולאה בין הסלילים ‪ B‬ו – ‪ C‬של חלבון זה‬
‫קצרה ב – ‪ 10‬חומצות אמיניות מזו של ‪ pHR‬היא של – ‪ sHR‬אין מבנה המזכיר את המכסה ההידרופובי בצד‬
‫החוץ – תאי של ‪ . pHR‬קיים כנראה שוני מהותי בין שתי המשאבות במנגנוני הבאת כלורידים מהתווך החוץ –‬
‫תאי אל התעלה הפנימית של האופסין‪ .‬כפי‬
‫שנראה בהמשך‪ ,‬שוני זה משתקף במעגלי האור‬
‫של הפיגמנטים הללו‪.‬‬
‫מבנה של כיס החלבון ליד אתר‬
‫הקישור של הרטינל נשמר בין ‪ pHR‬ל –‬
‫‪ ,sHR‬רואים זאת היטב באיור ‪ .5‬כל השיירים‬
‫הבאים במגע עם השרשרת הפוליאנית של‬
‫הרטינל נמצאים באותם המקומות בדיוק‬
‫במודלים המבניים שלהם‪ .‬המרחק בין הכלוריד‬
‫באתר הקישור הראשי שלו לבין בסיס שיף‬
‫איור ‪ :11‬המכסה ההידרופובי של ‪ pHR‬בצד החוץ – תאי‪ .‬המורכב‬
‫נשמר גם הוא‪ .‬קיים שוני במיקומן של שלושת מהסליל הקצר '‪ A‬והלולאה הארוכה בין הסלילים ‪ B‬ו – ‪.C‬‬
‫‪10‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫מולקולות המים באתר הפעיל וישנה קורלציה בין הקונפורמציה‬
‫של תריאונין )‪ Thr126‬ב – ‪ pHR‬ו – ‪ Thr111‬ב – ‪(sHR‬‬
‫היושב באמצע סליל ‪ C‬לסידור הזה של מולקולות המים‪ .‬בעוד‬
‫שההידרוקסיל של ‪ Thr126‬של ‪ pHR‬מכוון אל עבר יון הכלור‪ ,‬ה‬
‫– ‪ OH‬של ‪ Thr111‬ב – ‪ sHR‬פונה החוצה ובונה קשר מימן עם‬
‫הקרבוקסיל של חומצת שומן ‪ ,palmitate‬אשר קשורה לצד‬
‫החיצוני של אחד הסלילים של ‪ .sHR‬בכוחו של השוני העדין‬
‫הזה בין כיסי החלבון של שני ההלורודופסינים‪ ,‬להסביר מדוע‬
‫האפיניות של הכלוריד לאתר הקישור הראשי של ‪ pHR‬גבוהה‬
‫יותר מאשר לאתר הקישור הראשי שלו ב – ‪ .sHR‬קבועי‬
‫הדיסוציאציה של כלוריד שדווחו עבור ‪ pHR‬ו – ‪ sHR‬הם ‪ ~1‬ו‬
‫– ‪ ~10mM‬בהתאמה‪.35,34,33‬‬
‫איור ‪ :12‬למעלה רואים את הקרוטנואיד‬
‫ממצא מפתיע אודות ‪ pHR‬הוא שחלבון זה קושר אליו‬
‫בקטריורוברין‪ ,‬הכרומופור הנוסף של ‪.pHR‬‬
‫למתה מוצג ספקטרום הבליעה של ‪ pHR‬מצדו החיצוני כרומופור נוסף‪ ,‬הבולע בנראה ומקנה צבע אדום‬
‫כשהחלבון במצבו הטבעי‪ ,‬ז"א קשור‬
‫לממברנה )‪ (membrane bound form‬של של יין לממברנות המכילות את האופסין הנ"ל )איור ‪ .(12‬מדובר‬
‫‪.N. pharaonis‬‬
‫בקרוטנואיד בקטריורוברין )‪ ,(bacterioruberin‬על אף‬
‫הימצאות קרוטנואיד זה בממברנות של ‪ Halobacterium salinarum‬לא דווח על היקשרותו לרודופסינים‬
‫של הארכיאון הנ"ל‪.‬‬
‫הבליעה של הכרומופור הנוסף מושפעת מצפיפות האכלוס של אתר הקישור הראשי של ‪ pHR‬על ידי‬
‫כלוריד ולכן הוצע כי קיימות אינטראקציות חזקות בין החלבון לבין בקטריורוברין‪ .36‬הקישור בין החלבון לבין‬
‫בקטריורוברין לא קוולנטי כמו במקרה של הרטינל‪ .‬ניתן להפריד ביניהם באמצעות שטיפה של ‪pHR‬‬
‫בדטרגנטים שונים‪ .‬קשרי מימן בין ההידרוקסילים של הקרוטנואיד לבין קבוצות קוטביות של שני חלבונים‬
‫סמוכים מעגנים אותו לשני החלבונים בו זמנית ובכך הקרוטנואיד מסייע ביצירת המבנה הרבעוני של החלבון‬
‫שהוא יחידה טרימרית המורכבת משלושה הלורודופסינים )איור ‪ .(13‬הטרימרים האלה מוחזקים יחד על ידי‬
‫אינטראקציות נוספות בין המונומרים‪ ,‬בנוסף לאלה הנתרמים על ידי בקטריורוברין כך שהמבנה הרבעוני הזה‪,‬‬
‫אשר נצפה בחקר גבישים מלאכותיים של ‪ pHR‬באמצעות דיפרקציית קרני ‪ ,X‬כנראה דומה מאוד למבנה‬
‫הטבעי של חלבון זה בתנאים פיזיולוגיים‪.30,37‬‬
‫טרימרים דומים של ‪ BR‬בונים גבישים הקסגונליים‪ ,‬דו ממדיים על פני הממברנות של‬
‫‪ Halobacterium salinarum‬גבישים אלה ידועים בתור הממברנה הסגולה )‪ (purple membrane‬של‬
‫ארכיאון זה‪ . 19,38,6‬במקרה של בקטריורודופסין פוספוליפיד מסוים ממלא את התפקיד של בקטריורוברין‪ ,‬כנראה‬
‫שמדובר ב – ‪ diphytanylglycerol‬אבל יש גם מועמדים אפשריים אחרים לתפקיד זה‪ .39‬מכאן שקשירה של‬
‫כרומופור נוסף לא הכרחית לייצוב של מבנים רבעוניים של רודופסינים ארכיאליים‪.‬‬
‫נשאלת השאלה מדוע הלורודופסין של ‪ N. pharaonis‬ורודופסינים ארכיאליים אחרים קושרים‬
‫כרומופורים שונים בנוסף לרטינל? במחקר אשר התבצע לא מזמן במעבדתנו על משאבת פרוטונים ממונעת אור‬
‫‪11‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫קסנטורודופסין )‪ (Xanthorhodopsin‬המיוצרת על ידי‬
‫בקטריה הלופילית ‪ Salinibacter ruber‬עקבו ‪ I. Gdor‬ו –‬
‫‪ J. Zhu‬בזמן אמת אחר מעבר אנרגיה בין אנטנת הקרוטנואיד‬
‫שלה‪ ,‬סליניקסנטין )‪ ,(salinixanthin‬לרטינל‪ .‬מחקר זה היה‬
‫בין הראשונים מסוגו לעקוב אחר מעבר אנרגיה בין שני‬
‫כרומופורים בחלבון‪ ,‬המתרחש בסקלה של עשרות‬
‫פמטושניות‪ . 40‬האם קיים מעבר אנרגיה דומה בין בקטריורוברין‬
‫של ‪ pHR‬לבין הרטינל של חלבון זה? מחקר שיאפשר לענות‬
‫על שאלה זו תרם נעשה ובינתיים אין הוכחות לכך ש – ‪pHR‬‬
‫משתמש בקרוטנואיד שלו בתור אנטנה לצורך איסוף אור יעיל‬
‫ותיעול הבא בעקבות כך של האנרגיה הנקצרת לרטינל‪ .‬ייתכן‬
‫והתפקידים של בקטריורוברין הם להגן על החלבונים מפני‬
‫נזקים של קרינה אולטרה – סגולה ו‪/‬או וויסות של קצב שאיבת‬
‫יונים‪ .‬האפשרות השנייה מוצעת בעקבות גילוי ההשפעה של‬
‫פוטנציאל הממברנה של ‪ H. salinarum‬על ספקטרום הבליעה‬
‫איור ‪ :13‬טרימר של ‪ .pHR‬מבט מהצד‬
‫של בקטריורוברין כשהוא קשור לחלבון‪.41‬‬
‫הציטופלזמי של הממברנה‪ .‬קצה של מולקולת‬
‫בקטריורוברין נראה בצהוב‪ ,‬קרוב ליון הכלור‪.‬‬
‫בקטריורודופסין ו – ‪ pHR‬דומים לא רק בזה שהם הקרבה בין השניים מרמזת על מידה לא‬
‫מתפקדים בתור מחוללי אנרגיה בתנאים היפוקסיים עבור מבוטלת של אינטראקציה ביניהם‪.‬‬
‫האורגניזמים המייצרים אותם‪ .‬המבנה של האתר הפעיל נשמר ברובו בין שתי המשאבות הנ"ל ) איור ‪ .(5‬יון‬
‫הכלור ב – ‪ pHR‬תופס את המקום של הקרבוקסיל של ‪ Asp85‬בבקטריורודופסין‪ .‬מכאן שהתפלגות המטענים‬
‫סביב הרטינל בשני חלבונים אלה היינה זהה למעשה‪ .‬מיקום של שלושת מולקולות המים באתר הפעיל נשמר גם‬
‫הוא‪ .‬הצד הציטופלזמי של התעלה הפנימית של שני החלבונים הללו נשמר זהה למעט החומצה ‪ Asp96‬אשר‬
‫מתפקדת כ – ‪ donor‬של פרוטונים לבסיס שיף שעבר דה – פרוטונציה בשלב המעבר ‪ M→N‬במעגל האור של‬
‫‪ .BR‬חומצה זו מוחלפת ב – ‪ Ala137‬ב – ‪ .pHR‬מיקרו חלל בין הקרבוניל של השרשרת הראשית של ‪Lys256‬‬
‫של ‪ pHR‬לבין השייר של ‪ Thr71‬של חלבון זה )זהו ‪ Thr46‬בבקטריורודופסין( קיים גם ב – ‪.BR‬‬
‫דמיון זה בין האתרים הפעילים והחצי הציטופלזמי של התעלות הפנימיות של ‪ BR‬ו – ‪ pHR‬והעובדה‬
‫כי ניתן להפוך הלורודופסין למשאבת פרוטונים מוכוונת פנימה בנוכחות ‪) N3-‬כאשר ההנחה היא כי יון האזיד‬
‫מתפקד כ – ‪ acceptor‬של פרוטונים וגורם לדה – פרוטונציה של בסיס שיף בהלורודופסינים‪ (42‬מאפשרים‬
‫להניח את הדבר הבא לגבי המנגנון של ‪ :pHR‬במהלך שאיבה של כלוריד על ידי ‪ pHR‬מתרחשת כניסה ויציאה‬
‫של פרוטונים מהצד הציטופלזמי של חלבון זה‪ .‬בניגוד למה שקורה ב – ‪ BR‬הפרוטונים לא עוברים את‬
‫הממברנה דרך ההלורודופסין‪ ,‬אלא נעצרים בחצי הציטופלזמי של התעלה ופוגשים שם את יון הכלור לאחר‬
‫שהוא עוזב את אתר הקישור הראשי שלו ועובר לחצי הציטופלזמי של התעלה הפנימית‪ ,‬בעקבות‬
‫הפוטואיזומריזציה של הרטינל‪ .‬כך נוצרת מולקולה של חומצה הידרוכלורית ניטרלית‪ ,‬בעלת מסיסות גבוהה‬
‫יותר בסביבה ההידרופובית של חצי התעלה הציטופלזמי של ‪ .pHR‬מנגנון זה מסוכם באיור ‪ .3014‬נציין כי יש‬
‫‪12‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :14‬צד שמאל )‪ (a‬מציג חתך אורכי של ‪ pHR‬כאשר החלק העליון בתמונה מציג את‬
‫חצי התעלה הציטופלזמי‪ .‬צד ימין )‪ (b‬מסכם את מנגנון שאיבת כלוריד של ‪.pHR‬‬
‫צורך ליישב מודל זה עם העדר ביטוי לאפקט איזוטופי בקינטיקת הפוטוכימיה של ‪ pHR‬בהחלפת תמיסה‬
‫מימית רגילה במים כבדים‪ .‬אפקט זה מובהק במקרה של ‪.43BR‬‬
‫חקר נרחב של מעגל האור של ‪ pHR‬נעשה בעבודותיהם של ‪ G. Váró‬ו – ‪ J. K. Lanyi‬מ –‬
‫‪ . 44,231995‬החוקרים העלו השערה כי מעגל האור של חלבון זה מורכב משישה צורוני ביניים‪:‬‬
‫‪K ⇔ L ⇔ N ⇔O ⇔ HR '  HR‬‬
‫לא ניתן להבדיל באמצעים ספקטרוסקופיים בנראה בין התוצרים המאוחרים ‪ HR‬ו – '‪ ,HR‬הוספתו של‬
‫הצורון '‪ HR‬נדרשת על מנת לקבל התאמה טובה של דעיכת הספקטרה המזוהים עם התוצרים המאוחרים של‬
‫הפוטוכימיה של ‪ .pHR‬בסכמות מאוחרות יותר מחלקים את שלב ‪ L‬לשני שלבים‪ L1 ,‬ו – ‪ .L2‬גם במקרה זה‪,‬‬
‫הוספה של עוד צורון משפרת במעט את ההתאמה‪ . 46,45‬החוקרים הראו כי זמן ההופעה וריכוז מרבי של תוצרים‬
‫מאוחרים של מעגל האור )החל מ – ‪ (N‬מושפע מריכוז יוני כלור‪ .‬ממצאי ניסויים של ‪ Váró‬ו – ‪ Lanyi‬מוצגים‬
‫באיור ‪.15‬‬
‫בניסויים מאוחרים יותר נעשה ניסיון לעקוב אחר תנועת מטענים בתוך החלבונים במהלך מעגל האור‬
‫על ידי מדידת התגובה הפוטואלקטרית שלהם‪ .‬ניסויים אלה עזרו לזהות את השלבים של שחרור הכלוריד‬
‫לציטופלזמה )שלב המעבר ‪ (N → O‬וכניסה של כלוריד מהצד החוץ תאי )'‪ .47(O → HR‬כמה עבודות הוקדשו‬
‫למדידת תדרי וויברציה של קבוצות פונקציונליות שונות במהלך שלבים מוקדמים של מעגל האור של הפיגמנט‪.‬‬
‫כך מדדו החוקרים ‪ M. Shibata‬ו – ‪ H. Kandori‬את תדר ‪ N – H‬של בסיס שיף והסיקו כי בשלב ‪ K‬קיים‬
‫קשר מימן בין הפרוטון של בסיס שיף לבין הכלוריד‪ ,‬בעוד שבמצב יסוד התחלתי מולקולת מים מהווה‬
‫‪ acceptor‬של קשר זה‪ .‬במצב ‪ L1‬משתחזר קשר המימן בין מולקולת המים לבין הפרוטון של בסיס שיף‪ ,‬מה‬
‫שמשאיר בתורו את יון הכלור ללא קשרי מימן ‪ ,‬המשמעות היא שסביבת הכלוריד הופכת להיות פחות קוטבית ב‬
‫– ‪ L1‬וזה לטענת החוקרים מהווה את אחד הגורמים לניתוקו מאתר הקישור הראשי שלו‪ .‬חוקרים מקבוצה זו‬
‫הראו גם כי בשלב ‪ L2‬מתרחשת דה – פרוטונציה של ‪) Glu234‬איור ‪ (9‬והם העלו השערה כי הופעה של מטען‬
‫שלילי בחצי החוץ – תאי של התעלה הפנימית של החלבון מונעת מהכלוריד להיפלט בחזרה אל מחוץ לתא‪.48,31‬‬
‫‪13‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :15‬מעגל האור של ‪ . pHR‬תוצרי הביניים של הפוטוכימיה של הפיגמנט מוצגים בשורה התחתונה‪ .‬צד ימני‬
‫עליון מציג את הספקטרה האבסולוטיים שלהם‪ .‬הפנל התחתון מימין מציג את הריכוזים של תוצרי הביניים בסקלת‬
‫זמנים לוגריתמית‪ .‬משמאל מוצגים ספקטרה הפרש בליעה בנראה החל מזמן של ‪ 100ns‬עד עשירית השניה‪.‬‬
‫הבדל עיקרי בין מעגלי האור של ‪ pHR‬ו – ‪ sHR‬הוא בשלבים המאוחרים שלהם‪ ,‬בעצמת המאפיינים‬
‫הספקטרליים של צורון ‪ O‬המופיע בשני המעגלים‪ .‬תוצר מאוחר בעל מרכז ספקטרום בליעה מוסט ל – ‪640nm‬‬
‫במעגל האור של ‪ sHR‬נתרם כנראה על ידי פוטוכימיה של פיגמנטים בעלי קונפיגורציה ‪ 13−cis‬של‬
‫הרטינל‪ .49,23‬לעומת זה‪ ,‬צורון ‪ O‬הוא במידה רבה של וודאות חלק מפוטוכימיה של ‪ pHR‬בעל כרומופור‬
‫בקונפיגורציה התחלתית ‪ , all – trans‬אחרי הכל‪ ,‬לא דווח על מדידה של מעגל אור של פיגמנטים עם הרטינל‬
‫במצב ‪ 13−cis‬של ‪ .29pHR‬נציין כי הצורון ‪ O‬מצטבר במעגל אור של פיגמנט זה בריכוז נמוך יחסית של יוני‬
‫כלור‪ .‬כמעט ולא רואים אותו כאשר ריכוז ‪ NaCl‬בתמיסה המכילה את החלבונים קרוב לריכוז המאפיין תנאי‬
‫מחייה טבעיים של ‪) N. pharaonis‬בערך ‪ .23(4M‬הסיבה לכך היא ככל הנראה קינטית‪ .‬דעיכת המאפיינים‬
‫הספקטרליים של תוצר ‪ O‬של מעגל האור של ‪ pHR‬משקפת תהליך של כניסת כלוריד מהתווך החוץ תאי אל‬
‫התעלה הפנימית של האופסין‪ .47‬כניסה זו צפויה להיות אטית ב – ‪ ,pHR‬במיוחד בריכוזים נמוכים של כלוריד‪,‬‬
‫בגלל אותו מחסום אנרגיה הנובע מנוכחות הכיסוי ההידרופובי הבנוי על ידי לולאת ‪ BC‬ארוכה והסליל '‪ .A‬ב –‬
‫‪ sHR‬אין "מכסה הידרופובי" בצד החוץ תאי של החלבון‪ ,‬כניסת יון כלור לתעלה פנימית של חלבון זה מהירה‪,‬‬
‫ככל הנראה‪ ,‬גם בריכוזים נמוכים של כלוריד ולכן תוצר דמוי ‪ O‬של ‪ pHR‬לא מצטבר במעגל אור של חלבון זה‬
‫)הכוונה למעגל אור שתחילתו באיזומר מרחבי ‪ all – trans‬של הכרומופור‪.(30‬‬
‫נתמקד כעת בשלב המעניין אותנו של מעגל האור של ‪ ,pHR‬שלב יצירת ‪ .K‬אולם‪ ,‬לפני שנסקור‬
‫עבודות העוסקות בתהליכים ראשוניים בהלורודופסינים‪ ,‬ברצוננו להציג מאפיינים משותפים מעניינים של‬
‫‪14‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫תהליכים מושרי אור ראשוניים בחלבונים רטינליים ארכיאליים‪ ,‬כפי שהם משתקפים בספקטרוסקופיה מופרדת‬
‫זמן אולטרה – מהירה שלהם‪ .‬עיקר הדוגמאות יילקחו משפע המחקרים אשר נעשו על ‪ .BR‬מאפיינים רבים של‬
‫פוטוכימיה אולטרה מהירה של ‪ BR‬מופיעים גם ברודופסינים ארכיאליים אחרים‪ .‬עובדה זו לא צריכה להפתיע‬
‫נוכח כל מה שנאמר עד כה‪.‬‬
‫תהליכים ראשוניים בחלבונים רטינליים ארכיאליים וב – ‪.RPSB‬‬
‫מהי המוטיבציה שלנו לחקור תהליכים מושרי אור ראשוניים ב – ‪ ?pHR‬נתחיל מציון עובדה חשובה‬
‫בנוגע לפוטוכימיה של הלורודופסינים וחלבונים רטינליים בכלל‪ .‬לא כל אירוע של בליעת פוטון על ידי האופסין‬
‫מביא לאיזומריזציה של הרטינל‪ .‬היעילות הקוונטית לאיזומריזציה של הכרומופור של ‪ sHR‬היא ‪ 0.3‬וזו של‬
‫‪ pHR‬עומדת על – ‪ . 0.5‬היעילות הקוונטית הגבוהה ביותר אשר דווחה עד כה עבור חלבון רטינלי ארכיאלי‬
‫מתקרבת ל – ‪ 0.65‬והיא של ‪ . 52,51,50BR‬סך היעילות הקוונטית לאיזומריזציה סביב קשר כפול כלשהו של‬
‫‪ RPSB all – trans‬בתמיסה היא ‪ ~ 0.2‬ומתוך אותן המולקולות העוברות איזומריזציה רק כ – ‪ 8%‬עוברות‬
‫אותה סביב הקשר ‪ . 54,53 C13=C14‬החלבון מייעל משמעותית את תהליך האיזומריזציה סביב קשר זה וחוסם‬
‫אותו לחלוטין סביב הקשרים הכפולים האחרים של הרטינל‪.‬‬
‫משמעות של יעילות קוונטית קטנה מ – ‪ 1‬לאיזומריזציה היא שרק חלק מאוכלוסיה מעוררת של‬
‫רודופסין ארכיאלי מגיע בסופו של דבר לאזור קואורדינטות מולקולריות המגדיר את מצב היסוד של האיזומר‬
‫‪ . 13−cis‬החלק הנותר לעולם יחזור למצב היסוד בקונפיגורציה המקורית‪ .‬ממוצע של מספר יונים העוברים את‬
‫הממברנה התאית חלקי מספר פוטונים הנבלעים על ידי הפיגמנט‪ ,‬כלומר היעילות הסופית של כל התהליך‪,‬‬
‫קרובה ליעילות קוונטית לאיזומריזציה של הכרומופור‪ .‬אי לכך‪ ,‬השלב הראשון של מעגל האור של‬
‫הלורודופסינים ואופסינים ארכיאליים אחרים הוא שלב ייחודי אשר קובע את היעילות של החלבונים הללו‬
‫בביצוע עבודתם‪ .‬ניתן אפילו לומר כי בשלב זה הפוטוכימיה של הפיגמנטים האלה מתחילה ונגמרת כי המרת‬
‫אנרגיית פוטון לאנרגיה כימית ואגירתה מתרחשות אך ורק בשלב יצירת התוצר ‪ K‬של מעגל האור‪.‬‬
‫אין אנו מנסים לרמוז כי השלבים המאוחרים יותר של מעגל האור של הלורודופסין פחות מעניינים‬
‫ופחות ראויים למחקר‪ .‬מלהיב יהיה לגלות כיצד הכלוריד "מדלג " מעל הרטינל שעבר איזומריזציה ומה המהלך‬
‫שלו בתעלה הפנימית של החלבון ‪ .‬אנחנו יודעים כי שלב הבא אחרי יצירת התוצר ‪ K‬במעגל האור של ‪sHR‬‬
‫מלווה בבניית בליעה בירוק )‪ λmax = 520nm‬היא הבליעה המקסימלית של התוצר "‪ "L‬של מעגל האור של‬
‫חלבון זה(‪ .‬אולם‪ ,‬המסלול המדויק של הכלוריד בתעלה הפנימית של ‪ sHR‬ידוע בינתיים רק מחישובים‬
‫תאורטיים וניתן רק לשער כי בשלב זה חלה התחדשות של אינטראקציות בין הכלוריד לבין הפרוטון של בסיס‬
‫שיף אשר תוצאתה היא הסחת בליעת התוצר ‪ L‬לכחול‪ .25‬יחד עם זאת‪ ,‬השלבים המאוחרים במעגלי האור של‬
‫חלבונים אלה נחקרו יותר כי הם אטיים יותר‪ .‬אם ב כל הרודופסינים הארכיאליים תהליך החזרה של האוכלוסיה‬
‫המעוררת למצב יסוד בקונפיגורציה זו או אחרת של הרטינל הוא אולטרה מהיר ולוקח פיקושניות בודדות‪ ,‬אז‬
‫בשלב ‪ K‬הפיגמנטים נשארים סטטיים ננושניות רבות‪ .‬השלבים הבאים אטיים אף יותר‪ ,‬לשרשרת התגובות‬
‫הפוטוכימית של הלורודופסין לוקח כ – ‪ 15‬מילישניות להסתיים‪ .‬למעשה‪ ,‬החל משלב ‪ K‬והלאה ניתן לחקור את‬
‫מעגל האור של האופסינים הארכיאליים בתנאים קריאוגניים בשיטות של פיזור קרני ‪ X‬או אלקטרונים‪.55‬‬
‫‪15‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :16‬רצף מושרה אור של תגובות אולטרה מהירות של בקטריורודופסין‪.‬‬
‫מחקרנו הנוכחי מתמקד בשלב הראשון של מעגל האור של ‪ .pHR‬פיגמנט זה אינו שונה מרודופסינים‬
‫ארכיאליים אחרים בכך שדה – אקסיטציה של האוכלוסיה המעוררת והאיזומריזציה סביב הקשר ‪C13=C14‬‬
‫של הכרומופור שלו מתרחשים תוך פיקושניות בודדות‪ . 56‬סקלת זמנים זו נגישה למעבדות קרני רנטגן בודדות‬
‫בעולם‪ ,‬לרוב מדובר במתקני מחקר לאומיים‪ . 57‬לעומת זה‪ ,‬כמו במעבדתנו כך גם במעבדות רבות אחרות‪ ,‬מידע‬
‫לגבי התנהגות של מאפיינים ספקטרליים טרנזיינטיים של מצב אלקטרוני מעורר של מולקולות מושג באופן‬
‫שגרתי על ידי הפעלת טכניקות שונות של ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה‪ .‬תנאי הכרחי להבנה של פרטי מנגנון‬
‫ההמרה של אנרגיית אור לאנרגיה כימית ועל הדרך שבה החלבון אוגר אותה ומונע את בריחתה לסביבה הוא‬
‫מעקב בזמן אמת אחר התהליכים הללו‪ .‬תנאי זה מתקיים בהפעלת שיטות ניסיוניות שלנו‪.58‬‬
‫במשך שלושים שנות מחקר של בקטריורודופסין באמצעות לייזרים אולטרה מהירים התגבשה סכמה‬
‫המוצגת באיור ‪ 16‬אשר מסכמת את המתרחש בחלבון זה במהלך הפיקושניות הראשונות מרגע העירור‪.‬‬
‫מאפיינים רבים שלה רלוונטיים לצורך מתן תיאור של אירועים ראשוניים בחלבונים רטינליים אחרים כמו‬
‫הלורודופסין או סנסורי רודופסינים‪ .85,99,59‬נסביר את הנראה בה‪ .‬לאחר עירור הכרומופור של ‪ BR‬מתרחשת‬
‫רלקסציה אולטרה מהירה של המצב המעורר הראשוני שלו )זהו מצב ‪ .Franck – Condon‬בסכמה הנדונה הוא‬
‫מסומן על ידי *‪ .(BR‬רלקסציה זו מובילה למצב המעורר ‪ ,I‬או בשמו האחר "מצב פלואורסצנטי" של‬
‫בקטריורודופסין‪ .‬מאפיינים ספקטרליים של ‪ I‬מופעים בסקלה של עשרות פמטושניות לאחר שלב ספקטרלי‬
‫דינמי בו מאפיינים ספקטרליים התחלתיים של *‪ BR‬מוסטים‪ ,‬הבליעה לכחול והפליטה המאולצת לאדום‪ .‬שלב‬
‫דינמי זה בספקטרום מופרד זמן של‬
‫בקטריורודופסין נמשך מספר עשרות‬
‫פמטושניות‪ .‬ספקטרום ההפרש )נעמוד‬
‫על משמעות מדויקת של מונח זה‬
‫בחלק המוקדש לשיטות הניסיוניות‬
‫שלנו( של מצב ‪ I‬של ‪ BR‬מאופיין על‬
‫ידי סיגנל שלילי הנובע מפליטה‬
‫מאולצת בעלת שיא באינפרה אדום‬
‫קרוב‪ ,‬ב – ‪ .900nm‬כמו כן‪ ,‬בצד‬
‫הכחול של הספקטרום הנראה מופיע‬
‫סיגנל חיובי הנובע מבליעת המצב‬
‫איור ‪ :17‬ספק טרום הפרש בליעה מופרד זמן של בקטריורודופסין‪.‬‬
‫ציר האלקטרוני המעורר בעל שיא סביב‬
‫הצבעים )לפי הסרגל המצורף( הוא ציר של בליעה דיפרנציאלית‪ ,‬שני‬
‫הצירים הרגילים הם ציר אורכי הגל וציר הזמן‪ ,‬לפי הסימון‪.‬‬
‫‪) 460nm‬איור ‪ .(17‬מאפייני ‪ I‬דועכים‬
‫‪16‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫באופן מוסכם בכל אורכי הגל תוך פיקושניה אחת וספקטרום התוצר ‪ ,J‬שבו הכרומופור נמצא במצב יסוד‬
‫אלקטרוני בקונפיגורציה ‪ 13−cis‬עולה סביב ‪ .625nm‬רלקסציה ויברציונית של הכרומופור ושל סביבת‬
‫החלבון מובילה בסופו של דבר למצב קוואזי – סטציונרי ‪) K‬מרכז בליעתו של צורון זה ב – ‪.60,123(610nm‬‬
‫שאלה אשר מעסיקה רבים מקהילת חוקרי הרודופסינים הארכיאליים עוסקת בדינמיקה מולקולרית של‬
‫הכרומופור המעורר במהלך האיזומריזציה‪ .‬מבין כל דרגות החופש הויברציוניות שלו‪ ,‬אשר מעורבות בתהליך‬
‫זה‪ ,‬מהן החשובות יותר? תוצאות של ניסויים אשר נעשו על ‪ BR‬באמצע שנות ה – ‪ 80‬הוסברו במונחים של‬
‫פרופיל אנרגיה פוטנציאלית כפונקציה של קואורדינטת הראקציה‪ ,‬היא קואורדינטת פיתול )ליתר דיוק זווית דה‬
‫– הידרלית( סביב הקשר העובר איזומריזציה‪ ,‬קרי ‪ . 61 C13=C14‬עם שיפור הפרדת זמנים של הניסויים בתחום‬
‫הנראה של הספקטרום ופיתוח שיטות ניסיוניות חדשות כגון ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה באינפרה אדום‬
‫)ספקטרוסקופיה ויברציונית אולטרה מהירה( וספקטרוסקופיית ראמן מהירה ואולטרה מהירה‪ ,‬התקבלו תוצאות‬
‫אשר מעידות כי העירור האלקטרוני גורם לאקטיבציה של אופני תנודה נוספים של הכרומופור‪ ,‬אלה הן ויברציות‬
‫גבוהות תדר כגון מתיחת ‪ C=C‬ו – ‪ , C−C‬ניעור )‪ (rocking‬של מתיל ואופן תנודה הנתרם על ידי יציאת‬
‫מימן ממישור מולקולרי ) ‪ .(Hydrogen out of Plain, HOOP, vibration‬מעורבות תדר מתיחת קשר‬
‫‪ C=C‬כפול מצומד בתהליך האיזומריזציה מעידה על התארכות השלד הפחמני של הכרומופור במצבו המעורר‬
‫וקונסיסטנטית עם העובדה שהמצב האלקטרוני בפוליאן מצומד העובר איזומריזציה סביב אחד מהקשרים‬
‫הכפולים שלו חייב לקבל אופי של אורביטל אנטי קושר )המעבר האלקטרוני המוליד את הדינמיקה הגרעינית‬
‫המדוברת הוא *‪.66,65,64,63,62(π → π‬‬
‫תיאור פשוט של תהליך האיזומריזציה של הכרומופור ברודופסינים ארכיאליים בעקבות גילויים אלה‬
‫הוא מודל שתי רמות שני אופנים‪ .‬העירור ממקם חלק מאוכלוסיית מצב היסוד )רמה אלקטרונית ראשונה( על גבי‬
‫המשטח האלקטרוני המעורר )הרמה השנייה(‪ .‬משם חבילת גלים הויברציונית מתפתחת לאורך קואורדינטת‬
‫מתיחת השלד הפחמני ולאורך קואורדינטת פיתול נמוכת תדר‪ .‬עקב הבדל גדול בתדרים עצמיים בין שני אופני‬
‫תנודה אלה‪ 170cm-1 ,‬עבור הפיתול לעומת ‪ 1550cm-1 – 1500‬עבור המתיחה‪ ,121,66‬האבולוציה של חבילת‬
‫הגלים לאורך כל אחת מהקואורדינטות מתרחשת בסקלות זמנים מופרדות‪ .‬פיתול הכרומופור המעורר‬
‫בבקטריורודופסין מוביל באופן טבעי לאיזומריזציה תוך פיקושניה אחת בערך‪ ,‬מאידך‪ ,‬התפתחות חבילת הגלים‬
‫לאורך הקואורדינטה השנייה‪ ,‬מתיחת ‪ , C=C‬מתרחשת תוך כ – ‪ 50fs‬וביטויה של התפתחות זו בספקטרום‬
‫מופרד זמן של ‪ BR‬הוא הסט רציף של פסי הבליעה והפליטה המאולצת‪ .‬בהתייחס לסכמה המוצגת באיור ‪16‬‬
‫מדובר בשלב ‪.68,67BR* → I‬‬
‫חשיבות אופני תנודה אלה לתהליך האיזומריזציה של הכרומופור ברודופסינים ארכיאליים נתמכת על‬
‫ידי תוצאות של עבודות תאורטיות לפיהן התקדמות לאורך שתי קואורדינטות מולקולריות אלה מוליכה את‬
‫חבילת הגלים הויברציונית על משטח אלקטרוני עליון אל עבר אזור שבו הוא נחתך עם המשטח התחתון‪ .67‬אזורי‬
‫חיתוך כאלה של משטחי פוטנציאל בעלי אותה סימטריה מרחבית וסימטרית ספין )רק משטחי סינגלט מעורבים‬
‫בפוטופיזיקה של רטינל ברודופסינים ארכיאליים( נקראים חתכים קוניים‪.Conical Intersections – CI's :‬‬
‫במילים אחרות‪ ,‬מדובר בסט של נקודות במרחב הגאומטריה המולקולרית בהן משטחי הפוטנציאל מנוונים‪.‬‬
‫ממדיות של מרחב החיתוך במערכת מולקולרית בעלת ‪ n‬דרגות חופש ויברציוניות היא ‪ .n – 2‬אי לכך‪ ,‬במערכת‬
‫‪17‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫דו ממדית המשטחים יחתכו בנקודה אחת‪ ,‬גאומטריה מולקולרית אחת‪.‬‬
‫משטחי הפוטנציאל של מערכת דו ממדית כזאת ייראו כמו שני חרוטים‬
‫)קונוסים( הפוכים שקדקודיהם נפגשים בנקודת החיתוך )זוהי הצורה‬
‫האופיינית של יו – יו סיני ‪ ,(diabolo‬מכאן השם חתך קוני )איור ‪.(18‬‬
‫דה – אקסיטציה )חזרה אל משטח היסוד האלקטרוני( לא‬
‫רדיאטיבית של מולקולות מעוררות דרך חתכים קוניים היא מקרה פרטי של‬
‫תופעה הנקרית היפוך פנימי )‪ .(internal conversion‬מושג זה מתייחס‬
‫למעבר לא אדיאבטי של אוכלוסיה מרמה אלקטרונית גבוהה לרמה נמוכה‬
‫איור ‪ :18‬חתך קוני פשוט בין שני יותר דרך חתך קוני בין שתי הרמות‪ .‬דיסיפציה מלאה או חלקית של אנרגיית‬
‫משטחי פוטנציאל אלקטרוניים‬
‫במערכת המתוארת על ידי שתי הפוטון לסביבה מתרחשת תוך כדי מעבר כזה‪ .‬לשני המשטחים‬
‫קואורדינטות‪.‬‬
‫האלקטרוניים אותה סימטריית ספין במקרה של היפוך פנימי‪ ,‬למעבר בין‬
‫משטח טריפלטי לסינגלטי ולהפך קוראם חציה בין מערכתית ) ‪ .(inter system crossing‬מכאן והלאה נקרא‬
‫לתהליך חזרת האוכלוסיה המעוררת אל משטח היסוד בחלבונים רטינליים בשמו‪ ,‬ההיפוך הפנימי‪.69‬‬
‫חישובים מצבעים על כך שהגאומטריה המולקולרית של ‪ RPSB‬שבה משטחי הפוטנציאל‬
‫האלקטרוניים ‪ S0‬ו – ‪ S1‬נחתכים מתאפיינת בזווית פיתול קרובה ל – ◦‪ 90‬סביב קשר הכפול המיועד‬
‫לאיזומריזציה‪ .‬לא ברור עד כמה זה נכון עבור כרומופור בתוך סביבת החלבון‪ .‬מה שבטוח הוא שבהגעת‬
‫האוכלוסיה המעוררת של בקטריורודופסין אל אזור החתך הקוני ) ‪ (CI‬ויותר מדויק בעת ההיפוך הפנימי עצמו‪,‬‬
‫התגובה הפוטוכימית מתפצלת לשני ערוצים‪ ,‬כפי שניתן לראות בסכמה המוצגת באיור ‪ .16‬כ – ‪65%‬‬
‫מהמולקולות המעוררות יוצרים את התוצר ‪ J‬ואילו ‪ 35%‬הנותרות חוזרות אל מצב היסוד המקורי‪ ,‬בו הכרומופור‬
‫נמצא בקונפיגורציה ‪.71,70,67 all – trans‬‬
‫נדגים כיצד האירועים האלה משתקפים בספקטרוסקופיה אולטרה מהירה‪ .‬איור ‪ 19‬מציג דעיכות של‬
‫פליטה מאולצת באורכי גל אופייניים של בקטריורודופסין‪,‬‬
‫‪ pHR‬ו – ‪ RPSB‬מעוררים אלקטרונית )הגרף המוצג כאן‬
‫עבור ‪ BR‬מהווה חתך אורכי‪ ,‬באורך גל קרוב ל – ‪,900nm‬‬
‫של הספקטרום באיור ‪ .(17‬הפליטה המאולצת כפונקציה של‬
‫הזמן הנראית באיור ‪ 19‬נמדדה במעבדתנו בשיטת – ‪pump‬‬
‫‪ ,probe‬עליה נפרט בחלק הניסיוני‪ .‬עוצמת הפליטה‬
‫המאולצת פרופורציונית לריכוז המולקולות המעוררות‪,‬‬
‫כלומר מהירות הדעיכה שלה משקפת במקרה זה את‬
‫קינטיקת ההיפוך הפנימי‪ .‬איזו אינפורמציה מתקבלת ישירות‬
‫משלושת העקומות הנ"ל? בתור התחלה‪ ,‬אכן רואים כי‬
‫איור ‪ :19‬פליטה מאולצת כפונקציה של הזמן‪,‬‬
‫ההיפוך הפנימי בשני החלבונים הרטינליים מהיר מאוד‪ ,‬הוא באורכי גל מייצגים‪ ,‬של בקטריורודופסין )אדום(‬
‫הלורודופסין )שחור( ו – ‪) RPSB‬כחול(‪ .‬הפליטה של‬
‫מתרחש בסקלה של פיקושניות‪ .‬שנית‪ ,‬רואים כי מהירותו‬
‫שלושת הצורונים המעוררים מנורמלת לפי‬
‫שונה עבור שני הפיגמנטים‪ .‬תהליך זה מהיר יותר המקסימום‪.‬‬
‫‪18‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫בבקטריורודופסין מאשר בהלורודופסין ומהירותו גבוהה יותר בשני החלבונים מאשר ב – ‪ RPSB‬בתמיסה )אם‬
‫כי ההבדל בין ‪ pHR‬לבין ‪ RPSB‬לא משמעותי(‪ .‬מכאן ניתן ללמוד כי לחלבון יכולת שליטה גם על מהירות‬
‫ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה של הרטינל בנוסף ליכולתו לשלוט על ספקטרום הבליעה‪.‬‬
‫בשנים האחרונות מחקר של רודופסינים ארכיאליים באמצעות שיטות ספקטרוסקופיות אולטרה מהירות‬
‫מתמקד יותר בנושא האינטראקציה של הכרומופור עם החלבון‪ .‬השאלות המרכזיות עליהן החוקרים מנסים‬
‫להשיג תשובות הן‪ :‬כיצד החלבון מבצע את התפקיד הקטליטי שלו בתגובת איזומריזציה מושרית אור של‬
‫הכרומופור? איך החלבון מתעל את האנרגיה החופשית הנותרת של הפוטון המעורר‪ ,‬מונע את בריחתה לסביבה‬
‫ובסופו של דבר אוגר אותה כאנרגיה כימית? האם ניתן לפרק את השפעת החלבון למרכיבים שלה? כלומר האם‬
‫יש קשר בין הסלקטיביות של האיזומריזציה לבין מהירות ההיפוך הפנימי ולבין היעילות הקוונטית שלה? לבסוף‬
‫באיזה שוני מבני בין האתרים הפעילים של הרודופסינים הארכיאליים ניתן לתלות את ההבדלים ביניהם ביעילות‬
‫הקוונטית לאיזומריזציה ובמהירות ההיפוך הפנימי? ברור לנו כי בשלב ראשון אולטרה מהיר של מעגל האור של‬
‫חלבונים אלה לשוני מבני בסביבה המידית של הכרומופור תהיה השפעה מכרעת בקביעת מהירות ההיפוך‬
‫הפנימי‪ .‬חלקים מרוחקים יותר של החלבון "ירגישו" את העירור בזמנים מאוחרים יותר ולכן השפעתם תתן את‬
‫אותותיה בשלבים מאוחרים יותר של מעגל האור‪ .‬אי לכך‪ ,‬לא ניתן להפריד בין בעיית המבנה של האתרים‬
‫הפעילים לבין בעיית דינמיקה מושרית אור ראשונית בחקר חלבונים אלה‪.‬‬
‫התקדמות מסוימת בהבנת המנגנון האנזימטי של סביבת החלבון בתהליך הפוטו – איזומריזציה של‬
