שיעור מיקרוביולוגיה 1 - 82 פרופסור איתי בנהר המרצה : לא הביולוגים יוצרי

‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪82‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית‬
‫המרצה‪ :‬פרופסור איתי בנהר‬
‫הגנטיקה‬
‫גנטיקה קלאסית‬
‫הגנטיקה של מיקרואורגניזמים מבוססת על פנוטיפ‪ ,‬לרוב של מוטנט‪ .‬לא הביולוגים יוצרים את המוטנט‪,‬‬
‫אלא שינוי ספונטני ואקראי‪ .‬כאשר הביולוגיה יוצרת את המוטגנזה הדבר נכנס תחת הגדרה אחרת‪.‬‬
‫הגנטיקה הקלאסית חוקרת תפקוד ופונקציות על ידי מוטנטים שנגזרו מהיצורים המקוריים הנחשבים‬
‫‪ .WT‬המוטנטים מלמדים על הפונקציות‪ ,‬התפקודים‪ ,‬המסלולים המטאבולים והמערכות הביולוגיות‪.‬‬
‫תחילה מבצעים מיפוי מוטציות על ידי שימוש בהכלאות – העברת ‪ DNA‬בין פרטים על מנת למצוא היכן‬
‫נמצאת המוטציה‪ .‬המיפוי נעשה על ידי רמות שונות של רזולוציה‪.‬‬
‫גנטיקה מולקולרית‬
‫השיטות הקלאסיות של מיפוי גנטי הכרוכות בהעברת ‪ DNA‬בין חיידקים והסתכלות על הפנוטיפ היו‬
‫שיטות גסות‪ :‬הן מיפו את לוקוס המוטציה בדיוק של כמה ‪ ,Kb‬ללא זיהוי נקודתי‪ .‬היכולת לזהות את‬
‫המיפוי המדוייק התרחשה עם לידת הגנטיקה המולקולרית שאיפשרה ריצוף וסינטזה של ‪ DNA‬והחדרת‬
‫‪ DNA‬מלאכותי לחקירת מוטציות מלאכותיות ומכוונות‪.‬‬
‫הגנטיקה התקדמה ממדע המבוסס על תצפיות ליכולת להשפיע על התצפיות‪ ,‬על המוטנטים‬
‫הנחקרים ומיפוי המוטציות הנחקרות‪.‬‬
‫בעידן הפוסט‪-‬גנומי בו ריצוף גנום חיידקי היא עניין של מה בכך‪ ,‬נרכשה היכולת למחקר בהסתכלות‬
‫שיטתית‪ ,‬אשר למעשה במקום מסויים מעיבה על ההבנה‪ :‬היכולת הפשוטה לריצוף הופכת את הבנת‬
‫התנהלות תהליכים פנוטיפים מוטנטים למוגבלת יותר מכפי שהייתה כאשר הכלים היו מוגבלים בעומק‬
‫ההסתכלות והרזולוציה שלהם‪.‬‬
‫גנטיקה הפוכה‬
‫בתוך הגנטיקה נכנס גם תחום של ‪ – Reverse Genetics‬בה תחילה משבטים גן מסויים‪ ,‬כאשר היכולת‬
‫להכיר גן ואת מסגרת הקריאה שלו היום פשוטה יותר‪ ,‬להחזיר את הגן עם מוטציה לחיידק ולבחון את‬
‫הפנוטיפ‪ .‬בצורה זו למעשה הולכים הפוך לגנטיקה הקלאסית‪ :‬כאן יוצאים מהמוטנט ובודקים מהו הפנוטיפ‬
‫שלו‪ ,‬במקום לראות פנוטיפ ולהבין מהי המוטציה שגרמה לו‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית‬
‫‪83‬‬
‫גנטיקה מיקרוביאלית‬
‫גנטיקה של מיקרואורגניזמים‪ ,‬בדגש על חיידקים )ללא שמרים‪ ,‬שהם אאוקריוטים(‪ ,‬כאשר‬
‫היתרונות של חיידקים הם היכולת לתירבות והקלות בביצוע מניפולציות גנטיות‪.‬‬
‫אלו הגדרות כלליות ולא נכונות לאור ההבנות הנוכחיות של המיקרוביולוגיה‪ .‬הן ניתנו בזמנים בהם לא‬
‫הובן שהיכולת לתרבת חיידק אינה דבר של מה בכך – היום ניתן לתרבת פחות מ‪ 1%-‬מצורות החיידקים‬
‫הידועות שנמצאות בטבע‪.‬‬
‫מגבלה נוספת בתירבות חיידקים היא העבודה שמסתכלים על היצור בתנאים שאינם קרובים לתנאים בהם‬
‫הוא חי ומתפקד בטבע – סביבות הטרוגניות‪ ,‬לא לבד; למעט בנישות אקולוגיות ייחודיות ונדירות בהן יש‬
‫קולטי אלקטרונים לא מקובלים או ריכוזי בסיס גבוהים‪ .‬החיידקים נמצאים במצב של תחרות כבדה‪ ,‬של‬
‫מחסור נוטריינטים )ולא השפע המסופק להם במעבדה(‪ .‬תנאי המעבדה אינם משקפים את מצבו הטבעי‬
‫של החיידק‪.‬‬
‫היכולת למניפולציה גנטית גם היא אליה וקוץ בה‪ :‬המניפולציה הגנטית‪ ,‬בעיקר הכנסת ‪ DNA‬זר‬
‫לחיידקים לצורך שינוי הפנוטיפ שלהם‪ ,‬ניתנת לביצוע במספר מוגבל של חיידקים‪ .‬חיידק ה‪E.coli-‬‬
‫נחקר מאוד וקל למניפולציה וכך גם עוד כמה חיידקים‪ ,‬אך ברוב החיידקים לא ניתן לעשות זאת‪ .‬הדבר‬
‫בעייתי כי המיקרוביולוגיה היום אינה עוסקת בפנוטיפים אלא בתקשורת בין גנומים למשל‪.‬‬
‫בחיידקים שלא ניתן לגרום למניפולציות ניתן לבודד גנים ולהעביר אותם לחיידקים שניתן לחקור אותם;‬
‫ניתן להשתמש שוב במוטגנזה האקראית; וניתן ללמוד חיידק דומה‪ ,‬מאותה משפחה‪ ,‬שלו כן ניתן לעשות‬
‫מניפולציות גנטיות‪.‬‬
‫מדוע יש שיטות שעובדות בחיידק אחד ולא באחר? שיטות כמו טרנספורמציה למשל יכולות לעבוד רק אם‬
‫הפלסמיד המוחדר יכול לעבור שיכפול בחיידק; במרבית החיידקים‪ ,‬גם המתורבתים‪ ,‬לא ידועים עדיין‬
‫הפלסמידים אשר יוכלו להיות משוכפלים בהם‪.‬‬
‫מוטנטים יכולים להיות שונים מה‪ WT-‬באופן מובחן‪ .‬ההמתנה למוטנט המתאים שייווצר באופן אקראי יכולה‬
‫לארוך זמן רב‪ ,‬אך שיטות למוטגנזה אקראית מגבירות אותו‪ .‬היכולת להמשיך ולחקור את המוטציה תלויה‬
‫ביכולת להמשיך ולעשות הכלאות אשר יאפשרו לחקור את מקור הפנוטיפ המובחן‪.‬‬
‫חיידקים כמודלים לגנטיקה‬
‫•‬
‫הפלואידיות – כל גן מופיע בגנום פעם אחת )למעט שינויים מכוונים מלאכותית או אקראיים עקב‬
‫העברה הוריזונטלית(‪ .‬מכיוון שכך‪ ,‬הפנוטיפ מופיע באופן ישיר – אין מצבי הטרוזיגוטיות בחיידקים‬
‫ושאלות של דומיננטיות או רצסיביות לא מופיעות בחיידקים‪.‬‬
‫•‬
‫זמן דור קצר – הכפלה בינארית מהירה מאוד‪ .‬ב‪ E.coli-‬מזן הבר‪ 28‬מתרחשת מדי ‪) 20‬למרות שיש‬
‫זנים המכפילים עצמם בתוך ‪ 40‬דקות(‪ .‬מכאן שניתן לקבל בתוך שעות ספורות כמות אדירה של‬
‫פרטים ולהבחין בשינוי גנטי ופנוטיפי בניסויים שאורכים שעות‪/‬ימים‪ 29‬ולא שבועות‪/‬חודשים‪.‬‬
‫‪" 28‬זן הבר" הוא מונח אמורפי שכן קשה לדעת האם הוא מתייחס לחיידק מהמעי או לחיידק שנמצא במעבדה‪.‬‬
‫‪ 29‬אין זה נכון לכל חיידק – חידק השחפת )‪ (mycobacterium tubercolosis‬יוצר מושבה על אגר בין ‪ 7-10‬ימים‪ ,‬שכן‬
‫ההכפלה אורכת ‪ 2-3‬שעות‪ .‬מסיבה זו מיקובקטריה פחות נוחים למחקר גנטי והמחקר בהם מתוכנן אחרת על מנת לעמוד‬
‫במגבלותיהם‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪84‬‬
‫•‬
‫חלוקה א‪-‬מינית – שני הצאצאים של חיידק מתחלק זהים גנטית להורה‪ .‬יציבות גנטית זו נותנת בסיס‬
‫השוואתי נוח‪ .‬יש לזכור כי אלו הגדרות כלליות ‪ -‬גם היציבות הגנטית נכונה ברוב המקרים אך לא‬
‫באופן גורף ומוטציות מתרחשות גם באופן ספונטני – קצב ההתרחשות הספונטני מאוד איטי וקשה‬
‫לסמוך עליו למחקר גנטי במוטנטים‪ ,‬אך הוא קיים‪.‬‬
‫מימדים של חידקים‬
‫התא הצהוב הוא תא אאוקריוטי שמימדיו הם כמה‬
‫מיקרונים‪ .‬הגרעין מסומן בירוק‪ ,‬ובכתום מופיע חיידק‬
‫מתג – כ‪ 2-‬מיקרון אורכו ומיקרון אחד רוחבו‪.‬‬
‫וירוסים‪ ,‬כמו הבקטריופאג'ים‪ ,‬הם בגודל ננומטרי וגם‬
‫להם חשיבות לדיון בגנטיקה מיקרוביאלית ככלים‬
‫להעברת ‪ DNA‬בגנטיקה מיקרוביאלית‪.‬‬
‫גנומיקה של חיידקים‬
‫המדע כיום נשלט על ידי הדוֹגמה המרכזית – המתייחסת לרמות שונות של איחסון ושימוש באינפורמציה‬
‫הגנטית‪ .‬ידוע שהאינפורמציה נשמרת ב‪ ,DNA-‬משועתקת ל‪ RNA-‬כמידע זמין ומתורגמת לחלבונים‪.‬‬
‫קיים מעבר מ‪ RNA-‬ל‪ DNA-‬על ידי ‪ reverse transcription‬בוירוסים ומעט גם בחיידקים‪ .‬ה‪RNA-‬‬
‫משמש לביטוי האינפורמציה הגנטית‪ ,‬למרות שיש וירוסים רבים שהגנום שלהם הוא גנום של ‪RNA‬‬
‫)רטרו‪-‬וירוסים(‪ .‬האינפורמציה מועברת הלאה לחלבונים‪ ,‬המוציאים לפועל של הפונקציות התאיות‪ .‬טרם‬
‫אותר התהליך ההפוך לתרגום – היכולת להפוך רצף חלבון לרצף ‪ ,RNA‬למרות שהיום ניתן לקבוע רצף‬
‫מלא של חלבון ולסנטז מלאכותית גן שיתורגם לחלבון הזה‪.‬‬
‫בתהליך ‪ Edman degradation‬ניתן היה להוריד חומצות אמיניות בקצה ‪ N‬של חלבון על מנת לקבוע את‬
‫הרצף שלהן‪ .‬היום יש שיטות מורכבות יותר כמו ‪ Mass-spectrometry‬ו‪Tandem-Mass--‬‬
‫‪ Spectrometry‬המזהות חלבונים מתחילתם ועד סופם‪.‬‬
‫חיידקים גם מקיימים את הדוֹגמה המרכזית‪ .‬האיור‬
‫מדגים כיצד כאשר הגנטיקה כמקצוע עברה אבולוציה‬
‫והכלים התפתחו גם ההסתכלות התפתחה‪ :‬מזה ‪10-‬‬
‫‪ 15‬שנים אנו נמצאים בעידן ה‪– "omics"-‬‬
‫ההסתכלות הכוללנית על תכולת היצור ולא הסתכלות‬
‫פרטנית‪.‬‬
‫עידן ה"אומיקות"‬
‫לפני כמה עשרות שנים ההסתכלות הייתה פרטנית וקריירה שלמה הייתה יכולה להיות מוקדשת לחקר של‬
‫גן אחד או מסלול מטאבולי אחד – כי הכלים היו פשוטים וההסתכלות מוגבלת‪ .‬ניתן היה להסתכל על‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית‬
‫‪85‬‬
‫מוטנט‪ ,‬פנוטיפ שהוא תוצר שינוי בגן בודד על פי רוב‪ ,‬לבחון שינויים ברמת ‪ RNA‬של הגן הבודד‬
‫שמעניין – למשל קביעת זמן מחצית החיים של ה‪ ,RNA-‬יציבות בשיטות נורת'רן‪ ,‬ניסויי ‪primer‬‬
‫‪ extension‬לקביעת השיעתוק וכדומה‪ .‬בסופו של דבר המטרה הייתה חקר מערכת אנזימטית‪ ,‬בידוד‬
‫האנזים והחלבון וקבלת תובנות על תפקודו של החלבון בפני עצמו‪.‬‬
‫בעידן ה‪ "omics"-‬יכולת ההסתכלות על תופעות המובאות למחקר מורכבת יותר‪ :‬ניתן לחקור חיידקים‬
‫לא כפרטים אלא כאוכלוסיות מורכבות יותר ופחות‪ ,‬כולל השגת תובנות בנוגע לחיידקים שלא ניתן‬
‫לתרבת‪ .‬מבחינת הגנומיקה‪ ,‬ניתן לרצף גנים ולהכיר את רצף ה‪.DNA-‬‬
‫מתוך הידע הזה לא עולה כל רצף הגנים או תפקיד הגנים; אפילו ב‪ E.coli-‬לא ידוע עדיין מה עושה כל‬
‫מסגרת קריאה או קטע שידוע שניתן לתרגום‪.‬‬
‫כאשר יודעים שיש ‪ RNA‬שבא לידי ביטוי‪ ,‬גם אם הרצף מוכר‪ ,‬אין זה אומר שהפעילות תהיה מוכרת‪.‬‬
‫הצורך להבין את התפקוד מכונה ‪ .annotation‬הגנומים המפוענחים ברובם לא עברו אנוטציה – לא ידוע‬
‫מהי הפונקציה שלהם‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬היכולת הגנומית מאפשרת להסתכל על גנומים שלא תורבתו – לבודד‬
‫גנומים מנישה‪ ,‬לרצף אותם ולנתח אותם‪ .‬פעולה זו – מטא‪-‬גנטיקה – לא מאפשרת לרצף גנומים שלמים‬
‫של אורגניזמים‪ ,‬שכן כל דגימה יכולה להיות מורכבת מעשרות אלפי יצורים שונים והריצוף הגנטי מפענח‬
‫אותה ביחידות קצרות וישנה בעיה בהרכבה של החתיכות ליצירת גנומים שלמים‪ ,‬גם בחיידקים‪ .‬יחד עם‬
‫זאת ההסתכלות הזו חשובה להתחקוּת על מסלולים מטאבולים ופוטנציאל מטאבולי – למשל לצורך‬
‫פירוק צלולוז‪ ,‬תאית‪ ,‬שיש לו פוטנציאל אנרגטי כאנרגיה ירוקה שתחליף את הפחם והנפט‪.30‬‬
‫כל ההסתכלויות הכוללניות של האומיקות הן הסתכלויות השוואתיות; המטאגנומיקה ניגשת לסביבה על‬
‫מנת ללמוד את המגוון הגנטי שיש בתוכה‪ ,‬גם אם אין יכולת לדעת מה תפקיד כל חתיכת ‪ DNA‬נוכחת או‬
‫מיהו היצור ממנו באה חתיכת הגנום‪ .‬המטא‪-‬גנומיקה מפיקה משפחות של גנים ומאפשרת השוואה בדגימת‬
‫הנישה האקולוגית במצבים שונים‪.31‬‬
‫השוואה ב"אומיקות"‬
‫בהסתכלות הגנומית החלק ההשוואתי אינו הדומיננטי – המחקרים נעשים על מנת לקבל מידע על העושר‬
‫הגנטי‪ .‬יחד עם זאת בירידה לרמת הגן בטרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה מתייחסים יותר לנקודות‬
‫ההשוואתיות‪.‬‬
‫כאשר מבודדים מולקולה בודדת בגנטיקה קלאסית של גן מסויים‪ ,‬מנסים להבין את תכונותיה של‬
‫המולקולה – אורך חייה‪ ,‬אורך החלבון‪ ,‬מבנה החלבון‪ ,‬יחסי מבנה‪-‬תפקוד‪ .‬בהסתכלויות של אומיקות‬
‫הדבר שונה‪ :‬כלל ה‪ mRNA-‬נדגם מהיצורים ומופעל אחד ממספר כלים שיראה כיצד הגנים עולים או‬
‫יורדים כתוצאה משינויים סביבתיים‪.‬‬
‫‪ 30‬מחקר דוגמה שכזה הוא הכרס )‪ (rumen‬של הפרה המכיל חיידקים המתסיסים את הצלולוז ומסייעים בפירוקו‪ .‬בידוד של‬
‫חיידקים אלו יכול אפשר לזהות גן שייעל את התהליכים האלו לעומת האופן בו הם מתנהלים היום‪.‬‬
‫‪ 31‬בפרות למשל ניתן לשנות את הדיאטה – פרות בתעשיית החלב ניזונות ממזון עתיר אנרגיה כמו גרעיני תירס או חיטה ואחוז‬
‫מסוים של עשב או חציר‪ .‬שינוי הדיאטה מביאה לאדפטציה של אוכלוסיית חיידקי הכרס‪ ,‬כך שהיחסיות של האוכלוסיות תגייס‬
‫את כלל האוכלוסיה לניצול מיטבי של הדיאטה החדשה‪ .‬דגימת פרה שאוכלת חציר בלבד ופרה שאוכלת גרעיני תירס תראה‬
‫כיצד הנישה אקולוגית מתאקלמת לשינוי שהושרה באופן מלאכותי‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪86‬‬
‫ההסתכלות על השינויים נעשית בשני כלים עיקריים‪ microarray :‬בו משתמשים ב‪ RNA-‬בתור גלאי‬
‫ואז שימוש בצ'יפ במערך מסודר של מולקולות שמייצגות את הגנים‪ .‬בניסוי היברידיזציה ועוצמת הסיגנל‬
‫על כל נקודה בצ'יפ ניתן לנסות להבין את רמת הביטוי של הגן בתנאים בהם נדגם ה‪ ;RNA-‬אם ה‪RNA-‬‬
‫נדגם בחיידקים שגדלו בטמפרטורות שונות‪ ,‬מקורות תזונתיים שונים או עקות שונות – כל שינוי מביא‬
‫לירידה ברמת הביטוי של גנים שפחות נחוצים במצב החדש ועלייה ברמות הביטוי של גנים הנחוצים‬
‫להתמודדות יעילה עם התנאים החדשים‪ .‬היברידיזציה על הצ'יפ תאפשר לגלות מה עלה ומה ירד ולהבין‬
‫איך החיידק כמערכת הגיב לשינוי הסביבתי אליו נחשף‪.‬‬
‫טכנולוגית המיקרואראי‬
‫המיקרואראי פותחו לפני ‪ 10-15‬שנה‪ .‬בשנים האחרונות‪ ,‬תודות לטכנולוגיית הריצוף‪ ,‬פותח כלי חדש‬
‫המחליף את השיטה – ‪ .RNA SEQ‬השיטה מרצפת את ה‪ RNA-‬אך במקום לעשות היברידיזציה עושים‬
‫)‪ reverse transcription (RT‬שמספק רצפי ‪ DNA‬בשכיחות המייצגת את שכיחות ה‪ RNA-‬בחיידק‪.‬‬
‫שתי השיטות מבוססות הכרת הגנומים של היצור הנחקר‪.‬‬
‫במטאגנומיקה אין זה כך; טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה מופעלות על יצורים בודדים ובודקות את‬
‫ההתמודדות שלהם עם שינויים מלאכותיים‪.‬‬
‫פרוטאומיקה‬
‫ברמת החלבון‪ ,‬הפרוטיאומיקה באה לזהות את כל חלבוני החיידק מחד ולראות איך רמת הביטוי של‬
