‫שיעור ‪ :01‬מבוא למיקרוביולוגיה‬ ‫‪1‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא למיקרוביולוגיה‬ ‫מטרות הקורס‬ ‫ההיסטוריה של המיקרוביולוגיה‬ ‫ון לבנהוק הסתכל במיקרוסקופ וראה "דברים קטנים" זזים שכונו "חיות קטנות"‪ .‬הללו הפכו לגורם מחקר‬ ‫מרכזי‪ ,‬שתפס תאוצה במאה ה‪ 19-‬תודות לעבודותיהם של פסטר וקוך‪ ,‬הן במובן הרפואי והן במובן‬ ‫התעשייתי – תסיסה‪.‬‬ ‫בעידן‬ ‫זה‬ ‫רוב‬ ‫העבודה‬ ‫התרכזה בחיידקים מחוללי‬ ‫מחלות‬ ‫והתחילה‬ ‫עבודה‬ ‫במיקרוביולוגיה סביבתית –‬ ‫תפקיד החיידקים מחחוץ לגוף‬ ‫החי‪.‬‬ ‫משנות ה‪ 40-‬מתחיל עידן המחקר הגנטי‪ ,‬בו המיקרואורגניזמים משמשים מודל מחקרי‪ .‬בצורה זו הוכיחו‬ ‫שה‪ DNA-‬הוא החומר התורשתי‪ ,‬מהו מבנה ה‪ DNA-‬וכדומה‪ .‬כאשר התגלה שהקוד הגנטי זהה למדי‬ ‫נטבע המונח "מה שנכון לחיידק נכון לפיל" )שהתברר בדיעבד כלא מדוייק(‪ .‬משנות ה‪ 60-‬אופיינו‬ ‫תהליכי הביוסינטזה של חומצות אמינו וחומרי מזון‪.‬‬ ‫לקראת שנות ה‪ 80-‬עובדים יותר ברמות ה‪ DNA -‬וה‪ RNA-‬ומכירים את ממלכת הארכיאה‪ .‬ב‪1985-‬‬ ‫נכנסים לעידן מיקרוביולוגי‪-‬מולקולארי מואץ המשנה את המחקר על ידי גידול חיידקים שלא ניתן היה‬ ‫לתרבת לפני כן‪.‬‬ ‫ב‪ 1995-‬נעשה ריצוף הגנום הראשון והיום יש כמה אלפי גנומים שלמים‪.‬‬ ‫"כוכב המיקרובים"‬ ‫העולם הוא עולם מיקרוביאלי‪ ,‬והחיידקים נמצאים בו בגיוון עצום ובמספרים עצומים‪.‬‬ ‫•‬ ‫באוקיינוסים יש כמיליארד תאי חיידקים מ‪ 1000-‬מינים שונים בליטר מי אוקיינוס‪.‬‬ ‫•‬ ‫בקרקע יש יותר חיידקים בגרם אחד מאשר בני אדם בעולם כולו‪ ,‬המתפלגים ל‪ 4000-5000-‬מינים‪.‬‬ ‫•‬ ‫בגוף האדם יש כמויות חיידקים גדולות המרוכזות במעי ובחלל הפה‪ 1013-1014 ,‬תאים )פי ‪ 10‬יותר‬ ‫מתאים אנושיים( המתפלגים ל‪ 300-1500-‬מיני חיידקים )תלוי במי מדובר(‪ .‬אם יש בכל חיידק כ‪-‬‬ ‫‪ 3000‬גנים‪ ,‬הרי יש ‪ 3‬מיליון גנים חיידקים במעי אנושי‪ ,‬הרבה יותר מ‪ 20-25-‬אלף הגנים‬ ‫האנושיים‪ .‬לדבר יש השלכות אבולוציוניות על ההתפתחות האנושית‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪2‬‬ ‫מדוע לחקור מיקרוביולוגיה‬ ‫•‬ ‫בריאות – עד היום מזהים מחלות חיידקיות‪/‬ויראליות חדשות‪ ,‬המזוהות בשיטות מולקולאריות‪.‬‬ ‫כאשר גורם המחלה מזוהה‪ ,‬הרבה יותר קל לפתח חיסונים וטיפולים‪ .‬ניתן לפתח חיסונים לרוב‬ ‫החיידקים )למרות שלא תמיד זה כדאי(‪ .‬קשה יותר לחסן כנגד גורמי מחלות אאוקרוטיים‪.‬‬ ‫•‬ ‫חקלאות – חקלאות לא מתקיימת ללא החיידקים‪ ,‬שכן הם אלו שהופכים את החנקן האטמוספרי לזמין‬ ‫לצמחים – היצרנים הראשונים במערכת האקולוגית‪ .‬חיידקים סימביונטים חיים עם צמחים )דוגמה‬ ‫הריזוביה והקטניות( ומקבעים עבורם את החנקן‪ .‬לפני ייצור דשנים כימיים או חנקות במפעל לא ניתן‬ ‫היה לפתח חקלאות בלי העשרת הסביבה של הצמח בחיידקים‪ ,‬ולכן היו מגדלים כל כמה שנים‬ ‫בשטחים חקלאיים קטניות כדי להעשיר את הקרקע בחיידקים מקבעי חנקן‪ .‬מחזור החנקן כולו‬ ‫מותנה בפעילות חיידקית‪ .‬מחזור חשוב נוסף הוא מחזור הגופרית‪.‬‬ ‫אלמנט נוסף הוא באורגניזמים מעלי גרה – אשר קיבת הרומן )‪ (rumen‬שלהם מכילה כמויות גדולות‬ ‫של חיידקים מתאנוגנים )מייצרי מתאן( המפרקים את הצלולוז מהמזון הצמחי של הפרה‪ .‬ללא‬ ‫החיידקים‪ ,‬הפרה הייתה מתה מרעב שכן ‪ 70%‬מהאנרגיה שהיא קולטת מתקבלת על ידי פעילות‬ ‫המתאנוגנים‪ .‬התפתחות מעלי הגרה – על העלאת הגרה ועל זמני העיכול הארוכים – נובעת‬ ‫מהסימביוזה עם המיקרואורגניזמים הפעילים בגופם‪.‬‬ ‫שימור מזון מחייב עיקור המזון או שימורו בקירור על מנת למנוע קלקול המזון בשל פעילות‬ ‫מטאבולית של החיידקים‪ .‬ניתן גם לחסל את החיידקים על ידי קרינה או חומרים כימיים )חומרים‬ ‫משמרים(‪ .‬מכאן שעל מנת לדעת לשמר מזון צריך להכיר את המיקרוביולוגיה‪ .‬בצד החיובי עומדים‬ ‫תוצרי תסיסה כמו אלכוהול‪ ,‬רוטב סויה‪ ,‬קקאו‪ ,‬גבינה וכדומה‪ .‬גם תוספי מזון – חומצת לימון‪,‬‬ ‫מונוסודיום גלוטמאט‪ ,‬שמרי אפייה – כל אלו מיקרואורגניזמים או תוצריהם‪.‬‬ ‫•‬ ‫ביוטכנולוגיה – שימוש באורגניזמים מהונדסים גנטית )‪ (GMO‬למניעת צורך בהדברה כימית של‬ ‫צמחים‪ ,‬שימוש בחיידקים לייצור חלבונים ואלמנטים שונים לרפואה כמו אינסולין‪ ,‬שימוש בחיידקים‬ ‫לתרפיה גנטית‪.‬‬ ‫•‬ ‫סביבה – דלקים ביולוגים מתחדשים‪ ,‬גז טבעי המיוצר על ידי מתאנוגנים‪ .‬באתרי פסולת נאסף הגז‬ ‫הטבעי המיוצר מפירוק המפסולת‪ .‬תהליכי פרמנטציה מאפשרים ייצור אתנול – דלק – מצמחים‬ ‫עשירים בסוכרים‪ ,‬דוגמת תירס וקנה סוכר‪ .‬פעילות חשובה נוספת כאמור היא פירוק פסולת – דוגמת‬ ‫פירוק נפט באירועי שפיכת נפט בימים ובאוקיינוס‪ .‬תהליכי התיקון על ידי החיידקים כמעט תמיד‬ ‫יותר יעילים מהתהליכים מלאכותיים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא למיקרוביולוגיה‬ ‫‪3‬‬ ‫מיקרואורנגיזמים כמודל‬ ‫•‬ ‫מאפשרים חקירת אורגניזם‪/‬אוכלוסייה לבחינת תהליכי התרבות‪ ,‬גידול‪ ,‬הזדקנות ומוות‪.‬‬ ‫•‬ ‫הנדסה גנטית פשוטה יחסית‪ ,‬שינויים מטאבוליים‪ ,‬שליטה בקצה הגידול ונמודיפיקציות גנטיות‪.‬‬ ‫•‬ ‫יחסי הגומלין בין וירוסים )בקטריופאג'ים( וחיידקים המהווה גם כמערכת מודל ליחסי טפיל‪-‬מאחסן‬ ‫שניתן להקיש ממנה לאורגניזמים מורכבים יותר‪.‬‬ ‫יישומים תעשייתיים‬ ‫•‬ ‫מגוון גדול של אורגניזמים בטבע – ניתן למצוא חיידקים שיכולים לבצע כמעט כל תהליך ביוכימי‬ ‫או כימי בתנאים פחות קיצוניים‪.‬‬ ‫•‬ ‫אינפורמציה גנטית קלה לשינוי ומעבר בין פרטים‪ ,‬המגשרת על פערים אבולוציוניים גדולים‪.‬‬ ‫•‬ ‫מיקרואורגניזמים הם קטנים ולכן ניתן לקבל שטח פנים יצרני גדול וחילוף חומרים מהיר ויעיל‬ ‫בביוריאקטור‪ .‬מבחינה הנדסית קל יותר לעבוד איתם מאשר עם צמחים או בע"ח לייצור תוצרים‪.‬‬ ‫•‬ ‫האוכלוסיות גדולות והומוגניות‪ ,‬ולכן מאפשרות פיתוח תהליכים במהירות‪.‬‬ ‫•‬ ‫המיקרואורגניזמים גדלים בעצמם ולכן לא רק מייצרים את התוצר אלא גם את היצרן‪.‬‬ ‫האבולוציה המיקרוביולוגית‬ ‫רוב ההיסטוריה האבולוציונית היא של מיקרואורגניזמים בלבד – בהנחה שכד"א נוצר לפני ‪4.5‬מיליארד‬ ‫שנה‪ ,‬החיים מתחילים לפני ‪ 3.6‬מיליארד שנה והופעת החיידקים מתחילה לפני ‪ 3.3‬מיליון שנה‪.‬‬ ‫ציאנובקטריה מתחילים לפני ‪ 2.7‬מיליארד שנה‪ .‬הדוגמה המקובלת בנוגע לתיאוריה האנדוסימביונטית‬ ‫הוא שתא ארכיאון ותא בקטריה נפגשו‪ ,‬התאחו‪ ,‬והארכיאון הפך לאאוקריוט בעוד שהבקטריה הופך‬ ‫למיטוכונדריה‪ .‬הבעיה עם רעיון זה היא שאין ארכיאות בעלי אורח חיים פאגוציטי‪ ,‬ארכיאונים לא‬ ‫בולעים דברים )לפי הידוע מהארכיאונים הקיימים כיום(‪.‬‬ ‫הופעת האאוקריוטים התרחשה עקב איחוי בן ארכיאון וחיידק‪.‬‬ ‫החיים הרב‪-‬תאיים נמצאים בכדור הארץ זמן קצר למדיי – בתחילה כצמחים ומאוחר יותר כבעלי חיים‪.‬‬ ‫ולכן רוב האבולוציה היא מיקרואורגניזמית באופייה‪ .‬משכי הדורות הקצרים מקצרים את מהלך‬ ‫האבולוציה של המיקרואורגניזמים – ‪ 300‬מיליון שנה שוות לחודש ימים כשמדובר באבולוציה שנדרשים‬ ‫חיידקים לעבור‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪4‬‬ ‫מיון מיקרואורגניזמים‬ ‫מיקרואורגניזמים בכלל וחיידקים בפרט מגוונים‬ ‫מאוד במאפיינים הפיזיולוגיים – צורה וגודל –‬ ‫שלהם‪ .