שיעור מיקרוביולוגיה 1 - 82 פרופסור איתי בנהר המרצה : לא הביולוגים יוצרי
מיקרוביולוגיה -שיעור1 82 שיעור :12מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית המרצה :פרופסור איתי בנהר הגנטיקה גנטיקה קלאסית הגנטיקה של מיקרואורגניזמים מבוססת על פנוטיפ ,לרוב של מוטנט .לא הביולוגים יוצרים את המוטנט, אלא שינוי ספונטני ואקראי .כאשר הביולוגיה יוצרת את המוטגנזה הדבר נכנס תחת הגדרה אחרת. הגנטיקה הקלאסית חוקרת תפקוד ופונקציות על ידי מוטנטים שנגזרו מהיצורים המקוריים הנחשבים .WTהמוטנטים מלמדים על הפונקציות ,התפקודים ,המסלולים המטאבולים והמערכות הביולוגיות. תחילה מבצעים מיפוי מוטציות על ידי שימוש בהכלאות – העברת DNAבין פרטים על מנת למצוא היכן נמצאת המוטציה .המיפוי נעשה על ידי רמות שונות של רזולוציה. גנטיקה מולקולרית השיטות הקלאסיות של מיפוי גנטי הכרוכות בהעברת DNAבין חיידקים והסתכלות על הפנוטיפ היו שיטות גסות :הן מיפו את לוקוס המוטציה בדיוק של כמה ,Kbללא זיהוי נקודתי .היכולת לזהות את המיפוי המדוייק התרחשה עם לידת הגנטיקה המולקולרית שאיפשרה ריצוף וסינטזה של DNAוהחדרת DNAמלאכותי לחקירת מוטציות מלאכותיות ומכוונות. הגנטיקה התקדמה ממדע המבוסס על תצפיות ליכולת להשפיע על התצפיות ,על המוטנטים הנחקרים ומיפוי המוטציות הנחקרות. בעידן הפוסט-גנומי בו ריצוף גנום חיידקי היא עניין של מה בכך ,נרכשה היכולת למחקר בהסתכלות שיטתית ,אשר למעשה במקום מסויים מעיבה על ההבנה :היכולת הפשוטה לריצוף הופכת את הבנת התנהלות תהליכים פנוטיפים מוטנטים למוגבלת יותר מכפי שהייתה כאשר הכלים היו מוגבלים בעומק ההסתכלות והרזולוציה שלהם. גנטיקה הפוכה בתוך הגנטיקה נכנס גם תחום של – Reverse Geneticsבה תחילה משבטים גן מסויים ,כאשר היכולת להכיר גן ואת מסגרת הקריאה שלו היום פשוטה יותר ,להחזיר את הגן עם מוטציה לחיידק ולבחון את הפנוטיפ .בצורה זו למעשה הולכים הפוך לגנטיקה הקלאסית :כאן יוצאים מהמוטנט ובודקים מהו הפנוטיפ שלו ,במקום לראות פנוטיפ ולהבין מהי המוטציה שגרמה לו. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :12מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית 83 גנטיקה מיקרוביאלית גנטיקה של מיקרואורגניזמים ,בדגש על חיידקים )ללא שמרים ,שהם אאוקריוטים( ,כאשר היתרונות של חיידקים הם היכולת לתירבות והקלות בביצוע מניפולציות גנטיות. אלו הגדרות כלליות ולא נכונות לאור ההבנות הנוכחיות של המיקרוביולוגיה .הן ניתנו בזמנים בהם לא הובן שהיכולת לתרבת חיידק אינה דבר של מה בכך – היום ניתן לתרבת פחות מ 1%-מצורות החיידקים הידועות שנמצאות בטבע. מגבלה נוספת בתירבות חיידקים היא העבודה שמסתכלים על היצור בתנאים שאינם קרובים לתנאים בהם הוא חי ומתפקד בטבע – סביבות הטרוגניות ,לא לבד; למעט בנישות אקולוגיות ייחודיות ונדירות בהן יש קולטי אלקטרונים לא מקובלים או ריכוזי בסיס גבוהים .החיידקים נמצאים במצב של תחרות כבדה ,של מחסור נוטריינטים )ולא השפע המסופק להם במעבדה( .תנאי המעבדה אינם משקפים את מצבו הטבעי של החיידק. היכולת למניפולציה גנטית גם היא אליה וקוץ בה :המניפולציה הגנטית ,בעיקר הכנסת DNAזר לחיידקים לצורך שינוי הפנוטיפ שלהם ,ניתנת לביצוע במספר מוגבל של חיידקים .חיידק הE.coli- נחקר מאוד וקל למניפולציה וכך גם עוד כמה חיידקים ,אך ברוב החיידקים לא ניתן לעשות זאת .הדבר בעייתי כי המיקרוביולוגיה היום אינה עוסקת בפנוטיפים אלא בתקשורת בין גנומים למשל. בחיידקים שלא ניתן לגרום למניפולציות ניתן לבודד גנים ולהעביר אותם לחיידקים שניתן לחקור אותם; ניתן להשתמש שוב במוטגנזה האקראית; וניתן ללמוד חיידק דומה ,מאותה משפחה ,שלו כן ניתן לעשות מניפולציות גנטיות. מדוע יש שיטות שעובדות בחיידק אחד ולא באחר? שיטות כמו טרנספורמציה למשל יכולות לעבוד רק אם הפלסמיד המוחדר יכול לעבור שיכפול בחיידק; במרבית החיידקים ,גם המתורבתים ,לא ידועים עדיין הפלסמידים אשר יוכלו להיות משוכפלים בהם. מוטנטים יכולים להיות שונים מה WT-באופן מובחן .ההמתנה למוטנט המתאים שייווצר באופן אקראי יכולה לארוך זמן רב ,אך שיטות למוטגנזה אקראית מגבירות אותו .היכולת להמשיך ולחקור את המוטציה תלויה ביכולת להמשיך ולעשות הכלאות אשר יאפשרו לחקור את מקור הפנוטיפ המובחן. חיידקים כמודלים לגנטיקה • הפלואידיות – כל גן מופיע בגנום פעם אחת )למעט שינויים מכוונים מלאכותית או אקראיים עקב העברה הוריזונטלית( .מכיוון שכך ,הפנוטיפ מופיע באופן ישיר – אין מצבי הטרוזיגוטיות בחיידקים ושאלות של דומיננטיות או רצסיביות לא מופיעות בחיידקים. • זמן דור קצר – הכפלה בינארית מהירה מאוד .ב E.coli-מזן הבר 28מתרחשת מדי ) 20למרות שיש זנים המכפילים עצמם בתוך 40דקות( .מכאן שניתן לקבל בתוך שעות ספורות כמות אדירה של פרטים ולהבחין בשינוי גנטי ופנוטיפי בניסויים שאורכים שעות/ימים 29ולא שבועות/חודשים. " 28זן הבר" הוא מונח אמורפי שכן קשה לדעת האם הוא מתייחס לחיידק מהמעי או לחיידק שנמצא במעבדה. 29אין זה נכון לכל חיידק – חידק השחפת ) (mycobacterium tubercolosisיוצר מושבה על אגר בין 7-10ימים ,שכן ההכפלה אורכת 2-3שעות .מסיבה זו מיקובקטריה פחות נוחים למחקר גנטי והמחקר בהם מתוכנן אחרת על מנת לעמוד במגבלותיהם. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 84 • חלוקה א-מינית – שני הצאצאים של חיידק מתחלק זהים גנטית להורה .יציבות גנטית זו נותנת בסיס השוואתי נוח .יש לזכור כי אלו הגדרות כלליות -גם היציבות הגנטית נכונה ברוב המקרים אך לא באופן גורף ומוטציות מתרחשות גם באופן ספונטני – קצב ההתרחשות הספונטני מאוד איטי וקשה לסמוך עליו למחקר גנטי במוטנטים ,אך הוא קיים. מימדים של חידקים התא הצהוב הוא תא אאוקריוטי שמימדיו הם כמה מיקרונים .הגרעין מסומן בירוק ,ובכתום מופיע חיידק מתג – כ 2-מיקרון אורכו ומיקרון אחד רוחבו. וירוסים ,כמו הבקטריופאג'ים ,הם בגודל ננומטרי וגם להם חשיבות לדיון בגנטיקה מיקרוביאלית ככלים להעברת DNAבגנטיקה מיקרוביאלית. גנומיקה של חיידקים המדע כיום נשלט על ידי הדוֹגמה המרכזית – המתייחסת לרמות שונות של איחסון ושימוש באינפורמציה הגנטית .ידוע שהאינפורמציה נשמרת ב ,DNA-משועתקת ל RNA-כמידע זמין ומתורגמת לחלבונים. קיים מעבר מ RNA-ל DNA-על ידי reverse transcriptionבוירוסים ומעט גם בחיידקים .הRNA- משמש לביטוי האינפורמציה הגנטית ,למרות שיש וירוסים רבים שהגנום שלהם הוא גנום של RNA )רטרו-וירוסים( .האינפורמציה מועברת הלאה לחלבונים ,המוציאים לפועל של הפונקציות התאיות .טרם אותר התהליך ההפוך לתרגום – היכולת להפוך רצף חלבון לרצף ,RNAלמרות שהיום ניתן לקבוע רצף מלא של חלבון ולסנטז מלאכותית גן שיתורגם לחלבון הזה. בתהליך Edman degradationניתן היה להוריד חומצות אמיניות בקצה Nשל חלבון על מנת לקבוע את הרצף שלהן .היום יש שיטות מורכבות יותר כמו Mass-spectrometryוTandem-Mass-- Spectrometryהמזהות חלבונים מתחילתם ועד סופם. חיידקים גם מקיימים את הדוֹגמה המרכזית .האיור מדגים כיצד כאשר הגנטיקה כמקצוע עברה אבולוציה והכלים התפתחו גם ההסתכלות התפתחה :מזה 10- 15שנים אנו נמצאים בעידן ה– "omics"- ההסתכלות הכוללנית על תכולת היצור ולא הסתכלות פרטנית. עידן ה"אומיקות" לפני כמה עשרות שנים ההסתכלות הייתה פרטנית וקריירה שלמה הייתה יכולה להיות מוקדשת לחקר של גן אחד או מסלול מטאבולי אחד – כי הכלים היו פשוטים וההסתכלות מוגבלת .ניתן היה להסתכל על חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :12מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית 85 מוטנט ,פנוטיפ שהוא תוצר שינוי בגן בודד על פי רוב ,לבחון שינויים ברמת RNAשל הגן הבודד שמעניין – למשל קביעת זמן מחצית החיים של ה ,RNA-יציבות בשיטות נורת'רן ,ניסויי primer extensionלקביעת השיעתוק וכדומה .בסופו של דבר המטרה הייתה חקר מערכת אנזימטית ,בידוד האנזים והחלבון וקבלת תובנות על תפקודו של החלבון בפני עצמו. בעידן ה "omics"-יכולת ההסתכלות על תופעות המובאות למחקר מורכבת יותר :ניתן לחקור חיידקים לא כפרטים אלא כאוכלוסיות מורכבות יותר ופחות ,כולל השגת תובנות בנוגע לחיידקים שלא ניתן לתרבת .מבחינת הגנומיקה ,ניתן לרצף גנים ולהכיר את רצף ה.DNA- מתוך הידע הזה לא עולה כל רצף הגנים או תפקיד הגנים; אפילו ב E.coli-לא ידוע עדיין מה עושה כל מסגרת קריאה או קטע שידוע שניתן לתרגום. כאשר יודעים שיש RNAשבא לידי ביטוי ,גם אם הרצף מוכר ,אין זה אומר שהפעילות תהיה מוכרת. הצורך להבין את התפקוד מכונה .annotationהגנומים המפוענחים ברובם לא עברו אנוטציה – לא ידוע מהי הפונקציה שלהם .יחד עם זאת ,היכולת הגנומית מאפשרת להסתכל על גנומים שלא תורבתו – לבודד גנומים מנישה ,לרצף אותם ולנתח אותם .פעולה זו – מטא-גנטיקה – לא מאפשרת לרצף גנומים שלמים של אורגניזמים ,שכן כל דגימה יכולה להיות מורכבת מעשרות אלפי יצורים שונים והריצוף הגנטי מפענח אותה ביחידות קצרות וישנה בעיה בהרכבה של החתיכות ליצירת גנומים שלמים ,גם בחיידקים .יחד עם זאת ההסתכלות הזו חשובה להתחקוּת על מסלולים מטאבולים ופוטנציאל מטאבולי – למשל לצורך פירוק צלולוז ,תאית ,שיש לו פוטנציאל אנרגטי כאנרגיה ירוקה שתחליף את הפחם והנפט.30 כל ההסתכלויות הכוללניות של האומיקות הן הסתכלויות השוואתיות; המטאגנומיקה ניגשת לסביבה על מנת ללמוד את המגוון הגנטי שיש בתוכה ,גם אם אין יכולת לדעת מה תפקיד כל חתיכת DNAנוכחת או מיהו היצור ממנו באה חתיכת הגנום .המטא-גנומיקה מפיקה משפחות של גנים ומאפשרת השוואה בדגימת הנישה האקולוגית במצבים שונים.31 השוואה ב"אומיקות" בהסתכלות הגנומית החלק ההשוואתי אינו הדומיננטי – המחקרים נעשים על מנת לקבל מידע על העושר הגנטי .יחד עם זאת בירידה לרמת הגן בטרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה מתייחסים יותר לנקודות ההשוואתיות. כאשר מבודדים מולקולה בודדת בגנטיקה קלאסית של גן מסויים ,מנסים להבין את תכונותיה של המולקולה – אורך חייה ,אורך החלבון ,מבנה החלבון ,יחסי מבנה-תפקוד .בהסתכלויות של אומיקות הדבר שונה :כלל ה mRNA-נדגם מהיצורים ומופעל אחד ממספר כלים שיראה כיצד הגנים עולים או יורדים כתוצאה משינויים סביבתיים. 30מחקר דוגמה שכזה הוא הכרס ) (rumenשל הפרה המכיל חיידקים המתסיסים את הצלולוז ומסייעים בפירוקו .בידוד של חיידקים אלו יכול אפשר לזהות גן שייעל את התהליכים האלו לעומת האופן בו הם מתנהלים היום. 31בפרות למשל ניתן לשנות את הדיאטה – פרות בתעשיית החלב ניזונות ממזון עתיר אנרגיה כמו גרעיני תירס או חיטה ואחוז מסוים של עשב או חציר .שינוי הדיאטה מביאה לאדפטציה של אוכלוסיית חיידקי הכרס ,כך שהיחסיות של האוכלוסיות תגייס את כלל האוכלוסיה לניצול מיטבי של הדיאטה החדשה .דגימת פרה שאוכלת חציר בלבד ופרה שאוכלת גרעיני תירס תראה כיצד הנישה אקולוגית מתאקלמת לשינוי שהושרה באופן מלאכותי. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 86 ההסתכלות על השינויים נעשית בשני כלים עיקריים microarray :בו משתמשים ב RNA-בתור גלאי ואז שימוש בצ'יפ במערך מסודר של מולקולות שמייצגות את הגנים .בניסוי היברידיזציה ועוצמת הסיגנל על כל נקודה בצ'יפ ניתן לנסות להבין את רמת הביטוי של הגן בתנאים בהם נדגם ה ;RNA-אם הRNA- נדגם בחיידקים שגדלו בטמפרטורות שונות ,מקורות תזונתיים שונים או עקות שונות – כל שינוי מביא לירידה ברמת הביטוי של גנים שפחות נחוצים במצב החדש ועלייה ברמות הביטוי של גנים הנחוצים להתמודדות יעילה עם התנאים החדשים .היברידיזציה על הצ'יפ תאפשר לגלות מה עלה ומה ירד ולהבין איך החיידק כמערכת הגיב לשינוי הסביבתי אליו נחשף. טכנולוגית המיקרואראי המיקרואראי פותחו לפני 10-15שנה .בשנים האחרונות ,תודות לטכנולוגיית הריצוף ,פותח כלי חדש המחליף את השיטה – .RNA SEQהשיטה מרצפת את ה RNA-אך במקום לעשות היברידיזציה עושים ) reverse transcription (RTשמספק רצפי DNAבשכיחות המייצגת את שכיחות ה RNA-בחיידק. שתי השיטות מבוססות הכרת הגנומים של היצור הנחקר. במטאגנומיקה אין זה כך; טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה מופעלות על יצורים בודדים ובודקות את ההתמודדות שלהם עם שינויים מלאכותיים. פרוטאומיקה ברמת החלבון ,הפרוטיאומיקה באה לזהות את כל חלבוני החיידק מחד ולראות איך רמת הביטוי של החלבונים משתנה כתגובה לשינויים סביבתיים מאידך .