‫החלבונים משתנה כתגובה לשינויים סביבתיים מאידך‪ .‬הדרך הותיקה למחקר זה )למעלה מ‪ 40-‬שנה( היא‬
‫הרצת ג'ל דו‪-‬מימדי‪ 32‬של חלבונים‪ .‬לשיטה זו שני שלבים‪:‬‬
‫•‬
‫בשלב הראשון מפרידים את החלבונים בג'ל המבוסס תחילה על הנקודה האיזואלקטרית על ידי‬
‫גרדיינט ‪ – pH‬החלבונים לא נודדים לפי גודל אלא לפי הנקודה האיזואלקטרית‪ .‬מתקבל טור יחיד של‬
‫חלבונים‪.‬‬
‫•‬
‫את הטור הזה חותכים ומשכיבים על ג'ל ‪ SDS‬רגיל‪ .‬כעת כל חתיכה רצה שוב במימד נוסף ומופרדת‬
‫לפי גודל – מכאן שביצענו שתי הפרדות‪ .‬התוצר מכונה "טביעת אצבעות של החיידק"‪.‬‬
‫כאשר מבקשים לדעת מהי הכמות של החלבונים‪ ,‬הזהות שלהם והשינוי שנעשה בהם כתוצאה משינויים‬
‫סביבתיים‪ ,‬כדי לאתר נקודה ניתן לעשות אנליזות פרוטאומיות על מוטנטים – עבודה נרחבת נעשתה על‬
‫מוטנט להכרת המוטציה שלו ואז ערכו ג'ל דו‪-‬מימדי על חלבוני ה‪ WT-‬לעומת המוטנט ובדקו אילו נקודות‬
‫נעלמות במוטנט‪ .‬בצורה כזו ניתן לדעת שהחלבון שנעלם קשור למסלול הפנוטיפ המוטנט‪ .‬לא ניתן לקבל‬
‫כאלה אנליזות למוטציות ליתאליות – כמו ‪ RNA‬פולימראז‪.‬‬
‫ההפרדה הדו‪-‬מימדית רגישה מספיק כדי להפריד בין חלבונים מאוד דומים – אפילו בהבדלים של חומצת‬
‫אמינו אחת‪ ,‬ניתן לקבל שורה של נקודות באותו גודל )‪ (SDS‬אך נקודה איזואלקטרית שונה ולכן הן יהיו‬
‫‪ 32‬באנליזה חד מימדית‪ ,‬בה מריצים חלבונים בג'ל ‪ SDS‬לצד מרקר שמסמן את הגודל של המולקולות‪ ,‬נקבל הרבה בנדים‬
‫שונים‪ .‬ההסתכלות אינה ברזולוציה גבוהה מספיק להבחין בכל חלבוני החיידק ולכן פותחה שיטת הג'ל הדו‪-‬מימדי – ‪.2D Gel‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :12‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית‬
‫‪87‬‬
‫מוסטות מעט‪ .‬ניתוח הכמות מתאפשר על ידי בדיקת עובי הנקודה – ככל שיש יותר מהחלבון הנקודה‬
‫גדולה יותר‪.‬‬
‫היום התהליך נעשה באופן אוטומטי וזיהוי מוחלט של הנקודות בלי הכרת מוטנטים‪ :‬רובוט לוקח כל‬
‫נקודה‪ ,‬עושה לה אנליזת ‪ Mass spectrometry‬ומזהה את החלבון‪ .‬כעת ניתן לחזור לפרוטאום ולערוך‬
‫אנליזות בין חיידקים מסביבות שונות‪.‬‬
‫•‬
‫•‬
‫ההסתכלות של הפרוטאומיקה נעשית על ידי הסתכלות של אוכלוסיית חיידקים טהורה‪.‬‬
‫‪ Mass Spectrometry‬מפרידה חלבונים על פי מסה ומטען בדיוק של אטומים בודדים‪ .‬האנליזה‬
‫מספקת אוסף של מסות מאיכול פרוטאוליטי של החלבון‪ ,‬והמחשב יודע לזהות את החלבון‬
‫מתוך נתוני הגנים‪.‬‬
‫הטרנסקריפטום והפרוטאום מאפשרות להסתכל כלל‪-‬מערכתית על אוכלוסיה של פרטים זהים; יש לזכור כי‬
‫כמו שלא ניתן לעשות מטא‪-‬פרוטאומיקה כי עוצמת הכלי לא חזקה מספיק לתובנות כאלו‪ ,‬גם לכלים‬
‫האלה יש מגבלות – בין אם בגלל הגדלים ובין אם בגלל שכיחויות‪.‬‬
‫מולקולות מסויימות של ‪ RNA‬או חלבון יכולות להימצא בכמויות גדולות מאוד או קטנות מאוד‪ .‬בג'ל דו‬
‫מימדי ניתן לראות חלבונים שכיחים יחסית – הנדירים ביותר מתחת לכושר הרזולוציה שלנו‪ .‬לכל שיטה‬
‫אנליטית מספר מגבלות והתשובה לעולם לא מלאה לחלוטין‪.‬‬
‫כלים בגנטיקה בקטריאלית‬
‫בתחילת העידן הגנטי‪ ,‬הכלים הפשוטים ביותר היו מוגבלים מאוד‪:33‬‬
‫•‬
‫גידול מושבות על צלחות אגר והיכולת ל‪.Replica Plating-‬‬
‫•‬
‫היכולת לטיהור מושבות על ידי מיהול וזריעה מחדש‪ ,‬כולל הפעלת מצעים סלקטיבים‪ .‬צריך‬
‫טיהור מושבות כי בכל דגימת סביבה מתקבלות מאות רבות של אוכלוסיות של מיקרובים – כולל‬
‫פטריות ועובשים – הנזרעים בצפיפות מאוד גבוהה‪ .‬מיהול הדגימה יסייע לקבלת מושבות מבודדות‪.34‬‬
‫הגנטיקה דורשת תבדידים מופרדים היטב‪ .‬כלי המיהולים הסדרתיים משמש להפקת מושבות‬
‫מבודדות‪.‬‬
‫•‬
‫כלים של סלקציה והעשרה – שתי דרכים המאפשרות לצאת מאוכלוסיה הטרוגנית לאוכלוסיית‬
‫החיידקים המבוקשת‪ .‬שתיהן מבוססות על מתן יתרון לחיידק המבוקש על פני המתחרים לו – כאשר‬
‫סלקציה לרוב נעשית במצע מוצק והעשרה במצע נוזלי‪ .‬הסלקציה הקלאסית ביותר נעשית על ידי‬
‫דגימת סביבה הנזרעת על צלחת עם אנטיביוטיקה – רוב החיידקים בדגימה לא יהיו עמידים וימותו‪,‬‬
‫אך החיידקים העמידים יבודדו‪ ,‬יצמחו בצלחת וייתנו מושבה‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬העשרה תיעשה במצע‬
‫נוזלי – הדגימה תוכנס לבקבוק עם מצע מינימלי שמקיים חיידק פרוטוטרופ ונפט )למשל( כמקור‬
‫פחמן יחיד‪ .‬בצורה זו מחפשים חיידקים המפרקים את הנפט‪ ,‬ולהם ניתן היתרון‪.35‬‬
‫‪ 33‬יש לזכור למשל במודל האופרון כמה מדהים היה להעלות את המודל הזה כשכל הכלים שעמדו לרשות החוקרים היו צלחות‬
‫אגר ומושבות לבנות או כחולות‪.‬‬
‫‪ 34‬מושבת חידקים על צלחת אגר מתחילה מחיידק בודד – המושבה היא קלונלית וכל החיידקים זהים גנטית )בערבון מוגבל(‬
‫אחד לשני‪.‬‬
‫‪ 35‬זיהוי חיידקים כאלה מאפשר ביו‪-‬רמידיאציה לטיפול בשפכי נפט גולמי‪ ,‬למשל‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪88‬‬
‫•‬
‫היכולת לאחסן את החיידקים לזמן ממושך – יש חיידקים‪ ,‬בעיקר גרם חיוביים‪ ,‬שעוברים‬
‫ספורולציה המסוגלות לחיות לזמן ממושך ללא תנאים מיוחדים‪ .‬כאלה שלא עושים זאת מאוחסנים‬
‫במלאי מוקפא‪.‬‬
‫שיחלוף גנטי‬
‫כבר מתקופת הגטיקה הקלאסית זוהו שלוש שיטות לשיחלוף גנטי בין חיידקים‪:‬‬
‫•‬
‫טרנספורמציה – קליטת ‪ DNA‬עירום מהסביבה ואינקורפורציה של המידע לגנום החיידק המקבל‪.‬‬
‫התורם מתפרק‪ ,‬מתפוצץ וה‪ DNA-‬שלו נשפך החוצה‪ .‬ה‪ DNA-‬נלקח על ידי תאי המקבל‪ ,‬אשר‬
‫צריכים להיות קומפטנטים – במצב המאפשר קבלת ‪ DNA‬מהסביבה‪ .‬הוא מוכנס למקבל‬
‫והאינפורמציה עוברת אינקורפורציה לתוך הכרומוזום של החיידק המקבל‪ .‬כאשר הוא משתכפל‬
‫הפנוטיפ מופיע בצאצאים‪.‬‬
‫•‬
‫טרנסדוקציה – העברת מקטעי ‪ DNA‬בעזרת הדבקת בקטריופאג'‪ .‬הפאג'ים – וירוסים שמדביקים‬
‫חיידקים – אורזים את ה‪ DNA-‬של התורם ומשנעים אותו באירוע של הדבקה אל החיידק המקבל‪.‬‬
‫גם כאן נכנסה חתיכת ‪ DNA‬שמקורה בחיידק התורם אל החיידק המקבל ובתהליכי אינקורפורציה‬
‫היא נכנסת לגנום‪.‬‬
‫•‬
‫קוניוגציה – מעבר ‪ DNA‬על ידי פלסמידים מיוחדים המסוגלים לבצע את התהליך )"פלסמידים‬
‫קוניוגנטים"( ולהעביר את עצמם בין חיידק לחיידק‪ .‬בניגוד לשני המצבים הקודמים‪ ,‬בהם התורם‬
‫אינו חי כאשר התהליכים יוצאים לפועל‪ ,‬כאן התורם והמקבל חיים שניהם – ועובדה זו היא תנאי‬
‫להתקיימות התהליך‪ .‬קיים מגע פיזי בין החיידקים והעברה אקטיבית של ‪ DNA‬מתורם למקבל‪.‬‬
‫לאחר ההיפרדות‪ DNA ,‬מהתורם נמצא במקבל והאינפורמציה מתעגנת בגנום המקבל )או מתקיימת‬
‫כפלסמיד בעל כושר שיכפול(‪ ,‬כאשר הפנוטיפ מופיע בצאצאים‪.‬‬
‫בשלושת התהליכים יש תמיד תורם – החיידק ממנו האינפורמציה הגיע )גם בטרנספורמציה ה‪DNA-‬‬
‫העירום היה איפושהו תחילה( ושיטת מעבר של ה‪ DNA-‬לחיידק השני‪ ,‬הוא החיידק המקבל‪ .‬כאשר‬
‫מסתכלים על הפנוטיפ בוחנים את הצאצאים של המקבל – כי האירועים נעשים ברמת החיידק הבודד‪,‬‬
‫הפרט‪ ,‬והפנוטיפ נצפה ברמה של מושבה או תרבית בגידול נוזלי‪ .‬עם זאת‪ ,‬האוכלוסיה צפויה להיות‬
‫אחידה גנטית‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪89‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫חתיכות ‪ DNA‬שנכנסות לתוך חיידק מועדות בפני סכנות איכול על ידי נוקלאזות‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬אם קיימת‬
‫הומולוגיה ברמה כלשהי בין ה‪ DNA-‬הפולש ל‪ DNA-‬של החיידק המקבל‪ ,‬פיסת ה‪ DNA-‬יכולה לעבור‬
‫אינקורפורציה לגנום‪ .‬פיסת ‪ DNA‬זר לחלוטין אינה מסוגלת להיכנס לגנום בריקומבינציה‪ ,‬למרות‬
‫שישנן שיטות למעברים הוריזונטלים )שלא נעסוק בהן(‪.‬‬
‫גנטיקה של בקטריופאג'ים‬
‫פאג'ים הם וירוסים בקטריאלים וכנגיפים הם פרזיטים אובליגטורים בהגדרה‪ :‬אין להם מנגנוני שכפול‬
‫משלהם ולכן אינם יכולים להתרבות ללא המאחסן – הם מעטפות של חומר גנטי שיודעות להחדיר אותו‬
‫לחיידקים‪ ,‬שם החומר הגנטי יכול להשתכפל ולקודד למרכיבי הוירוס המתארגנים ליצירת ויריונים‬
‫היוצאים מהמאחסן – לרוב בצירוף השמדתו בליזיס‪.‬‬
‫הערכת כמות החיידקים נעשית על ידי ספירה חיה של מושבות לאחר סדרות מיהולים; פאג'ים לא מקימים‬
‫מושבות אלא "פלאקים" – מוקדי הדבקה‪ .‬בצלחת פטרי המכוסה בדשא חיידקים מזן הרגיש להדבקה על‬
‫ידי פאג'‪ ,‬אם מטפטפים על הצלחת מיהול של פאג'ים בנקודות מסויימות חלק מהחיידקים יידבקו בפאג'‪,‬‬
‫יתפוצצו וישחררו כמה עשרות עד מאות ויריונים בסביבתם‪ .‬כל ויריון ששוחרר ידביק חיידק סמוך‬
‫והתהליך יחזור על עצמו עד שיופיע "חור" בדשא החיידקים‪ .‬כל פלאק מקורו בפאג' אחד שהדביק חיידק‬
‫אחד‪ .‬ספירה של הפלאקים בחישוב המיהולים נותנת את המספר שלהם‪.‬‬
‫חיידקים סטציונרים הינם בעלי פעילות מטאבולית נמוכה ולכן התרבות הפאג'ים בתוכם איטית יותר‪ .‬מסיבה‬
‫זו‪ ,‬כאשר בודקים את הצלחת בזמן מוגדר‪ ,‬ניתן לראות פלאקים מבודדים לפני שהפאג'ים מספיקים להעלים‬
‫את כל החיידקים בצלחת‪.‬‬
‫לפאג'ים יש גנומים הפלואידים‪ ,‬אך ניתן "להכליא" בין פאג'ים על ידי הדבקת אותו החיידק בשני סוגי‬
‫פאג'‪ .‬ניתן גם לבצע סלקציה בעזרת פאג'ים‪ .‬הפאג'ים הינם כלים יעילים מאוד להעברת ‪DNA‬‬
‫)טרנסדוקציה(‪.‬‬
‫הגרף הבא הינו מסוג ‪ .One-Step Growth of Bacteriophage‬הוא מציג את מספר החיידקים‬
‫המודבקים בפאג'ים כפונקציה זה הזמן מרגע הוספת הכמות המדודה של הפאג'ים‪ .‬מדי כמה דקות נלקחת‬
‫דגימה מהנוזל העליון‪ ,‬מסלקים את‬
‫החיידקים בסירכוז ועושים מבחן‬
‫פלאקים כדי לבדוק כמה פאג'ים יש‬
‫בנוזל‪ .‬נראה שמתקבלים שני גרפים‪:‬‬
‫‪ Total Phage‬הוא סך הפאג'ים בעוד‬
‫ש‪ Extracellular phage-‬הוא כמות‬
‫הפאג'ים שיצאו מהתאים והיו בנוזל‬
‫העליון‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪90‬‬
‫בתקופה הראשונה‪ ,Eclipsed ,‬לא רואים פאג'ים כלל‪ .‬אפילו העקומה הראשונה שמתחילה לעלות – של‬
‫סך הפאג'ים – לא נראית בתקופה זו‪ .‬הסיבה היא שהפאג'ים נכנסו כולם לחיידקים‪ ,‬הזריקו את ה‪DNA-‬‬
‫וצריכים להשלים את תהליכי יצירת הויריונים‪ .‬תקופת ה‪ Eclipsed-‬היא התקופה בה עדיין לא בקע‬
‫אף פאג' שלם מאף חיידק‪.‬‬
‫בתקופה הבאה‪ ,Latent Period ,‬מתחילים לראות פאג'ים בספירה ה‪ Total-‬אך לא ב‪.Extracellular-‬‬
‫קבלת פאג'ים פוטנטים תנתן רק מפיצוץ התאים בתמיסה‪ ,‬לא מהנוזל העליון‪.‬אין פאג'ים חופשיים‬
‫בנוזל‪ .‬הסיבה היא שכעת יש כבר ויריונים שלמים בתוך החיידקים אולם הם עדיין לא בקעו החוצה‬
‫מהתא‪.‬‬
‫בתום תקופת ה‪ eclipsed-‬יש מספיק רכיבים ליצירת פאג'ים שלמים אולם כדי לצאת מהחיידק הפאג'ים‬
‫מקודדים לליזינים שמפוצצים את החיידק בסוף תהליך ההדבקה; יש להם מנגנוני בקרה גנטית מתוחכמים‬
‫וניתן לזהות בהם גנים מוקדמים )‪ (early genes‬וגנים מאוחרים )‪ ,(early genes‬המופעלים בפער רחוק‬
‫יחסית מנקודת ההדבקה‪ .‬ליזינים הם חלק מהגנים המאוחרים‪ ,‬כך שרק לאחר שיהיו ויריונים שלמים בתוך‬
‫התא יחול הליזיס‪ .‬שההפרש בין סוף התקופה האקליפסית וסוף התקופה הלאטנטית נובע מפרק הזמן‬
‫שבין יצירת פאג'ים בתא לבין תרגום הגנים לליזינים‪.‬‬
‫בתקופה האחרונה‪ ,Rise Period ,‬שני הגרפים מגיעים לאותה הנקודה שהיא מספר הפאג'ים הבוקעים‬
‫מחיידק בודד שהודבק על ידי פאג' בודד בתחילת הניסוי‪.‬‬
‫ההיסטוריה של הגנטיקה המיקרוביאלית‬
‫גריפית' ושות' – ניתן להעביר תכונות בין חיידקים‬
‫גריפית' הראה שניתן להעביר תכונות בין חיידקים על ידי עירבוב‬
‫חיידקים שונים‪ .‬הניסוי נעשה על ידי ערבוב חיידקים ליתאליים‪,‬‬
‫סטרפטוקוקוס בעלי קפסולה‪ ,‬יחד עם חיידקים לא‪-‬אלימים וחסרי‬
‫קפסולה מאותו זן והחדרתם עכבר‪.‬‬
‫החיידקים החיים בעלי הקאפסולה )‪ (smooth‬הורגים את העכבר‬
‫והמתים לא הורגים אותו; החיידקים חסרי הקאפסולה )‪(rough‬‬
‫אינם גורמים למוות‪ .‬יחד עם זאת השילוב בין החיידקים ‪smooth‬‬
‫המתים וחיידקי ‪ rough‬החיים גורם למוות של העכבר‪.‬‬
‫מה קרה כאן? החיידקים ה‪ rough-‬הם כנראה חיידקים מוטנטים ולא ‪ ,WT‬כי רוב המוטציות הן לרוב‬
‫אובדן יכולת ולא רכישת יכולת; מכאן שהחיידק איבד פונקציה חשובה לפתוגניות שלו‪ .36‬הפנוטיפ –‬
‫‪ 36‬היום ידוע שההבדל בין שני החיידקים הוא בסינטזה של מרכיבי דופן החיידק – הקאפסולה שנמצאת מחוץ לממברנה של‬
‫החיידק הגראם‪-‬חיובי‪ .‬המבנים הסוכריים של הדופן גורמים למופע המושבה המבריק והם גם חלק מגורמי האלימות של‬
‫החיידק‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪91‬‬
‫מושבות חלקות‪ ,‬עגולות ומבריקות ל‪ Smooth-‬לעומת מושבה עמומה עם שוליים מחורצים ל‪– Rough-‬‬
‫נותן ביטוי לעובדת המוטציה‪ .‬הניסוי הוכיח שקיימת יכולת להעביר תכונה וירולנטית‪.‬‬
‫מאוחר יותר‪ ,‬אייבורי ושות' הוכיחו גם שהחומר המועבר בין החיידקים הוא ‪ DNA‬על ידי הזרקת שני‬
‫סוגי החיידקים‪ ,‬מתים וחיים‪ ,‬עם נוקליאזות – מצב בו העכבר עדיין חי‪ .‬לעומת זאת כאשר הזריקו עם‬
‫פרוטאזות )או אנזימים מפרקים אחרים( העכבר עדיין מת – כלומר לא חלבונים )או כל אלמנט אחר‬
‫לצורך העניין( גורמים לתופעה‪.‬‬
‫הרשי וצ'ייס – ה‪ DNA-‬הוא החומר הגנטי של בקטריופאג'ים‬