‫הרטינל בבקטריורודופסין הושגה לא מזמן‪ .‬מחקרים רבים הראו שתנאי מקדים הכרחי לכך שתהליך ההיפוך‬
‫הפנימי בחלבון זה יהיה מהיר )עם קבוע דעיכה של ‪ (0.5ps‬הוא דה – פרוטונציה של השייר הקרבוקסילי של‬
‫‪ .Asp85‬למוטציות מסוימות יש השפעה על ערך ‪ pKa‬של חומצה זו‪ ,‬לכן מוטציות אלה ישפיעו במידה לא‬
‫מבוטלת על קצב ההיפוך הפנימי‪ .‬כך למשל החלפת ‪ Arg82‬של בקטריורודופסין בחומצה אמינית ניטרלית גורם‬
‫להאטה משמעותית בקצב ההיפוך הפנימי של הכרומופור המעורר‪ .72‬ייתכן והחלפת ‪ Asp85‬של‬
‫בקטריורודופסין ביון הכלור בהלורודופסינים הוא הגורם העיקרי לכך שקצב ההיפוך הפנימי איטי יותר‬
‫במשאבות הכלוריד‪ .‬ראויה לציון העובדה כי קצב תהליך זה בהלורודופסינים מואט עוד יותר כאשר מחליפים‬
‫את הכלוריד באניונים של הלוגנים פחות אלקטרושליליים‪ ,‬ברומיד ויודיד‪ .‬תרם נעשה ניסוי הבודק את השפעת‬
‫החלפה של כלוריד בפלואוריד על קינטיקת ההיפוך הפנימי‪.56‬‬
‫ניתן לתת הסבר לסלקטיביות של פוטו – איזומריזציה של הכרומופור סביב הקשר ‪C13=C14‬‬
‫באופסין לעומת ריבוי התוצרים של תגובה זו במקרה של ‪ RPSB‬בתמיסה במונחים של הפרעות סטריות‬
‫הנגרמות לרטינל על ידי סביבת החלבון‪ .‬ככל הנראה‪ ,‬הפרעות אלה אחראיות גם לשינוי דרסטי של תדר תנודת‬
‫הפיתול בעת הכנסת הכרומופור לחלבון‪ .‬כפי שכבר אמר נו‪ ,‬תדר תנודה זו עומד על ‪ 170cm-1‬עבור החלבון אך‬
‫ערכו יורד ל – ‪ 120cm-1‬בלבד עבור ‪ RPSB‬בתמיסה‪ . 121‬נחשוב לרגע על הטופוגרפיה של חתכים חד ממדיים‬
‫של משטח הפוטנציאל האלקטרוני המעורר לאורך קואורדינטות ראקציה עבור איזומריזציה של הכרומופור‬
‫סביב קשרים בין פחמנים אחרים בשרשרת הפוליאנית שלו‪ ,‬לא ‪ . C13=C14‬הגיוני יהיה למצוא מחסומי‬
‫פוטנציאל על גבי המשטח המעורר אשר מפרידים בין האוכלוסיה הפלואורסצנטית לבין חתכים קוניים‬
‫רלוונטיים עבור איזומריזציות סביב קשרים אלה‪ .‬הפרעות סטריות לרטינל על ידי השיירים הבונים את האתר‬
‫‪19‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :20‬שני המודלים המקובלים לתיאור השל ב הראשוני בפוטוכימיה של בקטריורודופסין‪.‬‬
‫משמאל מוצג מודל שתי רמות )‪ (A‬ומימין מודל שלוש רמות )‪.(B‬‬
‫הפעיל‪ ,‬אותן הזכרנו לעיל‪ ,‬הם הגורם למחסומים‪.‬‬
‫נוכחות מחסום על ‪ S1‬עשויה להשרות תלות של מהירות תהליך ההיפוך הפנימי של הכרומופור המעורר‬
‫בטמפרטורה אינטרה מולקולרית שלו‪ .‬אם נמתח לרגע אנלוגיה בין ההיפוך הפנימי לתהליכים משופעלים תרמית‬
‫במצב יסוד‪ ,‬אז משיקולים תאורטיים פשוטים אשר מבוססים על חילוץ קבועי קצב ממשוואת ארהניוס ניתן‬
‫להראות שעל מנת לכפות סלקטיביות על פוטו – איזומריזציה של הרטינל‪ ,‬על האופסין להנמיך את מחסום‬
‫הפוטנציאל לאורך ערוץ התגובה הרצוי בכ – ‪ 4kJ mol-1‬לעומת ערוצים אחרים )מכיוון שאין לנו אמדן‬
‫המקדמים הפרה אקספוננציאליים הנחנו שהם שווים עבור כל הערוצים(‪ .‬אמצעי שליטה פשוט זה יבטיח בסופה‬
‫של התגובה יחס של ‪ 100:1‬לטובת האיזומר הרצוי‪ .‬אי לכך‪ ,‬הסלקטיביות ומהירות ההיפוך הפנימי הן ככל‬
‫הנראה השפעות חלבון נפרדות‪ ,‬אשר תלותן מוטלת בספק‪ .‬בעוד שהסלקטיביות תלויה בהפרש גבהי המחסומים‬
‫לאורך ערוצי האיזומריזציה השונים‪ ,‬קצבה בערוץ האיזומריזציה המוביל לתוצר ‪ , 13−cis‬בטמפרטורה נתונה‬
‫של ‪ ,300K‬יהיה תלוי אך ורק בגובה אבסולוטי של מחסום זה‪.‬‬
‫נוכחות מחסום פוטנציאל בדרכה של אוכלוסיה מעוררת אל עבר החתך הקוני המתעל אותה לאזור‬
‫קואורדינטות מולקולריות המגדיר את הצורון ‪ 13−cis‬על המשטח התחתון עומד בסתירה להגיון‪ .‬מדוע‬
‫שיהיה שם מחסום כזה? משמעות הקיום שלו היא האטה בקצב התגובה המתרחשת בערוץ הרצוי! כנראה‬
‫שמדובר בתכונה אינהרנטית של הכרומופור )במצב התחלתי ‪ .( all – trans‬החלבון יכול לרכך את מחסום‬
‫הפוטנציאל )היפוך פנימי בבקטריורודופסין מהיר יותר מאשר ב – ‪ RPSB‬בתמיסה‪ ,‬איור ‪ (19‬אך אינו יכול‬
‫לבטל אותו לחלוטין‪ .‬מחסום כזה יכול לנבוע מנוכחות של חתך קוני של המשטח המעורר ‪ S1‬עם משטח‬
‫פוטנציאל מעורר גבוה יותר‪ . 86,102,60‬הצורך בהוספת רמה מעוררת נוספת למודל שתי רמות של ‪) BR‬והפיכת‬
‫מודל זה למודל שלוש רמות( נובע מכישלון מודל פשוט זה במתן הסבר לאספקטים מסוימים של תהליך ההיפוך‬
‫הפנימי בבקטריורודופסין‪ .‬לפי מודל שתי רמות‪ ,‬משטח פוטנציאל מעורר הוא ראקטיבי לאורך קואורדינטת‬
‫האיזומריזציה‪ .‬משטח כזה "ידחוף" את הרטינל המעורר אשר נמצא בקונפיגורציה ‪ all – trans‬בכוון התוצר‪,‬‬
‫לאורך מסלול חופשי ממחסומים‪ .‬כלומר‪ ,‬רטינל במצבו האלקטרוני המעורר צובר מתח בקשר ‪C13=C14‬‬
‫שלו‪ .‬ניתן לדמות אותו לקפיץ שעון מתוח‪ .‬האנרגיה האגורה בקפיץ מוציאה את האיזומריזציה אל הפועל ) איור‬
‫‪.(20‬‬
‫‪20‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫תנאי שהתקיימותו הייתה מחזקת באופן משמעותי‬
‫את הטענות על נכונות מודל שתי רמות הוא הסט‬
‫דינמי רציף לאדום של ספקטרום הפלואורסנציה עם‬
‫התקדמות הקונפורמציה של הכרומופור המעורר‬
‫לאורך קואורדינטת הראקציה אל עבר המצב‬
‫‪ . 13−cis‬התבוננות מדוקדקת בספקטרום הפרש‬
‫בליעה מופרד זמן של בקטריורודופסין )כגון זה‬
‫המוצג באיור ‪ (17‬מגלה כי השלב הדינמי שבו פסי‬
‫הבליעה והפליטה של המצב המעורר של הכרומופור‬
‫מראים הסטים רציפים אינו נמשך מעבר ל – ‪100fs‬‬
‫מרגע העירור‪ .123‬בזמן זה )שלב ‪Br Franck−Condon → I‬‬
‫איור ‪ :21‬מנגנוני איזומריזציה סביב קשר כפול‪ .‬למעלה )‪ (A‬בסכמה המוצגת באיור ‪ ,(16‬מתפתחים מאפיינים‬
‫היפוך סביב קשר כפול אחד ) ‪.One Bond Flip (OBF‬‬
‫באמצע )‪" (B‬דוושת האופניים" )‪ .Bicycle Pedal (BP‬ספקטרליים של המצב הפלואורסצנטי ‪ .I‬לאחר שלב‬
‫למתה )‪ (C‬מנגנון "היפוך חישוק" )‪.Hula Twist (HT‬‬
‫דינמי התחלתי קצר זה בהתפתחות ספקטרום ההפרש‬
‫של ‪ BR‬מעורר‪ ,‬פסי הבליעה והפליטה המאולצת אשר מזוהים עם המצב ‪ I‬נשארים מקובעים לתחומי אורכי הגל‬
‫שלהם ולא מראים שום דינמיקה נוספת‪.‬‬
‫יש לציין כי שלב דינמי ראשוני של התפתחות הספקטרום אינו יכול לשקף את תהליך האיזומריזציה‪.‬‬
‫מדובר בזמן קצר מדי עבור השלמת תנועת פיתול אטית יחסית של הרטינל סביב הקשר המיועד‪ .‬תוצאות של‬
‫ניסוי אשר נעשה במעבדתנו )ויתואר בפרוט בהמשך( מוכיחות באופן חד משמעי כי האיזומריזציה חייבת‬
‫להתרחש בשלב המעבר ‪ . I → J‬לפי ממצאי ניסוי זה‪ ,‬חתך המשטח האלקטרוני המעורר של ‪ BR‬לפי‬
‫קואורדינטת האיזומריזציה של הכרומופור הוא בעל אופי קושר ולא ראקטיבי )כפי שהוצע במודל שתי רמות(‬
‫והגאומטריה של הכרומופור המעורר בבקטריורודופסין קרובה לזו של המגיב‪ .86‬משמעות הדבר היא שקיים‬
‫קושי לנטר בזמן אמת את תהליך ההיפוך הפנימי בבקטריורודופסין וברודופסינים ארכיאליים אחרים‪ .‬דילוג של‬
‫אוכלוסיה מעוררת חמה מעל המחסום המפריד אותה מהחתך הקוני )ומנהור שלה דרכו( מתבצע בקלות‬
‫ובמהירות לעומת תהליך זה במקרה של אוכלוסיה קרה‪ .‬בגדול‪ ,‬לא מדובר בתהליך קוהרנטי והפיכתו לכזה‪,‬‬
‫במטרה לאפשר חקר שלו בנוחות באמצעות הכלים העומדים לרשותנו‪ ,‬תצריך גישה ניסיונית מורכבת‪.‬‬
‫ברור לנו שאיזומריזציה של הכרומופור בתוך החלבון מתרחשת בסביבה מופרעת סטרית‪ ,‬זאת להבדיל‬
‫מאיזומריזציה של ‪ RPSB‬בתמיסה‪ .‬לכן נצפה שיהיה שוני כלשהו בין מנגנוניה בשני מקרים אלה‪ .‬תפיסה‬
‫מקובלת לגבי מנגנון האיזומריזציה של פוליאנים בתמיסה היא סיבוב של קשר כפול אחד ) איור ‪ 21‬חלק עליון(‪.‬‬
‫פרדיגמה זו בעייתית במקרה של פוליאנים העוברים איזומריזציה במדיום קפוא או בכיס חלבון הדוק‪ .‬היפוך‬
‫סביב קשר כפול אחד מצריך את הנפח המקסימלי עבור התגובה והנפח הזה פשוט אינו זמין בסביבה הדוקה‪.‬‬
‫פוטו – איזומריזציה של רטינל ברודופסינים ארכיאליים מתרחשת בסקלת זמנים שבה האתר הפעיל של החלבון‬
‫אינו מספיק להתארגן מחדש ועל ידי כך לספק את הנפח הנדרש לאיזומריזציה לפי תרחיש זה‪ .‬אולם‪,‬‬
‫האיזומריזציה עדיין מתרחשת בחלבונים ובמדיה "קפואים" אחרים‪ .‬כיצד‪ ,‬אם כן‪ ,‬התהליך יוצא אל הפועל?‬
‫‪21‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫שני מנגנונים "משמרי נפח" הוצעו עבור איזומריזציה סביב קשר כפול בסביבה הדוקה‪ .‬הראשון הוא‬
‫מנגנון דוושת האופניים המתואר בחלקו האמצעי של איור ‪ .7321‬לפי מודל זה שני קשרים כפולים מתהפכים‬
‫באופן מוסכם אחד אחרי השני‪ .‬במודל זה‪ ,‬סידור מחדש של השלד הפוליאני מצריך סיבוב של ◦‪ 180‬של שתי‬
‫יחידות ‪ C− H‬בלבד ולא של חצי מולקולה כפי שמוצע במודל היפוך סביב קשר כפול אחד‪ .‬אי לכך‪,‬‬
‫איזומריזציה לפי מנגנון זה דורשת פחות נפח‪ .‬לפי מודל זה‪ ,‬בליעה של פוטון יחיד על ידי הכרומופור תביא‬
‫לאיזומריזציה של שני קשרים כפולים שלו וזאת לא התוצאה בפועל‪ .‬חישובים מראים כי שינוי קונפורמציה‬
‫במנגנון דוושת אופניים יכול להתרחש סביב שני קשרים יחידים‪ ,‬במצב יסוד‪ .‬מודל שני לאיזומריזציה משמרת‬
‫נפח הוא מודל היפוך חישוק – ‪ .74Hula Twist HT‬מנגנון זה מוצג בחלקו התחתון של איור ‪ .21‬לפי מודל זה‬
‫איזומריזציה מאותחלת על ידי היפוך יחידת ‪ C−H‬אחת בלבד‪ .‬שימור הנפח במקרה זה הוא מקסימלי ומכיוון‬
‫שבשלב ההתחלתי של התהליך סידור מחדש של השלד הפוליאני הוא מקומי ומינורי‪ ,‬איזומריזציה המתרחשת‬
‫לפי מודל זה יכולה להיות מהירה מאוד‪ .‬כפי שכבר אמרנו‪ ,‬נכון להיום לא ידוע מהו התרחיש הדינמי הנכון עבור‬
‫איזומריזציה של הרטינל ברודופסינים ארכיאליים‪ .‬גילוי המנגנון הנכון מהווה את אחת המטרות החשובות של‬
‫מחקר תהליכים מושרי אור אולטרה מהירים בחלבונים אלה‪.‬‬
‫בעת העירור האלקטרוני הכרומופור עובר שינוי מומנט דיפול גדול‪ ,‬מסדר גודל של ‪ ,15D‬זאת כי‬
‫בעקבות העירור מתרחשת תזוזה של מטען חיובי מבסיס שיף אל עבר טבעת ‪ β‬יונון‪ .‬זרימה זו של מטען נחזתה‬
‫בעבודות תאורטיות ואומתה בסופו של דבר בניסויים‪ . 76,75‬ככל הנראה‪ ,‬קיים קשר סיבתי בין מעבר המטען בזמן‬
‫העירור לבין אופנים ויברציוניים המעורבים בתהליך האיזומריזציה‪ .‬במיוחד‪ ,‬תנועת הפיתול של השלד הפוליאני‬
‫של הרטינל יכולה להסתייע בהצטברות של מטענים מנוגדים בקצוות השונים של המולקולה‪ .‬חישוב ‪ab initio‬‬
‫שנעשה לא מזמן מראה כי מומנט הדיפול עולה בזוויות דהידרליות גדולות של הקשר ‪ .77 C13=C14‬הסבר‬
‫פשטני לכך הוא שתנועת הפיתול משבשת את החיבור בין שני קצוות המולקולה ובכך עוזרת למקם את‬
‫המטענים‪ .‬כלומר תנועת הפיתול מייצבת את מומנט הדיפול אשר מסייע לה לצבור אמפליטודה‪ .‬השערת הקשר‬
‫בין שינוי מומנט הדיפול של הכרומופור לבין הדינמיקה‬
‫המובילה לאיזומריזציה שלו נתמכת בעובדה שהוכחה‬
‫ניסיונית‪ :‬ללא קיטוב של הרטינל אין לבקטריורודופסין‬
‫מעגל אור‪ .‬ממצא זה עולה מעבודות שנעשו על פיגמנטים‬
‫בהם הרטינל הוחלף בכרומופורים מלאכותיים אשר לא‬
‫עוברים שינוי מומנט דיפול גדול בעת העירור‪.78‬‬
‫ננסה כעת לכמת את תהליך ההיפוך הפנימי‬
‫במערכות אלה ולצורך זה נתאים פונקציות דעיכה‬
‫אקספוננציאליות לחלקים הדועכים של העקומות באיור‬
‫‪ .19‬מהר מאוד נגלה את שכבר גילו חוקרים בתחום‪ :‬לא איור ‪ :22‬התאמה בי אקספוננציאלית של דעיכת‬
‫הפליטה המאולצת ב – ‪ .pHR‬הקו השחור מראה את‬
‫ניתן להשיג התאמות מונו – אקספוננציאליות סבירות הפליטה המאולצת‪ ,‬האדום הוא ההתאמה הניתנת על‬
‫ידי סכום של הרכיב המהיר )ירוק( והרכיב האיטי‬
‫באף אחד מהמקרים‪ .‬כך הדעיכה של המצב האלקטרוני )כחול( קבועי הדעיכה המהיר והאיטי הם ‪ 2‬ו – ‪4.4ps‬‬
‫המעורר בהלורודופסין‪ ,‬כפי שהיא משתקפת בהעלמות בהתאמה‪ ,‬באורך גל זה‪.‬‬
‫‪22‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫הפליטה המאולצת שלו‪ ,‬היא טרי אקספוננציאלית‪ .‬בזמנים מוקדמים עקומת הדעיכה מותאמת בצורה טובה על‬
‫ידי סכום של שלושה אקספוננטים עם קבועי דעיכה של‪ 2ps ,0.22ps :‬ו – ‪) 4.5ps‬תוצאות שלנו(‪ .‬איור ‪ 22‬מציג‬
‫התאמה בי אקספוננציאלית‪ ,‬עם שני הרכיבים האטיים‪ ,‬של הפליטה המאולצת של פיגמנט זה‪ .‬רכיב מהיר נדרש‬
‫על מנת להתאים בצורה טובה אזורים ספקטרליים אחרים‪ .‬גם במקרה של ‪ RPSB‬בתמיסה התאמה טובה‬
‫מתקבלת על ידי סכום של שלשה אקספוננטים עם הקבועים הבאים‪ ,100fs ,1 – 2ps :‬ו – ‪ 4‬עד ‪.82,81,80,79,137ps‬‬
‫עבור בקטריורודופסין דווח על דעיכה טרי אקספוננציאלית עם הקבועים ‪ 90fs – 60 ,0.9ps – 0.6‬ו – ‪13ps – 9‬‬
‫עוד בשלבים מוקדמים של מחקר אולטרה מהיר של חלבון זה‪.102,83‬‬
‫הראינו כאן רק שני מקרים מייצגים של דינמיקה לא אקספוננציאלית של היפוך פנימי ברודופסינים‬
‫ארכיאליים‪ ,‬אך זהו ממצא שכיח במשפחת חלבונים זו‪ .40,85,84‬הגור מים למולטי אקספוננציאליות אינם ידועים‬
‫והוצעו מספר מודלים בניסיון להסביר אותה‪ .‬מקור הקושי במתן הסבר ממצה לתופעת הדעיכה המולטי –‬
‫אקספוננציאלית של המאפיינים הספקטרליים של המצב הפלואורסצנטי בחלבונים רטינליים ארכיאליים הוא‬
‫במורכבות של מולקולות ביולוגיות גדולות אלה‪ .‬חישוב הטופוגרפיה המדויקת של משטחי הפוטנציאל‬
‫האלקטרוניים המעורבים בפוטוכימיה שלהן‪ ,‬כפונקציה של הקואורדינטות המולקולריות של הכרומופור וסביבת‬
‫האופסין‪ ,‬אינו פשוט‪ .‬לאור חוסר ידיעת הטופוגרפיה של ‪ S1‬ניתן להציע מודלים שונים בניסיון להסביר את‬
‫הדינמיקה הלא אקספוננציאלית של היפוך הפנימי של הכרומופור המעורר‪ ,‬כל מודל יתאים לתוואי אחר של‬
‫המשטח העליון‪ .‬אחת מהמטרות היותר שכיחות של ניסויים כגון אלה הנעשים במעבדתנו על רודופסינים‬
‫ארכיאליים היא קבלת רמזים אודות הטופוגרפיה של המשטח האלקטרוני המעורר שלהם‪ .87,86‬רמזים אלה יעזרו‬
‫לנו בסופו של דבר לשפוט לטובת מודל זה או אחר‪ .‬להלן מספר הסברים מקובלים למולטי אקספוננציאליות של‬
‫תהליך ההיפוך הפנימי ברודופסינים ארכיאליים וב – ‪.RPSB‬‬
‫מפתה לפרש את הדעיכה המו לטי – אקספוננציאלית כביטוי לקיום צורונים מעוררים שונים )כאלה‬
‫שניתן להבחין ביניהם(‪ .‬כל צורון דועך בקצב אופייני לו‪ .‬אם קיימים שלושה צורונים מעוררים כאלה במקרה של‬
‫‪) BR‬כמספר רכיבי הדעיכה( הגיוני לצפות כי הללו ניתנים להבדלה על סמך ספקטרה בליעה ו‪/‬או פליטה שלהם‪.‬‬
‫לדוגמה‪ ,‬אם הצורונים נבדלים על ידי ספקטרה בליעה שלהם נצפה כי הבליעה של כלל האוכלוסיה המעוררת‬
‫תעבור הסחה עם הזמן כאשר מספר הצורונים הדועכים מהר יתמעט והאוכלוסייה המעוררת הנותרת תורכב‬
‫ברובה מצורונים הדועכים לאט‪ .‬אם ננסה ליישם מודל זה על ‪ ,BR‬נגלה כי לא ניתן להבחין בין הצורונים‬
‫המעוררים השונים על סמך המאפיינים הספקטרליים שלהם‪ .‬האמפליטודה היחסית של רכיבי הדעיכה השונים‬
‫זהה על פני תחום תדרים רחב בנראה וספקטרה הפרש בליעה של ‪ BR‬ב – ‪ 1ps‬וב – ‪ 0.2ps‬זהים למעשה‪ ,‬עד‬
‫כדי הכפלה בקבוע שלא תלוי באורך גל‪ .‬אם אכן קיימים צורונים מעוררים שונים של בקטריורודופסין הם חייבים‬
‫להיות אקוויוולנטיים מבחינה ספקטרוסקופית‪ ,‬הן בבליעה והן בפליטה‪.‬‬
‫דינמיקה לא אקספוננציאלית של היפוך פנימי ברודופסינים ארכיאליים יכולה להיגרם על ידי הטרוגניות‬
‫קונפורמציונית של האופסין‪ .‬סביבת האתר הפעיל יכולה ברגע נתון לאכלס תת – רמה קונפורמציונית מסוימת‬
‫בעוד שחלבונים אחרים באוסף מאכלסים תת רמות אחרות‪ .‬המעבר בין המצבים הקונפורמציוניים השונים‬
‫משופעל ת רמית ומתבצע בקלות בטמפרטורת החדר‪ .‬מכיוון שלסביבת החלבון השפעה ניכרת על הפוטוכימיה‬
‫של הרטינל‪ ,‬בכוחו של שוני קונפורמציוני עדין בין האתרים הפעילים של החלבונים באוסף לעמוד מאחורי‬
‫‪23‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫הקצבים השונים של ההיפוך הפנימי אשר נצפים בניסוי‪.‬‬
‫מודל דיפוזיוני‪ .‬מודל זה מניח כי לא קיים מחסום בין אזור של משטח הפוטנציאל המעורר בו ממוקמת‬
‫חבילת הגלים הוויברציונית על ידי פולס ה – ‪ pump‬לבין האזור של החתך הקוני בין המשטח המעורר למשטח‬
‫התחתון‪ ,‬כלומר הוא תולדה של מודל שתי רמות אלקטרוניות אשר מתואר בחלקו השמאלי של איור ‪ .20‬המודל‬
‫הדיפוזיוני מסביר קצב התחלתי גבוה של ההיפוך הפנימי על ידי תנועה התחלתית מכוונת של האוכלוסיה‬
‫המעוררת אל עבר החתך הקוני‪ .‬בהגעת חבילת הגלים אל מינימום של המשטח המעורר )אזור החתך הקוני(‬
‫התנועה המכוונת ההתחלתית שלה הופכת להיות רנדומלית והחבילה מתרחבת ועוברת דיפוזיה‪ .‬בשלב זה קצב‬
‫ההיפוך הפנימי מואט בשל איבוד ההכוונה של התנועה של חבילת הגלים הויברציונית‪.90,89,88‬‬
‫מודל הקירור הויברציוני הוא מודל המניח קיום מחסום בדרכה של חבילת הגלים הויברציונית אל החתך‬
‫הקוני‪ .‬הצבת מחסום פוטנציאל קטן אשר יוצר מינימום מקומי על המשטח המעורר ומעקב את האוכלוסיה‬
‫המעוררת‪ ,‬תגרום לקצב ההיפוך הפנימי שלה להיות תלוי טמפרטורה‪ .‬בהתחלה הטמפרטורה האינטרה –‬
‫מולקולרית עשויה להיות גבוהה כתלות בעודף האנרגיה של הפוטון המעורר‪ .‬אוכלוסיה חמה כזאת יכולה‬
‫להתגבר ביתר קלות על המחסום וקצב ההיפוך הפנימי ההתחלתי יהיה גבוה‪ .‬כעבור זמן‪ ,‬האוכלוסייה תתקרר‬
‫ובעקבות כך קצב מעבר המחסום יקטן‪ ,‬מה שיקטין בתורו את קצב ההיפוך הפנימי‪.‬‬
‫שכלול של מודל קירור ויב רציוני פשוט הוצע בעבודה תאורטית אשר פורסמה על ידי ‪Olivucci‬‬
‫וקולגות‪ .‬הם בחנו את תהליך הפוטואיזומריזציה ‪ 11−cis → all −trans‬של ‪ ,RPSB‬תהליך המתרחש‬
‫בפיגמנטי ראייה‪ .‬החוקרים הצליחו להראות באמצעות בניית מודל של דינמיקה גרעינית על גבי משטח‬
‫פוטנציאל אלקטרוני מעורר‪ ,‬במערכת קואורדינטות מולקולריות דו ממדית פשוטה ביותר‪ ,‬הכוללת את‬
‫קואורדינטת המתיחה של השלד הפוליאני של הרטינל ואת קואורדינטת הפיתול סביב הקשר המיועד‬
‫לאיזומריזציה‪ ,‬כי דינמיקת ההיפוך הפנימי במערכת מודל זו תהיה בי אקספוננציאלית רק באותם המקרים בהם‬
‫קיים מינימום מקומי על המשטח המעורר‪ .‬במקרים בהם למשטח הפוטנציאל האלקטרוני המעורר אין מינימום‬
‫מקומי‪ ,‬כלומר אין מחסום שמפריד בין חבילת גלים ויברציונית אשר ממוקמת על המשטח העליון בעת העירור‬
‫לבין החתך הקוני‪ ,‬לדינמיקת ההיפוך הפנימי יהיה אופי מונו – אקספוננציאלי מובהק‪ .‬ההסבר שניתן על ידי‬
‫החוקרים לתוצאות הסימולציה שלהם הוא שהמחסום הקטן על גבי ‪ S1‬בורר מסלולים של חבילת הגלים‬
‫הויברציונית‪ .‬ישנם מסלולים מסוימים אשר עוקפים את המחסום ואחרים‪ ,‬לעומתם‪ ,‬לא‪ .‬אוכלוסיה שעקפה את‬
‫המחסום תגיע מהר יחסית לאזור החתך הקוני‪ ,‬כתוצאה מכך‪ ,‬היפוך פנימי שלה יהיה מהיר‪ .‬החלק הנוטר‬
‫מחבילת הגלים הויברציונית ההתחלתית ייעצר על ידי המחסום‪ .‬שארית חבילת גלים זו תעבור דיפוזיה המלווה‬
‫על ידי קירור ויברציוני של האוכלוסיה המרכיבה אותה‪ .‬אוכלוסיה עצורה זו תעבור היפוך פנימי משופעל תרמית‬
‫ו‪/‬או תתמנהר דרך המחסום הנמוך‪ .‬קצב ההיפוך הפנימי שלה יהיה נמוך יחסית‪.91‬‬
‫מודל אחרון שנבחן הוא מודל ריבוי אוכלוסיות‪ .‬מודל זה הוא מעין גרסה מוגמרת של מודל ריבוי‬
‫צורונים מעוררים‪ .‬לפיו‪ ,‬קיימות מספר אוכלוסיות מעוררות שונות‪ .‬כל אחת מהאוכלוסיות נמצאת באזור מוגדר‬
‫ומבודד של המשטח המעורר ומגיעה לשם בעקבות פיצול של האוכלוסייה המעוררת הראשונית‪ .‬מידת‬
‫הראקטיביות של כל אחת מאוכלוסיות אלה שונה‪ .‬כך ישנן טענות כי ב – ‪ RPSB‬מעורר בתמיסה כל אחת‬
‫מהאוכלוסיות הללו מובילה לתוצר מסוים‪ ,‬כלומר איזומר מסוים של הרטינל מתקבל מכל אחת‬
‫‪24‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫מהאוכלוסיות‪ . 93,92,82‬מודל זה היה המודל המקובל להסביר את המתרחש ב – ‪ .sHR‬לפיו‪ ,‬קיימות שתי‬
‫אוכלוסיות מעוררות של פיגמנט זה‪ ,‬איזומר ‪ 13−cis‬של הכרומופור מתקבל מאוכלוסיה המעוררת הדועכת‬
‫מהר‪ ,‬היא האוכלוסיה הראקטיבית‪ .‬אוכלוסיה זו מובילה גם בחזרה למגיב‪ ,‬כלומר היעילות הקוונטית של‬
‫האיזומריזציה של מולקולות מעוררות השייכות לאוכלוסיה זו קטנה מ – ‪ .1‬האוכלוסיה הדועכת לאט היא‬
‫אוכלוסיה לא ראקטיבית החוזרת כולה אל המגיבים‪ .‬נציג בחלק הבא את הממצעים הניסיוניים אשר הוליכו‬
‫חוקרים למסקנה זאת‪.‬‬
‫ספקטרוסקופיה אולטרה מהירה של הלורודופסין‪ .‬תוצאות מחקרים קודמים‪.‬‬
‫מחקרים ראשונים שיישמו את‬
‫שיטות ‪) pump – probe‬עקרונותיה‬
‫מפורטים בחלק הניסיוני( על ‪sHR‬‬
‫הושלמו כעבור זמן לא רב אחרי הגילוי של‬
‫פיגמנט זה ואפיונו כמשאבת כלורידים‪.‬‬
‫העבודה הראשונה בנושא היא של‬
‫‪Polland,‬‬
‫‪Oesterhelt,‬‬
‫‪Zinth‬‬
‫וקולגות‪ .94‬המאמר שלהם מ – ‪ 1985‬מסכם‬
‫תוצאות של ניסוי ‪pump – probe‬‬
‫הנעשה על ‪ .sHR‬בין היתר‪ ,‬מוצגים בו איור ‪ :23‬ספקטרום הבליעה והפליטה‬
‫ספקטרה ‪ steady state‬של חלבון זה‪ .‬אורכי הגל של פולסי ‪.probe‬‬
‫של ‪ .sHR‬החצים מסמנים את‬
‫מדידת מקדם הבליעה ב – ‪ 578nm‬נותנת ‪ . 5×10 4 M −1 cm−1‬ספקטרום הפליטה של הפיגמנט )איור ‪(23‬‬
‫מוסט בכ – ‪ 4000cm-1‬ביחס לספקטרום הבליעה )‪ (Stokes shift‬והיעילות הקוונטית לפלואורסנציה נמדדה‪:‬‬
‫‪ . =5± 2×10−4‬ההפרדה הזמנית הניתנת על ידי הקרוס קורלציה )‪ (cross – correlation‬של ה – ‪pump‬‬
‫) ‪ ( λ max =540 nm‬עם ה – ‪) probe‬החצים באיור ‪ 23‬מצבעים על ארבעת אורכי גל בהם נעשתה הדגימה( הייתה‬
‫איור ‪ :24‬הפרש צפיפות אופטית כנגד הזמן ב ‪-‬‬
‫‪ 646nm‬של ‪ .sHR‬הכוון החיובי של הציר האנכי מסמן‬
‫עלייה בצפיפות האופטית של הדגם שבמקרה הנ"ל‬
‫מתפרשת כבליעה של תוצר ראשון במעגל האור אשר‬
‫נמצא במצב יסוד אלקטרוני‪ ,‬הוא ‪.sHR600‬‬
‫קצת יותר טובה מ – ‪.5ps‬‬
‫הניסוי חשף בליעה של תוצר המוסטת לאדום‬
‫ביחס לבליעתו של ‪ ,sHR578‬זאת ניתן לראות מהגרף‬
‫העולה באיור ‪ 24‬המציין שינוי בצפיפות האופטית של‬
‫הדגם כפונקציה של הזמן באורך גל של ‪ .646nm‬לחלק‬
‫החיובי של הגרף ניתן להתאים אקספוננט דועך‪ ,‬וקבוע‬
‫הדעיכה הנותן את ההתאמה הטובה ביותר הוא ‪.5ps‬‬
‫מנתונים באורכי גל אחרים מתקבל כי המצב המעורר‬
‫הראשוני גם הוא דועך אקספוננציאלית עם אותו קבוע‪.‬‬
‫מכיוון שההתאמה הטובה ביותר לזמן עליית‬
‫התוצר המוסט לאדום‪) sHR600 ,‬תוצר "‪ ,("K‬הייתה על‬
‫‪25‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :25‬שני המודלים המסבירים את הממצעים הניסיוניים‪ .‬המודל הראשון )‪ (I‬מניח שבליעת‬
‫התוצר אכן נבנית אקספוננציאלית עם הקבוע ‪ .5ps‬המודל השני )‪ (II‬לוקח בחשבון את הגבלת‬
‫ההפרדה הזמנית ומציע קיום של שתי אוכלוסיות שונות במצב המעורר‪ ,‬האחת דועכת‬
‫אקספוננציאלית למצב התחלתי עם הקבוע ‪ 5ps‬והשנייה מובילה מהר יותר לתוצר ‪.K‬‬
‫גבול הרזולוציה הזמנית של הניסוי‪ ,‬החוקרים הסתייגו והציעו שני מודלים אפשריים להתפתחות המצב‬
‫האלקטרוני המעורר של ‪ . sHR‬המודל הראשון תקף עבור סיטואציה שבה המצב המעורר אכן דועך‬
‫אקספוננציאלית עם הקבוע של ‪ 5ps‬ומצב ‪ K‬מופיע באותו קצב בדיוק‪ .‬זהו מודל קינטי פשוט‪ ,‬המסוכם בחלק‬
‫השמאלי של איור ‪ .25‬המצב המעורר הראשוני‪ ,S1 ,‬עובר היפוך פנימי שבמהלכו מתרחשת התפצלות‪ ,‬חלק‬
‫מהאוכלוסייה המעוררת חוזרת למצב היסוד בקונפיגורציה ‪ all – trans‬וחלק שני עובר איזומריזציה ומגיע‬
‫למצב יסוד בקונפיגורציה ‪ . 13−cis‬המודל השני )איור ‪ ,25‬חלק ימין( מתאר סיטואציה שבה התוצר ‪ K‬מופיע‬
‫מהר יותר ממה שרזולוציית זמנים בניסוי זה מאפשרת לראות‪ .‬במודל זה שתי אוכלוסיות שונות קיימות בו זמנית‬
‫במצב המעורר‪ ,‬האחת ‪ S1‬דועכת עם קבוע >‪ 5ps‬ומובילה בסופו של דבר לתוצר ‪ ,K‬והשנייה '‪ ,S1‬מתפתחת‬
‫איור ‪ :26‬ספקטרום ההפרש של ‪ sHR‬כפונקציה של ההשהיה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ .probe‬האזור‬
‫הספקטרלי בין ‪ 540‬ל – ‪ 620nm‬לא מוצג‪ .‬אזור זה חופף עם בליעת מצב היסוד ונשלט על ידי‬
‫סיגנל שלילי הנובע מהעדר אוכלוסייה במצב היסוד עקב עירורה‪ .‬מכחול לאורכי גל אלה רואים‬
‫סיגנל חיובי המיוחס לבליעת המצב המעורר‪ ,‬מאדום ל – ‪ 620nm‬רואים סיגנל שלילי‪ ,‬זוהי פליטה‬
‫מאולצת מהמצב המעורר‪ .‬סיגנל חיובי העולה עם ההשהיה סביב ‪ 645nm‬נגרם על ידי התוצר ‪.K‬‬
‫‪26‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :27‬הפרשי צפיפות אופטית כנגד הזמן ב – ‪ ,720nm‬סיגנל שלילי באורך גל זה‬
‫מיוחס לפליטה מאולצת של המצב המעורר ‪ ,I‬וב – ‪ ,645nm‬באורך גל זה נצפית‬
‫הבליעה של התוצר ‪ .K‬רואים כי הפליטה המאולצת של ‪ I‬ממשיכה לדעוך )עם קבוע‬
‫של ‪ (2.3ps‬אחרי שהבליעה של התוצר נבנתה‪.‬‬
‫מהראשונה ודועכת אקספוננציאלית עם הקבוע ‪ 5ps‬למצב היסוד ההתחלתי ‪ .all – trans‬החוקרים מציינים כי‬
‫התנאים בהם נעשה הניסוי אינם מאפשרים לשפוט לטובת מודל זה או אחר‪.‬‬
‫סדרה של עבודות על ‪ sHR‬נעשתה בתחילת שנות התשעים על ידי ‪ H. Kandori‬וקולגות במטרה‬
‫לחקור תהליכים ראשוניים בהלורודופסין כחלבון מייצג של משפחת הרודופסינים הארכיאליים‪ .97,96,95‬ספקטרום‬
‫של המצב המעורר של ‪ sHR‬אופיין לראשונה‪ ,‬ובין היתר נמצא שבליעתו מוסטת לכחול‪,  max =516nm ,‬‬
‫ביחס לספקטרום הבליעה של מצב היסוד‪ .‬החוקרים התאימו קבוע דעיכה של ‪ 2.3ps‬למאפיינים הספקטרליים‬
‫של המצב המעורר )מצב "‪ "I‬של ‪ , sHR‬איור ‪ (26‬והפעם ההפרדה הזמנית המדווחת‪ ,0.6ps ,‬לא היוותה גורם‬
‫מגביל בקביעת קבוע הזמן של הדעיכה‪ .‬העבודות האלה הראו שהעלייה של בליעת התוצר ‪ K‬באזור ‪645nm‬‬
‫מהירה יותר מהדעיכה של ספקטרום ההפרש של מצב ‪) I‬איור ‪ .(27‬לטענת החוקרים‪ ,‬עלייה מהירה כזאת אינה‬
‫יכולה להיות מוסברת על ידי מודל פשוט כגון זה הנראה בחלקו השמאלי של איור ‪ .25‬לפי המודל המוצע על‬
‫ידם התוצר ‪ K‬מתפתח ישירות מהאוכלוסיה המעוררת הראשונית‪ ,‬אוכלוסיית אזור ‪ Franck – Condon‬של‬
‫משטח פוטנציאל אלקטרוני מעורר‪ ,‬טרם דעיכתה לאזור המגדיר את מצב ‪ .I‬לטענתם‪ ,‬מצב ‪ I‬שהם גילו ואפיינו‬
‫אינו חלק ממעגל האור של ‪ .sHR‬המודל שהוצע על ידי ‪ Kandori‬מסוכם באיור ‪.28‬‬
‫התקדמות משמעותית בשנות ה – ‪ 90‬של אמצעים‬
‫ושיטות בתחום הספקטרוסקופיה האולטרה מהירה אפשרה‬
‫חקר של חלבונים רטינליים בתחומים ספקטרליים רחבים‬
‫ובהפרדה זמנית משופרת‪ .‬במחקר שנעשה על ‪ sHR‬ב – ‪1995‬‬
‫על ידי ‪ Zinth‬וקולגות בהפרדת זמנים של ‪ 100fs‬נמצא כי‬
‫ההתאמה המונו – אקספוננציאלית הטובה ביותר )עם קבוע‬
‫דעיכה של ‪ (3.6ps‬למאפיינים הספקטרליים של המצב‬
‫הפלואורסצנטי ‪ ,I‬מניבה תוצאות אשר מראות סטייה הן בזמני איור ‪ :28‬במודל המתואר כאן מצב ‪ K‬נוצר‬
‫השהייה )בין ‪ pump‬ל – ‪ (probe‬הקצרים והן בארוכים )איור ישירות מהאוכלוסייה המעוררת באזור – ‪Franck‬‬
‫‪ ,Condon‬התגובה מתרחשת לאורך קואורדינטה‬
‫‪ 29‬חלק שמאלי(‪ . 98‬לאחר שלא הצליחו להתאים אקספוננט רוטציונית של הקשר ‪ C13 = C14‬בפחות‬
‫מפיקושנייה אחת‪ .‬מצב ‪ I‬בסכמה זאת )*‪(hR‬‬
‫יחיד‪ ,‬ניסו החוקרים התאמה מולטי אקספוננציאלית והראו כי מיוצר כתוצאה מתהליך רלקסציה במצב המעורר‪.‬‬
‫קבוע הדעיכה עבור צורון זה – ‪.2.3ps‬‬
‫ניתן לקבל התאמה בי אקספוננציאלית טובה עבור דעיכת‬
‫‪27‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :29‬בצד שמאל נראים הפרשי צפיפות אופטית בארבעה אורכי גל ‪ probe‬מייצגים‪ .‬הסיגנל החיובי‬
‫ב – ‪ 465nm‬מיוחס לבליעת המצב המעורר ‪ .I‬הסיגנל השלילי ב – ‪ ,578nm‬מרכז פס הבליעה של מצב‬
‫היסוד‪ ,‬נגרם מה – ‪ photobleaching‬של מצב יסוד )העדר אוכלוסייה(‪ .‬סיגנל שלילי ב – ‪ 884nm‬הוא‬
‫בליעה של המצב המעורר וב – ‪ 687nm‬בליעת התוצר הולכת ונבנית בסקלה של פיקושניות‪ .‬הנקודות‬