‬הצורות הנפוצות הן צורות "מתג" ו"כדור"‪,‬‬ ‫וגודלם לרוב נע עד מיקרון אך יכול להגיע גם ל‪-‬‬ ‫‪ 600‬מיקרון‪ .‬יחד עם זאת הם עדיין קטנים‬ ‫משמעותית מתאים אאוקריוטים‪.‬‬ ‫מבחינת הצורות כאמור יש כדורים )‪ (Coccus‬או‬ ‫מתג‬ ‫)‪.(Rod‬‬ ‫ומיקרואורגניזמים‬ ‫ישנם‬ ‫מכופפים‬ ‫שיוצרים‬ ‫)‪(Spirilum‬‬ ‫מבנים‬ ‫ארוכים‬ ‫)‪ (Filaments‬או הנצות של "אברונים"‪ .‬ישנן צורות‬ ‫נוספות אך אלו הנפוצות‪.‬‬ ‫טקסונומיה‬ ‫כמו כל האורגניזמים החיים‪ ,‬גם הטקסונומיה הזו עובדת לפי שיטת לינאוס‪ :‬שם האורגניזם ניתן לפי ה‪-‬‬ ‫‪ Genus+species‬ונכתב בכתב נטוי‪ .‬בחירת השם נעשית בהתאם לתיאור האורגניזם או לכבודו של מדען‬ ‫מסויים‪ .‬השם משמש באופן גלובאלי‪.‬‬ ‫‪ – Staphylococcus aurus‬חיידק שיוצר צברים )‪ ,(staphylo‬בעל מבנה כדורי וצבע זהוב‪.‬‬ ‫‪ – Escherichia coli‬על שם החוקר תיאודור אשריש וכן על שם הקולון – המעי הגס‪ ,‬בו הוא חי‪.‬‬ ‫ניתן להוסיף אינפורמציה נוספת של "‪ – "serotype‬קבוצה‬ ‫סרולוגית המאפיינת את החיידק לפי הנוגדנים המצמיתים אותם‬ ‫ותלויה ברכיבים על פני השטח של החיידק‪ .‬ישנו גם פירוט לגבי‬ ‫זנים – למשל ‪ .DH5α‬על פי רוב ניתן לקצר את שם ה‪Genus-‬‬ ‫לאות הראשונה )‪.(E. coli‬‬ ‫הטקסונומיה היא שיטה היררכית הבנויה על ממלכות‪ ,‬מערכה )‪ ,(phylum‬קבוצה‪ ,‬סדרה‪ ,‬משפחה‪ ,‬סוג‬ ‫ומין‪ .‬הטקסונומיה צריכה לשרת מספר מטרות‪:‬‬ ‫•‬ ‫יציבות‪ :‬הגדרות לא צריכות להשתנות דראסטית מגילוי מינים חדשים או נתונים גנטיים חדשים‪.‬‬ ‫•‬ ‫גמישות להוספת מינים חדשים‪.‬‬ ‫•‬ ‫שיקוף דמיון בין אורגניזמים – מינים השייכים לאותה משפחה יהיו קרובים פנוטיפית ו‪/‬או גנוטיפית‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :01‬מבוא למיקרוביולוגיה‬ ‫‪5‬‬ ‫הבעיה בטקסונומיה לחיידקים‬ ‫החיידקים קטנים וצורתיהם מוגבלות; המאפיינים המורפולוגיים של החיידקים מאוד מוגבלים‪ .‬מסיבה‬ ‫זו הם אינם יכולים לשמש לטקסונומיה מהימנה‪ .‬תנאים מתקדמים יותר הם הפיזיולוגיה – תנאי גידול‪,‬‬ ‫פתוגנים מאפיינים‪ .‬חיידק ‪ E.coli‬שגורם לדיזינטריה יהיה מין אחר מ‪ E.coli-‬לא פתוגני‪ .‬גם הביוכימיה‬ ‫מאפשרת טקסונומיה מתקדמת יותר – תכונות של תסיסה‪ ,‬חימצון אמוניה לניטראט וכדומה‪.‬‬ ‫המגבלות בשיטות האלו מגוונות‪ :‬מוטנטים מפריעים למיון‪ ,‬קושי בקביעת המאפיינים המשותפים‬ ‫הנדרשים לשיוך אותה משפחה או הכרזה על משפחה חדשה‪ ,‬סתירות בין מורפולוגיה לביוכימיה‪ .‬דברים‬ ‫אלו קידמו את הלמחקר בכיוון יצירת סטנדרטים לשיטות שיוך וסדר טבעי‪.‬‬ ‫הקשיים האלו היו כה מהותיים‪ ,‬שסטנייה וון‪-‬ניל )העוסקים הגדולים בתחום בזמנו( הגדירו אפילו"הודעת‬ ‫כניעה" לקלסיפיקציה טבעית של חיידקים‪ ,‬שתהיה הגיונית אבולוציונית וגנטית‪.‬‬ ‫השימוש בשעונים ביולוגיים‬ ‫השינוי המהותי התקבל על ידי היחידה‬ ‫הקטנה של ה‪ .rRNA-‬גדיל זה בעל‬ ‫מבנים שניוניים של ‪stem & loop‬‬ ‫ושימש את קרל ווז לפיתוח שיטת מיון‬ ‫למיקרואורג‪-‬ניזמים‪.‬‬ ‫כשווז‬ ‫התחיל‬ ‫‪RNA/DNA‬‬ ‫בשנות‬ ‫לעבוד‪,‬‬ ‫יכול‬ ‫ה‪,'70-‬‬ ‫הבינו‬ ‫להוות‬ ‫ש‪-‬‬ ‫שעון‬ ‫אבולוציוני המתאר את האבולוציה של‬ ‫היצורים התאיים‪.‬‬ ‫רעיון השעון האבולוציוני סובב סביב ריצוף של גן מסויים‪ ,‬השמור מספיק כך שיופיע בכל האורגניזמים‪,‬‬ ‫כך שמדידת השינויים שנעשו בגן הזה בין אורגניזמים שונים תעמוד ביחס ישיר להבדל האבולוציוני‬ ‫ביניהם‪.‬‬ ‫בתקופתו של ווז לא ניתן היה לרצף גנים שלמים או חתיכות ‪ DNA‬גדולות‪ ,‬ולכן הוא הפיק ‪ RNA‬מסומן‬ ‫בכמויות גדולות ובדקו את ההתאמה והריצוף בעזרת ה‪ DNA-‬המסומן‪ .‬הוא אומנם מצא את ה‪rRNA-‬‬ ‫בחתיכות ולא ידע כיצד לסדר אותן‪ ,‬אבל זה נתן לו כלי ראשוני כד להשוות בין חיידקים ולבדוק את‬ ‫ההבדלים ביניהם‪.‬‬ ‫העבודה של ווז לא סיפקה רק תימוכין‬ ‫לתיאוריה האנדוסימביונטית אלא גם‬ ‫שינתה את חלוקת הממלכות – עם‬ ‫חלוקת החיים לממלכות הבקטריה‪,‬‬ ‫אאוקריה וארכיאה‪ .‬הארכיאה המוכרים‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪6‬‬ ‫בתקופתו‪ ,‬המתאנוגנים וההלופילים )אוהבי מלח(‪ ,‬היו בעלי מאפיינים שונים בתכלית מהחיידקים מבחינה‬ ‫ביוכימית אך קרובים מאוד זה לזה כפרטים ולאאוקריוטים כממלכה מבחינה גנטית ‪.‬‬ ‫אילן היוחסין המבוסס על מולקולות יכול לסדר את הטקסונומיה בצורה נכונה יותר‪ ,‬בה נמצאים‬ ‫הבקטריה והארכיאה ואאוקריה‪ ,‬שיוצאים מאותו ענף‪.1‬‬ ‫רצפי ‪ rRNA 18S‬אאוקריוטי קרובים יותר ל‪ rRNA 16S-‬של הארכיאה מאשר לזה של הבקטריה‪ .‬היום‬ ‫השיטה המדעית המועדפת היא בידוד ‪ DNA‬מהחיידק‪ ,‬הגברת וריצוף הגן ל‪ rRNA-‬ואז עימודו בעזרת‬ ‫‪ BLAST‬מול גנומים מוכרים על מנת לשייך אותו לקרוביו הגנטיים‪.‬‬ ‫היתרונות של ‪ rRNA‬כסמן טקסונומי‬ ‫•‬ ‫אוניברסלי – אין אורגניזם ללא ריבוזומים ולכן לכולם יש גם ‪.rRNA‬‬ ‫•‬ ‫נמצא באינטראקציה עם חלבונים ריבוזומליים ולכן אינו נוטה לעבור אופקית בין אורגניזמים‪.‬‬ ‫•‬ ‫ה‪ rRNA-‬בנוי מאיזורים של ‪ ,stem & loop‬והמבנה השניוני מקשה על היווצרות מוטציות –‬ ‫מוטציות מורידות את יציבות המבנה של ה‪ stem-‬ולכן האבולוציה של האיזור מואטת; איזורים של‬ ‫‪ loop‬מתירנים יותר למוטציות ולכן האיזורים נידונים יותר לשינויים‪ .‬האיזורים השמורים מאפשרים‬ ‫לדעת יותר טוב האם העימוד של ‪ rRNA‬משני אורגניזמים הוא נכון‪ .‬האיזורים המתירנים מספקים‬ ‫מידע אודות קצב מוטציות אקראיות והבדלים בין מינים‪.‬‬ ‫•‬ ‫ניתן לאתר טעויות בריצוף לפי המבנה השניוני – לא יתכן שתתקיים מוטציה בגדיל יחיד באיזור‬ ‫של ‪ stem‬ולכן אם קיים דבר כזה ניתן לדעת שזו טעות בריצוף‪.‬‬ ‫סמן טקסונומי טוב מכיל איזורים שמורים מאוד ואיזורים שמשתנים מהר יותר‪ ,‬הוא אינו עובר‬ ‫הוריזונטלית והינו שמור מאוד באבולוציה‪.‬‬ ‫‪ 1‬למרות שווז צייר בתחילה את העץ עם שורש כשהארכיאה והאאוקריה יוצאים מאותו ענף‪ ,‬מאוחר יותר העץ צוייר ללא‬ ‫שורש וללא התחייבות‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬טקסונומיה של מיקרואורגניזמים‬ ‫‪7‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬טקסונומיה של מיקרואורגניזמים‬ ‫החסרונות של ‪ rRNA‬כסמן טקסונומי‬ ‫•‬ ‫לעיתים הסמנים הם יותר מדי טובים עד כדי כך שבין מינים קרובים‪ ,‬שאינם אותו המין הוא אינו‬ ‫משתנה‪ .‬כך המקרה למשל במינים שונים של חיידק השחפת – אשר האחרים יכולים להיות לא‬ ‫פתוגניים או גורמים למחלות שונות משחפת – אולם לכולם יש אותו ‪ 16S rRNA‬ולכן לא ניתן‬ ‫להבחין ביניהם בעזרת הסמן הזה‪.‬‬ ‫•‬ ‫בגנום החיידקים לעיתים יש יותר מעותק אחד ל‪ ;rRNA-‬ב‪ E.coli-‬זה המקרה למשל‪ ,‬אבל הם‬ ‫כולם זהים‪ ,‬אך הדבר אינו מחייב; השונות הקטנה מ‪ 1%-‬אינה מהווה בעיה‪ ,‬אולם לעיתים באותו‬ ‫אורגניזם יש שני עותקים שונים מאוד‪ ,‬בעלי ‪ 5%‬הבדל ואפילו יותר‪ .‬במקרה זה קשה למקם את‬ ‫האורגניזם טקסונומית ואבולוציונית‪.