‫עוד לפני ווטסון וקריק ותגלית מבנה ה‪ DNA-‬ועוד לפני שידוע ש‪-‬‬
‫‪ DNA‬הוא החומר הגנטי של יצורים משוכללים וירודים כאחד‪,‬‬
‫ערכו הרשי וצ'ייס את הניסוי שלהם‪ .‬הם הראו שכאשר וירוס‬
‫מחדיר את החומר שלו לחיידק לא נדרש יותר מאשר ‪ DNA‬על‬
‫מנת לקבל ויריונים חדשים‪.‬‬
‫הדבר נעשה על ידי הדבקת חיידקים בפאג'ים משני סוגים – אחד‬
‫הכיל פוספט מסומן )‪ DNA‬בלבד‪ (37‬והשני הכיל גופרית מסומנת‬
‫)חלבונים בלבד(‪ .‬הפאג'ים גודלו בחיידקים שגדלו על מצע מזון עם‬
‫האיזוטופים‪ .‬החיידקים הבאים שהדביקו הפאג'ים המסומנים לא‬
‫גדלו במצע עם איזוטופים מסומנים‪.‬‬
‫כעת מכניסים את החיידקים המודבקים למעין בלנדר המערער את‬
‫החיבור העדין של מעטפת הפאג' לחיידק כך שניתן להפריד בין‬
‫המעטפות הריקות של הפאג'ים לבין החיידקים המודבקים‬
‫)בצנטריפוגה(‪ .‬כדי שהניסוי ייעשה כראוי יש לעשות אותו בכל‬
‫תקופה הקצרה יותר מסוף התקופה הלאטנטית‪.‬‬
‫בהפרדה נמצא כי המעטפות שנשארו מחוץ לחיידקים מכילות את מרבית הסימון בגופרית ואילו החיידקים‬
‫ללא המעטפות מכילים את מרבית הסימון בזרחן – כלומר הקאפסיד עשוי החלבונים נשאר בחוץ‬
‫ופנימה נכנס ה‪ .DNA-‬כאשר נתנו לחיידקים להמשיך לגדל את הפאג'ים‪ ,‬נמצא ש‪ 30%-‬מהויריונים‬
‫הכילו ‪ DNA‬מסומן ופחות מ‪ 1%-‬הכיל חלבון מסומן‪ .‬מכאן שה‪ DNA-‬לא רק נכנס לשיכפול גנים‬
‫ותוצרים ליצירת ויריונים‪ ,‬הוא גם נארז מחדש בויריונים החדשים‪.‬‬
‫הסיבה לכך היא שכנראה כל חיידק הודבק על ידי כמה וכמה פאג'ים ולכן היה אחוז כה גבוה – בעקרון כל‬
‫הדבקה יוצרת ויריון צאצא אחד שמכיל ‪ DNA‬רדיואקטיבי‪.‬‬
‫‪ 37‬יש לציין כי גם חלבונים יכולים להכיל זרחנים‪ ,‬במצב של חלבון מזורחן‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪92‬‬
‫ניסויים נוספים‬
‫•‬
‫לוריה ודלברוק הוכיחו שהעברת תכונות של חיידקים עובדת במודל דארוויניסטי ולא מודל למארקי‪.‬‬
‫•‬
‫זינדר ולדרברג גילו את הטרנסדוקציה – היכולת לגרום לשינוי גנטי בחיידקים תוך שימוש בפאג'ים‪.‬‬
‫•‬
‫סימור בנזר השתמש בריקומבינציה בפאג'ים כדי להדגים שגנים ב‪ DNA-‬הם יחידות רציפות‬
‫ומוטאביליות ושהקוד הגנטי מורכב משלישיות של בסיסים‪.‬‬
‫•‬
‫מסלסון וסטאל אישרו ששיכפול ‪ DNA‬הוא סמי‪-‬קונסרבטיבי‪.‬‬
‫•‬
‫ברנר‪ ,‬ג'קו ומסלסון הוכיחו את קיום ה‪ mRNA-‬וכן שהריבוזומים הם אתרי סינטזת החלבונים‪.‬‬
‫•‬
‫קריק ושות' מאפיינים את הקוד הגנטי בהיותו רציף )ללא דילוגים(‪ ,‬מורכב מקודונים של שלוש‬
‫אותיות והינו בעל חזרות‪.‬‬
‫•‬
‫ג'קו ומונו פירסמו את מודל האופרון‪ .‬מודל זה הוכיח את המדע על ההנחה שגנטיקה של אורגניזמים‬
‫גדולים כקטנים זהה – הסידור של האופרון היה אופייני לחיידקים בלבד ולא לאאוקריוטים‪.‬‬
‫•‬
‫קורנברג גילה את ה‪ DNA-‬פולימראז‪ .‬בפועל‪ ,‬זהו ה‪ DNA-‬הפולימראז הלא נכון‪ :‬בחיידקים יש‬
‫יותר מ‪ DNA-‬פולימראז אחד ועד היום לא ברור מה התפקיד של כל אחד מהם‪ ,‬למרות שידוע שלכל‬
‫פולימראז מספר תפקידים‪ .‬קורנברג גילה את ‪ DNA‬פולימראז ‪ ,I‬למרות שמי שעושה את‬
‫הרפליקציה של הגדיל המוביל‪ 38‬הוא ‪ DNA‬פולימראז ‪.III‬‬
‫•‬
‫סוף עידן הגנטיקה הקלאסית ותחילת העידן המולקולרי – העידן המולקולרי איפשר לבצע‬
‫‪ reverse gemnetics‬ולבחון את השפעתן של מוטציות מלאכותיות מתוכננות‪.‬‬
‫•‬
‫מוליס רשם את הפטנט על ‪ PCR‬המשתמש בפולימראז תרמוסטאבילי‪.‬‬
‫בנזר‬
‫בנזר עבד עם פאג' בשם ‪ MS2‬בעל חומר גנטי מסוג ‪ .RNA‬הוא גידל בחיידקים פאג'ים‪ ,‬הפעיל תהליכים‬
‫מוטגנים וקיבל צאצאי פאג' לא‪-‬אינפקטיבים‪.‬‬
‫כיצד הוא יודע שיש פאג'ים אם אין פלאקים? ניתן לקחת דגימה מהנוזל העליון ולראות במיקרוסקופ‬
‫אלקטרוני שהפאג'ים שם והם פשוט לא אינפקטיבים‪.‬‬
‫סדרת ניסויים כאלו נעשתה על ידי צבעי אקרידין – הגורמים להחסרות של מספר קטן של בסיסים‪.‬‬
‫בעזרת החומרים האלו כמוטגנים בנזר יצר מוטנטים שונים‪ ,‬עירבב אותם והדביק אותם בקומבינציות של‬
‫‪ 2-3‬מוטנטים יחד במטרה לבדוק האם ניתן לקבל פאג'ים אינפקטיבים‪.‬‬
‫בסופו של דבר הוא חילק את המוטנטים לקבוצות קומפלמנטציה – הוא חילק את הפאג'ים הלא‪-‬‬
‫אינפקטיבים לפאג'ים של ‪ +‬ושל ‪ .-‬אם מערבבים ‪ +‬עם – מקבלים פאג'ים אינפקטיבים; אם רוצים להפיק‬
‫פאג'ים אינפקטיבים מאותו סימן צריך לערבב שלושה מקבוצת ה‪ (+)-‬או שלושה מקבוצת ה‪.(-)-‬‬
‫‪ 38‬עד היום לא ידוע מיהו הפולימראז שתפקידו הייעודי הוא הגדיל מעוכב – למרות שידוע שיש כמה פולימראזות שיכולים‬
‫לעשות זאת‪ ,‬לא יודעים מי עושה זאת כי אם יוצרים מוטציה באחד אחר בא וממלא את מקומו‪ .‬היתירות הזו חשובה בביולוגיה‬
‫וקיימת לעיתים קרובות בפונקציות חיוניות‪ ,‬כעין ביטוח מפגיעה בגנים הראשוניים שפועלים במסלול על ידי תהליך מוטגני‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :13‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪93‬‬
‫הערה‪ :‬כל )‪ (+‬או )‪ (-‬נפרד הוא אירוע מוטגנזה נפרד שזוהה לאחר בדיקה התאים לקבוצת קומפלמנטציה‬
‫מסויימת‪.‬‬
‫אנזימי מתילציה )מתילאז( דואגים למודיפיקציות על ה‪ DNA-‬העצמי של החיידק כך שיוכל לזהות‬
‫‪ DNA‬זר‪ ,‬שאינו ממותל‪ .‬ה‪ DNA-‬הזר נחתך כתוצאה מהזיהוי על ידי אנזימי ההגבלה‪ .‬אנזימי הגבלה הם‬
‫מנגנוני הגנה של חיידקים כנגד מקורות ‪ DNA‬זרים‪ ,‬החותכים את הגנום במקטעים קבועים‪ ,‬בעלי תבנית‬
‫פלינדרומים‪.‬‬
‫שיבוט‬
‫פיתוח זה הצליח להביא לביטוי גן המשובט בתוך פלסמיד‪ .‬פעולה‬
‫זו הביאה לתחילת ההנדסה הגנטית בביולוגיה המולקולרית –‬
‫היכולת להכניס ‪ DNA‬לתוך תאים ולבחון למה אחראי ה‪DNA-‬‬
‫או לייצר בעזרתו חלבון מבוקש בעל ערך‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪94‬‬
‫מילון מונחים‬
‫•‬
‫זן הבר – החיידק במצב הכי טבעי שיש‪ ,‬נקודת ההתייחסות‪.‬‬
‫•‬
‫מוטנט – שונה מזן הבר בתכונה מסויימת‪.‬‬
‫•‬
‫זן – שני חיידקים שהם זן בר ומוטנט יכולים להיות מאותו המין אבל הן ‪ strain‬שונה‪.‬‬
‫•‬
‫פנוטיפ – מסומן בכתב ישר ולא מוטה‪ .‬הפנוטיפים בחיידקים כתובים באות ראשונה גדולה בשמו‬
‫המקוצר של הגן ולעיתים מצויין ‪ +‬או ‪ ,-‬המציין מוטציה או זן בר‪ .‬לרוב אם טורחים לציין פנוטיפ או‬
‫גנוטיפ הכוונה היא לתופעה חסרה בחיידק ולא לתופעות של זן הבר‪.‬‬
‫•‬
‫גנוטיפ – כל האותיות קטנות והאותיות נטויות‪ .‬אותם כללי )‪ (+‬ו‪ .(-)-‬אותיות בסוף שם הגן מציינים‬
‫גנים שונים באותו מסלול ביוסינטטי‪ .‬שימו לב להבדל בין מוטנטים אוקסוטרופים – שלא ייגדלו אם‬
‫לא יספקו להם את חומצת האמינו שאינם יכולים לסנטז – לעומת מוטנטים קטבוליים אשר לא‬
‫מסוגלים לנצל סוכר מסויים‪ ,‬אך כן ייגדלו אם יינתן להם סוכר אחר‪.‬‬
‫•‬
‫אללים – מספר המופיע ליד האות )למשל ‪ (trpA1‬מציין כי אלו אללים שונים למוטציות באותו הגן‬
‫)לעומת מוטציות בגנים שונים באותו מסלול ביוסינטטי‪ .‬בשני המקרים ניתן בעזרת ריקומבינציות‬
‫לקבל זן בר(‪.‬‬
‫בתמונה הבאה ניתן לראות דוגמה לכתיבה של זן מסויים בספרי הזנים במעבדה‪ .‬השם מעיד על מיהו‬
‫החיידק ומה הוא מסוגל לעשות‪ .‬סימני ∆ מעידים על מחיקה‪ ,‬כאשר הסוגריים מציינים באילו מקטעים‬
‫בגנום נמצא המחדר; גנים שלא עם דלתא הם גנים מוטנטים‪ .‬כמו כן ניתן לראות שיש פלסמיד ‪ F‬שעליו‬
‫נמצאים הגנים ‪ proA+B+‬ואופרון לקטוז עם מחיקה ספציפית‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪95‬‬
‫שיעור ‪ :14‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫חומרים מוטגנים אינם גורמים בעצמם למוטציה אלא לשינויים כימיים ב‪ .DNA-‬המוטציה נגרמת מכשל‬
‫בנסיונותיו של החיידק לתקן את השינויים האלה‪ ,‬בעיקר בשלב השיכפול‪ .‬הפולימראז העובר על ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬אינו מצליח לזהות את המוטגן )שאינו בסיס נוקליאוטיד( ולכן מחליף אותו בנוקליאוטיד אקראי‬
‫פחות או יותר‪ .‬מכיוון שבשלב הזה לרוב אין תבנית תקינה מול המוטציה‪ ,‬ההכנסה אינה תקינה והמוטציה‬
‫מתקבעת לדורות הבאים‪.‬‬
‫מוטגנים‬
‫ל‪DNA-‬‬
‫נכנסים‬
‫כמו‬
‫בסיסים רגילים אך אינם מזוהים‬
‫ככאלה;ישנם גם מוטגנים כימיים‬
‫שהינם‬
‫כימיים‬
‫חומרים‬
‫פעילים‬
‫התוקפים את הבסיסים או הטבעת‬
‫הסוכרית‬
‫וגורמים‬
‫למודיפיקציות‬
‫שמשנות את המבנה שלהם כך שלא‬
‫ניתן לזהותם‪.‬‬
‫יש לזכור שיש שני סוגי מוטציות‬
‫נקודתיות‬
‫בכל‬
‫הנוגע‬
‫להחלפות‬
‫בסיסים‪ :‬טרנזיציות וטרנסברסיות‪.‬‬
‫בהחלפות‪ ,‬מסגרת הקריאה נשמרת‬
‫אבל אם השינוי גורם לשינוי בחומצת‬
‫אמינו זו תהיה מוטציית ‪missense‬‬
‫ואם הקודון המקודד הפך לקודון‬
‫‪stop‬‬
‫המוטציה‬
‫תהיה‬
‫מוטציית‬
‫‪.nonsense‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪96‬‬
‫ישנם גם מוטגנים כימיים ופיזיקליים‬
‫שמסוגלים להיכנס לתוך ה‪.DNA-‬‬
‫אטידיום ברומיד משמש בתכונתו זו‬
‫לסימון ‪ ;DNA‬אקרידין גם כן נכנס‬
‫ל‪ DNA-‬ומפריע לשיכפול‪ ,‬כאשר‬
‫התוצר היא ‪micro-insertions and‬‬
‫‪ ,micro-deletions‬הפרעה של יותר‬
‫מבסיס אחד ברצף‪.‬‬
‫מוטגנזה מתקבלת גם על ידי קרינה‪,‬‬
‫כאשר זו נחלקת לשני סוגים‪:‬‬
‫•‬
‫קרינה מייננת – נמצאת בצד‬
‫הקצר‬
‫של‬
‫הספקטרום‪,‬‬
‫בה‬
‫נכללות קרני ה‪ X-‬והגמא‪ .‬זוהי‬
‫קרינה עוצמתית מבחינת הרמה‬
‫האנרגטית‪ .‬פגיעתה בתא גורמת‬
‫ליצירת‬
‫רדיקלים‬
‫חופשיים‬
‫פעילים כימית הפוגעים ב‪DNA-‬‬
‫וגורמים לשבירתו או לשינויים‬
‫כימיים בו‪.‬‬
‫•‬
‫קרינת ‪ – UV‬נמצאת בקצה‬
‫הרחוק של הספקטרום‪ ,‬פוגעת ב‪-‬‬
‫‪DNA‬‬
‫על‬
‫ידי‬
‫צילוב‬
‫פירימידינים‪ ,‬בעיקר זוגות ‪T‬‬
‫שנמצאים אחד ליד השני‪ .‬זוג ה‪ T-‬המצומדים מזוהה על ידי התא כנזק והנסיון לתקן אותו הוא‬
‫שלמעשה גורם למוטציה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪97‬‬
‫פנוטיפים מועילים‬
‫במחקר גנטי לא ממתינים להופעתו האקראית של פנוטיפ אלא מגבירים את הופעת המוטנטים בעזרת‬
‫מוטגנים‪ .‬המוטציות נוצרות במידה אקראית למחצה ויש להפעיל כלים מתאימים להסתכלות ולזיהוי‬
‫המוטנטים בכדי להתחיל להפעיל שיטות מיפוי למציאת מיקום וטיב המוטציה‪.‬‬
‫הכלים לתצפית בתחילת הביולוגיה המולקולרית היו מוגבלים והתחלקו לשנים‪:‬‬
‫•‬
‫יכולת‪/‬אי יכולת של חיידק לגדול על מצע‪.‬‬
‫•‬
‫אינדיקטורים המשנים את צבעם בהתרחשות‪ /‬אי התרחשות ריאקציה כימית‪.‬‬
‫כלים פשוטים אלו לא מאפשרים זיהוי מוטציה בכל מסלול שהוא‪ .‬אם ידוע שיש מחיקה בין שני גנים‪,‬‬
‫הכוללת את כל הגנים שביניהם‪ ,‬בהנחה שהפנוטיפ של הגנים אינו כה ברור‪ ,‬לא ניתן יהיה לאתר בצורה‬
‫מלאה מיהם הגנים שנמצאים בין שני הגנים שתוחמים את המחיקה‪ .‬מסיבה זו המפות בתקופה ההיא היו‬
‫בעלות כמות אינפורמציה נמוכה‪ ,‬שהלכה ועלתה בעיקר כאשר התחילו להשתמש בכלים מולקולריים‪.‬‬
‫הפנוטיפים השכיחים ביותר בהתחלה היו למסלולים ביוסינטטיים )=מוטנטים ביוסינטטיים(‪ ,‬כאשר‬
‫הפשוטים והמרכזיים היו המסלולים לביוסינטזה של טריפטופן‪ ,‬היסטידין ופרולין‪ .‬מוטנט למסלול‬
‫ביוסינטטי מכונה אוקסוטרופ )לעומת זן הבר שמכונה פרוטוטרופ ואינו זקוק לחומצות אמינו במצע(‪.‬‬
‫מוטנטים קטבולים ראשונים הוכרו במסלולי פירוק סוכרים‪ .‬מוטנטים אלו אינם מסוגלים לצמוח על מצע‬
‫סוכר שמסלול הפירוק פגום כאשר זהו מקור הפחמן היחיד; מהר מאוד השתמשו באינדיקטורים ולא‬
‫ביכולת גדילה‪ /‬אי גדילה על מצע‪.‬‬
‫מוטנטים נוספים הם מוטנטים מותנים – בעיקר בגנים חיוניים אשר מוטציה בהם היא ליתאלית‪ .‬למרות‬
‫שהכפילות הגדולה בגנים חיוניים‪ ,‬לא לכל גן יש גיבוי ולכן ניתן לחקור מוטנטים מותנים בגנים חיוניים‬
‫ליתאליים‪ ,‬אשר מגדלים בטמפרטורה מתירנית – המאפשרת קיום – וחוקרים אותם בטמפרטורה‬
‫המגבילה‪ ,‬שפוגעת בתוצר הגן‪.‬‬
‫חיידקים שהטמפרטורה המתירנית שלהם נמוכה מהטמפרוטורה המגבילה הם רגישים לחום לעומת מצב‬
‫הפוך בו הם רגישים לקור‪ .‬חיידקים הם פויקלותרמיים ולכן אינם מסוגלים לווסת את טמפרטורת התא‪.‬‬
‫רוב החיידקים )מזופילים( שידוע כיצד ניתן לתרבת אותם גדלים בין ‪ 20-42‬מעלות‪ ,‬כאשר יש גם‬
‫תרמופילים שגדלים בין ‪ 42-60‬מעלות ואקסתרמופילים שגדלים בטמפרטורות שמעל ‪ 60‬מעלות‪ .‬לרובם‬
‫כמובן יש טווח מצומצם בתוך הטווח הזה ובטמפרטורות אחרות קצב הגידול שלהם יהיה איטי יותר‪.‬‬
‫פנוטיפ נוסף הוא פנוטיפ של עמידות‪ ,‬כאשר העמידויות העיקריות המשמשות הן עמידות להדבקה בפאג'‬
‫ועמידות לאנטיביוטיקה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪98‬‬
‫סוגי מוטציות‬
‫•‬
‫אוקסוטרופ – פגוע במסלול ביוסינטטי של מולקולה חיונית כמו חומצת אמינו או נוקליאוטיד‪.‬‬
‫•‬
‫מוטנט קטבולי – מוטנט הפגוע במסלול קטבולי לשימוש בסוכר מסויים‪ .‬בשיטה זו נעשה שימוש‬
‫באינדיקטורים לראיית השינוי‪.‬‬
‫•‬
‫מוטציות תלויות‪-‬טמפרטורה – שינוי ביציבות התרמודינמית של החלבון מוציא אותו מכלל פעילות‬
‫בטמפרטורות המגבילות )ראו פרק הרחבה‪ :‬מוטציות מותנות(‪ .‬הגרף הבא מציג טווחי טמפטורות גידול‬
‫אופייניות אופטימליות של כל חיידק‪.‬‬
‫•‬
‫עמידות לתרופות – היכולת של חיידק לגדול בריכוזי תרופה שה‪ WT-‬לא יכולים לגדול בסביבתה‪.‬‬
‫המוטנטים מופיעים לאחר זריעה על צלחת עם התרופה‪ .‬אנטיביוטיקות משתייכות למספר משפחות‬