הדרך הותיקה למחקר זה )למעלה מ 40-שנה( היא הרצת ג'ל דו-מימדי 32של חלבונים .לשיטה זו שני שלבים: • בשלב הראשון מפרידים את החלבונים בג'ל המבוסס תחילה על הנקודה האיזואלקטרית על ידי גרדיינט – pHהחלבונים לא נודדים לפי גודל אלא לפי הנקודה האיזואלקטרית .מתקבל טור יחיד של חלבונים. • את הטור הזה חותכים ומשכיבים על ג'ל SDSרגיל .כעת כל חתיכה רצה שוב במימד נוסף ומופרדת לפי גודל – מכאן שביצענו שתי הפרדות .התוצר מכונה "טביעת אצבעות של החיידק". כאשר מבקשים לדעת מהי הכמות של החלבונים ,הזהות שלהם והשינוי שנעשה בהם כתוצאה משינויים סביבתיים ,כדי לאתר נקודה ניתן לעשות אנליזות פרוטאומיות על מוטנטים – עבודה נרחבת נעשתה על מוטנט להכרת המוטציה שלו ואז ערכו ג'ל דו-מימדי על חלבוני ה WT-לעומת המוטנט ובדקו אילו נקודות נעלמות במוטנט .בצורה כזו ניתן לדעת שהחלבון שנעלם קשור למסלול הפנוטיפ המוטנט .לא ניתן לקבל כאלה אנליזות למוטציות ליתאליות – כמו RNAפולימראז. ההפרדה הדו-מימדית רגישה מספיק כדי להפריד בין חלבונים מאוד דומים – אפילו בהבדלים של חומצת אמינו אחת ,ניתן לקבל שורה של נקודות באותו גודל ) (SDSאך נקודה איזואלקטרית שונה ולכן הן יהיו 32באנליזה חד מימדית ,בה מריצים חלבונים בג'ל SDSלצד מרקר שמסמן את הגודל של המולקולות ,נקבל הרבה בנדים שונים .ההסתכלות אינה ברזולוציה גבוהה מספיק להבחין בכל חלבוני החיידק ולכן פותחה שיטת הג'ל הדו-מימדי – .2D Gel חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :12מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית 87 מוסטות מעט .ניתוח הכמות מתאפשר על ידי בדיקת עובי הנקודה – ככל שיש יותר מהחלבון הנקודה גדולה יותר. היום התהליך נעשה באופן אוטומטי וזיהוי מוחלט של הנקודות בלי הכרת מוטנטים :רובוט לוקח כל נקודה ,עושה לה אנליזת Mass spectrometryומזהה את החלבון .כעת ניתן לחזור לפרוטאום ולערוך אנליזות בין חיידקים מסביבות שונות. • • ההסתכלות של הפרוטאומיקה נעשית על ידי הסתכלות של אוכלוסיית חיידקים טהורה. Mass Spectrometryמפרידה חלבונים על פי מסה ומטען בדיוק של אטומים בודדים .האנליזה מספקת אוסף של מסות מאיכול פרוטאוליטי של החלבון ,והמחשב יודע לזהות את החלבון מתוך נתוני הגנים. הטרנסקריפטום והפרוטאום מאפשרות להסתכל כלל-מערכתית על אוכלוסיה של פרטים זהים; יש לזכור כי כמו שלא ניתן לעשות מטא-פרוטאומיקה כי עוצמת הכלי לא חזקה מספיק לתובנות כאלו ,גם לכלים האלה יש מגבלות – בין אם בגלל הגדלים ובין אם בגלל שכיחויות. מולקולות מסויימות של RNAאו חלבון יכולות להימצא בכמויות גדולות מאוד או קטנות מאוד .בג'ל דו מימדי ניתן לראות חלבונים שכיחים יחסית – הנדירים ביותר מתחת לכושר הרזולוציה שלנו .לכל שיטה אנליטית מספר מגבלות והתשובה לעולם לא מלאה לחלוטין. כלים בגנטיקה בקטריאלית בתחילת העידן הגנטי ,הכלים הפשוטים ביותר היו מוגבלים מאוד:33 • גידול מושבות על צלחות אגר והיכולת ל.Replica Plating- • היכולת לטיהור מושבות על ידי מיהול וזריעה מחדש ,כולל הפעלת מצעים סלקטיבים .צריך טיהור מושבות כי בכל דגימת סביבה מתקבלות מאות רבות של אוכלוסיות של מיקרובים – כולל פטריות ועובשים – הנזרעים בצפיפות מאוד גבוהה .מיהול הדגימה יסייע לקבלת מושבות מבודדות.34 הגנטיקה דורשת תבדידים מופרדים היטב .כלי המיהולים הסדרתיים משמש להפקת מושבות מבודדות. • כלים של סלקציה והעשרה – שתי דרכים המאפשרות לצאת מאוכלוסיה הטרוגנית לאוכלוסיית החיידקים המבוקשת .שתיהן מבוססות על מתן יתרון לחיידק המבוקש על פני המתחרים לו – כאשר סלקציה לרוב נעשית במצע מוצק והעשרה במצע נוזלי .הסלקציה הקלאסית ביותר נעשית על ידי דגימת סביבה הנזרעת על צלחת עם אנטיביוטיקה – רוב החיידקים בדגימה לא יהיו עמידים וימותו, אך החיידקים העמידים יבודדו ,יצמחו בצלחת וייתנו מושבה .לעומת זאת ,העשרה תיעשה במצע נוזלי – הדגימה תוכנס לבקבוק עם מצע מינימלי שמקיים חיידק פרוטוטרופ ונפט )למשל( כמקור פחמן יחיד .בצורה זו מחפשים חיידקים המפרקים את הנפט ,ולהם ניתן היתרון.35 33יש לזכור למשל במודל האופרון כמה מדהים היה להעלות את המודל הזה כשכל הכלים שעמדו לרשות החוקרים היו צלחות אגר ומושבות לבנות או כחולות. 34מושבת חידקים על צלחת אגר מתחילה מחיידק בודד – המושבה היא קלונלית וכל החיידקים זהים גנטית )בערבון מוגבל( אחד לשני. 35זיהוי חיידקים כאלה מאפשר ביו-רמידיאציה לטיפול בשפכי נפט גולמי ,למשל. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 88 • היכולת לאחסן את החיידקים לזמן ממושך – יש חיידקים ,בעיקר גרם חיוביים ,שעוברים ספורולציה המסוגלות לחיות לזמן ממושך ללא תנאים מיוחדים .כאלה שלא עושים זאת מאוחסנים במלאי מוקפא. שיחלוף גנטי כבר מתקופת הגטיקה הקלאסית זוהו שלוש שיטות לשיחלוף גנטי בין חיידקים: • טרנספורמציה – קליטת DNAעירום מהסביבה ואינקורפורציה של המידע לגנום החיידק המקבל. התורם מתפרק ,מתפוצץ וה DNA-שלו נשפך החוצה .ה DNA-נלקח על ידי תאי המקבל ,אשר צריכים להיות קומפטנטים – במצב המאפשר קבלת DNAמהסביבה .הוא מוכנס למקבל והאינפורמציה עוברת אינקורפורציה לתוך הכרומוזום של החיידק המקבל .כאשר הוא משתכפל הפנוטיפ מופיע בצאצאים. • טרנסדוקציה – העברת מקטעי DNAבעזרת הדבקת בקטריופאג' .הפאג'ים – וירוסים שמדביקים חיידקים – אורזים את ה DNA-של התורם ומשנעים אותו באירוע של הדבקה אל החיידק המקבל. גם כאן נכנסה חתיכת DNAשמקורה בחיידק התורם אל החיידק המקבל ובתהליכי אינקורפורציה היא נכנסת לגנום. • קוניוגציה – מעבר DNAעל ידי פלסמידים מיוחדים המסוגלים לבצע את התהליך )"פלסמידים קוניוגנטים"( ולהעביר את עצמם בין חיידק לחיידק .בניגוד לשני המצבים הקודמים ,בהם התורם אינו חי כאשר התהליכים יוצאים לפועל ,כאן התורם והמקבל חיים שניהם – ועובדה זו היא תנאי להתקיימות התהליך .קיים מגע פיזי בין החיידקים והעברה אקטיבית של DNAמתורם למקבל. לאחר ההיפרדות DNA ,מהתורם נמצא במקבל והאינפורמציה מתעגנת בגנום המקבל )או מתקיימת כפלסמיד בעל כושר שיכפול( ,כאשר הפנוטיפ מופיע בצאצאים. בשלושת התהליכים יש תמיד תורם – החיידק ממנו האינפורמציה הגיע )גם בטרנספורמציה הDNA- העירום היה איפושהו תחילה( ושיטת מעבר של ה DNA-לחיידק השני ,הוא החיידק המקבל .כאשר מסתכלים על הפנוטיפ בוחנים את הצאצאים של המקבל – כי האירועים נעשים ברמת החיידק הבודד, הפרט ,והפנוטיפ נצפה ברמה של מושבה או תרבית בגידול נוזלי .עם זאת ,האוכלוסיה צפויה להיות אחידה גנטית. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :13מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 89 שיעור :13מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך חתיכות DNAשנכנסות לתוך חיידק מועדות בפני סכנות איכול על ידי נוקלאזות .יחד עם זאת ,אם קיימת הומולוגיה ברמה כלשהי בין ה DNA-הפולש ל DNA-של החיידק המקבל ,פיסת ה DNA-יכולה לעבור אינקורפורציה לגנום .פיסת DNAזר לחלוטין אינה מסוגלת להיכנס לגנום בריקומבינציה ,למרות שישנן שיטות למעברים הוריזונטלים )שלא נעסוק בהן(. גנטיקה של בקטריופאג'ים פאג'ים הם וירוסים בקטריאלים וכנגיפים הם פרזיטים אובליגטורים בהגדרה :אין להם מנגנוני שכפול משלהם ולכן אינם יכולים להתרבות ללא המאחסן – הם מעטפות של חומר גנטי שיודעות להחדיר אותו לחיידקים ,שם החומר הגנטי יכול להשתכפל ולקודד למרכיבי הוירוס המתארגנים ליצירת ויריונים היוצאים מהמאחסן – לרוב בצירוף השמדתו בליזיס. הערכת כמות החיידקים נעשית על ידי ספירה חיה של מושבות לאחר סדרות מיהולים; פאג'ים לא מקימים מושבות אלא "פלאקים" – מוקדי הדבקה .בצלחת פטרי המכוסה בדשא חיידקים מזן הרגיש להדבקה על ידי פאג' ,אם מטפטפים על הצלחת מיהול של פאג'ים בנקודות מסויימות חלק מהחיידקים יידבקו בפאג', יתפוצצו וישחררו כמה עשרות עד מאות ויריונים בסביבתם .כל ויריון ששוחרר ידביק חיידק סמוך והתהליך יחזור על עצמו עד שיופיע "חור" בדשא החיידקים .כל פלאק מקורו בפאג' אחד שהדביק חיידק אחד .ספירה של הפלאקים בחישוב המיהולים נותנת את המספר שלהם. חיידקים סטציונרים הינם בעלי פעילות מטאבולית נמוכה ולכן התרבות הפאג'ים בתוכם איטית יותר .מסיבה זו ,כאשר בודקים את הצלחת בזמן מוגדר ,ניתן לראות פלאקים מבודדים לפני שהפאג'ים מספיקים להעלים את כל החיידקים בצלחת. לפאג'ים יש גנומים הפלואידים ,אך ניתן "להכליא" בין פאג'ים על ידי הדבקת אותו החיידק בשני סוגי פאג' .ניתן גם לבצע סלקציה בעזרת פאג'ים .הפאג'ים הינם כלים יעילים מאוד להעברת DNA )טרנסדוקציה(. הגרף הבא הינו מסוג .One-Step Growth of Bacteriophageהוא מציג את מספר החיידקים המודבקים בפאג'ים כפונקציה זה הזמן מרגע הוספת הכמות המדודה של הפאג'ים .מדי כמה דקות נלקחת דגימה מהנוזל העליון ,מסלקים את החיידקים בסירכוז ועושים מבחן פלאקים כדי לבדוק כמה פאג'ים יש בנוזל .נראה שמתקבלים שני גרפים: Total Phageהוא סך הפאג'ים בעוד ש Extracellular phage-הוא כמות הפאג'ים שיצאו מהתאים והיו בנוזל העליון. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 90 בתקופה הראשונה ,Eclipsed ,לא רואים פאג'ים כלל .אפילו העקומה הראשונה שמתחילה לעלות – של סך הפאג'ים – לא נראית בתקופה זו .הסיבה היא שהפאג'ים נכנסו כולם לחיידקים ,הזריקו את הDNA- וצריכים להשלים את תהליכי יצירת הויריונים .תקופת ה Eclipsed-היא התקופה בה עדיין לא בקע אף פאג' שלם מאף חיידק. בתקופה הבאה ,Latent Period ,מתחילים לראות פאג'ים בספירה ה Total-אך לא ב.Extracellular- קבלת פאג'ים פוטנטים תנתן רק מפיצוץ התאים בתמיסה ,לא מהנוזל העליון.אין פאג'ים חופשיים בנוזל .הסיבה היא שכעת יש כבר ויריונים שלמים בתוך החיידקים אולם הם עדיין לא בקעו החוצה מהתא. בתום תקופת ה eclipsed-יש מספיק רכיבים ליצירת פאג'ים שלמים אולם כדי לצאת מהחיידק הפאג'ים מקודדים לליזינים שמפוצצים את החיידק בסוף תהליך ההדבקה; יש להם מנגנוני בקרה גנטית מתוחכמים וניתן לזהות בהם גנים מוקדמים ) (early genesוגנים מאוחרים ) ,(early genesהמופעלים בפער רחוק יחסית מנקודת ההדבקה .ליזינים הם חלק מהגנים המאוחרים ,כך שרק לאחר שיהיו ויריונים שלמים בתוך התא יחול הליזיס .שההפרש בין סוף התקופה האקליפסית וסוף התקופה הלאטנטית נובע מפרק הזמן שבין יצירת פאג'ים בתא לבין תרגום הגנים לליזינים. בתקופה האחרונה ,Rise Period ,שני הגרפים מגיעים לאותה הנקודה שהיא מספר הפאג'ים הבוקעים מחיידק בודד שהודבק על ידי פאג' בודד בתחילת הניסוי. ההיסטוריה של הגנטיקה המיקרוביאלית גריפית' ושות' – ניתן להעביר תכונות בין חיידקים גריפית' הראה שניתן להעביר תכונות בין חיידקים על ידי עירבוב חיידקים שונים .הניסוי נעשה על ידי ערבוב חיידקים ליתאליים, סטרפטוקוקוס בעלי קפסולה ,יחד עם חיידקים לא-אלימים וחסרי קפסולה מאותו זן והחדרתם עכבר. החיידקים החיים בעלי הקאפסולה ) (smoothהורגים את העכבר והמתים לא הורגים אותו; החיידקים חסרי הקאפסולה )(rough אינם גורמים למוות .יחד עם זאת השילוב בין החיידקים smooth המתים וחיידקי roughהחיים גורם למוות של העכבר. מה קרה כאן? החיידקים ה rough-הם כנראה חיידקים מוטנטים ולא ,WTכי רוב המוטציות הן לרוב אובדן יכולת ולא רכישת יכולת; מכאן שהחיידק איבד פונקציה חשובה לפתוגניות שלו .36הפנוטיפ – 36היום ידוע שההבדל בין שני החיידקים הוא בסינטזה של מרכיבי דופן החיידק – הקאפסולה שנמצאת מחוץ לממברנה של החיידק הגראם-חיובי .המבנים הסוכריים של הדופן גורמים למופע המושבה המבריק והם גם חלק מגורמי האלימות של החיידק. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :13מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 91 מושבות חלקות ,עגולות ומבריקות ל Smooth-לעומת מושבה עמומה עם שוליים מחורצים ל– Rough- נותן ביטוי לעובדת המוטציה .הניסוי הוכיח שקיימת יכולת להעביר תכונה וירולנטית. מאוחר יותר ,אייבורי ושות' הוכיחו גם שהחומר המועבר בין החיידקים הוא DNAעל ידי הזרקת שני סוגי החיידקים ,מתים וחיים ,עם נוקליאזות – מצב בו העכבר עדיין חי .