‬‬ ‫במקרים כאלה אפשר להשתמש בגנים שמורים אחרים‪ ,‬דוגמת תת יחידות של ‪.RNA Polymerase‬‬ ‫סמנים אלו משתנים מעט יותר מהר מ‪ .rRNA-‬אך השוואת מספר סמנים גנטיים יכולה לסייע במיון‬ ‫חיידקים מאוד קרובים‪.‬‬ ‫אנומליית ספירת המושבות‬ ‫ההכרה שה‪ rRNA-‬הוא סמן טקסונומי טוב עזרה‬ ‫לפתור בעיה גדולה עוד מלפני העידן המולקולארי –‬ ‫‪ .the great plate count anomaly‬האנומליה‬ ‫אומרת שאם מניחים תחת המיקרוסקופ טיפת מים‬ ‫עם צבע לתאים חיים‪ ,‬מתקבלים עשרות אלפי תאים‬ ‫חיים; פוטנציאלית‪ ,‬נקבל עשרות אלפי מושבות‪.‬‬ ‫בפועל מתקבלות הרבה פחות‪.‬‬ ‫מתברר שכמות החיידקים שניתן לתרבת בצורה נקייה היא מזערית – עשיריות ספורות של אחוז במקרה‬ ‫הטוב ביותר‪ .‬לכן‪ ,‬למרות חשיבות החיידקים לביוספרה‪ ,‬לא ניתן לחקור אותם בפועל; כיצד ניתן לבצע‬ ‫מחקר באוכלוסיה כה חשובה אם מפספסים את רובה?‬ ‫לאחר פיתוח שיטת ה‪ PCR-‬והסמנים הגנטיים של ‪ rRNA‬התוודעו לאפשרות להכיר חיידקים גם בלי‬ ‫לתרבת אותם‪ :‬להפריד את הרצפים של הסמנים הטקסונומיים מתוך הדגימה ולבדוק מהו החיידק השכיח‬ ‫בסביבה המורכבת‪ .‬כשעושים זאת‪ ,‬מתקבל ‪ Total Community DNA‬ממנו מפיקים ‪.16S rRNA‬‬ ‫לאחר מכן מפרידים בין הרצפים השונים של ‪ ,16S‬מבצעים שיחזור פילוגנטי ובודקים למי החיידקים‬ ‫האלה דומים מהעץ הקיים‪ .‬פעמים רבות מוצאים בשיטה זו מינים חדשים למדע‪.‬‬ ‫כבר בעבודות הראשונות שנעשו במי ים סרגאסו‪ ,‬נמצא מין ‪ SAR 11‬שמתברר כמין הנפוץ ביותר‬ ‫באוקיינוס‪ ,‬ולא יכלו לאתר אותו עד אותו רגע‪ .‬מרגע שהוא אותר ניתן היה לחקור אותו‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪8‬‬ ‫הכשל בתרבות מיקרואורגניזמים‬ ‫•‬ ‫גידול על מצעים עשירים יכול לגרום לאוכלוסיה "להזדהם" בחיידקים שהם לא חיידק העניין‪.‬‬ ‫•‬ ‫חלק מהנוטריינטים במצע עשויים להיות טוקסיים בכמויות מסויימות לחיידקים מסויימים‪.‬‬ ‫•‬ ‫האגר שבו משתמשים בצלחות אינו סטרילי לחלוטין – הוא מכיל חומרים של שאריות מתהליך‬ ‫הייצור או מהאצות מהן הוא מופק‪ .‬חומרים אלו יכולים להרוג חיידקים‪ .‬עובדה זו מוכחת כאשר‬ ‫משתמשים באגר נקי יותר המשמש לצורך הפקת ‪.PCR‬‬ ‫•‬ ‫חיידקים יכולים להיות סימביונטים שללא חומרים מהמאחסן – שלא ניתן לנחש אותם בקלות – לא‬ ‫ייגדלו‪.‬‬ ‫הוועדה הטקסונומית העולמית לא מאשרת הגדרת מינים חדשים ללא גידולם בתרבית נקייה; אולם היום‬ ‫ניתן לחקור חיידקים‪ 2‬גם אם לא בודדו אותם ולהגדיר אותם כ‪.candidate species-‬‬ ‫בעוד שהמיקרוביולוגיה הקלאסית מניחה שיש לגדל את החיידק במושבה נקייה‪ ,‬הטכניקות היום‬ ‫מאפשרות לחקור את החיידקים גם בתרביות לא נקיות‪.‬‬ ‫מיון של מיקרואורגניזמים‬ ‫הטקסונומיה מתחלקת כיום לשלוש ממלכות‪ :‬בקטריה‪ ,‬ארכיאה ואאוקריה‪.‬‬ ‫החיידקים‬ ‫•‬ ‫פרוקריוטיים‪.‬‬ ‫•‬ ‫מכילים פפטידוגליקן בדפנות התא )ברובם(‪.‬‬ ‫•‬ ‫מבצעים חלוקה בינארית‪.‬‬ ‫•‬ ‫מנצלים כמקור אנרגיה את אנרגיית השמש‪ ,‬חומרים אנאורגניים או תרכובות אורגניות‪.‬‬ ‫הארכיאה‬ ‫•‬ ‫פרוקריוטיים‪.‬‬ ‫•‬ ‫אינם מכילים פפטידוגליקן בדופן התא‪ ,‬ולא תמיד מכילים אפילו דופן )אם כן היא לרוב חלבונית(‪.‬‬ ‫•‬ ‫הליפידים בממברנה בנויים מאיזופרנואידים הקשורים בקשר אתרי‪.‬‬ ‫•‬ ‫חלוקה בינארית‪.‬‬ ‫•‬ ‫לא זוהו ארכיאה פוטוסינטטיים – משתמשים בכימיקלים אורגניים או אנאורגניים כמקור אנרגיה‪.‬‬ ‫•‬ ‫איחוי ציטופלזמטי – שני תאי ארכיאה יוצרים גשר ציטופלזמטי המאפשר ריקומבינציה של האחד עם‬ ‫הגנום של השני‪ .‬זהו זיווג פארה‪-‬מיני‪ ,‬שעשוי להיות המקור לרבייה המינית‪.‬‬ ‫‪ 2‬המחקר נעשה על הגנום של החיידקים ועל ידי גידולם בתרבית לא נקייה או במצע נוזלי‪ .‬בצורה זו ניתן לחקור פעילויות‬ ‫הנחשדות כמשוייכות לאותם חיידקים ולהתקדם לקראת תירבות נקי‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬טקסונומיה של מיקרואורגניזמים‬ ‫•‬ ‫‪9‬‬ ‫"אקסטרימופילים" – חובבי תנאים קיצוניים )נכון לרוב הארכיאה(‪ .‬סביבות מסויימות בעולם אינן‬ ‫מאפשרות גידול של אורגניזמים כלשהם למעט ארכיאה‪ .‬כך הדבר בהיפר‪-‬תרמופילים )שאינם‬ ‫יכולים לגדול בפחות מ‪ ,80°C-‬ויכולים לגדול בטמפרטורות של ‪ 3120°C‬ולחצים מאוד גבוהים(;‬ ‫אסידופילים )הגדלים ב‪ pH-‬נמוך מ‪ 2-‬ואפילו ‪ – 0.06‬יכולים לגדול בחומצה גופריתית מרוכזת!(;‬ ‫הלופילים )חובבי תמיסות רוויות מלח‪ ,‬חלקם אפילו בריכוזי מגנזיום גבוהים כמו בים המלח‪.‬‬ ‫מאופיינים לרוב בכך שהסביבה המלוחה מחייבת – הם יתפוצצו בסביבה פחות מלוחה(; כמו כן יש‬ ‫קומבינציות – סביבות הגייזרים שהן חמות וחומציות )תרמו‪-‬אסידופילים( או סביבות מלוחות‬ ‫ובסיסיות )תרמו‪-‬אלקאלופילים(‪.‬‬ ‫ממברנות הארכיאה שונות משל בקטריה ואאוקריה כאחד‪ .‬הן עשויות מולקולה איזופרנואידית‪ ,‬המהווה‬ ‫באאוקריה את תחילת מסלול סינטזת הכולסטרול‪ .‬בממברנות הארכיאה נמצאים פיטאניל או ביפיטניל‬ ‫)בחלק קטן מהארכיאה(‪ .‬ביפיטניל יוצר ‪ lipid monolayer‬במקום ‪ bilayer‬והוא כנראה עמיד יותר‬ ‫לחומצה – שכן עד היום האסידופילים שבודדו היו בעלי הממברנה הזו בלבד – אפילו ללא דופן‪.‬‬ ‫העץ הפילוגנטי של הארכיאה‬ ‫העץ מתאר את הפילוגנזה של‬ ‫הארכיאה כפי שהורכבה מסמן‬ ‫ה‪ .16S-‬העץ מורכב ביסודו‬ ‫משני ענפים‪Euryarchaeota :‬‬ ‫‪) & Crenarchaeota‬הקשת‬ ‫אינה בהקשר אבולוציוני אלא‬ ‫מקיפה את ההיפרתרמופילים(‪.‬‬ ‫היוריארכיאה‬ ‫מכילים‬ ‫את‬ ‫האקסטרימופילים‪ :‬מתאנוגנים‬ ‫)סביבות מאוד אנאירוביות – היעדר מוחלט של חמצן(‪ ,‬אסידופילים‪ ,‬הלופילים ותרמופילים‪.‬‬ ‫‪ 3‬לצורך השוואה‪ ,‬זוהי טמפרטורת העיקור של האוטוקלב‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪10‬‬ ‫הקרנארכיאה‪ ,‬עד לפני ‪ 10‬שנים‪ ,‬הכילו רק תרמופילים שניתן היה לתרבת; היום‪ ,‬בשיטות החדשות‪,‬‬ ‫נמצאו בים ענף רחוק של הקרנארכיאוטה ])‪ – [Thaumarcheoya (Marine Crenarchaeota‬ואם הם‬ ‫גדלים בים הם אינם תרמופילים‪ .‬חלקם חופשיים בים ואחרים בסימביוזה עם ספוגים וכנראה חשובים‬ ‫לתפקודם‪.‬‬ ‫שכפול הגנום של הארכיאה‬ ‫כאשר בוחנים את תהליכי השיכפול הגנטי‪ ,‬השיעתוק והתרגום ומשווים אלמנטים חשובים בהם בין שלוש‬ ‫הממלכות – נמצא כי למרות שהגנום של הארכיאה מעגלי כמו של הבקטריה‪ ,‬בכל הנוגע לחלבונים הם‬ ‫ברובם דומים לחלבונים הפעילים באאוקריה‪.‬‬ ‫חשוב לזכור שלחלק מהארכיאה יש ‪ OriR‬יחיד כמו לחיידקים‪ ,‬אך לחלקם יש מספר ‪ OriR‬כמו‬ ‫לאאוקריוטיים‪ .‬עוד עובדה מעניינת היא שבכל הארכיאה שנחקרו עד היום יש איחוי של שני חלבונים‬ ‫)שמקודדים באאוקריוטים בשני גנים שונים( – ליצירת קומפלקס ‪ ,Cdc6/Orc1‬הקושר את ‪.OriR‬‬ ‫עובדה זו מראה שלא רק ששני הגנים האאוקריוטים קשורים‪ ,‬אלא גם‬ ‫המיקום של הגן המקודד לקומפלקס המאוחה קרוב ל‪ OriR-‬של הגנום‪.‬‬ ‫החלבון שנקשר ל‪ OriR-‬מקודד קרוב ל‪.OriR-‬‬ ‫מבחינת שיעתוק נראה שתת היחידה השמורה ביותר דומה יותר בין ארכיאה לאאוקריה‪ ,‬והארכיאה‬ ‫מכילים גם תת יחידות נוספות שלא קיימות בחיידקים אך קיימות ב‪-RNA-‬פולימראז אאוקרוטי‪ .‬כמו כן‬ ‫יש ‪ TATA box‬ב‪ (-30)-‬ויש להם פקטורי שיעתוק הומולוגים לאאוקריוטים‪ .‬יחד עם זאת בקרים‬ ‫שיעתוקיים דומים לאלו של הבקטריה‪ ,‬והאופרונים משותפים‪.