‫פונקציונליות המעכבות מסלולים ספציפיים בחיידק‪ .‬התרופות אמורות שלא לפגוע במאחסן‬
‫האאוקריוטי כיוון שהן פוגעות באלמנטים חיוניים וספציפיים לחיידקים – הדופן‪ ,‬מסלולי השיעתוק‬
‫והתרגום הפרוקריוטים וכדומה‪ .‬מסלולי העמידות )שהם תולדה של מוטציות( לרוב משנים את חלבון‬
‫המטרה של האנטיביוטיקה או את מערכת הטרנספורט של האנטיביוטיקה לתוך החיידק‪ .39‬עמידויות‬
‫אחרות הינן תוצאה של מנגנוני פירוק‪ /‬אינאקטיבציה‪ /‬אקספורט של האנטיביוטיקה מהתא החוצה על‬
‫ידי משאבות טבעיות‬
‫‪40‬‬
‫בחיידקים‪ .‬פעילות זו קשורה למנגנון המצוי בכרומוזום ומשופעל על ידי‬
‫האנטיביוטיקה‪ .‬פירוק אנטיביוטיקה מתבצע על ידי אנזימים כמו בטא‪-‬לקטמאז‪ .‬הגנים האלה לא‬
‫נוצרו במוטציה ואינם מצויים בכרומוזום כי אם על גבי פלסמידים המכילים קסטות של הגן שנרכשו‬
‫בהעברה לאטרלית‪.‬‬
‫•‬
‫עמידות לנגיפים – אי הידבקות בבקטריופאג' שתוקף ‪ .WT‬לרוב עקב איבוד רצפטור אליו הפאג'‬
‫נקשר בתחילת מנגנון ההדבקה‪ .‬פאג'ים עברו אבולוציה לזהות אלמנטים ממברנליים של החיידק‪,‬‬
‫‪ 39‬רוב האנטיביוטיקה לא נכנסות בדיפוזיה אלא במערכת טרנספורט‪.‬‬
‫‪ 40‬משאבות ‪ MDR = multiple drug resistance‬שנוצרו באבולוציה להוצאת טוקסינים שונים‪ ,‬הקיימות גם בחיידקים וגם‬
‫בתאים סרטניים ומקנות להם עמידות לכימותרפיה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪99‬‬
‫ולכן יש להם ספקטרום מאחסנים מאוד צר; מוטנטים מסוגלים לגדול על צלחת שרוססה בפאג'ים‪.‬‬
‫בתחילת תהליך ההדבקה הפאג' משתמש ברגליות – שהן נקודות העיגון של הפאג' – וקישורן למוטיב‬
‫ממברנלי של החיידק המשמש כרצפטור‪ .‬לאחר הקישור הרגליים עוברות שינוי קונפורמציה‬
‫המקרבות את הפאג' לממברנה ומאפשרת לו להזריק את הגנום לתוך החיידק‪ .‬שינוי של המולקולות‬
‫המזוהות על ידי הרגליים של הפאג' יביא לחוסר יכולת זיהוי החיידק על ידי הפאג'‪.‬‬
‫•‬
‫פנוטיפ נייחות – לחיידקים רבים יש שוטונים או ריסניות שמקנות להם יכולת תנועתיות; פגיעה בהן‬
‫גורמת לאובדן יכולת התנועה‪ ,‬והפנוטיפ ניכר במושבות צפופות יותר מאשר ‪.WT‬‬
‫•‬
‫איבוד פיגמנט – למושבות רבות יש צבע‪ ,‬פיגמנט שניתן גם כאשר לא זורעים אותן על גבי מצע עם‬
‫אינדיקטור‪ ,‬עקב ביטוי חלבונים קושרי מתכות – ברזל או מנגן‪ .‬פגיעה ביכולת אינקורפורמציית‬
‫החלבון לקומפלקס או בחלבון הקומפלקס עצמו תביא לאיבוד פנוטיפ הפיגמנט‪.‬‬
‫•‬
‫מושבות מחוספסות – עקב איבוד הפוליסכריד בממברנה החיצונית‪ ,‬המושבות פחות חלקות‬
‫ומבריקות‪.‬‬
‫•‬
‫מוטנטים ללא קפסולה – מוטנטים קרובים למושבות המחוספסים‪ ,‬מוטציה שפוגעת בקפסולה‬
‫העוטפת את החיידק אך לאו דווקא בסוכרים‪ .‬המושבות גדולות ומפורצות ולא חלקות‪ .‬קשה להבדיל‬
‫בין שני המוטנטים האלה רק מהסתכלות על המושבות‪.‬‬
‫הטבלה הבאה מציגה שלוש דוגמאות לעמידויות – עמידות לפאג'‪ ,‬לאנטיביוטיקה ולתהליך ההמרה של‬
‫כלוראט לכלוריט )=רעלן(‪ ,‬ולכן ה‪ WT-‬הוא הרגיש לכלוראט והמוטנט הפגוע במסלול ההמרה עמיד‪.‬‬
‫מוטציות של עמידות נדירות יותר ממוטציות מטאבוליות‪ ,‬משום שמוטציות מטאבוליות או קטבוליות‬
‫יכולות לקרות בכל אחד ממספר גנים האחראים לביוסינטזה או לפירוק של אותו חומר; פגיעה בכל אחד‬
‫מחמשת הגנים באופרון הטריפטופן יכולה להביא לפנוטיפ‪ .‬לעומת זאת מוטציה של עמידות צריכה‬
‫לקרות בחלבון מאוד מסויים ובאופן כזה שלא תיפגע בפעילות שלו – ולכן היא נדירה יותר‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪100‬‬
‫הרחבה‪ :‬מוטציות מותנות‬
‫חיידקים מכילים מערכות אנזימטיות המותאמות לטמפרטורות הגידול האופטימליות שלהם‪ .‬בטמפרטורות‬
‫גבוהות מדי החלבונים והאנזימים של החיידק עוברים דה‪-‬נטורציה‪ ,‬עקב היפרדות קשרים חלשים‬
‫המייצבים את המבנה השלישוני של החלבון או את נכונותו להישאר מסיס בתמיסה‪ .‬בחימום משקיעים‬
‫אנרגיה בתמיסה‪ ,‬האנרגיה חזקה מהאינטראקציות של החלבון והוא עובר דה‪-‬נטורציה ולרוב גם שוקע –‬
‫משום שהדה‪-‬נטורציה גורמת לחשיפה של חומצות אמינו הידרופוביות הבאות במגע עם מולקולות‬
‫הידרופוביות שכנות‪ .‬חלבונים מסויימים מסוגלים לעבור רה‪-‬נטורציה אם מרחיקים את הגורם הדה‪-‬‬
‫נטורטיבי‪ ,‬אך על פי רוב הדה‪-‬נטורציה אינה הפיכה – חשיפה של חלבון לתנאים קשים גורמת לאובדן‬
‫פעילות‪.‬‬
‫עובדה זו רלוונטית למוטנטים מכיוון שהם רגישים לטמפרטורה‪ .‬המוטציה פוגעת בחומצת אמינו‬
‫האחראית לאינטראקציה מייצבת של החלבון; אם השינוי גרם לחלבון להיות פחות יציב‪ ,‬בטמפרטורת‬
‫גבוהות – גם אם לא מחוץ לטווח הגידול של ‪ – WT‬החלבון יעבור דה‪-‬נטורציה‪.‬‬
‫זה המצב בחימום; בקירור הבעיה היא קשיחות – חלבונים פוקנציונאלים רבים דורשים מידה מסויימת‬
‫של גמישות על מנת לתפקד‪ .‬דוגמה למנגנון כזה היא ‪ – induced fit‬התאמה מושרית‪ ,‬המדברת על‬
‫שינויי קונפורמציה של החלבון העוזרים לו להינעל על הסובסטרט‪ .‬ברגע שמוטציה בחלבון יוצרת‬
‫אינטראקציה מייצבת נוספת וגורמת ליציבות יתר‪ ,‬המוטציה נועלת את החלבון בקונפורמציה קשיחה יותר‬
‫ובקירור הקשיחות הזו תתבטא עד לאובדן פעילות‪.‬‬
‫סלקציה של מוטנטים‬
‫גם עם במוטגנים קשה למצוא מוטנטים ולראות אותם על צלחות‪ .‬לכן ניתן להשתמש בהעשרות‪ ,‬הנעשות‬
‫על פי רוב במצע נוזלי )לעומת סלקציה שנעשית במצע מוצק(‪.‬‬
‫הסלקציה היא הפעלה של לחץ סלקטיבי שמאפשר רק לחיידקים המבוקשים לצמוח‪ .‬כך‪ ,‬גם אם החיידקים‬
‫המוטנטים נדירים מאוד‪ ,‬ניתן יהיה למצוא אותם בקלות‪ .‬כאשר מחפשים מוטנט ‪,gain of function‬‬
‫שרכש יכולת שאינה קיימת ב‪ ,WT-‬ניתן לזרוע את החיידקים על צלחת המכילה את הגורם הסלקטיבי‬
‫שהחיידקים אמורים היו לרכוש לו עמידות‪ .‬זוהי סלקציה חיובית‪.‬‬
‫מוטציות של ‪ loss of function‬קשות יותר לאיתור‪ ,‬כי כעת מבקשים לחפש חוסר יכולת ולא רכישת‬
‫יכולת‪ .‬קשה לראות העדר צמיחה על רקע צמיחה של ‪ WT‬ולכן עושים סלקציה שלילית על ידי ‪replica‬‬
‫‪ ,plating‬בה משווים בין יכולות הגידול על רקעים שונים‪.‬‬
‫מוטנטים נוספים שאפילו ‪ replica plating‬לא מאפשרת לראות ניתן לזהות על ידי ‪counter selection‬‬
‫– במצבים שבהם המוטנטים יכולים לשרוד )לא לגדול( וה‪ WT-‬מתים בגלל שהם גדלים‪ .‬לרוב‬
‫משתמשים בפניצילים או ‪ .BUdR‬פניצילין פוגע בסינטזה של דופן‪ ,‬ולכן פוגע בחיידקים מתחלקים‪.‬‬
‫חיידקים שלא גדלים לא מייצרים דופן ולכן אינם רגישים לפניצילין‪ .‬שיטה זו מעשירה את החיידקים‬
‫המוטנטים על חשבון ה‪.WT-‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪101‬‬
‫השיטה היא כלי העשרה הנעשה במצע נוזלי‪ .‬אוכלוסיית החיידקים מועברת למצע נוזלי ללא טריפטופן;‬
‫רוב האוכלוסייה של ‪ WT‬גדלה היטב‪ ,‬כי הם פרוטוטרופים; האוקסוטרופים לא מתים אך גידולם מעוכב‪.‬‬
‫לאחר כשעה מכניסים פניצילין למצע‪ .‬הפניצילין הורג את ‪ WT‬הגדלים והמוטנטים‪ ,‬שאינם גדלים‪,‬‬
‫שורדים‪ .‬לאחר שעה נוספת בנוכחות פניצילין מרחיקים את הפניצילין בשטיפות וזורעים את החיידקים על‬
‫צלחת עם טריפטופן; כעת שכיחות המוטנטים באוכלוסיה גדולה יותר וייקל לראות אותם בשיטת‬
‫‪.replica plating‬‬
‫משמאל‪ :‬מוטנטים פוגעים במסלול הטריפטופן לא‬
‫גדלים על מצע מינימלי; אם מוסיפים לחיידקים‬
‫‪ DNA‬מחיידקי ‪ Trp+‬יתקבלו ריקומביננטים ‪Trp+‬‬
‫בטרנספורמציה‪.41‬‬
‫משמאל‪ :‬תהליך ה‪ .replica plating-‬בתהליך זה‬
‫מחפשים מוטנטים של אובדן פונקציה‪ ,‬לעומת‬
‫מוטנטים שרכשו פונקציה חדשה‪ .‬התהליך יוצא‬
‫מצלחת מצע עשיר‪ ,‬בה גדלים ‪ WT‬ומוטנטים‪.‬‬
‫לוחצים את הצלחת לבד קטיפה‬
‫סטרילי‪ ,‬לוחצים על הקטיפה לצלחת‬
‫מצע עני ולאחר מכן לצלחת מצע‬
‫עשיר‪ .‬על המצע העשיר ייגדלו כל‬
‫המושבות; על המצע העני ייגדלו רק‬
‫‪ .WT‬כך ניתן לברר אילו מושבות‬
‫חסרות במצע העני ולבודד אותן‬
‫מתוך הצלחת עם המצע העשיר‪.‬‬
‫‪ 41‬בחיידקי ‪ E.coli‬לא ניתן יהיה לקבל חיידקים אלו באופן טבעי‪ ,‬מכיוון שמעבר הטרנספורמציה נעשה בחיידקים קומפטנטים‬
‫בלבד ומצב הקומפטנטיות לא קיים ב‪ E.coli-‬באופן טבעי‪ .‬וחיידקי ‪ E.coli‬בטבע לא מקבלים ‪ DNA‬בטרנספורמציות‪ .‬עם זאת‬
‫במעבדה ניתן ליצור ‪E.coli‬טרנספורמנטים באופן מלאכותי‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪102‬‬
‫כלי זה מאפשר עבודה עם מושבות ברורות ומבודדות על צלחת;‬
‫אולם מוטנטים נדירים מאוד ולכן במקרים רבים‪ ,‬לא ניתן יהיה‬
‫לראות את המוטנטים במדגם קטן‪ .‬ניתן להשתמש ב‪counter -‬‬
‫‪ selection‬על מנת להעשיר את שכיחות המוטנטים‪.‬‬
‫הכניסה של ה‪ DNA-‬נעשית בריקומבינציה חלקית‪ .‬שתי חתיכות‬
‫‪ – DNA‬כרומוזומלי וחיצוני – עוברות ריקומבינציה על מנת‬
‫להכניס ‪ DNA‬חיצוני לגנום החיידקי ולעגן את המוטציה כך‬
‫שניתן יהיה לראות אותה גם בצאצאים‪.‬‬
‫סוגי מוטציות‬
‫ניתן להסביר בכמה דברים מוטנט שחוזר לפנוטיפ ‪:WT‬‬
‫•‬
‫רברסיה – המוטנט קיבל מוטציה שנייה בדיוק בנקודת‬
‫המוטציה המקורית‪ ,‬כך שהוא חוזר לרצף של ‪ .WT‬הסיכוי‬
‫לכך הוא נמוך עד אפסי‪ .‬זהו המקרה היחיד של רברטנט‬
‫אמיתי‪ ,‬שחזר גנוטיפית – ולא רק פנוטיפית – למצב ‪.WT‬‬
‫•‬
‫סופרסיה – רכישה של פנוטיפ ‪ WT‬עקב מוטציה שנייה שאינה רברסיה‪ .‬ישנם כמה סוגי סופרסיות‪:‬‬
‫•‬
‫מוטציות שינוי מסגרת קריאה – כניסת בסיס לגן שינתה את מסגרת הקריאה של הגן‪ .‬מוטציה‬
‫שנייה באותו הגן שתוציא בסיס באיזור קרוב תביא לשחזור מסגרת הקריאה‪ .‬אם המוטציות‬
‫שבתווך בין שני האירועים הן מוטציות שקטות )למשל החלפת קודון בקודון אחר של אותה‬
‫חומצת אמינו או החלפת חומצת אמינו באופן שאינו פוגע בפונקציה( תתקבל סופרסיה של‬
‫הפנוטיפ‪.‬‬
‫•‬
‫סופרסורים של ‪ – Nonsense‬מולקולות ‪ tRNA‬מוטנטים הקוראים קודוני סטופ ומכניסים‬
‫חומצת אמינו כלשהי‪ .‬אם המוטציה יצרה קודון סטופ שגרמה לקיצור החלבון‪ ,‬ה‪tRNA-‬‬
‫הסופרסורי יימנע מהסינטזה להיפסק‪ .‬השכיחות של ‪ tRNA‬סופרסורי נמוכה מאוד ורובם‬
‫עובדים על קודון סטופ ‪ UAG‬הנדיר ברוב הגנים התקינים‪ .‬כמו כן‪ ,‬גם אם הסופרסור ימשיך‬
‫חלבון תקין ליצירת חלבון לא תקין‪ ,‬מערכות הבקרה של החיידק ייפטרו מהחלבון‪ .‬לעומת זאת‬
‫התיקון שהסופרסור עושה למוטנט‪ ,‬גם בכמויות חלבון נמוכות‪ ,‬יכול להספיק ליצירת פנוטיפ‬
‫סופרסורי‪.‬‬
‫•‬
‫סופרסיה אינטרגנית – מוטציה בגן שונה לחלוטין המבטלת את הפנוטיפ המוטנטי‪) .‬שקופית ‪,52‬‬
‫מצגת ‪ (1‬מוטנט קטבולי באופרון הגלקטוז בגן ‪ GalE‬לא רק שאינו יכול לגדול על גלקטוז אלא‬
‫הוא מורעל עקב הצטברות הסובסטרט הטוקסי לחיידק‪ .‬מוטציה ב‪ ,GalK-‬שמקודד לגן הראשון‬
‫במסלול‪ ,‬תמנע את הרעילות של ‪ GalE‬כי לא נוצר הסובסטרט שלו‪ .‬מכאן שעבור הפנוטיפ של‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :14‬מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך‬
‫‪103‬‬
‫רעילות גלקטוז למוטנטים ב‪ ,GalE-‬המוטציה ב‪ GalK-‬הינה סופרסורית; שימו לב‬
‫שהמוטציה אינה סופרסורית ליכולת הגדילה על גלקטוז‪.‬‬
‫אתרי ציס ומולקולות טרנס‬
‫חיידקים ופאג'ים הם הפלואידים ומכילים עותק יחיד מכל גן; יחד עם זאת‪ ,‬ניתן ליצור מצבים דיפלואידים‬
‫יציבים בתוך חיידקים על ידי קוניוגציה‪ ,‬מעבר פלסמידים‪ ,‬בה נוצרים מצבים דיפלואידים יציבים אם‬
‫הפלסמיד הנכנס מביא איתו חתיכה מגנום של חיידק דומה‪.‬‬
‫במצבים אלו של דיפלואידיות יציבה ניתן לחקור גנטיקה של דיפלואידים אמיתיים – כמו אאוקריוטיים‪.‬‬
‫ניתן לחקור קומפלמנטציה ציס )שתי המוטציות נמצאות על אותו גדיל ‪ DNA‬ומוטציה אחת לא עוברת‬
‫קומפלמנטציה על ידי גן בגדיל אחר( או טראנס )מוטציה שפוגעת בייצור חלבון והעותק התקין על‬
‫המולקולה השנייה מסוגל לתקן את החלבון ולשחזר את הפנוטיפ(‪.‬‬
‫למטה‪ :‬דוגמה לניסויים שנעשו בדומה לניסויים של ז'קו ומונו שחקרו את אופרון הלקטוז‪.‬‬
‫החיידק מכיל פלסמיד ’‪ F‬קוניוגטיבי שהביא חתיכת גנום הנושאת את אופרון הלקטוז‪ .‬זהו מרודיפלואיד‬
‫)דיפלואיד למחצה( והוא יכול להיות בעל אחד משני פנוטיפים‪:‬‬
‫•‬
‫המוטציה שעל הפלסמיד היא באותו הגן של המוטציה של החיידק‪ ,‬ולכן הגן עדיין פגום בשני‬
‫העותקים ולא מתקבל פנוטיפ‪.‬‬
‫•‬
‫המוטציות בגנים שונים‪ ,‬כל אחד מקודד לגן תקין במוטציה של השני ולכן מתקבלת קומפלמנטציה‪.‬‬
‫למטה‪ :‬מוטציות בגנים ‪ Z‬ו‪ Y-‬בגנום ומוטציה בפרומוטור של האפיזום )הפלסמיד(‪ .‬במצב זה‪ ,‬למרות שיש‬
‫קומפלמטציה‪ ,‬לא יהיה פנוטיפ תקין משום שלא ניתן לשעתק את האופרון שעל האפיזום‪ .‬מוטציה כזו היא‬
‫ציס‪ ,‬ומאפיינת לרוב אלמנטים רגולטורים‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪104‬‬
‫למטה‪ :‬מצב דומה שבו דווקא הרפרסור שעל האפיזום אינו תקין‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬הרפרסור פועל בטראנס‬
‫ולכן הרפרסור האנדוגני יכול לפעול גם על האופרון של האפיזום‪ .‬יש להבחין בין מצבים קונסטיטוטיבים‬
‫– בהם יש ביטוי קבוע ללא בקרה – ומצבים מבוקרים‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :15‬תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה‬
‫‪105‬‬