‫מראות באילו השהיות בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ probe‬ספקטרום ההפרש נדגם‪ .‬קווים מקוטעים מראים את‬
‫ההתאמה המונו אקספוננציאלית הטובה ביותר עם הקבוע של ‪ ,3.6ps‬הקווים הרציפים מראים את‬
‫ההתאמה הבי אקספוננציאלית עם הקבועים של ‪ 1.5nm‬ו – ‪ 8.5nm‬בכל אורכי הגל חוץ מב ‪687nm -‬‬
‫שם נדרש רכיב אקספוננציאלי נוסף של ‪ 0.17ps‬על מנת לקבל התאמה טובה בזמני ההשהיה הקצרים‪.‬‬
‫בחלק הימני של האיור נראים ספקטרה המזוהים עם הדעיכות האקספוננציאליות השונות – ‪ .DAS‬חלק‬
‫‪ d‬של האיור בצד ימין משווה את האמפליטודות של ה – ‪ .DAS‬אמפליטודות של הרכיבים האטיים‬
‫פרופורציוניות בכל התחום הספקטרלי הנמדד חוץ מב ‪ 550 -‬עד ‪ .700nm‬ה – ‪ DAS‬המהיר מופיע רק‬
‫בין ‪ 600‬ל – ‪.700nm‬‬
‫ספקטרום ההפרש של ‪ ,I‬עם קבועי הדעיכה של ‪ 1.5‬ו – ‪ ,8.5ps‬כמו כן‪ ,‬נמצא כי בתחום ספקטרלי מ – ‪ 550‬עד‬
‫‪ 700nm‬מופיע רכיב אשר דועך הרבה יותר מהר‪ ,‬עם קבוע של ‪ .0.17ps‬מידע חדש זה אודות דינמיקת תהליך‬
‫ההיפוך הפנימי ב – ‪ sHR‬דרש התייחסות‪ .‬מה המשמעות של דינמיקה מולטי אקספוננציאלית במקרה זה? האם‬
‫ניתן לייחס את הדעיכות השונות לתהליכים שונים או שמה מדובר בפאזות שונות של אותו תהליך? בהנחה‬
‫שמולטי אקספוננציאליות משקפת תהליכים שונים של חזרת האוכלוסייה המעוררת אל המשטח התחתון האם‬
‫מדובר בתהליכים מקבילים או עוקבים?‬
‫על מנת לענות על חלק מהשאלות הנ"ל החוקרים ביצעו מיפוי ספקטרלי של רכיבי הדעיכה וקיבלו‬
‫שורה של ספקטראות המזוהים עם רכיבי הדעיכה השונים‪ ,‬אלה נקראים ‪DAS – Decay Associated‬‬
‫‪ ,Spectra‬הם מוצגים בחציו הימני של איור ‪) 29‬הסבר מפורט לשיטת ההתאמה הגלובלית אשר מניבה את ה –‬
‫‪ DAS‬מופיע בחלק הניסיוני(‪ .‬ה חוקרים מבאים שני הסברים אפשריים לדעתם למולטי אקספוננציאליות של‬
‫דינמיקת ההיפוך הפנימי‪ .‬שני ההסברים מבוססים על הנחת קיום אוכלוסיות מעוררות שונות‪:‬‬
‫‪ .I‬קיימת אי הומוגניות במצב היסוד של ההלורודופסין‪ ,‬כלומר הדגם מכיל שתי אוכלוסיות במצב היסוד‬
‫הנבדלות זו מזו‪ ,‬לאחר עירורן‪ ,‬בקצבי ההיפוך הפנימי ובתכונות ספקטרליות של המצב המעורר‬
‫‪28‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫)החוקרים מצבעים על השוני של שני ה – ‪DAS‬‬
‫באזור של ‪.(650nm‬‬
‫‪ .II‬מתרחש פיצול מוקדם‪ ,‬מהיר מאזור – ‪Franck‬‬
‫‪ Condon‬של המשטח המעורר לשתי‬
‫אוכלוסיות מעוררות שונות‪ ,‬התהליך המהיר הזה‬
‫הוא המייצר את הדעיכה עם הקבוע של ‪.0.17ps‬‬
‫אחת משתי האוכלוסיות הנוצרות על המשטח‬
‫הפוטנציאל העליון היא אוכלוסיה ראקטיבית‬
‫העוברת בחלקה היפוך פנימי אל עבר התוצר ‪K‬‬
‫ובחלקה השני‪ ,‬בחזרה אל המגיבים‪ .‬האוכלוסיה‬
‫השנייה לא ראקטיבית לחלוטין ועוברת היפוך‬
‫פנימי בכוון המגיב באזור אחר של משטח‬
‫הפוטנציאל המעורר‪.‬‬
‫המודל השני )סיכומו מוצג באיור ‪ (30‬מתייחס‬
‫גם ליעילות קוונטית נמוכה של ‪ .sHR‬שני הפיצולים של‬
‫האוכלוסייה המעוררת הראשונית של הלורודופסין בדרך איור ‪ :30‬חלק עליון של איור זה מציג דיאגרמת רמות‬
‫אפשרית עבור התהליכים הראשוניים ב – ‪ .sHR‬חלק‬
‫אל התוצר מורידים את הניצולת הקוונטית‪ .‬הפיצול‬
‫תחתון מראה באופן סכמתי את משטחי הפוטנציאל‬
‫הראשון‪ ,‬המהיר מאזור ‪ FC‬של המשטח העליון מחלק )התחתון ‪ ,S0‬והעליון ‪ (S1‬כפונקציה של קואורדינטות‬
‫הראקציה‪ .‬שני הערוצים האפשריים של דעיכת המצב‬
‫את האוכלוסייה המעוררת באופן שווה בין הערוץ המעורר הראשוני נמצאים לאורך הקואורדינטות‬
‫הרלוונטיות‪ .‬המקור המולקולרי של שני ערוצי תגובה‬
‫הראקטיבי והלא ראקטיבי והפיצול השני בעת ההיפוך‬
‫יכול להיות הטרוגניות שלה או פיצול של האוכלוסייה‬
‫הפנימי של האוכלוסייה הראקטיבית גורם לאבדן של עוד המעוררת הראשונית לשתי אוכלוסיות שונות במשטח‬
‫המעורר‪.‬‬
‫‪ 40%‬מהתוצר‪ ,‬בחישוב הכולל‪ ,‬רק ‪ 30%‬מהמולקולות‬
‫המעוררות עוברות איזומריזציה‪.‬‬
‫החוקרים נמנעו מלהגיד איזו מבין שתי האוכלוסיות היא ראקטיבית ואיזו לא‪ .‬הטענה בעד כך‬
‫שהאוכלוסייה הדועכת לאט‪ ,‬עם הקבוע של ‪ ,8.5ps‬היא המובילה לתוצר ‪ K‬נתמכת על ידי השוני של ה – ‪DAS‬‬
‫באזור הספקטרלי של בליעת מצב היסוד ובליעת התוצר‪ .‬אם האוכלוסיה האיטית היא ראקטיבית הרי שנצפה‬
‫שהאמפליטודה שלה באזור הבליעה של המגיב תהיה קטנה יותר ובאזור הספקטרלי שבו התוצר בולע שם‬
‫האמפליטודה תהיה גדולה יותר וזאת כי האוכלוסיה הראקטיבית מובילה ברובה לתוצר ולא למגיב‪ .‬ה – ‪DAS‬‬
‫של ‪ 8.5ps‬מתנהג בדיוק כך‪ ,‬רואים זאת בחלקו הימני התחתון של איור ‪ .29‬מצד שני‪ ,‬משיקולים תאורטיים‬
‫פשוטים ניתן לצפות כי האוכלוסייה הראקטיבית עוברת היפוך פנימי דרך חתך קוני של משטחי הפוטנציאל‪,‬‬
‫כלומר באזור שבו שני המשטחים מתקרבים‪ ,‬באזורים כאלה קצב ההיפוך הפנימי צפוי להיות מהיר יותר‪ .‬לפי כך‬
‫האוכלוסייה הדועכת מהר צריכה להיות זאת שמובילה לתוצר‪.‬‬
‫בעבודה של ‪ T. Kobayashi‬מ – ‪ 1997‬ישנה התייחסות לצורת פס הפליטה המאולצת‪ .99‬פס זה מתחיל‬
‫לצבור אמפליטודה בערך ב – ‪ 650nm‬ומסתיים באינפרה אדום קרוב‪ .‬באיור ‪ 26‬הספקטרה הטרנזיינטיים‬
‫‪29‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫נקטעים באזור ה – ‪ 780nm‬ונראה כי פס‬
‫הפליטה דועך שם‪ ,‬אך ‪Kobayashi‬‬
‫מציג נתונים בתחום אורכי גל רחב יותר‬
‫ומראה כי ישנם שני שיאים לפליטה‬
‫מאולצת‪ ,‬האחד ב – ‪ 730nm‬והשני ב –‬
‫‪ ,860nm‬השיאים מופרדים על ידי‬
‫מינימום הנופל סביב ‪) 780nm‬איור ‪.(31‬‬
‫לטענתו שני השיאים הללו שייכים‬
‫לאותה פליטה‪ ,‬הנגרמת על ידי אותו‬
‫מעבר‪ ,‬זאת כי שניהם דועכים בדיוק‬
‫באותו קצב‪.‬‬
‫איור ‪ :31‬ספקטרה הפרש בליעה של ‪ sHR‬מעבודתו של ‪.Kobayashi‬‬
‫את‬
‫מסביר‬
‫‪Kobayashi‬‬
‫רואים את המבנה של הפליטה המאולצת בעלת שני השיאים ב – ‪ 730‬וב‬
‫המינימום סביב ‪ 780nm‬על ידי חפיפה‬
‫– ‪.860nm‬‬
‫בתחום אורכי גל זה של סיגנל שלילי הנובע מפליטה מאולצת עם סיגנל חיובי הנגרם על ידי בליעה של‬
‫הפיגמנטים המעוררים )איור ‪ 32‬מציג מודל של צורת ספקטרום הפרש בליעה המתקבלת בעקבות חפיפה כזאת(‪.‬‬
‫מכיוון שהפליטה והבליעה דועכים אקספוננציאלית עם אותו קבוע )‪ Kobayashi‬מסתפק בהתאמות מונו‬
‫אקספוננציאליות(‪ ,‬הוא מייחס את שני המאפיינים הספקטרליים הנ"ל למעברים המערבים את אותה האוכלוסיה‪,‬‬
‫היא אוכלוסיית ‪ , S1‬המצב האלקטרוני המעורר הראשון‪ .‬חפיפה זו של בליעה ופליטה באורכי גל ארוכים מ –‬
‫‪ 650nm‬קיימת גם ב – ‪ pHR‬ויש לכך השלכות חשובות לגבי האופן בו הניסוי שלנו התבצע‪ .‬מכל מקו ם‪ ,‬בנושא‬
‫של דינמיקת המצב המעורר של הלורודופסין לא היה ל – ‪ Kobayashi‬הרבה מה להוסיף‪ ,‬הוא ראה כי הבליעה‬
‫של התוצר ‪ K‬מופיעה מהר יותר מההיעלמות של מאפיינים ספקטרליים של המצב המעורר ובכך שחזר למעשה‬
‫את התוצאות של ‪ Kandori‬וקולגות‪ ,‬תוך כדי אימוץ המודל אשר הוצע על ידם‪ .‬אך בכל זאת‪ ,‬ההפרדה הזמנית‬
‫שלו הייתה טובה יותר )בערך ‪ (250fs‬והוא הצליח לכסות תחום רחב יותר של אורכי גל בשיטת הגילוי שלו‪.‬‬
‫מידע משלים אודות דינמיקה מבנית של צורונים המשתתפים בתגובה פוטוכימית ניתן לקבל משיטות‬
‫של ספקטרוסקופיה ויברציונית מופרדת זמן‪ .‬ניסוי שבו ‪ sHR‬עורר בנראה ונדגם באינפרה אדום נעשה ב – ‪2005‬‬
‫על ידי ‪ F. Peters‬ו – ‪.100R. Diller‬‬
‫הרעיון היה לחקות אחר דינמיקה‬
‫ויברציונית של הכרומופור במצב‬
‫מעורר באופן ישיר‪ ,‬בהפרדת זמנים‬
‫טובה‪ .‬כמו בתחום הנראה‪ ,‬שיטת‬
‫‪ pump – probe‬באינפרה אדום‬
‫מייצרת ספקטרה הפרש צפיפות‬
‫אופטית של הדגם עם פולס המעורר‬
‫איור ‪ :32‬הדגמה של צורת ספקטרום הפרש בליעה שהיא תולדה של‬
‫ובלעדיו‪ ,‬בתחום הספקטרלי הרצוי ב – חפיפה בין פליטה לבליעה של המצב המעורר‪.‬‬
‫‪30‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫‪ .IR‬בספקטרה אלה סיגנל חיובי נובע‬
‫ממעברים ויברציוניים במצב מעורר וסיגנל‬
‫שלילי יכול להתפרש כפליטה מאולצת‬
‫המזוהה עם מעבר ויברציוני על המשטח‬
‫המעורר או כ – ‪ photobleach‬הנגרם על ידי‬
‫העדר אוכלוסיה במצב יסוד‪.‬‬
‫ספקטרום כזה נראה באיור ‪ .33‬פולס קצר‬
‫ועצמתי בעל רוחב של כ – ‪ 100fs‬בחצי‬
‫הגובה‪ ,‬ממורכז סביב ‪ 570nm‬מעורר את‬
‫הדגם שלאחר מכן נדגם על ידי פולס קצר‪,‬‬
‫איור ‪ :33‬ספקטראות הפרש צפיפות אופטית‪ ,‬בזמני ההשהייה אורכו ‪ 160fs‬בחצי הגובה‪ ,‬בעל רוחב‬
‫השונים בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ probe‬באזור של טביעות אצבע של ספקטרלי של ‪ 100cm-1‬ב – ‪ .mid IR‬הפרדה‬
‫הספקטרום הוויברציוני‪.‬‬
‫זמנית מינימלית של ניסוי זה הניתנת על ידי‬
‫פונקציית תגובת המכשור )‪ (Instrument Response Function – IRF‬הייתה בערך ‪.220fs‬‬
‫אזור ספקטרלי בין ‪ 1100‬ל ‪ 1600cm-1‬מעניין כי פסים ויברציוניים הנגרמים על ידי מתיחות של הקשר‬
‫‪) C – C‬המצומדת לכיפוף ‪ ( C – H‬והקשר האתילני הכפול ‪ C=C‬מופיעים שם וכבר ציינו כי תהליך‬
‫האיזומריזציה מערב קואורדינטות מולקולריות אלה‪ .‬סיגנל שלילי סביב ‪ 1203‬ו – ‪ 1167cm-1‬בספקטרה באיור‬
‫‪ 33‬נגרם על ידי ‪ bleach‬של מצב יסוד‪ .‬סיגנל חיובי העולה תוך פיקושניות בודדות סביב ‪ 1195cm-1‬מעיד על‬
‫האיזומריזציה‪ ,‬זהו תדר מתיחת קשר ‪ , C – C‬מצומד לכיפוף ‪ , C – H‬של התוצר ‪.K‬‬
‫גם כאן ניתן לפרק את הספקטרום הטרנזיינטי לספקטרה של רכיבי הדעיכה‪ ,‬ההתאמה הבי‬
‫אקספוננציאלית מניבה שני זמני דעיכה אופייניים‪ 1.8 ± 0.1 :‬ו – ‪ , 6.9 ± 0.5ps‬שני קבועים אלה קרובים דיים‬
‫לקבועי הדעיכה של המצב המעורר האלקטרוני ‪ I‬שראינו קודם בעבודתם של ‪ Arlt‬ו – ‪ .Oesterhelt‬להבדיל‬
‫מהתוצאות המוצגות בעבודה ההיא‪ ,‬יש הבדלים משמעותיים בין ה – ‪ DAS‬השונים‪ ,‬כפי שרואים באיור ‪.34‬‬
‫באזור מ – ‪ 1140‬עד ‪) 1240cm-1‬איור ‪ 34‬חלק שמאל( לספקטרום המזוהה עם הדעיכה של ‪ 6.9ps‬אמפליטודה‬
‫גדולה באזורים של בליעת התוצר בעוד שספקטרום הדועך תוך ‪ 1.8ps‬מראה אמפליטודה משמעותית דווקא‬
‫באזור של ‪ . 1195cm-1‬המשמעות היא שהמאפיינים הספקטרליים של התוצר נבנים עם הקבוע של ‪ .1.8ps‬האזור‬
‫איור ‪ :34‬ספקטרה מזוהים עם קבועי דעיכה באזורים ספקטרליים של "טביעות אצבע" )שמאל( ומתיחת קשר אתילני‬
‫)אמצע( של הכרומופור ב – ‪ . sHR‬מימין‪ :‬המודל שהציעו החוקרים‪ ,‬בו קבוע הדעיכה הקטן מבין השניים משוייך לדעיכת‬
‫האוכלוסייה הראקטיבית‪.‬‬
‫‪31‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫הספקטרלי שבו מופיע פס הבליעה הנגרם על ידי המתיחה האתילנית ‪ , C=C‬בסביבת ‪) 1530cm-1‬איור ‪34‬‬
‫באמצע( מראה אותה מגמה‪ .‬גם שם ה – ‪ DAS‬הדועך מהר‪ ,‬עם קבוע של ‪ ,2.2ps‬הוא בעל משרעת גדולה יותר‬
‫באזור של בליעת התוצר‪ ,‬ב – ‪.1512cm-1‬‬
‫לאור העובדה שהתוצאות של ניסוי בו הדגימה מתבצעת באינפרה אדום מראים דינמיקה בי‬
‫אקספוננציאלית של תהליך ההיפוך הפנימי ובכך הם קונסיסטנטיים עם התוצאות בנראה שראינו בניסוי קודם‪,‬‬
‫החוקרים מאמצים את מודל הקיום של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות‪ ,‬שרק אחת מהן מובילה לתוצר‪ .‬בניגוד‬
‫לתוצאות הניסוי בנראה המראות שוני מינורי בין שני ה – ‪ DAS‬ולכן לא מאפשרות קביעה חד משמעית של‬
‫זמני הדעיכה של האוכלוסיות השונות‪ ,‬הניסוי באינפרה אדום מציג ‪ DAS‬שונים מאוד‪ ,‬והעובדה שהדעיכה‬
‫המהירה בונה את התוצר‪ ,‬מאפשרת במסגרת מודל שתי האוכלוסיות ייחוס של הדעיכה המהירה לאוכלוסיה‬
‫הריאקטיבית )איור ‪ 34‬חלק ימין(‪.‬‬
‫בשנת ‪ 2008‬הגיע תורו של ‪ pHR‬לקבל את מנת תשומת הלב שלו מקהילת חוקרי ה – ‪.ultrafast‬‬
‫במחקר שנערך על ידי ‪ Takumi Nakamura‬מקבוצתו של ‪ Tahei Tahara‬נבדקה תלות של קינטיקת ההיפוך‬
‫הפנימי של פיגמנט זה במצבו המעורר ביון ההליד המועבר על ידו‪ .56‬יכולתו של ‪ pHR‬לשאוב אניונים אחרים‬
‫בנוסף לכלור הייתה ידועה זה מכבר והשפעת סוג האניון על שלבים מאוחרים של מעגל האור נחקרה על ידי‬
‫מספר קבוצות‪.101,42,35‬‬
‫עבודתו של ‪ Nakamura‬נעשתה בעקבות ממצאים מעניינים שעלו ממחקר של ‪ M. Shibata‬אשר בדק‬
‫תלות של תדר המתיחה של קשר ‪ N – D‬של רטינל )שעבר דיוטרציה( ב – ‪ pHR‬בהליד הנשאב‪ .31‬תלות זו‬
‫נבדקה במצב יסוד התחלתי ‪ all −trans‬ובמצב ‪ .K‬הבדיקה עבור מצב ‪ K‬נעשתה באמצעות הקפאת הפיגמנט‬
‫בשלב זה של מעגל האור שלו‪ .‬ממצאי ניסוי זה מרוכזים בטבלה הבאה‪:‬‬
‫‪pHR – Cl- pHR – Br- pHR – I‬‬‫‪2458cm-1‬‬
‫‪2480cm-1‬‬
‫‪2488cm-1‬‬
‫‪Initial ground state.‬‬
‫‪2427cm-1‬‬
‫‪2375cm-1‬‬
‫‪2338cm-1‬‬
‫‪K state.‬‬
‫רואים כי במצב יסוד התחלתי תדר מתיחת ‪ N – D‬קטן עם הגדלת הרדיוס והמסה של ההליד המועבר‪ .‬במצב‬
‫‪ K‬המגמה היא הפוכה‪.‬‬
‫תוצאות אלה מעידות על החלשות תלוית הליד של קשר מימן בין הפרוטון של בסיס שיף לצורונים‬
‫בסביבתו‪ ,‬בין מצב ההתחלתי של הכרומופור למצב ‪ 13 – cis‬שלו‪ .‬על פי האינטרפרטציה של החוקרים‪ ,‬במצב‬
‫‪ all – trans‬קיים קשר מימן בין הפרוטון של בסיס שיף למולקולת מים כפי שרואים באיור ‪ ,35‬ואילו במצב ‪K‬‬
‫הקשר המימני הוא בין הפרוטון להליד‪ .‬התלות של תדר מתיחת הקשר ‪ N – D‬בהליד מעידה על מידת‬
‫ההשפעה של רדיוס ההליד על שדה הכח של הכרומופור‪ .‬אין המסה של ההליד צפויה להשפיע על תדר המתיחה‬
‫של הקשר כלשהו בכרומופור בשלב מוקדם זה של מעגל האור וזאת כי ההליד נשאר קשור במקומו ההתחלתי‬
‫במהלכה של האיזומריזציה והרבה זמן לאחר סיומה‪ .‬באופן טבעי מעניין לחקור את ההשפעה של סוג ההליד על‬
‫דינמיקת תהליך ההיפוך הפנימי של הכרומופור בתקווה שמחקר כזה יספק מידע חדש אודות המנגנון שלו‪ .‬זאת‬
‫הייתה המוטיבציה עבור המחקר של ‪.Nakamura‬‬
‫‪32‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫החוקרים דווחו הפרדת זמנים של ‪ 30fs‬עבור הניסוי זה כך‬
‫שלא הייתה להם שום בעיה לחקות אחר דינמיקה של רכיבים‬
‫ספקטרליים מהירים מאוד‪ ,‬למשל הם מדווחים על רכיב של‬
‫בליעת המצב המעורר )מעבר ‪ ( S 1 → S n‬העולה עם הקבוע של‬
‫‪ .50fs‬עליה מהירה זאת נראית גם בפליטה המאולצת של המצב‬
‫המעורר‪ .‬לטענתם‪ ,‬הרכיב הזה משקף ריקון של אוכלוסיית‬
‫‪ Franck – Condon‬ראשונית‪ ,‬הממוקמת על המשטח המעורר‬
‫על ידי פולס ה – ‪ .pump‬בעבודה תאורטית שנעשתה על ידי‬
‫‪ Massimo Olivucci‬על ‪ RPSB‬ריקון אזור ‪ F – C‬של‬
‫המשטח ‪ S1‬של מולקולה זו לאחר עירורה נעשה לאורך‬
‫איור ‪ :35‬שינוי בקשר מימן בין‬
‫מצב יסוד קואורדינטה של התארכות כלל הקשרים בין הפחמנים בשרשרת‬
‫התחלתי לבין מצב ‪ K‬ברטינל של ‪.pHR‬‬
‫הפוליאנית )לא רק קשר ‪ C = C‬ספציפי שעובר איזומריזציה(‪.91‬‬
‫קרוב לוודאי כי גם ב – ‪ pHR‬מדובר בתנועה של חבילת הגלים הויברציונית על המשטח המעורר לאורך אותה‬
‫קואורדינטה‪ .‬בנוסף‪ ,‬אכן נצפתה תלות של דינאמיקת ההיפוך הפנימי והאיזומריזציה בסוג ההליד‪.‬‬
‫הלורודופסין עורר על ידי פולס ‪ pump‬שהספקטרום שלו נראה בכתום באיור ‪ .36‬הדגימה נעשתה‬
‫בארבעה אורכי גל שונים אשר מכסים את המאפיינים הספקטרליים החשובים של המצב המעורר‪ 490nm :‬ידגום‬
‫את בליעתו‪ ,‬הדגימה ב – ‪ 560nm‬תראה את ההתנהגות של ‪ photobleach‬של מצב יסוד כפונקציה של הזמן‬
‫והדגימה באדום‪ ,690nm ,‬נעשית על מנת לבדוק התנהגות של הפליטה המאולצת של ‪ pHR‬מעורר‪ .‬על מנת‬
‫לראות את הופעת התוצר ‪ K‬במעגל האור של פיגמנט זה החוקרים דגמו ב – ‪ .650nm‬בחירה של אורכי גל עבור‬
‫פולסי הדגימה בניסוי זה מעידה כי החוקרים ציפו‬
‫שספקטרום הטרנזיינטי של ‪ pHR‬יזכיר מקרוב את‬
‫זה של ‪.sHR‬‬
‫תחילה‪ ,‬נדגמה ההתנהגות הספקטרלית של‬
‫‪ pHR-Cl‬כפונקציה של השהיית ה – ‪probe‬‬‫לעומת ה – ‪ ,pump‬באורכי הגל הנ"ל‪ .‬איור ‪37‬‬
‫מסכם ממצאי בדיקה זו‪ .‬דעיכת הבליעה והפליטה‬
‫של המצב המעורר משוחזרת טוב על ידי התאמה בי‬
‫– אקספוננציאלית עם הקבועים‪2 =1.4±0.2ps :‬‬
‫ו – ‪  3=4.5±0.2ps‬כזכור בזמנים המוקדמים‬
‫נדרש קבוע נוסף‪.  1=50fs :‬‬
‫בשלב זה של עבודתם החוקרים מאמצים‬
‫את מודל שתי האוכלוסיות אשר הוצע כהסבר‬
‫למולטי – אקספוננציאליות של תהליך ההיפוך‬
‫הפנימי ב – ‪ .sHR‬אינטרפרטציה של תוצאות‬
‫איור ‪ :36‬ספקטרה רלוונטיים לניסוי של ‪ .Nakamura‬בחלקו‬
‫העליון של האיור רואים את ספקטראות הבליעה של ‪pHR‬‬
‫הקושר הלידים שונים במצב יסוד‪ ,‬ספקטרום פולס ה –‬
‫‪ pump‬נראה בכתום‪ .‬בחלק התחתון של האיור רואים את‬
‫ספקטרה של פולסי ה – ‪.probe‬‬
‫‪33‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :37‬הפרשי צפיפות אופטית בין ‪ pHR-Cl-‬מעורר לצורון זה במצב יסוד בארבעת אורכי‬
‫גל ‪ probe‬הנראים באיור ‪ .36‬בליעת מצב מעורר נראית ב – ‪ ,490nm‬פליטתו המאולצת ב‬
‫– ‪ ,690nm‬קרוב למרכז ספקטרום הבליעה של ‪ pHR-Cl-‬במצב יסוד ב – ‪ 560nm‬רואים‬
‫‪ bleach‬של מצב יסוד‪ .‬סיגנל המיוחס ל – ‪ K‬עולה סביב ‪ .650nm‬הקו השחור מראה את‬
‫ההתאמה הבי אקספוננציאלית‪.‬‬
‫הניסוי שלהם‪ ,‬המראות תלות של דינמיקת ההיפוך הפנימי בסוג ההליד‪ ,‬נשענת על ההנחה כי מודל שתי‬
‫האוכלוסיות‪ ,‬הראקטיבית אשר דועכת מהר והלא ראקטיבית הדועכת לאט‪ ,‬מתאר נכון את המתרחש ב – ‪pHR‬‬
‫מעורר‪ .‬התלות המוזכרת לעיל מתבטאת בראש ובראשונה בקבועים ‪ τ2‬ו – ‪ .τ3‬ההתאמה הבי – אקספוננציאלית‬
‫הטובה ביותר מניבה את הקבועים‪:‬‬
‫‪pHR – I-‬‬
‫‪pHR – Br-‬‬
‫‪pHR – Cl-‬‬
‫‪2.2ps‬‬
‫‪1.6ps‬‬
‫‪1.4ps‬‬
‫‪τ2‬‬
‫‪6.3ps‬‬
‫‪4.6ps‬‬
‫‪4.5ps‬‬
‫‪τ3‬‬
‫לא נצפתה תלות של הקבוע ‪ τ1‬בסוג ההליד‪.‬‬
‫התוצאות מראות כי הגדלת רדיוס ההליד מגדילה את ‪ .τ2‬מכיוון שקבוע זה משקף את תהליך‬
‫האיזומריזציה על פי מודל שתי האוכלוסיות‪ ,‬מסקנת החוקרים היא שככל שמגדילים את הרדיוס של האניון‬
‫האיזומריזציה מואטת‪ .‬לפי אינטרפרטציה שלהם‪ ,‬ממצא זה קונסיסטנטי עם ההשפעה של רדיוס ההליד על תדר‬
‫מתיחת קשר ‪ N – D‬אשר נצפתה לפני כן‪ .‬החוקרים מפרשים השפעה זו כמשיכה הולכת ומתחזקת של הפרוטון‬
‫של בסיס שיף במצב ‪ all −trans‬אל ההליד עם הגדלת הרדיוס שלו‪ .‬המשיכה החזקה מאטה את ההיפוך‬
‫הפנימי‪ .‬הקבוע ‪ τ3‬מייצג חזרה של אוכלוסיה לא ראקטיבית אל משטח הפוטנציאל של מצב יסוד‪ .‬מכיוון שאין‬
‫בתהליך זה שום שינוי גאומטרי של הכרומופור‪ ,‬תלות של קבוע זה בסוג ההליד תמוהה בעיני החוקרים‪ ,‬הם לא‬
‫נותנים הסבר משכנע לממצא זה ולמעשה לא דנים בו‪.‬‬
‫‪34‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫הניצולת הקוונטית הכוללת לאיזומריזציה של‬
‫הכרומופור גדלה עם הגדלת רדיוס ההליד‪ .‬כך מפרשים‬
‫החוקרים את התנהגות הסיגנל ב – ‪) 650nm‬איור ‪.(38‬‬
‫באורך גל זה הסיגנל החיובי נתרם על ידי בליעה של‬
‫התוצר ‪ .K‬בזמני השהיה ארוכים סיגנל זה הכי עצמתי‬
‫במקרה של ‪ pHR-I-‬והכי חלש עבור ‪ .pHR-Cl-‬יש‬
‫צורך ליישב פרשנות זאת עם קצבי האיזומריזציה‬
‫המשתקפים ב – ‪ .τ2‬לפי מודל מעברים של ‪ Landau‬ו‬
‫– ‪ Zener‬הסתברות למעבר באזור של חיתוך עקומות‬
‫איור ‪ :38‬הפרשי צפיפות אופטית של ‪) ,pHR-Br-‬גרף‬
‫ירוק( ‪) pHR-Cl-‬אדום( ו – ‪) pHR-I-‬כחול(‪ .‬באורך גל פוטנציאל תגדל ככל שמהירות התנועה של הגרעינים‬
‫של ‪ 650nm‬בו עולה סיגנל חיובי המיוחס‬
‫לבליעת– )הנתונה על ידי ‪ (τ2-1‬תגדל‪ .‬החוקרים מיישבים סתירה זו‬
‫התוצר ‪ .K‬הקווים השחורים מראים את ההתאמה הבי‬
‫אקספוננציאלית עבור כל אחד מהטרנזיינטים‪.‬‬
‫על ידי טענה כי חייב להיות משהו שמאט את קצב‬
‫ההיפוך הפנימי ולא משפיע על היעילות לאיזומריזציה‪ .‬לצורך זה הם מניחים קיום מחסום פוטנציאל על המשטח‬
‫העליון‪ .‬מחסום כזה יכול להאט את קצב ההיפוך הפנימי של ‪ pHR‬מעורר במידה שונה עבור כל אחד מההלידים‬
‫כי גובהו יכול להיות תלוי במשתנה זה‪ .‬אחרי ההתגברות של‬
‫האוכלוסיה המעוררת על המחסום‪ ,‬היעילות של האיזומריזציה‬
‫הנקבעת על ידי הטופוגרפיה של אזור החתך הקוני שוב תהיה תלויה‬
‫בהליד ויכול להיות מצב שבו היא תהיה גבוהה יותר דווקא במקרה‬
‫של ‪ .pHR-I-‬קיום מחסום פוטנציאל על המשטח המעורר במקרה‬
‫של ‪ BR‬הוכח הלכה למעשה על ידי ‪ Ruhman‬ולא מן הנמנע‬
‫שבחלבונים קרובים אלה הטופוגרפיה של המשטח המעורר תהיה‬
‫דומה‪ .‬מודל המוצע על ידי ‪ Nakamura‬מסוכם באיור ‪.39‬‬
‫עד כאן סיכמנו את מצב התקדמות המחקר של תהליכים‬
‫ראשוניים בשני ההלורודופסינים‪ .‬כפי שהראינו‪ ,‬פריטי אינפורמציה‬
‫חדשים אודות חלבונים אלה מתווספים בכל אחת מהעבודות והפזל‬
‫רחוק מלהיות מושלם‪ .‬השאלה שאנחנו שאלנו את עצמנו כאשר‬
‫ניגשנו לחקר ‪ pHR‬היא עד כמה מודל שתי האוכלוסיות מבוסס‬
‫איור ‪ :39‬המודלים המתארים את דינמיקת‬
‫עבור הלורודופסינים? מנקודת ראות שלנו‪ ,‬מודל זה לא בוסס באופן ההיפוך הפנימי של הכרומופור ב – ‪pHR‬‬
‫מעורר‪ .‬חלק עליון )‪ (a‬מודל ללא המחסום‪.‬‬
‫המספק את הדעת עבור ‪ .sHR‬לא נעשו מספיק מחקרים המעמידים חלק תחתון )‪ (b‬מודל המניח קיום מחסום‬
‫שמוצע על ידי ‪ . Nakamura‬סימונים‪ S1r :‬ו‬
‫אותו במבחן‪ .‬הנחת נכונות מודל זה עבור ‪ pHR‬ואינטרפרטציה של‬
‫– ‪ S1nr‬האוכלוסיה הראקטיבית והלא‬
‫תוצאות ניסיוניות על סמך הנחה זו כפי שראינו בעבודה של ראקטיבית בהתאמה‪ .‬קבוע התהליך המהיר‬
‫– ‪ τ1‬מתייחס לריקון ההתחלתי של‬
‫‪ Nakamura‬תמוהה בעיננו‪ ,‬כמו שאמרנו‪ ,‬מדובר בשני חלבונים אוכלוסיית ‪ .FC‬הקבוע ‪ τ2‬משקף את קצב‬
‫האיזומריזציה והקבוע האיטי ‪ τ3‬את קצב‬
‫שונים ומה שעשוי להיות נכון עבור אחד מהם לא בהכרח יהיה נכון החזרה של האוכלוסיה הלא ראקטיבית אל‬
‫המשטח התחתון‪.‬‬
‫עבור השני‪ .‬הגענו לשלב בו ניתן לנסח את מטרות המחקר שלנו‪.‬‬
‫‪35‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫מטרות המחקר ובחירת שיטה ניסיונית‪.‬‬
‫• מטרתנו הראשונה היא לאפיין את הדינמיקה האולטרה מהירה של ההיפוך הפנימי של ‪ pHR‬מעורר‬
‫בתחום ספקטרלי רחב‪ ,‬באור נראה‪ .‬הדגימה שלנו תתבצע בכל אורכי הגל מ – ‪ 420‬עד ‪ 830nm‬באופן‬
‫סימולטני‪ .‬זאת נעשה על מנת להשלים את המידע החסר אודות הספקטרום הטרנזיינטי של פיגמנט זה‪.‬‬
‫דגימה כזו של ‪ pHR‬מעורר ברזולוציית זמנים של עשרות פמטושניות‪ ,‬האופיינית למחקרים הנעשים‬
‫במעבדתנו על רודופסינים ארכיאליים‪ ,‬לא בוצעה עד כה‪.‬‬
‫יתרון של דגימה רחבת תדר‪ ,‬או בשמה האחר דגימה היפרספקטרלית‪ ,‬על פני דגימה באו רכי גל נבחרים‬
‫באזורים בהם צפויים להופיע מאפיינים ספקטרליים של צורון המעניין אותנו נעוץ בעובדה כי אין ביכולתה של‬
‫דגימה בתדרים בודדים לאפיין דינמיקה ספקטרלית‪ .‬לא נוכל לדעת מתוך הסתכלות על הפרש בליעה כפונקציה‬
‫של זמן הדגימה באורך גל בודד האם בזמן מסוים שיא הסיגנל הנצפה הוסט לתדרים גבוהים או נמוכים יותר‪.‬‬
‫מגבלה נוספת של דגימה בתחום ספקטרלי צר היא שאפס סיגנל יכול לנבוע מביטול הדדי הנובע מחפיפת סיגנל‬
‫חיובי עם שלילי בתחום צר זה‪ .‬הסתכלות על אורך גל נבחר המראה אפס סיגנל כפונקציה של הזמן יכולה‬
‫להוליך את החוקרים למסקנה שגויה לגבי תחום תדרים רחב סביב אורך הגל הנדגם והיא ששום דבר מעניין לא‬
‫קורה שם‪ .‬ראינו כבר שחפיפה כזאת של בליעה ופליטה קיימת בתחום בין ‪ 650‬ל – ‪ 800nm‬ב – ‪ ,sHR‬וצפי‬
‫לראותה גם ב – ‪ pHR‬הוא סביר ביותר‪.‬‬
‫• המטרה השנייה היא העמדה במבחן של מודל קיום בו זמני של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות של‬
‫‪ , pHR‬כאשר היעד האולטימטיבי מבחינתנו הוא פענוח התפתחותו של המצב המעורר של פיגמנט זה‪.‬‬
‫את הבדיקה הזאת נעשה באמצעות השיטה שנקרית ‪.Stimulated Emission Pumping – SEP‬‬
‫יתרונה הוא בכך שהיא מאפשרת בדיקה ישירה של נכונות מודל שתי האוכלוסיות‪ ,‬כך שהתוצאות שהיא‬
‫מניבה אינן מתפרשות לשני פנים‪.‬‬
‫עוצמת שיטה זו הודגמה במעבדתנו ב – ‪ 2001‬במחקר אשר עסק בשלב ראשון של מעגל האור של‬
‫בקטריורודופסין‪ . 86‬באותו זמן מספר שאלות הנוגעות בפוטוכימיה מוקדמת של ‪ BR‬היו פתוחות‪ .‬בתור התחלה‬
‫לא היה ברור אם המצב האלקטרוני המעורר ‪) S1‬המצב הפלואורסצנטי( מהווה שלב ראשון במעגל האור )הוא‬
‫שלב "‪ (" I460‬או שמא מדובר באוכלוסיה מעוררת לא ראקטיבית שלא מובילה לתוצרים מאוחרים במעגל אור של‬
‫פיגמנט זה‪ .‬מודלים אשר שילבו את ‪ I460‬במעגל האור נתמכו על ידי תוצאות ניסיוניות שהשוו תהליכים מושרי‬
‫אור ראשוניים בבקטריורודופסין טבעי ובפיגמנט מהונדס אשר החליפו את הכרומופור שלו ברטינל שבו הקשר‬
‫‪ C13=C14‬לא יכול לעבור איזומריזציה עקב נעילתו בטבעת מחומשת של אטומי פחמן‪ .‬הדינמיקה של ‪BR‬‬
‫נעול וטבעי התפצלה בשלב של דעיכת מצב פלואורסצנטי בעל מאפיינים ספקטרליים זהים בשניהם‪ .‬הפיגמנט‬
‫הטבעי המשיך את מעגל האור והניב את התוצר ‪ K‬ואילו בפיגמנט הנעול דעיכת המצב המעורר הייתה הרבה‬
‫יותר איטית‪ ,‬עם קבוע של ‪ 20ps‬לעומת ‪ 0.5ps‬בטבעי‪ ,‬כמו כן‪ ,‬לא נצפה שום תוצר עם בליעה מוסטת לאדום‬
‫במקרה שלו‪ .‬תוצאות של ניסוי זה רמזו על כך שהדעיכה מ – ‪ I‬ל – ‪ K‬משקפת את שלב האיזומריזציה של‬
‫הרטינל ב – ‪.BR‬‬
‫כפי שראינו כבר‪ ,‬ספקטרום ההפרש של ‪ I460‬של ‪ BR‬דועך אך לא משתנה‪ .‬בין החוקרים שאימצו את‬
‫המודל המשלב את המצב הפלואורסצנטי במעגל האור התעוררו חילוקי דעות בנוגע לפרשנויות של סטציונריות‬
‫‪36‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫המאפיינים הספקטרליים של מצב זה‪ .‬חוקרים אחדים ראו באי התפתחות ספקטרלית של ‪ I460‬הוכחה לכך‬
‫שמדובר במצב לכל דבר‪ ,‬בעל מבנה ואנרגיה מוגדרים ואחרים לעומתם היו סבורים כי הדעיכה של המצב‬
‫הפלואורסצנטי משקפת התפתחות של האוכלוסיה המעוררת על גבי משטח פוטנציאל ללא מחסום‪ ,‬בדרכה אל‬
‫אזור החתך הקוני‪ .‬לטענתם‪ ,‬ההתפתחות הנ"ל מאופיינת על ידי השתנות של חתכי הפעולה לבליעה ופליטה של‬
‫האוכלוסיה המעוררת ולכן לא נכון יהיה לפרש את הדעיכה של המאפיינים הספקטרליים של ‪ I460‬כתהליך אשר‬
‫מצביע רק על חזרה של האוכלוסיה המעוררת אל משטח פוטנציאל אלקטרוני תחתון בקונפיגורציה זו או אחרת‬
‫של הרטינל‪.‬‬
‫ניסויי ‪ pump – probe‬ברזולוציית זמנים של פמטושניות לא סיפקו תשובות ישירות וחד משמעיות‬
‫לשאלות אלה‪ .‬לכן ‪ Ruhman‬וקולגות יישמו שיטה המבוססת על שלושה פולסים‪pump – dump – probe :‬‬
‫כאשר התפקיד של הפולס הנוסף הוא לגרום ל – ) ‪ Stimulated Emission Pumping (SEP‬של האוכלוסיה‬
‫המעוררת‪ .‬הכוונה היא להעברה אימפולסיבית של חלק מאוכלוסיה זו בחזרה אל משטח אלקטרוני יסודי על ידי‬
‫פולס ‪ dump‬עצמתי אשר מאלץ פיגמנטים מעוררים לפלוט פוטונים באנרגיה המתאימה למרווח בין ‪ S0‬ל – ‪,S1‬‬
‫כפונקציה של הקואורדינטות הגרעיניות‪.‬‬
‫שיטת שלושת הפולסים יכולה לספק תשובות לשאלות לגבי התפתחות של המצב המעורר של ‪BR‬‬
‫באופן הבא‪ .‬נניח כי הדעיכה עם הקבוע של ‪ 0.5ps‬של המצב הפלואורסצנטי משקפת התפתחות רציפה של‬
‫האוכלוסיה המעוררת המלווה על ידי הפחתה אקספוננציאלית של חתך הפעולה לפליטה ובליעה של אוכלוסיה‬
‫זו‪ .‬במקרה כזה אחוז האוכלוסיה המעוררת המועבר על ידי ה – ‪ dump‬אל המשטח האלקטרוני התחתון צפוי‬
‫לקטון עם הדעיכה של המאפיינים הספקטרליים של ‪ .I460‬במקרה שבו מודל "קינטי" מתאר נכון את התפתחות‬
‫האוכלוסיה המעוררת‪ ,‬כלומר האוכלוסיה הזאת איננה מתפתחת אלא עצורה בקונפיגורציה ספציפית אשר‬
‫מאופיינת על ידי מבנה לא משתנה וחתכי פעולה קבועים לפליטה ובליעה )במקרה כזה הדעיכה של ספקטרום‬
‫ההפרש של ‪ I460‬מתפרשת רק כהפחתה אקספוננציאלית של ריכוז צורון זה( נצפה לכך שהסתברות לאלץ פליטה‬