לעומת זאת כאשר הזריקו עם פרוטאזות )או אנזימים מפרקים אחרים( העכבר עדיין מת – כלומר לא חלבונים )או כל אלמנט אחר לצורך העניין( גורמים לתופעה. הרשי וצ'ייס – ה DNA-הוא החומר הגנטי של בקטריופאג'ים עוד לפני ווטסון וקריק ותגלית מבנה ה DNA-ועוד לפני שידוע ש- DNAהוא החומר הגנטי של יצורים משוכללים וירודים כאחד, ערכו הרשי וצ'ייס את הניסוי שלהם .הם הראו שכאשר וירוס מחדיר את החומר שלו לחיידק לא נדרש יותר מאשר DNAעל מנת לקבל ויריונים חדשים. הדבר נעשה על ידי הדבקת חיידקים בפאג'ים משני סוגים – אחד הכיל פוספט מסומן ) DNAבלבד (37והשני הכיל גופרית מסומנת )חלבונים בלבד( .הפאג'ים גודלו בחיידקים שגדלו על מצע מזון עם האיזוטופים .החיידקים הבאים שהדביקו הפאג'ים המסומנים לא גדלו במצע עם איזוטופים מסומנים. כעת מכניסים את החיידקים המודבקים למעין בלנדר המערער את החיבור העדין של מעטפת הפאג' לחיידק כך שניתן להפריד בין המעטפות הריקות של הפאג'ים לבין החיידקים המודבקים )בצנטריפוגה( .כדי שהניסוי ייעשה כראוי יש לעשות אותו בכל תקופה הקצרה יותר מסוף התקופה הלאטנטית. בהפרדה נמצא כי המעטפות שנשארו מחוץ לחיידקים מכילות את מרבית הסימון בגופרית ואילו החיידקים ללא המעטפות מכילים את מרבית הסימון בזרחן – כלומר הקאפסיד עשוי החלבונים נשאר בחוץ ופנימה נכנס ה .DNA-כאשר נתנו לחיידקים להמשיך לגדל את הפאג'ים ,נמצא ש 30%-מהויריונים הכילו DNAמסומן ופחות מ 1%-הכיל חלבון מסומן .מכאן שה DNA-לא רק נכנס לשיכפול גנים ותוצרים ליצירת ויריונים ,הוא גם נארז מחדש בויריונים החדשים. הסיבה לכך היא שכנראה כל חיידק הודבק על ידי כמה וכמה פאג'ים ולכן היה אחוז כה גבוה – בעקרון כל הדבקה יוצרת ויריון צאצא אחד שמכיל DNAרדיואקטיבי. 37יש לציין כי גם חלבונים יכולים להכיל זרחנים ,במצב של חלבון מזורחן. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 92 ניסויים נוספים • לוריה ודלברוק הוכיחו שהעברת תכונות של חיידקים עובדת במודל דארוויניסטי ולא מודל למארקי. • זינדר ולדרברג גילו את הטרנסדוקציה – היכולת לגרום לשינוי גנטי בחיידקים תוך שימוש בפאג'ים. • סימור בנזר השתמש בריקומבינציה בפאג'ים כדי להדגים שגנים ב DNA-הם יחידות רציפות ומוטאביליות ושהקוד הגנטי מורכב משלישיות של בסיסים. • מסלסון וסטאל אישרו ששיכפול DNAהוא סמי-קונסרבטיבי. • ברנר ,ג'קו ומסלסון הוכיחו את קיום ה mRNA-וכן שהריבוזומים הם אתרי סינטזת החלבונים. • קריק ושות' מאפיינים את הקוד הגנטי בהיותו רציף )ללא דילוגים( ,מורכב מקודונים של שלוש אותיות והינו בעל חזרות. • ג'קו ומונו פירסמו את מודל האופרון .מודל זה הוכיח את המדע על ההנחה שגנטיקה של אורגניזמים גדולים כקטנים זהה – הסידור של האופרון היה אופייני לחיידקים בלבד ולא לאאוקריוטים. • קורנברג גילה את ה DNA-פולימראז .בפועל ,זהו ה DNA-הפולימראז הלא נכון :בחיידקים יש יותר מ DNA-פולימראז אחד ועד היום לא ברור מה התפקיד של כל אחד מהם ,למרות שידוע שלכל פולימראז מספר תפקידים .קורנברג גילה את DNAפולימראז ,Iלמרות שמי שעושה את הרפליקציה של הגדיל המוביל 38הוא DNAפולימראז .III • סוף עידן הגנטיקה הקלאסית ותחילת העידן המולקולרי – העידן המולקולרי איפשר לבצע reverse gemneticsולבחון את השפעתן של מוטציות מלאכותיות מתוכננות. • מוליס רשם את הפטנט על PCRהמשתמש בפולימראז תרמוסטאבילי. בנזר בנזר עבד עם פאג' בשם MS2בעל חומר גנטי מסוג .RNAהוא גידל בחיידקים פאג'ים ,הפעיל תהליכים מוטגנים וקיבל צאצאי פאג' לא-אינפקטיבים. כיצד הוא יודע שיש פאג'ים אם אין פלאקים? ניתן לקחת דגימה מהנוזל העליון ולראות במיקרוסקופ אלקטרוני שהפאג'ים שם והם פשוט לא אינפקטיבים. סדרת ניסויים כאלו נעשתה על ידי צבעי אקרידין – הגורמים להחסרות של מספר קטן של בסיסים. בעזרת החומרים האלו כמוטגנים בנזר יצר מוטנטים שונים ,עירבב אותם והדביק אותם בקומבינציות של 2-3מוטנטים יחד במטרה לבדוק האם ניתן לקבל פאג'ים אינפקטיבים. בסופו של דבר הוא חילק את המוטנטים לקבוצות קומפלמנטציה – הוא חילק את הפאג'ים הלא- אינפקטיבים לפאג'ים של +ושל .-אם מערבבים +עם – מקבלים פאג'ים אינפקטיבים; אם רוצים להפיק פאג'ים אינפקטיבים מאותו סימן צריך לערבב שלושה מקבוצת ה (+)-או שלושה מקבוצת ה.(-)- 38עד היום לא ידוע מיהו הפולימראז שתפקידו הייעודי הוא הגדיל מעוכב – למרות שידוע שיש כמה פולימראזות שיכולים לעשות זאת ,לא יודעים מי עושה זאת כי אם יוצרים מוטציה באחד אחר בא וממלא את מקומו .היתירות הזו חשובה בביולוגיה וקיימת לעיתים קרובות בפונקציות חיוניות ,כעין ביטוח מפגיעה בגנים הראשוניים שפועלים במסלול על ידי תהליך מוטגני. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :13מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 93 הערה :כל ) (+או ) (-נפרד הוא אירוע מוטגנזה נפרד שזוהה לאחר בדיקה התאים לקבוצת קומפלמנטציה מסויימת. אנזימי מתילציה )מתילאז( דואגים למודיפיקציות על ה DNA-העצמי של החיידק כך שיוכל לזהות DNAזר ,שאינו ממותל .ה DNA-הזר נחתך כתוצאה מהזיהוי על ידי אנזימי ההגבלה .אנזימי הגבלה הם מנגנוני הגנה של חיידקים כנגד מקורות DNAזרים ,החותכים את הגנום במקטעים קבועים ,בעלי תבנית פלינדרומים. שיבוט פיתוח זה הצליח להביא לביטוי גן המשובט בתוך פלסמיד .פעולה זו הביאה לתחילת ההנדסה הגנטית בביולוגיה המולקולרית – היכולת להכניס DNAלתוך תאים ולבחון למה אחראי הDNA- או לייצר בעזרתו חלבון מבוקש בעל ערך. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 94 מילון מונחים • זן הבר – החיידק במצב הכי טבעי שיש ,נקודת ההתייחסות. • מוטנט – שונה מזן הבר בתכונה מסויימת. • זן – שני חיידקים שהם זן בר ומוטנט יכולים להיות מאותו המין אבל הן strainשונה. • פנוטיפ – מסומן בכתב ישר ולא מוטה .הפנוטיפים בחיידקים כתובים באות ראשונה גדולה בשמו המקוצר של הגן ולעיתים מצויין +או ,-המציין מוטציה או זן בר .לרוב אם טורחים לציין פנוטיפ או גנוטיפ הכוונה היא לתופעה חסרה בחיידק ולא לתופעות של זן הבר. • גנוטיפ – כל האותיות קטנות והאותיות נטויות .אותם כללי ) (+ו .(-)-אותיות בסוף שם הגן מציינים גנים שונים באותו מסלול ביוסינטטי .שימו לב להבדל בין מוטנטים אוקסוטרופים – שלא ייגדלו אם לא יספקו להם את חומצת האמינו שאינם יכולים לסנטז – לעומת מוטנטים קטבוליים אשר לא מסוגלים לנצל סוכר מסויים ,אך כן ייגדלו אם יינתן להם סוכר אחר. • אללים – מספר המופיע ליד האות )למשל (trpA1מציין כי אלו אללים שונים למוטציות באותו הגן )לעומת מוטציות בגנים שונים באותו מסלול ביוסינטטי .בשני המקרים ניתן בעזרת ריקומבינציות לקבל זן בר(. בתמונה הבאה ניתן לראות דוגמה לכתיבה של זן מסויים בספרי הזנים במעבדה .השם מעיד על מיהו החיידק ומה הוא מסוגל לעשות .סימני ∆ מעידים על מחיקה ,כאשר הסוגריים מציינים באילו מקטעים בגנום נמצא המחדר; גנים שלא עם דלתא הם גנים מוטנטים .כמו כן ניתן לראות שיש פלסמיד Fשעליו נמצאים הגנים proA+B+ואופרון לקטוז עם מחיקה ספציפית. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :14מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 95 שיעור :14מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך חומרים מוטגנים אינם גורמים בעצמם למוטציה אלא לשינויים כימיים ב .DNA-המוטציה נגרמת מכשל בנסיונותיו של החיידק לתקן את השינויים האלה ,בעיקר בשלב השיכפול .הפולימראז העובר על ה- DNAאינו מצליח לזהות את המוטגן )שאינו בסיס נוקליאוטיד( ולכן מחליף אותו בנוקליאוטיד אקראי פחות או יותר .מכיוון שבשלב הזה לרוב אין תבנית תקינה מול המוטציה ,ההכנסה אינה תקינה והמוטציה מתקבעת לדורות הבאים. מוטגנים לDNA- נכנסים כמו בסיסים רגילים אך אינם מזוהים ככאלה;ישנם גם מוטגנים כימיים שהינם כימיים חומרים פעילים התוקפים את הבסיסים או הטבעת הסוכרית וגורמים למודיפיקציות שמשנות את המבנה שלהם כך שלא ניתן לזהותם. יש לזכור שיש שני סוגי מוטציות נקודתיות בכל הנוגע להחלפות בסיסים :טרנזיציות וטרנסברסיות. בהחלפות ,מסגרת הקריאה נשמרת אבל אם השינוי גורם לשינוי בחומצת אמינו זו תהיה מוטציית missense ואם הקודון המקודד הפך לקודון stop המוטציה תהיה מוטציית .nonsense הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 96 ישנם גם מוטגנים כימיים ופיזיקליים שמסוגלים להיכנס לתוך ה.DNA- אטידיום ברומיד משמש בתכונתו זו לסימון ;DNAאקרידין גם כן נכנס ל DNA-ומפריע לשיכפול ,כאשר התוצר היא micro-insertions and ,micro-deletionsהפרעה של יותר מבסיס אחד ברצף. מוטגנזה מתקבלת גם על ידי קרינה, כאשר זו נחלקת לשני סוגים: • קרינה מייננת – נמצאת בצד הקצר של הספקטרום, בה נכללות קרני ה X-והגמא .זוהי קרינה עוצמתית מבחינת הרמה האנרגטית .פגיעתה בתא גורמת ליצירת רדיקלים חופשיים פעילים כימית הפוגעים בDNA- וגורמים לשבירתו או לשינויים כימיים בו. • קרינת – UVנמצאת בקצה הרחוק של הספקטרום ,פוגעת ב- DNA על ידי צילוב פירימידינים ,בעיקר זוגות T שנמצאים אחד ליד השני .זוג ה T-המצומדים מזוהה על ידי התא כנזק והנסיון לתקן אותו הוא שלמעשה גורם למוטציה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :14מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 97 פנוטיפים מועילים במחקר גנטי לא ממתינים להופעתו האקראית של פנוטיפ אלא מגבירים את הופעת המוטנטים בעזרת מוטגנים .המוטציות נוצרות במידה אקראית למחצה ויש להפעיל כלים מתאימים להסתכלות ולזיהוי המוטנטים בכדי להתחיל להפעיל שיטות מיפוי למציאת מיקום וטיב המוטציה. הכלים לתצפית בתחילת הביולוגיה המולקולרית היו מוגבלים והתחלקו לשנים: • יכולת/אי יכולת של חיידק לגדול על מצע. • אינדיקטורים המשנים את צבעם בהתרחשות /אי התרחשות ריאקציה כימית. כלים פשוטים אלו לא מאפשרים זיהוי מוטציה בכל מסלול שהוא .אם ידוע שיש מחיקה בין שני גנים, הכוללת את כל הגנים שביניהם ,בהנחה שהפנוטיפ של הגנים אינו כה ברור ,לא ניתן יהיה לאתר בצורה מלאה מיהם הגנים שנמצאים בין שני הגנים שתוחמים את המחיקה .מסיבה זו המפות בתקופה ההיא היו בעלות כמות אינפורמציה נמוכה ,שהלכה ועלתה בעיקר כאשר התחילו להשתמש בכלים מולקולריים. הפנוטיפים השכיחים ביותר בהתחלה היו למסלולים ביוסינטטיים )=מוטנטים ביוסינטטיים( ,כאשר הפשוטים והמרכזיים היו המסלולים לביוסינטזה של טריפטופן ,היסטידין ופרולין .מוטנט למסלול ביוסינטטי מכונה אוקסוטרופ )לעומת זן הבר שמכונה פרוטוטרופ ואינו זקוק לחומצות אמינו במצע(. מוטנטים קטבולים ראשונים הוכרו במסלולי פירוק סוכרים .מוטנטים אלו אינם מסוגלים לצמוח על מצע סוכר שמסלול הפירוק פגום כאשר זהו מקור הפחמן היחיד; מהר מאוד השתמשו באינדיקטורים ולא ביכולת גדילה /אי גדילה על מצע. מוטנטים נוספים הם מוטנטים מותנים – בעיקר בגנים חיוניים אשר מוטציה בהם היא ליתאלית .למרות שהכפילות הגדולה בגנים חיוניים ,לא לכל גן יש גיבוי ולכן ניתן לחקור מוטנטים מותנים בגנים חיוניים ליתאליים ,אשר מגדלים בטמפרטורה מתירנית – המאפשרת קיום – וחוקרים אותם בטמפרטורה המגבילה ,שפוגעת בתוצר הגן. חיידקים שהטמפרטורה המתירנית שלהם נמוכה מהטמפרוטורה המגבילה הם רגישים לחום לעומת מצב הפוך בו הם רגישים לקור .חיידקים הם פויקלותרמיים ולכן אינם מסוגלים לווסת את טמפרטורת התא. רוב החיידקים )מזופילים( שידוע כיצד ניתן לתרבת אותם גדלים בין 20-42מעלות ,כאשר יש גם תרמופילים שגדלים בין 42-60מעלות ואקסתרמופילים שגדלים בטמפרטורות שמעל 60מעלות .לרובם כמובן יש טווח מצומצם בתוך הטווח הזה ובטמפרטורות אחרות קצב הגידול שלהם יהיה איטי יותר. פנוטיפ נוסף הוא פנוטיפ של עמידות ,כאשר העמידויות העיקריות המשמשות הן עמידות להדבקה בפאג' ועמידות לאנטיביוטיקה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 98 סוגי מוטציות • אוקסוטרופ – פגוע במסלול ביוסינטטי של מולקולה חיונית כמו חומצת אמינו או נוקליאוטיד. • מוטנט קטבולי – מוטנט הפגוע במסלול קטבולי לשימוש בסוכר מסויים .בשיטה זו נעשה שימוש באינדיקטורים לראיית השינוי. • מוטציות תלויות-טמפרטורה – שינוי ביציבות התרמודינמית של החלבון מוציא אותו מכלל פעילות בטמפרטורות המגבילות )ראו פרק הרחבה :מוטציות מותנות( .