‫שיעור ‪ :15‬תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה‬
‫חיידקים מתרבים ברבייה א‪-‬מינית ומתחלקים‬
‫בחלוקה שיוויונית יחסית‪ .‬החיידק גדל ומשכפל את‬
‫החומר הגנטי וכאשר הוא חש כי התנאים מתאימים‪,‬‬
‫הוא עובר "‪) "Septum Formation‬הנחת מחיצה(‬
‫כאשר שני עותקי ה‪ DNA-‬נמצאים בקו המחיצה‪.‬‬
‫תהליך נוסף גורם לכרומוזומים לנדוד לקטבים ואז‬
‫המחיצה מושלמת ליצירת שני חיידקים‪ .‬המחיצה‬
‫בנויה ממברנה ודופן‪.‬‬
‫דרך למדידת התרבות החיידקים נעשית על ידי‬
‫מדידת העכירות – )‪– Optical Density (OD‬‬
‫המודדת העכירות כפונקציה של צפיפות החיידקים‬
‫)חיים ומתים( בתמיסה‪.‬‬
‫למטה‪ :‬בגרף ניתן לראות שתי עקומות – הירוקה הינה מדידת עכירות והאדומה הינה ספירה חיה‪.‬‬
‫ניתן לראות שתחילה יש זמן השתהות – החיידקים המועברים למצע טרי צריכים להתרגל למצע לפני‬
‫שהם מתחילים להתחלק ולכן אין גידול ניכר במספר החיידקים‪ .‬העלייה בספירה החיה ניכרת לפני העלייה‬
‫בעכירות כי זוהי שיטה יותר רגישה )הגרף מוצג באופן שגוי(‪.‬‬
‫לאחר תקופת ההשהייה מתחיל גידול אקפוננציאלי‪ ,‬כאשר בכל‬
‫זמן דור כמות החיידקים בתרבית מוכפלת‪ .‬על גרף בסקלה‬
‫לוגריתמית ניתן לראות גרף ישר שמאפשר גם חישוב זמן הדור‬
‫של החיידקים‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫‪106‬‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫לאחר מספר שעות החיידקים גדלו מאוד‪ ,‬צרכו את הנוטריינטים או את רוב החמצן‪ ,‬והתנאים כבר לא‬
‫מאפשרים גידול אקפוננציאלי‪ .‬אפילו עצם הצפיפות של החיידקים – כמות גדולה בנפח מוגבל – גורמת‬
‫להם לשלוח אותות מסוג ‪ quorum sensing‬האומרים להאט את הגידול עד לעצירתו‪ .‬מסיבה זו‬
‫מתחילה התייצבות במספר החיידקים – בספירה החיה כמו גם בעכירות‪ .‬זהו מצב סטציונרי בו אין תמותה‬
‫ואין גידול‪.‬‬
‫בשלב האחרון מתחילה התמותה – חיידקים שלא מסוגלים לספורולציה יתחילו בסופו של דבר‪ ,‬לאחר‬
‫מצב סטציונרי ממושך‪ ,‬למות‪ .‬בספירה החיה המוות ניכר יותר מאשר בעכירות מכיוון שספירה חיה‬
‫מדווחת מספר חיידקים חיים – רק אלו ייתנו מושבות‪ .‬העכירות יורדת לאט יותר כי גוויות של חיידקים‬
‫מפזרות אור באותה מידה כמעט כמו חיידקים חיים‪ .‬בהמשך חיידקים מתים מתחילים לעבור ליזיס ולכן‬
‫תתחיל גם ירידה בעכירות‪.‬‬
‫בטבע החיידקים לרוב נמצאים במצב של מחסור בנוטריינטים ולכן הם נמצאים במצבי גידול איטיים או‬
‫סטציונרים‪ .‬אוכלוסיות מתרסקות ועולות בחוזקה כל הזמן‪ ,‬בהתאם לשינויים פתאומיים בתנאים‪ .‬בסקלה‬
‫לוגריתמית ניתן לתאר את הגידול האקפוננציאלי על קו לינארי ומתוכו לחשב את זמן הדור – לפי הזמן‬
‫שחלף בין שתי נקודות שערך האחת כפול מהשנייה‪.‬‬
‫דורות לעומת מחזורי חלוקה‬
‫משמאל‪ :‬תרבית שמקורה בתא אחד‬
‫שעברה ‪ 4‬מחזורי חלוקה‪ .‬מספר‬
‫התאים הוא ‪ ,2n‬כאשר ‪ n‬הוא מספר‬
‫מחזורי החלוקה‪ .‬לאחר שידוע מספר‬
‫התאים הסופי‪ ,‬מספר הדורות שווה‬
‫‪ ,N2-N1‬כאשר ‪ N2‬הוא מספר התאים‬
‫הסופי ו‪ N1-‬הוא מספר התאים‬
‫ההתחלתי‪.‬‬
‫מוטציה יכולה להתרחש בכל נקודת‬
‫זמן לאורך תהליך הניסוי‪ .‬ככל שהיא‬
‫תתרחש מוקדם יותר יופיעו יותר מוטנטים בתרבית‬
‫הסופית‪ .‬יכולים להיות מצבים בהם מתרחשות יותר‬
‫מוטציות במהלך הניסוי אך מתקבלים פחות‬
‫מוטנטים; כאשר כבר במחזור החלוקה הראשון‬
‫נוצרה מוטציה ולכן לאחר ‪ 4‬מחזורי חלוקה‬
‫מתקבלים ‪ 50%‬מוטנטים בתרבית‪ .‬לעומת זאת‪,‬‬
‫אפשרי גם שיתרחשו שתי מוטציות לאורך חייה של התרבית – פעם אחת במחזור החלוקה השני ופעם‬
‫שנייה במחזור החלוקה השלישי‪ .‬כתוצאה מתקבלים רק ‪ 37.5%‬מוטנטים‪ .‬מכאן שתדירות מוטציה אינה‬
‫ניתנת להקשה מתוך שכיחות המוטנטים הסופית וידיעת שכיחות אירוע המוטציה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :15‬תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה‬
‫‪107‬‬
‫תורשה לפי שנות ה‪40-‬‬
‫המודל הניאו‪-‬דרוויניסטי טען שמוטציות מתרחשות באופן אקראי‪ ,‬כאשר מוטציות שמקנות יתרון‬
‫מקובעות באוכלוסיה ומשתלטות עליה‪ .‬הגישה הלמארקית טענה שהמוטציה היא תכונה ה"מאומצת"‬
‫במהלך חייו של האורגניזם על ידי הסתגלות לסביבה בתהליך של שינוי ישיר עקב לחצי הסביבה‪.‬‬
‫האם יש תורשה למארקית בחיידקים?‬
‫בניסוי הנתון הדגירו חיידקי ‪ WT‬על‬
‫צלחת שמכילה אנטיביוטיקה מסוג‬
‫סטרפטומיצין‪ .42‬לעומת זאת‪ ,‬אם‬
‫מוסיפים לתרבית זהה של חיידקים‬
‫סטרפטומיצין‪ ,‬לוקחים דגימה מתוך‬
‫התרבית הנוזלית וזורעים על צלחת‬
‫עם‬
‫סטרפטומיצין‬
‫–‬
‫מתקבלות‬
‫מושבות עמידות לסטרפטומיצין‪.‬‬
‫כיצד ניתן להסביר תופעה זו? הוספת‬
‫הסטרפטומיצין לתרבית עצמה יצרה‬
‫לחץ סלקטיבי שלכאורה גרם להופעת המוטציות כבר בתרבית‪ ,‬המאפשרות לחיידק להתמודד עם הלחץ‬
‫הסלקטיבי‪ .‬זוהי לכאורה תורשה למארקית; אולם אנו יודעים שתורשה למארקית אינה מתרחשת במרבית‬
‫המקרים‪ .‬אז מהו כן ההסבר?‬
‫הכנסת לחץ סלקטיבי למצע נוזלי הינה‪ ,‬למעשה‪ ,‬תהליך העשרה‪ .‬השכיחות למוטציה של עמידות‬
‫לסטרפטומיצין היא ‪ 1x1010‬ולכן ב‪ 100-‬מ"ל יש כ‪ 100-‬חיידקים עמידים‪ .‬אולם לא זורעים את כל ‪100‬‬
‫המ"ל בצלחת‪ ,‬אלא דגימה של ‪ 100‬מיקרוליטר; מכאן שהסיכוי להרים מוטנט יחיד הוא אפסי‪ .‬לעומת זאת‬
‫כאשר מוסיפים סטרפטומיצין לתרבית‪ ,‬מבצעים במוטנטים המעטים הקיימים העשרה ולכן הדגימה הקטנה‬
‫מושכת הרבה יותר חיידקים עמידים‪.‬‬
‫האם התורשה בחיידקים היא דרוויניסטית?‬
‫כדי לבחון מהו המודל הנכון – הדרוויניסטי או הלמארקי – נערכו שלושה ניסויים מפורסמים‪ :‬ניוקומב‪,‬‬
‫לוריה ודלברוק ולדרברג‪.‬‬
‫‪ 42‬אנטיביוטיקה שהעמידות לה ניתנת על ידי מוטציה בריבוזום ופחות על ידי העברה לאטרלית‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪108‬‬
‫ניוקומב ולוריה ודלברוק )עמידות לפאג' ‪(T1‬‬
‫בהדגרה של פאג'ים על מצע של ‪ E.coli WT‬מתקבל ליזיס‪ .‬אם ה‪ E.coli-‬מוטנט ועמיד לפאג'ים‪,‬‬
‫החיידקים שורדים ולא עוברים ליזיס – לא מתקבלים פלאקים‪ .‬על הטכנולוגיה הזו מבוססים שני הניסויים‬
‫הבאים‪:‬‬
‫הניסוי של ניוקומב‬
‫קבוצתו של ניוקומב לקחה שש‬
‫צלחות פטרי וזרעה בזמן ‪ 0‬מספר‬
‫מדוד וזהה של חיידקים בכל צלחת‪.‬‬
‫לאחר ‪ 5‬או ‪ 6‬שעות ריססו את‬
‫הצלחות בתמיסה שהכילה פאג'ים‪.‬‬
‫החוקרים ריססו הרבה פאג'ים ולכן‬
‫אם כל החיידקים יהיו ‪ WT‬לא יהיו‬
‫כל מושבות; אם יהיו חיידקים עמידים‬
‫יופיעו מושבות של חיידקים עמידים‪.‬‬
‫מהלך הניסוי ותוצאות‬
‫כל זוג צלחות רוססו לאחר ‪ 5‬שעות ו‪-‬‬
‫‪ 6‬שעות – שעה מאוחר יותר‪ .‬לאחר הריסוס ספרו את החיידקים העמידים – דהיינו מספר המושבות‬
‫בצלחות‪ .‬בצלחות שרוססו בפאג'ים לאחר ‪ 5‬שעות‪ ,‬הופיעו ‪ 8‬מושבות; בצלחת שרוססה שעה מאוחר יותר‬
‫הופיעו ‪ 49‬מושבות‪.‬‬
‫בזוג אחר של צלחות הוסיפו טיפול‪ :‬מעט לפני הריסוס מרחו את הצלחת כך ששינו את מיקום החיידקים‬
‫על פני הצלחת‪ .‬הפיזור מחדש גרם לכך שכל חיידק שהתחיל את הניסוי יצר מושבה קטנה – כך‬
‫שהמושבות פוזרו‪ .‬בצורה זו התקבלו ‪ 13‬מושבות בצלחת שרוססה לאחר ‪ 5‬שעות ולמעלה מ‪3000-‬‬
‫מושבות עמידות בצלחת שרוססה שעה לאחר מכן‪.‬‬
‫כמו כן זוג צלחות שלא רוססו בכלל היוו ביקורת לכלל גודל האוכלוסיה‪.‬‬
‫דיון‬
‫לפי הפתרון הלמארקי‪ ,‬המוטציה מתחילה להתרחש רק לאחר החשיפה לגורם הסלקציה‪ .‬מכאן שהיה‬
‫צריך להיות אותו מספר מוטנטים בשני הניסויים – לאחר ‪ 5‬או ‪ 6‬שעות‪ .‬המודל הדרוויניסטי לעומת זאת‬
‫מסביר מדוע התקבלו יותר מושבות לאחר ‪ 6‬שעות – משום שהחיידקים המוטנטים שהופיעו ספונטנית‬
‫התחלקו יותר זמן‪ ,‬התרבו באוכלוסיה ויצרו יותר מושבות בריסוס המאוחר יותר‪.‬‬
‫ההפרשים הגדולים יותר בניסוי המריחה נובעים מכך שהחיידקים העמידים המוטנטים‪ ,‬אשר לפי המודל‬
‫של דארווין היו קיימים עוד בטרם הזריעה‪ ,‬יצרו מושבה קטנה של כמה יחידות מוטנטים‪ .‬כאשר מורחים‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :15‬תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה‬
‫‪109‬‬
‫את החיידקים‪ ,‬כל חיידק ממושבה עמידה נוחת בנקודה אחרת ויוצר מושבה משלו; מסיבה זו מתקבלות‬
‫הרבה יותר מושבות‪ .‬עובדה זו מחזקת את הטענה שהמוטנטים היו קיימים מראש – ולא נוצרו רק עם‬
‫החשיפה ללחץ הסלקציה‪.‬‬
‫כאשר הישוו את מספר המוטנטים בצלחות הלא מפוזרות הצליחו לחשב את שכיחות המוטציה לעמידות –‬
‫והגיעו לכך שהיא בסביבות ‪.1.6-1.75x10-8‬‬
‫מהלך הניסוי של לוריה ודלברוק ותוצאותיו‬
‫לוריה ודלברוק לקחו תרבית נוזלית שגדלה ללא‬
‫לחץ סלקטיבי; מספר דגימות נלקחו מהתרבית‬
‫ונזרעו בצלחות שונות‪ ,‬שרוססו לאחר מספר שעות‬
‫בפאג'‪ .‬לאחר הדגרה ספרו את מספר המושבות‬
‫שהתקבלו‪ .‬בכל צלחת התקבל מספר דומה של‬
‫מושבות‪.‬‬
‫בוריאציה שנייה לקחו נפחים קטנים מהתרבית לתוך‬
‫מבחנות‪ ,‬גידלו כל מבחנה בנפרד‪ ,‬ואז מכל מבחנה‬
‫זרעו בצלחת‪ ,‬ריססו בפאג' וגידלו למשך כמה‬
‫שעות‪ .‬במקרה זה התקבלה שונות הרבה יותר גדולה‬
‫בין מספרי המושבות‪.‬‬
‫הטבלה מציגה את התוצאות המספריות מצלחות‬
‫הניסוי הראשון והשני בנפרד‪ .‬ניתן לראות בניסוי‬
‫השני שונות מאוד גדולה בין המושבות – ברבות‬
‫מהצלחות לא התקבלו כלל מושבות בעוד שבאחת‬
‫הצלחות היו ‪ 107‬מושבות‪.‬‬
‫דיון‬
‫לפי המודל הלמארקי‪ ,‬המוטציות‬
‫מתחילות רק לאחר הפעלת הלחץ‬
‫הסלקטיבי‪ .‬יש לציין כי אותו מספר‬
‫חיידקים נזרע בכל פלטה‪ .‬מכאן‪,‬‬
‫שבהתאם לשכיחות אירוע המוטציה‬
‫תהיה שכיחות זהה של מושבות בכל‬
‫צלחת‪ .‬העובדה שזה לא קורה כאשר הניסוי נעשה בצורתו השניה אומרת שזה כנראה לא המודל‬
‫שמתרחש בפועל‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪110‬‬
‫התוצאות ניתנות להסבר על ידי המודל הדרוויניסטי‪ :‬בתרבית הגדולה יש מספר נתון של חיידקים‬
‫ומוטציות מתרחשות כל הזמן בקצב אחיד‪ .‬בנקודת הזמן שבה דוגמים ושמים בצלחות‪ ,‬היות וזוהי תרבית‬
‫אחת‪ ,‬ההתפלגות תהיה אחידה‪.‬‬
‫לעומת זאת‪ ,‬כאשר דוגמים בתחילת הניסוי – כשמספר החיידקים יחסית קטן – ומגדלים במבחנות‪ ,‬לא‬
‫מגיעים למיצוע של מספר החיידקים‪ .‬אירועים מוטציונים שמתרחשים במבחנה אחת מוקדם יותר‬
‫מבאחרת משפיעים בצורה יותר דראסטית על התוצאות של המבחנה‪.‬‬
‫גם למארק וגם דארווין מסכימים שאירועי מוטציה מתפלגים בצורה פואסונית; יחד עם זאת הם חלוקים‬
‫בנוגע להתפלגות מספר המושבות המתקבלות‪ .‬לצורך חישוב אירועי המוטציה ניתן למנות את התרביות‬
‫בהן היו ‪ 0‬אירועי מוטציות – כלומר צלחות שבהן היו ‪ 0‬מושבות‪ .‬החישוב מבוצע לפי התפלגות פואסונית‬
‫ומאפשר לחשב את שכיחות אירוע המוטציה‪ .‬קצב התרחשות המוטציות מאפשר לתת אומדן לניסוי של‬
‫ניוקומב‪ ,‬ולראות שהחישובים אומנם חרגו בסדר גודל – אך האומדן עדיין קרוב מספיק‪.‬‬
‫שימו לב שבניסויים אלו לא נעשה כל לחץ מוטגני‪ ,‬והמוטציות הנדירות המתרחשות אחת לביליון חלוקות‬
‫תאים הופיעו במספרים נמוכים; למרות זאת הן יכלו להניב גם צלחות המכילות למעלה מ‪ 100-‬מושבות‪,‬‬
‫כלומר החלוקה כנראה אינה למארקית‪.‬‬
‫לדרברג )עמידות לאנטיביוטיקה(‬
‫בניסוי זה‪ ,‬לדרברג זרע מרבד של‬
‫מיליוני חיידקים על צלחת אגר ללא‬
‫לחץ סלקטיבי‪ .‬מתוך הצלחת הוא‬
‫עשה ‪ replica‬לצלחות עם פניצילין‬
‫וסימן על גבי הצלחות איפה מופיעות‬
‫המושבות העמידות‪ .‬לאחר מכן הוא‬
‫חזר לפלטות המקוריות וחילץ את‬
‫החיידקים מאותם איזורים‪.‬‬
‫את החיידקים האלה הוא זרע שוב‬
‫בצלחת ללא אנטיביוטיקה‪ ,‬עשה‬
‫‪ replica‬לצלחות עם אנטיביוטיקה‪,‬‬
‫וגילה שוב איזורים עם מושבות‪ .‬ככל שחזר על כך שוב ושוב‪ ,‬הופיעו יותר מושבות של חיידקים עמידים‬
‫עד שבסופו של דבר כל האוכלוסיה הייתה עמידה‪ .‬התקבלה תרבית טהורה של חיידקים עמידים‬
‫לאנטיביוטיקה בלי שנחשפו מעולם ללחץ סלקטיבי של אנטיביוטיקה‪ .‬מכאן שאין זו תורשה מוכוונת‪.‬‬
‫ניסוי זה היה ההדגמה הפשוטה והאלגנטית ביותר לכך שאפשר לקבל מוטנטים גם בלי לחשוף אותם‬
‫מראש ללחץ הסלקטיבי‪ ,‬כפי שטוען המודל הלמארקי‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :15‬תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה‬
‫‪111‬‬
‫השלכות מעשיות‬
‫מעבר לכך שהמודלים איפשרו התלבטויות וקבלת החלטה בנוגע למודל הנכון )כנראה(‪ ,‬ניתן לראות גם‬
‫שאוכלוסיית חיידקים אינה זהה גנטית לחלוטין לחיידק המקורי שיצר את המושבה‪ :‬מוטציות‬
‫מתרחשות כל הזמן בקצב נמוך ולכן הזהות הגנטית של מושבה לחיידק המקור אינה דבר ברור מאליו או‬
‫מחייב‪ .‬עם כל חלוקה מתקבלים חיידקים ששונים גנטית מהחיידקים איתם החל הניסוי‪.‬‬
‫אם עושים ניסוים גנטיים ב‪ ,E.coli-‬כותבים את הגנים שלו ורוצים לוודא שזה אכן הגנום‪ ,‬צריך לשמור‬
‫סטוקים של חיידקים בצורת ‪ ,non-dividing cultures‬זנים המוקפאים בהקפאה עמוקה כדי שלא ייתחלקו‪.‬‬
‫ניסויים נערכים בזן שעבר מספר מוגבל של חלוקות על מנת להקטין את הסיכון שחיידקי הניסוי יישתנו‬
‫באופן רציף ממחזור למחזור‪.‬‬
‫פלסמידים‬
‫פלסמידים הם רפליקונים חוץ‪-‬כרומוזומלים הממלאים תפקיד משמעותי בהסתגלות ואבולוציה חיידקית‪.‬‬