‫על ידי פולס ה – ‪ dump‬תהיה קבועה ולא תלויה בהשהיה בינו לבין ה – ‪ .pump‬אי לכך‪ ,‬ביצוע ‪SEP‬‬
‫בהשהיות שונות בין ה – ‪ pump‬ל – ‪) dump‬כלומר בשלבי חיים שונים של האוכלוסיה המעוררת( עשוי לעזור‬
‫להחליט איזה מהמודלים מתאים יותר לתיאור תהליכים מושרי אור ראשוניים ב – ‪ .BR‬בנוסף‪ ,‬גישה ניסיונית זו‬
‫בשילוב עם הערכה איכותנית של השפעת ה – ‪ dumping‬של האוכלוסיה המעוררת על הופעת תוצרים‬
‫מאוחרים יותר של מעגל האור )למשל ‪ (K‬יכולה לספק תשובה לשאלת מיקום המצב הפלואורסצנטי במעגל‬
‫האור של בקטריורודופסין‪.‬‬
‫החוקרים עוררו את הבקטריורודופסין עם פולסים ממורכזים סביב ‪ 535nm‬ודגמו בשני אורכי גל‪ 900 :‬ו‬
‫– ‪) 650nm‬איור ‪ ,40‬חלק עליון(‪ .‬הדגימה ב – ‪ 900nm‬נועדה לבחון את השפעת ‪ SEP‬על האוכלוסיה‬
‫הפלואורסצנטית ואילו הדגימה ב – ‪ 650nm‬בוחנת האם ובאיזו מידה ה – ‪ dumping‬משפיע על תוצר ‪ K‬של‬
‫מעגל האור‪ .‬אורך גל מרכזי של פולסי ‪ dump‬בניסוי זה היה ‪ .1070nm‬התרחקות ממרכז פס הפליטה המאולצת‬
‫של ‪ BR‬סביב ‪ 900nm‬אל אינפרה אדום עמוק יותר נועדה להוציא את ספקטרום של פולס ה – ‪ dump‬מאזור‬
‫החפיפה של הפליטה עם הבליעה‪ .‬מקור הטענה כי קיימת חפיפה כזאת בספקטרום הפרש בליעה של‬
‫בקטריורודופסין הוא עבודתם של ‪ Anfinrud, Hasson‬ו – ‪ Gai‬משנת ‪ .1021996‬כפי שראינו קודם‪,‬‬
‫‪37‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :40‬תוצאות הניסוי של ‪ Ruhman‬ו – ‪.Hou‬‬
‫החלק העליון מציג את ספקטרום הבליעה של מצב‬
‫היסוד של ‪ ,BR‬את ספקטרום הפרש בליעה של ‪I460‬‬
‫בהשהיה של ‪ 200fs‬בין ‪ pump‬ל – ‪ probe‬ואת‬
‫ספקטרה של הפולסים‪ .‬החלק האמצעי מציג את‬
‫הפרש הבליעה כפונקציה של ההשהיה בין ה –‬
‫‪ pump‬ל – ‪ probe‬באורך גל של ‪ .900nm‬הגרף‬
‫המוכנס הקטן מציג את היחס בין הטרנזיינטים‬
‫באורך גל זה‪ ,‬עם ובלי ה – ‪ dump‬בהשהיות שונות‬
‫בינו לבין ה – ‪ .pump‬החלק התחתון של איור זה‬
‫מציג את הפרש בליעה ב – ‪ 900nm‬עם ‪dumping‬‬
‫בזמנים מוקדמים ובגרף הקטן‪ ,‬את הפרש צפיפות‬
‫אופטית ב – ‪ .650nm‬באורך גל זה צפויה עליית‬
‫סיגנל חיובי אשר נגרם על ידי הופעת התוצר ‪.K‬‬
‫‪ Kobayashi‬מצא חפיפה דומה באזור הפליטה המאולצת‬
‫של ‪ ,sHR‬היא נצפתה במעבדתנו ב – ‪ RPSB‬ולא מן הנמנע‬
‫שהיא קיימת גם בחלבונים רטינליים אחרים‪.103‬‬
‫החלק האמצעי של איור ‪ 40‬מראה את השפעת‬
‫‪ SEP‬בהשהיות שונות בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ dump‬על‬
‫האוכלוסיה הפלואורסצנטית‪ .‬תוצאות של סריקת הפליטה‬
‫המעוררת ללא ‪ dumping‬מוצגות כ – ‪ .reference‬הגרף‬
‫הקטן בפינה ימנית עליונה מציג את היחס בין טרנזיינט ה –‬
‫‪ reference‬לבין טרנזיינטים שהתקבלו עם ה – ‪.dumping‬‬
‫נסכם את תוצאות ניסוי זה‪ .‬עבור השהיות ‪SEP‬‬
‫הגדולות מ – ‪ ~200fs‬חלקי הטרנזיינטים שלאחר ה –‬
‫‪ dumping‬נופלים אחד על השני )הגרפים של יחס‬
‫הטרנזיינטים זהים‪ ,‬בגבול הרעש‪ ,‬ללא תלות בתזמון ה –‬
‫‪ SEP‬בטווח של השהיות בין ‪ 200‬ל – ‪ .(1000fs‬לעומת זה‪,‬‬
‫במקרה שבו הפולס האינפרה אדום מגיע מוקדם יותר פחות‬
‫אוכלוסיה מעוררת מועברת אל המשטח התחתון‪ .‬התוצאות‬
‫הללו מספקות אינדיקציה ברורה לכך שהמודל הקינטי מתאר‬
‫טוב יותר מהמודל הדינמי את המתרחש בחלבון המעורר‪.‬‬
‫לאחר זמן קצר שבו האוכלוסיה הפלואורסצנטית עוברת‬
‫שינוי דינמי‪ ,‬ההסתברות ל – ‪ dumping‬נשארת קבועה כל‬
‫עוד קיימת אוכלוסיה זו‪ .‬תוצאות אלה צפויות רק במקרה שבו‬
‫האנרגיה והמבנה של הפיגמנטים המעוררים מוגדרים ולא‬
‫משתנים במהלך החיים של המצב ‪.I460‬‬
‫האם מעבר האוכלוסיה המעוררת למשטח התחתון‬
‫על ידי ה – ‪ dump‬משפיע על ריכוז התוצר ‪ K‬במעגל האור‬
‫של ‪ ?BR‬התשובה היא כן‪ ,‬רואים זאת בברור בחלק התחתון‬
‫של איור ‪ 40‬אשר מציג טרנזיינטים ב – ‪ 650nm‬בגרף הקטן‬
‫בפינה ימנית עליונה‪ .‬באורך גל זה צפוי להופיע סיגנל חיובי‬
‫הנגרם על ידי הבליעה של ‪) K‬הסיגנל הזה מוצג כאן עם סימן‬
‫הפוך‪ ,‬אך אין זה משנה‪ ,‬מה שמעניין בתוצאות אלה זה‬
‫ההשפעה של ה – ‪ SEP‬על האמפליטודה של הטרנזיינט ב –‬
‫‪ .(650nm‬קורלציה בין ה – ‪ dumping‬של ‪ I460‬לבין הקטנת‬
‫האמפליטודה של ‪ K‬מצדיקה באופן חד משמעי את מיקום‬
‫המצב הפלואורסצנטי בסכמת מעגל האור של‬
‫‪38‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫בקטריורודופסין‪ .‬יותר מזה‪ ,‬השבר של האוכלוסיה המורחקת ממעגל האור‪ ,‬המחושב מיחס הטרנזיינטים ב –‬
‫‪ 900‬וב – ‪ 650nm‬זהה לחלוטין‪ .‬מכאן ששום חלק מאוכלוסיה מעוררת אשר מועברת על ידי ה – ‪ dump‬בחזרה‬
‫למצב יסוד לא עובר איזומריזציה תוך כדי‪ .‬אי לכך‪ ,‬ניתן לומר בוודאות כי הקואורדינטות הגרעיניות שמגדירות‬
‫את ‪ I460‬דומות מאוד לקואורדינטות של מצב היסוד ההתחלתי ‪ all −trans‬ומצד שני‪ ,‬שונות מאוד מאלה‬
‫המאפיינות את האזור של החתך הקוני בין ‪ S1‬ל – ‪ ,S0‬דרכו הפיגמנטים המעוררים מאכלסים בחזרה את מצב‬
‫היסוד בקונפיגורציה ‪ all −trans‬ו – ‪ 13−cis‬של הכרומופור‪.‬‬
‫בניסיון להסביר את האופי הסטציונרי של האוכלוסיה המעוררת בבקטריורודופסין ‪ Ruhman‬וקולגות‬
‫מעלים השערה כי קיים מחסום על ‪ S1‬בין האזור שמגדיר את ‪ I460‬לבין קונפיגורציה שבה משטח פוטנציאל זה‬
‫נחתך עם ‪ .S0‬מחסום כזה לא יאפשר שינוי מבני של המצב הפלואורסצנטי ויגרום להצטברות שלו‪ .‬מולקולות‬
‫מעוררות עשויות להתגבר על המחסום באמצעות אקטיבציה תרמית‪ ,‬אם כי במקרה זה קצב ההיעלמות של ‪I460‬‬
‫צפוי להיות תלוי טמפרטורה וניסויים אשר נעשו על מנת לבדוק קיום תלות מסוג זה לא הניבו תוצאות‬
‫חיוביות‪ . 104‬יחד עם זאת‪ ,‬תאוריית מחסום העוצר את התפתחות האוכלוסיה הפלואורסצנטית ב – ‪ ,BR‬הנגרם על‬
‫ידי ‪ avoided crossing‬של המשטח ‪ S1‬עם משטח פוטנציאל נוסף‪ ,‬השוכן מעליו‪ ,‬קיבלה חיזוק משמעותי‬
‫בעקבות פרסום תוצאות ניסוי שלושה פולסים על בקטריורודופסין‪ .‬מודל זה אומץ גם עבור רודופסינים‬
‫ארכיאליים אחרים‪ .‬ראינו כי ‪ Nakamura‬בעבודתו מ – ‪ 2008‬מצטט את ממצאי המחקר של ‪ Ruhman‬ומאמץ‬
‫את השערת המחסום על מנת לתאר את דינמיקת המצב המעורר ב – ‪) pHR‬איור ‪ 39‬חלק תחתון(‪.‬‬
‫כיצד הפעלת שיטת שלושת הפולסים יכולה לענות על שאלת קיום שתי אוכלוסיות מעוררות שונות של‬
‫‪ ? pHR‬אם אכן קיימות שתי אוכלוסיות ורק אחת מהן )זאת שדועכת מהר( מובילה לתוצר הרי שלביצוע ‪SEP‬‬
‫לא תהיה השפעה על מעגל האור בהשהיות ארוכות בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ ,dump‬כלומר בשלבים מאוחרים של‬
‫חיי המצב המעורר‪ ,‬בהם לא נותרה כמעט אוכלוסיה ראקטיבית על ‪ .S1‬בהשהיות קצרות לעומת זה‪ ,‬נצפה‬
‫להפחתה משמעותית של אוכלוסיית מעגל האור בעקבות ‪ dumping‬של האוכלוסיה המעוררת הראקטיבית‪.‬‬
‫בנוסף‪ ,‬אם שתי האוכלוסיות המעוררות אכן שונות‪ ,‬לא סביר שחתך הפעולה לפליטה מאולצת זהה לשתיהן‪ .‬לכן‬
‫אחוז האוכלוסיה המעוררת המועברת למשטח תחתון צפוי להיות תלוי בהשהיה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪,dump‬‬
‫שלא כמו במקרה של ‪.BR‬‬
‫הצלחת טכניקת ‪ SEP‬במקרה של ‪ BR‬וכמות המידע החדש אודות התפתחות המצב המעורר של חלבון‬
‫זה אשר התקבל עקב הפעלתה‪ ,‬גרמה לנו לאופטימיות באשר ליכולתה לתרום לפענוח תהליכים מושרי אור‬
‫ראשוניים בהלורודופסין של ‪ .Natronomonas pharaonis‬נראה בהמשך כי האופטימיות שלנו הייתה‬
‫מוצדקת‪.‬‬
‫‪39‬‬
‫שיטות העבודה והמערכת הניסיונית‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫ספקטרוסקופיית בליעה מופרדת זמן בשיטת ‪.pump – probe‬‬
‫על מנת לעמוד ביעדים שהצבנו לעצמנו במחקר הנוכחי‪ ,‬נרצה בתור התחלה לעקוב אחר התפתחות‬
‫בזמן של מאפיינים ספקטרליים של פיגמנטים מעוררים‪ .‬שיטות ספקטרוסקופיות מסורתיות במרחב התדר‬
‫מוגבלות ביכולתן למדוד ספקטרה של צורונים טרנזיינטיים קצרי חיים כי ריכוזם בתנאי תאורה קבועים בכל רגע‬
‫נתון הוא זניח‪ .‬פנייה לספקטרוסקופיה במרחב הזמן היא הבחירה הטבעית של ניסיונאי המבקש לחקור דינמיקה‬
‫של תהליכים פוטוכימיים‪/‬פוטופיזיקליים מהירים‪ .‬הנ"ל מעמידה לרשותו שלל שיטות וכלים לחקר תהליכים‬
‫דינמיים המתרחשים בסקלות זמנים שונות‪ .‬למשל‪ ,‬ניתן למדוד פלואורסנציה של הלורודופסינים המעוררים על‬
‫ידי הבזק אור קצר‪ ,‬באמצעות מצלמה מהירה ) ‪ .(streak camera‬מגרעתה של שיטת מדידה זו היא תלותה‬
‫במהירות הגלאי‪ .‬קיימות היום מצלמות מהירות מספיק על מנת לנטר אירועים המתרחשים בסקלה של מאות‬
‫פמטושניות‪ ,‬אך אלה לא בשימוש במעבדתנו‪ .‬שיטת‬
‫‪ pump – probe‬היא גרסה עדכנית של ‪Flash‬‬
‫‪ ,photolysis‬המבוססת על פולסי אור של לייזרים‬
‫באורך של פיקו – פמטושניות‪ .‬כפי שנראה בהמשך‪,‬‬
‫יתרון שיטה זאת הוא בכך שההפרדה הזמנית שהיא‬
‫מאפשרת לא תלויה במהירות התגובה של מכשירי‬
‫המדידה ובימינו מגיעה לפמטושניות בודדות באופן‬
‫איור ‪ :41‬סכמת ניסוי ‪ pump – probe‬בסיסי‪.‬‬
‫שגרתי‪.106,105‬‬
‫סכמה טיפוסית של ניסוי ‪ pump - probe‬מוצגת באיור ‪ .41‬פולס ראשון הוא פולס ‪ pump‬עצמתי‪,‬‬
‫רזונטיבי עם מעבר אלקטרוני או ויברציוני של צורוני הדגם‪ .‬תפקידו לאתחל תגובה פוטוכימית או לחלופין‬
‫לגרום לאכלוס מוגבר של רמות אנרגיה מעוררות של מולקולות‪/‬אטומי הדגם‪ .‬פולס ‪ probe‬הוא פולס שני‬
‫בסכמה ניסיונית זו‪ .‬הוא יכול להיות חלש בהרבה מפולס ה – ‪ ,pump‬במקרה כזה אין ביכולתו לגרום לשינוי‬
‫משמעותי באכלוס רמות האנרגיה של הדגם‪ .‬עצמתו לאחר המעבר בדגם נמדדת על ידי גלאי לא מהיר‪ ,‬כפונקציה‬
‫של ההשהיה בינו לבין ה – ‪ . pump‬סריקת פרמטר ניסיוני זה מתאפשרת הודות לשליטתנו על הפרש הדרכים‬
‫האופטיות בין ה – ‪ pump‬ל – ‪.probe‬‬
‫להלן תיאור מתמטי בסיסי של ניסוי ‪ .107pump-probe‬נתעלם לבינתיים מהתלות של הפולסים וגדלים‬
‫מדידים בניסוי באורך גל‪ ,‬נתאר את התנהגות הסיגנל כפונקציה של הזמן‪ ,‬באורך גל כלשהו‪ .‬ניקח סיטואציה‬
‫שבה הדגם מואר על ידי שני הבזקי אור עוקבים‪ :‬פולס ‪ pump‬אשר מרוכז סביב זמן ‪, I pump t=I 1 t ,t = 0‬‬
‫ופולס ‪ probe‬המושהה לעומתו בזמן ‪ . I probe t= I 2 t− , τ‬שינוי של מקדם בליעה אופטי לינארי‪,α ,‬‬
‫עקב חשיפת הדגם ל – ‪ pump‬יהיה‬
‫‪t‬‬
‫‪(1)  t = ∫ I 1 t '  At −t '  d t ' =I 1 t∗At .‬‬
‫∞‪−‬‬
‫הסימן * משמעותו קונוולוציה )‪ (convolution‬ו – )‪ A(t‬היא תגובת הדגם לעירור אימפולסיבי‪ ,‬קביעתה היא‬
‫לרוב המטרה של הניסוי‪ .‬בעקבות המעבר דרך הדוגמה )לפני מעבר ה – ‪ (pump‬פולס ה – ‪ probe‬מוחלש לפי‬
‫חוק ‪Beer – Lambert‬‬
‫‪40‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫‪(2) I probe =I 0, probe t exp −0 d  .‬‬
‫האות ‪ d‬מסמנת את עובי הדגם‪ .‬ה – ‪ pump‬משפיע על מקדם הבליעה‪ ,‬לכן לאחר מעברו בדגם עוצמת ה –‬
‫‪ probe‬תיחלש לפי‬
‫‪(3) I probe , with pump =I 0, probe t exp −0  t d  .‬‬
‫השינוי בעוצמת ה – ‪ probe‬הנגרם על ידי מעבר ה – ‪ pump‬בדגם הוא לפיכך‬
‫‪(4)  I probe t=I 0, probe t exp −0 d   exp − t d −1 ≈−I 0, probe t exp−0 d  t d .‬‬
‫כאשר אנו מניחים כי ההפרעה הנגרמת על ידי ה – ‪ pump‬קטנה‪ .   d ≪1 ,‬נבצע אינטגרציה לפי זמן על‬
‫העצמה על מנת לחשב את השינוי באנרגיית ה – ‪ probe‬הנגרם על ידי מעבר ה – ‪ pump‬בדגם‬
‫'‪t‬‬
‫∞‬
‫∞‬
‫‪(5)  E probe =∫  I probe t '  dt '=k ∫ I 2 t '−  dt ' ∫ I 1 t ' '  At '−t ' '  dt ' ' .‬‬
‫∞‪−‬‬
‫∞‪−‬‬
‫∞‪−‬‬
‫כלומר‬
‫‪(6) Δ E probe (τ)=k I 2 (t )⊗[ I 1 (t)∗A(t) ] .‬‬
‫משמעות הסימון ‪ ‬היא קרוס – קורלציה ) ‪ .(cross - correlation‬על ידי מעבר משתנים ניתן לשכתב את‬
‫המשוואה האחרונה ולקבל אותה בצורתה האחרת‬
‫‪(7)  E probe = At∗[ I 1 t I 2 t ]= At ∗C t .‬‬
‫הגדרנו‪:‬‬
‫∞‬
‫' ‪(8) C t = ∫ I 1 t ' I 2 tt ' dt‬‬
‫∞‪−‬‬
‫קרוס – קורלציה של פרופילי העצמה של ה – ‪ pump‬וה – ‪ .probe‬הסיגנל הנמדד בניסוי מסוג זה הוא לפיכך‬
‫ניתן על ידי קונוולוציה של תגובת המערכת עם הקרוס – קורלציה של ה – ‪ pump‬עם ה – ‪ .probe‬משוואה ‪7‬‬
‫ממחישה את הצורך בפולסים קצרים מאוד על מנת לעקוב אחר דינמיקה אולטרה מהירה של תהליכים מושרי‬
‫אור‪ .‬כל אותם התהליכים המתרחשים תוך פרק זמן קצר בהרבה מזמן הקרוס – קורלציה בין ה – ‪ pump‬ל –‬
‫‪ probe‬ימוצעו ולא יופרדו בסכמה ניסיונית זו‪.‬‬
‫דרך אחת לזקק מתוך העצמה הנמדדת של ה – ‪ probe‬את המידע אודות האבולוציה של המערכת‬
‫הנגרמת על ידי הפולס המעורר‪ ,‬היא מדידת השינוי של צפיפות האופטית של הדגם‪ ,‬כפונקציה של ההשהיה בין‬
‫שני הפולסים הללו‪ .‬צפיפות אופטית מוגדרת‪:‬‬
‫‪(9) OD =−log 10  I /I 0  .‬‬
‫החזרנו את התלות באורך גל על מנת להמחיש את האו פי ההיפרספקטרלי של הדגימה בניסויים שלנו‪ .‬השינוי‬
‫בצפיפות האופטית‪ ,‬הנגרם על ידי ה – ‪ pump‬יהיה‬
‫)‬
‫( )‬
‫)‪I probe , no pump (λ , t‬‬
‫‪I‬‬
‫)‪(λ , t‬‬
‫‪−log 10 probe , with pump‬‬
‫)‪I 0, probe ( λ , t‬‬
‫)‪I 0, probe (λ , t‬‬
‫(‬
‫‪(10) Δ OD (λ , t)=OD with pump −OD no pump =log 10‬‬
‫כאשר ‪ t‬מסמנת כאן השהיה בין ‪ pump‬ל – ‪ .probe‬מדידתו מחדש של הגודל ‪ I 0, probe  ,t ‬עבור כל נקודת‬
‫השהיה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ probe‬ושמירתו במשוואות נעשית מסיבות טכניות‪ .‬היא עוזרת לצמצם את הרעש‬
‫‪41‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫הנגרם על ידי הפלקטואציות בעצמת ה – ‪.probe‬‬
‫הסיגנל הנמדד‪ ,ΔOD ,‬תלוי בהשהיה בין ה –‬
‫‪ pump‬ל – ‪ probe‬ובאורך גל של ה – ‪ .probe‬בכל‬
‫אורך גל הגודל הזה יכול להיבנות מחפיפה של תרומות‬
‫של מספר מעברים ספקטרליים השקולים על ידי חתכי‬
‫הפעולה שלהם‪ .‬איור ‪ 42‬מראה סכמה של רמות אנרגיה‬
‫של מערכת מולקולרית‪ .‬מעברים אלקטרוניים הגורמים‬
‫לסיגנלים הניתנים למדידה בניסוי ‪pump – probe‬‬
‫מיוצגים על ידי חצים‪.‬‬
‫אכלוס מוגבר של רמות אנרגיה מעוררות על ידי ה‬
‫איור ‪ :42‬דיאגרמת רמות אנרגיה של מערכת‬
‫מולקולרית המציגה סיגנלים אשר יכולים להימדד – ‪ pump‬יגרום לכך שפולס ‪ probe‬יבלע בחלקו על ידי‬
‫בניסוי ‪.pump-probe‬‬
‫מולקולות מעוררות‪ .‬במקרה זה השינוי בצפיפות‬
‫האופטית של הדגם יהיה חיובי וסימן הסיגנל בתחום ספקטרלי המאפיין את בליעת המצב המעורר יהיה בהתאם‬
‫חיובי‪ .‬מולקולות מעוררות יכולות לדעוך למצב יסוד תוך כדי פליטה של פוטון‪ .‬פליטה זו יכולה להיות מאולצת‬
‫על ידי ה – ‪ ,probe‬לכן נצפה להגברת העצמה של ה – ‪ probe‬בתחום אורכי גל שבו מתרחשת פליטה של‬
‫המצב המעורר‪ .‬הגבר ה – ‪ probe‬משמעותו הקטנת הצפיפות האופטית של הדגם בתדרים אלה‪ ,‬הסיגנל הנובע‬
‫מפליטה מאולצת יהיה לפיכך שלילי‪ .‬לא כל סיגנל שלילי שיימדד משמעותו פליטה מאולצת של המצב המעורר‪.‬‬
‫פולס ‪ pump‬מקטין את אוכלוסיית מצב היסוד‪ ,‬מכאן שצפיפות האופטית של הדגם באורך גל המאפיין את‬
‫בליעת מצב היסוד תקטן לאחר חשיפתו ל – ‪ .pump‬שינוי שלילי של צפיפות האופטית של הדגם בתחום‬
‫ספקטרלי שבו מתרחשת בליעת מצב היסוד נקרא ‪ .ground state photobleaching‬עד כה מיינו את‬
‫הסיגנלים הנגרמים על ידי מעברים בין רמות האנרגיה השונות של הצורון המקורי של הדגם‪ .‬פוטוכימיה הנגרמת‬
‫על ידי ה – ‪ pump‬תייצר צורונים חדשים‪ ,‬אלה יבלעו באורכי גל אופייניים להם וסיגנלים נוספים יופיעו‪.‬‬
‫חפיפת סיגנלים הנובעים ממעברים שונים‪ ,‬בתחומים ספקטרליים רחבים‪ ,‬בדרך כלל מקשה על פענוח‬
‫ספקטרום הפרש בליעה טרנזיינטי‪ .102,99 Δ OD(λ , t) ,‬שיטות ספקטרוסקופיות אשר מבוססות על פלואורסנציה‬
‫מאפשרות בידוד סיגנלים הנובעים ממצב מעורר בלבד‪ ,‬אך שיטות אלה נופלות מספקטרוסקופיית בליעה‬
‫טרנזיינטית בשיטת ‪ pump – probe‬בהפרדה הזמנית שלהם ובפשטות הביצוע‪ .‬אי לכך‪ ,‬שיטת – ‪pump‬‬
‫‪ probe‬היא השיטה המועדפת עלינו לחקר דינמיקה אולטרה מהירה של תגובות פוטוכימיות‪.‬‬
‫גילוי דינמיקה ויברציונית באמצעות ספקטרוסקופיה אלקטרונית אולטרה מהירה‪.‬‬
‫עירור של מולקולה על ידי קרינה רחבת פס‪ ,‬ממשטח אלקטרוני יסודי )‪ (S0‬לאחד המשטחים הקושרים‬
‫הגבוהים )‪ ,( Sn‬מוליד חלוקה מסוימת של אוכלוסיה ברמות ויברציוניות של אותו המשטח המעורר‪ .‬התנאי לכך‬
‫שהאוכלוסיה המעוררת תתחלק בין מספר רמות הוא שוני בין גאומטריות מולקולריות בשווי משקל של שני‬
‫המצבים האלקטרוניים‪ .‬מקדמי ‪ ,Franck – Condon‬כלומר סכום אינטגרלי חפיפה של פונקציות גל‬
‫ויברציוניות של משטח יסוד אלקטרוני )הסכימה היא על הרמות הויברציוניות המאוכלסות של משטח היסוד( עם‬
‫‪42‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫פונקציית גל ויברציונית רלוונטית של המשטח המעורר‪ ,‬קובעים מה תהיה מידת האכלוס של רמה ויברציונית של‬
‫מצב אלקטרוני מעורר ביחס לרמות אחרות שלו‪ .‬ספקטרום ה – ‪ pump‬בניסויי ‪ ultrafast‬נדרש להיות רחב‬
‫תדר‪ ,‬הרי שבין רוחב הפולס במרחב התדר לבין משכו המינימלי מתקיים קשר של טרנספורם פורייה‪ .‬לכן המעבר‬
‫ממשטח יסוד למשטח מעורר‪ ,‬הנגרם על ידי ה – ‪ pump‬יהיה מעבר מהסוג המתואר‪ ,‬קרי מעבר ויברוני אשר‬
‫מערב מספר רמות ויברציוניות של ה – ‪ manifold‬העליון‪.‬‬
‫השאלה המתבקשת היא מהן ההשלכות של אורך הפולס המעורר על האופי של אותה התפלגות‬
‫אוכלוסיה לפי רמות ויברציוניות של המצב האלקטרוני העליון המיוצרת על ידו? תשובה לשאלה זו תלויה‬
‫במשך פולס ה – ‪ , τ pump , pump‬ביחס לזמן המחזור של ויברציה של המולקולה המעוררת‪ . T vibration ,‬אם‬
‫מתקיים תנאי האימפולסיביות‪ , τ pump <T vibration ,‬אזי לחבילת גלים ויברציונית אשר ממוקמת על משטח‬
‫פוטנציאל אלקטרוני מעורר על ידי ה – ‪ pump‬יהיה אופי לא סטציונרי‪ ,‬ויברציות של אוסף המולקולות‬
‫המעוררות יהיו מתואמות מופע‪ .‬למעבר אימפולסיבי של אוכלוסיה ממצב יסוד אלקטרוני לאחד המצבים‬
‫המעוררים יש השלכות גם על המתרחש במשטח היסוד‪ .‬הפולס המעורר "שורף חור דינמי" בחבילת הגלים‬
‫הויברציונית הסטציונרית )בהתחלה( של מצב היסוד‪ .‬חבילת הגלים ה"מחוררת" הזו ניתנת למעשה על ידי‬
‫סופרפוזיציה של מצבים ויברציוניים‪ ,‬היא לא סטציונרית ומתפתחת בזמן לפי ההמילטוניאן של משטח היסוד‪.‬‬
‫ההתפתחות שלה קוהרנטית במונחי האוסף המולקולרי‪.‬‬
‫הופעה של ‪ coherences‬ויברציוניים במצב יסוד של מולקולות בעקבות אינטראקציה שלהן עם פולס‬
‫אור קצר יכולה להתרחש גם ללא עירור אלקטרוני‪ .‬תנאי האימפולסיביות צריך להתקיים גם במקרה זה‪ ,‬משך ה –‬
‫‪ pump‬צריך להיות קצר יותר מזמן מחזור של ויברציה של מולקולה במצב יסוד אלקטרוני שלה‪ .‬מנגנון היצירה‬
‫של ה – ‪ coherences‬במקרה זה מבוסס על אינטראקציית אור – חומר המערבת שלושה פוטונים ונקרא )‬
‫‪ .Impulsive Stimulated Raman Scattering (ISRS‬בגבול האימפולסיבי של תהליך ראמן מאולץ‬
‫ויברציות של מולקולות אשר גורמות לפיזור ‪ ,Stokes‬כלומר אלה הקולטות אנרגיה בשיעור קוונטום ויברציוני‬
‫אחד משדה הקרינה )לייזר(‪ ,‬יהיו מתואמות מופע‪ .‬שלושה פוטונים משתתפים בתהליך פיזור ראמן מאולץ‪ ,‬כאשר‬
‫הפרש האנרגיות של הפוטון ה"נבלע" לפוטון מתפזר שווה בגודלו לקוונטום ויברציוני אחד של מולקולה‪ .‬פוטון‬
‫ראשון "מעורר" את המולקולה לרמה וירטואלית )תכף נתייחס למקרה של פיזור ראמן רזונטיבי(‪ ,‬פוטון שני‬
‫מאלץ פליטה מרמה זו לרמה ויברציונית מעוררת שלה והפוטון השלישי הוא הפוטון ה"נפלט"‪ .‬במקרה בו‬
‫הפולס המעורר רחב תדר‪ ,‬שני הפוטונים המאלץ וה"נבלע"‪ ,‬זמינים ומצויים בשדה הקרינה‪.‬‬
‫במקרה בו השדה המעורר מכיל תדרים רזונטיביים עם מעבר ‪ S 0 → S n‬של מולקולה מדברים על‬
‫תהליך של פיזור ראמן רזונטיבי מאולץ‪Resonant Impulsive Stimulated Raman Scattering ) :‬‬
‫‪ .(RISRS‬ניתן להבין תהליך זה במונחי ‪ ISRS‬כאשר הרמה הוירטואלית מוחלפת ברמה אלקטרונית אמתית‬
‫של המולקולה‪ .‬אוכלוסיה מועברת ל – ‪ Sn‬על ידי פוטון ראשון ומונחתת בחזרה לרמה ויברציונית מעוררת‬
‫ראשונה של ‪ S0‬על ידי פוטון שני‪ ,‬תוך כדי פליטת פוטון שלישי הזהה לשני‪ .‬בגבול העירור הרזונטיבי כל המעבר‬
‫הזה מתרחש בסקלת זמנים שבה הגרעינים אינם מספיקים לזוז‪ .‬כתוצאה מאינטראקציה של המולקולה עם שדה‬
‫הקרינה נוצרת חבילת גלים לא סטציונרית קוהרנטית על גבי משטח אלקטרוני תחתון שלה‪ .‬תנודות חבילה זו‬
‫יהיו מתואמות פאזה בין המולקולות המרכיבות את האוסף המגיב לשדה הלייזר‪ .‬ההבדל בין ‪ ISRS‬ל –‬
‫‪43‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫‪ RISRS‬הוא שבמהלך אינטראקציה עם שדה קרינה רזונטיבי‪ ,‬מספר כזה או אחר של מולקולות יעוררו‪ .‬מכאן‬
‫שיש צורך להתחשב בזה שה – ‪ coherences‬במצב יסוד במקרה הרזונטיבי ייתרמו גם על ידי מעבר אוכלוסיה‬
‫אימפולסיבי וגם על ידי פיזור ראמן מאולץ‪.109,108‬‬
‫אוסף מולקולות הרוטטות תוך כדי שמירת קשר פאזה לא יישאר במצב זה לנצח‪ .‬לכל התופעות‬
‫הקוהרנטיות זמן אופייני של איבוד קשר מופע ) ‪ (dephasing‬ולתוצאה של תהליך זה קוראים ‪.decoherence‬‬
‫הסיבות ל – ‪ dephasing‬הן דעיכה של המולקולות המעוררות למצב היסוד הויברציוני )מעבר אנרגיה לדרגות‬
‫חופש אחרות( וחלוקה מחדש של אנרגיה בין מולקולות מעוררות ויברציונית )פיזורים אלסטיים(‪ .‬זמן‬
‫‪ dephasing‬ויברציוני אופייני לפאזות מעובות הוא פיקושניות בודדות‪.‬‬
‫ספקטרוסקופיה ויברציונית אימפולסיבית )‪ Impulsive Vibrational Spectroscopy (IVS‬היא‬
‫שיטה ניסיונית אשר הוצעה ככלי אשר מסוגל לפענח דינמיקה ויברציונית של מולקולות מעוררות אלקטרונית ‪.110‬‬
‫שיטה זו מבוססת על יכולת לגלות את אותם ה – ‪ coherences‬המיוצרים על ידי ה – ‪ .pump‬ניקח מקרה של‬
‫בליעה‪/‬פליטה של מצב מעורר כלשהו בתור דוגמה‪ .‬חבילת גלים ויברציונית לא סטציונרית המבצעת תנועה‬
‫מחזורית )האופיינית למצבים קוהרנטיים( סביב מצב שווי המשקל של קואורדינטה נורמלית מסוימת ‪ Q0‬על גבי‬
‫משטח מעורר תופיע ותיעלם באופן מחזורי‪ ,‬בתדר האוסצילציה שלה‪ ,‬מחלון ‪ Franck – Condon‬לבליעה או‬
‫פליטה המוגדר על ידי תחום מסוים של אורכי גל של ה – ‪ .probe‬בעקבות כך‪ ,‬צפיפות האופטית של הדגם‬
‫תשתנה באופן מחזורי כפונקציה של זמן ההשהיה )ושל אורך גל כמובן( ועצמת ה – ‪ probe‬הנמדדת תשתנה גם‬
‫היא‪ .‬תדר המודולציה של עצמת ה – ‪ probe‬יהיה זהה לתדר האוסצילציה של חבילת הגלים בקצוות פס‬
‫הבליעה‪/‬פליטה וכפול מתדר האוסצילציה שלה במרכז הפס‪ .‬כמו כן‪ ,‬יהיה הפרש מופע של ‪ π‬בין המודולציות‬
‫בשני הקצוות של הפס‪ .‬המגבלה של ‪ IVS‬היא שעירור אלקטרוני אימפולסיבי מסוגל לייצר ‪ coherences‬גם‬
‫על המשטח האלקטרוני המעורר וגם על משטח היסוד ומודולציות בעצמת ה – ‪ probe‬יכולות לנבוע‬
‫מהדינמיקה הויברציונית על שני המשטחים הללו‪ ,‬ברגע שה – ‪ probe‬מצמד את שניהם‪ .‬מכאן ששיוך דינמיקה‬
‫ויברציונית למצב אלקטרוני מסוים הוא לא פשוט ומצריך מלאכת מחשבת‪.‬‬
‫מערכת לייזר מתוצרת עצמית ליצירת פולסי אור אולטרה קצרים‪.‬‬
‫משכם המינימלי של פולסי אור ממקור פועם צר פס יהיה מוגבל על ידי רוחבו‪ ,‬ניתן להיווכח בזאת על‬
‫ידי מיפוי הספקטרום של אותו המקור לזמן הבזק מינימלי על ידי טרנספורם פורייה‪ .‬נניח כי המקור מתאפיין‬
‫בספקטרום גאוסי ממורכז סביב ‪ ω0‬ובעל רוחב ‪ Δ ω‬בחצי הגובה )‪(FWHM‬‬
‫‪.‬‬
‫}‬
‫])‪[−(ω−ω0 )2 4 ln( 2‬‬
‫‪(Δ ω)2‬‬
‫{‬
‫‪(11) E (ω)= Aexp‬‬
‫הטרנספורם למרחב הזמן נותן את )‪E (t‬‬
‫‪.‬‬
‫}‬
‫‪(Δ ω)2‬‬
‫‪+i ω0 t‬‬
‫] )‪[ 16 ln( 2‬‬
‫{‬
‫‪(12) E (t)=B exp −t 2‬‬
‫מכאן שהקשר בין הרוחב הספקטרלי של הפולס‪ , Δ ω ,‬לבין המשך המינימלי שלו בזמן‪) Δ t ,‬כאשר גם כאן‬
‫הכוונה היא ל – ‪ FWHM‬של פונקציית המעטפת של השדה בזמן(‪ ,‬ניתן על ידי‬
‫‪44‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫‪(13) Δ ω(Δ t) E=8ln (2) .‬‬
‫מכיוון שהערך הנמדד הוא עצמת הפולס‪ , I ( t) ,‬ולא השדה החשמלי‪ ,‬נקשר בין הרוחב הספקטרלי לבין משך‬
‫הזמן שבו העצמה הנמדדת של פולס גאוסי מכווץ גבוהה ממחצית העצמה המקסימלית שלו‬
‫)‪ Δ ω(Δ t) I =4 ln( 2) (14‬או )‪Δ ν (Δ t) I =0.4413 (15‬‬
‫על מנת לייצר פולס גאוסי באורך ‪ 20fs‬רוחב מינימלי של ספקטרום המקור צריך להיות ‪ 2.21×1013 Hz‬מה‬
‫שמתורגם ל – ‪ FWHM‬של ‪ 46nm‬עבור ספקטרום ממורכז סביב ‪.790nm‬‬
‫ספקטרום רחב של המקור הוא תנאי הכרחי אך לא‬
‫מספיק ליצירת פולסים אולטרה קצרים‪ .‬מקור אור רחב פס‬
‫ללא קשר מופע מוגדר בין רכיבים ספקטרליים שלו יהיה‬
‫רציף בזמן ולא פולסי )שמש(‪ .‬על מנת ליצור פולסי אור‬
‫אולטרה קצרים יש צורך במקור אשר מתאפיין ברוחב פס‬
‫מספיק וגם בקשר פאזה מוגדר בין רכיבים ספקטרליים שלו‬
‫איור ‪ :43‬תוצאה של ‪ mode - locking‬היא מופע )רכיבי פורייה(‪.‬‬
‫מוגדר וקבוע של אופני הלייזר ביחס אחד לשני‪.‬‬
‫אופן הפעלה של לייזר שבו מושג הפרש פאזה‬
‫קבוע בין אופנים אורכיים שלו נקרא "נעילת אופנים" ‪) mode – locking‬איור ‪ .111(43‬דרך אחת‪ ,‬פשוטה‬
‫יחסית‪" ,‬לנעול" את האופנים האורכיים של לייזר היא על ידי הוספת אלמנט אופטי פסיבי בין מראות הקצה של‬
‫ה – ‪ . cavity‬תפקידו של אלמנט זה הוא להקשיח את תנאי המהוד באופן כזה שתוצאת הסופרפוזיציה של‬
‫האופנים שלו תהיה פולס עצמתי יחיד המסתובב הלוך ושוב בין מראות הקצה של המהוד‪ .‬אלמנט זה נקרא‬
‫"בולען מתרווה" )‪ .( saturable absorber‬הוא עשוי מחומר בעל תכונות בליעה לא לינאריות אשר גורמות לו‬
‫להעביר אור בעצמות רגעיות גבוהות‪ ,‬המאפיינות לייזר נעול אופנים ולבלוע אור בעוצמות נמוכות המיוצרות על‬
‫ידו באופן הפעלה רציף )‪ .(continuous wave‬ברגע שמהוד המכיל בולען מתרווה עבר אופטימיזציה ויכול‬
‫לתמוך בכל האופנים הרלוונטיים אשר בונים את הפולס הקצר )בדרך כלל אופטימיזציה של המהוד ל – ‪mode‬‬
‫‪ locking‬גורמת ללזירה רציפה להיות לא יציבה(‪ ,‬הפרעה בצורת הזזה קדימה ואחורה של אחת ממראות הקצה‬
‫מקריסה את הלייזר למצב ‪.mode – locked‬‬
‫לייזר הפמטושניות במערכת הניסיונית שלנו מבוסס על אפקט נעילת אופנים עצמית – ‪self mode‬‬
‫‪ locking‬בתווך לוזר עצמו שהוא גביש קורונדום מאלח בטיטניום‪ Ti:Al2O3 :‬הנשאב על ידי לייזר‬
‫‪ Nd:YVO‬מסחרי‪ ,‬מוכפל תדר )הספקו ‪ 3.7W‬ב – ‪ .112(532nm‬מדובר בלייזר ארבע רמות‪ ,‬התווך הלוזר שלו‬
‫עונה על דרישת רוחב פס בזכות ספקטרום ‪ gain‬רחב )‪ ,1000nm – 650‬ממורכז סביב ‪ ,(790nm‬כמו כן הוא‬
‫מתאפיין בהולכת חום טובה ולכן עמיד לאורך זמן בעוצמת שאיבה גבוהה‪ .‬אפקט נעילת האופנים העצמית של‬
‫לייזר ‪ Ti:sapphire‬התגלה בשנות ה – ‪ 90‬ומאז לייזרים אלה הם האמצעי הנפוץ ביותר בעולם ליצירת פולסי‬
‫אור אולטרה קצרים‪ .‬בסיס הפעולה של נעילת אופנים שלו הוא מודולציה מרחבית של אינדקס השבירה של‬
‫הגביש על ידי שדה אור עצמתי‪ ,‬ספציפית ‪ .Optical Kerr Effect‬עצמה של קרן לייזר אשר נשלטת על ידי‬
‫אופן מרחבי ‪ TEM00‬דועכת גאוסית אם התרחקות ממרכזה‪ .‬אי לכך‪ ,‬אינדקס השבירה של הגביש יהיה גבוה‬
‫באזור מרכז קרן כזאת ונמוך בשוליה‪ .‬אפקטיבית‪ ,‬תיווצר עדשה ) ‪ (Kerr – lens‬בדרכה של קרן עצמתית בתוך‬
‫‪45‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :44‬סכמת אוסצילטור ‪ Ti:sapphire‬במערכת שלנו‪.‬‬
‫הגביש והיא מתפקדת בתור האלמנט אשר משנה את תנאי המהוד לטובת ה – ‪ .mode locking‬ניתן לגרום‬
‫לעדשת ‪ Kerr‬כזאת לתפקד בתור סוג של בולען מתרווה על ידי הוספת חריר קטן )‪ (aperture‬סמוך לגביש‪,‬‬