הגרף הבא מציג טווחי טמפטורות גידול אופייניות אופטימליות של כל חיידק. • עמידות לתרופות – היכולת של חיידק לגדול בריכוזי תרופה שה WT-לא יכולים לגדול בסביבתה. המוטנטים מופיעים לאחר זריעה על צלחת עם התרופה .אנטיביוטיקות משתייכות למספר משפחות פונקציונליות המעכבות מסלולים ספציפיים בחיידק .התרופות אמורות שלא לפגוע במאחסן האאוקריוטי כיוון שהן פוגעות באלמנטים חיוניים וספציפיים לחיידקים – הדופן ,מסלולי השיעתוק והתרגום הפרוקריוטים וכדומה .מסלולי העמידות )שהם תולדה של מוטציות( לרוב משנים את חלבון המטרה של האנטיביוטיקה או את מערכת הטרנספורט של האנטיביוטיקה לתוך החיידק .39עמידויות אחרות הינן תוצאה של מנגנוני פירוק /אינאקטיבציה /אקספורט של האנטיביוטיקה מהתא החוצה על ידי משאבות טבעיות 40 בחיידקים .פעילות זו קשורה למנגנון המצוי בכרומוזום ומשופעל על ידי האנטיביוטיקה .פירוק אנטיביוטיקה מתבצע על ידי אנזימים כמו בטא-לקטמאז .הגנים האלה לא נוצרו במוטציה ואינם מצויים בכרומוזום כי אם על גבי פלסמידים המכילים קסטות של הגן שנרכשו בהעברה לאטרלית. • עמידות לנגיפים – אי הידבקות בבקטריופאג' שתוקף .WTלרוב עקב איבוד רצפטור אליו הפאג' נקשר בתחילת מנגנון ההדבקה .פאג'ים עברו אבולוציה לזהות אלמנטים ממברנליים של החיידק, 39רוב האנטיביוטיקה לא נכנסות בדיפוזיה אלא במערכת טרנספורט. 40משאבות MDR = multiple drug resistanceשנוצרו באבולוציה להוצאת טוקסינים שונים ,הקיימות גם בחיידקים וגם בתאים סרטניים ומקנות להם עמידות לכימותרפיה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :14מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 99 ולכן יש להם ספקטרום מאחסנים מאוד צר; מוטנטים מסוגלים לגדול על צלחת שרוססה בפאג'ים. בתחילת תהליך ההדבקה הפאג' משתמש ברגליות – שהן נקודות העיגון של הפאג' – וקישורן למוטיב ממברנלי של החיידק המשמש כרצפטור .לאחר הקישור הרגליים עוברות שינוי קונפורמציה המקרבות את הפאג' לממברנה ומאפשרת לו להזריק את הגנום לתוך החיידק .שינוי של המולקולות המזוהות על ידי הרגליים של הפאג' יביא לחוסר יכולת זיהוי החיידק על ידי הפאג'. • פנוטיפ נייחות – לחיידקים רבים יש שוטונים או ריסניות שמקנות להם יכולת תנועתיות; פגיעה בהן גורמת לאובדן יכולת התנועה ,והפנוטיפ ניכר במושבות צפופות יותר מאשר .WT • איבוד פיגמנט – למושבות רבות יש צבע ,פיגמנט שניתן גם כאשר לא זורעים אותן על גבי מצע עם אינדיקטור ,עקב ביטוי חלבונים קושרי מתכות – ברזל או מנגן .פגיעה ביכולת אינקורפורמציית החלבון לקומפלקס או בחלבון הקומפלקס עצמו תביא לאיבוד פנוטיפ הפיגמנט. • מושבות מחוספסות – עקב איבוד הפוליסכריד בממברנה החיצונית ,המושבות פחות חלקות ומבריקות. • מוטנטים ללא קפסולה – מוטנטים קרובים למושבות המחוספסים ,מוטציה שפוגעת בקפסולה העוטפת את החיידק אך לאו דווקא בסוכרים .המושבות גדולות ומפורצות ולא חלקות .קשה להבדיל בין שני המוטנטים האלה רק מהסתכלות על המושבות. הטבלה הבאה מציגה שלוש דוגמאות לעמידויות – עמידות לפאג' ,לאנטיביוטיקה ולתהליך ההמרה של כלוראט לכלוריט )=רעלן( ,ולכן ה WT-הוא הרגיש לכלוראט והמוטנט הפגוע במסלול ההמרה עמיד. מוטציות של עמידות נדירות יותר ממוטציות מטאבוליות ,משום שמוטציות מטאבוליות או קטבוליות יכולות לקרות בכל אחד ממספר גנים האחראים לביוסינטזה או לפירוק של אותו חומר; פגיעה בכל אחד מחמשת הגנים באופרון הטריפטופן יכולה להביא לפנוטיפ .לעומת זאת מוטציה של עמידות צריכה לקרות בחלבון מאוד מסויים ובאופן כזה שלא תיפגע בפעילות שלו – ולכן היא נדירה יותר. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 100 הרחבה :מוטציות מותנות חיידקים מכילים מערכות אנזימטיות המותאמות לטמפרטורות הגידול האופטימליות שלהם .בטמפרטורות גבוהות מדי החלבונים והאנזימים של החיידק עוברים דה-נטורציה ,עקב היפרדות קשרים חלשים המייצבים את המבנה השלישוני של החלבון או את נכונותו להישאר מסיס בתמיסה .בחימום משקיעים אנרגיה בתמיסה ,האנרגיה חזקה מהאינטראקציות של החלבון והוא עובר דה-נטורציה ולרוב גם שוקע – משום שהדה-נטורציה גורמת לחשיפה של חומצות אמינו הידרופוביות הבאות במגע עם מולקולות הידרופוביות שכנות .חלבונים מסויימים מסוגלים לעבור רה-נטורציה אם מרחיקים את הגורם הדה- נטורטיבי ,אך על פי רוב הדה-נטורציה אינה הפיכה – חשיפה של חלבון לתנאים קשים גורמת לאובדן פעילות. עובדה זו רלוונטית למוטנטים מכיוון שהם רגישים לטמפרטורה .המוטציה פוגעת בחומצת אמינו האחראית לאינטראקציה מייצבת של החלבון; אם השינוי גרם לחלבון להיות פחות יציב ,בטמפרטורת גבוהות – גם אם לא מחוץ לטווח הגידול של – WTהחלבון יעבור דה-נטורציה. זה המצב בחימום; בקירור הבעיה היא קשיחות – חלבונים פוקנציונאלים רבים דורשים מידה מסויימת של גמישות על מנת לתפקד .דוגמה למנגנון כזה היא – induced fitהתאמה מושרית ,המדברת על שינויי קונפורמציה של החלבון העוזרים לו להינעל על הסובסטרט .ברגע שמוטציה בחלבון יוצרת אינטראקציה מייצבת נוספת וגורמת ליציבות יתר ,המוטציה נועלת את החלבון בקונפורמציה קשיחה יותר ובקירור הקשיחות הזו תתבטא עד לאובדן פעילות. סלקציה של מוטנטים גם עם במוטגנים קשה למצוא מוטנטים ולראות אותם על צלחות .לכן ניתן להשתמש בהעשרות ,הנעשות על פי רוב במצע נוזלי )לעומת סלקציה שנעשית במצע מוצק(. הסלקציה היא הפעלה של לחץ סלקטיבי שמאפשר רק לחיידקים המבוקשים לצמוח .כך ,גם אם החיידקים המוטנטים נדירים מאוד ,ניתן יהיה למצוא אותם בקלות .כאשר מחפשים מוטנט ,gain of function שרכש יכולת שאינה קיימת ב ,WT-ניתן לזרוע את החיידקים על צלחת המכילה את הגורם הסלקטיבי שהחיידקים אמורים היו לרכוש לו עמידות .זוהי סלקציה חיובית. מוטציות של loss of functionקשות יותר לאיתור ,כי כעת מבקשים לחפש חוסר יכולת ולא רכישת יכולת .קשה לראות העדר צמיחה על רקע צמיחה של WTולכן עושים סלקציה שלילית על ידי replica ,platingבה משווים בין יכולות הגידול על רקעים שונים. מוטנטים נוספים שאפילו replica platingלא מאפשרת לראות ניתן לזהות על ידי counter selection – במצבים שבהם המוטנטים יכולים לשרוד )לא לגדול( וה WT-מתים בגלל שהם גדלים .לרוב משתמשים בפניצילים או .BUdRפניצילין פוגע בסינטזה של דופן ,ולכן פוגע בחיידקים מתחלקים. חיידקים שלא גדלים לא מייצרים דופן ולכן אינם רגישים לפניצילין .שיטה זו מעשירה את החיידקים המוטנטים על חשבון ה.WT- חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :14מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 101 השיטה היא כלי העשרה הנעשה במצע נוזלי .אוכלוסיית החיידקים מועברת למצע נוזלי ללא טריפטופן; רוב האוכלוסייה של WTגדלה היטב ,כי הם פרוטוטרופים; האוקסוטרופים לא מתים אך גידולם מעוכב. לאחר כשעה מכניסים פניצילין למצע .הפניצילין הורג את WTהגדלים והמוטנטים ,שאינם גדלים, שורדים .לאחר שעה נוספת בנוכחות פניצילין מרחיקים את הפניצילין בשטיפות וזורעים את החיידקים על צלחת עם טריפטופן; כעת שכיחות המוטנטים באוכלוסיה גדולה יותר וייקל לראות אותם בשיטת .replica plating משמאל :מוטנטים פוגעים במסלול הטריפטופן לא גדלים על מצע מינימלי; אם מוסיפים לחיידקים DNAמחיידקי Trp+יתקבלו ריקומביננטים Trp+ בטרנספורמציה.41 משמאל :תהליך ה .replica plating-בתהליך זה מחפשים מוטנטים של אובדן פונקציה ,לעומת מוטנטים שרכשו פונקציה חדשה .התהליך יוצא מצלחת מצע עשיר ,בה גדלים WTומוטנטים. לוחצים את הצלחת לבד קטיפה סטרילי ,לוחצים על הקטיפה לצלחת מצע עני ולאחר מכן לצלחת מצע עשיר .על המצע העשיר ייגדלו כל המושבות; על המצע העני ייגדלו רק .WTכך ניתן לברר אילו מושבות חסרות במצע העני ולבודד אותן מתוך הצלחת עם המצע העשיר. 41בחיידקי E.coliלא ניתן יהיה לקבל חיידקים אלו באופן טבעי ,מכיוון שמעבר הטרנספורמציה נעשה בחיידקים קומפטנטים בלבד ומצב הקומפטנטיות לא קיים ב E.coli-באופן טבעי .וחיידקי E.coliבטבע לא מקבלים DNAבטרנספורמציות .עם זאת במעבדה ניתן ליצור E.coliטרנספורמנטים באופן מלאכותי. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 102 כלי זה מאפשר עבודה עם מושבות ברורות ומבודדות על צלחת; אולם מוטנטים נדירים מאוד ולכן במקרים רבים ,לא ניתן יהיה לראות את המוטנטים במדגם קטן .ניתן להשתמש בcounter - selectionעל מנת להעשיר את שכיחות המוטנטים. הכניסה של ה DNA-נעשית בריקומבינציה חלקית .שתי חתיכות – DNAכרומוזומלי וחיצוני – עוברות ריקומבינציה על מנת להכניס DNAחיצוני לגנום החיידקי ולעגן את המוטציה כך שניתן יהיה לראות אותה גם בצאצאים. סוגי מוטציות ניתן להסביר בכמה דברים מוטנט שחוזר לפנוטיפ :WT • רברסיה – המוטנט קיבל מוטציה שנייה בדיוק בנקודת המוטציה המקורית ,כך שהוא חוזר לרצף של .WTהסיכוי לכך הוא נמוך עד אפסי .זהו המקרה היחיד של רברטנט אמיתי ,שחזר גנוטיפית – ולא רק פנוטיפית – למצב .WT • סופרסיה – רכישה של פנוטיפ WTעקב מוטציה שנייה שאינה רברסיה .ישנם כמה סוגי סופרסיות: • מוטציות שינוי מסגרת קריאה – כניסת בסיס לגן שינתה את מסגרת הקריאה של הגן .מוטציה שנייה באותו הגן שתוציא בסיס באיזור קרוב תביא לשחזור מסגרת הקריאה .אם המוטציות שבתווך בין שני האירועים הן מוטציות שקטות )למשל החלפת קודון בקודון אחר של אותה חומצת אמינו או החלפת חומצת אמינו באופן שאינו פוגע בפונקציה( תתקבל סופרסיה של הפנוטיפ. • סופרסורים של – Nonsenseמולקולות tRNAמוטנטים הקוראים קודוני סטופ ומכניסים חומצת אמינו כלשהי .אם המוטציה יצרה קודון סטופ שגרמה לקיצור החלבון ,הtRNA- הסופרסורי יימנע מהסינטזה להיפסק .השכיחות של tRNAסופרסורי נמוכה מאוד ורובם עובדים על קודון סטופ UAGהנדיר ברוב הגנים התקינים .כמו כן ,גם אם הסופרסור ימשיך חלבון תקין ליצירת חלבון לא תקין ,מערכות הבקרה של החיידק ייפטרו מהחלבון .לעומת זאת התיקון שהסופרסור עושה למוטנט ,גם בכמויות חלבון נמוכות ,יכול להספיק ליצירת פנוטיפ סופרסורי. • סופרסיה אינטרגנית – מוטציה בגן שונה לחלוטין המבטלת את הפנוטיפ המוטנטי) .שקופית ,52 מצגת (1מוטנט קטבולי באופרון הגלקטוז בגן GalEלא רק שאינו יכול לגדול על גלקטוז אלא הוא מורעל עקב הצטברות הסובסטרט הטוקסי לחיידק .מוטציה ב ,GalK-שמקודד לגן הראשון במסלול ,תמנע את הרעילות של GalEכי לא נוצר הסובסטרט שלו .מכאן שעבור הפנוטיפ של חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :14מבוא לגנטיקה מיקרוביאלית – המשך 103 רעילות גלקטוז למוטנטים ב ,GalE-המוטציה ב GalK-הינה סופרסורית; שימו לב שהמוטציה אינה סופרסורית ליכולת הגדילה על גלקטוז. אתרי ציס ומולקולות טרנס חיידקים ופאג'ים הם הפלואידים ומכילים עותק יחיד מכל גן; יחד עם זאת ,ניתן ליצור מצבים דיפלואידים יציבים בתוך חיידקים על ידי קוניוגציה ,מעבר פלסמידים ,בה נוצרים מצבים דיפלואידים יציבים אם הפלסמיד הנכנס מביא איתו חתיכה מגנום של חיידק דומה. במצבים אלו של דיפלואידיות יציבה ניתן לחקור גנטיקה של דיפלואידים אמיתיים – כמו אאוקריוטיים. ניתן לחקור קומפלמנטציה ציס )שתי המוטציות נמצאות על אותו גדיל DNAומוטציה אחת לא עוברת קומפלמנטציה על ידי גן בגדיל אחר( או טראנס )מוטציה שפוגעת בייצור חלבון והעותק התקין על המולקולה השנייה מסוגל לתקן את החלבון ולשחזר את הפנוטיפ(. למטה :דוגמה לניסויים שנעשו בדומה לניסויים של ז'קו ומונו שחקרו את אופרון הלקטוז. החיידק מכיל פלסמיד ’ Fקוניוגטיבי שהביא חתיכת גנום הנושאת את אופרון הלקטוז .זהו מרודיפלואיד )דיפלואיד למחצה( והוא יכול להיות בעל אחד משני פנוטיפים: • המוטציה שעל הפלסמיד היא באותו הגן של המוטציה של החיידק ,ולכן הגן עדיין פגום בשני העותקים ולא מתקבל פנוטיפ. • המוטציות בגנים שונים ,כל אחד מקודד לגן תקין במוטציה של השני ולכן מתקבלת קומפלמנטציה. למטה :מוטציות בגנים Zו Y-בגנום ומוטציה בפרומוטור של האפיזום )הפלסמיד( .במצב זה ,למרות שיש קומפלמטציה ,לא יהיה פנוטיפ תקין משום שלא ניתן לשעתק את האופרון שעל האפיזום .