‫הרפליקונים הם יחידות המוכרות מהטבע ומזוהות גם בחיידקים מתורבתים‪ .‬הפלסמידים המועברים לתוך‬
‫חיידקים בטרנספורמציה‪ ,‬לעומת זאת‪ ,‬מהונדסים על ידי אדם‪.‬‬
‫מרבית הפלסמידים הם דו‪-‬גדיליים ומעגליים למרות שבטבע מוכרים פלסמידים חד גדיליים‪ ,‬לינארים‬
‫וכאלה המסוגלים לקיים את שני מצבי הגדיל‪ .‬פלסמידים הינם בעלי שונות גדולה בגודלם ומספר‬
‫עותקיהם‪ .‬החלוקה היא ל‪) single copy plasmid-‬עותק בודד(‪medium copy ,(3-5) low copy ,‬‬
‫)‪ (5-10‬ו‪) high copy-‬מעל ‪.(10‬‬
‫הפלסמידים מקודדים לתוצרי גנים החיוניים לקיומם העצמאי – לאו דווקא לטובת שרידות החיידק‪ ,‬כעין‬
‫פרזיטים‪ .‬הם לא נושאים פונקציות חיוניות למאחסן‪ ,‬למרות שלעיתים הם נושאים פונקציות המקנות‬
‫יתרון למאחסן‪.‬‬
‫בטבלה מופיעים מספר פלסמידים שבודדו מהטבע‪ .‬היא מציגה את רשימת חיידקים שניתן לתרבת )עמודה‬
‫ימנית( ושמות הפלסמידים הקשורים אליהם )עמודה שמאלית(‪ .‬שם הפלסמיד מרמז על המקור שלו‬
‫)‪ (ColE1‬או על הפונקציה שהוא נושא )‪ ,Tol‬נושא מערכת לדגרדציה של טולואן – חומר המצוי בנפט‬
‫גולמי‪ ,‬תכונה המאפשרת לחיידק לגדול בנישות אקולוגיות עם תחרות מועטה(‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪112‬‬
‫משמאל‪ :‬הבדלים במספרי העותקים בין פלסמידים‬
‫שונים‪ .‬פלסמיד ‪ F‬והפרופאג' של ‪) P1‬מצב ליזוגני(‬
‫מצויים בעותק יחיד‪ ,‬בעוד שהאחרים הם ‪ Low‬או‬
‫‪.Medium to High‬‬
‫כלל אצבע‪ :‬הפלסמידים הגדולים‪ ,‬שהם לרוב פלסמידים קוניוגטיבים‪ ,‬נמצאים בעותק יחיד בתא; פלסמידים‬
‫קטנים יותר נמצאים לרוב במספר עותקים גבוה יותר‪.‬‬
‫שכפול פלסמידים‬
‫פלסמידים לא מביאים פולימראזים ופונקציות מטאבוליות מורכבות לרפליקציה‪ ,‬אלא משתמשים‬
‫במנגנונים התאיים בעזרת אלמנטים הדומים למנגנון הרפליקציה החיידקי‪ .‬בשורה ‪ B‬ניתן לראות את‬
‫מנגנון הרפליקציה הרגיל של תאים – על ידי בועת שכפול; יש גם רפליקציה במנגנון בשם ‪Rolling‬‬
‫‪ (C) Circle‬המשתמש בגדיל אחד כתבנית לבניית הגדיל השני במלואו‪ ,‬תוך כדי יצירת ‪ nick‬ושימוש‬
‫בגדיל המקור השני כתחל‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬תורשה בבקטריה‪ ,‬פלסמדים וטרנספורמציה ‪ -‬המשך‬
‫‪113‬‬
‫שיעור ‪ :16‬תורשה בבקטריה‪ ,‬פלסמדים וטרנספורמציה ‪ -‬המשך‬
‫טרנספורמציה‬
‫טרנספורמציה הינה תופעה של קליטת ‪ DNA‬על ידי החיידק‪ .‬טרנספורמציה טבעית קולטת ‪DNA‬‬
‫לינארי‪ .‬התהליך פעיל‪ ,‬מבוקר ונעשה כאשר החיידק במצב קומפטנטי ומסוגל לקבל את ה‪.DNA-‬‬
‫טרנספורמציה מלאכותית משמשת להכנסת חומר גנטי לחיידקים על גבי פלסמידים‪.‬‬
‫בתהליך הטרנספורמציה יש חיידק תורם )‪ ,(donor‬חיידק מקבל )‪ (recipient‬וטרנספורמנטים‬
‫)‪ (transformant‬שהם צאצאי הטרנספורמציה‪ .‬בטרנספורמציות מלאכותיות אין ‪ donor‬מכיוון‬
‫שמכניסים פלסמיד מלאכותי‪.‬‬
‫טרנספורמציה מלאכותית‬
‫קליטת פלסמיד ‪ DNA‬שלם מהתמיסה היא תהליך לא יעיל – החיידקים צריכים להיות קומפטנטים כדי‬
‫לקלוט את החומר הגנטי‪ ,‬מצב המושרה באופן מלאכותי‪ .‬ההשראה גורמת לערעור של הממברנה‬
‫החיצונית של החיידקים לצד שמירה על איזון החיידק כך שניתן יהיה לערער את המעטפת מבלי להרוג‬
‫את החיידק‪.‬‬
‫•‬
‫טיפול בקלציום‪-‬כלוריד – תמיסת מלחים שגורמת לדה‪-‬פולריזציה בערעור הממברנה ויצירת חורים‬
‫דרכם יכול ה‪ DNA-‬להיכנס‪.‬‬
‫•‬
‫אלקטרופורזה – שמים את החיידקים במים ובשדה חשמלי; השדה דוחף את ה‪ DNA-‬פנימה‪.‬‬
‫התהליכים עדיין לא יעילים במיוחד ולכן יש להפעיל סלקציה – שלרוב נעשית על ידי גן עמידות‬
‫לאנטיביוטיקה המצוי על גבי הפלסמיד המוחדר‪ .‬ב‪ 108-‬חיידקים שעוברים טרנספורמציה מתקבלים ‪104‬‬
‫חיידקים טרנספורמנטים‪.‬‬
‫שימוש בטרנספורמציה מלאכותית‬
‫מחקר גנטי – תהליך ‪ Gene Replacement‬מחליף גן בזן מסויים‬
‫של חיידק בגן מוטנט‪ ,‬על מנת לחקור את הפנוטיפים של המוטציה‪.‬‬
‫התהליך מתעלה על הגנטיקה הקלאסית כי הוא מאפשר מוטגנזה‬
‫ישירה ומכוונת לגן ספציפי‪ ,‬ולא אקראית כמו על ידי ‪.UV‬‬
‫התהליך מתאפשר בעזרת ‪ – Suicide Vectors‬פלסמידים שלרוב‬
‫אינם מתאימים בין מקור ומאחסן‪ ,‬כך שהם אינם יכולים להשתכפל‬
‫במאחסן ונמצאים בעותק יחיד‪ .‬חשיבות הדבר היא בכך שלא יווצר‬
‫מצב מרופלואידי‪-‬לכאורה שיטעה את התוצאות‪.‬‬
‫באיור מובא מקטע מכרומוזום של חיידק ופלסמיד‪ .‬מבקשים להחליף‬
‫את הגן המסומן בשחור‪ .‬בגן המתאים בפלסמיד יש גן עמידות‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪114‬‬
‫לקנאמיצין אשר גם משמש כגורם סלקציה וגם כגורם הפרעה שיוצר מוטציה בגן‪ .‬ריקומבינציה בודדת‬
‫בין הפלסמידים לאיזורים קומפלמנטרים של הגן יכניסו את הגן לכרומוזום לצד הגן התקין )‪.(A‬‬
‫כעת יש לקבל היפוך של תהליך כניסת הפלסמיד – אם המולקולה תתקפל סביב עצמה )‪ (B‬כך שהגן‬
‫המוטנט יהיה מול התקין‪ .‬במצב זה יכולה להיות חזרה לאחור – מעגל ייצא מתוך הכרומוזום עם הגן‬
‫הפגום; לחילופין יכול להיות שהמעגל שייצא יכיל דווקא את הגן התקין ואז בכרומוזום החיידק יהיה‬
‫עותק יחיד של הגן הפגום עם עמידות לאנטיביוטיקה‪.‬‬
‫מכיוון שהפלסמיד הוא ‪ suicide vector‬בסופו של דבר הוא נמהל ונעלם מהאוכלוסיה‪.‬‬
‫שימוש בטרנספורמציה לאפיון מוטנטים‬
‫היום משתמשים בחיידקים לצורך ביטוי חלבונים – מכניסים את הגן לפלסמיד המצוייד באלמנטי הבקרה‬
‫והשכפול הדרושים לגן בקטריאלי‪ ,‬מבצעים טרנספורמציה לחיידק המבטא את החלבון בכמויות וכך ניתן‬
‫להפיק כמויות חלבון גדולות‪.‬‬
‫הטרנספורמציות הקלו על חקר תהליכים ביולוגיים ומיפוי גנטי‪ .‬הקומפלמנטציה על ידי פלסמידים מקלה‬
‫על מיפוי מוטציות היום‪ :‬ניתן לחתוך ‪ DNA‬של חיידק ‪ WT‬באנזימי רסטריקציה ולקבל "ספרייה" של‬
‫פלסמידים המכילים כל אחד מחדר‪ ,‬איזור אחר של הגנום‪ .‬אז מחדירים את הספריה לחיידקים מוטנטים‬
‫בעלי פנוטיפ מסויים‪ ,‬ומחפשים ביניהם כאלו שרואים בהם פנוטיפ ‪ – WT‬תהליך רברסיה אמיתית‪.‬‬
‫בצורה זו ניתן לזהות מהו הגן שנבע מ‪ WT-‬והחליף את הגן הפגוע במוטנט‪.‬‬
‫הניסוי של גריפית' לאור הטרנספורמציה‬
‫תהליך זה הוא טרנספורמציה טבעית‪ :‬גריפית' לקח חיידקים לא‪-‬אלימים מחוספסים וערבב עם תמצית‬
‫חיידקים אלימים מומתים‪ .‬הוא ראה שהחיידקים הלא‪-‬אלימים הופכים לאלימים‪ .‬מזלו של גריפית' שיחק‬
‫לו‪ :‬חיידקי הסטרפטוקוקוס הינם בעלי מצב קומפטנטי טבעי‪.‬‬
‫גריפית' חשב שמה שמועבר הוא מרכיבים של הקפסולה‪ ,‬מכיוון שהוא ראה שההבדל בין החיידקים הוא‬
‫מרכיבי הקפסולה‪ .‬הצדק היה עמו‪ ,‬באופן חלקי‪ :‬ההבדל בין החיידקים הוא מרכיב של הקפסולה‪ ,‬אך‬
‫העברת היכולת התאפשרה תודות להעברת הגן למרכיב ולא העברה של המרכיב עצמו‪.‬‬
‫טרנספורמציה טבעית‬
‫קומפטנטיות טבעית היא תהליך מבוקר שאינו קיים כל הזמן בחיידקים שיכולים להיות קומפטנטים‪ ,‬מכיוון‬
‫שקליטת ‪ DNA‬מהסביבה היא יותר סיכון מאשר תועלת‪ .‬הבקרה הפעילה מתרחשת בעזרת מערכת‬
‫המאפשרת לחיידק לחוש את סביבתו ולהגיב לשינויים סביבתיים על ידי הפעלת מערכות גנים נחוצות‪.‬‬
‫המערכות האלה פעילות במצבים שונים ומגוונים ומכונות ‪) Two-Component Systems‬שכן הן‬
‫מורכבות משני רכיבים(‪ .‬הרכיב הראשון הוא רכיב ממברנלי‪ ,‬הרצפטור בעזרתו החיידק חש את סביבתו‪.‬‬
‫לרצפטור יש שני תפקידים‪ :‬בחלקו החיצוני הוא קושר מולקולת ליגנד; הקישור גורם לשינוי קונפורמציה‬
‫הגורם לו לזרחן את עצמו בחלקו התוך‪-‬תאי )‪ (auto-kinase‬ולהתחיל את שרשרת מעבר האותות פנימה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬תורשה בבקטריה‪ ,‬פלסמדים וטרנספורמציה ‪ -‬המשך‬
‫‪115‬‬
‫לאחר הזירחון‪-‬העצמי החלבון מסוגל לזרחן חלבונים‬
‫נוספים ומזרחן ‪ ,Response Regulator‬פקטור‬
‫שיעתוק שמאפשר שיעתוק של גנים מתאימים למערכת‬
‫אותה הוא מבקר )הוא הרכיב השני במערכת(‪.‬‬
‫התהליך מתחיל מסיגנל סביבתי‪ ,‬העשוי להתחלק‬
‫לשנים‪:‬‬
‫•‬
‫מולקולה המופרשת על ידי תאים אחרים ולא‬
‫קשורה לחיידק עצמו‪.‬‬
‫•‬
‫מולקולה המופרשת על ידי החיידק עצמו‬
‫וחבריו שזהים לו סביבו‪ .‬במצב זה המערכת‬
‫משמשת‬
‫לתקשורת‬
‫בין‬
‫החיידקים‬
‫ומגיבה‬
‫לשינויים שעוברים החיידקים – בראש ובראשונה‬
‫לצפיפות שלהם‪ .‬קומפטנטיות היא סוג כזה של‬
‫מערכת – תגובה לסיגנל שמופרש מהתאים עצמם‪.‬‬
‫המערכת מופעלת על בסיס גירוי סיפי – מעל סף מסויים‪ .‬בריכוזים נמוכים היא אינה פעילה‪ .‬מסיבה זו‬
‫המערכת חשה‪ ,‬בראש ובראשונה‪ ,‬את צפיפות החיידקים‪ .‬לאחר מעבר הסף הרצפטור עובר זירחון‪-‬‬
‫עצמי תוך פירוק ‪ ,ATP‬מזרחן את בקר התגובה‪ ,‬אשר מתיישב על גן מסויים ומאפשר את ביטויו‪.‬‬
‫כמו כן במערכת פעיל גם חלבון פוספאטאז – אשר עוצר את התגובה כאשר אין בה צורך‪ .‬לאחר‬
‫שהסיגנל נעלם‪ ,‬הרצפטור עובר שינוי קונפורמציה שמסיר ממנו את הפוספט; אולם בקר התגובה אינו‬
‫עובר תהליך שכזה ולכן נדרשת הפוספאטאזה‪.‬‬
‫מערכת בי‪-‬מרכיב נוספות‬
‫למטה‪ :‬מערכת בי‪-‬מרכיב קלאסית המשמשת לתגובת חיידקים לשינוי הלחץ האוסמוטי בסביבה‪ .‬ניתן לראות‬
‫שזירחון הרצפטורים הוא על גבי שייר היסטידין והזירחון של בקר התגובה הוא על גבי שייר של אספרטאט‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪116‬‬
‫למטה‪ :‬מערכת זו מכילה ארבעה רכיבים והינה מערכת המבקרת ספורולציה‪ .‬בין הרצפטור לבקר התגובה יש‬
‫מתווכי ביניים של הזירחון‪ .‬סדר העברת הזרחנים מתחיל עדיין בזירחון היסטידין ועובר לסירוגין בין‬
‫אספרטאט והיסטידין‪.‬‬
‫למרות שיש ארבעה רכיבים זה עדיין משוייך למשפחות הבי‪-‬רכיבי‪.‬‬
‫מערכות שמופעלות בליגנד שמקורו בחיידק עצמו מכונות ‪ ,quorum sensing‬בו החיידקים עצמם‬
‫מפרישים את הגורם לתגובה‪ .‬במערכת משמאל‪ ,‬הקשורה לקומפטנטיות‪ ,‬פרומונים מופרשים החוצה‬
‫מהחיידק ונקשרים לרצפטור‪ .‬רצפטור אחר מגיב‬
‫לפפטיד קומפטנטיות אחר‪ .‬שני המסלולים הפנימיים‬
‫של הרצפטורים מתנקזים לתוצר ביניים אחד שמוביל‬
‫להפעלה של גנים הקשורים בוקמפטנציה‪.‬‬
‫הסיגנלים לספורולציה או לקומפטנטיות הם דומים‪:‬‬
‫צפיפות גבוהה ומחסור במזון גורמים להם להיכנס‬
‫לכל אחד מההמצבים שלעיל‪ .‬מסיבה זו שתי המערכות יכולות להתנקז לאותו החלבון )‪ .(ComA‬יש‬
‫לציין כי למרות זאת‪ ,‬החיידק לא יעשה את שני התהליכים בו זמנית‪ :‬גורם ההפעלה הסביבתי עשוי‬
‫להיות דומה אך התוצאה שונה מאוד‪.‬‬
‫שאלות בנוגע למנגנון קומפטנטיות טבעית‬
‫•‬
‫כמה יעיל התהליך?‬
‫•‬
‫האם חיידקים בעלי העדפה ל‪ DNA-‬מחיידקים דומים?‬
‫•‬
‫באיזה מצב נכנס ה‪ ,DNA-‬חד‪ -‬או דו‪-‬גדיל?‬
‫•‬
‫מהו מנגנון כניסת ה‪ ,DNA-‬אם נעשית ללא כניסה דיפוזית‪/‬ספונטנית של טרנספורמציה מלאכותית?‬
‫•‬
‫כיצד ה‪ DNA-‬מקובע בחיידק המקבל והאינפורמציה תופיעה בו ובצאצאיו?‬
‫יעילות הקליטה‬
‫לצורך קביעה זו‪ ,‬משרים על חיידקים מצב קומפטנטי‪ ,‬מוסיפים ‪ DNA‬מסומן רדיואקטיבית ולאחר פרקי‬
‫זמן מתאימים מסרכזים ומפרידים את החיידקים על מנת לבדוק כמה ‪ DNA‬מסומן נמצא בחיידקים‪.‬‬
‫התגובה‪ :‬מעט‪ ,‬זהו תהליך לא יעיל לאורך כל שלביו‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬תורשה בבקטריה‪ ,‬פלסמדים וטרנספורמציה ‪ -‬המשך‬
‫‪117‬‬
‫ספציפיות הקליטה‬
‫בתשובה לשאלה זו מתגלה שקיימים שני המצבים‪ :‬חיידקי עגבת או שפעת מעדיפים קליטה של רצף‬
‫מבני מינם המכיל רצף ספציפי מסויים‪ .‬העדפה זו נובעת מכך שהרצפטור לגנום מזהה רצף בן ‪11‬‬
‫בסיסים‪ ,‬שהסיכוי להופעתו אקראית הוא נמוך בעוד שהרצף הזה דווקא שכיח ומועשר בגנום של‬
‫החיידקים הספציפיים בני אותו המין‪ .‬מכאן שהם יעברו טרנספורמציה ביעילות גבוהה יותר )יחסית(‬
‫בנוכחות הרצפים האלה‪ .‬לעומתם חיידקים אחרים יכולים לקלוט כל ‪ ,DNA‬ללא תלות ברצף מסויים‬
‫שיוצר העדפה‪.‬‬
‫מצב המעבר של ה‪ DNA-‬והמנגנון‬
‫למטה‪ :‬מערכות חישה נוספות של חיידקים‪ .‬בעוד שיש מערכות המשמשות גם ל‪ quorum sensing-‬כדי‬
‫לחוש את הסביבה‪ ,‬ישנן מערכות כדי לשלוח הודעות החוצה לסביבה‪ .‬יחד עם זאת כרגע עוסקים בכניסה‪ ,‬לא‬
‫בהפרשה‪.‬‬
‫)‪ (a‬במערכת ‪ type II secretion‬של חיידק גרם שלילי קיים מרכיב דמוי‪-‬תעלה דרכו עוברות‬
‫המולקולות‪ .‬למעט התעלה יש חלבונים ורכיבים שמגייסים מרכיבים שונים לתעלה ומאפשרים את מעבר‬
‫המולקולה החוצה‪.‬‬
‫)‪ (b‬במערכת ‪ Type IV Pilus‬של חיידק גראם שלילי יש פילוס‪ ,‬עמוד המועבר דרך הממברנות בעזרת‬
‫התעלה‪ .‬לעומת זאת‪ ,‬מערכת ה‪ competence-‬נראית דומה )‪ – (c‬ברכיב התעלה ובסיס הפילוס – אבל‬
‫חלקו העליוןש ל הפילוס אינו נמצא‪ .‬היעדרו מאפשר ל‪ DNA-‬להיכנס דרך התעלה השנייה לתווך הבין‪-‬‬
‫ממברנלי של החיידק‪ .‬בממברנה הפנימית של תעלה נוספת ‪ ComA‬שכעת מפרקת את ה‪ DNA-‬הדו‪-‬‬
‫גדילי לחד‪-‬גדיל וכוללת פעילות נוקליאז‪.‬‬
‫בכל הטרנפורמציות הטבעיות המולקולה הנכנסת היא ‪ DNA‬חד‪-‬גדילי‪.‬‬
‫הקליטה והקישור של טרנספורט ה‪ DNA-‬משתמשות במערכות תקשורת אחרות עם הסביבה‪ ,‬כמו‬
‫טרנפורטרים ושוטונים‪ ,‬כדי ליצור מערכת קליטת ‪ DNA‬פנימה‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪118‬‬
‫בחיידק גראם חיובי )‪ (d‬יש מערכת דומה‪ :‬בתוך הדופן הפפטידוגליקאנית‪ ,‬שאינה מהווה מחסום ממשי ל‪-‬‬