‬‬ ‫תרגום בארכיאה‬ ‫הקודון ‪ AUG‬מקודד בבקטריה לפורמילמתיונין‪ ,‬ובארכיאה ואאוקריה למתיונין; כשבוחנים את הריבוזום‬ ‫של הארכיאה‪ ,‬ישנם ‪ 33‬חלבונים ריבוזומליים שקיימים רק בארכיאה ובאאוקריה ולא בבקטריה; לעומת‬ ‫זאת אין אף חלבון שקיים רק בארכיאה ובקטריה או בקטריה ואאוקריה‪ .‬גם תהליכי האלונגציה והתרגום‬ ‫מתבצעים בארכיאה על ידי חלבונים דומים לאלו של האאוקריוטים‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬טקסונומיה של מיקרואורגניזמים‬ ‫‪11‬‬ ‫בארכיאה יש גם פרוטאוזום המזכיר את הפרוטאוזום האאוקריוטי‪ ,‬יחד עם מערכת ‪) tagging‬סימון(‪,‬‬ ‫למרות שזו אינה משתמשת ביוביקוויטין כמו אאוקריה‪ .‬בבקטריה אין פרוטאוזום למעט במין אחד של‬ ‫טוברקולוזיס שכנראה קיבל זאת במעבר אופקי‪.‬‬ ‫אאוקריה‬ ‫•‬ ‫אאוקריה מוגדרים כבעלי גרעין‪ ,‬ולרוב יש גם גולג'י ומיטוכונדריה‪.‬‬ ‫•‬ ‫הם מייצרים אנרגיה על ידי חימצון תרכובות אורגניות ו‪/‬או שימוש באנרגיית השמש‪.‬‬ ‫ה‪ rRNA-‬היה סמן טוב למיקרואורגניזמים אבל הוא גם נותן פתח לטעויות‪ :‬בעוד שעד שנות ה‪ 90-‬הוצע‬ ‫שהענפים הקדומים בעץ הפילוגנטי היו מינים ללא מיטוכונדריה‪ ,4‬ולכן מין אחד כזה בלע חיידק וכך נוצר‬ ‫האאוקריוט‪ .‬אורגניזמים היו בעלי גרעין וללא מיטוכונדריה ובהמשך בלעו מיטוכונדריון והפכו‬ ‫לאאוקריוטים שאנו מכירים היום‪ .‬תיאוריה זו בעייתית מכיוון שהענפים ה"קדומים" האלה מאוד‬ ‫ארוכים – כלומר האבולוציה של ה‪ rRNA-‬הזה היא מהירה מאוד‪.‬‬ ‫כאשר משווים בין המינים לפי סמן טקסונומי אחר‪ ,‬חלבונים השמורים באוקריוטים‪ ,‬מתקבל דווקא עץ‬ ‫שונה לחלוטין מהעץ של ה‪ .rRNA-‬המיקרוספורידיה לא נפלו במקום קרוב לשורש – והם למעשה‬ ‫קרובים של שמרים ופטריות‪ .‬הם אינם כה קדומים כפי שחשבו בתחילה‪ .‬נמצא גם שהקבוצות נטולות‬ ‫המיטוכונדריה אינן קרובות בעץ – אינן על אותם ענפים‪.‬‬ ‫עבודות נוספות מצאו שאורגניזמים אנאירוביים חסרי מיטוכונדריה מכילים שיירי מיטוכונדריה – גנים‬ ‫מיטוכונדריאלים שנותרו בגרעין התא כמו גם מבנים מנוונים של המיטוכונדריה עם פונקציות מוגבלות‪.‬‬ ‫אין אאוקריוט המוכר היום ושאינו מכיל שארית של מיטוכונדריה‪.‬‬ ‫היום‪ ,‬תיאוריית הארכיזואה )אאוקריוטים קדומים ללא מיטוכונדריה( היא התיאוריה הפחות‪-‬מקובלת ורוב‬ ‫התמיכה היא לעץ השני‪ ,‬אשר מושיב את החיות והספוגים קרוב לפטריות והשמרים ולא לצמחים‪.‬‬ ‫‪ 4‬הדוגמה הקיצונית היא המיקרוספורידיה שאין להם גולג'י ולא מיטוכונדריה‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪12‬‬ ‫מיקרואורגניזמים אאוקריוטיים‬ ‫•‬ ‫פטריות – קבוצה אבולוציונית אמיתית )אחידה(‪ ,‬אשר דווקא שונה מורפולוגית‪ .‬מאופיינים בדופן תא‬ ‫עשוי כיטין ואינם משתמשים בפוטוסינתזה‪ .‬עובשים ופטריות הם רב תאיים והשמרים הם חד‪-‬תאיים‪.‬‬ ‫חלוקה לא אבולוציונית מחלקת את שאר המיקרואורגניזמים לקבוצות לא אמיתיות‪ :‬אצות ופרוטוזואה‪.‬‬ ‫•‬ ‫פרוטוזואה – מזכירים יותר חיות מאשר צמחים מכיוון שהם אוכלים או סופגים מולקולות מזון )ע"י‬ ‫פאגוציטוזה או דיפוזיה‪ ,‬בהתאמה(‪ .‬לעיתים יכול להיות תא מעורב שסופג‪/‬אוכל וגם מבצע‬ ‫פוטוסינטזה‪ ,5‬כמו הדונאליאלה‪ .‬הם אינם בעלי דופן קשיחה ולרוב בעלי יכולת תנועה עצמאית‬ ‫)‪ (motile‬תודות לפסודופודיה )מעין רגליים( או מנועי שוטונים )אחד או‬ ‫שניים( או ריסים )מרובים( )‪ .(flagella & cillia‬ההגדרה שלהם לרוב‬ ‫נעשית מורפולוגית – אמבות‪ ,‬ריסניות או פלאגלטות‪ ,‬בהתאם לצורת‬ ‫התנועה‪.‬‬ ‫חשוב לזכור את ההבדלים בין ריסים )רבים ומכסים את הגוף‪ ,‬מתבססים על קינאז ו‪(ATP-‬‬ ‫ושוטונים )מעטים‪ ,‬בצד אחד של הגוף לרוב‪ ,‬צורכים מפלי פרוטונים ולא ‪.(ATP‬‬ ‫• אצות – בעלות דופן תא מצלולוז )לא לכולם(; רובן אינן פגוציטיות‪ ,‬אך כולן פוטוסינטטיות‬ ‫ומייצרות חמצן תוך קיבוע פחמן וייצור חומר אורגני‪ .‬אצות פרימיטיביות יכולות להיות חד‪-‬תאיות‬ ‫בודדות‪ ,‬מושבתיות או יוצרות קורים‪ .‬למרות שכל האצות מכילות כלורופלסטים‪ ,‬הן מחולקות‬ ‫למספר קבוצות מאוד רחוקות בעת האבולוציוני‪ :‬ליד הצמחים היבשתיים‪ ,‬כמובן‪ ,‬אך בענפים רחוקים‬ ‫מאוד‪ .‬בעוד שאירוע בליעת הכלורופלסט לכאורה קרה פעם אחת באבולוציה‪ ,‬ניתן להסביר את‬ ‫הפיצול על ידי אירועים משניים‪ :‬תא אאוקריוטי אחד בלע תא אאוקריוטי אחר שהכיל כלורופלסט‬ ‫וכך רכש את הכלורופלסט שלו‪ .‬חשוב לזכור שלמרות שהאירוע המקורי בו חיידק הפך סימביונט‬ ‫של אאוקריוט‪ ,‬בגלל יכולת הפאגוציטוזה של אאוקריוטים הופיעו שושלות רבות בעלות יכולות‬ ‫‪ 5‬יש גם פוטוסינטזה על ידי בליעת אורגניזמים ירוקים אשר ממשיכים לבצע פוטוסינטזה בגוף הבולען לאחר שנבלעו ועד‬ ‫שייתפרקו‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :02‬טקסונומיה של מיקרואורגניזמים‬ ‫‪13‬‬ ‫פוטוסינטטיות או כלורופלסטים דפקטיבים – כלורופלסטים מנוונים שאינם עושים פוטוסינטזה אך‬ ‫מכיל פונקציות גנטיות חשובות אחרות‪.‬‬ ‫אלמנטים כאלה בפתוגנים דוגמת המלריה מהווים מטרה טובה כנגד החיידק‪.‬‬ ‫בהסתכלות מורפולוגית ופיזיולוגית‪ ,‬קבוצות האצות השונות נבדלות בסוגי הפיגמנט )כולם מכילים‬ ‫את כלורופיל ‪ A‬אך לא לכולם יש כלורופיל ‪ B‬המאפיין צמחי יבשה(; בדופן התא יש לרוב צלולוז‬ ‫אך יש גם קבוצות )דיאטומים( המכילים שלד חיצוני מצורן‪.‬‬ ‫מיון הבקטריה במעבדה‬ ‫מעבדה בקטריולוגית במערכות רפואיות אינה יכולה להתחיל לרצף ‪ 16S‬של חיידקים; בשל כך‬ ‫משתמשים בשיטות מסורתיות לסיווג וזיהוי‪.‬‬ ‫צביעת גרם )‪(Gram Stain‬‬ ‫צביעת גרם מבחינה בין שני סוגי חיידקים לפי סוג‬ ‫הדופן‪ :‬אלו שהדופן שלהם מסוג מסויים יקבלו צבע‬ ‫אחד )סגול( ואחרים‪ ,‬שדופנם יותר חדירה‪ ,‬יקבלו‬ ‫צבע שני )אדום(‪.‬‬ ‫הליך הצביעה מקבע חיידקים על זכוכית‪ ,‬צובע‬ ‫אותם בצבע סגול )‪ (Crystal Violet‬ואז מקבע את‬ ‫הצבע ביוד‪ .‬בשלב הבא מבצעים שטיפה באלכוהול‪:‬‬ ‫מכיוון שבחיידקים עם דופן חדירה האלכוהול נכנס‬ ‫לתאים‪ ,‬הוא מצליח לשטוף החוצה את הצבע‪.‬‬ ‫בהמשך צובעים שוב בצבע אדום )‪,(Safarnin Red‬‬ ‫כך שכל אלו שהצבע פונה מהם הופכים אדומים‪.‬‬ ‫המשך הזיהוי‬ ‫לאחר קביעת סוג החיידק לפי הצביעה )סגול =‬ ‫חיובי‪ ,‬אדום = שלילי( ניתן להמשיך לאפיין אותו‬ ‫לפי מורפולוגיה )קוקוס או מתג( ופיזיולוגיה )צריכת‬ ‫חמצן‪ ,‬תסיסה‪ ,‬וכדומה(‪ .‬על מנת להבחין בדיוק מהו‬ ‫החיידק‬ ‫ניתן‬ ‫להשתמש‬ ‫גם‬ ‫במצעי‬ ‫גידול‬ ‫אינדיקטיבים‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪14‬‬ ‫מצעי גידול‬ ‫יש להבחין בין מצעי גידול עשירים עליהם גדלים רוב החיידקים הבעייתיים מבחינת תעשיית המזון‬ ‫והרפואה לבין מצעים דיפרנציאלים בהם צבע או תכונה אחרת של המושבה תהיה שונה לעומת מצע‬ ‫עשיר )דוגמת מצע עם ‪ X-Gal‬שמבחין בחיידקים בעלי ‪ β-Gal‬פונקציונלי(‪ .‬כמו כן קיימים מצעים‬ ‫סלקטיבים המאפשר גידול של חיידק מסוים או נותן לו עדיפות )למשל מצע עם לקטוז כמקור פחמן‬ ‫יחיד(‪ .‬מצע העשרה מבצע העשרה של קבוצות מסויימות‪ ,‬בעיקר כאלו שעשויות להיות קבוצת מיעוט‪.