מוטציה כזו היא ציס ,ומאפיינת לרוב אלמנטים רגולטורים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 104 למטה :מצב דומה שבו דווקא הרפרסור שעל האפיזום אינו תקין .יחד עם זאת ,הרפרסור פועל בטראנס ולכן הרפרסור האנדוגני יכול לפעול גם על האופרון של האפיזום .יש להבחין בין מצבים קונסטיטוטיבים – בהם יש ביטוי קבוע ללא בקרה – ומצבים מבוקרים. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :15תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה 105 שיעור :15תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה חיידקים מתרבים ברבייה א-מינית ומתחלקים בחלוקה שיוויונית יחסית .החיידק גדל ומשכפל את החומר הגנטי וכאשר הוא חש כי התנאים מתאימים, הוא עובר ") "Septum Formationהנחת מחיצה( כאשר שני עותקי ה DNA-נמצאים בקו המחיצה. תהליך נוסף גורם לכרומוזומים לנדוד לקטבים ואז המחיצה מושלמת ליצירת שני חיידקים .המחיצה בנויה ממברנה ודופן. דרך למדידת התרבות החיידקים נעשית על ידי מדידת העכירות – )– Optical Density (OD המודדת העכירות כפונקציה של צפיפות החיידקים )חיים ומתים( בתמיסה. למטה :בגרף ניתן לראות שתי עקומות – הירוקה הינה מדידת עכירות והאדומה הינה ספירה חיה. ניתן לראות שתחילה יש זמן השתהות – החיידקים המועברים למצע טרי צריכים להתרגל למצע לפני שהם מתחילים להתחלק ולכן אין גידול ניכר במספר החיידקים .העלייה בספירה החיה ניכרת לפני העלייה בעכירות כי זוהי שיטה יותר רגישה )הגרף מוצג באופן שגוי(. לאחר תקופת ההשהייה מתחיל גידול אקפוננציאלי ,כאשר בכל זמן דור כמות החיידקים בתרבית מוכפלת .על גרף בסקלה לוגריתמית ניתן לראות גרף ישר שמאפשר גם חישוב זמן הדור של החיידקים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב 106 מיקרוביולוגיה -שיעור1 לאחר מספר שעות החיידקים גדלו מאוד ,צרכו את הנוטריינטים או את רוב החמצן ,והתנאים כבר לא מאפשרים גידול אקפוננציאלי .אפילו עצם הצפיפות של החיידקים – כמות גדולה בנפח מוגבל – גורמת להם לשלוח אותות מסוג quorum sensingהאומרים להאט את הגידול עד לעצירתו .מסיבה זו מתחילה התייצבות במספר החיידקים – בספירה החיה כמו גם בעכירות .זהו מצב סטציונרי בו אין תמותה ואין גידול. בשלב האחרון מתחילה התמותה – חיידקים שלא מסוגלים לספורולציה יתחילו בסופו של דבר ,לאחר מצב סטציונרי ממושך ,למות .בספירה החיה המוות ניכר יותר מאשר בעכירות מכיוון שספירה חיה מדווחת מספר חיידקים חיים – רק אלו ייתנו מושבות .העכירות יורדת לאט יותר כי גוויות של חיידקים מפזרות אור באותה מידה כמעט כמו חיידקים חיים .בהמשך חיידקים מתים מתחילים לעבור ליזיס ולכן תתחיל גם ירידה בעכירות. בטבע החיידקים לרוב נמצאים במצב של מחסור בנוטריינטים ולכן הם נמצאים במצבי גידול איטיים או סטציונרים .אוכלוסיות מתרסקות ועולות בחוזקה כל הזמן ,בהתאם לשינויים פתאומיים בתנאים .בסקלה לוגריתמית ניתן לתאר את הגידול האקפוננציאלי על קו לינארי ומתוכו לחשב את זמן הדור – לפי הזמן שחלף בין שתי נקודות שערך האחת כפול מהשנייה. דורות לעומת מחזורי חלוקה משמאל :תרבית שמקורה בתא אחד שעברה 4מחזורי חלוקה .מספר התאים הוא ,2nכאשר nהוא מספר מחזורי החלוקה .לאחר שידוע מספר התאים הסופי ,מספר הדורות שווה ,N2-N1כאשר N2הוא מספר התאים הסופי ו N1-הוא מספר התאים ההתחלתי. מוטציה יכולה להתרחש בכל נקודת זמן לאורך תהליך הניסוי .ככל שהיא תתרחש מוקדם יותר יופיעו יותר מוטנטים בתרבית הסופית .יכולים להיות מצבים בהם מתרחשות יותר מוטציות במהלך הניסוי אך מתקבלים פחות מוטנטים; כאשר כבר במחזור החלוקה הראשון נוצרה מוטציה ולכן לאחר 4מחזורי חלוקה מתקבלים 50%מוטנטים בתרבית .לעומת זאת, אפשרי גם שיתרחשו שתי מוטציות לאורך חייה של התרבית – פעם אחת במחזור החלוקה השני ופעם שנייה במחזור החלוקה השלישי .כתוצאה מתקבלים רק 37.5%מוטנטים .מכאן שתדירות מוטציה אינה ניתנת להקשה מתוך שכיחות המוטנטים הסופית וידיעת שכיחות אירוע המוטציה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :15תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה 107 תורשה לפי שנות ה40- המודל הניאו-דרוויניסטי טען שמוטציות מתרחשות באופן אקראי ,כאשר מוטציות שמקנות יתרון מקובעות באוכלוסיה ומשתלטות עליה .הגישה הלמארקית טענה שהמוטציה היא תכונה ה"מאומצת" במהלך חייו של האורגניזם על ידי הסתגלות לסביבה בתהליך של שינוי ישיר עקב לחצי הסביבה. האם יש תורשה למארקית בחיידקים? בניסוי הנתון הדגירו חיידקי WTעל צלחת שמכילה אנטיביוטיקה מסוג סטרפטומיצין .42לעומת זאת ,אם מוסיפים לתרבית זהה של חיידקים סטרפטומיצין ,לוקחים דגימה מתוך התרבית הנוזלית וזורעים על צלחת עם סטרפטומיצין – מתקבלות מושבות עמידות לסטרפטומיצין. כיצד ניתן להסביר תופעה זו? הוספת הסטרפטומיצין לתרבית עצמה יצרה לחץ סלקטיבי שלכאורה גרם להופעת המוטציות כבר בתרבית ,המאפשרות לחיידק להתמודד עם הלחץ הסלקטיבי .זוהי לכאורה תורשה למארקית; אולם אנו יודעים שתורשה למארקית אינה מתרחשת במרבית המקרים .אז מהו כן ההסבר? הכנסת לחץ סלקטיבי למצע נוזלי הינה ,למעשה ,תהליך העשרה .השכיחות למוטציה של עמידות לסטרפטומיצין היא 1x1010ולכן ב 100-מ"ל יש כ 100-חיידקים עמידים .אולם לא זורעים את כל 100 המ"ל בצלחת ,אלא דגימה של 100מיקרוליטר; מכאן שהסיכוי להרים מוטנט יחיד הוא אפסי .לעומת זאת כאשר מוסיפים סטרפטומיצין לתרבית ,מבצעים במוטנטים המעטים הקיימים העשרה ולכן הדגימה הקטנה מושכת הרבה יותר חיידקים עמידים. האם התורשה בחיידקים היא דרוויניסטית? כדי לבחון מהו המודל הנכון – הדרוויניסטי או הלמארקי – נערכו שלושה ניסויים מפורסמים :ניוקומב, לוריה ודלברוק ולדרברג. 42אנטיביוטיקה שהעמידות לה ניתנת על ידי מוטציה בריבוזום ופחות על ידי העברה לאטרלית. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 108 ניוקומב ולוריה ודלברוק )עמידות לפאג' (T1 בהדגרה של פאג'ים על מצע של E.coli WTמתקבל ליזיס .אם ה E.coli-מוטנט ועמיד לפאג'ים, החיידקים שורדים ולא עוברים ליזיס – לא מתקבלים פלאקים .על הטכנולוגיה הזו מבוססים שני הניסויים הבאים: הניסוי של ניוקומב קבוצתו של ניוקומב לקחה שש צלחות פטרי וזרעה בזמן 0מספר מדוד וזהה של חיידקים בכל צלחת. לאחר 5או 6שעות ריססו את הצלחות בתמיסה שהכילה פאג'ים. החוקרים ריססו הרבה פאג'ים ולכן אם כל החיידקים יהיו WTלא יהיו כל מושבות; אם יהיו חיידקים עמידים יופיעו מושבות של חיידקים עמידים. מהלך הניסוי ותוצאות כל זוג צלחות רוססו לאחר 5שעות ו- 6שעות – שעה מאוחר יותר .לאחר הריסוס ספרו את החיידקים העמידים – דהיינו מספר המושבות בצלחות .בצלחות שרוססו בפאג'ים לאחר 5שעות ,הופיעו 8מושבות; בצלחת שרוססה שעה מאוחר יותר הופיעו 49מושבות. בזוג אחר של צלחות הוסיפו טיפול :מעט לפני הריסוס מרחו את הצלחת כך ששינו את מיקום החיידקים על פני הצלחת .הפיזור מחדש גרם לכך שכל חיידק שהתחיל את הניסוי יצר מושבה קטנה – כך שהמושבות פוזרו .בצורה זו התקבלו 13מושבות בצלחת שרוססה לאחר 5שעות ולמעלה מ3000- מושבות עמידות בצלחת שרוססה שעה לאחר מכן. כמו כן זוג צלחות שלא רוססו בכלל היוו ביקורת לכלל גודל האוכלוסיה. דיון לפי הפתרון הלמארקי ,המוטציה מתחילה להתרחש רק לאחר החשיפה לגורם הסלקציה .מכאן שהיה צריך להיות אותו מספר מוטנטים בשני הניסויים – לאחר 5או 6שעות .המודל הדרוויניסטי לעומת זאת מסביר מדוע התקבלו יותר מושבות לאחר 6שעות – משום שהחיידקים המוטנטים שהופיעו ספונטנית התחלקו יותר זמן ,התרבו באוכלוסיה ויצרו יותר מושבות בריסוס המאוחר יותר. ההפרשים הגדולים יותר בניסוי המריחה נובעים מכך שהחיידקים העמידים המוטנטים ,אשר לפי המודל של דארווין היו קיימים עוד בטרם הזריעה ,יצרו מושבה קטנה של כמה יחידות מוטנטים .כאשר מורחים חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :15תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה 109 את החיידקים ,כל חיידק ממושבה עמידה נוחת בנקודה אחרת ויוצר מושבה משלו; מסיבה זו מתקבלות הרבה יותר מושבות .עובדה זו מחזקת את הטענה שהמוטנטים היו קיימים מראש – ולא נוצרו רק עם החשיפה ללחץ הסלקציה. כאשר הישוו את מספר המוטנטים בצלחות הלא מפוזרות הצליחו לחשב את שכיחות המוטציה לעמידות – והגיעו לכך שהיא בסביבות .1.6-1.75x10-8 מהלך הניסוי של לוריה ודלברוק ותוצאותיו לוריה ודלברוק לקחו תרבית נוזלית שגדלה ללא לחץ סלקטיבי; מספר דגימות נלקחו מהתרבית ונזרעו בצלחות שונות ,שרוססו לאחר מספר שעות בפאג' .לאחר הדגרה ספרו את מספר המושבות שהתקבלו .בכל צלחת התקבל מספר דומה של מושבות. בוריאציה שנייה לקחו נפחים קטנים מהתרבית לתוך מבחנות ,גידלו כל מבחנה בנפרד ,ואז מכל מבחנה זרעו בצלחת ,ריססו בפאג' וגידלו למשך כמה שעות .במקרה זה התקבלה שונות הרבה יותר גדולה בין מספרי המושבות. הטבלה מציגה את התוצאות המספריות מצלחות הניסוי הראשון והשני בנפרד .ניתן לראות בניסוי השני שונות מאוד גדולה בין המושבות – ברבות מהצלחות לא התקבלו כלל מושבות בעוד שבאחת הצלחות היו 107מושבות. דיון לפי המודל הלמארקי ,המוטציות מתחילות רק לאחר הפעלת הלחץ הסלקטיבי .יש לציין כי אותו מספר חיידקים נזרע בכל פלטה .מכאן, שבהתאם לשכיחות אירוע המוטציה תהיה שכיחות זהה של מושבות בכל צלחת .העובדה שזה לא קורה כאשר הניסוי נעשה בצורתו השניה אומרת שזה כנראה לא המודל שמתרחש בפועל. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 110 התוצאות ניתנות להסבר על ידי המודל הדרוויניסטי :בתרבית הגדולה יש מספר נתון של חיידקים ומוטציות מתרחשות כל הזמן בקצב אחיד .בנקודת הזמן שבה דוגמים ושמים בצלחות ,היות וזוהי תרבית אחת ,ההתפלגות תהיה אחידה. לעומת זאת ,כאשר דוגמים בתחילת הניסוי – כשמספר החיידקים יחסית קטן – ומגדלים במבחנות ,לא מגיעים למיצוע של מספר החיידקים .אירועים מוטציונים שמתרחשים במבחנה אחת מוקדם יותר מבאחרת משפיעים בצורה יותר דראסטית על התוצאות של המבחנה. גם למארק וגם דארווין מסכימים שאירועי מוטציה מתפלגים בצורה פואסונית; יחד עם זאת הם חלוקים בנוגע להתפלגות מספר המושבות המתקבלות .לצורך חישוב אירועי המוטציה ניתן למנות את התרביות בהן היו 0אירועי מוטציות – כלומר צלחות שבהן היו 0מושבות .החישוב מבוצע לפי התפלגות פואסונית ומאפשר לחשב את שכיחות אירוע המוטציה .קצב התרחשות המוטציות מאפשר לתת אומדן לניסוי של ניוקומב ,ולראות שהחישובים אומנם חרגו בסדר גודל – אך האומדן עדיין קרוב מספיק. שימו לב שבניסויים אלו לא נעשה כל לחץ מוטגני ,והמוטציות הנדירות המתרחשות אחת לביליון חלוקות תאים הופיעו במספרים נמוכים; למרות זאת הן יכלו להניב גם צלחות המכילות למעלה מ 100-מושבות, כלומר החלוקה כנראה אינה למארקית. לדרברג )עמידות לאנטיביוטיקה( בניסוי זה ,לדרברג זרע מרבד של מיליוני חיידקים על צלחת אגר ללא לחץ סלקטיבי .מתוך הצלחת הוא עשה replicaלצלחות עם פניצילין וסימן על גבי הצלחות איפה מופיעות המושבות העמידות .לאחר מכן הוא חזר לפלטות המקוריות וחילץ את החיידקים מאותם איזורים. את החיידקים האלה הוא זרע שוב בצלחת ללא אנטיביוטיקה ,עשה replicaלצלחות עם אנטיביוטיקה, וגילה שוב איזורים עם מושבות .ככל שחזר על כך שוב ושוב ,הופיעו יותר מושבות של חיידקים עמידים עד שבסופו של דבר כל האוכלוסיה הייתה עמידה .התקבלה תרבית טהורה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה בלי שנחשפו מעולם ללחץ סלקטיבי של אנטיביוטיקה .מכאן שאין זו תורשה מוכוונת. ניסוי זה היה ההדגמה הפשוטה והאלגנטית ביותר לכך שאפשר לקבל מוטנטים גם בלי לחשוף אותם מראש ללחץ הסלקטיבי ,כפי שטוען המודל הלמארקי. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :15תורשה בבקטריה – פלסמידים וטרנספורמציה 111 השלכות מעשיות מעבר לכך שהמודלים איפשרו התלבטויות וקבלת החלטה בנוגע למודל הנכון )כנראה( ,ניתן לראות גם שאוכלוסיית חיידקים אינה זהה גנטית לחלוטין לחיידק המקורי שיצר את המושבה :מוטציות מתרחשות כל הזמן בקצב נמוך ולכן הזהות הגנטית של מושבה לחיידק המקור אינה דבר ברור מאליו או מחייב .