‫‪ ,DNA‬יש מבנה דמוי‪-‬שוטון‪ .‬אין כאן גיוס מרכיבים ממערכות קיימות אחרות )למרות שזה לא המצב‬
‫הכולל של גראם‪-‬חיוביים(‪ .‬המבנה דמוי‪-‬השוטון הוא רצפטור ה‪ DNA-‬דרכו הכניסה היא דו‪-‬גדילית‪.‬‬
‫ה‪ DNA-‬מתפרק עם ההגעה לטרנספורטר ‪.ComEC‬‬
‫לאחר שה‪ DNA-‬נקשר לחיידקים ונכנס‬
‫פנימה‪ ,‬ה‪ DNA-‬החד‪-‬גדילי נעטף בחלבון‬
‫‪ DNA-binding protein‬שיגן עליו מפני‬
‫מנגנוני‬
‫נוקליאז‬
‫בתאים‪,‬‬
‫בעיקר‬
‫אקסונוקליאזות )שהן גם הסיבה שלא‬
‫משתמשים ב‪ DNA-‬לינארי לטרנספורמציה‬
‫מלאכותית(‪ .‬במידה ומתקיימת ריקומבינציה‬
‫הומולוגית כפולה בין ה‪ DNA-‬הלינארי‬
‫לכרומוזום החיידק‪ ,‬ה‪ DNA-‬מתקבע בגנום‪.‬‬
‫חיידקים שקולטים ‪ DNA‬זר לחלוטין – של חיידק מזן אחר – מבצעים העברת גנים הוריזונטלית‬
‫המאפשרת רכישת יכולות חדשות בקנה מידה אבולוציוני‪ .‬שני המנגנונים העיקריים הפעילים בתהליכים‬
‫אלו הם‪:‬‬
‫•‬
‫)‪ – None-Homologuos End-Joining (NHEJ‬תהליכי קרינה יוצרים שברים דו‪-‬גדיליים ב‪-‬‬
‫‪ DNA‬ומפעילים מנגנוני תיקון‪ .‬בתהליך תיקון השבר יכולים להיכנס מקטעי ‪ DNA‬שאין בהם‬
‫דמיון‪ .‬תהליכים אלו מאפשרים לחיידק מקבל להטמיע את הגנום הזר בתוך הכרומוזום שלו‪.‬‬
‫•‬
‫טרנספוזונים – אלמנטים גנטיים שיודעים לקפוץ ממקום למקום‪ .‬השינוע אינו תלוי במקור ה‪DNA-‬‬
‫של התורם והמקבל ולכן רוב אירועי העברת גנים הוריזונטלית הם אירועי טרנספוזיציה ולא ‪.NHEJ‬‬
‫במידה ובתוך ה‪ DNA-‬הנכנס היה טרנספוזון ניתן יהיה להכניס את המקטע לתוך הגנום‪.‬‬
‫האיור הבא מציג משמאל כניסה של‬
‫חיידק למצב קומפטנטי )‪ ,(a‬קשירה‬
‫של מולקולת ‪ DNA‬לינארי הנכנסת‬
‫פנימה )‪ (b‬ונעטפת בחלבונים מגנים‬
‫)‪ ,43(RecA‬לאחר מכן מצב הומולוגיה‬
‫וריקומבינציה )‪ (c‬מכניסים את הגן‬
‫ומחליף אותו בגנום )‪.(d‬‬
‫‪ 43‬מקור החלבון מ‪ E.coli-‬שאין לו מצב קומפטנטי טבעי ידוע‪ .‬יחד עם זאת יש לציין שרק מכיוון שהמחקר לא גילה את תנאי‬
‫הטרנספורמציה במעבדה על מנת שניתן יהיה לשחזר אותה‪ ,‬אין זה אומר שהגנים לא קיימים וככל הנראה הבעיה היא באמת‬
‫מציאת התנאים המתאימים ולא שהתכונה אינה קיימת – היא קיימת ככל הנראה בכל העולם הבקטריאלי‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬תורשה בבקטריה‪ ,‬פלסמדים וטרנספורמציה ‪ -‬המשך‬
‫‪119‬‬
‫מנגנון יוצא דופן ‪ -‬טרנספורמזום‬
‫חיידק מסויים )‪ (Hemophilus influenzae‬מקיים‬
‫מבנה ביניים שונה מכפי שנראה קודם‪ :‬כאשר ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬נקשר הוא נקשר לאיבר הטרנספורמזום במצב‬
‫דו‪-‬גדילי‪ .‬לאחר מכן הטרנספורמזום עובר תהליך‬
‫‪ flipping‬ההופך אותו מהחוץ לפנים‪ .‬אחד הגדילים‬
‫של ה‪ DNA-‬עובר פירוק ובסופו של דבר‬
‫לציטופלזמה ה‪ DNA-‬יגיע במצב חד‪-‬גדילי‪.‬‬
‫מצב זה מראה מבנה מתמחה שתפקידו לקשור את ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬הנכנס מההממברנה במצב דו‪-‬גדילי למרות‬
‫שהוא לעולם לא מגיע לציטופלזמה במצב דו‪-‬גדיל‪.‬‬
‫הקינטיקה של התהליך‬
‫תהליך הטרנספורמציה מתחלק למספר שלבים‪ :‬קישור ‪ ,DNA‬כניסה במצב ‪ ssDNA‬אינקורפורציה‬
‫לגנום ועיגון האינפורמציה בצאצאים‪ .‬בניסוי הבא מנסים לתזמן את התהליכים האלה‪.‬‬
‫בתהליך זה מוסיפים לחיידקים ‪ DNA‬רדיואקטיבי‪ .‬לאחר פרק זמן נתון מפוצצים את החיידקים המקבלים‬
‫ואת ה‪ DNA-‬שלהם מוסיפים לחיידקים חדשים‪ .‬רק אז בודקים אם התקבלו טרנספורמנטים‪ .‬אם מחכים‬
‫מספיק זמן‪ ,‬ניתן לראות שה‪ DNA-‬נכנס פנימה ובסופו של דבר מתקבלים טרנספורמנטים‪.‬‬
‫בפרקי זמן קצרים מאוד לא נכנסת שום רדיואקטיביות; מכאן שהמדידה הייתה מהירה מדי – הקישור של‬
‫ה‪ DNA-‬אורך יותר מ‪ 2-3-‬דקות )נדרשות כ‪ 10-‬דקות ל‪ 50-‬קילובסיסים(‪ .‬בפרק הזמן הבא ידוע שה‪-‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪120‬‬
‫‪ DNA‬בפנים אבל לא ידוע אם הוא עבר ריקומבינציה; פיצוץ של החיידקים המקבלים הראשונים לא יניב‬
‫טרנספורמנטים בפעם השנייה משום שללא קיבוע ה‪ DNA-‬בגנום ה‪ DNA-‬נותר חד‪-‬גדילי והוא לא יודע‬
‫להיקשר לרצפטור של ה‪ DNA-‬בחיידק הקומפטנטי – המכניס ‪ DNA‬דו גדילי בלבד והופך אותו לחד‪-‬‬
‫גדילי‪.‬‬
‫מדוע חיידקים מקיימים קומפטנטיות?‬
‫•‬
‫מקור להגדלת שונות גנטית – מוטציות מתרחשות בקצב קבוע‪ ,‬למרות שמצבי מצוקה יכולים‬
‫להגביר את הקצב המוטציוני על ידי מנגנוני רפליקציה בעלי פעילות לקויה ולא מהימנה‪ .‬החיידקים‬
‫חושפים עצמם לחוסר‪-‬יציבות גנטית מוגבר מתוך "שאיפה" למוטציה שתשפר את הפיטנס ללחץ‬
‫הסביבתי החזק‪ .‬טרנספורמציה יכולה למלא תפקיד דומה בהקשר זה‪ :‬אוכלוסיית חיידקים הנמצאים‬
‫במצב מצוקה קיצוני יכולה להיכנס לקומפטנטיות על מנת לרכוש מהסביבה יכולת להתחמק מהלחץ‬
‫הסביבתי‪.‬‬
‫•‬
‫תבנית לתיקון נזקים גנטיים – אוכלוסיית חיידקים שמוקרנת ב‪ UV-‬עוברת מוטגנזה וגם מתה‬
‫ומפוצצת‪ .‬חיידקים שלא הומתו יכולים לקלוט ‪ DNA‬של חיידקים מתים ולהשתמש בו כתבנית‬
‫לתיקון מקטעים שנפגעו במוטגנזה כתוצאה מהקרינה‪ .‬שיטה זו הינה אסטרטגיה הישרדותית‪.‬‬
‫•‬
‫‪ DNA‬כמקור מזון‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬קוניוגציה‬
‫‪121‬‬
‫שיעור ‪ :16‬קוניוגציה‬
‫קוניוגציה היא מעבר של ‪ DNA‬פלסמידי בין חיידק תורם למקבל‪ ,‬תוך יצירת קשר בין שני החיידקים –‬
‫הקשורים במבנה תעלת קוניוגציה שמאפשר מעבר ‪ – DNA‬ולכן התופעה חייבת להתנהל כששני‬
‫החיידקים – התורם והמקבל – חיים )להבדיל מטרנספורמציה(‪.‬‬
‫התצפיות הראשונות היו של לדרברג וטאטום שראו שבין שני חיידקי ‪ E.coli‬שמערבבים יחד מתקבלים‬
‫צאצאים שנראים כמו שילוב תכונות של ההורים‪.‬‬
‫הפלסמידים הקוניוגטיבים מתחלקים לשני סוגים‪:‬‬
‫•‬
‫העברה עצמית )‪ – (Self Transmissible‬יודעים לבצע קוניוגציה‪ ,‬תהליך המקוטלז ודורש מנגנון‬
‫מתאים להתרחשותו‪ .‬הפלסמידים מכילים את הגנים לקיום המנגנון‪.‬‬
‫•‬
‫טרמפיסטים )‪ – (Mobilized‬פלסמידים היודעים לעבור בקוניוגציה אבל לא יודעים להשרות את‬
‫התהליך‪ .‬הם אינם מכילים את הגנים המתאימים למנגנון ולכן כדי לעבור עליהם לשהות בחיידק‬
‫המכיל פלסמיד קוניוגטיבי בעל יכולת העברה עצמית‪.‬‬
‫הקוניוגציות מתחלקות לשני סוגים עיקריים‪:‬‬
‫•‬
‫שמרניות – בין חיידקים וחיידקים דומים מאוד‪ ,‬בני אותו מין או זן‪.‬‬
‫•‬
‫מתירניות )‪ – (Promiscuous‬פלסמידים העוברים בין חיידקים שלא דומים אחד לשני ובמקרים‬
‫קיצוניים אפילו בין חיידקים לתאים ממחלקה אחרת‪.44‬‬
‫אגרובקטריום – שיא המתירנות‬
‫דוגמת האגרובקטריום היא הצורה המתירנית ביותר של‬
‫קוניוגציה‪ :‬העברת חומר גנטי בין ממלכות פילוגנטיות שונות‪ .‬ה‪-‬‬
‫‪ Ti-Plasmid‬מעביר מקטע‪ 45‬בשם ‪ T-DNA‬לגרעין הצמח וגורם‬
‫לביטוי של שתי מערכות גנים – ‪ – onc & ops‬המאפשרות את‬
‫יצירת העפץ‪.‬‬
‫פציעה של רקמת הצמח גורמת לו להפריש תרכובות פנוליות‪.‬‬
‫האגרובקטריום מכיל חיישן אוטוקינאז במערכת דו‪-‬מרכיבית‬
‫המעוררת הפעלה של של הגנים המאפשרים את המשך התהליך‪.‬‬
‫זה לא ‪ quorum sensing‬כי ההפרשה אינה במקור מהחיידק וגם‬
‫לא קשורה לפלסמיד‪.‬‬
‫‪ 44‬תופעת הבסיס לביוטכנולוגיה החקלאית היא קוניוגציה מתירנית – מעבר פלסמיד ה‪ Ti-‬מחיידק האגרובקטריום לתוך הצמח‬
‫על מנת ליצור שינוי גנטי מכוון של הצמח‪ .‬תופעה זו מתחילה בפציעה מכאנית של הצמח המאפשרת לאגרובקטריום להיכנס‬
‫לתא; הפלסמיד מקבל אות להתחלת קוניוגציה שתעביר חתיכה מסויימת ממנו – ‪ – T-DNA‬לגרעין התא הצמחי בכדי להתחיל‬
‫בתהליכים הדרושים לקיום האגרובקטריום‪.‬‬
‫‪ 45‬העובדה שעוברת רק חתיכה מהפלסמיד היא ייחודית – לרוב בקוניוגציה עובר פלסמיד שלם ולא רק חלק ממנו‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪122‬‬
‫לאחר אקטיבציה של המערכת‪ ,‬ה‪-‬‬
‫‪ tDNA‬עובר קיצור ועיבוד המשחרר‬
‫עותק חד‪-‬גדילי שלו עטוף בחלבון‬
‫שהוא תוצר של אחד ה‪Virgins-‬‬
‫)הגנים‬
‫המתעוררים‬
‫מהתרכובות‬
‫הפנוליות‪ .(vir ,‬בהמשך החתיכה‬
‫עוברת לתא הצמח‪ ,‬מתקבעת ומתחילה‬
‫בתהליך ייצור העפץ‪.‬‬
‫פלסמידים בעלי מתירנות בינונית‬
‫מתירנות בינונית היא בין חיידקים‬
‫ממינים שונים‪ .‬הפלסמיד לא יכול‬
‫לעבור בין ממלכות‪ .‬המקבילה של ה‪-‬‬
‫‪ Virgins‬מה‪ Ti-Plasmid-‬הם ‪Tra‬‬
‫‪ ,Genes‬גנים המקודדים למרכיבים‬
‫של מערכת הקוניוגציה ולכן חלק גדול‬
‫הפלסמיד מוקדש לגנים אלו‪ ,‬החיוניים‬
‫להקניית היכולת הקוניוגטיבית‪.‬‬
‫כמו כן הפלסמיד חייב לעבור שיכפול‬
‫במצבים שונים ולכן יש לו שני‬
‫מקורות שיכפול‪ :‬כאשר מושרה מצב‬
‫הקוניוגציה‪ ,‬השיכפול מתחיל בנקודת‬
‫‪ OriT‬במקום ‪.OriR‬‬
‫לסדרת הגנים ‪ Tra‬יש תוצרים ‪ trans-acting‬והם משמשים למצבי רפליקציה ייחודיים‪ ,‬יצירת הפילוס‬
‫כפולימר של חלבוני ה‪ Pilin-‬היוצא מהבסיס כלפי חוץ‪ ,‬שינוע ה‪ DNA-‬דרך התעלה וגם אינהיביציה של‬
‫הקוניוגציה במקרה של "קרובי משפחה" – חיידקים שמכילים פלסמיד קוניוגטיבי לא יכולים לקבל‬
‫בשנית את אותו הפלסמיד‪.‬‬
‫באיור ניתן לראות שני חיידקים בתהליך קוניוגציה – הפילוס קיים‬
‫בין שני החיידקים‪ .‬הפילוס נקשר לחלבון ממברנלי של החיידק‬
‫המקבל )שאין בו את הפלסמיד(‪ .‬לאחר יצירת הקשר‪ ,‬הפילוס‬
‫ייתכווץ ויביא את שני החיידקים למגע ישיר כך שיוכלו לקיים את‬
‫הקוניוגציה‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬קוניוגציה‬
‫‪123‬‬
‫שני סוגי קוניוגציות‬
‫•‬
‫העברת פלסמיד מתורם למקבל – המקבל לא‬
‫הכיל פלסמיד אבל לאחר התהליך מתקבלים שני‬
‫חיידקים עם פלסמיד קוניוגטיבי ושניהם יכולים‬
‫להיות תורמים )'‪.(F+, F‬‬
‫•‬
‫העברה של כרומוזום בקטריאלי – אם‬
‫הפלסמיד‬
‫הקוניוגטיבי‬
‫עבר‬
‫אינטגרציה‬
‫לכרומוזום הקוניוגציה תנסה להעביר את כל‬
‫הכרומוזום מהתורם למקבל )‪ .(HFR‬לרוב‬
‫המעבר לא יתקיים במלואו והמקבל יהיה‬
‫מרופלואידי‬
‫זמני‬
‫ללא‬
‫היכולת‬
‫להעברה‬
‫קוניוגטיבית‪.‬‬
‫טבלה‪ :‬גנים בעלי עיגול אדום הם הגנים החשובים‬
‫לקוניוגציה בפלסמיד ‪ .F‬יש הרבה גנים בעלי פונקציות‬
‫קוניוגטיביות‪ ,‬מה שמעיד על הטענה שהפלסמיד‬
‫מוקדש בעיקרו לגנים מסוג זה‪.‬‬
‫תהליך הקוניוגציה‬
‫הפלסמיד עובר רפליקציה רגילה בתוך‬
‫התא עד שניתן האות לקוניוגציה;‬
‫בשלב‬
‫זה‪,‬‬
‫‪knicking-enzyme‬‬
‫המקודד על ידי אחד מה‪Tra Genes-‬‬
‫מבצע "‪ "knick‬חד גדילי בפלסמיד‪.‬‬
‫הקצה ‪ '5‬של הגדיל החתוך מוזז‬
‫ממקומו‬
‫)‪(displacement‬‬
‫ונדחק‬
‫מהדו‪-‬גדיל בעוד הקצה ‪ '3‬מהווה‬
‫פריימר לסינטזה על תבנית הגדיל‬
‫השלם‪ .‬התהליך ממשיך כאשר הגדיל‬
‫האחד הולך ומיסנטז תוך כדי דחיקת הגדיל החוצה; בסוף התהליך מתקבל גדיל חדש וגדיל מקורי של‬
‫הפלסמיד מחוברים יחד‪ .‬הגדיל המקורי יעבור בסופו של דבר בקוניוגציה אל החיידק התורם‪ ,‬לאחר‬
‫שייחתך מהגדיל החדש‪.‬‬
‫הערה‪ :‬התהליך לא חייב להפיק הכפלה אחת בלבד‪ .‬בויריונים הוא משמש ליצירת גדיל מאורך שמכיל כמה‬
‫וכמה עותקים חוזרים של הגנום במנגנון המכונה ‪.rolling circle‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪124‬‬
‫במהלך הסינטזה של הגדיל החדש הגדיל המקורי מוכנס דרך ממשק‬
‫המגע בין החיידקים התורם והמקבל‪ ,‬עד שהמקבל קולט את מלוא‬
‫החד‪-‬גדיל‪ .‬תוך כדי הכניסה של החד‪-‬גדיל מתחילה בתורם סינטזה‬
‫של גדיל קומפלמנטרי בעזרת מקטעי אוקזקי‪.‬‬
‫פלסמידים קוניוגטיבים‪-‬טרמפיסטים עוברים כאשר פלסמיד‬
‫קוניוגטיבי פעיל יצר מצב קוניוגציה‪ .‬הממשק קיים כבר תודות‬
‫לפעילות ‪ Tra Genes‬של הפלסמיד הקוניוגטיבי העצמאי; יחד עם‬
‫זאת אם בסוף התהליך רק הפלסמיד הטרמפיסט יעבור‪ ,‬החיידק‬
‫המקבל לא יהיה חיידק קוניוגטיבי‪.‬‬
‫חיידקי ‪F+‬‬
‫לתא התורם קוראים ‪ F+‬כי הוא מכיל את הפלסמיד )פלסמיד ‪F‬‬
‫במקרה זה( והתא המקבל מכונה ‪ .F-‬לאחר קוניוגציה והעברה‬
‫מלאה של הפלסמיד מתקבלים שני תאים שהם ‪ .F+‬המעבר לא‬
‫מאפשר לימוד על מיפוי גנטי‪ ,‬משום שמי שעובר הוא הפלסמיד;‬
‫כאשר מנסים להשתמש בקוניוגציה למיפוי גנטי עוסקים במצבים‬
‫שיוצרים חיידק מקבל מרודיפלואידי‬
‫ואפשרות של שיחלוף גנטי מהתורם‬
‫למקבל ברמת הכרומוזום‪ .‬עם זאת‪,‬‬
‫וריאציות של המנגנון הרגיל עוזרות‬
‫לבצע מיפוי גנטי‪.‬‬
‫משמאל‪:‬‬
‫תעלת‬
‫הקוניוגציה‪.‬‬
‫כל‬
‫הרכיבים – למעט ה‪ DNA-‬פולימראז –‬
‫מקורם בפלסמיד הקוניוגטיבי‪ .‬ה‪DNA-‬‬
‫החד‪-‬גדילי של הפלסמיד נמשך ומושחל‬
‫דרך תעלת הקוניוגציה והוא עובר‬
‫פולימריזציה‬
‫למצב‬
‫דו‪-‬גדיל‬
‫בתא‬
‫המקבל‪.‬‬
‫חיידקי ‪HFR‬‬
‫‪ .HFR = High Frequency Recombination‬אם הייתה זהות גנטית כלשהי בין הפלסמיד‬
‫הקוניוגטיבי לכרומוזום החיידק המקבל‪ ,‬למשל על ידי אלמנט טרנספוזיציה‪ ,‬יכולה להתקים ריקומבינציה‬
‫הגורמת לאינטגרציה של הפלסמיד הקוניוגטיבי לכרומוזום‪ .‬כעת הכרומוזום השלם הפך לפלסמיד‬
‫קוניוגטיבי אחד – כי יש לו את כל ה‪ Tra Genes-‬וה‪ .OriT-‬אם יתחיל תהליך קוניוגציה החיידק ינסה‬
‫להעביר את כל הכרומוזום במנגנון קוניוגציה כמו שהודגם קודם‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :16‬קוניוגציה‬
‫‪125‬‬