‬‬ ‫אגר דם – מצע עשיר דיפרנצציאלי‬ ‫מצע עשיר שמוסיפים לו ‪ 5%‬דם כבש )לרוב(‪ .‬זהו מצע עשיר מאוד שרוב‬ ‫החיידקים יכולים לגדול עליו‪ .‬על מצע זה מחפשים חיידקים בעלי פעילות‬ ‫המוליטית על כדוריות דם אדומות – דוגמת סטרפטוקוקים‪ ,‬המסוגלים לבצע‬ ‫המוליזה שלמה )אלפא( הגורמת לאיזור האדום להפוך לצלול‪ ,‬בעוד שחירור‬ ‫חלקי )בטא( על ידי חיידקים אחרים גורם לשינוי בצבע‪ .‬מושבות שלא‬ ‫עושות המוליזה יופיעו אך לא ישנו את הצבע‪.‬‬ ‫אגר מניטול‪-‬מלח – סלקטיבי דיפרנציאלי‬ ‫מניטול הוא סוכר שמעטים החיידקים המסוגלים לפרק אותו; הוספת ‪ 7.5%‬אחוז מלח כבר הורגת את‬ ‫מרבית החיידקים‪ ,‬אך השורדים הם בין היתר מקבוצת סטפילוקוקוס‪ .‬המצע משמש לאיתור את‬ ‫הסטפילוקוקוס אאורוס‪ ,‬שמזהם מזון‪ .‬על ‪ ,phenol red‬חיידק שמסוגל לנצל מניטול כמו ס‪.‬אאורוס ייצר‬ ‫חומצה אשר תיגרום ל‪ phenol red-‬לשנות צבעו‬ ‫לצהוב )מכאן שמו אאורוס(‪ .‬באיור ניתן לראות‬ ‫שעל המצע הדיפרנציאלי‪ ,‬ה‪ E.coli-‬לא גדל וס‪.‬‬ ‫אפידרמידיס לא משנה את הצבע‪.‬‬ ‫אגר מק'קונקי – סלקטיבי דיפרנציאלי‬ ‫חיידקי גרם חיובי לרוב לא גדלים על מצע זה )למעט חיידקי מעיים(‪ .‬המצע‬ ‫מכיל ‪ neutral red‬אשר נהיה סגלגל במגע עם חומצה המופרשת מצריכת‬ ‫לקטוז )שהוא מקור הפחמן במצע(‪ .‬היכולת לחיות במלחי מרה הנמצאים‬ ‫במצע אופיינית לקוליפורמים – ‪ E.coli‬וקרוביו‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬שיטות מולקולאריות לזיהוי בקטריה‬ ‫‪15‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬שיטות מולקולאריות לזיהוי בקטריה‬ ‫•‬ ‫בעזרת ‪ PCR‬ניתן לבודד רצפי ‪ DNA‬הספציפיים למיני חיידקים‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ PCR‬יכול לזהות גם גנים לרעלנים מסויימים‪ ,‬המראים הבדלים דקים בין זני בקטריה‪.‬‬ ‫•‬ ‫)‪ MLST (multi-locus sequence typing‬מאפשר זיהוי אפידמיולוגי – לזהות האם כמה אנשים‬ ‫נדבקו באותו מקור חיידקי )למשל אותה מסעדה שהגישה בשר מקולקל(‪ .‬שיטה זו מגבירה חלקים‬ ‫מהגנים‪ ,‬משווה ביניהם ובודקת האם החולים הותקפו על ידי אותו הזן האלים‪.‬‬ ‫זיהוי מקור החיידק‬ ‫חולים במחלות זהות יכולים לשאת חיידקים מזנים שונים או חיידקים אופורטוניסטים שהיו באותם חולים‬ ‫והתעוררו בשעת כושר מתאימה; יחד עם זאת‪ ,‬במקרים מסויימים‪ ,‬חולים הנדבקים בחיידק מאותו הזן‬ ‫עשויים להתחיל תופעה אפידמיולוגית של התפרצות מחלה מסויימת – למשל התחלת הפצה של זן‬ ‫נוקוזומלי‪.6‬‬ ‫לצורך זיהוי זה ניתן להשתמש בשתי שיטות משלימות ל‪:PCR-‬‬ ‫•‬ ‫‪ – MLST‬רצף הנוקליאוטידים שמקודד לאותו חלבון סביר להניח שיהיה שונה בין זנים שונים –‬ ‫אפילו בנוקליאוטידים ספורים‪ .‬כל הבדל כזה מהווה אלל שונה של הגן‪ .‬שיטה זו בודקת את האללים‬ ‫הקיימים עבור מספר גנים שונים‪ .7‬כאשר נתקלים בשני חולים שלחיידק שלהם אותו ארגון גנטי ניתן‬ ‫להניח שמקור ההדבקה היה זהה‪.‬‬ ‫במידה ויש אחוז גבוה יחסית )אך לא ‪ (100%‬של זהות בין האללים ניתן לומר שמדובר בקבוצה של‬ ‫זנים קרובים‪ ,‬גם אם לא אותו מקור הדבקה ישירה )יכול להיות הדבקה ממקור משני שבו כבר עברו‬ ‫מוטציה קלה(‪ .‬אם זנים זהים ב‪ 7-‬מתוך ‪ 7‬לוקוסים הם כנראה אותו זן; גם אם יש ‪ 6‬מתוך ‪ 7‬סביר‬ ‫שהזנים קרובים ומקורם באותו זן אבל גורמי מחלה אינם מאותו מקור הדבקה‪.‬‬ ‫שיטה זו מבוססת על ריצוף ולכן יחסית רגישה‬ ‫לשינויים‪ .‬ניתן גם לבדוק האם השינוי באלל נובע‬ ‫ממוטציה או ריקומבינציה בשיטות מתקדמות יותר‪.‬‬ ‫משמאל‪ :‬אופן התפזרות מחלות‪ ,‬ככל שהעיגול גדול יותר‬ ‫המחלה יותר נפוצה באיזור המקור וכל נקודת שלוחה היא‬ ‫איזשהו וריאנט‪.‬‬ ‫‪ 6‬זן נוקוזומלי = זן בית חולים שלרוב מסוכן כיוון שהוא מכיל עמידויות לאנטיביוטיקה עקב החשיפה הכבדה לאנטיביוטיקה‬ ‫בבתי חולים‪.‬‬ ‫‪ 7‬גנים של ‪ ,housekeeping‬לא גנים לאלימות או עמידויות‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪16‬‬ ‫•‬ ‫)‪ – PFGE (pulsed-field gel electrophoresis‬גנום החיידקים מופק ונחתך באנזים‬ ‫רסטריקציה שחותך במידה נמוכה יחסית‪ .‬בשיטה זו‪ ,‬על מנת להפריד מולקולות גדולות יחסית‪,‬‬ ‫משנים את כיוון ההרצה בפולסים‪ .‬ככל שהמולקולה יותר גדולה היא מתקשה יותר לשנות כיוון ולכן‬ ‫נוטה להתקבע במקומה‪ .‬בצורה זו‬ ‫ניתן לזהות גם פרגמנטים גדולים‬ ‫של למעלה מ‪ 20-‬אלף בסיסים‪.‬‬ ‫משמאל‪ :‬ג'ל ‪ ,PFGE‬כאשר כל בארית‬ ‫מייצגת חיידק‪ .‬ניתן לראות שכל החיידקים‬ ‫מאותו מקור למעט אחד שניכר בו בנד‬ ‫שלא מופיע בחיידקים האחרים‪ .‬מצב כזה‬ ‫יהיה על פי רוב הוספה של פרגמנט ולא‬ ‫מוטציה‪.8‬‬ ‫מדוע נדרשות שתי השיטות?‬ ‫שיטת ה‪ MLST-‬מדוייקת ומסוגלת להבחין בצורה רגישה בין שני חיידקים שונים; אולם‪ ,‬אם זן מסויים‬ ‫קולט פרגמנט גדול של ‪ – DNA‬למשל פלסמיד עם עמידות לאנטיביוטיקה‪ ,‬המשנה מאוד את מידת‬ ‫האלימות או העמידות של החיידק – שני הזנים ייראו זהים ב‪ ,MLST-‬מכיוון שהגן הנוסף לא נבדק כלל‬ ‫בין הזנים השונים‪ .‬שיטת ה‪ ,PFGE-‬אם כן‪ ,‬משלימה חסרון זה‪.‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מטבוליזם של מיקרואורגניזמים‬ ‫בהסתכלות על מטבוליזם ניתן להבחין בין תהליכים‬ ‫קטבוליים )תהליכי פירוק והפקת אנרגיה( ותהליכים‬ ‫אנבוליים )תהליכי יצירה צורכי אנרגיה(‪.‬‬ ‫רוב‬ ‫הביומסה‬ ‫של‬ ‫המיקרואורגניזם‬ ‫מרוכזת‬ ‫במקרומולקולות – חלבונים‪ ,‬ליפידים פוליסכרידים‬ ‫וחומצות גרעין‪ .‬המונומרים מהווים אחוז מזערי‬ ‫מהביומסה‪ .‬לסינטזת המקרומולקולות נדרשים‬ ‫יסודות‪ ,‬המתחלקים בהתאם לשכיחות אבני הבניין‬ ‫וגודל המולקולות‪ :‬פחמן‪ ,‬חמצן המשמש בתהליכים מטבוליים‪ ,‬חנקן המרכיב נוקליאוטידים וחומצות‬ ‫אמינו‪ ,‬מימן‪ ,‬זרחן החשוב לתהליכי זירחון ובניית נוקליאוטידים וגופרית החשובה לבניית ציסטאין‬ ‫ומתיונין וחלבונים אחרים המשמשים בפעולות מטבוליות אחרות‪.‬‬ ‫‪ 8‬אם הייתה מוטציה שמורידה אתר חיתוך‪ ,‬לא היה רק נוסף בנד – אלא היה נעלם בנד מסויים‪ .‬מכיוון שזה לא המקרה כנראה‬ ‫נוספה חתיכת ‪ DNA‬לגנום‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מטבוליזם של מיקרואורגניזמים‬ ‫‪17‬‬ ‫לצד אלמנטים אלו ישנם יסודות נוספים חיוניים לכל המיקרואורגניזמים‪ ,‬כמו קטיונים )אשלגן‪ ,‬סידן‪,‬‬ ‫מגנזיום וברזל(‪ ,‬מיקרונוטריינטים וויטמינים )הנמצאים בכמויות קטנות אך לרוב אינם חיוניים לכל‬ ‫המיקרואורגניזמים(‪.‬‬ ‫הכרת חומרי ההזנה המצויים בסביבה מאפשרת לקבוע מהו הגורם המגביל את הגידול‪ .‬אם משווים בין‬ ‫ריכוז החומרים בבית הגידול לעומת ריכוזם בביומסה של החיידק‪ ,‬ניתן לראות שבעוד שחומרים‬ ‫מסויימים נמצאים בעודף )דוגמת אשלגן במי ים(‬ ‫אחרים נמצאים במחסור חמור )חנקן וזרחן(‪ .‬מכאן‬ ‫ששני נוטריינטים אלו מגבילים את יכולת הנשיאה‬ ‫של מי הים למיקרואורגניזמים‪.‬‬ ‫בהזרמת שפכים חקלאיים או אבקות כביסה לים‪,‬‬ ‫מגדילים את ריכוז החנקן והזרחן ולכן את כושר‬ ‫הנשיאה של הסביבה לחיידקים‪ .‬השינוי מהותי‬ ‫למערכת האקולוגית‪ ,‬כי העלייה במיקרואורגניזמים‬ ‫משפיעה מאוד על כל המערכת‪.‬‬ ‫‪9‬‬ ‫משמאל‪ :‬אגמים לרוב חסרים בזרחן וחנקן; בניסוי הבא הכניסו תוספת זרחן לאיזור‬ ‫אגם תחום )‪ .