‫החריר יחסום קרן רציפה‪ ,‬לא ממוקדת ויעביר קרן ממוקדת של לייזר ‪ Ti:sapphire‬נעול אופנים‪ .‬שיטת נעילת‬
‫אופנים זו נקראת ‪ .Hard aperture Kerr – lens mode locking‬מאידך‪ ,‬אפשר לתכנן את המהוד באופן‬
‫כזה שקרן לא ממוקדת בתוך הגביש לא תחפוף טוב את האזור הנשאב ולכן לא תוגבר‪ ,‬כמו שנעשה במערכת‬
‫שלנו )‪.(Soft aperture Kerr – lens mode locking‬‬
‫האוסצילטור שלנו מוצג גרפית באיור ‪ .44‬הוא מתבסס על תכנון מקורי של ‪ Asaki‬וקולגות‪ .113‬תפקיד‬
‫זוג מנסרות קוורץ בתוך ה – ‪ cavity‬הוא לפצות על נפיצה )דיספרסיה( של הפולס הנגרמת לו תוך כדי מעברו‬
‫בגביש‪ .‬הגביש עצמו חתוך בזווית ‪ Brewster‬כלפי הקרן‪ ,‬בדרך זו שדה חשמלי של הפולסים המתקבלים‬
‫מקוטב מישורית במקביל לשולחן האופטי והאיבודים עקב החזרת הקרן מהפן הקדמי של הגביש ממוזערים‪.‬‬
‫המכשיר הנ"ל מפיק פולסים באורך של כ – ‪ 20fs‬ממורכזים סביב ‪ 790nm‬בתדר של ‪ ~86MHz‬הנקבע על ידי‬
‫התדר שבו הפולס המסתובב הלוך ושוב בתוך המהוד פוגע ב – ‪ output coupler‬אשר מצמד ‪ 10%‬ממנו‬
‫החוצה‪ .‬סך העצמה של הקרן המופקת היא בערך ‪ ,0.5W‬מה שנותן ‪ .5nJ/pulse‬אנרגיה של פולס יחיד קטנה‬
‫מדי לרוב האפליקציות שלנו )אנרגיה גבוהה של פולסים נדרשת לצורך הגבר פרמטרי‪ ,‬כלומר הגבר הפולסים‬
‫תוך כדי שינוי הספקטרום שלהם‪ ,‬עליו נדבר בהמשך( ולכן יש צורך להגביר את ה – ‪ output‬של האוסצילטור‪.‬‬
‫ההגבר נעשה בשיטת ‪ .Chirped Pulse Amplification‬שיטת ה – ‪ CPA‬מאפשרת הגבר של עצמת‬
‫הפולס עד חמישה סדרי גודל מבלי לגרום נזק לאלמנטים אופטיים רגישים העומדים בדרכה של הקרן‪ .106‬שלב‬
‫ראשון בסכמת הגבר זו הוא פרישת הפולס‪ ,‬באופן הפיך‪ ,‬לאורך של כ – ‪ 100ps‬בחצי הגובה על ידי הפרדה בזמן‬
‫של הרכיבים הספקטרליים שלו‪ ,‬כלומר באמצעות הכנסה מכוונת של דיספרסיה‪ .‬ניתן להשיג זאת על ידי העברה‬
‫של הפולס דרך תווך דיספרסיבי )כזה שמקדם השבירה שלו תלוי אורך גל‪ ,‬נתעלם כאן בתלות אינדקס השבירה‬
‫בעצמת האור(‪ .‬אפקט של תווך דיספרסיבי על פולס קצר העובר בו מודגם על ידי איור ‪ .45‬יש כאן שתי נקודות‬
‫איור ‪ chirp :45‬חיובי הנגרם לפולס קצר לאחר מעברו בתווך דיספרסיבי‪.‬‬
‫‪46‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫ראויות לציון‪ ( 1 :‬מרכז הפולס מושהה ביחס לפולס העובר באוויר‪ ,‬אפקט זה נקרא ‪ group delay‬והוא משהה‬
‫אך לא מרחיב את הפולס‪ ( 2 ,‬לרוב‪ ,‬תווך דיספרסיבי ישרה תלות מסוימת של תדר הפולס בזמן‪ ,‬תלות זאת נקראת‬
‫"‪ " chirp‬ועבור פולס מכווץ אשר נמתח בזמן בעקבות מעברו בזכוכית היא באה לידי ביטוי בכך שהתדר של הגל‬
‫הנושא של הפולס משתנה בזמן מנמוך לגבוה ) ‪ chirp‬חיובי(‪ .‬במושגים של גלי קול פולס כזה נשמע כמו ציוץ‬
‫של ציפור וזהו המקור למונח ‪ chirp‬בהקשר זה‪.‬‬
‫תיאור מתמטי של השפעת ה – ‪ chirp‬על הפולס מתחיל במתן ביטוי לתלות של הפאזה בתדר‪ .‬את‬
‫הפאזה ניתן לפתח לטור טיילור סביב התדר המרכזי ‪ ω0‬של הפולס‬
‫‪3‬‬
‫‪( ω−ω 0) +... .‬‬
‫) (‬
‫‪ω=ω 0‬‬
‫‪1 ∂3 ϕ‬‬
‫‪6 ∂ ω3‬‬
‫) (‬
‫‪2‬‬
‫‪( ω−ω0 ) +‬‬
‫‪ω=ω 0‬‬
‫‪1 ∂2 ϕ‬‬
‫‪2 ∂ω 2‬‬
‫בהנחה שהתלות שלה בתדר לא חריפה‪ .‬האיבר‬
‫‪0‬‬
‫‪0‬‬
‫) (‬
‫‪( ω−ω 0 )+‬‬
‫‪ω=ω 0‬‬
‫‪∂ϕ‬‬
‫‪∂ω‬‬
‫‪(16) ϕ=ϕ0 +‬‬
‫‪ ( ∂ϕ/∂ ω )ω=ω‬נקרא ‪ ,group delay‬האיבר‬
‫‪ ( ∂2 ϕ/∂ω 2) ω=ω‬הוא ) ‪ group delay dispersion (GDD‬והנגזרות מסדרים גבוהים יותר הם דיספרסיה‬
‫מסדר שלישי רבעי )‪ (TOD, FOD‬וכך הלאה‪ .‬נשתמש במונחים האלה בהמשך‪.‬‬
‫נוח לנתח את השפעת הפאזה הספקטרלית על הפולס בזמן תוך כדי התייחסות לכל איבר בנפרד‪ .‬ברור‬
‫שלהוספת איבר קבוע לפאזה לא תהיה השפעה על רוחב הפולס בזמן‪ ,‬הוספתו אקוויוולנטית להכפלת כל הביטוי‬
‫בקבוע קומפלקסי‪.‬‬
‫‪).‬‬
‫‪−a 2 t 2‬‬
‫‪+i ϕ0+it ω 0‬‬
‫‪2‬‬
‫])‬
‫(‬
‫‪+i ϕ0 = B exp‬‬
‫‪−(ω−ω 0)2‬‬
‫‪2a 2‬‬
‫( [‬
‫‪(17) F.T. A exp‬‬
‫נכניס את ה – ‪ ϕ1=( ∂ ϕ/∂ ω )ω=ω ,group delay‬ונקבל‬
‫‪0‬‬
‫‪.‬‬
‫)‬
‫(‬
‫])‬
‫‪−a 2 (t+ϕ1)2‬‬
‫‪+i ϕ1 (ω−ω0 ) =B exp‬‬
‫‪+it ω0‬‬
‫‪2‬‬
‫‪−(ω−ω 0)2‬‬
‫‪2a 2‬‬
‫( [‬
‫‪(18) F.T. A exp‬‬
‫רואים הסט של כל הפולס בזמן ללא הרחבה‪ ,‬כיוון ההסט תלוי בסימן של ‪ .φ1‬שלב הבא הוא בדיקת ההשפעה‬
‫של ‪GDD‬‬
‫])‬
‫) ‪=E (t‬‬
‫‪.‬‬
‫))‬
‫‪2‬‬
‫)‪+i ϕ2 (ω−ω 0‬‬
‫(‬
‫‪1‬‬
‫)‪+i t ω 0+ arctan ( 2 a 2 ϕ2‬‬
‫‪2‬‬
‫( [‬
‫(‬
‫( (‬
‫‪−(ω−ω0)2‬‬
‫‪2a 2‬‬
‫‪F.T. A exp‬‬
‫) ‪−( at)2 1+2 i a 2 ϕ2‬‬
‫)‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪2 1+4 (a ϕ2‬‬
‫)‪(19‬‬
‫‪E (t)=B exp‬‬
‫הביטוי המלא יתקבל כאשר נוסיף את ה – ‪ group delay‬ואת הפאזה הקבועה‪ .‬רואים שרוחב פונקציית מעטפת‬
‫שדה חשמלי בזמן הוא כעת‬
‫‪.‬‬
‫)‪(1+4 a 4 ϕ22) 8 ln( 2‬‬
‫‪a2‬‬
‫מכיוון ש – ) )‪ a 2=(Δ ω)2 /( 8ln( 2‬נקבל‬
‫‪47‬‬
‫√‬
‫= ‪(20) ( Δ t )E , new‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫‪2‬‬
‫‪.‬‬
‫)‬
‫(‬
‫√‬
‫‪2‬‬
‫)‬
‫‪2‬‬
‫)‪8 ln (2‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪8 ln( 2‬‬
‫‪+4 ((Δ ω)ϕ2 ) = ( ( Δ t )E , old ) +4 ϕ22‬‬
‫‪Δω‬‬
‫‪( Δ t ) E ,old‬‬
‫(√‬
‫=‪(21) ( Δ t )E , new=2 ( Δ t )I , new‬‬
‫אפקט ה – ‪ GDD‬על רוחב הפולס הסופי כפונקציה של רוחבו ההתחלתי הוא כדלהלן‪ :‬ככל שהרוחב ההתחלתי‬
‫של הפולס גדול יותר האיבר השני מתחת לשורש במשוואה האחרונה נהיה קטן יותר ובגבול ∞ → ‪(Δ t)old‬‬
‫מקבלים ‪ . (Δ t)new =(Δ t)old‬בגבול השני‪ , (Δ t)old → 0 ,‬התנהגות הרוחב הסופי של הפולס תהיה‬
‫‪ . (Δ t)new =16 ln (2) ϕ2 /( Δ t )old‬כמו כן‪ ,‬אם נסתכל על משוואה מס' ‪ 19‬נראה באקספוננט איבר מרוכב‬
‫מתכונתי ל – ‪ . t 2‬זהו האיבר אשר מבטא תלות לינארית של תדר הפולס בזמן‪ ,‬כלומר הוא הגורם ל – ‪.chirp‬‬
‫הסימן של ‪ φ2‬יקבע אם ה – ‪ chirp‬יהיה חיובי או שלילי‪.‬‬
‫הארכת פולסים באמצעות מעבר הקרן בתווך דיספרסיבי היא לא ברירת המחדל בסכמת ה – ‪,CPA‬‬
‫סדרים גבוהים של דיספרסיה המוכנסים ל – )‪ φ(ω‬של הפולס בדרך זו יקנו תלות מורכבת של תדר גל הנושא‬
‫שלו בזמן‪ .‬הרבה יותר פשוט להפריד מרחבית את הרכיבים הספקטרליים של הפולס ולגרום להם לעבור דרך‬
‫אופטית שונה באוויר‪ .‬ניתן בקלות לעשות זאת על ידי זוג סריגים‪ ,‬כפי שמוצג באיור ‪ 46‬המסכם את שיטת ה –‬
‫‪ .CPA‬לרוב‪ ,‬לאחר מתיחת הפולסים השלב הבא בסכמת ההגבר הוא הנמכת תדירות ה – ‪ ,pulse train‬זאת כי‬
‫אין לנו אפשרות וצורך מעשי להגביר את כל ‪ 86‬מיליון פולסים המיוצרים על ידי האוסצילטור בשנייה‪ .‬לאחר‬
‫הדילול‪ ,‬הפולסים מוגברים ובסוף מכווצים בחזרה‪.‬‬
‫פורש הפולסים במערכת שלנו )המוצג סכמטית באיור ‪ (47‬מבוסס על ארבע פגיעות של הפולס בסריג‬
‫יחיד ) ‪ ( 1200 lines /mm‬כאשר מטרת שתי הפגיעות הראשונות היא למתוח את הפולס בזמן ושתיים האחרונות‬
‫מתקנות את הדיספרסיה המרחבית אשר מוכנסת בפגיעות הראשונות‪ .‬בנוסף הפורש מכיל מראה פרבולית בעלת‬
‫אורך מוקד של ‪ 61cm‬ושתי מראות זהב מישוריות )מראות עם ציפוי זהב יעילות במיוחד בהחזרת אור אינפרה‬
‫אדום קרוב(‪ .‬מטרת תכנון זה של הפורש היא להכריח את אורכי הגל הקצרים של הפולס לעבור דרך אופטית‬
‫ארוכה יותר )משמעות הפרש בין דרכים אופטיות של ‪ 10cm‬באוויר עבור תדרי הקצה של הפולס גאוסי מכווץ‬
‫היא מתיחתו ליותר מ – ‪ 100ps‬בחצי גובהו(‪.‬‬
‫איור ‪Chirped Pulse Amplification :46‬‬
‫‪48‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :47‬פורש הפולסים ) ‪.(stretcher‬‬
‫הנמכת תדר ה – ‪ output‬של לייזר פמטושניות שלנו נעשית ב – ‪ single pulse selector‬תפקיד‬
‫מכשיר זה‪ ,‬כפי ששמו מרמז‪ ,‬הוא לבודד פולס יחיד ליחידת זמן מתוך ה – ‪ pulse train‬הצפוף המופק‬
‫מהאוסצילטור‪ .‬שיטת בחירת הפולס היחיד מתבססת על היכולת שלנו לשנות את קיטובו באמצעות העברתו דרך‬
‫גביש אלקטרו – אופטי )‪ .(Pockel's cell‬הגביש מתפקד כלוחית חצי גל ) ‪ ( λ /2 waveplate‬הודות ל –‬
‫‪ birefringence‬שלו‪ ,‬המושרה על ידי שדה חשמלי חיצוני‪ .‬הקיטוב של הפולס משתנה ב – ‪ 90°‬בעוברו דרך‬
‫הגביש ועקב כך הוא לא נחסם על ידי מקטב המוצב בפתח היציאה מה – ‪ .Pockel's cell‬על מנת שבורר‬
‫הפולסים לא יהפוך את הקיטוב שלהם לצמיתות‪ ,‬לוחית גל נוספת הופכת את הקיטוב של ה – ‪ pulse train‬טרם‬
‫כניסתו לבורר‪ ,‬בדרך זו הקיטוב של הפולס הנבחר לא משתנה‪ .‬הפעלת מתח בתדר רצוי על הגביש ובמשך זמן‬
‫המאפשר היפוך קיטוב של פולס יחיד בכל הפעלה תקבע את תדר ה – ‪ .output‬לצורך הניסוי שלנו התדר הונמך‬
‫מ – ‪ 86MHz‬ל – ‪.460Hz‬‬
‫פרישה בזמן ודילול ה – ‪ pulse train‬מאפשרים את ההגברה של הפולסים הנבחרים‪ .‬מגבר מהסוג‬
‫המשמש אותנו נקרא ‪ Multipass ampliﬁer‬זאת כי ההגבר מתבצע תוך כדי מספר מעברים של הפולס בתוך‬
‫גביש ‪) Ti:sapphire‬תשעה מעברים במגבר שלנו(‪ ,‬המשמש תווך ‪ gain‬לצורך ההגבר‪ .‬בחירה של‬
‫‪ Ti:sapphire‬למטרה זו היא טבעית‪ ,‬יש לו רוויית הגבר גבוהה וזמן אחסון ארוך של האוכלוסיה הלוזרת‪.‬‬
‫הגביש של המגבר נשאב על ידי לייזר ‪ Nd:Yag‬פועם )‪ (Q – switched‬אשר מופעל בתדר ה – ‪pulse train‬‬
‫המופק מבורר הפולסים )‪ .(460Hz‬פעימה אחת של הלייזר השואב נמשכת כ – ‪ ,200ns‬זמן הדרוש לפולס יחיד‬
‫להשלים תשעה מעברים בתוך הגביש‪ .‬תשעת המעברים הללו מגבירים את הפולס לרמת רוויה ואין טעם להעביר‬
‫אותו בגביש פעמים נוספות‪ .‬לקראת המעבר העשירי הפולס נקטף על ידי מראה ) איור ‪ (48‬ונזרק החוצה‬
‫מהמגבר‪ .‬תפקיד המסכה המורכבת מסדרה של חרירים עגולים‪ ,‬דרכם נאלץ הפולס לעבור בכל אחד מהמעברים‬
‫איור ‪.Multipass – ampliﬁer arrangement :48‬‬
‫‪49‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :49‬מכווצי פולסים‪ .‬מימין‪ :‬מכווץ מבוסס פריזמות של האו סצילטור‪ .‬משמאל‪ :‬מכווץ מבוסס סריגים‪ ,‬שלב אחרון‬
‫בסכמת ‪ CPA‬שלנו‪.‬‬
‫שלו‪ ,‬הוא לשמור על גודל מוקד קבוע בתוך הגביש בכל אחד מהם )גודל מוקד של קרן לייזר גאוסית תלוי בזווית‬
‫ההתכנסות של הקרן‪ ,‬זווית התכנסות קטנה יותר משמעותה מוקד גדול יותר(‪ .‬האנרגיה הסופית של הפולסים‬
‫לאחר ההגברה )ביציאה מה – ‪ (compressor‬היא ‪) 0.3mJ/pulse‬בניסוי שלנו(‪.114‬‬
‫לאחר ההגבר יש צורך לכווץ בחזרה את הפולסים הפרושים‪ .‬הכיווץ נעשה באמצעות שני סריגים )בעלי‬
‫‪ ( 1200 lines /mm‬המוצבים באופן כזה שמאלץ רכיבים ספקטרליים אדומים של הפולס לעבור דרך אופטית‬
‫ארוכה יותר )איור ‪ ,(49‬כך שהמערך הזה מיועד להכניס ‪ chirp‬שלילי לפולסים אשר עוברים דרכו )במידה והם‬
‫מכווצים מלכתחילה(‪ .‬המרחק בין הסריגים הוא פרמטר שאנחנו שולטים עליו ובכך ביכולתנו להקנות הפרש‬
‫דרכים יחסי שונה בין אורכי גל הכחולים לאדומים של הפולס‪ .‬מכאן שיכולת שינוי המרחק בין הסריגים‬
‫משמעותה שליטה במידת הכיווץ של הפולס‪ .‬הנתון הסופי לאחר ה – ‪ CPA‬של רוחב במחצית הגובה של‬
‫פרופיל העצמה של הפולסים בזמן הוא ‪ .~ 30fs‬נציין כי קיימים פורשים וגם מכווצים של פולסים מבוססים על‬
‫זוג פריזמות )שתי הפריזמות באוסצילטור מתפקדות כמכווץ(‪ .‬אופן הפעולה במקרה זה מבוסס על מתן הפרש‬
‫דרכים אופטיות לרכיבים ספקטרליים של הפולס במנסרות עצמן )איור ‪ ,49‬חלק ימין( ולכן ה – ‪ chirp‬שנגרם‬
‫לפולס בעקבות מעבר בפורש מנסרות יהיה שונה‪ ,‬הפריזמות מכניסות יותר ‪ TOD‬מ – ‪ GDD‬לפאזת פולס‬
‫הממורכז סביב ‪ 800nm‬ולכן זוג סריגים לא יכווץ ביעילות פולס אשר נפרש על ידי זוג פריזמות‪ .‬לעומת זה‪,‬‬
‫שילוב של סריגים ופריזמות בשלב הכיווץ בסכמת ה – ‪ CPA‬יכול להיות יעיל מאוד‪.106‬‬
‫המרת אור‪.‬‬
‫בתנאים רגילים אינטראקציה בין חומר לקרינה ניתנת לתיאור במונחים של אינדקס שבירה לינארי‪ .‬רק‬
‫עם המצאת הלייזר בשנות השישים מקורות אור הגיעו לעצמות המסוגלות לגרום לסטייה ניתנת למדידה של‬
‫תגובת תווך דיאלקטרי מהתנהגות לינארית ולהכריחה להיות תלויה בעצמת הקרינה‪ .‬לייזרים נעולי אופנים‬
‫מייצרים שטפים רגעיים העולים בסדרי גודל רבים על אלה של המקורות הקוהרנטיים הרציפים‪ ,‬כלומר לצורך‬
‫מתן תיאור של תוצאת אינטראקציה של פולס אולטרה – קצר של לייזר כזה עם חומר הפנייה לאופטיקה לא‬
‫לינארית היא הכרחית‪ .‬בתחום זה נהוג לתאר את התגובה של החומר לאור באמצעות פרישה של הפולריזציה‬
‫שלו )צפיפות מומנטי דיפול מושרים‪/‬קבועים ליחידת נפח( לטור טיילור של חזקות השדה המשרה‬
‫‪50‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫)‪(1‬‬
‫)‪(2‬‬
‫)‪(3‬‬
‫‪(22) P i /ϵ0=∑ χ ij E j+∑ χ ijk E j E k +∑ χ ijkl E j E k E l +... .‬‬
‫‪jk‬‬
‫‪jkl‬‬
‫‪j‬‬
‫קירוב זה ייפול בשדות חזקים מאוד‪ ,‬המשתווים בגודלם לשדות האינטרינזיים של אטומי התווך‪ .‬המקדמים ) ‪χ(n‬‬
‫מתייחסים לטנזורי הסוספטיביליות החשמלית של החומר עבור תהליכים לא לינאריים )תהליכים רב פוטוניים(‬
‫מסדר ‪ .n‬איבר הסוספטיביליות מסדר שני‪ , χ(2 ) ,‬עומד מאחורי תופעות כמו ‪ ,Pockel's effect‬יישור אופטי )‬
‫‪ ,(Optical Rectification‬והכפלת תדר ) ‪ (Second Harmonic Generation – SHG‬ואילו איבר מסדר‬
‫שלישי‪ , χ(3) ,‬מייצר את אפקט ‪ ,Kerr‬את אפקט ‪ Raman‬ואת המודולציה העצמית של הפאזה ) ‪Self Phase‬‬
‫‪ ( Modulation SPM‬של פולס אולטרה – קצר עצמתי‪ ,‬אפקט המרחיב מאוד את ספקטרום של הפולס הידוע‬
‫גם כ"יצירת אור לבן" )‪.(super continuum generation‬‬
‫יכולת הקרן המוגברת של לייזר ‪ Ti:sapphire‬נעול אופנים לחולל תגובה לא לינארית בחומר בו היא‬
‫עוברת מאפשרת את המרת הספקטרום שלה‪ .‬לצרכים שלנו ההמרה היא הכרחית‪ ,‬לרודופסינים ארכיאליים‬
‫ספקטרה בליעה אופייניים הנמצאים מחוץ לתחום פס ה – ‪ gain‬של האוסצילטור )ספקטרה אלה מוצגים באיור‬
‫‪ .( 4‬אי לכך‪ ,‬לא נוכל לעורר את החלבונים הללו ישירות באמצעות ה – ‪ output‬של הלייזר שלנו‪ .‬שיטה‬
‫ורסטילית ביותר שבה השתמשנו לצורך שינוי ספקטרום הפולסים שלנו מאזור ‪ 800nm‬לאזור ‪ 570nm‬נקראת‬
‫הגבר אופטי פרמטרי ) ‪ ,Optical Parametric Amplification (OPA‬בנוסף השתמשנו ביצירת אור לבן‬
‫ובהכפלת תדר פשוטה‪ ,‬אותה נתאר כעת‪.‬‬
‫כפי שאמרנו‪ ,‬דרישה בסיסית להכפלת תדר היא הופעה של איבר מתכונתי לריבוע השדה בביטוי עבור‬
‫הפולריזציה‪ .‬איבר זה מתאפס בחומרים סימטריים ביחס לפעולת האינוורסיה‪ ,‬בפרט בחומרים איזוטרופיים‪.‬‬
‫פעולה האינוורסיה משנה את כוון השדה החשמלי ב – ‪ ,180°‬כלומר ) ⃗‬
‫‪ , ⃗E →(−E‬משמעות היפוך השדה היא‬
‫שכל האברים מסדר זוגי בביטוי עבור ‪ P‬משמרים סימן ואלה מסדר אי זוגי משנים סימן‪ .‬בעקבות היפוך השדה‬
‫בחומר סימטרי ביחס לאינוורסיה הפולריזציה הכוללת חייבת להתהפך גם היא‪ ,‬כלומר צריך להתקיים‬
‫) ‪ . ⃗P →(− ⃗P‬אם נדרוש זאת ונכפיל את כל הטור ב – )‪ (−1‬נקבל שהאברים הזוגיים משמרים סימן‪ ,‬ביחס‬
‫למצב ההתחלתי‪ ,‬והאי זוגיים משנים אותו‪ .‬על מנת שיתקיים כנדרש ) ‪ ⃗P →(− ⃗P‬האברים הזוגיים צריכים‬
‫להתאפס‪ .‬המשמעות של זה היא שהכפלת תדר אפשרית רק בסוג מסוים של גבישים לא לינאריים‪ .‬בניסוי שלנו‬
‫השתמשנו בגביש ‪ β BaBO4‬הידוע יותר תחת ראשי התיבות שלו‪ .BBO ,‬חומר זה שקוף בנראה‪ ,‬לא סימטרי‬
‫ביחס לאינוורסיה והמקדם ) ‪ χ(2‬שלו גדול יחסית )זהו חומר בעל אינדקס שבירה שונה עבור שלושה צירים‬
‫אופטיים‪ ,‬אבל עבור שניים מהצירים ההפרש בין האינדקסים אינו גדול כך שאפקטיבית מדובר בחומר‬
‫‪.(birefringent‬‬
‫נח להסתכל על תהליך הכפלת התדר כעל תהליך המתרחש בשני שלבים‪ .‬תחילה השדה החיצוני ‪ E1‬בעל‬
‫תדר ‪ ω‬משרה פולריזציה ) ‪ ( P 2 ∝ E 12‬לא לינארית בתדר כפול ובשלב השני הדיפולים )הרציאניים‪ ,‬קלסיים(‬
‫המתנדנדים המושרים קורנים לפי משוואות מאכסוול ופולטים אור בתדר ‪ .2ω‬הפאזה והאמפליטודה של השדה‬
‫המאלץ מוגדרים היטב בכל נקודה בגביש בזמן נתון וכך גם הפאזה היחסית של הדיפולים המושרים‪ .‬על מנת‬
‫שתתקבל קרן מוכפלת ביציאה מהגביש יש צורך בכך שהדיפולים המושרים יקרנו בהפרש פאזה נכון‪ ,‬אחרת‬
‫‪51‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫השדה המוכפל יתאבך באופן הורס‪ .‬דרישה זו נקראת ‪ phase matching‬והיא קריטית עבור תהליך ה – ‪.SHG‬‬
‫במקרה של אור הניתן לתיאור על ידי גלים מישוריים המתקדמים בתווך דיאלקטרי בכוון מסוים )יהי זה הכוון‬
‫החיובי של ציר ‪ ( z‬ובתנאי שפונקציית מעטפת השדה החשמלי של אור זה משתנה לאט‪ ,‬קל לתרגם את דרישת ה‬
‫– ‪ phase matching‬לביטוי מתמטי פשוט‪ ,‬אם כי הפיתוח ארוך יחסית‪ .115‬ניתן להראות כי עצמת האור‬
‫המוכפל תקיים‬
‫‪2‬‬
‫‪.‬‬
‫)‬
‫(‬
‫)‪sin(Δ k L/ 2‬‬
‫∝ ‪(23) I‬‬
‫‪Δ k L /2‬‬
‫פונקציית ה – ‪ sinc‬הנ"ל תופיע גם עבור מקרה של פולס אור בעל מעטפת גאוסית של השדה‪ .‬הגודל‬
‫‪ Δ k =2 k ω−k 2 ω‬נקרא ‪ vector mismatch‬ו – ‪ L‬הוא עובי התווך הלא לינארי‪ .‬מקסימום של פונקציית ה –‬
‫‪ sinc‬מתקבל עבור ‪ .Δk = 0‬חומרים אופטיים רגילים הם דיספרסיביים ולכן הגודל ‪ Δk‬בדרך כלל לא מתאפס‪:‬‬
‫) )‪ , Δ k =( 2 ω/c ) ( n( ω)−n (2 ω‬עבור זכוכית למשל גודל זה יהיה קטן מ – ‪ ,0‬בתחום הנראה של‬
‫הספקטרום‪.‬‬
‫התאמת פאזה מושלמת מתאפשרת בגבישים ביריפרינג'יים‪ .‬בחומרים אלה אינדקס שבירה תלוי לא רק‬
‫באורך גל של האור אלה גם בקיטובו ביחס לצירי הגביש‪ .‬נדגים באמצעות גביש ביריפרינג'י אוניאקסיאלי )בעל‬
‫ציר אופטי מיוחד יחיד‪ ,‬נקרא לו ציר ‪ .( c‬על מנת לתאר התקדמות של אור בגביש כזה יש צורך בפירוק וקטור‬
‫השדה החשמלי לפי הצירים של הגביש‪ .‬רכיב שדה המקוטב במישור המאונך לציר המיוחד יישבר לפי אינדקס‬
‫רגיל )‪ (ordinary‬של הגביש‪ . no ,‬וקטור שיישאר לאחר ההפחתה של הרכיב המקוטב במישור המאונך‪ ,‬יכיל‬
‫רכיב מקביל לציר ‪ c‬של הגביש‪ .‬האינדקס הרלוונטי לגביו יהיה תלוי בזווית בין כוון ההתקדמות של השדה‬
‫המקורי )אשר מוגדר על ידי וקטור ‪ Poynting‬שלו( לבין ציר ‪c‬‬
‫‪2‬‬
‫‪2‬‬
‫) () (‬
‫‪.‬‬
‫‪1‬‬
‫‪sinθ‬‬
‫‪cos θ‬‬
‫=‬
‫‪+‬‬
‫)‪(24‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪n o (λ‬‬
‫)‪[ neff (θ , λ)] ne (λ‬‬
‫כאשר ‪ neff‬הוא אינדקס שבירה אפקטיבי‪ θ ,‬היא הזוית בין ציר ‪ c‬לכוון ההתקדמות ההתחלתי של השדה ו – ‪ne‬‬
‫הוא אינדקס שבירה מיוחד של הגביש‪ ,‬המתקבל עבור קרן שהשדה החשמלי שלה מקוטב במקביל לציר ‪c‬‬
‫)במקרה זה‪ .( θ=π/2 ,‬הגביש שהשתמשנו בו‪ ,BBO ,‬משתייך ל – ‪negative birefringent crystals‬‬
‫עבורם‪ .ne(ω) < no(ω) :‬אם נתחשב בדיספרסיה של הגביש‪ ,‬הרי שחייבת להיות זוית ‪ θm‬כך ש‪:‬‬
‫)‪ . n eff (θ m , λ)=no (θ m , 2 λ‬נציב דרישה זו במשוואה ‪ 24‬ונקבל‬
‫‪.‬‬
‫‪no ( 2 λ)−2−no ( λ)−2‬‬
‫‪ne (λ )−2−n o (λ)−2‬‬
‫‪2‬‬
‫= )‪(25) (sin θ m‬‬
‫מכאן ש – ‪ phase matching‬מושלם ב – ‪ BBO‬מתקבל כאשר קיטוב הקרן המוכפלת מאונך לקיטוב‬
‫הקרן המשרה את הפולריזציה‪ .‬הכפלת תדר מסוג כזה‪ ,‬כלומר חיבור שני פוטונים מקוטבים במקביל לקבלת‬
‫פוטון שלישי בעל תדר כפול וקיטוב מאונך לזה של שני הפוטונים ההתחלתיים נקרא ‪ .type I SHG‬על מנת‬
‫להפחית איבודים להחזרה מהפן הקדמי ולמנוע דיספרסיה כרומטית‪ ,‬הגבישים נחתכים בצורה כזו שהקרן‬
‫המקורית פוגעת בהם בניצב‪ ,‬כל חיתוך מבטיח ‪ phase matching‬לתחום צר יחסית של אורכי גל‪.‬‬
‫המרת אור מסוג אחר מתקבלת בתווך סימטרי ביחס לפעולת האינוורסיה ולכן חייבת להגרם על ידי‬
‫‪52‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫נוכחות של )‪ χ(3‬במשוואת הפולריזציה )אנו מזניחים איברים מסדרים אי זוגיים גבוהים יותר(‪ .‬מדובר בתופעת‬
‫ה – ‪ SPM‬השימושית מאוד לצורך הרחבת ספקטרום הפולס‪ .116‬תנועה של פולס אולטרה קצר‪ ,‬עצמתי בתווך‬
‫דיאלקטרי משנה את אינדקס השבירה של המדיום בזמן באמצעות אפקט ‪ .Kerr‬האינדקס המשתנה יגרום בתורו‬
‫להסט פאזה של הפולס‪ ,‬מה שבסופו של דבר יוביל לשינוי הספקטרום של הפולס‪ .‬נדגים זאת באמצעות‬
‫משוואות‪ .‬העצמה כפונקציה של הזמן של פולס גאוסי אולטרה קצר נתונה על ידי‪I (t)= I 0 exp(−t 2 / τ2 ) :‬‬
‫ואינדקס השבירה של החומר כאשר אפקט ‪ Kerr‬נלקח בחשבון יהיה‬
‫‪(26) n=n 0+(3 χ(3) /8 n 0)∣ E⃗ω∣2=n0+n2 I .‬‬
‫אם התקדמות הפולס בתווך העצמה של האור בנקודה מסוימת של התווך עולה ויורדת לאחר שהפולס עובר‬
‫אותה‪ .‬אינדקס השבירה ישתנה לפי המשוואה‬
‫(‬
‫)‬
‫‪−2 t I 0‬‬
‫) ‪dn( I‬‬
‫‪dI‬‬
‫‪=n2 =n2‬‬
‫‪exp (−t 2 /τ 2 ) .‬‬
‫‪2‬‬
‫‪dt‬‬
‫‪dt‬‬
‫‪τ‬‬
‫)‪(27‬‬
‫השתנות של אינדקס השבירה בזמן מסיטה את פאזה הרגעית‬
‫‪2π L‬‬
‫‪n0+n 2 I 0 exp (−t 2 /τ 2 )) .‬‬
‫(‬
‫‪λ0‬‬
‫‪(28) ϕ(t)=ω0 t −‬‬
‫במשוואה האחרונה ‪ λ0‬ו – ‪ ω0‬הוא אורך גל ותדר הנושא של הפולס בוואקום ו – ‪ L‬הוא המרחק אותו עבר‬
‫הפולס בחומר‪ .‬הסט פאזה גורר הסט תדר‪ .‬התדר הרגעי נתון על ידי‬
‫‪4 π L n2 I 0‬‬
‫)‪d ϕ(t‬‬
‫) ‪2 π L dn( I‬‬
‫‪=ω 0−‬‬
‫‪=ω0+‬‬
‫‪⋅t exp(−t 2 / τ2 ) .‬‬
‫‪2‬‬
‫‪dt‬‬
‫‪λ0‬‬
‫‪dt‬‬
‫‪λ0 τ‬‬
‫(‬
‫)‬
‫=)‪(29) ω( t‬‬
‫איור ‪ 50‬מציג את התדר הרגעי של הפולס כפונקציה של הזמן‪ ,‬לפי משוואה ‪ .29‬רואים שקדמת הפולס‬
‫מוסטת לתדרים נמוכים‪ ,‬זאת אומרת לאדום ואילו זנב הפולס מוסט לכחול‪ .‬מכאן שהספקטרום של הפולס מכיל‬
‫כעת תדרים חדשים שלא היו כוללים בו מלכתחילה‪ .‬הסט של מרכז הפולס מתקבל על ידי פיתוח לטור טיילור‬
‫של )‪ ω(t‬סביב ‪ t = 0‬והוא בקירוב טוב לינארי‪:‬‬
‫‪.‬‬
‫איור ‪ Self phase modulation : 50‬של פולס אור‬
‫אולטרה קצר עצמתי בעוברו בתווך דיאלקטרי‬
‫סימטרי ביחס לאינוורסיה‪.‬‬
‫)‬
‫‪4 π L n2 I 0‬‬
‫‪λ0 τ2‬‬
‫(‬
‫⋅‪(30) ω( t)=ω 0+t‬‬
‫מכאן שבנוסף להרחבה ספקטרלית סימטרית אפקט ה –‬
‫‪ SPM‬ישרה על הפולס ‪ chirp‬לינארי )בקירוב(‪ ,‬מצד שני‬
‫אין כאן הרחבה בזמן של מעטפת הפולס‪ .‬דיספרסיה רגילה‬
‫)תלות של אינדקס שבירה לינארי בתדר(‪ ,‬אם היא קיימת‪,‬‬
‫תרחיב את הפולס גם בזמן‪.‬‬
‫שיטה מתוחכמת יותר להמרת אור ואחרונה שנדון‬
‫בה מאפשרת שליטה באורך גל של האור המתקבל‪ .‬היא‬
‫נקרית הגבר אופטי פרמטרי‪Optical Parametric ) ,‬‬
‫‪ .115Amplification (OPA‬המגבר שלנו הוא מכשיר‬
‫‪53‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫מסחרי של ‪ , Quantronix‬הוא פועל בשיטת הגבר של סופר – פלואורסנציה פרמטרית אשר מיוצרת בגביש‬
‫‪ BBO‬על ידי פולס מוגבר של ‪ .Ti:sapphire‬שמו ‪Traveling – wave OPA of Superfluorescence‬‬
‫‪ .TOPAS‬מכשיר ה – ‪ TOPAS‬מאפשר המרת פולסים ממורכזים סביב ‪ 790nm‬של האוסצילטור לפולסים‬
‫קצרים בתחום אורכי גל רחב ‪.2580nm – 450‬‬
‫המונח סופר – פלואורסנציה בא לציין כי העצמה של הפליטה הספונטנית במקרה זה מתכונתית למספר‬
‫הצורונים הפולטים בריבוע‪ ,‬כלומר האופי של הפליטה הוא קוהרנטי‪ .‬במקרה שלנו‪ ,‬הפולריזציה אשר מייצרת את‬
‫הפליטה היא מראש מתואמת פאזה )קיים דיפול מקרוסקופי בתווך הפולט( בזכות הקוהרנטיות של האור המשרה‬
‫)יש הקוראים לסופר – פלואורסנציה מסוג זה ‪ ,(superradiance‬אך במקרים אחרים סופר – פלואורסנציה‬
‫יכולה להתרחש גם עקב עירור לא קוהרנטי‪ .‬נציין כי תהליך יצירת הקרינה הפרמטרית הוא לא תהודתי‪ ,‬כלומר‬
‫אין כאן פליטה ספונטנית‪/‬מאולצת של אוכלוסיה מעוררת‪ .‬אי לכך‪ ,‬השם פיזור פרמטרי ) ‪parametric‬‬
‫‪ (scattering‬מתאים יותר לתיאור התופעה‪.‬‬
‫לצורך פשטות התיאור נחלק את תהליך ההגבר הפרמטרי לשני שלבים‪ .‬השלב הראשון הוא יצירת פיזור‬
‫פרמטרי ראשוני חלש אשר נקרא ‪ .seed‬בשלב זה פולס קצר ועצמתי של האוסצילטור בתדר‬
‫‪ ω1=2 π ν 1=2.4⋅1015 Hz‬מתחלק בגביש לא לינארי לשני פולסים תוך כדי שימור תנע ואנרגיה‪ ,‬במילים‬
‫אחרות‪ ,‬תדרים ווקטורי גל של שני הפולסים מקיימים‪ . k⃗2 +k⃗3= k⃗1 , ω2 +ω3=ω 1 :‬ב – ‪ TOPAS‬שלנו‬
‫התווך הלא לינארי בו הפיצול מתרחש הוא גביש ‪ BBO‬כלומר איבר של פולריזציה המתכונתי לריבוע השדה‬
‫מנוצל לצורך הפקת פיזור פרמטרי‪ .‬כמו במקרה של ה – ‪ SHG‬שתיארנו‪ ,‬כך גם עבור יצירת פיזור פרמטרי‪ ,‬תנאי‬
‫ה – ‪ ( n 1 ω1 =n 2 ω 2+n 3 ω 3 ) phase matching‬צריך להתקיים על מנת שתתאפשר זרימת אנרגיה מקרן ה –‬
‫‪ booster‬בתדר ‪ ω1‬לקרן ה – ‪ signal‬וה – ‪ idler‬בתדרים ‪ ω2‬ו – ‪ ω3‬בהתאמה‪ .‬אי לכך‪ ,‬שליטה בזווית גביש‬
‫ה – ‪ BBO‬ביחס לקרן ‪ booster‬מאפשרת בחירה של תדרי ה – ‪ signal‬וה – ‪ .idler‬במסגרת אלקטרודינמיקה‬
‫קלסית לא ניתן לתת הסבר להופעת התדרים ‪ ω2‬ו – ‪ ,ω3‬בתנאים היפותטיים של ‪ .0K‬מקור הפוטונים האלה‬
‫במודל הקוונטי הוא רעש פרמטרי ראשוני‪ ,‬כלומר פלקטואציות של שדה הוואקום‪ .‬ברגע שפיזור פרמטרי מייצר‬
‫פוטונים ראשונים‪ ,‬ניתן להסתכל על המשך התהליך כעל הגבר של קרינה קיימת‪ ,‬כלומר תהליך הפיזור הופך‬
‫להיות מאולץ‪ .‬שלב יצירת ה – ‪ seed‬ב – ‪ TOPAS‬נעשה תוך כדי שלושה מעברים משותפים בהם קרן‬
‫‪ booster‬חלשה חופפת את קרן ‪ seed‬בתוך הגביש‪ .‬ה – ‪ seed‬עצמו נוצר כבר במעבר הראשון כך שתפקידם‬
‫של שני המעברים הבאים הוא לעצב את ה – ‪ seed‬ולשפר את הקוהרנטיות שלו‪.‬‬
‫שלב הגבר ה – ‪ seed‬הוא שלב שני בסכמת ההגבר הפרמטרי‪ .‬השיטה שבה הדבר נעשה ב – ‪TOPAS‬‬
‫היא חפיפה של ה – ‪ signal‬עם קרן ‪ booster‬חזקה פעמיים נוספות‪ ,‬תוך כדי ניפוי של ה – ‪ idler‬לפני כל‬
‫חפיפה‪ .‬בשלב ההגברה הפוטונים של ה – ‪ signal‬מאלצים את הפוטונים של ה – ‪ booster‬להתפזר ובכך‬
‫מייצרים בחזרה את קרן ה – ‪ .idler‬הניפוי של ה – ‪ idler‬בכל אחד משלבי ההגברה הכרחי‪ ,‬בלעדיו הקרן‬
‫המופקת מה – ‪ TOPAS‬הופכת להיות מאוד לא יציבה‪ .‬לאחר חלוקת הפוטונים של ה – ‪ booster‬ניתן לעשות‬
‫מניפולציות נוספות למשל להכפיל את תדר ה – ‪ signal/idler‬או לייצר תדר סכום של שניהם )הכפלת תדר היא‬
‫מקרה פרטי של יצירת תדר סכום של שני פוטונים(‪.‬‬
‫‪54‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫מערך ניסיוני‪.‬‬
‫איור ‪ 51‬מציג סכמתית את עיקר המערך הניסיוני שלנו‪ .‬פלט ‪ Ti:sapphire‬מוגבר )פולסים באורך ‪30fs‬‬
‫במחצית גובהם‪ ,‬בעלי מרכז ספקטרום ב – ‪ ,790nm‬באנרגיה של ‪ ~0.5mJ‬לפולס‪ ,‬בתדר ‪ pulse train‬של‬
‫‪ ,450Hz‬מחולק על ידי ‪ beam splitter‬לשני קרניים שוות הספק‪ .‬הקרן הראשונה שואבת את ה – ‪TOPAS‬‬
‫לצורך יצירת ‪ signal‬בתדר ‪ .1.15µm‬קרן אינפרה אדומה זו מחולקת בתורה לשתיים על ידי ‪ splitter‬נוסף‬
‫וחלק ממנה מוכפל תדר ל – ‪ 580nm‬בגביש ‪ BBO‬בעובי ‪ .0.25mm‬הקרן המוכפלת תשמש כ – ‪ .pump‬פולסי‬
‫ה – ‪ pump‬מכווצים על ידי זוג פריזמות )לא מוצגות באיור ‪ (51‬על מנת לתקן ‪ chirp‬הנצבר על ידם בעקבות‬
‫מעבר בעדשות וב – ‪ .BBO‬השארית האינפרה אדומה הלא מוכפלת משמשת ‪ .dump‬הנחנו כי ביצוע‬
‫‪ dumping‬ב – ‪ 1.15µm‬לא יגרום ל – ‪ repump‬של האוכלוסיה המעוררת‪ ,‬אורך גל מרכזי של ה – ‪dump‬‬
‫שלנו מספיק רחוק מאזור החפיפה של פליטה ובליעה של מצב מעורר המתוארת על ידי ‪ Kobayashi‬בעבודתו‬
‫על ‪ .99sHR‬פולסי ‪ probe‬רחבי תדר התקבלו באמצעות מיקוד של חלק מפלט הלייזר אשר לא נוצל ב –‬
‫‪ TOPAS‬לתוך לוחית ‪ sapphire‬בעובי ‪ 2.5mm‬לצורך יצירת אור לבן‪ .‬קרן זו פוצלה גם היא וחלק ממנה‬
‫שימש קרן ‪) reference‬משוואה ‪ .(10‬אורך הדרכים האופטיות של קרני ‪ pump, dump‬ו – ‪ probe‬היה שווה‬
‫)איור ‪ 51‬לא ממחיש עובדה זו( על מנת להבטיח הגעה של שלושת הפולסים לדגם בסמיכות‪ .‬כוון עדין של‬