‫ריקומבינציה הומולוגית גורמת ליצירה של חיידק‬
‫‪ .HFR‬חיידק ‪ E.coli‬מכיל כמה ‪IS elements‬‬
‫שונים במקומות מגוונים בגנום; מכאן שכל ‪HFR‬‬
‫יכול להכיל את הפלסמיד הקוניוגטיבי במקומות‬
‫שונים בגנום בין חיידקים שונים‪.‬‬
‫חיידק ‪ HFR‬יתחיל קוניוגציה באותה צורה –‬
‫"‪ "knick‬באיזור ‪ OriT‬ויצירת גדיל חדש תוך דחיקת‬
‫הגדיל המקורי המועבר לחיידק המקבל‪ .‬הזמן‬
‫המחושב של מעבר מלא של הכרומוזום הוא כ‪100-‬‬
‫דקות‪ ,‬עקב גודלו הרב; אולם הקוניוגציה היא קשר‬
‫עדין שלרוב לא מחזיק במשך זמן רב כל כך‪ .‬מסיבה זו מעבר הכרומוזום אינו שלם והחתיכה המועברת‬
‫כוללת בערך מחצית מהפלסמיד הקוניוגטיבי )ללא ה‪ (Tra Genes-‬ואת הגנים הכרומוזומלים הקרובים‬
‫לאותה פיסת פלסמיד – ככל שהחתיכה הכללית ארוכה יותר‪ ,‬עוברים יותר גנים‪ .‬מסיבה זו גם החיידק‬
‫המקבל נותר ‪ F-‬ואינו רוכש יכולת לקוניוגציה בהמשך‪ .‬החתיכה הזו יוצרת מצב מרודיפלואידי זמני‪,‬‬
‫כי היא מכילה עותק נוסף של הגנים הכרומוזומלים‪ ,‬אולם חסרת יכולת שיכפול ולא תשרוד זמן רב‬
‫בחיידק; יחד עם זאת היא יכולה לעגן את האינפורמציה שהיא הביאה בעזרת ריקומבינציה הומולוגית‪.‬‬
‫מיפוי גנטי‬
‫הכלאות בין ‪ HFR‬לחיידקי ‪ F-‬היא מבחן ‪ .Interrupted Mating‬אורך החתיכה של הכרומוזום‬
‫שעוברת מחיידק ‪ HFR‬תלויה במשך זמן הקוניוגציה שמתאפשר במהלך הניסוי – ככל שההפרעה‬
‫מתרחשת מאוחר יותר כן יעבור נתח יותר גדול מהכרומוזום‪ ,‬כלומר יעברו יותר גנים‪ .‬העצירה יכולה‬
‫להיעשות על ידי טלטול חזק בעזרת וורטקס‪ ,‬השובר את המבנה העדין של הקוניוגציה‪.‬‬
‫ככל שיותר גנים יעברו יהיה מעבר של יותר סמנים – אם החיידק התורם הוא ‪ WT‬והמקבל הוא )–( לכל‬
‫הגנים‪ ,‬ניתן לראות אילו גנים עוברים‪ .‬כך נוצרת מפה של החיידק בה הגנים מסודרים אחד אחרי השני‬
‫לפי זמן הופעתם כאשר היחידות במפה הן דקות זמן העברה‪.‬‬
‫‪ HFR‬מופיעים במקומות שונים‬
‫‪ HFR‬מעביר את הגנים הקרובים ל‪ OriT-‬שלו; אולם כל ‪HFR‬‬
‫יכול להכיל את ה‪ OriT-‬במקום אחר‪ .‬ניתן להרכיב מפות שונות‬
‫שמתקבלות מ‪ HFR-‬שונים‪ ,‬הממפות רק איזור קרוב ל‪;HFR-‬‬
‫אינטגרציה של הנתונים תיתן קונטיגים חופפים ומפה גנטית מלאה‪.‬‬
‫יש לציין שמפות ראשוניות אלו גסות מאוד‪ ,‬כי השיטה כזו; לא ניתן‬
‫להגיע בה לרמות רגישות של מוטציות נקודתיות‪ ,‬למשל‪ ,‬כי גן בודד‬
‫עובר בחלקי‪-‬דקה‪ .‬כמו כן לא ניתן למפות גנים שלא נותנים פנוטיפ‬
‫מובחן ‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪126‬‬
‫פלסמיד ’‪Prime Factors – F‬‬
‫פלסמידים מסוג פריים‪-‬פקטור )'( הם פלסמידים‬
‫הנוצרים באופן הפיך ליצירת ‪ :HFR‬פלסמיד ‪ F‬נכנס‬
‫לתוך הכרומוזום בריקומבינציה אולם בשלב מאוחר‬
‫הייתה ריקומבינציה נוספת הוציאה את הפלסמיד‪.‬‬
‫לכאורה התהליך רברסיבילי מלא; אולם מכיוון שיש‬
‫‪IS‬‬
‫שונים‬
‫ורבים‬
‫בכרומוזום‪,‬‬
‫אם‬
‫תתרחש‬
‫ריקומבינציה בין שני ‪ IS‬כך שחתיכת כרומוזום –‬
‫המכילה את הפלסמיד‪ – F-‬תצא מתוך הכרומוזום של‬
‫החיידק‪ ,‬ייתקבל פלסמיד קטן וקוניוגטיבי‪ ,‬המכיל את‬
‫ה‪ OriT ,Tra Genes-‬וגנים כרומוזומליים‪.‬‬
‫הפלסמיד הזה מסוגל לבצע את הפעילות של פלסמיד‬
‫‪ F‬המקורי – הוא עדיין קטן מספיק כדי לעבור‬
‫בתהליך קוניוגציה‪ .‬המעבר השלם אומר שהחיידק‬
‫המקבל של ’‪ F‬יהיה בעצמו חיידק קוניוגטיבי ’‪;F‬‬
‫מעבר לכך‪ ,‬הוא יכיל באופן קבוע את הגנים שהועברו מהכרומוזום על גבי הפלסמיד ’‪ – F‬הגנים האלו‬
‫יהיו בחיידק באופן יציב ומשתכפל‪ ,‬ויוכלו להיות מועברים הלאה גנטית‪ .‬המצב הזה הוא מרודיפלואידי‬
‫יציב‪ .‬המרודיפלואידיות היציבה מאפשרת מחקרים של ציס‪-‬טראנס ודומיננטיות‪-‬רצסיביות בגנים של‬
‫חיידקים‪ ,‬כמו שעשו במציאת מודל האופרון – אלו לא שאלות של מיפוי גנטי אלא של יחסי גומלין בין‬
‫גנים ותוצרי גנים שלא ניתן לבצע במצבו ההפלואיד של החיידק הרגיל‪.‬‬
‫סיכום‬
‫‪F+‬‬
‫החומר הגנטי העובר‬
‫פלסמיד ‪F‬‬
‫המצב של החומר הגנטי‬
‫פלסמיד‬
‫התוצר של ‪F-‬‬
‫קוניוגטיבי עם ‪F+‬‬
‫‪HFR‬‬
‫’‪F‬‬
‫גנים ראשונים של‬
‫פלסמיד ’‪ ,F‬מכיל את‬
‫הפלסמיד ‪ +‬גנים‬
‫כל פלסמיד ‪ F‬ונגים‬
‫כרומוזומלים ללא ‪.Tra‬‬
‫כרומוזומלים‪.‬‬
‫לינארי‬
‫פלסמיד‬
‫מרודיפלואיד ארעי‪,‬‬
‫מרודיפלואיד קבוע‪,‬‬
‫ללא יכולת קוניוגטיבית‪ .‬בעל יכולת קוניוגטיבית‪.‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקטריופאג'ים‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקטריופאג'ים‬
‫‪127‬‬
‫בקטריופאג'ים הם וירוסים של חיידקים‪ .‬לרוב מאופיינים במבנה‬
‫"רגליים" המהווה רצפטורים המזהים את החיידק הספציפי אותו‬
‫יכול הפאג' להדביק‪ .‬מספר הפאג'ים עולה על מספר חיידקים בסדר‬
‫גודל אחד לפחות‪ ,‬ויש שהגדירו אותם בתור "הניסוי המוצלח‬
‫ביותר של הטבע"‪.‬‬
‫לפני כ‪ 30-‬שנים התחבטו בשאלת הסיווג הסיסטמטי של הפאג'ים‬
‫בפרט והוירוסים בכלל‪ .‬הסיווג המקובל נקבע על ידי דייויד‬
‫בולטימור‪ ,‬זוכה נובל מתחילת שנות ה‪ 70-‬עבור גילוי ה‪ RT-‬של‬
‫הרטרו‪-‬וירוסים‪ .‬בולטימור מגדיר משפחות וירוסים לפי סוג הגנום ואסטרטגיית השיכפול‪ .‬הגנום יכול‬
‫להיות ‪ RNA‬או ‪ ,DNA‬חד גדילי או דו‪-‬גדילי; אסטרטגיית השיכפול קובעת האם חד גדיל הוא ‪+‬‬
‫)‪ (sense‬או – )‪ ,antisense‬גדיל קומפלמנטרי(‪.‬‬
‫שימו לב שכאשר הגדיל הוא ‪ +‬סימן שהוא נראה לחלוטין כמו ה‪ .mRNA-‬אם זהו ‪ RNA‬ולא ‪DNA‬‬
‫משמעות הדבר היא שלא ניתן להתחיל לתרגם אותו מכיוון שאז ייצא החלבון הקומפלמנטרי‪.‬‬
‫מחזור הרפליקציה‬
‫מחזור הרפליקציה של פאג' מתחיל בהיצמדותו לחיידק‪ ,‬הזרקה של החומר הגנטי לחיידק – לא כל הוירוס‬
‫נכנס לחיידק‪ .46‬מנגנוני החיידק מתחילים לסנטז חומצות גרעין וחלבונים של הוירוס‪ ,‬הויריונים מורכבים‬
‫בתוך התא עד שהם פורצים מתוכו החוצה – לרוב בתהליך של ליזיס‪.‬‬
‫זהו מחזור חייהם של וירוסים ליטיים; שיש וירוסים שיודעים להיכנס בצורה מורדמת – להעביר את‬
‫הגנום באינטגרציה לתוך כרומוזום החיידק‪ .‬מצב זה מכונה פרופאג' שיכול להתקיים דורות רבים של‬
‫החיידק במצב רדום‪ .‬זוהי דרך נוחה להמשיך את קיומו של הוירוס – שהוא במהותו חומצת הגרעין בלבד‬
‫– בצורה שקטה ולא אלימה‪.‬‬
‫במצב זה‪ ,‬המכונה ליזוגני‪ ,‬הפרופאג' ממשיך להתרבות עם החיידק עד לאינדוקציה‪ ,‬המתרחשת באירוע‬
‫קטסטרופה ההופך את החיידק למאחסן פחות טוב‪ .‬הוירוס נוטש את החיידק על ידי חזרה למסלול הליטי‪.‬‬
‫פאג' ‪ – T4‬פאג' זה הוא פאג' ליטי אובליגטורי )ללא מצב ליזוגני(‪.‬‬
‫‪ 46‬בשונה מוירוסים אנימלים בהם לכל הפחות הקאפסיד נכנס לחיידק בשלמותו‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪128‬‬
‫תזמון השיעתוק של הגנים‬
‫הגנים של החיידק מתחלקים לגנים מוקדמים‪ ,‬אמצעיים ומאוחרים כאשר הגנים המוקדמים מכינים את‬
‫הקרקע לתחילת תהליכי היצירה של הויריונים‪ ,‬על ידי סינטזה של חומצות גרעין למשל; הגנים האמצעיים‬
‫מסנטזים את הקאפסיד לרוב; והגנים המאוחרים הם הגנים הליטיים שגורמים לפיצוץ‪.‬‬
‫הפאג' הוא מעין "לגו" – חלקים מורכבים אחד על השני ונארזים יחד‪ .‬רוב הפאג'ים יודעים לארוז את‬
‫החומר הגנטי של עצמם – מנגנון האריזה יודע לזהות את חומצת הגרעין של עצמו‪.‬‬
‫תהליך הטרנסדוקציה הכללית‬
‫תהליך זה הוא תהליך שכיח של‬
‫העברת חומר גנטי מתורם למקבל על‬
‫ידי פאג'ים‪ :‬בתהליך זה יש פאג'‬
‫שמדביק חיידק‪ ,‬מכניס חומצות גרעין‪,‬‬
‫מתרבה‪ ,‬נארז ועומד לפוצץ את התא;‬
‫אלא שכאן קורה דבר חריג‪ :‬בעוד‬
‫שלרוב‬
‫הפאג'ים‬
‫יש‬
‫סלקטיביות‬
‫לחומצות הגרעין של הוירוס‪ ,‬פאג'ים‬
‫בודדים אינם אורזים את חומצות‬
‫הגרעין של הפאג' אלא חתיכת ‪DNA‬‬
‫של המאחסן שהיא מאותו להגודל‪.‬‬
‫תהליכים אלו קורים לרוב במסגרת ‪ headfull packaging‬שאורזים כל חתיכת גרעין שגודלה מתאים‬
‫למילוי הקאפסיד‪ .‬הזיהוי בשיטה זו מתבסס על כך שגנום שלם עצום ביחס לגנום של פאג'‪ .‬יחד עם זאת‪,‬‬
‫בזמן ההתרבות הפאג' גורם לפרגמנטציה של גנום המאחסן – היכולות המטאבוליות של החיידק‬
‫משועבדות לוירוס ואם חתיכה שבורה של גנום החיידק נארזת בוירוס ייתקבל ויריון שמכיל חתיכת‬
‫‪ DNA‬כרומוזומלית‪.‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫שיעור ‪ :17‬בקטריופאג'ים‬
‫‪129‬‬
‫כאשר המאחסן הזה יתפוצץ הוא ישחרר וירוסים רבים; רובם יהיו ‪ ,WT‬לא רלוונטים לדיון בהכלאות‪ .‬מי‬
‫שכן רלוונטי הוא הפאג' הטרנסדוקטיבי – פאג' כלפי חוץ שהקאפסיד והמבנה שלו יודעים להזריק חומר‬
‫גנטי; אולם החומר הגנטי המוזרק הוא ‪ DNA‬שמקורו בחיידק הראשון שהודבק על ידי הפאג' –‬
‫החיידק התורם‪.‬‬
‫המקבל כעת במצב מרודיפלואידי ארעי‪ ,‬כמו ב‪ .HFR-‬אם בין התורם למקבל ליש קשר משפחתי )מה‬
‫שלרוב נכון כי פאג' מדביק חיידקים באופן מאוד ספציפי(‪ ,‬ריקומבינציה יכולה להביא לשיחלוף‬
‫אינפורמציה בין החיידק התורם למקבל ולקבלת צאצאים שעברו שינוי פנוטיפי )טרנסדוקטנטים(‪.‬‬
‫כיצד ניתן לאתר את התופעה הזו בלי שהויריונים התקינים יהרגו את זה שיודבק על ידי הפאג'‬
‫הטרנסדוקטיבי? צריך לדעת לעשות את הניסויים האלה‪ :‬עושים אותם ביחס נמוך של פאג'ים לחיידקים‪ ,‬על‬
‫מצע מוצק‪ ,‬כך שניתן יהיה למצוא את החיידק שהודבק על ידי הפאג' הטרנסדוקטיבי‪.‬‬
‫משמאל‪ :‬התורמים הם ‪ Trp+‬והמקבלים ‪.Trp-‬‬
‫התורמים מודבקים בפאג'ים‪ ,‬ורובם אורזים גנום‬
‫וירולוגי; אחד מהם אורז את הגן של ‪ .Trp+‬כעת‬
‫מדביקים את המקבלים בוירוסים שהתקבלו מהחיידק‬
‫התורם וזורעים את כל התערובת על מצע ללא‬
‫טריפטופן‪ .‬הויריונים הרגילים מדביקים חיידקים אך‬
‫לא יכולים להתרבות‪ ,‬כי לתא עצמו אין יכולת לייצר‬
‫טריפטופן; רק החיידק שהודבק על ידי הויריון עם‬
‫הגן התקין ‪ Trp+‬יוכל להתרבות‪.‬‬
‫סטטיסטית‪ ,‬אלו אירועים מאוד נדירים; בפועל‪ ,‬מכל‬
‫חיידק יוצאים ‪ 100‬פאג'ים חדשים והניסוי נעשה‬
‫במיליונים של חיידקים – כלומר מיליארדים של‬
‫פאג'ים‪ .‬המספרים הגדולים עוזרים להתקבל על מחסום‬
‫הנדירות של התופעה‪.‬‬
‫הטבלה מספקת מידע בנוגע לשני הפאג'ים שלרוב‬
‫משמשים טרנסדוקציה‪.‬‬
‫תדירות קו‪-‬טרנסדוקציה‬
‫הפאג'ים הטרנסדוקטיבים אורזים את הגנום החיידקי‬
‫באופן אקראי; ידוע מניסויי קוניוגציה מהו הסדר‬
‫היחסי של הגנים‪ ,‬אך לא ידוע מהו המרחק בין הגנים‪.‬‬
‫שיטה זו מאפשרת קביעה יחסית מדויקת של‬
‫המרחקים‪.‬‬
‫ניתן לבדוק קו‪-‬טרנסדוקציה – העברה בו זמנית של‬
‫סמנים קרובים על ידי פאג'ים‪ .‬ככל שהגנים קרובים‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬
‫חמוטל בן דב‬
‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬
‫‪130‬‬
‫יותר‪ ,‬הסיכוי שיימצאו בחתיכת אחת בת ‪ 100‬קילובסיסים יותר גדול; אם המרחק גדול מ‪100-‬‬
‫קילובסיסים הגנים לעולם לא יעברו יחד‪.‬‬
‫כך ניתן לשלב את הנתונים‪ :‬מה אחוז הטרנסדוקטנטים שעבר אליהם סמן אחד וגם סמן שני; גן שנמצא‬
‫בין שני גנים רחוקים יכול לעבור עם כל אחד מהם אך שני הגנים הרחוקים לעולם לא יעברו יחד‪ .‬ככל‬
‫שהגנים קרובים יותר תדירות הקו‪-‬טרנסדוקציה יותר גבוהה‪.‬‬
‫נניח שיש שלושה גנים – ‪ .Pro, Lac & Arg‬נניח שמתוך ‪ 100%‬טרנסדוקטנטים של ‪ ,Lac‬התקבלו ‪40%‬‬
‫שהיו קו‪-‬טרנסדוקציה עם ‪ Arg‬ו‪ 60%‬קו טרנסדוקציה עם ‪ .Pro‬ניתן להבין ש‪ Pro-‬קרוב יותר ל‪Lac-‬‬
‫מאשר ‪ ,Arg‬אבל איך ניתן לדעת אם ‪ Pro & Arg‬הם מצדדים מנוגדים או לא? ניתן לבדוק קו‪-‬טרנסדוקציה‬
‫של שניהם – אם הם מאותו צד הם יהיו בשכיחות גבוהה מ‪ ,60-‬אם מצדדים מנוגדים יהיו פחות מ‪ 40-‬ואם‬
‫יהיו במרחק יותר מ‪ 100-‬קילובסיסים יהיה שכיחות ‪.0‬‬
‫טרנסדוקציה מתמחה – ליזוגניה‬
‫פרופאג' במצב ליזוגני‪ ,‬כאשר מתחילה קטסטרופה‬
‫במאחסן‪ ,‬יכול לצאת החוצה ולהתחיל מסלול ליטי;‬
‫אולם הוא יכול גם להיפלט החוצה מהכרומוזום עקב‬
‫אירוע ריקומבינציה‪ .‬שני אלמנטי ‪ IS‬משני צידי‬
‫הגנום של הפרופאג' יכולים להוציא החוצה‬
‫"פלסמיד" עם הגנים של הפאג'‪ ,‬אשר לרוב ייכלול‬
‫גם גנום כרומוזומלי‪ .‬כאשר הגנום ייארז הוא יכיל‬
‫חלקית כרומוזום של החיידק התורם; אם הגנום ייכנס‬
‫במקביל למצב ליזוגני ייתקבל מצב מרודיפלואידי‬
‫יציב בחיידק המקבל‪ ,‬כי הפאג' לקח את חתיכות ה‪-‬‬
‫‪ DNA‬הקרובות לאתר האינטגרציה שלו‪.‬‬
‫לכל פאג' יש אתר אינטגרציה אחד במצב ליזוגני; לכן תמיד הטרנסדוקציה של פאג' ליזוגני מסויים תהיה‬
‫מוגבלת לאיזור הגנטי שקרוב לאתר האינטגרציה‪ .‬חיידקי ’‪ F‬יותר מגוונים כי מקורם ב‪ ,HFR-‬שיכולים‬
‫להיכנס באופן אקראי יחסית בגנום וליצור ’‪ F‬של אותו איזור‪ .‬יחד עם זאת בשני המקרים הגדילים של‬
‫הכרומוזום היוצאים ועוברים לדיפלואידיות יציבה קטנים מאוד ולא מאפשרים מיפוי כמו שהם‬
‫יכולים לאפשר מחקר דומינטיות או מסלולים רגולטורים‪.‬‬
‫טרנסדוקציה כללית‬
‫הגנים העוברים‬
‫האירועים‬
‫חמוטל בן דב‬
‫כל אחד מהגנים יכולים לעבור‬
‫נדירים‪ ,‬עובדים בתנאים‬
‫סלקטיביים‪.‬‬
‫טרנסדוקציה מתמחה‬
‫גנים קרובים לאתר האינטגרציה‬
‫של הפאג' בלבד‪.‬‬
‫האירועים מאוד נדירים כי‬
‫מתבססים גם על ריקומבינציה‬
‫וגם על מעבר של גודל מסויים‪.‬‬
‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