עם כל חלוקה מתקבלים חיידקים ששונים גנטית מהחיידקים איתם החל הניסוי. אם עושים ניסוים גנטיים ב ,E.coli-כותבים את הגנים שלו ורוצים לוודא שזה אכן הגנום ,צריך לשמור סטוקים של חיידקים בצורת ,non-dividing culturesזנים המוקפאים בהקפאה עמוקה כדי שלא ייתחלקו. ניסויים נערכים בזן שעבר מספר מוגבל של חלוקות על מנת להקטין את הסיכון שחיידקי הניסוי יישתנו באופן רציף ממחזור למחזור. פלסמידים פלסמידים הם רפליקונים חוץ-כרומוזומלים הממלאים תפקיד משמעותי בהסתגלות ואבולוציה חיידקית. הרפליקונים הם יחידות המוכרות מהטבע ומזוהות גם בחיידקים מתורבתים .הפלסמידים המועברים לתוך חיידקים בטרנספורמציה ,לעומת זאת ,מהונדסים על ידי אדם. מרבית הפלסמידים הם דו-גדיליים ומעגליים למרות שבטבע מוכרים פלסמידים חד גדיליים ,לינארים וכאלה המסוגלים לקיים את שני מצבי הגדיל .פלסמידים הינם בעלי שונות גדולה בגודלם ומספר עותקיהם .החלוקה היא ל) single copy plasmid-עותק בודד(medium copy ,(3-5) low copy , ) (5-10ו) high copy-מעל .(10 הפלסמידים מקודדים לתוצרי גנים החיוניים לקיומם העצמאי – לאו דווקא לטובת שרידות החיידק ,כעין פרזיטים .הם לא נושאים פונקציות חיוניות למאחסן ,למרות שלעיתים הם נושאים פונקציות המקנות יתרון למאחסן. בטבלה מופיעים מספר פלסמידים שבודדו מהטבע .היא מציגה את רשימת חיידקים שניתן לתרבת )עמודה ימנית( ושמות הפלסמידים הקשורים אליהם )עמודה שמאלית( .שם הפלסמיד מרמז על המקור שלו ) (ColE1או על הפונקציה שהוא נושא ) ,Tolנושא מערכת לדגרדציה של טולואן – חומר המצוי בנפט גולמי ,תכונה המאפשרת לחיידק לגדול בנישות אקולוגיות עם תחרות מועטה(. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 112 משמאל :הבדלים במספרי העותקים בין פלסמידים שונים .פלסמיד Fוהפרופאג' של ) P1מצב ליזוגני( מצויים בעותק יחיד ,בעוד שהאחרים הם Lowאו .Medium to High כלל אצבע :הפלסמידים הגדולים ,שהם לרוב פלסמידים קוניוגטיבים ,נמצאים בעותק יחיד בתא; פלסמידים קטנים יותר נמצאים לרוב במספר עותקים גבוה יותר. שכפול פלסמידים פלסמידים לא מביאים פולימראזים ופונקציות מטאבוליות מורכבות לרפליקציה ,אלא משתמשים במנגנונים התאיים בעזרת אלמנטים הדומים למנגנון הרפליקציה החיידקי .בשורה Bניתן לראות את מנגנון הרפליקציה הרגיל של תאים – על ידי בועת שכפול; יש גם רפליקציה במנגנון בשם Rolling (C) Circleהמשתמש בגדיל אחד כתבנית לבניית הגדיל השני במלואו ,תוך כדי יצירת nickושימוש בגדיל המקור השני כתחל. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :16תורשה בבקטריה ,פלסמדים וטרנספורמציה -המשך 113 שיעור :16תורשה בבקטריה ,פלסמדים וטרנספורמציה -המשך טרנספורמציה טרנספורמציה הינה תופעה של קליטת DNAעל ידי החיידק .טרנספורמציה טבעית קולטת DNA לינארי .התהליך פעיל ,מבוקר ונעשה כאשר החיידק במצב קומפטנטי ומסוגל לקבל את ה.DNA- טרנספורמציה מלאכותית משמשת להכנסת חומר גנטי לחיידקים על גבי פלסמידים. בתהליך הטרנספורמציה יש חיידק תורם ) ,(donorחיידק מקבל ) (recipientוטרנספורמנטים ) (transformantשהם צאצאי הטרנספורמציה .בטרנספורמציות מלאכותיות אין donorמכיוון שמכניסים פלסמיד מלאכותי. טרנספורמציה מלאכותית קליטת פלסמיד DNAשלם מהתמיסה היא תהליך לא יעיל – החיידקים צריכים להיות קומפטנטים כדי לקלוט את החומר הגנטי ,מצב המושרה באופן מלאכותי .ההשראה גורמת לערעור של הממברנה החיצונית של החיידקים לצד שמירה על איזון החיידק כך שניתן יהיה לערער את המעטפת מבלי להרוג את החיידק. • טיפול בקלציום-כלוריד – תמיסת מלחים שגורמת לדה-פולריזציה בערעור הממברנה ויצירת חורים דרכם יכול ה DNA-להיכנס. • אלקטרופורזה – שמים את החיידקים במים ובשדה חשמלי; השדה דוחף את ה DNA-פנימה. התהליכים עדיין לא יעילים במיוחד ולכן יש להפעיל סלקציה – שלרוב נעשית על ידי גן עמידות לאנטיביוטיקה המצוי על גבי הפלסמיד המוחדר .ב 108-חיידקים שעוברים טרנספורמציה מתקבלים 104 חיידקים טרנספורמנטים. שימוש בטרנספורמציה מלאכותית מחקר גנטי – תהליך Gene Replacementמחליף גן בזן מסויים של חיידק בגן מוטנט ,על מנת לחקור את הפנוטיפים של המוטציה. התהליך מתעלה על הגנטיקה הקלאסית כי הוא מאפשר מוטגנזה ישירה ומכוונת לגן ספציפי ,ולא אקראית כמו על ידי .UV התהליך מתאפשר בעזרת – Suicide Vectorsפלסמידים שלרוב אינם מתאימים בין מקור ומאחסן ,כך שהם אינם יכולים להשתכפל במאחסן ונמצאים בעותק יחיד .חשיבות הדבר היא בכך שלא יווצר מצב מרופלואידי-לכאורה שיטעה את התוצאות. באיור מובא מקטע מכרומוזום של חיידק ופלסמיד .מבקשים להחליף את הגן המסומן בשחור .בגן המתאים בפלסמיד יש גן עמידות הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 114 לקנאמיצין אשר גם משמש כגורם סלקציה וגם כגורם הפרעה שיוצר מוטציה בגן .ריקומבינציה בודדת בין הפלסמידים לאיזורים קומפלמנטרים של הגן יכניסו את הגן לכרומוזום לצד הגן התקין ).(A כעת יש לקבל היפוך של תהליך כניסת הפלסמיד – אם המולקולה תתקפל סביב עצמה ) (Bכך שהגן המוטנט יהיה מול התקין .במצב זה יכולה להיות חזרה לאחור – מעגל ייצא מתוך הכרומוזום עם הגן הפגום; לחילופין יכול להיות שהמעגל שייצא יכיל דווקא את הגן התקין ואז בכרומוזום החיידק יהיה עותק יחיד של הגן הפגום עם עמידות לאנטיביוטיקה. מכיוון שהפלסמיד הוא suicide vectorבסופו של דבר הוא נמהל ונעלם מהאוכלוסיה. שימוש בטרנספורמציה לאפיון מוטנטים היום משתמשים בחיידקים לצורך ביטוי חלבונים – מכניסים את הגן לפלסמיד המצוייד באלמנטי הבקרה והשכפול הדרושים לגן בקטריאלי ,מבצעים טרנספורמציה לחיידק המבטא את החלבון בכמויות וכך ניתן להפיק כמויות חלבון גדולות. הטרנספורמציות הקלו על חקר תהליכים ביולוגיים ומיפוי גנטי .הקומפלמנטציה על ידי פלסמידים מקלה על מיפוי מוטציות היום :ניתן לחתוך DNAשל חיידק WTבאנזימי רסטריקציה ולקבל "ספרייה" של פלסמידים המכילים כל אחד מחדר ,איזור אחר של הגנום .אז מחדירים את הספריה לחיידקים מוטנטים בעלי פנוטיפ מסויים ,ומחפשים ביניהם כאלו שרואים בהם פנוטיפ – WTתהליך רברסיה אמיתית. בצורה זו ניתן לזהות מהו הגן שנבע מ WT-והחליף את הגן הפגוע במוטנט. הניסוי של גריפית' לאור הטרנספורמציה תהליך זה הוא טרנספורמציה טבעית :גריפית' לקח חיידקים לא-אלימים מחוספסים וערבב עם תמצית חיידקים אלימים מומתים .הוא ראה שהחיידקים הלא-אלימים הופכים לאלימים .מזלו של גריפית' שיחק לו :חיידקי הסטרפטוקוקוס הינם בעלי מצב קומפטנטי טבעי. גריפית' חשב שמה שמועבר הוא מרכיבים של הקפסולה ,מכיוון שהוא ראה שההבדל בין החיידקים הוא מרכיבי הקפסולה .הצדק היה עמו ,באופן חלקי :ההבדל בין החיידקים הוא מרכיב של הקפסולה ,אך העברת היכולת התאפשרה תודות להעברת הגן למרכיב ולא העברה של המרכיב עצמו. טרנספורמציה טבעית קומפטנטיות טבעית היא תהליך מבוקר שאינו קיים כל הזמן בחיידקים שיכולים להיות קומפטנטים ,מכיוון שקליטת DNAמהסביבה היא יותר סיכון מאשר תועלת .הבקרה הפעילה מתרחשת בעזרת מערכת המאפשרת לחיידק לחוש את סביבתו ולהגיב לשינויים סביבתיים על ידי הפעלת מערכות גנים נחוצות. המערכות האלה פעילות במצבים שונים ומגוונים ומכונות ) Two-Component Systemsשכן הן מורכבות משני רכיבים( .הרכיב הראשון הוא רכיב ממברנלי ,הרצפטור בעזרתו החיידק חש את סביבתו. לרצפטור יש שני תפקידים :בחלקו החיצוני הוא קושר מולקולת ליגנד; הקישור גורם לשינוי קונפורמציה הגורם לו לזרחן את עצמו בחלקו התוך-תאי ) (auto-kinaseולהתחיל את שרשרת מעבר האותות פנימה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :16תורשה בבקטריה ,פלסמדים וטרנספורמציה -המשך 115 לאחר הזירחון-העצמי החלבון מסוגל לזרחן חלבונים נוספים ומזרחן ,Response Regulatorפקטור שיעתוק שמאפשר שיעתוק של גנים מתאימים למערכת אותה הוא מבקר )הוא הרכיב השני במערכת(. התהליך מתחיל מסיגנל סביבתי ,העשוי להתחלק לשנים: • מולקולה המופרשת על ידי תאים אחרים ולא קשורה לחיידק עצמו. • מולקולה המופרשת על ידי החיידק עצמו וחבריו שזהים לו סביבו .במצב זה המערכת משמשת לתקשורת בין החיידקים ומגיבה לשינויים שעוברים החיידקים – בראש ובראשונה לצפיפות שלהם .קומפטנטיות היא סוג כזה של מערכת – תגובה לסיגנל שמופרש מהתאים עצמם. המערכת מופעלת על בסיס גירוי סיפי – מעל סף מסויים .בריכוזים נמוכים היא אינה פעילה .מסיבה זו המערכת חשה ,בראש ובראשונה ,את צפיפות החיידקים .לאחר מעבר הסף הרצפטור עובר זירחון- עצמי תוך פירוק ,ATPמזרחן את בקר התגובה ,אשר מתיישב על גן מסויים ומאפשר את ביטויו. כמו כן במערכת פעיל גם חלבון פוספאטאז – אשר עוצר את התגובה כאשר אין בה צורך .לאחר שהסיגנל נעלם ,הרצפטור עובר שינוי קונפורמציה שמסיר ממנו את הפוספט; אולם בקר התגובה אינו עובר תהליך שכזה ולכן נדרשת הפוספאטאזה. מערכת בי-מרכיב נוספות למטה :מערכת בי-מרכיב קלאסית המשמשת לתגובת חיידקים לשינוי הלחץ האוסמוטי בסביבה .ניתן לראות שזירחון הרצפטורים הוא על גבי שייר היסטידין והזירחון של בקר התגובה הוא על גבי שייר של אספרטאט. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 116 למטה :מערכת זו מכילה ארבעה רכיבים והינה מערכת המבקרת ספורולציה .בין הרצפטור לבקר התגובה יש מתווכי ביניים של הזירחון .סדר העברת הזרחנים מתחיל עדיין בזירחון היסטידין ועובר לסירוגין בין אספרטאט והיסטידין. למרות שיש ארבעה רכיבים זה עדיין משוייך למשפחות הבי-רכיבי. מערכות שמופעלות בליגנד שמקורו בחיידק עצמו מכונות ,quorum sensingבו החיידקים עצמם מפרישים את הגורם לתגובה .במערכת משמאל ,הקשורה לקומפטנטיות ,פרומונים מופרשים החוצה מהחיידק ונקשרים לרצפטור .רצפטור אחר מגיב לפפטיד קומפטנטיות אחר .שני המסלולים הפנימיים של הרצפטורים מתנקזים לתוצר ביניים אחד שמוביל להפעלה של גנים הקשורים בוקמפטנציה. הסיגנלים לספורולציה או לקומפטנטיות הם דומים: צפיפות גבוהה ומחסור במזון גורמים להם להיכנס לכל אחד מההמצבים שלעיל .מסיבה זו שתי המערכות יכולות להתנקז לאותו החלבון ) .(ComAיש לציין כי למרות זאת ,החיידק לא יעשה את שני התהליכים בו זמנית :גורם ההפעלה הסביבתי עשוי להיות דומה אך התוצאה שונה מאוד. שאלות בנוגע למנגנון קומפטנטיות טבעית • כמה יעיל התהליך? • האם חיידקים בעלי העדפה ל DNA-מחיידקים דומים? • באיזה מצב נכנס ה ,DNA-חד -או דו-גדיל? • מהו מנגנון כניסת ה ,DNA-אם נעשית ללא כניסה דיפוזית/ספונטנית של טרנספורמציה מלאכותית? • כיצד ה DNA-מקובע בחיידק המקבל והאינפורמציה תופיעה בו ובצאצאיו? יעילות הקליטה לצורך קביעה זו ,משרים על חיידקים מצב קומפטנטי ,מוסיפים DNAמסומן רדיואקטיבית ולאחר פרקי זמן מתאימים מסרכזים ומפרידים את החיידקים על מנת לבדוק כמה DNAמסומן נמצא בחיידקים. התגובה :מעט ,זהו תהליך לא יעיל לאורך כל שלביו. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :16תורשה בבקטריה ,פלסמדים וטרנספורמציה -המשך 117 ספציפיות הקליטה בתשובה לשאלה זו מתגלה שקיימים שני המצבים :חיידקי עגבת או שפעת מעדיפים קליטה של רצף מבני מינם המכיל רצף ספציפי מסויים .העדפה זו נובעת מכך שהרצפטור לגנום מזהה רצף בן 11 בסיסים ,שהסיכוי להופעתו אקראית הוא נמוך בעוד שהרצף הזה דווקא שכיח ומועשר בגנום של החיידקים הספציפיים בני אותו המין .מכאן שהם יעברו טרנספורמציה ביעילות גבוהה יותר )יחסית( בנוכחות הרצפים האלה .לעומתם חיידקים אחרים יכולים לקלוט כל ,DNAללא תלות ברצף מסויים שיוצר העדפה. מצב המעבר של ה DNA-והמנגנון למטה :מערכות חישה נוספות של חיידקים .בעוד שיש מערכות המשמשות גם ל quorum sensing-כדי לחוש את הסביבה ,ישנן מערכות כדי לשלוח הודעות החוצה לסביבה .יחד עם זאת כרגע עוסקים בכניסה ,לא בהפרשה. ) (aבמערכת type II secretionשל חיידק גרם שלילי קיים מרכיב דמוי-תעלה דרכו עוברות המולקולות .למעט התעלה יש חלבונים ורכיבים שמגייסים מרכיבים שונים לתעלה ומאפשרים את מעבר המולקולה החוצה. ) (bבמערכת Type IV Pilusשל חיידק גראם שלילי יש פילוס ,עמוד המועבר דרך הממברנות בעזרת התעלה .לעומת זאת ,מערכת ה competence-נראית דומה ) – (cברכיב התעלה ובסיס הפילוס – אבל חלקו העליוןש ל הפילוס אינו נמצא .היעדרו מאפשר ל DNA-להיכנס דרך התעלה השנייה לתווך הבין- ממברנלי של החיידק .