‫הדרכים נעשו באמצעות ‪ delay lines‬אשר מסומנים ‪ R.R‬באיור ‪.51‬‬
‫פולסי ‪ pump, dump‬ו – ‪ probe‬זהי קיטוב מוקדו לתא שהכיל את הדגם‪ .‬עוביו של התא היה‬
‫‪ 0.5mm‬ועובי דפנות הזכוכית שלו )‪ (crown – glass‬היה ‪ .0.15mm‬פולסי ה – ‪ probe‬מוקדו לתוך נקודה‬
‫בקוטר ‪ ,0.1mm‬ואילו מיקוד ה – ‪ pump‬וה – ‪ dump‬היה פחות חזק‪ ,‬שני הפולסים הללו מוקדו לכדי‬
‫‪ .0.2mm‬מדידת שטף ה – ‪ pump‬הניבה תוצאה של ‪ 6.5×10 14 photons /cm2‬ועוצמת הסיגנל הנמדד הייתה‬
‫לינארית עם השטף עד לערך זה‪ .‬מדידה מדויקת של שטף ה – ‪ dump‬הייתה בעייתית מבחינתנו‪ ,‬זאת עקב‬
‫מגבלה של כושר הגילוי של אמצעים שעמדו לרשותנו בזמן הניסוי בתחום אורכי גל של ה – ‪) dump‬ממדידה‬
‫באמצעות מד עצמה חומני גס אנו מעריכים כי שטף ה – ‪ dump‬בניסויינו היה ‪.( 5×1015 photons /cm2‬‬
‫בדקנו ולא מצאנו שום השפעה של פולס ה – ‪ dump‬על ‪ pHR‬במצב יסוד‪ .‬על מנת לחדש את הדגם בין שני‬
‫איור ‪ :51‬החלק השמאלי מציג האופן סכמטי את המערך הניסיוני שלנו ‪ .‬פרטים לא חיוניים להצגה הושמטו בכוונה‪.‬‬
‫ספקטרה של ה – ‪ pump‬וה – ‪ dump‬מוצגים בחלק הימני של האיור על רקע ספקטרום הבליעה של ‪ pHR‬במצב יסוד‪.‬‬
‫‪55‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫פולסי ‪ pump‬עוקבים דאגנו לסירקולציה תמידית שלו באמצעות משאבת מזרק‪ ,‬בקצב הנדרש‪ .‬לאחר המעבר‬
‫בדגם פולסי ‪ probe‬יחד עם פולסי ‪) reference‬אלה לא עוברים בדגם( נאספו לתוך סיבים אופטיים והוסעו‬
‫לתוך ספקטרוגרף בעל שני מערכים של דיודות‪ 512 ,‬דיודות בכל מערך‪ .‬מתוך ארבעה ספקטרה של צפיפות‬
‫אופטית המתקבלים לכל השהיה ‪) t‬כל אחד מהם הוא ממוצע של אלפי פולסים(‪ ,‬ספקטרום יחיד של )‪ΔOD(t‬‬
‫מחושב על פי משוואה ‪.10‬‬
‫אופן הכנת דגם החלבון היה כדלהלן‪ :‬תאי ‪ E. coli‬מהונדסים גנטית )‪ (BL21 strain‬גודלו‬
‫בטמפרטורה של ‪ 37°C‬על גבי מצע מזין עם תוספת של ‪ 50mg/mL‬של אנטיביוטיקה )‪ (kanamycin‬במיכל‬
‫תסיסה בנפח ‪ .10L‬במהלך הגדילה של התאים הוספו למצע ‪ 10µM‬של רטינל ‪ all – trans‬ו – ‪ 0.5mM‬של‬
‫‪ .IPTG‬חומר זה משמש טריגר לתחילת שעתוק של אופרון ‪ ,lac‬פעולה זו מקנה את היכולת של מטבוליזם של‬
‫לקטוז לתאי ‪ . E. coli‬לאחר דגירה של ארבע שעות התאים נאספו והוקפאו בטמפרטורה של ‪ -20°C‬על מנת‬
‫לגרום לפירוק של דופן וקרום התא‪ .‬בשלב הבא התאים השבורים הופשרו והוכן מהם תרחיף )בעל ‪ pH 7‬על ידי‬
‫הוספת בופר ‪ ( HOCH 2)3 CNH 2−HCl‬הידוע בשמו המקוצר ‪ (Tris-HCl‬שרכיביו הופרדו בסופו של דבר‬
‫על ידי צנטריפוגציה‪ .‬לאחר מכן המשקע הורחף בבופר ‪ S‬אשר מבוסס על ‪ 50mM‬של חומצת )‪(MES‬‬
‫‪ . 2−( N −morpholino )ethanesulfonic acid‬בנוסף לחומצת ‪ MES‬בופר זה מכיל ‪ NaCl‬בריכוז ‪,0.5M‬‬
‫דטרגנט )‪ n–dodecyl–β–D–maltoside (DM‬המרכיב – ‪ 0.5%‬מהתמיסה ו – ‪ imidazole‬בריכוז ‪,5mM‬‬
‫הבופר שומר על ‪ pH‬קבוע של התמיסה בסביבות ‪ .6‬ההרחפה נעשתה באמצעות ערבוב של ‪ 12‬שעות‬
‫בטמפרטורה של ‪ . 4°C‬בשלב הבא התרחיף שוב עבר צנטריפוגציה והפעם חלק ששקע הורחק‪ .‬התרחיף מעל‬
‫המשקע נאסף והועבר דרך קולנת הפרדה מבוססת ‪ .Ni-NTA agarose‬שרף הקולנה נשטף באופן אינטנסיבי‬
‫על ידי בופר ‪) W‬הזהה לבופר ‪ S‬אבל מכיל רק ‪ (DM 0.06%‬לאחר מכן ריכוז ה – ‪ imidazole‬הוגדל ל –‬
‫‪ 100mM‬על מנת להרחיק חלבונים שנקשרו למצע הקולונה באופן לא ספציפי‪ .‬בשלב הבא ‪ pHR‬הוצא‬
‫מהקולונה על ידי הזרמת בופר ‪ E‬בעל ‪ pH 7.8‬והרכב‪0.5M NaCl, 50mM Tris-HCl, 0.3M imidazole :‬‬
‫ו – ‪ .DM 0.06%‬הבופר הסופי ששימש לייצוב החלבון היה בעל ‪ pH 7‬ודומה בהרכבו לבופר ‪ E‬אך לא הכיל‬
‫‪ imidazole‬וריכוז המלח בו הוקטן ל – ‪.0.3M‬‬
‫נציין כאן עובדה חשובה‪ .‬אופן ההכנה של הדגם שלנו לא אפשר את היקשרות של קרוטנואיד‬
‫בקטריורוברין לחלבון‪ .‬קרוטנואידים מצויים באופן טבעי בממברנות של ארכיאה‪ ,‬אך לא בממברנות של‬
‫בקטריה‪ .‬לכן תוצאה של ביטוי הגן המקודד ל – ‪ pHR‬ב – ‪ E. coli‬היא חלבון עם כרומופור אחד בלבד‪,‬‬
‫הרטינל‪ .‬אי לכך‪ ,‬חקר יחסי הגומלין של שני הכרומופורים של ‪ pHR‬לא התאפשר‪ ,‬עקב מגבלות הדגם‪.‬‬
‫עיבוד נתונים‪.‬‬
‫שלב ראשון של עיבוד התוצאות שלנו הוא תיקון הדיספרסיה של ה – ‪ .probe‬ציינו כבר כי לצורך‬
‫קבלת רזולוציית זמנים טובה בניסויי ‪ pump-probe‬יש צורך בערך ‪ FWHM‬קטן של פונקציית הקרוס –‬
‫קורלציה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ .probe‬הוספת פולס ‪ dump‬לסכמה הניסיונית גורמת לרזולוציית הזמנים להיות‬
‫תלויה בקרוס קורלציה של שלושת הפולסים )אם כי לפעמים ניתן להזניח את ה – ‪ ,pump‬במיוחד אם הוא קצר‬
‫ביחס לשני הפולסים האחרים וההשהיה בינו לבין ה – ‪ dump‬ארוכה מספיק ומאפשרת שיכוך של תהליכים‬
‫‪56‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫מהירים(‪ .‬על מנת לקצר את משך הפולסים אנחנו משתמשים בשיטות כיווץ שונות )כך למשל ה – ‪ pump‬שלנו‬
‫מכווץ על ידי זוג פריזמות( אך במקרים מסוימים‪ ,‬הכיווץ לא מתאפשר מסיבות טכניות‪ .‬פולס ‪ probe‬בניסויינו‬
‫מופק על ידי יצירת אור לבן ב – ‪ sapphire‬תוך כדי ניצול ‪ SPM‬של פולס מוגבר של האוסצילטור‪ .‬כיווץ יעיל‬
‫של אור לבן כזה דורש שילוב של אמצעים‪ ,‬הסיבה לכך היא הספקטרום הרחב שלו‪ .‬במקרה זה הכיווץ יחליש‬
‫משמעותית את העצמה הסופית של הפולס‪ ,‬לצורך המחשה‪ ,‬לאחר ארבע פגיעות בזוג סריגים הפולס יכול לאבד‬
‫יותר מ – ‪ 3/4‬מהאנרגיה שלו ואם בנוסף לכך נדרש מעבר בפריזמות ואמצעים אחרים )כגון מראה מתעוותת או‬
‫‪ ( chirp mirrors‬אזי בסוף העצמה של הפולס המכווץ דועכת לכעשירית עד חמישית מהערך ההתחלתי‪.‬‬
‫מכיוון שאין אנו רוצים להגדיל את הרעש על חשבון סיגנל בתוצאות שלנו אנחנו לא מכווצים את ה –‬
‫‪ probe‬ומתקנים את הדיספרסיה שלו באמצעות מניפולציות מתמטיות של התוצאות‪ .‬בחלק של התוצאות נציג‬
‫את ה – ‪ scans‬שלנו כמפה‪ ,‬ערך הפרש צפיפות אופטית ייוצג כפונקציה של אורך גל וזמן השהיה בין ה –‬
‫‪ pump‬ל – ‪ probe‬על ידי צבעים שונים‪ .‬דיספרסיה של ה – ‪ probe‬משתקפת בתוצאות בכך שעליית‬
‫אמפליטודת הסיגנל מ – ‪ 0‬באורכי גל כחולים מתרחשת בזמני השהיה מוקדמים יותר‪ .‬אין זה אומר של – ‪probe‬‬
‫שלנו ‪ chirp‬שלילי‪ ,‬אחרי הכל‪ ,‬מתן ההשהיה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ probe‬מתבצע על ידי הארכת הדרך‬
‫האופטית של ה – ‪ , probe‬לכן כששני הפולסים יתחילו לחפוף בזמן בתוך הדגם ה – ‪ pump‬יתפוס בהתחלה‬
‫את ה"זנב" של ה – ‪ , probe‬כלומר את אורכי גל הכחולים שלו‪ ,‬מה שמסביר את העובדה שהסיגנל מתחיל‬
‫להופיע בכחול‪.‬‬
‫תיקון הדיספרסיה של ה – ‪ probe‬מתבצע באופן הבא‪ :‬אנו מחליפים את הדגם בתא בתמיסת בופר‬
‫נקייה שלו )הדגם החדש מכיל את כל הרכיבים שלו חוץ מהחלבון עצמו( ומריצים על תמיסה זו ניסוי – ‪pump‬‬
‫‪ probe‬שעשינו לפני זה על הדגם שהכיל את החלבון‪ .‬בדרך זו אנו מחסירים את תרומת הצורונים הפעילים‬
‫אופטית מהסיגנל המתקבל‪ .‬לכאורה‪ ,‬ניתן היה לצפות שלא נראה סיגנל כלל במצב זה‪ ,‬אך תהליכים רב פוטוניים‬
‫עדיין מתרחשים ולכן ‪ scan‬כזה יראה סיגנל הנובע מה – )‪ Cross Phase Modulation (CPM‬בין ה –‬
‫‪ pump‬ל – ‪ .probe‬תהליך זה דומה ל – ‪ SPM‬ומתרחש עקב שינוי אינדקס השבירה של התווך על ידי ה –‬
‫‪ pump‬עבור ה – ‪ . probe‬סיגנל זה יראה בקירוב ראשון כגאוסיאן )כפונקציה של הזמן( ויופיע בזמנים‬
‫מוקדמים בצד הכחול של הספקטרום ובמאוחרים באדום‪ .‬לעקומת הדיספרסיה כפונקציה של אורך גל הנקבעת‬
‫על ידי השיאים של אותם גאוסיאנים נתאים פולינום מסדר נמוך ונשתמש בערכים שלו על מנת להסיט את‬
‫הנתונים של ה – ‪ scan‬הכולל את הצורונים הפעילים כך שעקומת הדיספרסיה תתיישר‪ .‬תיקון זה מאפשר קביעה‬
‫מדויקת של זמן תחילת העלייה של הסיגנל באורך גל מסוים וניתוח דינמיקה‪/‬קינטיקה נצפית של הדגם ללא‬
‫חשש שהיא נובעת מדיספרסיה של ה – ‪.probe‬‬
‫דרך פשוטה לאפיין את התפתחות בזמן של ספקטרה הפרש בליעה טרנזיינטיים של צורון פעיל אופטית‬
‫מסוים היא להתאים את )‪ ΔOD(t‬בכל אורך גל לסכום של סט מצומצם של פונקציות אקספוננציאליות דועכות‬
‫בזמן‪ .‬משמעות של "סט מצומצם" במקרה זה היא שההתאמה עבור כל אורך גל נעשית רק באמצעות שינוי‬
‫המקדמים של האקספוננטים )המרכיבים את אותו סט( בסופרפוזיציה‪ .‬יש כאן הנחה כי ההתנהגות של הספקטרה‬
‫הטרנזיינטיים בזמן היא אחידה על פני טווח רחב של תדרים‪ ,‬כלומר מה שאנחנו מחפשים זה את ההתנהגות‬
‫הגלובלית בזמן של ה – ‪ .data‬סוג כזה של התאמה נקרא התאמה גלובלית‪ .117‬תוצאה של ניתוח כזה היא מספר‬
‫‪57‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫ספקטרה‪ ,‬כמספר האקספוננטים בסט‪ ,‬הדועכים בזמן באופן מונו – אקספוננציאלי‪ .‬כל אחד מספקטרה אלה‬
‫מזוהה עם רכיב דעיכה יחיד ולכן נקרא ‪ Decay Associated Spectrum‬או ‪ .DAS‬כל ה – ‪ DAS‬בעלי‬
‫אמפליטודה מקסימלית בזמן ‪ t = 0‬והסיגנל ‪  OD  , t‬בכל נקודת זמן ובכל אורך גל הוא סופרפוזיציה של‬
‫ה – ‪:DAS‬‬
‫‪(31) Δ OD (t ,ω)=Δ OD 0 (ω)+∑ Δ OD i (ω)exp (−t/ τ i) .‬‬
‫‪i‬‬
‫האיבר )‪ Δ OD 0 (ω‬הוא פונקציית ‪) δ‬של הזמן( והכנסתו נדרשת לצורך תיאור של סיגנל הנובע מ – ‪ CPM‬בין‬
‫ה – ‪ pump‬ל – ‪ . probe‬בנוסף‪ ,‬על מנת לתאר את העליה של הסיגנל‪ ,‬כל אחד מהאקספוננטים וגם האיבר‬
‫)‪ Δ OD 0 (ω‬הם ‪ convoluted‬עם פונקציית תגובת המערכת ) ‪.Instrument Response Function (IRF‬‬
‫בניסוי שלנו ה – ‪ IRF‬היא פשוט קרוס – קורלציה של שלושת הפולסים‪.‬‬
‫התאמה גלובלית לא מתאימה לאפיון התנהגות דינמית של הספקטרה‪ ,‬כמו למשל הסט בזמן של פס‬
‫בליעה‪/‬פליטה מסוים‪ .‬על מנת לקבל התאמה להתנהגות דינמית יש צורך בסט אינסופי של אקספוננטים‪ .‬אי לכך‪,‬‬
‫שיטה זו טובה מאוד לניתוח הקינטיקה של ‪  OD  , t‬ואינה מתאימה כלל לזיקוק הדינמיקה מתוך הנתונים‪.‬‬
‫למרות מוגבלותה של שיטת ההתאמה הגלובלית היא כלי אנליטי נח לצרכים שלנו כי שלב דינמי באבולוציה‬
‫ספקטרלית של רודופסינים ארכיאליים הוא יחסית קצר ולאחר כמה מאות פמטושניות מרגע העירור התנהגות של‬
‫הספקטרום היא קינטית לחלוטין‪ ,‬הפסים המזוהים עם מעברים נשארים מעוגנים באזור ספקטרלי מסוים ולא‬
‫"מטיילים" בתחום התדר‪.‬‬
‫התאמה סימולטנית של התפתחות בזמן של הטרנזיינטים בכל אורכי הגל היא אפשרית אך לרוב ניתן‬
‫לצמצם באופן דרסטי את ממד מטריצת הנתונים )‪ m‬אורכי גל על ‪ n‬נקודות זמן(‪ ,‬כך שהאינפורמציה אודות‬
‫האבולוציה של הספקטרה תשמר והרעש יורחק‪ .‬שיטה שבה הדבר מושג נקראת ) ‪Singular Value‬‬
‫‪ .118Decomposition (SVD‬שיטה זו מפרקת את מטריצת ‪ m×n‬המקורית למכפלה של שלוש מטריצות‪:‬‬
‫)‪M =U ΣV † (32‬‬
‫כאשר ‪ U‬היא מטריצה ‪ m×m‬אוניטרית‪ V† ,‬היא ‪) conjugate transpose‬צימוד הרמיטי( של מטריצת ‪V‬‬
‫אוניטרית שהיא ‪) n×n‬שתי המטריצות הנ"ל יכולות להיות מרוכבות( ו – ‪ Σ‬היא מטריצה ‪ m×n‬עם ערכים‬
‫ממשיים אי שליליים על האלכסון הראשי‪ .‬הערכים ‪ Σi,i‬נקראים ערכים סינגולריים של ‪ .M‬וקטורי העמודות ‪ m‬ו‬
‫– ‪ n‬של ‪ U‬ו – ‪ V‬נקראים וקטורים סינגולריים שמאליים וימניים של ‪ M‬בהתאמה‪ .‬שיטת ה – ‪ SVD‬היא הכללה‬
‫של תהליך הלכסון על מטריצות שאינן ניתנות ללכסון‪ ,‬בפרט מטריצות ‪ , m×n‬כאשר ‪ m≠n‬במובן זה‬
‫שהווקטורים הסינגולריים השמאליים של ‪ M‬הם וקטורים עצמיים של † ‪ MM‬והימניים‪ ,‬של ‪ . M † M‬הערכים‬
‫הסינגולריים של ‪ Σ‬השונים מ – ‪ 0‬הם שורשים ריבועיים של הערכים העצמיים של † ‪ MM‬או ‪. M † M‬‬
‫הערכים הסינגולריים של ‪ M‬נותנים בעצם את המשקל של המכפלה הווקטורית של העמודות של ‪,U‬‬
‫שבמקרה שלנו מהוות פונקציות של סיגנל כתלות בזמן ההשהיה‪ ,‬בשורות של †‪ ,V‬שהם הספקטרה‪ .‬אם נסדר את‬
‫את שלושת המטריצות באופן כזה שהערכים הסינגולריים של ‪ Σ‬קטנים באופן מונוטוני עם ההתקדמות לאורך‬
‫האלכסון הראשי אזי נוכל לצמצם את מטריצה ‪ M‬המקורית על ידי כך שנזניח מכפלות בעלות משקלים נמוכים‬
‫)מעשית זה פשוט אומר להחליף את הערכים הסינגולריים שלהם באפסים במטריצה ‪ Σ‬ולבצע את המכפלה‬
‫‪58‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫לקבלת מטריצה '‪ M‬חדשה(‪ .‬פעולה זו לא רק מאפשרת ניקוי רעש ממטריצת הנתונים‪ ,‬היא גם מקלה על תהליך‬
‫ההתאמה הגלובלית‪ .‬מספר מצומצם של וקטורי העמודות של ‪ U‬אוגר בתוכו את כל האינפורמציה המעניינת‬
‫אודות האבולוציה הספקטרלית של הנתונים שלנו ולכן מספיק להתאים סט של אקספוננטים רק לוקטורים הללו‬
‫על מנת לאפיין את ההתפתחות של הספקטרה בזמן‪.‬‬
‫ניתוח גלובלי של הספקטרום שכולל צמצום על ידי ‪ SVD‬יכול להוביל לכך שלא נבחין בהתנהגות‬
‫מחזורית שלו בזמן‪ .‬אמפליטודת תנודות של הטרנזיינטים המשקפת דינמיקה ויברציונית של הדגם עשויה להיות‬
‫קטנה‪ .‬על מנת להוציא אינפורמציה זו מה – ‪ data‬שלנו יש צורך בפירוק ממד הזמן שלו לרכיבי פורייה‪ .‬בניתוח‬
‫מסוג זה אנו מעוניינים לנפות החוצה דווקא את הדעיכה המונוטונית של הסיגנל‪ ,‬זאת נעשה על ידי החסרה של‬
‫התאמה מולטי אקספוננציאלית )שקיבלנו לפני כן( מטרנזיינטים בכל אורכי הגל‪ .‬את השארית שנקבל נחתוך‬
‫בזמנים רלוונטיים לזמן ‪ dephasing‬ויברציוני אופייני של הדגם‪ .‬במקרה שלנו נקח קטע של הספקטרה בין ‪200‬‬
‫ל – ‪ 2000fs‬מתחילת העלייה של הסיגנל‪ .‬הזמנים המאוחרים יותר לא מעניינים מבחינת ניתוח ויברציוני בגלל ה‬
‫– ‪ decoherence‬של תיאום פאזה התחלתי של האוסף וזמנים מוקדמים יותר מראים עלייה מהירה של סיגנל‪,‬‬
‫השתנות מהירה כזאת של הטרנזיינט יכולה להכניס ארטפקטים לטרנספורם פורייה‪ .‬תוצאה של ניתוח כזה היא‬
‫מיפוי של רכיבי פורייה לפי אורך גל‪ ,‬מפת ) ‪ Discrete Fourier Transform (DFT‬שמתקבלת מראה על‬
‫איזה פס רוכבות ויברציות בתדר מסוים‪ ,‬כלומר בעזרתה ניתן לצמצם את מספר משטחי הפוטנציאל המעורבים ל‬
‫– ‪ 2‬המקושרים על ידי אותו מעבר ספקטרלי‪ .‬ניתן גם לנתח את מבנה הפאזות של מודולציות הטרנזיינטים‪ ,‬כפי‬
‫שציינו קודם נצפה להפרש פאזה של ‪ π‬בין מודולציות בקצוות המנוגדים של הפס‪ .‬על ידי כך לתחום את הפס‬
‫ולהפריד אותו מפסים ספקטרליים אחרים איתם הוא חופף‪.‬‬
‫‪59‬‬
‫תוצאות‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫ספקטרה בליעה טרנזיינטיים של ‪.pHR‬‬
‫איור ‪ 52‬מציג ספקטרה הפרש בליעה טרנזיינטיים של ‪ pHR‬כמפה‪ .‬הציר האופקי הוא ציר אורכי גל‬
‫והציר האנכי הוא ציר הזמן‪ .‬הצבעים במפה מציינים את עצמת הסיגנל‪ ,‬לפי סרגל הצבעים המצורף‪ .‬הספקטרום‬
‫הנ"ל נמדד בניסוי ‪ pump – probe‬פשוט‪ ,‬פולס ה – ‪ dump‬האינפרה אדום לא נכלל בשלב זה בסכמה‬
‫הניסיונית‪ .‬מטרת ניסוי זה הייתה לקבל ספקטרום טרנזיינטי באיכות טובה על מנת שנוכל להשוות אליו את‬
‫תוצאות ניסויי ‪ pump – dump – probe‬בחקירתנו את השפעת הפולס האינפרה אדום על האוכלוסיה‬
‫המעוררת ועל תוצר "‪ " K‬של מעגל האור‪ .‬אך כפי שכבר אמרנו‪ ,‬לא פורסמו למיטב ידיעתנו תוצאות ניסוי‬
‫‪ pump – hyperspectral probe‬על ‪ pHR‬ברזולוציית זמן של הניסוי שלנו‪ ,‬לכן נתאר בקצרה את מה‬
‫שרואים באיור ‪.52‬‬
‫איור ‪ :52‬ספקטרום הפרש בליעה טרנזיינטי של ‪ pHR‬בזמנים מ – ‪ −0.2ps‬עד‬
‫‪ 15ps‬לאחר תיקון הדיספרסיה של פולס ה – ‪) probe‬תיקון ‪GDD group delay‬‬
‫‪.(dispersion‬‬
‫הצד הכחול של הספקטרום נשלט על ידי בליעה של המצב המעורר ‪ ,S1‬שיאה ב – ‪ .475nm‬פס בליעה‬
‫זה מוסט לכחול בזמנים המוקדמים וחופף חלקית את ה – ‪ bleach‬של מצב יסוד אשר מייצר סיגנל שלילי באזור‬
‫של ‪ .580nm – 570‬מצדו האדום של פס ה – ‪ ground state bleach‬מופיעה פליטה מאולצת של מצב מעורר‬
‫אשר מחולקת לשני שיאים‪ ,‬סביב ‪ 720‬ו – ‪ .830nm‬כל ה מאפיינים הספקטרליים של המצב המעורר דועכים תוך‬
‫כ – ‪ 20ps‬ומשאירים ספקטרום הפרש בליעה בין המצב ההתחלתי לבין מצב ‪ .K‬זהו הספקטרום השחור החלש‬
‫בגרף הראשון מימין באיור ‪ .53‬ספקטרום כחול באותו הגרף מראה הגדלה של הנ"ל פי ‪ .8‬רואים בו סיגנל חיובי‬
‫מאדום ל – ‪ bleach‬של מצב יסוד המשקף הסט קל לאדום של פס הבליעה של תוצר ‪ K‬במעגל האור של ‪pHR‬‬
‫לעומת מצב יסוד התחלתי‪.‬‬
‫כמו בעבודות קודמות על הלורודופסין‪ ,‬כך גם בעבודתנו‪ ,‬אפיון ההתפתחות בזמן של הספקטרום‬
‫‪60‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :53‬אבולוציה של המאפיינים הספקטרליים של המצב המעורר ‪ S1‬של ‪ .pHR‬שלושת הגרפים מציגים הפרש‬
‫צפיפות אופטית כפונקציה של אורך הגל בזמנים שונים ומהווים חתכים רוחביים של הספקטרום הטרנזיינטי באיור ‪ 52‬כל‬
‫שלושת הגרפים מציגים בנוסף את בליעת מצב היסוד של ‪ pHR‬בירוק‪ .‬באמצעותה ניתן בקלות לאתר את הסיגנל השלילי‬
‫הנובע מה – ‪ photobleaching‬של מצב היסוד‪ .‬גרף ‪ 3‬מציג בצבע כחול את ספקטרום ההפרש ב ‪ 30ps -‬מוכפל ב – ‪.8‬‬
‫הטרנזיינטי של ‪ pHR‬נעשה באמצעות התאמה גלובלית שלו לאחר ניקויו על ידי ‪ ,SVD‬למודל קינטי המניח‬
‫קיום החל מזמן ‪ t = 0‬של כל הצורונים אשר תורמים לספקטרה ההפרש ) ‪ .(parallel kinetic model‬חמישה‬
‫‪ DAS‬הספיקו על מנת לקבל התאמה טובה‪ :‬ספקטרום קבוע שלא דועך בסקלת הזמנים של הניסוי שלנו‪,‬‬
‫שלושה ספקטרה אשר דועכים אקספוננציאלית עם הקבועים ‪ 2 ,0.22‬ו – ‪ 5ps‬וספקטרום המתנהג כמו פונקציית‬
‫‪ δ‬בזמן ומתאר את תרומת ה – ‪ CPM‬בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ probe‬לסיגנל‪ .‬הכנסתו של ‪ DAS‬זה נדרשת לצורך‬
‫קבלת התאמה טובה בזמנים המוקדמים‪ .‬כל ‪ DAS‬מהווה קונוולוציה של תגובת המערכת עם פונקציה גאוסית‬
‫בעלת רוחב של ‪ 70fs‬בחצי הגובה‪ ,‬היא פונקציית תגובת המכשור )‪ . (IRF‬איור ‪ 54‬מציג את חמשת ה – ‪.DAS‬‬
‫ניתן לראות כי שלושת ה – ‪ DAS‬הדועכים עם קבועי זמן סופיים כמעט חופפים בקצוות הספקטרום אבל שונים‬
‫באזור של הסיגנל החיובי הנובע מהופעת פס הבליעה של התוצר ‪.K‬‬
‫התבוננות מקרוב על החלק האדום של הספקטרום באזור של פס הפליטה המאולצת חושפת מודולציה‬
‫מחזורית דועכת של אמפליטודת הטרנזיינטים‬
‫באורכי גל ‪) 830nm – 670‬איור ‪ .(55‬מודולציה‬
‫זו קונסיסטנטית עם קיום ויברציות נמוכות תדר‬
‫של הכרומופור במצב אלקטרוני מעורר‬
‫הנובעות מתנועה קוהרנטית של חבילת גלים‬
‫ויברציונית אשר ממוקמת על המשטח העליון‬
‫במהלך העירור האימפולסיבי‪ .‬מודולציות‬
‫נמוכות תדר הרוכבות על טרנזיינטים באזור פס‬
‫הפליטה המאולצת דווחו עבור ‪ BR‬ועבור‬
‫‪ RPSB‬בתמיסה‪ .‬במקרה של ‪ BR‬תדר‬
‫הוויברציה הוא ‪ 170cm-1‬ועבור ‪ RPSB‬תדר זה‬
‫נמוך יותר ועומד על ‪ .120cm-1‬בשני המקרים‬
‫איור ‪ DAS :54‬המתקבלים על ידי התאמה גלובלית של‬
‫ספקטרום המוצג באיור ‪ 52‬עם סופרפוזיציה של פונקציות דעיכה האלה הוויברציה האחראית למודולציית‬
‫אקספוננציאליות בעלות קבועי דעיכה המוצגים בגרף‪.‬‬
‫הטרנזיינטים באזור הפליטה המאולצת יוחסה‬
‫‪61‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫איור ‪ :55‬בפנלים השמאליים נראים שאריות )‪ (residuals‬של הטרנזיינטים באורכי גל ‪) 728‬כחול עליון( ו – ‪810nm‬‬
‫)כחול תחתון( לאחר הפחתת התאמה פולינומיאלית של הדעיכות שלהם‪ .‬כמו כן מוצגים אותם ה – ‪ residuals‬לאחר‬
‫סינונם מרעש בעל תדר גבוה )בירוק(‪ .‬בפנל הימני רואים מפת ‪ DFT‬של החלק האדום של הספקטרום המכסה אזור של‬
‫פס הפליטה‪.‬‬
‫לתנועת פיתול המערבת חלקים גדולים של השלד המולקולרי של הרטינל ‪ .121,120,119‬אם המודולציות באזור‬
‫הפליטה ב – ‪ data‬שלנו משקפות את אותה הויברציה‪ ,‬הרי שתנועה מולקולרית זו אטית יותר ב – ‪ pHR‬מאשר‬
‫ב – ‪ BR‬ו – ‪ .RPSB‬כפי שרואים במפת ה – ) ‪ DFT (Discrete Fourier Transform‬בפנל הימני באיור ‪55‬‬
‫ויברציה זו מאפננת את הטרנזיינטים ב – ‪ 830nm – 670‬בתדר של כ – ‪ 90cm-1‬בלבד‪ .‬השארית האוסצילטורית‬
‫משנה סימן במעבר מ – ‪ 728‬ל – ‪ 810nm‬נשים לב כי אורכי גל אלה נמצאים בקצוות מנוגדים של פס הפליטה‬
‫המאולצת של ‪ . pHR‬נדון בהמשך מדוע נכון יותר לייחס את הוויברציות הנ"ל למצב מעורר ולא למצב יסוד‪.‬‬
‫תוצאות ניסוי ‪.SEP‬‬
‫פולסי ‪ dump‬המקוטבים במקביל ל – ‪ pump‬ו – ‪ probe‬הוספו לסכמה הניסיונית בשני ניסויים‬
‫שונים‪ .‬מטרת הראשון הייתה לבחון את השפעת ה – ‪ dump‬על האוכלוסייה המעוררת‪ ,‬כתלות בהשהיה בינו‬
‫לבין ה – ‪ .pump‬השני נועד לבדוק האם‪ ,‬ובאיזו מידה ה – ‪ dumping‬בזמנים השונים משנה את אוכלוסיית‬
‫מעגל האור‪ .‬הבדיקה הנ"ל נעשית באמצעות מעקב אחר שינויים בבליעת התוצר ‪ K‬הנגרמים על ידי הפולס‬
‫האינפרה אדום‪ ,‬בזמנים מאוחרים של ‪) 30ps‬כלומר לאחר שההיפוך הפנימי של הרטינל המעורר הסתיים(‪ .‬שני‬
‫ניסויים אלה אנלוגיים לניסוי על בקטריורודופסין אשר בוצע במעבדתנו ב – ‪ 2001‬ותואר בהרחבה במבוא‪ .‬איור‬
‫‪ 56‬מסכם את תוצאות הניסוי הראשון‪ .‬האיור מראה טרנזיינטים ממוצעים מפס הבליעה )המיצוע הוא על תחום‬
‫אורכי גל מ – ‪ 470‬עד ‪ (480nm‬והפליטה )‪ (833nm – 823‬וכמו כן‪ ,‬חלקים מתאימים ממוצעים של ספקטרום ה‬
‫– ‪ reference‬מאיור ‪ . 52‬הגרפים הקטנים המוכנסים מציגים את היחס בין הטרנזיינטים הממוצעים עם ובלי‬
‫‪ .dumping‬נסכם את הממצעים של ניסוי זה‪:‬‬
‫•‬
‫ניתן להבחין בכך שלאחר המתנה מתאימה חלקי הטרנזיינטים לאחר ה – ‪ dump‬חופפים )בגבול‬
‫הרעש( עבור כל ההדעכות‪ ,‬ללא שום תלות בזמן ההדעכה‪.‬‬
‫‪62‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫• ההדעכה המוקדמת ב – ‪ 0.75ps‬גורמת‬
‫לריקון פחות חזק של האוכלוסייה‬
‫המעוררת‪ ,‬רואים את זה הכי טוב בקפיצה‬
‫קטנה יותר באמפליטודה של הטרנזיינט‬
‫האדום ב – ‪.475nm‬‬
‫• התבוננות מדוקדקת יותר חושפת‬
‫הבדלים בין אפקט ה – ‪ dump‬על‬
‫הטרנזיינטים של הפליטה לאלה של‬
‫הבליעה‪ .‬בטרנזיינטים של פליטה רואים כי‬
‫ה – ‪ dump‬גורם ל"נפילת יתר" של‬
‫אמפליטודת הטרנזיינט אשר נצברת בחזרה‬
‫פמטושניות‪.‬‬
‫מאות‬
‫כמה‬
‫במהלך‬
‫בטרנזיינטים של הבליעה לעומת זה רואים‬
‫אפקט מתון יותר ובעל סימן הפוך‪ ,‬כלומר‬
‫האמפליטודה ממשיכה לקטון כמה מאות‬
‫פמטושניות לאחר ה – ‪.dump‬‬
‫• מידת נפילת האמפליטודה בבליעה‬
‫ובפליטה זהה‪ .‬יחס בין חלקי הטרנזיינטים‬
‫לאחר ה – ‪ dump‬ל טרנזיינט ללא ה –‬
‫‪ dump‬בשני המקרים הוא בסביבות ה –‬
‫איור ‪ :56‬תוצאות ניסויי ‪ pump – dump – probe‬בשני אורכי גל‬
‫המייצגים בליעה )‪ (475nm‬ופליטה )‪ (825nm‬של מצב מעורר ‪S1‬‬
‫‪ ,0.75‬כלומר כ – ‪ 25%‬מהאוכלוסייה‬
‫של ‪ .pHR‬הטרנזיינטים מראים תוצאות של ‪ dumping‬בזמנים‬
‫שונים בשטף קבוע של פולס ה – ‪ .dump‬כמו כן ניתן לראות את‬
‫המעוררת הוחזרה למצב יסוד על ידי פולס‬
‫תוצאות הניסוי ללא הדעכה )גרף שחור( בשני הפנלים‪ .‬הפנלים‬
‫ה – ‪.dump‬‬
‫הקטנים מראים יחס בין הטרנזיינט ללא ה – ‪ dump‬לזה עם ה –‬
‫‪ dump‬בהשהיות שונות בין ה – ‪ pump‬לפולס האינפרה אדום‪.‬‬
‫אי תלות של הסתברות הריקון של‬
‫האוכלוסייה המעוררת בהשהיה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ dump‬נצפתה גם עבור ‪ .BR‬במקרה ההוא אי התלות‬
‫יוחסה לכך שהאוכלוסייה המעוררת לא עוברת שינוי דינמי במהלך זמן החיים שלה‪ .‬מספר המולקולות‬
‫המעוררות משתנה אך המולקולות עצמן לא עוברות שינוי‪ . 86‬על מנת שנוכל לענות על השאלה האם הסבר כזה‬
‫מתאים לממצאים של הניסוי שלנו נצטרך תחילה לראות כיצד ה – ‪ dumping‬בזמנים השונים במהלך החיים‬
‫של אוכלוסייה המעוררת משפיע על הבליעה של התוצר ‪ .K‬ספקטרה הפרש של התוצר נמדדו בזמני השהיה‬
‫מאוחרים בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ ,probe‬ב – ‪ .30ps‬ספקטרום אחד כזה נראה בפנל ‪ 3‬באיור ‪ .53‬הורדת‬
‫האוכלוסייה המעוררת על ידי הפולס באינפרה אדום אל משטח היסוד מתבטאת בהקטנת האמפליטודה של‬
‫הספקטרום הנ"ל‪ .‬האמפליטודה מוקטנת באותו פקטור בכל אורכי הגל‪ ,‬בגבול הרעש‪ ,‬כך שספקטרום ההפרש‬
‫עם ה – ‪ dump‬מתכנתי לאותו הספקטרום ללא ה – ‪ .dump‬ממצא ניסיוני זו נלקח בתור הבסיס לחישוב שבר‬
‫האוכלוסייה שהופחת ממעגל האור‪ .‬עבור שמונה השהיות ‪ SEP‬אשר פורשות יותר מפעמיים את זמן החיים של‬
‫‪63‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫המצב המעורר ‪ ,S1‬נמדד ספקטרום ההפרש של התוצר ‪ K‬ב – ‪ .30ps‬עבור שמונת הספקטרה חושב שבר‬
‫ההפחתה על פי הנוסחה הפשוטה הבאה‬
‫‪.‬‬
‫)∣‪∑ (∣dumped difference spectrum@ 30 ps‬‬
‫‪depletion fraction=1− λ‬‬
‫)∣‪∑ (∣difference spectrum @30 ps , no dump‬‬
‫)‪(32‬‬
‫‪λ‬‬
‫איור ‪ 57‬מציג את התוצאה‪ ,‬כפונקציה של ההשהיה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ dump‬על רקע גרף המתאר את‬
‫הדעיכה הבי אקספוננציאלית של פליטת האוכלוסיה המעוררת בערכה המוחלט‪ .‬הגרף הקטן בפינה הימנית‬
‫העליונה מציג שני ספקטרה הפרש של ‪ K‬עם ובלי ‪ ,dumping‬כאשר הספקטרום עם הפולס האינפרה אדום‬
‫נמדד עבור ההשהיה הקצרה ביותר‪ ,0.75ps ,‬בינו לבין הפולס המעורר‪.‬‬
‫איור ‪ :57‬שבר ההפחתה מאוכלוסיית ‪ K‬כפונקציה של השהיית ה –‬
‫‪ SEP‬מוצג על רקע טרנזיינט של הפליטה המאולצת ב – ‪830nm‬‬
‫בערכו המו חלט‪ ,‬באותה סקלת זמנים‪ .‬אמפליטודת הטרנזיינט‬
‫מתכונתית לריכוז המצבים המעוררים‪ .‬הגרף הקטן בפינה ימנית‬
‫עליונה מראה את השפעת הפולס האינפרה אדום ב – ‪ 0.75ps‬על‬
‫הספקטרום ההפרש של התוצר ‪ K‬ב – ‪.30ps‬‬
‫להלן הממצאים‪:‬‬
‫•‬
‫ניתן "לקצר" את מעגל האור לאורך כל זמן החיים של אוכלוסיה מעוררת ‪.S1‬‬
‫•‬
‫מידת ההנחתה של אוכלוסיית מעגל האור‪ ,‬כפי שזאת באה לידי ביטוי בהקטנה הנגרמת על ידי ה –‬
‫‪ dump‬של אמפליטודת הספקטרום של התוצר ‪ , K‬מתכונתית לריכוז החלבונים המעוררים ברגע ה ‪-‬‬
‫‪ ,dumping‬בגבול האי דיוק של הניסוי שלנו‪.‬‬
‫‪64‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫דיון בתוצאות‪ .‬א‪ .‬צורת הטרנזיינטים בזמני השהיה מוקדמים‪.‬‬
‫ספקטרה בליעה טרנזיינטיים המוצגים באיור ‪ 52‬מזכירים את אלה של ‪ sHR‬אשר פורסמו על ידי‬
‫‪ Kandori‬ב – ‪ 1992‬ו – ‪ Kobayashi‬ב – ‪ ,1998‬לרבות האמפליטודה היחסית של פסי בליעה ופליטה והצורה‬
‫ה"דו דבשתית" של פס הפליטה המאולצת )איורים ‪ 26‬ו – ‪ .(31‬זמני הדעיכה של המאפיינים הספקטרליים של‬
‫המצב המעורר ‪ S1‬אשר התקבלו מהתאמה גלובלית של הנתונים שלנו מהירים מאלה של ‪ sHR‬ודומים מאוד‬
‫לאלה שפורסמו על ידי ‪ Nakamura‬עבור ‪.56pHR‬‬
‫היבט אחד של תוצאות שלנו לא נצפה בעבודה ההיא‪ .‬מדובר בדעיכה מאוד מהירה ) ‪ ,(~200fs‬לא‬
‫אקספוננציאלית של בליעת המצב המעורר סביב ‪) 470nm‬איור ‪ 58‬פנל שמאלי מציג נתונים שהתקבלו בניסוי‬
‫שלנו‪ ,‬בשטפי ‪ pump‬שונים‪ .‬טרנזיינט אשר התקבל באורך גל ‪ probe‬של ‪ 490nm‬על ידי ‪ Nakamura‬וקולגות‬
‫נראה באדום בפנל ימני של איור זה‪ .‬כפי ששמים לב‪ ,‬אין לו רכיב דעיכה מהיר בזמנים המוקדמים(‪ .‬מכיוון‬
‫שהדוגמאות אקוויוולנטיות‪ ,‬מקור השוני הוא כנראה בייחוד אינטראקציית ה – ‪ pump‬עם הדגם בכל אחד משני‬
‫הניסויים‪.‬‬
‫שני מאפיינים של ה – ‪ pump‬עשויים ליצור את ההבדלים בין שני הסטים של ה – ‪ :data‬עוצמת‬
‫הפולס ואורך הגל המרכזי שלו‪ .‬מכיוון שבניסוי שלנו רצינו למדוד בדיוק מספיק טוב הפרשי אמפליטודה קטנים‬
‫הנגרמים על ידי ה – ‪ dump‬של ספקטרה חלשים של התוצר‪ ,‬היינו חייבים להגדיל את שטף ה – ‪ pump‬על מנת‬