(B‬ניתן לראות בבירור שאיזור זה נעשה עכור לחלוטין ומלא‬ ‫במיקרואורגניזמים‪ ,‬המשפיעים על הביוספרה בעלייה בביומסה לצד ירידה של מגוון‬ ‫המינים‪.‬‬ ‫מקורות פחמן ואנרגיה‬ ‫כל יצור חי צריך אנרגיה; אורגניזמים שונים נבדלים בסוג האנרגיה שהם צורכים‪:‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Phototroph‬אורגניזם המנצל אנרגיית אור כמקור אנרגיה‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Heterotroph/ Chemotroph‬אורגניזם המנצל תרכובות פחמן כמקור אנרגיה‪.‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Lithotroph‬אורגניזם המנצל חימצון מולקולות אנאורגניות כמקור אנרגיה‪.‬‬ ‫כמו כן‪ ,‬כל אורגניזם ניתן לאפיין גם לפי מקור הפחמן שהוא צורך‪:‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Autotroph‬אורגניזם המקבע פחמן מהאוויר‪.CO2 ,‬‬ ‫•‬ ‫‪ – Heterotroph‬אורגניזם המשתמש בתרכובות אורגניות כמקור פחמן‪ .‬אינם מקבעים פחמן‬ ‫מהאוויר‪.‬‬ ‫חיידק המשתמש באור השמש כמקור אנרגיה אינו חייב להיות אוטוטרופ! באותה המידה‪ ,‬חיידקים‬ ‫המקבעים פחמן מהאוויר אינם חייבים לעשות זאת בתהליך פוטוסינטזה המשתמש באנרגיית‬ ‫השמש ויכולים לשאוב אנרגיה מחימצון תרכובות אנאורגניות‪.‬‬ ‫‪ 9‬הסיבה שמספיקה תוספת זרחן בלבד היא קיומם של חיידקים המקבעים חנקן מהאוויר ומספקים כך את צורכי החנקן במידה‬ ‫ויתמלא מלאכותית הצורך בזרחן‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪18‬‬ ‫האיורים והטבלה המסכמת מציגים מצבי המקור הפחמני‪/‬אנרגטי של חיידקים מסוגים שונים‪.‬‬ ‫מצעים מעשירים‬ ‫כאשר ידועים הצרכים הייחודיים של אורגניזם‪ ,‬הנגזרים מהכרת חלוקת הביומסה שלו‪ ,‬ניתן ליצור מצעים‬ ‫מעשירים אשר יתעדפו גדילת חיידקים מסוג מסויים על פני חיידקים אחרים‪ .10‬ההרכב חושף לא רק‬ ‫צרכים בנוטריינטים כי אם גם מקורות פחמן ואנרגיה‪ :‬כך למשל‪ ,‬חיידקים שמקבלים הרבה מקורות פחמן‬ ‫הם הטרוטרופיים‪ ,‬ואפילו הטרוטרופיים מפונקים – שאינם מייצרים את כל חומצות האמינו או ויטמינים‬ ‫לבדם‪ ,‬כי החיידק נסמך על המאחסן שיספק לו את הנוטריינטים שהוא זקוק להם‪.‬‬ ‫מצע הגידול מכוּ ָון לחיידק שמבקשים לגדל; חיידק ליטואוטוטרופי שמחמצן גופרית ייגדל על מצע עם‬ ‫הרבה גופרית וללא פחמן‪ .‬אם במצע לא יהיה מקור פחמן כלל‪ ,‬ייקטן הסיכוי לזיהום על ידי חיידקים‬ ‫אחרים מחיידק המטרה שלנו – ‪.Thiobacillus‬‬ ‫בעצם זה שלא מוסיפים מקור פחמן מבצעים ברירה ראשונית כנגד כל ההטרוטרופיים‪.‬‬ ‫נשימה ותסיסה‬ ‫ניתן לחמצן תרכובות אורגניות בשני תהליכים‪ :‬נשימה ותסיסה‪.‬‬ ‫•‬ ‫בתהליכי נשימה – קיימת מולקולה מקבל אלקטרונים סופית כלשהי‪ .‬בתהליך נשימה אירובית גם‬ ‫נוצר מפל פרוטונים המסייע לתהליך זירחון חמצני )‪.(oxidative phosphorilation‬‬ ‫•‬ ‫תסיסה – קיימת מולקולה תורמת אלקטרונים העוברת חיזור‪.‬‬ ‫‪ 10‬לדוגמאות להרכבי מצעים מעשירים‪ ,‬ראו שקופיות ‪ 19-22‬במצגת ‪ 3‬של אורי גופנא‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מטבוליזם של מיקרואורגניזמים‬ ‫‪19‬‬ ‫נשימה‬ ‫הנשימה יכולה להעשות בשתי צורות‪ :‬נשימה אירובית‪ ,‬בה מקבל האלקטרונים הוא חמצן – מקבל‬ ‫האלקטרונים הטוב ביותר מבחינת פוטנציאל החימצון חיזור ולכן מפיק אנרגיה מירבית; או נשימה‬ ‫אנאירובית בה מקבל האלקטרונים הסופי אינו חמצן ולכן מידת האנרגיה המופקת נמוכה יותר‪.‬‬ ‫מקבלי אלקטרונים נפוצים אחרים מלבד חמצן הם‬ ‫ניטראט‪ ,‬סופלאט וקרבונאט‪ .‬שלושת אלו עוברים‬ ‫דה‪-‬ניטריפיקציה‪ ,‬חיזור סופלאט ומתנוגנזה המפיקים‬ ‫חנקן גזי או ניטריט‪ SH2 ,‬או מתאן )בהתאמה(‪.‬‬ ‫שימו לב שבכל התהליכים מתקבלים מים – שכן יש כניסה של חמצן למערכת דרך קולט‬ ‫האלקטרונים‪ ,‬אולם מקבל האלקטרונים אינו החמצן עצמו אלא אטום אחר‪.‬‬ ‫השפעת החמצן‬ ‫השפעת החמצן משתנה בין קבוצות אורגניזמים שונות‪:‬‬ ‫•‬ ‫אירובים אובליגטורים – חייבים חמצן לצורך התרבותם ומחייתם‪ .‬קולט האלקטרונים שלהם הוא‬ ‫תמיד ‪ O2‬ולכן ללא חמצן אינם מסוגלים להתקיים‪.‬‬ ‫•‬ ‫אנאירובים אובליגטורים – נוכחות חמצן אטמוספרי מעכבת את גידולם ואף הורגת אותם‪ .‬לצורכי‬ ‫האנרגיה הם משתמשים בנשימה אנאירובית‪ ,‬תסיסה או מתנוגנזה‪.‬‬ ‫•‬ ‫אנאירובים פקולטטיבים – עוברים בין מצב אנאירובי ואירובי לפי תנאי הסביבה‪ .‬לרוב רק אחד‬ ‫המצבים יהיה מועדף – ולכן הם ייבחרו בו תמיד אם יוכלו‪.‬‬ ‫•‬ ‫ארוטולראנטים )‪ (aerotolerant‬אנאירוביים – מיקרואורגניזמים המשתמשים בתסיסה; החמצן‬ ‫אינו מפריע לגידולם אולם הם לא צורכים אותו‪.‬‬ ‫•‬ ‫מיקרואירופילים – צורכים מעט חמצן אך ברמה מוגבלת מאוד‪.‬‬ ‫על מנת לראות את ההבדלים בין הקבוצות‪ ,‬ניתן‬ ‫לגדל את החיידקים במבחנות עמוקות ללא טלטול‪:‬‬ ‫במצב זה כמות החמצן הולכת ויורדת ל‪ 0-‬ככל‬ ‫שמעמיקים לתוך המצע ולכן ניתן לזהות את אופי‬ ‫צריכת החמצן לפי מיקום החיידקים במבחנה‪.‬‬ ‫נזקי החמצן‬ ‫נזקים אלו נובעים מרדיקלים של חמצן‪ .‬למרות‬ ‫יציבותה של מולקולת ‪ ,O2‬היא עשוייה לייצר‬ ‫בפירוק לא‪-‬מלא מחמצנים חזקים – סופראוקסידים‪,‬‬ ‫מי חמצן או רדיקלים אוקסידים‪ .‬לאורגניזמים הנחשפים לחמצן יש רמות התמודדות שונות לצורך דה‪-‬‬ ‫טוקסיפיקציה של תוצרי החמצן ויכולת התמודדות טובה יותר תאפשר חשיפה וצריכה מוגברות של חמצן‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪20‬‬ ‫•‬ ‫סופראוקסיד דיסמוטאז – הופך‬ ‫שתי מולקולות סופראוקסיד לים ומי‬ ‫חמצן‪ .‬מי חמצן הם עדיין מחמצן חזק‬ ‫ולכן נדרש טיפול נוסף‪.‬‬ ‫•‬ ‫פרוקסידאז – הופך את מי החמצן‬ ‫למים בעזרת כוח מחזר‪.‬‬ ‫•‬ ‫קטאלאז – הופך את מי החמצן‬ ‫למים וחמצן ללא ניצול של חומר‬ ‫מחזר‪.‬‬ ‫ברוב‬ ‫המיקרואורניזמים‬ ‫האירובים‪,‬‬ ‫הפקולטטביים והאובליגטורים‪ ,‬קיימים‬ ‫האנזימים‬ ‫סופראוקסיד‬ ‫דיסמוטאז‬ ‫וקטאלאז‪ ,‬עובדה שמתבטאת בבעבוע במצע עקב הנשימה של חיידקים דוגמת ‪ .E.coli‬האירוטולראנטים‬ ‫לרוב בעלי האנזימים סופראוקסיד דיסמוטאז ופרוקסידאז‪ ,‬העובד ביעילות נמוכה יותר מאשר קטאלאז;‬ ‫אנאירובים אובליגטורים אינם מכילים אף אחד מהאנזימים הנ"ל‪ .‬מיקרואירופילים מבטאים כמויות‬ ‫נמוכות של קטאלאז או פרוקסידאז‪ ,‬ולכן אינם מתמודדים היטב עם כמויות חמצן גדולות‪.‬‬ ‫לחלק מהאנאירוביים האובליגטוריים‪ ,‬כפי שידוע היום‪ ,‬יש אנזימי סופראוקסידאז אך הם כנראה אינם‬ ‫יעילים מספיק כדי לסייע להם‪ .‬עם זאת‪ ,‬האנזים כנראה עוזר בהתמודדות עם חשיפה זמנית לחמצן עד‬ ‫שיחזרו לסביבה אנאירובית‪.‬‬ ‫אורגניזמים כה רגישים לחמצן קשים‬ ‫לגידול במעבדה‪ .‬אחד הפתרונות הוא‬ ‫‪ :anaerobic jars‬השקית הקרועה‬ ‫)באיור( מכילה חומר שמגיב עם החמצן‬ ‫ומחסל אותו‪ .‬יחד עם זאת פתיחת‬ ‫המיכל תחשוף שוב את הסביבה לחמצן‪ .‬לשם כך יש מעין אינקובטור אנאירובי – שולחן עבודה אליו‬ ‫מוזרם חנקן המונע כניסת אוויר‪ .‬האיזור הוא סביבת עבודה שלמה ומשמשת לעבודה עם חיידקים מאוד‬ ‫רגישים לחמצן‪ ,‬כמו מתאנוגנים‪.‬‬ ‫תרביות העשרה‬ ‫תרבית העשרה היא אחד הבסיסים עליהם נשענת המיקרוביולוגיה‪ .