בממברנה הפנימית של תעלה נוספת ComAשכעת מפרקת את ה DNA-הדו- גדילי לחד-גדיל וכוללת פעילות נוקליאז. בכל הטרנפורמציות הטבעיות המולקולה הנכנסת היא DNAחד-גדילי. הקליטה והקישור של טרנספורט ה DNA-משתמשות במערכות תקשורת אחרות עם הסביבה ,כמו טרנפורטרים ושוטונים ,כדי ליצור מערכת קליטת DNAפנימה. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 118 בחיידק גראם חיובי ) (dיש מערכת דומה :בתוך הדופן הפפטידוגליקאנית ,שאינה מהווה מחסום ממשי ל- ,DNAיש מבנה דמוי-שוטון .אין כאן גיוס מרכיבים ממערכות קיימות אחרות )למרות שזה לא המצב הכולל של גראם-חיוביים( .המבנה דמוי-השוטון הוא רצפטור ה DNA-דרכו הכניסה היא דו-גדילית. ה DNA-מתפרק עם ההגעה לטרנספורטר .ComEC לאחר שה DNA-נקשר לחיידקים ונכנס פנימה ,ה DNA-החד-גדילי נעטף בחלבון DNA-binding proteinשיגן עליו מפני מנגנוני נוקליאז בתאים, בעיקר אקסונוקליאזות )שהן גם הסיבה שלא משתמשים ב DNA-לינארי לטרנספורמציה מלאכותית( .במידה ומתקיימת ריקומבינציה הומולוגית כפולה בין ה DNA-הלינארי לכרומוזום החיידק ,ה DNA-מתקבע בגנום. חיידקים שקולטים DNAזר לחלוטין – של חיידק מזן אחר – מבצעים העברת גנים הוריזונטלית המאפשרת רכישת יכולות חדשות בקנה מידה אבולוציוני .שני המנגנונים העיקריים הפעילים בתהליכים אלו הם: • ) – None-Homologuos End-Joining (NHEJתהליכי קרינה יוצרים שברים דו-גדיליים ב- DNAומפעילים מנגנוני תיקון .בתהליך תיקון השבר יכולים להיכנס מקטעי DNAשאין בהם דמיון .תהליכים אלו מאפשרים לחיידק מקבל להטמיע את הגנום הזר בתוך הכרומוזום שלו. • טרנספוזונים – אלמנטים גנטיים שיודעים לקפוץ ממקום למקום .השינוע אינו תלוי במקור הDNA- של התורם והמקבל ולכן רוב אירועי העברת גנים הוריזונטלית הם אירועי טרנספוזיציה ולא .NHEJ במידה ובתוך ה DNA-הנכנס היה טרנספוזון ניתן יהיה להכניס את המקטע לתוך הגנום. האיור הבא מציג משמאל כניסה של חיידק למצב קומפטנטי ) ,(aקשירה של מולקולת DNAלינארי הנכנסת פנימה ) (bונעטפת בחלבונים מגנים ) ,43(RecAלאחר מכן מצב הומולוגיה וריקומבינציה ) (cמכניסים את הגן ומחליף אותו בגנום ).(d 43מקור החלבון מ E.coli-שאין לו מצב קומפטנטי טבעי ידוע .יחד עם זאת יש לציין שרק מכיוון שהמחקר לא גילה את תנאי הטרנספורמציה במעבדה על מנת שניתן יהיה לשחזר אותה ,אין זה אומר שהגנים לא קיימים וככל הנראה הבעיה היא באמת מציאת התנאים המתאימים ולא שהתכונה אינה קיימת – היא קיימת ככל הנראה בכל העולם הבקטריאלי. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :16תורשה בבקטריה ,פלסמדים וטרנספורמציה -המשך 119 מנגנון יוצא דופן -טרנספורמזום חיידק מסויים ) (Hemophilus influenzaeמקיים מבנה ביניים שונה מכפי שנראה קודם :כאשר ה- DNAנקשר הוא נקשר לאיבר הטרנספורמזום במצב דו-גדילי .לאחר מכן הטרנספורמזום עובר תהליך flippingההופך אותו מהחוץ לפנים .אחד הגדילים של ה DNA-עובר פירוק ובסופו של דבר לציטופלזמה ה DNA-יגיע במצב חד-גדילי. מצב זה מראה מבנה מתמחה שתפקידו לקשור את ה- DNAהנכנס מההממברנה במצב דו-גדילי למרות שהוא לעולם לא מגיע לציטופלזמה במצב דו-גדיל. הקינטיקה של התהליך תהליך הטרנספורמציה מתחלק למספר שלבים :קישור ,DNAכניסה במצב ssDNAאינקורפורציה לגנום ועיגון האינפורמציה בצאצאים .בניסוי הבא מנסים לתזמן את התהליכים האלה. בתהליך זה מוסיפים לחיידקים DNAרדיואקטיבי .לאחר פרק זמן נתון מפוצצים את החיידקים המקבלים ואת ה DNA-שלהם מוסיפים לחיידקים חדשים .רק אז בודקים אם התקבלו טרנספורמנטים .אם מחכים מספיק זמן ,ניתן לראות שה DNA-נכנס פנימה ובסופו של דבר מתקבלים טרנספורמנטים. בפרקי זמן קצרים מאוד לא נכנסת שום רדיואקטיביות; מכאן שהמדידה הייתה מהירה מדי – הקישור של ה DNA-אורך יותר מ 2-3-דקות )נדרשות כ 10-דקות ל 50-קילובסיסים( .בפרק הזמן הבא ידוע שה- הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 120 DNAבפנים אבל לא ידוע אם הוא עבר ריקומבינציה; פיצוץ של החיידקים המקבלים הראשונים לא יניב טרנספורמנטים בפעם השנייה משום שללא קיבוע ה DNA-בגנום ה DNA-נותר חד-גדילי והוא לא יודע להיקשר לרצפטור של ה DNA-בחיידק הקומפטנטי – המכניס DNAדו גדילי בלבד והופך אותו לחד- גדילי. מדוע חיידקים מקיימים קומפטנטיות? • מקור להגדלת שונות גנטית – מוטציות מתרחשות בקצב קבוע ,למרות שמצבי מצוקה יכולים להגביר את הקצב המוטציוני על ידי מנגנוני רפליקציה בעלי פעילות לקויה ולא מהימנה .החיידקים חושפים עצמם לחוסר-יציבות גנטית מוגבר מתוך "שאיפה" למוטציה שתשפר את הפיטנס ללחץ הסביבתי החזק .טרנספורמציה יכולה למלא תפקיד דומה בהקשר זה :אוכלוסיית חיידקים הנמצאים במצב מצוקה קיצוני יכולה להיכנס לקומפטנטיות על מנת לרכוש מהסביבה יכולת להתחמק מהלחץ הסביבתי. • תבנית לתיקון נזקים גנטיים – אוכלוסיית חיידקים שמוקרנת ב UV-עוברת מוטגנזה וגם מתה ומפוצצת .חיידקים שלא הומתו יכולים לקלוט DNAשל חיידקים מתים ולהשתמש בו כתבנית לתיקון מקטעים שנפגעו במוטגנזה כתוצאה מהקרינה .שיטה זו הינה אסטרטגיה הישרדותית. • DNAכמקור מזון חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :16קוניוגציה 121 שיעור :16קוניוגציה קוניוגציה היא מעבר של DNAפלסמידי בין חיידק תורם למקבל ,תוך יצירת קשר בין שני החיידקים – הקשורים במבנה תעלת קוניוגציה שמאפשר מעבר – DNAולכן התופעה חייבת להתנהל כששני החיידקים – התורם והמקבל – חיים )להבדיל מטרנספורמציה(. התצפיות הראשונות היו של לדרברג וטאטום שראו שבין שני חיידקי E.coliשמערבבים יחד מתקבלים צאצאים שנראים כמו שילוב תכונות של ההורים. הפלסמידים הקוניוגטיבים מתחלקים לשני סוגים: • העברה עצמית ) – (Self Transmissibleיודעים לבצע קוניוגציה ,תהליך המקוטלז ודורש מנגנון מתאים להתרחשותו .הפלסמידים מכילים את הגנים לקיום המנגנון. • טרמפיסטים ) – (Mobilizedפלסמידים היודעים לעבור בקוניוגציה אבל לא יודעים להשרות את התהליך .הם אינם מכילים את הגנים המתאימים למנגנון ולכן כדי לעבור עליהם לשהות בחיידק המכיל פלסמיד קוניוגטיבי בעל יכולת העברה עצמית. הקוניוגציות מתחלקות לשני סוגים עיקריים: • שמרניות – בין חיידקים וחיידקים דומים מאוד ,בני אותו מין או זן. • מתירניות ) – (Promiscuousפלסמידים העוברים בין חיידקים שלא דומים אחד לשני ובמקרים קיצוניים אפילו בין חיידקים לתאים ממחלקה אחרת.44 אגרובקטריום – שיא המתירנות דוגמת האגרובקטריום היא הצורה המתירנית ביותר של קוניוגציה :העברת חומר גנטי בין ממלכות פילוגנטיות שונות .ה- Ti-Plasmidמעביר מקטע 45בשם T-DNAלגרעין הצמח וגורם לביטוי של שתי מערכות גנים – – onc & opsהמאפשרות את יצירת העפץ. פציעה של רקמת הצמח גורמת לו להפריש תרכובות פנוליות. האגרובקטריום מכיל חיישן אוטוקינאז במערכת דו-מרכיבית המעוררת הפעלה של של הגנים המאפשרים את המשך התהליך. זה לא quorum sensingכי ההפרשה אינה במקור מהחיידק וגם לא קשורה לפלסמיד. 44תופעת הבסיס לביוטכנולוגיה החקלאית היא קוניוגציה מתירנית – מעבר פלסמיד ה Ti-מחיידק האגרובקטריום לתוך הצמח על מנת ליצור שינוי גנטי מכוון של הצמח .תופעה זו מתחילה בפציעה מכאנית של הצמח המאפשרת לאגרובקטריום להיכנס לתא; הפלסמיד מקבל אות להתחלת קוניוגציה שתעביר חתיכה מסויימת ממנו – – T-DNAלגרעין התא הצמחי בכדי להתחיל בתהליכים הדרושים לקיום האגרובקטריום. 45העובדה שעוברת רק חתיכה מהפלסמיד היא ייחודית – לרוב בקוניוגציה עובר פלסמיד שלם ולא רק חלק ממנו. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 122 לאחר אקטיבציה של המערכת ,ה- tDNAעובר קיצור ועיבוד המשחרר עותק חד-גדילי שלו עטוף בחלבון שהוא תוצר של אחד הVirgins- )הגנים המתעוררים מהתרכובות הפנוליות .(vir ,בהמשך החתיכה עוברת לתא הצמח ,מתקבעת ומתחילה בתהליך ייצור העפץ. פלסמידים בעלי מתירנות בינונית מתירנות בינונית היא בין חיידקים ממינים שונים .הפלסמיד לא יכול לעבור בין ממלכות .המקבילה של ה- Virginsמה Ti-Plasmid-הם Tra ,Genesגנים המקודדים למרכיבים של מערכת הקוניוגציה ולכן חלק גדול הפלסמיד מוקדש לגנים אלו ,החיוניים להקניית היכולת הקוניוגטיבית. כמו כן הפלסמיד חייב לעבור שיכפול במצבים שונים ולכן יש לו שני מקורות שיכפול :כאשר מושרה מצב הקוניוגציה ,השיכפול מתחיל בנקודת OriTבמקום .OriR לסדרת הגנים Traיש תוצרים trans-actingוהם משמשים למצבי רפליקציה ייחודיים ,יצירת הפילוס כפולימר של חלבוני ה Pilin-היוצא מהבסיס כלפי חוץ ,שינוע ה DNA-דרך התעלה וגם אינהיביציה של הקוניוגציה במקרה של "קרובי משפחה" – חיידקים שמכילים פלסמיד קוניוגטיבי לא יכולים לקבל בשנית את אותו הפלסמיד. באיור ניתן לראות שני חיידקים בתהליך קוניוגציה – הפילוס קיים בין שני החיידקים .הפילוס נקשר לחלבון ממברנלי של החיידק המקבל )שאין בו את הפלסמיד( .לאחר יצירת הקשר ,הפילוס ייתכווץ ויביא את שני החיידקים למגע ישיר כך שיוכלו לקיים את הקוניוגציה. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :16קוניוגציה 123 שני סוגי קוניוגציות • העברת פלסמיד מתורם למקבל – המקבל לא הכיל פלסמיד אבל לאחר התהליך מתקבלים שני חיידקים עם פלסמיד קוניוגטיבי ושניהם יכולים להיות תורמים )'.(F+, F • העברה של כרומוזום בקטריאלי – אם הפלסמיד הקוניוגטיבי עבר אינטגרציה לכרומוזום הקוניוגציה תנסה להעביר את כל הכרומוזום מהתורם למקבל ) .(HFRלרוב המעבר לא יתקיים במלואו והמקבל יהיה מרופלואידי זמני ללא היכולת להעברה קוניוגטיבית. טבלה :גנים בעלי עיגול אדום הם הגנים החשובים לקוניוגציה בפלסמיד .Fיש הרבה גנים בעלי פונקציות קוניוגטיביות ,מה שמעיד על הטענה שהפלסמיד מוקדש בעיקרו לגנים מסוג זה. תהליך הקוניוגציה הפלסמיד עובר רפליקציה רגילה בתוך התא עד שניתן האות לקוניוגציה; בשלב זה, knicking-enzyme המקודד על ידי אחד מהTra Genes- מבצע " "knickחד גדילי בפלסמיד. הקצה '5של הגדיל החתוך מוזז ממקומו )(displacement ונדחק מהדו-גדיל בעוד הקצה '3מהווה פריימר לסינטזה על תבנית הגדיל השלם .התהליך ממשיך כאשר הגדיל האחד הולך ומיסנטז תוך כדי דחיקת הגדיל החוצה; בסוף התהליך מתקבל גדיל חדש וגדיל מקורי של הפלסמיד מחוברים יחד .הגדיל המקורי יעבור בסופו של דבר בקוניוגציה אל החיידק התורם ,לאחר שייחתך מהגדיל החדש. הערה :התהליך לא חייב להפיק הכפלה אחת בלבד .בויריונים הוא משמש ליצירת גדיל מאורך שמכיל כמה וכמה עותקים חוזרים של הגנום במנגנון המכונה .rolling circle הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 124 במהלך הסינטזה של הגדיל החדש הגדיל המקורי מוכנס דרך ממשק המגע בין החיידקים התורם והמקבל ,עד שהמקבל קולט את מלוא החד-גדיל .תוך כדי הכניסה של החד-גדיל מתחילה בתורם סינטזה של גדיל קומפלמנטרי בעזרת מקטעי אוקזקי. פלסמידים קוניוגטיבים-טרמפיסטים עוברים כאשר פלסמיד קוניוגטיבי פעיל יצר מצב קוניוגציה .הממשק קיים כבר תודות לפעילות Tra Genesשל הפלסמיד הקוניוגטיבי העצמאי; יחד עם זאת אם בסוף התהליך רק הפלסמיד הטרמפיסט יעבור ,החיידק המקבל לא יהיה חיידק קוניוגטיבי. חיידקי F+ לתא התורם קוראים F+כי הוא מכיל את הפלסמיד )פלסמיד F במקרה זה( והתא המקבל מכונה .F-לאחר קוניוגציה והעברה מלאה של הפלסמיד מתקבלים שני תאים שהם .F+המעבר לא מאפשר לימוד על מיפוי גנטי ,משום שמי שעובר הוא הפלסמיד; כאשר מנסים להשתמש בקוניוגציה למיפוי גנטי עוסקים במצבים שיוצרים חיידק מקבל מרודיפלואידי ואפשרות של שיחלוף גנטי מהתורם למקבל ברמת הכרומוזום .עם זאת, וריאציות של המנגנון הרגיל עוזרות לבצע מיפוי גנטי. משמאל: תעלת הקוניוגציה. כל הרכיבים – למעט ה DNA-פולימראז – מקורם בפלסמיד הקוניוגטיבי .הDNA- החד-גדילי של הפלסמיד נמשך ומושחל דרך תעלת הקוניוגציה והוא עובר פולימריזציה למצב דו-גדיל בתא המקבל. חיידקי HFR .HFR = High Frequency Recombinationאם הייתה זהות גנטית כלשהי בין הפלסמיד הקוניוגטיבי לכרומוזום החיידק המקבל ,למשל על ידי אלמנט טרנספוזיציה ,יכולה להתקים ריקומבינציה הגורמת לאינטגרציה של הפלסמיד הקוניוגטיבי לכרומוזום .כעת הכרומוזום השלם הפך לפלסמיד קוניוגטיבי אחד – כי יש לו את כל ה Tra Genes-וה .OriT-אם יתחיל תהליך קוניוגציה החיידק ינסה להעביר את כל הכרומוזום במנגנון קוניוגציה כמו שהודגם קודם. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :16קוניוגציה 125 ריקומבינציה הומולוגית גורמת ליצירה של חיידק .HFRחיידק E.coliמכיל כמה IS elements שונים במקומות מגוונים בגנום; מכאן שכל HFR יכול להכיל את הפלסמיד הקוניוגטיבי במקומות שונים בגנום בין חיידקים שונים. חיידק HFRיתחיל קוניוגציה באותה צורה – " "knickבאיזור OriTויצירת גדיל חדש תוך דחיקת הגדיל המקורי המועבר לחיידק המקבל .הזמן המחושב של מעבר מלא של הכרומוזום הוא כ100- דקות ,עקב גודלו הרב; אולם הקוניוגציה היא קשר עדין שלרוב לא מחזיק במשך זמן רב כל כך .מסיבה זו מעבר הכרומוזום אינו שלם והחתיכה המועברת כוללת בערך מחצית מהפלסמיד הקוניוגטיבי )ללא ה (Tra Genes-ואת הגנים הכרומוזומלים הקרובים לאותה פיסת פלסמיד – ככל שהחתיכה הכללית ארוכה יותר ,עוברים יותר גנים .מסיבה זו גם החיידק המקבל נותר F-ואינו רוכש יכולת לקוניוגציה בהמשך .החתיכה הזו יוצרת מצב מרודיפלואידי זמני, כי היא מכילה עותק נוסף של הגנים הכרומוזומלים ,אולם חסרת יכולת שיכפול ולא תשרוד זמן רב בחיידק; יחד עם זאת היא יכולה לעגן את האינפורמציה שהיא הביאה בעזרת ריקומבינציה הומולוגית. מיפוי גנטי הכלאות בין HFRלחיידקי F-היא מבחן .Interrupted Matingאורך החתיכה של הכרומוזום שעוברת מחיידק HFRתלויה במשך זמן הקוניוגציה שמתאפשר במהלך הניסוי – ככל שההפרעה מתרחשת מאוחר יותר כן יעבור נתח יותר גדול מהכרומוזום ,כלומר יעברו יותר גנים .העצירה יכולה להיעשות על ידי טלטול חזק בעזרת וורטקס ,השובר את המבנה העדין של הקוניוגציה. ככל שיותר גנים יעברו יהיה מעבר של יותר סמנים – אם החיידק התורם הוא WTוהמקבל הוא )–( לכל הגנים ,ניתן לראות אילו גנים עוברים .כך נוצרת מפה של החיידק בה הגנים מסודרים אחד אחרי השני לפי זמן הופעתם כאשר היחידות במפה הן דקות זמן העברה. HFRמופיעים במקומות שונים HFRמעביר את הגנים הקרובים ל OriT-שלו; אולם כל HFR יכול להכיל את ה OriT-במקום אחר .ניתן להרכיב מפות שונות שמתקבלות מ HFR-שונים ,הממפות רק איזור קרוב ל;HFR- אינטגרציה של הנתונים תיתן קונטיגים חופפים ומפה גנטית מלאה. יש לציין שמפות ראשוניות אלו גסות מאוד ,כי השיטה כזו; לא ניתן להגיע בה לרמות רגישות של מוטציות נקודתיות ,למשל ,כי גן בודד עובר בחלקי-דקה .כמו כן לא ניתן למפות גנים שלא נותנים פנוטיפ מובחן . הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 126 פלסמיד ’Prime Factors – F פלסמידים מסוג פריים-פקטור )'( הם פלסמידים הנוצרים באופן הפיך ליצירת :HFRפלסמיד Fנכנס לתוך הכרומוזום בריקומבינציה אולם בשלב מאוחר הייתה ריקומבינציה נוספת הוציאה את הפלסמיד. לכאורה התהליך רברסיבילי מלא; אולם מכיוון שיש IS שונים ורבים בכרומוזום, אם תתרחש ריקומבינציה בין שני ISכך שחתיכת כרומוזום – המכילה את הפלסמיד – F-תצא מתוך הכרומוזום של החיידק ,ייתקבל פלסמיד קטן וקוניוגטיבי ,המכיל את ה OriT ,Tra Genes-וגנים כרומוזומליים. הפלסמיד הזה מסוגל לבצע את הפעילות של פלסמיד Fהמקורי – הוא עדיין קטן מספיק כדי לעבור בתהליך קוניוגציה .המעבר השלם אומר שהחיידק המקבל של ’ Fיהיה בעצמו חיידק קוניוגטיבי ’;F מעבר לכך ,הוא יכיל באופן קבוע את הגנים שהועברו מהכרומוזום על גבי הפלסמיד ’ – Fהגנים האלו יהיו בחיידק באופן יציב ומשתכפל ,ויוכלו להיות מועברים הלאה גנטית .המצב הזה הוא מרודיפלואידי יציב .המרודיפלואידיות היציבה מאפשרת מחקרים של ציס-טראנס ודומיננטיות-רצסיביות בגנים של חיידקים ,כמו שעשו במציאת מודל האופרון – אלו לא שאלות של מיפוי גנטי אלא של יחסי גומלין בין גנים ותוצרי גנים שלא ניתן לבצע במצבו ההפלואיד של החיידק הרגיל. סיכום F+ החומר הגנטי העובר פלסמיד F המצב של החומר הגנטי פלסמיד התוצר של F- קוניוגטיבי עם F+ HFR ’F גנים ראשונים של פלסמיד ’ ,Fמכיל את הפלסמיד +גנים כל פלסמיד Fונגים כרומוזומלים ללא .Tra כרומוזומלים. לינארי פלסמיד מרודיפלואיד ארעי, מרודיפלואיד קבוע, ללא יכולת קוניוגטיבית .בעל יכולת קוניוגטיבית. שיעור :17בקטריופאג'ים חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :17בקטריופאג'ים 127 בקטריופאג'ים הם וירוסים של חיידקים .לרוב מאופיינים במבנה "רגליים" המהווה רצפטורים המזהים את החיידק הספציפי אותו יכול הפאג' להדביק .מספר הפאג'ים עולה על מספר חיידקים בסדר גודל אחד לפחות ,ויש שהגדירו אותם בתור "הניסוי המוצלח ביותר של הטבע". לפני כ 30-שנים התחבטו בשאלת הסיווג הסיסטמטי של הפאג'ים בפרט והוירוסים בכלל .הסיווג המקובל נקבע על ידי דייויד בולטימור ,זוכה נובל מתחילת שנות ה 70-עבור גילוי ה RT-של הרטרו-וירוסים .בולטימור מגדיר משפחות וירוסים לפי סוג הגנום ואסטרטגיית השיכפול .הגנום יכול להיות RNAאו ,DNAחד גדילי או דו-גדילי; אסטרטגיית השיכפול קובעת האם חד גדיל הוא + ) (senseאו – ) ,antisenseגדיל קומפלמנטרי(. שימו לב שכאשר הגדיל הוא +סימן שהוא נראה לחלוטין כמו ה .mRNA-אם זהו RNAולא DNA משמעות הדבר היא שלא ניתן להתחיל לתרגם אותו מכיוון שאז ייצא החלבון הקומפלמנטרי. מחזור הרפליקציה מחזור הרפליקציה של פאג' מתחיל בהיצמדותו לחיידק ,הזרקה של החומר הגנטי לחיידק – לא כל הוירוס נכנס לחיידק .46מנגנוני החיידק מתחילים לסנטז חומצות גרעין וחלבונים של הוירוס ,הויריונים מורכבים בתוך התא עד שהם פורצים מתוכו החוצה – לרוב בתהליך של ליזיס. זהו מחזור חייהם של וירוסים ליטיים; שיש וירוסים שיודעים להיכנס בצורה מורדמת – להעביר את הגנום באינטגרציה לתוך כרומוזום החיידק .מצב זה מכונה פרופאג' שיכול להתקיים דורות רבים של החיידק במצב רדום .זוהי דרך נוחה להמשיך את קיומו של הוירוס – שהוא במהותו חומצת הגרעין בלבד – בצורה שקטה ולא אלימה. במצב זה ,המכונה ליזוגני ,הפרופאג' ממשיך להתרבות עם החיידק עד לאינדוקציה ,המתרחשת באירוע קטסטרופה ההופך את החיידק למאחסן פחות טוב .הוירוס נוטש את החיידק על ידי חזרה למסלול הליטי. פאג' – T4פאג' זה הוא פאג' ליטי אובליגטורי )ללא מצב ליזוגני(. 46בשונה מוירוסים אנימלים בהם לכל הפחות הקאפסיד נכנס לחיידק בשלמותו. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 128 תזמון השיעתוק של הגנים הגנים של החיידק מתחלקים לגנים מוקדמים ,אמצעיים ומאוחרים כאשר הגנים המוקדמים מכינים את הקרקע לתחילת תהליכי היצירה של הויריונים ,על ידי סינטזה של חומצות גרעין למשל; הגנים האמצעיים מסנטזים את הקאפסיד לרוב; והגנים המאוחרים הם הגנים הליטיים שגורמים לפיצוץ. הפאג' הוא מעין "לגו" – חלקים מורכבים אחד על השני ונארזים יחד .רוב הפאג'ים יודעים לארוז את החומר הגנטי של עצמם – מנגנון האריזה יודע לזהות את חומצת הגרעין של עצמו. תהליך הטרנסדוקציה הכללית תהליך זה הוא תהליך שכיח של העברת חומר גנטי מתורם למקבל על ידי פאג'ים :בתהליך זה יש פאג' שמדביק חיידק ,מכניס חומצות גרעין, מתרבה ,נארז ועומד לפוצץ את התא; אלא שכאן קורה דבר חריג :בעוד שלרוב הפאג'ים יש סלקטיביות לחומצות הגרעין של הוירוס ,פאג'ים בודדים אינם אורזים את חומצות הגרעין של הפאג' אלא חתיכת DNA של המאחסן שהיא מאותו להגודל. תהליכים אלו קורים לרוב במסגרת headfull packagingשאורזים כל חתיכת גרעין שגודלה מתאים למילוי הקאפסיד .הזיהוי בשיטה זו מתבסס על כך שגנום שלם עצום ביחס לגנום של פאג' .יחד עם זאת, בזמן ההתרבות הפאג' גורם לפרגמנטציה של גנום המאחסן – היכולות המטאבוליות של החיידק משועבדות לוירוס ואם חתיכה שבורה של גנום החיידק נארזת בוירוס ייתקבל ויריון שמכיל חתיכת DNAכרומוזומלית. חמוטל בן דב הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 שיעור :17בקטריופאג'ים 129 כאשר המאחסן הזה יתפוצץ הוא ישחרר וירוסים רבים; רובם יהיו ,WTלא רלוונטים לדיון בהכלאות .מי שכן רלוונטי הוא הפאג' הטרנסדוקטיבי – פאג' כלפי חוץ שהקאפסיד והמבנה שלו יודעים להזריק חומר גנטי; אולם החומר הגנטי המוזרק הוא DNAשמקורו בחיידק הראשון שהודבק על ידי הפאג' – החיידק התורם. המקבל כעת במצב מרודיפלואידי ארעי ,כמו ב .HFR-אם בין התורם למקבל ליש קשר משפחתי )מה שלרוב נכון כי פאג' מדביק חיידקים באופן מאוד ספציפי( ,ריקומבינציה יכולה להביא לשיחלוף אינפורמציה בין החיידק התורם למקבל ולקבלת צאצאים שעברו שינוי פנוטיפי )טרנסדוקטנטים(. כיצד ניתן לאתר את התופעה הזו בלי שהויריונים התקינים יהרגו את זה שיודבק על ידי הפאג' הטרנסדוקטיבי? צריך לדעת לעשות את הניסויים האלה :עושים אותם ביחס נמוך של פאג'ים לחיידקים ,על מצע מוצק ,כך שניתן יהיה למצוא את החיידק שהודבק על ידי הפאג' הטרנסדוקטיבי. משמאל :התורמים הם Trp+והמקבלים .Trp- התורמים מודבקים בפאג'ים ,ורובם אורזים גנום וירולוגי; אחד מהם אורז את הגן של .Trp+כעת מדביקים את המקבלים בוירוסים שהתקבלו מהחיידק התורם וזורעים את כל התערובת על מצע ללא טריפטופן .הויריונים הרגילים מדביקים חיידקים אך לא יכולים להתרבות ,כי לתא עצמו אין יכולת לייצר טריפטופן; רק החיידק שהודבק על ידי הויריון עם הגן התקין Trp+יוכל להתרבות. סטטיסטית ,אלו אירועים מאוד נדירים; בפועל ,מכל חיידק יוצאים 100פאג'ים חדשים והניסוי נעשה במיליונים של חיידקים – כלומר מיליארדים של פאג'ים .המספרים הגדולים עוזרים להתקבל על מחסום הנדירות של התופעה. הטבלה מספקת מידע בנוגע לשני הפאג'ים שלרוב משמשים טרנסדוקציה. תדירות קו-טרנסדוקציה הפאג'ים הטרנסדוקטיבים אורזים את הגנום החיידקי באופן אקראי; ידוע מניסויי קוניוגציה מהו הסדר היחסי של הגנים ,אך לא ידוע מהו המרחק בין הגנים. שיטה זו מאפשרת קביעה יחסית מדויקת של המרחקים. ניתן לבדוק קו-טרנסדוקציה – העברה בו זמנית של סמנים קרובים על ידי פאג'ים .ככל שהגנים קרובים הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011 חמוטל בן דב מיקרוביולוגיה -שיעור1 130 יותר ,הסיכוי שיימצאו בחתיכת אחת בת 100קילובסיסים יותר גדול; אם המרחק גדול מ100- קילובסיסים הגנים לעולם לא יעברו יחד. כך ניתן לשלב את הנתונים :מה אחוז הטרנסדוקטנטים שעבר אליהם סמן אחד וגם סמן שני; גן שנמצא בין שני גנים רחוקים יכול לעבור עם כל אחד מהם אך שני הגנים הרחוקים לעולם לא יעברו יחד .ככל שהגנים קרובים יותר תדירות הקו-טרנסדוקציה יותר גבוהה. נניח שיש שלושה גנים – .Pro, Lac & Argנניח שמתוך 100%טרנסדוקטנטים של ,Lacהתקבלו 40% שהיו קו-טרנסדוקציה עם Argו 60%קו טרנסדוקציה עם .Proניתן להבין ש Pro-קרוב יותר לLac- מאשר ,Argאבל איך ניתן לדעת אם Pro & Argהם מצדדים מנוגדים או לא? ניתן לבדוק קו-טרנסדוקציה של שניהם – אם הם מאותו צד הם יהיו בשכיחות גבוהה מ ,60-אם מצדדים מנוגדים יהיו פחות מ 40-ואם יהיו במרחק יותר מ 100-קילובסיסים יהיה שכיחות .0 טרנסדוקציה מתמחה – ליזוגניה פרופאג' במצב ליזוגני ,כאשר מתחילה קטסטרופה במאחסן ,יכול לצאת החוצה ולהתחיל מסלול ליטי; אולם הוא יכול גם להיפלט החוצה מהכרומוזום עקב אירוע ריקומבינציה .שני אלמנטי ISמשני צידי הגנום של הפרופאג' יכולים להוציא החוצה "פלסמיד" עם הגנים של הפאג' ,אשר לרוב ייכלול גם גנום כרומוזומלי .כאשר הגנום ייארז הוא יכיל חלקית כרומוזום של החיידק התורם; אם הגנום ייכנס במקביל למצב ליזוגני ייתקבל מצב מרודיפלואידי יציב בחיידק המקבל ,כי הפאג' לקח את חתיכות ה- DNAהקרובות לאתר האינטגרציה שלו. לכל פאג' יש אתר אינטגרציה אחד במצב ליזוגני; לכן תמיד הטרנסדוקציה של פאג' ליזוגני מסויים תהיה מוגבלת לאיזור הגנטי שקרוב לאתר האינטגרציה .חיידקי ’ Fיותר מגוונים כי מקורם ב ,HFR-שיכולים להיכנס באופן אקראי יחסית בגנום וליצור ’ Fשל אותו איזור .יחד עם זאת בשני המקרים הגדילים של הכרומוזום היוצאים ועוברים לדיפלואידיות יציבה קטנים מאוד ולא מאפשרים מיפוי כמו שהם יכולים לאפשר מחקר דומינטיות או מסלולים רגולטורים. טרנסדוקציה כללית הגנים העוברים האירועים חמוטל בן דב כל אחד מהגנים יכולים לעבור נדירים ,עובדים בתנאים סלקטיביים. טרנסדוקציה מתמחה גנים קרובים לאתר האינטגרציה של הפאג' בלבד. האירועים מאוד נדירים כי מתבססים גם על ריקומבינציה וגם על מעבר של גודל מסויים. הפקולטה למדעי החיים ,אוניברסיטת תל אביב 2011
© Copyright 2024