‫להפיק יותר אוכלוסיה מעוררת אשר תגיב בחלקה לתת את התוצר ‪ .K‬יותר אוכלוסיה מעוררת משמעותה יותר‬
‫תוצר‪ ,‬אך נדרש שטף ‪ pump‬גבוה יותר על מנת לייצרה‪ .‬שטף גבוה יותר יעלה את הסיכוי לבליעה דו – פוטונית‬
‫אשר עלולה לעוות את הדינמיקה הספקטרלית‪ ,‬ובין היתר לגרום להופעה של דעיכה חדה לא אקספוננציאלית‬
‫בזמנים המוקדמים‪.‬‬
‫על מנת לוודא כי אין השפעת בליעה דו פוטונית על ערכי קבועי הדעיכה אשר קיבלנו מההתאמה‬
‫הגלובלית לספקטרה הטרנזיינטיים שלנו בדקנו את התנהגות האמפליטודה של הטרנזיינטים ב – ‪470nm‬‬
‫כפונקציה של עוצמת העירור‪ .‬פנל שמאלי של איור ‪ 58‬מציג את התוצאה‪ .‬ניתן לראות כי היחס בין חלקי‬
‫הטרנזיינטים המתקבלים בעוצמות של ‪ ( 6.5×10 14 photons /cm2 ) 20μW‬ו – ‪ 40μW‬לבין טרנזיינט‬
‫איור ‪ :58‬השוואה בין דינמיקה ספקטרלית בזמנים מוקדמים בעבודה של ‪) Nakamura‬ימין( ובעבודתנו )שמאל(‪ .‬הפנל‬
‫השמאלי מציג את הטרנזיינט ב – ‪ 470nm‬המתקבל בעוצמות ‪ pump‬שונות‪ .‬הגרף המוכנס הקטן מראה את היחס בין‬
‫הטרנזיינטים בזמנים מ – ‪ 250fs‬עד ‪.2.5ps‬‬
‫‪65‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫המתקבל בעצמה של ‪ 10μW‬נשאר קבוע )בגבול הרעש( מ – ‪ 250fs‬עד ‪ .2.5ps‬מכאן שהתרומה של דינמיקה‬
‫ספקטרלית אשר נובעת מבליעה דו – פוטונית של הדגם זניחה אפילו בעוצמות הגבוהות של ‪ .40μW‬נציין כי‬
‫הניסויים בוצעו בעוצמת ‪ pump‬שלא עולה על ‪ ,20μW‬למען הסר כל ספק‪ .‬כמו כן‪ ,‬בכל ניסויי ‪ SEP‬ה –‬
‫‪ dumping‬נעשה לאחר הפאזה הדינמית אשר מערבת את הדעיכה הלא אקספוננציאלית המהירה‪ .‬מקור השוני‬
‫בין הנתונים שלנו לבין אלה של ‪ Nakamura‬יכול להיות נעוץ באורכי גל ‪ pump‬שונים בשני הניסויים‪ .‬ה –‬
‫‪ pump‬שלנו היה כחול יותר‪ 570nm ,‬מול ‪ 610nm‬בניסוי שלהם‪ ,‬אך זוהי השערה שטרם נבדקה‪.‬‬
‫ב‪ .‬מבנה פס הפליטה המאולצת‪.‬‬
‫את מבנה פס הפליטה המאולצת באזור של ‪ >650nm‬אנו מייחסים לתוצאה של חפיפת בליעה של‬
‫המצב המעורר עם פליטה שלו‪ .‬חפיפה כזו הוצעה לראשונה על ידי ‪P. A. Anfinrud, K. C. Hasson, F.‬‬
‫‪ Gai‬בעבודתם מ – ‪ , 1996‬כהסבר לשיא המוסת לאדום של פליטה מאולצת של בקטריורודופסין‪ ,‬לעומת שיא‬
‫הפלואורסנציה של חלבון זה ) בבקטריורודופסין אמנם לא רואים מבנה "דו דבשתי" של הפליטה המאולצת‪ ,‬אבל‬
‫גם שם יש עדויות לחפיפה של פליטה מאולצת ובליעה באורכי גל ‪ . 102(1000nm – 600‬מאוחר יותר רעיון זה‬
‫אומץ על ידי ‪ O. Bismuth‬לצורך מתן הסבר לשני השיאים הנפרדים של הפליטה המאולצת של ‪ .103RPSB‬גם‬
‫במקרה זה השיקול המרכזי לאימוץ השערת החפיפה היה חוסר ההתאמה של ספקטרום הפליטה המאולצת עם‬
‫ספקטרום הפלואורסנציה‪ .‬הצורה הנקייה מחפיפות של פס הפליטה המאולצת צריכה לשחזר את הצורה של פס‬
‫הפלואורס נציה‪ ,‬ניתן לגזור את פס הפליטה המאולצת מהפלואורסנציה על ידי הכפלתה בפקטור ‪ .ν2‬ספקטרה‬
‫פלואורסנציה של ‪ RPSB‬בממסים שונים אשר נלקחו מהמאמר של ‪ G. Zgrablić‬נראים בחלקו השמאלי של‬
‫איור ‪ . 8259‬כמו כן‪ ,‬האיור הנ"ל מציג ספקטרה הפרש בליעה טרנזיינטיים מתוצאות המחקר של ‪O. Bismuth‬‬
‫)חלק ימני(‪ .‬רואים כי לפליטה המאולצת שני שיאים ב – ‪ 670‬וב – ‪ .900nm‬מנגד‪ ,‬הפלואורסנציה בעלת שיא‬
‫יחיד ב – ‪ 600‬עד ‪ ,700nm‬כתלות בממס‪.‬‬
‫איור ‪ :59‬השוואה בין ספקטרה בליעה טרנזייניים של ‪ RPSB‬מהעבודה של ‪O. Bismuth‬‬
‫)ימין( לספקטרה פלואורסנציה במצב עמיד של מולקולה זאת‪ ,‬בממסים שונים אשר פורסמו‬
‫על ידי ‪) G. Zgrablić‬שמאל‪ ,‬ספקטרה פלוארסנציה הם האדומים יותר‪ .‬הכחולים מציגים את‬
‫הבליעה(‪ .‬לפליטה המאולצת שני שיאים ב – ‪ 670‬וב – ‪ .900nm‬לפלואורסנציה שיא יחיד‬
‫באזור ‪.700nm – 600‬‬
‫‪66‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫ניסויי פלואורסנציה מופרדת זמן אולטרה מהירה של ‪ pHR‬תרם נעשו‪ .‬כמו כן‪ ,‬לא מצאנו ולא מדדנו‬
‫ספקטרום פלואורסנציה במצב עמיד של חלבון זה‪ .‬ספקטרום כזה עבור ‪ sHR‬פורסם‪ ,‬ניתן לראות אותו באיור‬
‫‪ . 23‬מהשוואה של ספקטרום זה עם הנתונים של הבליעה הטרנזיינטית של אותו החלבון מהעבודות של‬
‫‪ Kobayashi‬עולה חוסר ההתאמה כמו עבור ‪ .RPSB‬פלואורסנציה של ‪ sHR‬בעלת שיא יחיד ב – ‪690nm‬‬
‫ואילו לפליטה המאולצת שני שיאים ב – ‪ 725‬ו – ‪ .850nm‬על מנת לקבוע אם קיימת חפיפה של פליטה מאולצת‬
‫ובליעה באזור ספקטרלי ‪ >650nm‬בספקטרה הפרש בליעה טרנזייניים של ‪ pHR‬צריך לבחון את ספקטרום‬
‫פלואורסנציה של חלבון זה‪ .‬אולם‪ ,‬חפיפה כזאת קיימת בוודאות ב – ‪ BR, RPSB‬וב – ‪ sHR‬מה שמחזק את‬
‫הטענה שהדבר נכון גם עבור ‪.pHR‬‬
‫בהינתן והחפיפה אכן קיימת ב – ‪ pHR‬אזי הסיבה לכך שפולס ה – ‪ dump‬שלנו אדום כל כך ברורה‬
‫לחלוטין‪ .‬תוצאת ‪ dumping‬לתוך פס הפליטה המאולצת באזור של החפיפה היא בין היתר שאיבת האוכלוסיה‬
‫המעוררת אל רמות מעוררות גבוהות יותר )‪ .(Sn‬אנחנו לא מעוניינים בכך כי לא ניתן לדעת אם אוכלוסיה‬
‫מעוררת על משטחי פוטנציאל גבוהים תוביל לתוצר או תחזור אל המגיבים‪ .‬אין אנו יודעים בוודאות על קיום‬
‫אזור ספקטרלי "בטוח" ל – ‪ dumping‬בהקשר זה ב – ‪ ,pHR‬אך ידוע כי הפליטה המאולצת של ‪RPSB‬‬
‫מעורר נמשכת לאינפרה אדום קרוב ודועכת סופית באזור של ‪ ,1300nm‬כמו כן באזור של ‪ 1200nm‬הפליטה של‬
‫‪ RPSB‬לא מראה שום מבנה העשוי לרמוז על חפיפתה עם בליעה ‪ .122‬לפיכך‪ ,‬בחירת אזור ספקטרלי זה עבור ה –‬
‫‪ dump‬שלנו הגיונית‪ .‬מצד אחד התרחקנו מספיק מאזור החפיפה ומצד שני‪ ,‬ב – ‪ 1150nm‬האמפליטודה‬
‫הספקטרלית של הפליטה המאולצת של ‪ pHR‬מעורר עודנה משמעותית‪.‬‬
‫ג‪ .‬דינמיקה ספקטרלית בזמני השהיה מוקדמים‪.‬‬
‫פס הבליעה של המצב המעורר הממורכז סביב ‪ 470nm‬ומיוחס למעברים ‪ S1 → Sn‬מוסט לכחול‬
‫במאות פמטושניות ראשונות מזמן העירור‪ .‬מאידך‪ ,‬קשה לראות הסט של פס הפליטה המאולצת באורכי גל‬
‫‪ >650nm‬הנגרם על ידי המעבר מהמצב המעורר ‪ S1‬אל מצב יסוד )‪ (S1 → S0‬בזמנים המוקדמים‪ .‬ממצא זה‬
‫מעניין בהתחשב בעובדה כי אותה אוכלוסייה מעוררת משתתפת בשני המעברים‪ .‬נציין כי הסט של פלואורסנציה‬
‫איור ‪ :60‬הסט לאדום של פלואורסנציה טרנזיינטית של ‪) RPSB‬פנל ימין( ושל ‪) BR‬פנל שמאל(‬
‫במאות פמטושניות ראשונות מרגע העירור‪ .‬הקו בספקטרה של ‪ BR‬מסמן את הזמן של מקסימום‬
‫הפלואורסנציה באורך גל מסוים‪.‬‬
‫‪67‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫טרנזיינטית לאדום בסקלה של מאות פמטושניות נצפה עבור ‪ BR‬ו – ‪ RPSB‬במתאנול )איור ‪ .(60‬אך כמו‬
‫במקרה של ‪ , pHR‬הסטים של פליטה מאולצת לא נראים בספקטרה בליעה טרנזיינטיים של אותם צורונים‪.‬‬
‫החוקרים ‪ B. Schmidt, C. Sobotta‬וקולגות אשר ראו לראשונה את ההסט לאדום של פלואורסנציה‬
‫טרנזיינטית של בקטריורודופסין )החלק השמאלי של איור ‪ 60‬מציג את התוצאות שלהם( מסבירים אותו במונחים‬
‫של הסט ‪ Stokes‬דינמי אשר נובע מתנועה של חבילת גלים ויברציונית על משטח פוטנציאל מעורר דוחה אל‬
‫עבר החתך הקוני‪ . 123‬אולם‪ ,‬קיימים הסברים אחרים לתופעה‪ .‬הצגנו עדויות מוצקות לכך שאזור – ‪Franck‬‬
‫‪ Condon‬של משטח הפוטנציאל האלקטרוני ‪ S1‬של רודופסינים ארכיאליים יכול להיות די שטוח ומופרד‬
‫מהחתכים הקוניים על ידי מחסום‪ .86‬במקרה זה הסט ‪ Stokes‬דינמי יכול להיגרם על ידי התארגנות מחדש של‬
‫שיירי האתר הפעיל של החלבון בעקבות עירור הכרומופור במקרה של ‪ BR‬ו – ‪ pHR‬או רלקסציה דיאלקטרית‬
‫של הממס במקרה של ‪ . 82RPSB‬הסט לאדום של פליטה מאולצת יכול להיות מוסווה על ידי הסט לכחול של‬
‫הבליעה החופפת אותה‪ ,‬לכן לא מן הנמנע שהסט פס הפליטה המאולצת של ‪ pHR‬מעורר קיים אך קשה להבחין‬
‫בו‪.‬‬
‫ד‪ .‬מודולציות פס הפליטה המאולצת‪.‬‬
‫את מודולציות פס הפליטה המאולצת של ‪ pHR‬אשר נצפו בניסוי שלנו ניתן לייחס במידה רבה של‬
‫וודאות לוויברציות פיתול נמוכות תדר‪ ,‬מעוררות קוהרנטית על המשטח ‪ S1‬של הכרומופור‪ .‬כפי שציינו בחלק‬
‫הניסיוני‪ ,‬מודולציות כאלה יכולת להיגרם על ידי דינמיקה על המשטח היסודי‪ .‬אולם‪ ,‬בעבודתם של ‪ Zgrablić‬ו‬
‫– ‪ Haake‬מ – ‪ ,2007‬מודולציות בתדר ‪ ~120cm-1‬נמצאו רוכבות על פס הפלואורסנציה של ‪RPSB‬‬
‫בתמיסה‪ . 119‬אי לכך‪ ,‬הטענה כי ניתן לייחס את אפנון פס הפליטה המאולצת ברודופסינים ארכיאליים לוויברציות‬
‫של המצב המעורר מקבלת חיזוק משמעותי‪ .‬תדר של מודולציות אלה ב – ‪ pHR‬נמוך יחסית לתדרים המזוקקים‬
‫מפס הפליטה ב – ‪ BR‬ו – ‪) RPSB‬התדרים הם ‪ 170‬ו – ‪ 120cm-1‬בהתאמה(‪ .‬זהו ממצא ניסיוני מעניין לאור‬
‫ההסבר אשר ניתן לתדר גבוה יותר של ויברציית פיתול של הכרומופור המעורר בבקטריורודופסין לעומת‬
‫‪ RPSB‬בתמיסה‪ .‬בעבודה של ‪ Bixue Hou‬מ – ‪ 2003‬נטען כי העלאת תדר וויברציה זו של הרטינל כאשר הוא‬
‫נמצא בתוך החלבון נגרמת על ידי כוחות המופעלים על הכרומופור על ידי סביבת האתר הפעיל במהלך‬
‫איזומריזציה מושרית אור שלו‪ .‬לטענת החוקרים‪ ,‬כוחות אלה הם האחראיים להגברת קצב ההיפוך הפנימי של‬
‫הרטינל וכפיית הסטריאוסלקטיביות של האיזומריזציה של הכרומופור בבקטריורודופסין‪ .121‬לפי ההסבר הנ"ל‬
‫התדר הנמוך יחסית אפילו ל – ‪ RPSB‬בתמיסה של וויברציה זו ב – ‪ pHR‬נובע מריכוך עקומת הפוטנציאל‬
‫כפונקציה של קואורדינטת הפיתול עם הכנסת הכרומופור לאתר הפעיל של חלבון האב‪ .‬נציין כי בסימולציה של‬
‫דינמיקה מושרית אור ראשונית של ‪ sHR‬אשר נעשתה בשנת ‪ 2009‬על ידי ‪ C. Pfisterer‬וקולגות הוצע כי‬
‫עקומת הפוטנציאל אשר מכתיבה את תנועת הפיתול של הכרומופור סביב הקשר ‪ C13=C14‬שטוחה יותר‬
‫במצב ‪ K‬מאשר במצב יסוד התחלתי ‪ . 24 all – trans‬נכון לעכשיו תרם התפרסם מחקר תאורטי שיעזור להחליט‬
‫האם זה יכול להיות נכון גם עבור המצב המעורר של הלורודופסינים‪.‬‬
‫‪68‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫ה‪ .‬דיון בהבדלי התנהגות של יחס הטרנזיינטים בבליעה ובפליטה בתוצאות ניסוי ‪.SEP‬‬
‫לאחר אפיון אבולוציה ספקטרלית של ‪ pHR‬מעורר‪ ,‬דינמיקה מולקולרית מושרית אור המולידה אותה‬
‫נחקרת על ידי בחינת ההשפעה של פולסי ‪ dump‬אינפרה אדומים ב – ‪ 1.15µm‬על ספקטרה הפרש טרנזיינטיים‬
‫של הפיגמנט‪ .‬מההסתכלות על הגרף המציג את היחס‬
‫‪.‬‬
‫)‬
‫‪∆OD (t )dump‬‬
‫‪∆OD (t)no dump‬‬
‫(‬
‫=) ‪(33) R(t‬‬
‫בפנלים הקטנים של איור ‪ , 56‬הן בפס הבליעה והן בפס הפליטה‪ ,‬ברור כי כל עוד קיימת אוכלוסיה מעוררת ניתן‬
‫להחזיר אותה למשטח פוטנציאל של מצב יסוד על ידי פולסי ה – ‪ .dump‬יתרה מכך‪ ,‬הטרנזיינטים בשני‬
‫האזורים הספקטרליים הללו מדגימים כי שבר ההפרש של צפיפות האופטית ומכאן שבר האוכלוסיה המעוררת‬
‫המוחזר למשטח התחתון לא תלוי בהשהיה בין ה – ‪ pump‬ל – ‪ .dump‬זאת אנו לומדים מההתקרבות‬
‫האסימפטוטית של )‪ R(t‬לאותו הערך ללא שום תלות בהשהיית ה – ‪.dump‬‬
‫מאפיין אחד של היחס )‪ R(t‬שהוא תלוי אורך גל‪ ,‬הוא כוון ההתקרבות של עקומות אלה לערך‬
‫האסימפטוטי שלהן‪ .‬יחסי הטרנזיינטים בפס הפליטה המאולצת שואפים לערך האסימפטוטי מלמתה‪ ,‬כלומר‬
‫היחס )‪ R(t‬גדל בסקלה של כמה מאות פמטושניות לאחר ה – ‪ .dumping‬לעומת זה‪ ,‬בפס הבליעה הערך‬
‫ההתחלתי של יחס הטרנזיינטים מעט גדול יותר מהערך האסימפטוטי והעקומות מת קרבות אליו מלמעלה‪.‬‬
‫היבנות מחדש של אמפליטודת טרנזיינטים בפסי פליטה מאולצת נצפתה במספר ניסויי ‪ SEP‬עם רזולוציית זמן‬
‫טובה שנעשו על מולקולות אורגניות גדולות‪ .125,124‬למיטב ידיעתנו‪ ,‬התנהגות כגון זאת הנראית בניסוי שלנו‬
‫בטרנזיינטים של בליעה‪ ,‬בעקבות מעבר פולס ‪ dump‬בדגם‪ ,‬לא דווחה נכון להיום‪.‬‬
‫תופעה של הפחתה התחלתית והשחזור הבא בעקבותיה של פליטה מאולצת לאחר ה – ‪ SEP‬הוסברה‬
‫בעבר על ידי כך שהפולס הנוסף לסכמה הניסיונית ) ‪ dump‬במקרה שלנו( מעביר אוכלוסיה באופן אימפולסיבי‪.‬‬
‫הוא מייצר חבילות גלים ויברציוניות על משטח הפוטנציאל אליו הוא מעביר אוכלוסיה מ – ‪ .S1‬זהו המשטח‬
‫היסודי במקרה שהפולס הנוסף מבצע ‪ , dumping‬כמו בניסוי שלנו‪ .‬משמעות נוספת של העברה אימפולסיבית‬
‫של אוכלוסיה על ידי ה – ‪ dump‬היא שריפה של חור ממוקם בחבילת הגלים על ‪ .S1‬נזכור כי משטחי‬
‫הפוטנציאל המצומדים על ידי שלושת הפולסים ‪ pump/dump/probe‬הם פונקציות של קואורדינטות אינטרה‬
‫ואינטר מולקולריות‪ .‬במילים אחרות‪ ,‬מדובר ביצירה אימפולסיבית על ידי ה – ‪ dump‬של העדר מקומי של‬
‫אוכלוסיה מעוררת על משטח פוטנציאל רב ממדי ‪ S1‬ועודף מקומי של אוכלוסיה על ‪ ,S0‬בקואורדינטות‬
‫מולקולריות בהן ה – ‪ dump‬מצמד את שני המשטחים‪ ,‬היסודי והמעורר‪.‬‬
‫בניסוי ‪ SEP‬שבו הספקטרום של ה – ‪ dump‬חופף באופן חלקי או מלא את זה של ה – ‪ probe‬חבילת‬
‫גלים ממוקמת אשר תופיע על ‪ S0‬בעקבות ה – ‪ dumping‬תתרום באופן מיידי לבליעה של ה – ‪ probe‬מה‬
‫שיראה במדידה כהגדלת הצפיפות האופטית של הדגם בתחום אורכי גל המרכיבים את ספקטרום ה – ‪dump‬‬
‫)נראה תוספת של סיגנל חיובי באורכי גל אלה(‪ .‬בו בזמן‪ ,‬החור הנפער בעקבות ה – ‪ dumping‬על ‪,S1‬‬
‫בקואורדינטות מולקולריות אופטימליות לצימוד בין ‪ S1‬לבין ‪ S0‬על ידי ה – ‪ ,dump‬יפחית את הפליטה‬
‫המאולצת באזור אורכי גל של ה – ‪) dump‬פחות סיגנל שלילי(‪ .‬דינמיקה הנגרמת על ידי ה – ‪ dump‬במצב‬
‫יסוד תשפיע רק על הפליטה המאולצת ואילו בכוחו של החור הקוהרנטי הנפער ב – ‪ S1‬להשפיע גם על הפליטה‬
‫‪69‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫וגם על הבליעה של האוכלוסיה המעוררת )איור ‪.(61‬‬
‫החור על ‪ S1‬וחבילת הגלים על ‪ S0‬הנוצרים על ידי ה – ‪ dump‬הם בטוח לא סטציונריים‪ ,‬אי לכך‪,‬‬
‫השחזור החלקי של הפליטה המופחתת על ידי ה – ‪ SEP‬הגיוני ונובע מעזיבת המבנים הקוהרנטיים את חלון‬
‫‪ Franck – Condon‬המוגדר על ידי אורכי הגל של ה – ‪ dump‬ו‪/‬או איבוד קשר מופע של האוכלוסיה‬
‫המולקולרית המרכיבה את הקונסטרוקציות הללו‪.‬‬
‫בניסוי שלנו אורך גל מרכזי של ה – ‪ dump‬היה באזור ‪ 1160nm – 1150‬רחוק מתחום אורכי הגל‬
‫המכוסה על ידי ה – ‪ .probe‬נובע מכך שקואורדינטות מולקולריות בהן ה – ‪ dump‬מאלץ חזק את המעבר‬
‫‪ S 1 → S 0‬שונות מאלה בהן המשטחים הללו מצומדים על ידי ה – ‪ .probe‬כמו כן‪ ,‬אין לנו סיבה להניח כי‬
‫בליעת המצב המעורר מתרחשת בקואורדינטות המוגדרות על ידי ספקטרום ה – ‪ .dump‬אילו זה היה המצב‪,‬‬
‫הגיוני היה לצפות כי עצמת הבליעה תופחת ביתר ותשתחזר לאחר מכן‪ ,‬כלומר טרנזיינטים של הבליעה היו‬
‫מתנהגים כמו אלה של הפליטה )איור ‪ .(61‬אולם‪ ,‬התנהגותם הפוכה‪.‬‬
‫ייתכן כי ההתקרבות מלמעלה בטרנזיינטים של הבליעה של היחס )‪ R(t‬הנראית בניסוי שלנו מלמדת על‬
‫דיפוזיה מהירה מאוד‪ ,‬בסקלה של מאות פמטושניות‪ ,‬של החור הקוהרנטי המיוצר על ידי ה – ‪ dump‬על ‪.S1‬‬
‫הרחקה התחלתית של אוכלוסיה מעוררת על ידי הפולס האינפרה אדום שלנו מתבצעת כאמור באזור ספציפי של‬
‫קואורדינטות מולקולריות‪ .‬אזור זה הוא לא נקודה מתמטית‪ ,‬הספקטרום של ה – ‪ dump‬הוא אחרי הכל בעל‬
‫רוחב סופי‪ .‬לכן ההרחקה מתרחשת בעדיפות באזור הצימוד האופטימלי‪ ,‬אבל גם אזורים אחרים יכולים להיות‬
‫מושפעים‪ ,‬במילים אחרות‪ ,‬החור הנפער על ‪ S1‬הוא יחסית רחב‪ .‬הנפילה הראשונית בטרנזיינטים של הבליעה‬
‫מעידה במקרה זה על הרחקת אוכלוסיה על ידי ה – ‪ dump‬מ – ‪ .S1‬הרחקה זו מתבצעת באופן מועדף‬
‫איור ‪ :61‬הצגה סכמטית של ניסוי ‪ .SEP‬אנו מבאים כאן בתור דוגמה מקרה פשוט שבו‪ :‬א‪ .‬משטחי הפוטנציאל ) ‪ S0, S1‬ו‬
‫– ‪ ( Sn‬הם פונקציות של קואורדינטה נורמלית אחת בלבד‪ ,‬ב‪ .‬הצימוד בין שלושת המשטחים המוצגים כאן על ידי פולסי‬
‫‪ probe‬ו – ‪ dump‬הוא באותה נקודה על קואורדינטה ‪ .Q‬חבילת הגלים הויברציונית על גבי ‪ S1‬מיוצגת על ידי העקומה‬
‫הכתומה‪ ,‬אוכלוסיית מצב היסוד לא מוצגת‪ .‬החצים מייצגים את פולס ה – ‪ .probe‬הפנלים ‪ ,2 , 1‬ו – ‪ 3‬מציגים שלבים‬
‫בניסוי‪ (1 :‬זמן מה אחרי ה – ‪ pump‬קיימת על משטח ‪ S1‬אוכלוסיה מעוררת‪ .‬אוכלוסיה זו בולעת בכחול ופליטתה‬
‫מאולצת על ידי ה – ‪ probe‬באדום‪ (2 .‬מיד לאחר ה – ‪ .dumping‬חלק מאוכלוסיית ‪ S1‬מועבר על ידי ה – ‪dump‬‬
‫למשטח פוטנציאל יסודי‪ .‬מעבר האוכלוסיה הוא אימפולסיבי ולכן נוצרים על גבי המשטחים ‪ S1‬ו – ‪ S0‬מבנים קוהרנטיים‬
‫לא סטציונריים‪ ,‬חור דינמי על ‪ S1‬וחבילת גלים דינמית על ‪ .S0‬מיד לאחר ה – ‪ dumping‬האוכלוסיה שהועברה למשטח‬
‫היסודי תבלע באותו אורך גל שבו ה – ‪ probe‬מאלץ פליטה של האוכלוסיה המעוררת על ‪ S1‬ובכך יתווסף סיגנל חיובי‬
‫הנובע מבליעת האוכלוסיה החדשה על ‪ S0‬לסיגנל שלילי הנובע מהפליטה המאולצת‪ .‬כתוצאה מכך נראה הפחתה של‬
‫הסיגנל השלילי‪ .‬כמו כן‪ ,‬החור הנפער בחבילת הגלים על ‪ S1‬יפחית הן את הבליעה של אוכלוסיה זו והן את הפליטה‬
‫המאולצת שלה‪ (3 .‬כעבור מספיק זמן לאחר ה – ‪ dump‬המבנים הקוהרנטיים עוזבים את חלון ‪ F – C‬ו‪/‬או עוברים‬
‫דיפוזיה‪ .‬האוכלוסיה על ‪ S1‬בנקודת הצימוד משתחזרת באופן חלקי מה שיגרום לשחזור חלקי של עצמת הבליעה של‬
‫האוכלוסיה המעוררת ושל עצמת הפליטה המאולצת שלה‪.‬‬
‫‪70‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫בקואורדינטות שונות מאלו בהן מתרחשת בליעה של המצב המעורר‪ .‬הנפילה הנוספת שבאה לידי ביטוי‬
‫בהתקרבות מלמעלה של יחס הטרנזיינטים )‪ R(t‬מרמזת על התרחבות )דיפוזיה( של אותו חוסר אוכלוסיה מקומי‬
‫והגעתו לאזור הקואורדינטות האופטימלי לבליעה‪ ,‬ליתר דיוק‪ ,‬מדובר בדיפוזיה של אוכלוסיה של כרומופורים‬
‫אשר נמצאת בגאומטריה מולקולרית אופטימלית לצימוד בין ‪ S1‬ל – ‪ Sn‬על ידי ה – ‪ probe‬לאזור של חוסר‬
‫האוכלוסיה )החור( אשר ייצר פולס ה – ‪.dump‬‬
‫הסבר זה של התנהגות של הטרנזיינטים של הבליעה לא חייב להתנגש במה שרואים בפליטה‪ .‬יכול‬
‫להיות כי במקרה של הפליטה אזורי קואורדינטות לצימוד אופטימלי בין ‪ S1‬ל – ‪ S0‬על ידי ה – ‪ dump‬וה –‬
‫‪ probe‬פחות רחוקים אחד מהשני מאשר במקרה של הבליעה‪ .‬הגאומטריה המולקולרית יכולה להיות די דומה‪.‬‬
‫כלומר התנהגות של )‪ R(t‬אשר מזכירה את זו הנגרמת במקרה הפשוט שבו ספקטרה ה – ‪ dump‬וה – ‪probe‬‬
‫חופפים )התנהגות זו מנותחת באיור ‪ (61‬לא צריכה להפתיע‪ .‬בכל אופן‪ ,‬מעניין יהיה לבדוק כיצד תשתנה מגמת‬
‫היחס של הטרנזיינטים של הפליטה ובליעה כפונקציה של משך ואורך גל מרכזי של ה – ‪ .dump‬אינפורמציה‬
‫שתתקבל בניסוי כזה עשויה להיות שימושית לצורך מיפוי משטחי הפוטנציאל האלקטרוניים המעורבים‬
‫בספקטרוסקופיה ופוטוכימיה של חלבונים רטינליים ארכיאליים‪.‬‬
‫ו‪ .‬תובנות מניסוי ‪.SEP‬‬
‫אי השתנות עם הזמן של חתך הפעולה לפליטה מאולצת על ידי הפולסים האינפרה אדומים של כלל‬
‫האוכלוסיה המעוררת העולה מממצאי הניסוי המסוכמים באיור ‪ 56‬כבר מרמזת על כך שהמאפיינים הספקטרליים‬
‫של ‪ S1‬שייכים לאוכלוסיה מעוררת אחת בלבד‪ .‬לדעתנו‪ ,‬תגובה זהה לחלוטין של שתי אוכלוסיות מעוררות‬
‫שונות לפולסי ה – ‪ dump‬לא סבירה‪ .‬אך אין ממצאים אלה מהווים ראיה ישירה לאי קיום שתי אוכלוסיות ‪S1‬‬
‫שונות‪ .‬ניתן להגיע למסקנה זאת רק על ידי מעקב אחר אמפליטודת ספקטרום ההפרש של ‪ K‬עם ובלי‬
‫‪ .dumping‬התוצאות המסוכמות באיור ‪ 57‬מראות כי האוכלוסיה המונחתת לא רק מורחקת ממעגל האור‪ ,‬אלה‬
‫גם שניתן "לקצר" את המעגל בכל שלב בו עדיין קיימת אוכלוסיית ‪ .S1‬בנוסף לכך‪ ,‬מידת הקצר הנגרם‪ ,‬כלומר‬
‫שבר האוכלוסיה המורחקת בדרך ל – ‪ ,K‬פרופורציוני לשארית הפיגמנטים המעוררים‪ .‬המסקנה ברורה‪ .‬כל‬
‫השלבים של ההיפוך הפנימי של הכרומופור המעורר ב – ‪ pHR‬יכולים להביא לאיזומריזציה באותה מידה‪.‬‬
‫במחקר ‪ SEP‬קודם שנעשה במעבדתנו על בקטריורודופסין הממצאים הניסיוניים היו דומים ‪ .86‬שבר‬
‫האוכלוסיה שהורד בחזרה ל – ‪ S0‬על ידי ה – ‪ dump‬לא היה תלוי בשלב ההיפוך הפנימי שלה‪ ,‬האוכלוסיה‬
‫המונחתת לא הופיעה כתוצר מאוחר של מעגל האור ולא הראתה שום סימנים של פעילות ביולוגית‪ .‬בניסיון‬
‫להסביר את ממצאי ניסוי על ‪ BR‬נטען כי הפלואורסנציה מתרחשת מקונפיגורציות מעוררות הנמצאות הרחק‬
‫מחיתוך העקומות דרכו מתבצע ההיפוך הפנימי למצב היסוד‪ .‬תרם הגעתה לחתך הקוני האוכלוסיה המעוררת‬
‫חייבת להתגבר על מחסום פוטנציאל על ‪ S1‬אשר מפריד בין אזור ‪ FC‬לחתכים קוניים על משטח זה‪ .‬הנחת קיום‬
‫מחסום כזה על המשטח המעורר של ‪ pHR‬נעשתה בעבר על ידי ‪ Nakamura‬ותוצאות מחקרינו מחזקות טענה‬
‫זו‪.‬‬
‫על מנת ליישב מסקנות אלה עם עלייה מהירה של סיגנל חיובי סביב ‪ ,645nm‬אותה פירש ‪Kandori‬‬
‫בעבודות שלו על ‪ sHR‬כאינדיקציה לכך ש – ‪ K‬נוצר במהלך ההיפוך הפנימי של האוכלוסיה המעוררת קצרת‬
‫‪71‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫החיים ועם האמפליטודה הגדולה יותר באזור‬
‫‪ 640nm‬של ה – ‪ DAS‬הדועך עם הקבוע ‪2.0ps‬‬
‫מממצאי הניסוי שלנו‪ ,‬נציג כאן תוצאות עבודתנו על‬
‫בקטריורודופסינים מהונדסים‪ .‬תוצאות אלה טרם‬
‫איור ‪ :62‬כרומופור נעול של חלבון רטינלי ארכיאלי‪.‬‬
‫פורסמו‪ .‬מדובר בחלבונים אשר הוכנס לתוכם רטינל ‪ all – trans‬שבו הקשר ‪ C13=C14‬נעול בתוך טבעת‬
‫מחומשת של אטומי פחמן )איור ‪ .( 62‬הכרומופור בבקטריורודופסין כזה לא יכול לעבור איזומריזציה סביב‬
‫הקשר הנעול ואי לכך‪ ,‬אין לבקטריורודופסינים מהונדסים כאלה מעגל אור‪ .‬בין היתר לא נצפה לראות שום תוצר‬
‫אשר ניתן לייחס אותו לבליעה של פיגמנטים עם צבען במצב ‪ . 13−cis‬ניתוח ספקטרה בליעה טרנזיינטיים של‬
‫פיגמנט כזה הוא קל יחסית כי את כל הסיגנלים החיוביים ניתן לייחס לעודף בליעה של המצב המעורר "‪ "I‬ואת‬
‫השליליים לעודף פליטה שלו או ל – ‪ bleach‬של מצב יסוד‪.‬‬
‫ממצא מעניין ביותר‪ ,‬בנוגע לעבודתנו על ‪ ,pHR‬העולה מנתונים אלה הוא הופעת סיגנל חיובי ב – ‪BR‬‬
‫נעול סביב ‪ ,670nm‬לא רחוק מבליעת התוצר ‪ K‬אשר נבנית סביב ‪ 640nm – 630‬בבקטריורודופסין לא נעול‬
‫)איור ‪ .(63‬אם להתחשב בעובדה כי ה – ‪ bleach‬של מצב יסוד של בקטריורודופסין נעול מוסט לאדום בכ –‬
‫‪ 20nm‬ביחס ל – ‪ BR‬רגיל אזי הסיגנל החיובי של הפיגמנט הנעול מופיע באותו אזור ביחס ל – ‪ bleach‬שבו‬
‫אמור לצוץ פס הבליעה של התוצר ‪ . K‬מכיוון שאין אנו מצפים להופעה של בליעת תוצר ב – ‪ BR‬נעול‪ ,‬הסיגנל‬
‫החיובי יכול להיות מיוחס רק לעודף בליעה של המצב המעורר‪ .‬נעקוב אחר דינמיקת התפתחות הסיגנלים‬
‫בספקטרה של בקטריורודופסין נעול בפנל ימני עליון של איור ‪ . 63‬פס הבליעה של המצב המעורר באזור‬
‫‪ <550nm‬נע לכחול בזמנים המוקדמים )עד ‪ .(100fs‬כמו ב – ‪ ,pHR‬כך גם כאן‪ ,‬קשה להבחין בתזוזה של פס‬
‫הפליטה המאולצת בסקלת זמנים זו אבל הופעת עודף בליעה של מצב מעורר ב – ‪ ,670nm‬בזמן שכל הבליעה‬
‫איור ‪ :63‬השוואה בין דינמיקה ספקטרלית אולטרה מהירה של בקטריורודופסין ‪) wild type‬שמאל( לבין פיגמנט‬
‫מלאכותי עם הכרומופור הנעול )ימין(‪ .‬צבעים של הספקטרה מציינים זמני מדידה לפי המפתח המצורף‪.‬‬
‫‪72‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫הנ"ל זזה לכחול‪ ,‬יכולה להיות מוסברת על ידי תנועה סימולטנית של פס הפליטה לאדום‪.‬‬
‫המסקנה המתבקשת מתוצאות אלה היא שייחוס חד משמעי של סיגנל חיובי העולה בזמנים מוקדמים‬
‫מאדום ל – ‪ bleach‬של מצב יסוד ברודופסינים ארכיאליים לתוצר של מעגל אור שבו הרטינל בקונפיגורציה‬
‫‪ 13−cis‬לא יהיה מוצדק‪ .‬שינויים דינמיים ב – ‪ S1‬שלא בהכרח קיים קשר בינם לבין היווצרות התוצר יכולים‬
‫לגרום להופעה מהירה של סיגנל חיובי באזור הספקטרלי בו התוצר בולע‪ .‬אי לכך‪ ,‬אינטרפרטציה של העלייה‬
‫המהירה של סיגנל חיובי ב – ‪ 650nm – 640‬בספקטרה בליעה טרנזיינטיים של ‪ pHR‬ולדעתנו גם באלה של‬
‫‪ ,sHR‬כיצירת התוצר ‪ K‬מאוכלוסיה קצרת החיים מבין השתיים הקיימות על – ‪ ,S1‬שנויה במחלוקת‪.‬‬
‫מעניינת בהקשר זה תמונה העולה מהשוואת ה – ‪ DAS‬הדועכים אקספוננציאלית שהתאמנו לספקטרה‬
‫הפרש בליעה טרנזיינטיים של ‪ .pHR‬הנ"ל שונים בעיקר באזור של בליעת התוצר ‪ K‬וה – ‪ bleach‬של מצב‬
‫יסוד‪ .‬אם נאמץ לרגע את הגישה אשר הנחתה את חוקרי דינמיקה ספקטרלית אולטרה מהירה של ‪ sHR‬ונחשוב‬
‫על שני ה – ‪ DAS‬הדועכים עם הקבועים של ‪ 2‬ו – ‪ 5ps‬כעל תרומות של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות‬
‫לספקטרה בליעה טרנזיינטיים‪ ,‬הרי שמשמעות שוני האמפליטודות של שני ה – ‪ DAS‬באזור בליעת התוצר ‪K‬‬
‫תהיה עליית פס הבליעה שלו בקצב ההיפוך הפנימי של אוכלוסיה קצרת החיים‪ .‬הצעד הבא המתבקש במסגרת‬
‫פרדיגמת שתי האוכלוסיות הוא לשער כי האוכלוסיה הדועכת מהר היא הראקטיבית ואילו האיטית היא הלא‬
‫ריאקטיבית ודועכת חזרה אל המגיבים‪ .‬כפי שראינו‪ ,‬פירוש כזה של דינמיקה ספקטרלית של ‪ pHR‬לא יהיה נכון‬
‫אם קיימת תרומה של בליעת מצב מעורר באורך גל של ‪ 640nm‬בו אמורה להופיע בליעת התוצר‪ .‬אי לכך‪ ,‬אין‬
‫להסתפק רק ב – ‪ DAS‬על מנת להצדיק או להפריך מודל של דינמיקה מושרית אור של רודופסינים ארכיאליים‪.‬‬
‫למעשה‪ ,‬האסטרטגיה הניסיונית שלנו פותחה במיוחד על מנת להעמיד במבחן פרשנויות קודמות של מידע‬
‫ניסיוני באמצעות שיטה המסתמכת על ראיות ישירות ולפיכך‪ ,‬בניסיוננו להסביר את העומד מאחורי דינמיקת‬
‫ההיפוך הפנימי של ‪ pHR‬אנו נותנים יותר אמון בתוצאות ‪.SEP‬‬
‫סיכום‪.‬‬
‫במקרה של ‪ pHR‬הקינטיקה הלא אקספוננציאלית של ההיפוך הפנימי והעלייה המהירה של בליעה‬
‫סביב ‪ 640nm‬אינם משקפים קיום בו זמני של שתי אוכלוסיות מעוררות שונות שרק אחת מהן ריאקטיבית‪ .‬אין‬
‫אנו מנסים לומר כי לא תתכן תגובה של פיגמנטים מעוררים בחזרה אל המגיבים‪ ,‬סך הכל היעילות הקוונטית‬
‫המדווחת של ‪ pHR‬היא ‪ 0.5‬ולא ‪ . 1‬מכל מקום‪ ,‬התגובה החוזרת יכולה להתרחש כתוצאה מפיצול בעת הדעיכה‬
‫של האוכלוסיה המעוררת אל מצב יסוד בנקודת החתך הקוני‪.‬‬
‫כפי שמוסכם עבור בקטריורודופסין שגם הוא מראה קינטיקה לא אקספוננציאלית של היפוך פנימי‪ ,‬כך‬
‫גם במקרה של הלורודופסין של ‪ Natronomonas pharaonis‬אותו חקרנו‪ ,‬המצב המעורר ‪ S1‬מורכב‬
‫מאוכלוסיה מעוררת אחת בלבד‪ .‬מאפייני הדעיכה של מצב זה ובין היתר היות דעיכה זו מולטי אקספוננציאלית‬
‫נובעים מתהליכים אחרים‪ ,‬למשל מרלקסציה ויברציונית של הכרומופור המעורר‪ .‬ברור כי לא בהכרח ניתן‬
‫להשליך מסקנות אלה על משאבת הכלורידים השנייה‪ .sHR ,‬פוטוכימיה של חלבון זה יכולה להיות שונה‪ .‬אחרי‬
‫הכל דינמיקה מושרית אור של המשאבה הזאת ולא של ‪ pHR‬נדגמה על ידי פולסים אולטרה מהירים במרכז‬
‫האינפרה אדום‪ ,‬מחקר שהראה כי הפסים הויברציוניים המשויכים לתוצר מופיעים תוך שבר מזמן החיים של‬
‫‪73‬‬
‫פענוח אבולוציית המצב המעורר בהלורודופסין באמצעות ניסוי שלושה פולסים‬
‫המצב המעורר‪ .‬אף על פי כן‪ ,‬המידע המחקרי הרחב בתחום הספקטרוסקופיה האולטרה מהירה של משפחת‬
‫הרודופסינים הארכיאליים והקרבה הלא מבוטלת בין חברי המשפחה הנ"ל‪ ,‬יכולים באותה מידה לרמוז על‬
‫קבילות מסכנות אלה לצורך בניית מודל של דינמיקת המצב המעורר עבור רבים מהם‪ .‬ייתכן כי הדינמיקה הזאת‬
‫כלל לא בעלת אופי מקבילי כפי שמוצע עבור ‪ ,sHR‬בכל החלבונים הללו‪ .‬מחקר משלים של ‪ pHR‬במרכז‬
‫האינפרה אדום או לחליפין מחקר כגון זה המוצג כאן של דינמיקת המצב המעורר של ‪ ,sHR‬עשוי לשפוך אור‬