‬המטרה היא לבנות מצע גידול‬ ‫סלקטיבי לטובת החיידקים שרוצים לגדל וכנגד כל השאר‪.‬‬ ‫לעיתים קרובות על מנת לבודד אורגניזמים ניתן לקחת דגימה מבית הגידול )למשל גוש עפר( ולהשליכו‬ ‫בסביבה המכילה חיקוי של הסביבה הטבעית עם תנאים המתאימים לחיידקים המבוקשים‪ .‬הדגימה עוברת‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫שיעור ‪ :03‬מטבוליזם של מיקרואורגניזמים‬ ‫‪21‬‬ ‫מהסביבה ישירות למצע העשרה ומאפשרת להעשיר אפילו תא יחיד‪ .‬שיטה זו מהווה יתרון כי היא‬ ‫מאפשרת לאתר חיידקים נדירים באוכלוסיה‪ ,‬אולם אליה וקוץ בה – מספיק חיידק אחד נוסף שיכול לחיות‬ ‫באותם התנאים והתרבית מזוהמת ורמת הפעילות אינה ניתנת להערכה; גם תגובה שלילית אינה אומרת‬ ‫כלום – אם לא התקבלו חיידקים אין זה אומר שהם לא קיימים‪ ,‬יכול להיות שפשוט לא נמצאה השיטה‬ ‫לתרבת אותם עדיין‪.‬‬ ‫הדבר שימושי גם בתעשייה‪ :‬ניתן להעשיר בתעשייה חיידקים מפרקי נפט וכך במקרים של זיהומי נפט‬ ‫מוכרים קוקטייל מפרקי נפט שיעזרו לפירוק השפכים בצורה מהירה לפני שתספיק לגרום נזקים חמורים‬ ‫מאוד לסביבה האקולוגית‪ .‬אותה השיטה תקפה לכל מזהם – החל מקוטלי עשבים ועד שיירים של חומרי‬ ‫נפץ‪ .‬לשם כך פשוט משתמשים בחומר המזהם כבסיס של מצע העשרה ויוצרים תרבית חיידקים שתוכל‬ ‫לפרק את מקור הזיהום‪.‬‬ ‫על מנת לבנות מצעי העשרה שונים יש להרכיב מסלול תנאים שונים‬ ‫‪11‬‬ ‫שניתנים על מנת לקבל את‬ ‫החיידקים המבוקשים‪ :‬חומרים אורגנים עם‪/‬בלי תאורה‪ ,‬תנאי נשימה אירובית‪/‬אנאירובית‪ ,‬תרכובות פחמן‬ ‫שניתן‪/‬לא ניתן להתסיס‪ ,‬מקור חנקן מורכב‪/‬חנקן אטמוספרי‪ ,‬מקורות נשימה אנאורגנים‪/‬אורגנים‪.‬‬ ‫תסיסה‬ ‫תהליך זה מתחיל במולקולה אורגנית המהווה תורם‬ ‫אלקטרונית העוברת תהליכי ביניים ומתקדמת לשלב‬ ‫של זירחון ויצירת תוצר עתיר‪-‬אנרגיה שמתחמצן‪.‬‬ ‫בשלב החימצון עוברים האלקטרונים לתורם‬ ‫אלקטרונים‪ ,‬לרוב ‪ ,NAD‬ובתהליך החימצון נוצר‬ ‫‪ .ATP‬התוצר המחומצן עובר חיזור כדי למחזר את‬ ‫נשא האלקטרונים‪ .‬תהליך הגליקוליזה משמש כשלב מקדים לתסיסה‪ ,‬כאשר תוצר הגליקוליזה –‬ ‫פירובאט – ממשיך לתסיסה‪ .‬בשלב ההכנה מושקעות שתי מולקולות ‪ ATP‬על מנת להפוך את הגלוקוז‬ ‫ל‪ G3P-‬הממשיך לייצור פירובאט‪ ,‬בתהליך המפיק ארבע מולקולות ‪.ATP‬‬ ‫התססת הפירובאט נועדה למיחזור נשא האלקטרונים שהוא הכוח המחזר‪ .‬דרך אחת היא חיזור‬ ‫הפירובאט ללקטאט‪ ,‬הנעשה על ידי חיידקי חומצה לאקטית ושרירים‪ .‬דרך אחרת היא הפיכת הפירובאט‬ ‫לאצטאלדהיד ומשם חיזורו לאתנול )שמרים(‪.‬‬ ‫תסיסה היא תהליך בו ייצור ה‪ ATP-‬נעשה ישירות בתהליך ומקבל האלקטרונים הוא תוצר של‬ ‫התהליך עצמו ולא גורם חיצוני‪.‬‬ ‫‪ 11‬למספר מסלולים לדוגמה‪ ,‬ראו שקופיות ‪ 37-39‬במצגת ‪ 3‬של אורי גופנא‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪22‬‬ ‫שיעור ‪ :04‬מחזור החנקן‬ ‫החנקן יכול להימצא במספר מצבי חימצון בטבע‪,‬‬ ‫כאשר הוא נע ממצב פוטנציאל חימצון של )‪(-3‬‬ ‫באמוניה ועד )‪ (+5‬בניטראט‪.‬‬ ‫החנקן במצבו הגזי אינו זמין ביולוגית לרוב האורגניזמים‪ ,‬אולם הוא נדרש לכל היצורים החיים‪ .‬למרות‬ ‫שהחנקן הגזי לא זמין‪ ,‬תרכובות אחרות של מלחי חנקן‪ ,‬אמוניה וניטריט זמינות לצורך אסימילציה‬ ‫)הטמעה(‪.‬‬ ‫הגורם המגביל של גידול מיקרואורגניזמים בסביבות מימיות הוא לרוב הפוספט‪ ,‬אולם בקרקע הגורם המגביל‬ ‫– בעיקר לצמחים‪ ,‬החשובים לחקלאות – הוא כמות החנקן‪.‬‬ ‫מחזור החנקן בטבע‪:‬חנקן אטמוספרי מקובע על ידי מיקרואורגניזמים או אדם ומסופק כדשן אמוניה לקרקע;‬ ‫האמוניה עוברת תהליכי חימצון וחוזרת בסופו של דבר לחנקן אטמוספרי‪ .‬במקביל תהליכי פירוק של‬ ‫אורגניזמים מתים עוברים אמוניפיקציה – פירוק על ידי מיקרואורגניזמים ופטריות המוביל ליצירת אמוניה‪.‬‬ ‫אמוניפיקציה – פירוק תרכובות חנקן שבסופו של דבר יוצר אמוניה‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :04‬מחזור החנקן‬ ‫‪23‬‬ ‫היום ידוע שמחזור החנקן מורכב יותר; תהליך‬ ‫חשוב שנוסף לסכמה הוא ה‪– ANAMMOX-‬‬ ‫חימצון אמוניה אנאירובי‪ ,‬שהתגלה בשנים‬ ‫האחרונות‪ .‬רוב התהליכים האחרים מוכרים מסוף‬ ‫המאה ה‪.19-‬‬ ‫קיבוע חנקן‬ ‫החנקן היא מולקולה בעלת קשר משולש‪ ,‬הקשה‬ ‫לניתוק ושבירה‪ .‬המרת חנקן אטמוספרי לאמוניה‬ ‫בתוספת מימן היא ריאקציה עם אנרגיית שיפעול גבוהה מאוד‪ ,‬ולכן רק ב‪ 1918-‬הומצא תהליך המאפשר‬ ‫את הריאקציה‪ ,‬ועדיין הוא דרש לחצים של מאות אטמוספרות‪ ,12‬טמפרטורות גבוהות – תהליך עם‬ ‫השקעה אנרגטית גבוהה מאוד להפקת הדשנים‪.‬‬ ‫היום לא היו יכולים בני אדם כה רבים להתקיים ולאכול בלי היכולת לקבע חנקן באופן מלאכותי‪ .‬אולם‬ ‫החיידקים עשו זאת קודם ובצורה יעילה יותר – בלחצים ובטמפרטורות סביבתיים )למרות שזהו תהליך‬ ‫הצורך אנרגיה רבה מהחיידק(‪.‬‬ ‫מדוע לא ניתן להשתמש בחיידקים מקבעי‪-‬חנקן לייצור דשנים?‬ ‫התהליך החיידקי בעייתי מבחינה תעשייתית היום‪ ,‬אבל כן מנסים ליצור צמחים טרנסגנים שיקבעו חנקן‪ .‬יש‬ ‫לזכור כי אמוניה רבה בקרקע אינה מועילה; צריך למצוא דרך לגרום לקיום הרבה אמוניה בצמח‪.‬‬ ‫קומפלקס הניטרוגנאז וקיבוע חנקן‬ ‫קיבוע חנקן אטמוספרי מוכר רק בפרוקריוטיים ספציפיים – בעיקר בקטריה אך גם ארכיאה‪ .‬ישנם‬ ‫מיקרואורגניזמים מקבעי חנקן שהם "‪ ,"free living‬אחרים סימביונטיים ויש מצבי ביניים‪.‬‬ ‫קומפלקס קיבוע החנקן רגיש מאוד לחמצן‬ ‫‪13‬‬ ‫ובכל זאת יש מינים רבים המקבעים חנקן‪ ,‬אפילו בתחום‬ ‫המיקרובים העצמאיים‪ .‬רובם גם מצליחים להתמודד עם גדילה אירובית – צריכת חמצן ליצירת חומר‬ ‫אורגני – לצד קיבוע החנקן‪ .‬מיותר לציין שהמיקרובים האנאירובים אינם מתקשים בתהליך הקיבוע‪.‬‬ ‫גם בקרב הארכיאה – בקבוצות מסויימות של מתאנוגנים – יודעים לקבע חנקן ובתור אורגניזמים שמקבעים‬ ‫גם פחמן וגם חנקן הם מאוד עצמאיים מבחינת דרישות החיים שלהם‪.‬‬ ‫סוגים שונים של קיבוע חנקן ביולוגי‬ ‫•‬ ‫חיידקים עצמאיים – בעיקר ציאנובקטריה מקבעי חנקן ומיני קרקע כמו אזוטובקטריה‪.‬‬ ‫•‬ ‫חיידקים סימביונטים – יקבעו חנקן באינטראקציה כזו או אחרת עם שורשים‪ ,‬כמו זו שבין שורשי‬ ‫הקטניות ומיני הריזוביום או הפרנקיה )‪ ,(Frankia‬משפחת מיקרואורגניזמים שיכולים לעבוד‬ ‫‪ 12‬הריאקציה נעשית בלחץ גבוה כי זו ריאקציה בה ‪ 4‬מול גז מגיבים ליצירת ‪ 2‬מול גז ולחץ גבוה דוחף לכיוון התוצרים‪.‬‬ ‫‪ 13‬עובדה זו הינה חלק מהקושי לבסס תהליך תעשייתי על תהליך זה‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪24‬‬ ‫בסימביוזה לא ספציפית באינטראקציה עם כמה מינים של צמחים )שלא כמו בריזוביום‪ ,‬שם‬ ‫הסימביוזה ספציפית למין מסויים של קטנית(‪.‬‬ ‫•‬ ‫סימביוזה אסוציאטיבית – לא צריכה פקטורים של הצמח לקיבוע חנקן אולם המיקרואורגניזם נוטה‬ ‫"לאהוב" להיות באדמה עם סביבה של שורשים ולכן ימצא שם יותר‪ .‬לעובדה זו יש יתרון לחקלאות‪:‬‬ ‫ניתן לפזר מיקרואורגניזמים אלו בקרבת שורשי צמחים חקלאיים והם נוטים להישאר בסביבת‬ ‫השורש‪ .‬יחד עם זאת הם לא צריכים את השורש‪ ,‬פעילות צמחית או פקטורים ממנו על מנת לגדול‪.