‫על התעלומה הזאת‪.‬‬
‫‪74‬‬
‫ביבליוגרפיה‬
1 Oren, Aharon. Halophilic Microorganisms and their Environments. Dordrecht: Kluwer Academic, 2002.
2 Spudich, John L., Chii-Shen Yang, Kwang-Hwan Jung, and Elena N. Spudich. "Retinylidene Proteins: Structures
and Functions from Archaea to Humans." Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16 (2000): 395 – 392.
3 Terakita, Akihisa. "The Opsins." Genome Biology 6.3 (2005): Article 213.
4 Dugave, Christophe., ed. cis – trans Isomerization in Biochemistry. Weinheim: 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH &
Co. KGaA, 2006.
5 Stoeckenius, Walther. "The Rhodopsin-Like Pigments of Halobacteria: Light-Energy and Signal Transducers in an
Archaebacterium." Trends in Biochemical Sciences 58.6 (1985): 483 – 486.
6 Oesterhelt, Dieter., Walther Stoeckenius. "Rhodopsin-Like Protein from the Purple Membrane of Halobacterium
Halobium." Nature New Biology 233 (1971): 149 – 152.
7 Oesterhelt, Dieter., and Walther Stoeckenius. "Functions of a New Photoreceptor Membrane." Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 70.10 (1973): 2853 – 2857.
8 Lanyi, Janos K. "Halorhodopsin: a Light-Driven Chloride Ion Pump." Annual Review of Biophysics and
Biophysical Chemistry 15 (1986): 11 – 28.
9 MacDonald, Russell E., Richard V. Greene, Robert D. Clark, and Edward V. Lindley. "Characterization of the LightDriven Sodium Pump of Halobacterium Halobium. Consequences of Sodium Efflux as the Primary Light-Driven
Event." The Journal of Biological Chemistry 254.23 (1979): 11831 – 11838.
10 Takahashi, Tetsuo., Hiroaki Tomioka, Naoki Kamo and Yonosuke Kobatake. "A Photosystem Other than PS370 Also
Mediates the Negative Phototaxis of Halobacterium Halobium." FEMS Microbiology Letters 28 (1985): 161 – 164.
11 Bogomolni, Roberto A., and John L. Spudich. "Identification of a Third Rhodopsin-Like Pigment in Phototactic
Halobacterium Halobium." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79 (1982): 6250 – 6254.
12 Kolbe, Michael., Hüseyin Besir, Lars-Oliver Essen, and Dieter Oesterhelt. "Structure of the Light-Driven Chloride
Pump Halorhodopsin at 1.8Å Resolution." Science 288 (2000) 1390 – 1396.
13 Kandori, Hideki., and Hiroyuki Sasabe. "Excited-State Dynamics of a Protonated Schiff Base of all-Trans Retinal in
Methanol Probed by Femtosecond Fluorescence Measurement." Chemical Physics Letters 216.1 – 2 (1993) 126 –
172.
14 Rajput, Jyoti., Dennis B. Rahbek, Lars H. Andersen, Amiram Hirshfeld, Mordechai Sheves, Piero Alto, Giorgio
Orlandi, and Marco Garavelli. "Probing and Modeling the Absorption of Retinal Protein Chromophores in Vacuo."
Angewandte Chemie International Edition 49 (2010) 1790 – 1793.
15 Sasaki, Jun., Leonid S. Brown, Young-Shin Chon, Hideki Kandori, Akio Maeda, Richard Needleman, Janos K.
Lanyi. "Conversion of Bacteriorhodopsin into a Chloride Ion Pump." Science 269 (1995) 73 – 75.
16 Dér, A., S. Száraz, R. Tóth-Boconádi, Zs. Tokaji, L. Keszthelyi, and W. Stoeckenius. "Alternative Translocation of
Protons and Halide Ions by Bacteriorhodopsin." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88 (1991): 4751 – 4755.
17 Olson, Karl D., Xue-Nong Zhang, and John L. Spudich. "Residue Replacements of Buried Aspartyl and Related
Residues in Sensory Rhodopsin I: D201N Produces Inverted Phototaxis Signals." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 92
(1995): 3185 – 3189.
18 Bogomolni, R. A., W. Stoeckenius, I. Szundi, E. Perozo, K. D. Olson, and J. L. Spudich. "Removal of Transducer
Htr I Allows Electrogenic Proton Translocation by Sensory Rhodopsin I." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 (1994):
10188 – 10192.
19 Luecke, Hartmut., Brigitte Schobert, Hans-Thomas Richter, Jean-Philippe Cartailler, and Janos K. Lanyi. "Structure
of Bacteriorhodopsin at 1.55Å Resolution." Journal of Molecular Biology 291 (1999) 899 – 911.
20 Lozier, Richard H., Roberto A. Bogomolni, and Walther Stoeckenius. "Bacteriorhodopsin: a Light-Driven Proton
Pump in Halobacterium Halobium." Biophysical Journal 15.9 (1975) 955 – 962.
21 Tittor, J., D. Oesterhelt, R. Maurer, H. Desel, and R. Uhl. "The Photochemical Cycle of Halorhodopsin: Absolute
Spectra of Intermediates Obtained by Flash Photolysis and Fast Difference Spectra Measurements." Biophysical
Journal 52.6 (1987) 999 – 1006.
22 Hoff, Wouter D., Kwang-Hwan Jung, and John L. Spudich. "Molecular Mechanism of Photosignaling by Archaeal
Sensory Rhodopsins." Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26 (1997): 223 – 258.
23 Váró, György., Leonid S. Brown, Jun Sasaki, Hideki Kandori, Akio Maeda, Richard Needleman, and Janos K.
Lanyi. "Light-Driven Chloride Ion Transport by Halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis. 1. The
Photochemical Cycle." Biochemistry 34 (1995): 14490 – 14499.
24 Pfisterer, Christoph., Andreea Gruia, and Stefan Fischer. "The Mechanism of Photo-energy Storage in the
Halorhodopsin Chloride Pump." The Journal of Biological Chemistry 284 (2009): 13562 – 13569.
25 Gruia, Andreea D., Ana-Nicoleta Bondar, Jeremy C. Smith, and Stefan Fischer. "Mechanism of a Molecular Valve in
the Halorhodopsin Chloride Pump." Structure 13 (2005): 617 – 627.
26 Schäfer, Günter., Martin Engelhard, and Volker Müller. "Bioenergetics of the Archaea." Microbiology and Molecular
Biology Reviews 63.3 (1999) 570 – 620.
27 Mukohata, Yasuo., Kunio Ihara, Takeshi Tamura, and Yasuo Sugiyama. "Halobacterial Rhodopsins." Journal of
Biochemistry 125.4 (1999) 649 – 657.
28 Falb, Michaela., Friedhelm Pfeiffer, Peter Palm, Karin Rodewald, Volker Hickmann, Jörg Tittor, and Dieter
Oesterhelt. "Living with Two Extremes: Conclusions from the Genome Sequence of Natronomonas pharaonis."
Genome Research 15 (2005) 1336 – 1343.
29 Zimányi, Lászlo., and Janos K Lanyi. "Fourier Transform Raman Study of Retinal Isomeric Composition and
Equilibration in Halorhodopsin." Journal of Physical Chemistry B 101 (1997): 1930 – 1933.
30 Kouyama, Tsutomu., Soun Kanada, Yuu Takeguchi, Akihiro Narusawa, Midori Murakami, and Kunio Ihara. "Crystal
Structure of the Light-Driven Chloride Pump Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis." Journal of Molecular
Biology 369.3 (2010): 564 – 579.
31 Shibata, Mikihiro., Norikazu Muneda, Takanori Sasaki, Kazumi Shimono, Naoki Kamo, Makoto Demura, Hideki
Kandori. "Hydrogen-Bonding Alterations of the Protonated Schiff Base and Water Molecule in the Chloride Pump
of Natronobacterium pharaonis." Biochemistry 44 (2005): 12279 – 12286.
32 Otomo, Jun. "Anion Selectivity and Pumping Mechanism of Halorhodopsin." Biophysical Journal 56 (1995) 137 –
141.
33 Schobert, Brigitte., Janos K. Lanyi, and Dieter Oesterhelt. "Effects of Anion Binding on the Deprotonation
Reactions of Halorhodopsin." The Journal of Biological Chemistry 261.6 (1986): 2690 – 2696.
34 Duschl, Albert., Janos K. Lanyi, Lászlo Zimányi. "Properties and Photochemistry of a Halorhodopsin from the
Haloalkalophile, Natronobacterium pharaonis." The Journal of Biological Chemistry 265.3 (1990): 1261 – 1267.
35 Scharf, Birgit., and Martin Engelhard. "Blue Halorhodopsin from Natronobacterium pharaonis: Wavelength
Regulation by Anions." Biochemistry 33 (1994): 6387 – 6393.
36 Ihara, Kunio., Akihiro Narusawa, Keita Maruyama, Masashi Takeguchi, Tsutomu Kouyama. "A Halorhodopsin –
Overproducing Mutant Isolated from an Extremely Haloalkaliphilic Archaeon Natronomonas pharaonis." FEBS
Letters 582.19 (2008): 2931 – 2936.
37 Sasaki, Takanori., Megumi Kubo, Takashi Kikukawa, Masakatsu Kamiya, Tomoyasu Aizawa, Keiichi Kawano,
Naoki Kamo, and Makoto Demura. "Halorhodopsin from Natronomonas pharaonis Forms a Trimer Even in the
Presence of a Detergent, Dodecyl – b – D – maltoside." Photochemistry and Photobiology 85.1 (2009): 130 – 136.
38 Hampp, Norbert. "Bacteriorhodopsin as a Photochromic Retinal Protein for Optical Memories." Chemical Reviews
100.5 (2000): 1755 − 1776.
39 Sato, Hidenori., Kazuki Takeda, Koji Tani, Tomoya Hino, Tetsuji Okada, Masayoshi Nakasako, Nobuo Kamiya, and
Tsutomu Kouyama. "Specific Lipid – Protein Interactions in a Novel Honeycomb Lattice Structure of
Bacteriorhodopsin." Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography 55.7 (1999): 1251 – 1256.
40 Zhu, Jingyi., Itay Gdor, Elena Smolensky, Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman.
"Photoselective Ultrafast Investigation of Xanthorhodopsin and Its Carotenoid Antenna Salinixanthin." Journal of
Physical Chemistry B 114 (2010): 3038 – 3045.
41 Seki, Shun Ichi., Hiroyuki Sasabe, and Hiroaki Tomioka. "Voltage – Dependent Absorbance Change of Carotenoids
in Halophilic Archaebacteria." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes 1284.1 (1996): 79 – 85.
42 Váró, György., Leonid S. Brown, Richard Needleman, and Janos K. Lanyi. "Proton Transport by Halorhodopsin."
Biochemistry 35 (1996): 6604 – 6611.
43 Szakács, Juliánna., Melinda Lakatos, Constanta Ganea, and György Váró. "The Kinetics of the Photochemical
Reaction Cycle of Deuterated Bacteriorhodopsin and Pharaonis Halorhodopsin." Romanian Journal of Biophysics
15.1 – 2 (2005): 79 – 84.
44 Váró, György., Richard Needleman, and Janos K. Lanyi. "Light – Driven Chloride Ion Transport by Halorhodopsin
from Natronobacterium pharaonis. 2. Chloride Release and Uptake, Protein Conformation Change, and
Thermodynamics." Biochemistry 34 (1995): 14500 – 14507.
45 Chizhov, Igor., and Martin Engelhard. "Temperature and Halide Dependence of the Photocycle of Halorhodopsin
from Natronobacterium pharaonis." Biophysical Journal 81.3 (2001) 1600 – 1612.
46 Essen, Lars – Oliver. "Halorhodopsin: Light – Driven Ion Pumping Made Simple?" Current Opinion in Structural
Biology 12.4 (2002) 516 – 522.
47 Ludmann, Krisztina., Grazyna Ibron, Janos K. Lanyi, and György Váró. "Charge Motions During the Photocycle of
pharaonis Halorhodopsin." Biophysical Journal 78.2 (2000) 959 – 966.
48 Shibata, Mikihiro., Yuko Saito, Makoto Demura, Hideki Kandori. "Deprotonation of Glu234 During the Photocycle
of Natronomonas pharaonis Halorhodopsin." Chemical Physics Letters 432.4 – 6 (2006) 545 – 547.
49 Ames, James B., Jan Raap, Johan Lugtenburg, and Richard A. Mathies. "Resonance Raman Study of Halorhodopsin
Photocycle Kinetics, Chromophore Structure, and Chloride – Pumping Mechanism." Biochemistry 31 (1992): 12546
– 12554.
50 Oesterhelt, D., P. Hegemann, and J. Tittor. "The Photocycle of the Chloride Pump Halorhodopsin. II: Quantum
Yields and a Kinetic Model." The EMBO Journal 4.9 (1985): 2351 – 2356.
51 Losi, Aba., Ansgar A. Wegener, Martin Engelhard, and Silvia E. Braslavsky. "Thermodynamics of the Early Steps in
the Photocycle of Natronobacterium pharaonis Halorhodopsin. Inﬂuence of Medium and of Anion Substitution."
Photochemistry and Photobiology 74.3 (2001): 495 – 503.
52 Tittor, Jörg., and Dieter Oesterhelt. "The Quantum Yield of Bacteriorhodopsin." FEBS Letters 263.2 (1990): 269 –
273.
53 Becker, Ralph S., Kenn Freedman. "A Comprehensive Investigation of the Mechanism and Photophysics of
Isomerization of a Protonated and Unprotonated Schiff Base of 11 – Cis – Retinal." Journal of the American
Chemical Society 107.6 (1985) 1477 – 1485.
54 Koyama, Yasushi., Keishi Kubo, Mika Komori, Haruo Yasuda, and Yumiko Mukai. "Effect of Protonation on the
Isomerization Properties of N – butylamine Schiff Base of Isomeric Retinal as Revealed by Direct HPLC Analyses:
Selection of Isomerization Pathways by Retinal Proteins." Photochemistry and Photobiology 54.3 (1991): 433 – 443.
55 Edman, Karl., Peter Nollert, Antoine Royant, Hassan Belrhali, Eva Pebay-Peyroula, Janos Hajdu, Richard Neutze, &
Ehud M. Landau. "High-Resolution X-Ray Structure of an Early Intermediate in the Bacteriorhodopsin Photocycle."
Nature 401 (1999): 822 – 826.
56 Nakamura, Takumi., Satoshi Takeuchi, Mikihiro Shibata, Makoto Demura, Hideki Kandori, and Tahei Tahara.
"Ultrafast Pump Probe Study of the Primary Photoreaction Process in pharaonis Halorhodopsin: Halide Ion
Dependence and Isomerization Dynamics." Journal of Physical Chemistry B 112 (2008): 12795 – 12800.
57 McNeil, Brian. "First Light from Hard X-Ray Laser." Nature Photonics 3 (2009): 375 – 377.
58 Zewail, Ahmed H. "Atomic – Scale Dynamics of Chemical Bond Using Ultrafast Lasers (Nobel Lecture)."
Angewandte Chemie International Edition 39 (2000) 2586 – 2631.
59 Briand, Julien., Jérémie Léonard, and Stefan Haacke. "Ultrafast Photo – Induced Reaction Dynamics in
Bacteriorhodopsin and its Trp Mutants." Journal of Optics 12.8 (2010) 084004.
60 Gai, Feng., K. C. Hasson, J. Cooper McDonald, Philip A. Anfinrud. "Chemical Dynamics in Proteins: The
Photoisomerization of Retinal in Bacteriorhodopsin." Science 279 (1998) 1886 – 1891.
61 Mathies, Richard A., C. H. Brito Cruz, Walter T. Polard, and Charles V. Shank. "Direct Observation of the
Femtosecond Excited – State Cis – Trans Isomerization In Bacteriorhodopsin." Science 240 (1988) 777 – 779.
62 Doig, Stephen J., Philip J. Reid, and Richard A. Mathies. "Pikosecond Time – Resolved Resonance Raman
Spectroscopy of Bacteriorhodopdn's J, K, and KL Intermediates." Journal of Physical Chemistry 95 (1991): 6372 –
6379.
63 Atkinson, G. H., L. Ujj, and Yidong Zhou. "Vibrational Spectrum of the J – 625 Intermediate in the Room
Temperature Bacteriorhodopsin Photocycle." Journal of Physical Chemistry A 104 (1999): 4130 – 4139.
64 Song, Li., and M. A. El – Sayed. "Primary Step in Bacteriorhodopsin Photosynthesis: Bond Stretch Rather than
Angle Twist of Its Retinal Excited – State Structure." Journal of the American Chemical Society 120.34 (1998) 8889
– 8890.
65 Ujj, L., Yidong Zhou, M. Sheves, M. Ottolenghi, S. Ruhman, and G. H. Atkinson. "Vibrational Spectrum of a
Picosecond Intermediate in the Artificial BR5.12 Photoreaction: Picosecond Time – Resolved CARS of T5.12."
Journal of the American Chemical Society 122.1 (2000) 96 – 106.
66 Shim, Sangdeok., Jyotishman Dasgupta, and Richard A. Mathies. "Femtosecond Time – Resolved Stimulated
Raman Reveals the Birth of Bacteriorhodopsin’s J and K Intermediates." Journal of the American Chemical Society
131.22 (2009) 7592 – 7597.
67 Garavelli, Marco., Fabrizia Negri, and Massimo Olivucci. "Initial Excited – State Relaxation of the Isolated 11 – cis
Protonated Schiff Base of Retinal: Evidence for in – Plane Motion from ab Initio Quantum Chemical Simulation of
the Resonance Raman Spectrum." Journal of the American Chemical Society 121.5 (1999) 1023 – 1029.
68 González – Luque, Remedios., Marco Garavelli, Fernando Bernardi, Manuela Merchán, Michael A. Robb and
Massimo Olivucci. "Computational Evidence in Favor of a Two – State, Two – Mode Model of the Retinal
Chromophore Photoisomerization." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 97.17 (2000): 9379 – 9384.
69 Yarkony, David R. "Diabolical Conical Intersections." Reviews of Modern Physics 68.4 (1996): 985 – 1013.
70 Garavelli, Marco., Thom Vreven, Paolo Celani, Fernando Bernardi, Michael A. Robb, and Massimo Olivucci.
"Photoisomerization Path for a Realistic Retinal Chromophore Model: The Nonatetraeniminium Cation." Journal of
the American Chemical Society 120.6 (1998) 1258 – 1288.
71 Levine, Benjamin G., and Todd J. Martínez. "Isomerization Through Conical Intersections." Annual Review of
Physical Chemistry 58 (2007) 613 – 634.
72 Heyne, Karsten., Johannes Herbst, Barbara Dominguez – Herradon, Ulrike Alexiev, and Rolf Diller. "Reaction
Control in Bacteriorhodopsin: Impact of Arg82 and Asp85 on the Fast Retinal Isomerization, Studied in the Second
Site Revertant Arg82Ala/Gly231Cys and Various Purple and Blue Forms of Bacteriorhodopsin." Journal of Physical
Chemistry B 104 (2000): 6053 – 6058.
73 Dugave, Christophe., and Luc Demange. "Cis − Trans Isomerization of Organic Molecules and Biomolecules:
Implications and Applications." Chemical Reviews 103.7 (2003): 2475 – 2532.
74 Liu, Robert S. H. "Photoisomerization by Hula – Twist: A Fundamental Supramolecular Photochemical Reaction."
Accounts of Chemical Research 34.7 (2001) 555 – 562.
75 Mathies, Rich., and Lubert Stryer. "Retinal Has a Highly Dipolar Vertically Excited Singlet State: Implications for
Vision." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 73.7 (1976): 2169 – 2173.
76 Cembran, Alessandro., Fernando Bernardi, Massimo Olivucci, and Marco Garavelli. "The Retinal
Chromophore/Chloride Ion Pair: Structure of the Photoisomerization Path and Interplay of Charge Transfer and
Covalent States." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 102.18 (2005): 6255 – 6260.
77 De Vico, Luca., Christopher S. Page, Marco Garavelli, Fernando Bernardi, Riccardo Basosi, and Massimo Olivucci.
"Reaction Path Analysis of the "Tunable" Photoisomerization Selectivity of Free and Locked Retinal
Chromophores." Journal of the American Chemical Society 124.15 (2002) 4124 – 4134.
78 Zadok, Uri., Artium Khatchatouriants, Aaron Lewis, Michael Ottolenghi, and Mordechai Sheves. "Light – Induced
Charge Redistribution in the Retinal Chromophore Is Required for Initiating the Bacteriorhodopsin Photocycle."
Journal of the American Chemical Society 124.40 (2002) 11844 – 11845.
79 Hamm, P., M. Zurek, T. Röschinger, H. Patzelt, D. Oesterhelt, W. Zinth. "Femtosecond Spectroscopy of the
Photoisomerisation of the Protonated Schiff Base of All – Trans Retinal." Chemical Physics Letters 263.5 (1996)
613 – 621.
80 Hamm, P., M. Zurek, T. Röschinger, H. Patzelt, D. Oesterhelt, W. Zinth. "Subpicosecond Infrared Spectroscopy on
the Photoisomerisation of the Protonated Schiff Base of All – Trans Retinal." Chemical Physics Letters 268.1 – 2
(1997) 180 – 186.
81 Hou, B., N. Friedman, S. Ruhman, M. Sheves, and M. Ottolenghi. "Ultrafast Spectroscopy of the Protonated Schiff
Bases of Free and C13=C14 Locked Retinals." Journal of Physical Chemistry B 105 (2001): 7042 – 7048.
82 Zgrablić, Goran., Kislon Voïtchovsky, Maik Kindermann, Stefan Haacke, and Majed Chergui. "Ultrafast Excited
State Dynamics of the Protonated Schiff Base of All – trans Retinal in Solvents." Biophysical Journal 88 (2005)
2779 – 2788.
83 Du, Mei., and Graham R. Fleming. "Femtosecond Time – Resolved Fluorescence Spectroscopy of
Bacteriorhodopsin: Direct Observation of Excited State Dynamics in the Primary Step of the Proton Pump Cycle."
Biophysical Chemistry 48.2 (1993): 101 – 111.
84 Diller, Rolf., Ruth Jakober, Christian Schumann, Frank Peters, Johann P. Klare, and Martin Engelhard. "The trans –
cis Isomerization Reaction Dynamics in Sensory Rhodopsin II by Femtosecond Time – Resolved Midinfrared
Spectroscopy: Chromophore and Protein Dynamics." Biopolymers 82.4 (2006): 358 – 362.
85 Lutz, I., A. Sieg, A. A. Wegener, M. Engelhard, I. Boche, M. Otsuka, D. Oesterhelt, J. Wachtveitl, and W. Zinth.
"Primary Reactions of Sensory Rhodopsins." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98.3 (2001): 962 – 967.
86 Ruhman, Sanford., Bixue Hou, Noga Friedman, Michael Ottolenghi, and Mordechai Sheves. "Following Evolution
of Bacteriorhodopsin in Its Reactive Excited State via Stimulated Emission Pumping." Journal of the American
Chemical Society 124.30 (2002) 8854 – 8858.
87 Rupenyan, Alisa., Ivo H. M. van Stokkum, Jos C. Arents, Rienk van Grondelle, Klaas J. Hellingwerf, and Marie
Louise Groot. "Reaction Pathways of Photoexcited Retinal in Proteorhodopsin Studied by Pump – Dump – Probe
Spectroscopy." Journal of Physical Chemistry B 113 (2009): 16251 – 16256.
88 Agmon, Noam., and Ronnie Kosloff. "Dynamics of Two – Dimensional Diffusional Barrier Crossing." Journal of
Physical Chemistry 92 (1987): 1988 – 1996.
89 Bagchi, Biman., and Graham R. Fleming. "Dynamics of Activationless Reactions in Solution." Journal of Physical
Chemistry 94 (1990): 9 – 20.
90 Åberg, U., E. Åkesson, J. - L. Alvarez, I. Fedchenia, and V. Sundström. "Femtosecond Spectral Evolution
Monitoring the Bond – Twisting Event in Barrierless Isomerization In Solution." Chemical Physics 183 (1994) 269
– 288.
91 Olivucci, Massimo., Alessandro Lami, and Fabrizio Santoro. "A Tiny Excited – State Barrier Can Induce a
Multiexponential Decay of the Retinal Chromophore: A Quantum Dynamics Investigation." Angewandte Chemie
International Edition 44 (2005) 5118 – 5121.
92 Zgrablić, Goran. "Solvent Effects on the Ultrafast Dynamics of the Retinal Chromophore of Bacteriorhodopsin."
Ph.D. Dissertation.
93 Zgrablić, Goran., Stefan Haacke, and Majed Chergui. "Heterogeneity and Relaxation Dynamics of the Photoexcited
Retinal Schiff Base Cation in Solution." Journal of Physical Chemistry B 113 (2009): 4384 – 4393.
94 Polland, H.J., M.A. Franz, W. Zinth, W. Kaiser, P. Hegemann, and D. Oesterhelt. "Picosecond Events in the
Photochemical Cycle of the Light – Driven Chloride – Pump Halorhodopsin." Biophysical Journal 47.1 (1985) 55 –
59.
95 Kandori, Hideki., Keitaro Yoshihara, Hiroaki Tomioka, and Hiroyuki Sasabe. "Subpicosecond Transient Absorption
Spectrum of the Excited State of a Retinal Protein, Halorhodopsin." Chemical Physics Letters 187.6 (1991) 579 –
582.
96 Kandori, Hideki., Keitaro Yoshihara, Hiroaki Tomioka, and Hiroyuki Sasabe. "Primary Photochemical Events in
Haiorhodopsin Studied by Subpicosecond Time – Resolved Spectroscopy." Journal of Physical Chemistry 96
(1992): 6066 – 6071.
97 Kandori, Hideki., Keitaro Yoshihara, Hiroaki Tomioka, Hiroyuki Sasabe, and Yoshinori Shichida. "Comparative
Study of Primary Photochemical Events of two Retinal Proteins, Bacteriorhodopsin and Halorhodopsin, by Use of
Subpicosecond Time – Resolved Spectroscopy." Chemical Physics Letters 211.4 – 5 (1993) 385 – 391.
98 Arlt, T., S. Schmidt, W. Zinth, U. Haupts, D. Oesterhelt. "The Initial Reaction Dynamics of the Light – Driven
Chloride Pump Halorhodopsin." Chemical Physics Letters 241.5 – 6 (1995) 559 – 565.
99 Kobayashi, Takayoshi., Mijong Kim, Makoto Taiji, Tatsuo Iwasa, Masashi Nakagawa, and Motoyuki Tsuda.
"Femtosecond Spectroscopy of Halorhodopsin and Rhodopsin in a Broad Spectral Range of 400 – 1000 nm."
Journal of Physical Chemistry B 102 (1998): 272 – 280.
100 Peters, Frank., Johannes Herbst, Jörg Tittor, Dieter Oesterhelt, and Rolf Diller. "Primary Reaction Dynamics of
Halorhodopsin, Observed by Sub – Picosecond IR – Vibrational Spectroscopy." Chemical Physics 323 (2006) 109 –
116.
101 Mevorat – Kaplan, Keren., Vlad Brumfeld, Martin Engelhard, and Mordechai Sheves. "Effect of Anions on the
Photocycle of Halorhodopsin. Substitution of Chloride with Formate Anion." Biochemistry 44 (2005): 14231 –
14237.
102 Hasson, K. C., Feng Gai, and Philip A. Anfinrud. "The Photoisomerization of Retinal in Bacteriorhodopsin:
Experimental Evidence for a Three – State Model." Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93 (1996): 15124 – 15129.
103 Bismuth, Oshrat., Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "Photochemical Dynamics of all –
Trans Retinal Protonated Schiff – Base in Solution: Excitation Wavelength Dependence." Chemical Physics 341
(2007) 267 – 275.
104 Logunov, S. L., T. M. Masciangioli, V. F. Kamalov, and M. A. El – Sayed. "Low – Temperature Retinal
Photoisomerization Dynamics in Bacteriorhodopsin." Journal of Physical Chemistry B 102 (1998): 2303 – 2306.
105 Dantus, Marcos., and Peter Gross. "Ultrafast Spectroscopy." in Encyclopedia of Applied Physics 1998. Volume 22.
WILEY-VCH. pages 431 – 456.
106 Reid, Gavin D., and Klaas Wynne. "Ultrafast Laser Technology and Spectroscopy." in Encyclopedia of Analytical
Chemistry R. A. Meyers (Ed.) pages 13644 – 13670. 1998. Volume 22. JohnWiley & Sons Ltd, Chichester, 2000.
107 Cerullo, Giulio., Cristian Manzoni, Larry Lüer, and Dario Polli. "Time – Resolved Methods in Biophysics. 4.
Broadband Pump – Probe Spectroscopy System with Sub – 20 fs Temporal Resolution for the Study of Energy
Transfer Processes in Photosynthesis." Photochemical & Photobiological Sciences 6 (2007): 135 – 144.
108 Hartke, B., R. Kosloff and S. Ruhman. "Large Amplitude Ground State Vibrational Coherence Induced by
Impulsive Absorption in CsI. A Computer Simulation." Chemical Physics Letters 158.3 – 4 (1989) 238 – 244.
109 Banin, Uri., Allon Bartana, Sanford Ruhman, and Ronnie Kosloff. "Impulsive Excitation of Coherent Vibrational
Motion Ground Surface Dynamics Induced by Intense Short Pulses." Journal of Chemical Physics 101.10 (1994)
8461 – 8481.
110 Dhar, Lisa., John A. Rogers, and Keith A. Nelson. "Time – Resolved Vibrational Spectroscopy in the Impulsive
Limit." Chemical Reviews 94.1 (1994): 157 − 193.
111 Mocker, Hans W., and R. J. Collins. "Mode Competition and Self – Locking Effects in a Q – Switched Ruby Laser."
Applied Physics Letters 7 (1965): 270 − 273.
112 Spence, D. E., P. N. Kean, and W. Sibbett. "60 – fsec Pulse Generation From a Self – Mode – Locked Ti:sapphire
Laser." Optics Letters 16.1 (1991): 42 − 44.
113 Asaki, Melanie T., Chung – Po Huang, Dennis Garvey, Jianping Zhou, Henry C. Kapteyn, and Margaret M.
Murnane. "Generation of 11 fs Pulses from a Self – Mode – Locked Ti:sapphire Laser." Optics Letters 18.12 (1993):
977 − 979.
114 Backus, S., J. Peatross, C. P. Huang, M. M. Murnane, and H. C. Kapteyn. "Ti:sapphire Amplifier Producing
Millijoule – Level, 21 fs Pulses At 1 Khz." Optics Letters 20.19 (1995): 2000 − 2002.
115 Yariv, Amnon., and Pochi Yeh. Optical Waves in Crystals. Propagation and Control of Laser Radiation. John Willey
& Sons, Inc. 1984. Ch. 12.
116 Boyd, Robert W. Nonlinear Optics (second edition) Academic Press. 2003. Ch. 7.
117 van Stokkum, Ivo H.M., Delmar S. Larsen, and Rienk van Grondelle. "Global and Target Analysis of Time –
Resolved Spectra." Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics 1657.2 – 3 (2004): 82 – 104.
118 Golub, G., and W. Kahan. "Calculating the Singular Values and Pseudo – Inverse of a Matrix." Journal of the
Society for Industrial and Applied Mathematics: Series B, Numerical Analysis 2.2 (1965): 205 – 224.
119 Zgrablić, Goran., Stefan Haacke, and Majed Chergui. "Vibrational Coherences of the Protonated Schiff Base of all
– Trans Retinal in Solution." Chemical Physics 338 (2007) 168 – 174.
120 Kahan, Anat., Omer Nahmias, Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "Following Photoinduced
Dynamics in Bacteriorhodopsin with 7fs Impulsive Vibrational Spectroscopy." Journal of the American Chemical
Society 129.3 (2007) 537 – 546.
121 Hou, Bixue., Noga Friedman, Michael Ottolenghi, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "Comparing
Photoinduced Vibrational Coherences in Bacteriorhodopsin and in Native and Locked Retinal Protonated Schiff
Bases." Chemical Physics Letters 381.5 – 6 (2003) 549 – 555.
122 Loevsky, Boris., Amir Wand, Oshrat Bismuth, Noga Friedman, Mordechai Sheves, and Sanford Ruhman. "A New
Spectral Window on Retinal Protein Photochemistry." Journal of the American Chemical Society 133.6 (2011) 1626
– 1629.
123 Schmidt, B., C. Sobotta, B. Heinz, S. Laimgruber, M. Braun, and P. Gilch. "Excited – State Dynamics of
Bacteriorhodopsin Probed by Broadband Femtosecond Fluorescence Spectroscopy." Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) - Bioenergetics 1706.1 – 2 (2005): 165 – 173.
124 Gai, Feng., J. Cooper McDonald, and Philip A. Anfinrud. "Pump – Dump – Probe Spectroscopy of
Bacteriorhodosin: Evidence for a Near – IR Excited State Absorbance." Journal of the American Chemical Society
119.26 (1997) 6201 – 6202.
125 Loring, Roger F., Yi Jing Yan, and Shaul Mukamel. "Time – Resolved Fluorescence and Hole – Burning Line
Shapes of Solvated Molecules: Longitudinal Dielectric Relaxation and Vibrational Dynamics." Journal of Chemical
Physics 87.10 (1987) 5840 – 5857.