‬‬ ‫קומפלקס ניטרוגנאז‬ ‫מורכב משתי יחידות אנזימטיות‪:‬‬ ‫•‬ ‫)‪Dinitrogenase reductase (Fe‬‬ ‫•‬ ‫)‪ – Dinitrogenase (FeMo‬מכיל קופקטור של ברזל‪.‬‬ ‫שתי תת היחידות רגישות לחמצן‪ ,‬אשר בנוכחותו הן עוברות דה‪-‬נטורציה בלתי‪-‬הפיכה‪ .‬התהליך צורך‬ ‫הרבה ‪ ATP‬ומערב מעבר אלקטרונים על ידי חלבון מעביר אלקטרונים‪ .‬האלקטרונים עוברים ל‪Fe-‬‬ ‫שמעביר אותם ל‪ ,FeMo-‬ממנו הם מועברים בסופו של דבר למולקולת החנקן‪.‬‬ ‫התהליך מצריך ‪ ATP‬ויוני מגנזיום והוא מאוד יקר‪ :‬צריכה של ‪ 16‬מול ‪ ATP‬להפיכת מול אחד של‬ ‫חנקן לאמוניה‪ .‬ברגע שריכוזי האמוניה עולים יש רפרסיה לתהליך‪ ,‬על מנת שלא יהיה בזבוז אנרגיה‬ ‫כאשר יש מספיק חנקן לחיידק‪.‬‬ ‫קומפלקס הניטרוגנאז יכול לחזר גם קשרים משולשים אחרים‪ ,‬ואינו עובד רק על חנקן אטמוספרי; עובדה‬ ‫זו נוחה לצורך זיהוי פעילות ניטרוגנאז במעבדה‪ ,‬למרות שניתן היה להשתמש גם באיזוטופ לא סטנדרטי‬ ‫של חנקן או בחנקן מסומן ולראות שהוא מגיע ל‪ DNA-‬או לביומסה של החיידק‪.‬‬ ‫עם זאת‪ ,‬זה תהליך מורכב ולכן פשוט יותר לבדוק את התהליך על ‪ :Acetylene‬בניסוי הבא שמים תרחיף‬ ‫חיידקים בבקבוק‪ .‬חלל האוויר מורכב בהתאם לחיידקים )אירובים או אנאירובים( מאוויר‪/‬חנקן )בהתאמה( ו‪-‬‬ ‫‪ 10%‬של אצטילן‪ .‬אם לחיידקים יש פעילות ניטרוגנאז הם יהפכו את האצטילן לאתילן‪ .‬יש להשתמש בצינור‬ ‫שיאפשר להוציא דגימות מהחלל הגזי על מנת שייבדקו בגז‪-‬כרומטוגרף בו פיק האצטילן יילך ויירד לטובת‬ ‫פיק אתילן שיילך ויופיע‪ .‬עובדה זו מעידה על פעילות אנזימטית של ניטרוגנאז‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :04‬מחזור החנקן‬ ‫‪25‬‬ ‫כיצד אורגניזמים אירוביים מרחיקים חמצן מניטרוגנאז?‬ ‫הסבר אחד גורס שאם לאורגניזם יש קצב נשימה מאוד גבוה‪ ,‬ריכוז החמצן התוך תאי לעולם לא יעלה על‬ ‫רף מסויים‪ ,‬הוא יישאר נמוך ואז לא ייפגע בניטרוגנאז; מעשית הסבר זה אינו מספק לכלל החיידקים‬ ‫מקבעי החנקן‪.‬‬ ‫אזוטובקטריה שגדלים בריכוז אטמוספרי של חמצן מפרישים‬ ‫‪ ,slime layer‬שכבה רירית עבה המגבילה את הדיפוזיה של‬ ‫החמצן לתוך התא‪ .‬גדילה באדמה לא מאווררת‪ ,‬בה ריכוז החמצן‬ ‫נמוך יותר‪ ,‬תגרור פחות הפרשה של השכבה – כלומר עובי‬ ‫השכבה הוא פונקציה של ריכוז החמצן הסביבתי‪.‬‬ ‫ציאנובקטריה פילמנטית‪ ,‬בקטריה פוטוסינטטית‪ ,‬מכילה מנגנון אחר‪ ,‬מתוחכם יותר‪ ,‬של יצירת התמיינות‬ ‫תאים השונים מתא האם‪ :‬תא ייחודי בשם הטרוציסט עבר התמיינות בלתי הפיכה )הוא לא יכול להתחלק‬ ‫יותר( והוא מקבע חנקן בשביל כל התאים השכנים‪ .‬הדופן העבה של ההטרוציסט לא מאפשרת לחמצן‬ ‫לחדור פנימה‪ .‬יכולת קיבוע הפחמן הפוטוסינטטית‪-‬אוקסידנטית אינה קיימת בהטרוציסט‪ ,‬שכן אם היה‬ ‫מסוגל לקיבוע פחמן הוא היה מייצר חמצן שהיה הורס את‬ ‫הניטרוגנאז‪ .‬החנקן המיוצר מופק כגלוטמין ומסופק לתאים‬ ‫השכנים‪ .‬הטרוציסט צריך להיות במגע עם תא וגטטיבי רגיל‬ ‫כדי לקבל אנרגיה ומעביר מקורות חנקן לתאים שכנים‪.‬‬ ‫אורגניזמים רבים מנצלים את צורת הגלוטמין כדי למחזר חנקן בגופם‪.‬‬ ‫הפרנקיה )אקטינובקטריה( הם סימביונטים לא‪-‬ספציפיים של צמחים‪ .‬בתוך התא קיימות וזיקולות סגורות‬ ‫האטומות לחמצן ובהן מתבצע קיבוע החנקן‪.‬‬ ‫אין זה חריג שמתקיים מידור בבקטריה על מנת לקיים תהליכים שאינם יכולים להתקיים בשאר הסביבה‬ ‫התאית‪ .‬ישנם איזורים של סביבה מחזרת ואיזורים של סביבה מחמצנת‪ ,‬ותהליכים שונים מתבצעים במדורים‬ ‫בהתאם לצרכים‪.‬‬ ‫חיידקים מקבעי חנקן סימביונטים‬ ‫הפרנקיה יכולים להימצא באסוציאציה עם מספר מיני צמחים שאינם בהכרח ממינים קרובים‪ .‬בקטניות‪,‬‬ ‫לעומת זאת‪ ,‬התופעה הרבה יותר ספציפית‪ :‬מין מסויים של ריזוביה מתאים למין מסויים של קטנית‪.‬‬ ‫האסוציאציה הספציפית נובעת מתקשורת כימית בין החיידק לצמח‪.‬‬ ‫יכולת יצירת הסימביוזה של הריזוביה )‪ (Rhizobium‬מקודדת על פי רוב בפלסמידים ספציפיים המכונים‬ ‫‪ .sym (symbiosis) plasmids‬התוצר הסופי של הסימביוזה הוא ‪) nodules‬פקעיות(‪ ,‬המתחילות‬ ‫כשערות שורש ומתפתחות באופן מסויים כדי להעניק מיקרוסביבה מתאימה לחיידק‪ ,‬המספקת אנרגיה‬ ‫לתהליך היקר של קיבוע החנקן ומונעת גישה של חמצן על מנת שלא יפריע לניטרוגנאז‪.‬‬ ‫הצמח מבקר את רמת החמצן בצורה מדוייקת בעזרת קומפלקס )קטנית=‪.leghemoglobin (legum‬‬ ‫בצורה זו מסופקת רמת חמצן אופטימלית הדרושה לקיום החיידק מחד ואינה פוגעת בניטרוגנאז‬ ‫מאידך‪.‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪26‬‬ ‫הסימביוזה של הריזוביה מתוחכמת וכוללת מספר שלבים‪:‬‬ ‫•‬ ‫הכרת החיידק את המאחסן והצמדות החיידק לשורש‪ .‬מתעוררת עקב הפרשת פקטורים מהצמח‪.‬‬ ‫•‬ ‫הפרשת פקטורים של החיידק אל הצמח‪ ,‬לאחר ההצמדות‪.‬‬ ‫•‬ ‫פלישת החיידק אל שערת השורש‪.‬‬ ‫•‬ ‫הגעה אל תאי השורש העיקריים דרך מבנה שהוא מאלץ את הצמח לייצר – ‪.infection thread‬‬ ‫•‬ ‫במציאת נישה טובה החיידק עובר התמיינות למצב בקטרואיד – תא לא מתחלק שמקבע חנקן‪.‬‬ ‫•‬ ‫רקמת הצמח ממשיכה להתחלק‪ ,‬החיידקים ממשיכים להתחלק ונוצרת פקעית בוגרת המכילה‬ ‫חיידקים שרובם במצב הבקטרואיד המקבע חנקן‪.‬‬ ‫האיורים מציגים את תהליכי הסימביוזה‪.‬‬ ‫)‪ (1‬החיידק מזהה ספציפית את הצמח המיועד‬ ‫לסימביוזה‪ :‬לחיידקים יש איברי הצמדות ספציפיים‬ ‫היודעים לזהות את שערות השורש‪ .‬פקטורים‬ ‫המשוחררים‬ ‫מהצמח‬ ‫)‪(flavonoids‬‬ ‫מושכים‬ ‫חיידקים רצויים ודוחים חיידקם לא רצויים‪ .‬החומר‬ ‫משוחרר כתוצאה מעקת חנקן‪ .‬בהיעדר עקת חנקן‬ ‫הצמח אינו משקיע מאמץ בגיוס ריזוביה‪.‬‬ ‫)‪ (2‬הפקטורים שמפריש החיידק ) ‪Nodulation‬‬ ‫‪ (Factors‬הם סוג של אוליגוסכריד שאורכו נע בן‬ ‫‪ 3-5‬מסוג ‪ .N-acetylglucosamide‬הם גורמים‬ ‫לשערת השורש לעבור ‪ ,(3) curling‬פיתול סביב‬ ‫החיידק המאפשר לו לפלוש לתוך שערת השורש‪.‬‬ ‫בפנים‪ ,‬החיידק גורם לצמח לייצר את ה‪infection -‬‬ ‫‪ ,(4) thread‬מבנה שרובו צלולוז המיוצר על ידי‬ ‫הצמח ומאפשר לחיידק לחדור לרקמות יותר עמוקות‬ ‫בצמח‪.‬‬ ‫לאחר ההדבקה‪ ,‬נעצרת זמנית הגדילה של התאים‬ ‫כמו גם של החיידקים והם מתחילים בהתמיינות )‪.(5‬‬ ‫חלק קטן מאוכלוסיית הריזוביה נותר במצב וגטטיבי‪-‬‬ ‫מתחלק – בעוד שרוב האוכלוסיה מתמיינת‬ ‫לבקטרואידים מקבעי חנקן‪ .‬לאחר ביסוס אוכלוסיה‬ ‫זו‪ ,‬מתחדשת החלוקה התאית של הצמח )‪ .(6‬הגרעין‬ ‫הוגטטיבי של הריזוביה מתחזק את האוכלוסיה‬ ‫הממויינת והטרמינלית‪ ,‬מקבעת החנקן‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :04‬מחזור החנקן‬ ‫‪27‬‬ ‫הספציפיות של הריזוביה לקטניה אינה מאופיינת‬ ‫רק באורך האוליגוסכריד שהיא משחררת אלא‬ ‫מוקנית גם מהמודיפיקציות של הסוכר‪ :‬איזורי ‪sym‬‬ ‫‪plasmid‬‬ ‫מקודדים‬ ‫האחראים‬ ‫לחלבונים‬ ‫למודיפיקציות הספציפיות מודיפיקציות של ‪ R1‬הן‬ ‫חומצות שומן ומודיפיקציות של ‪ R2‬הן לרוב‬ ‫מולקולות קטנות‪ ,‬כמו יון סולפאט או אצטאט‪.‬‬ ‫מיני הריזוביה השונים נבדלים בכמות הסוכרים באוליגוסכריד ובמודיפיקציות‪ ,‬וכך נוצרים שילובים‬ ‫שונים המאפשרים את הספציפיות למין הקטניה איתה הריזוביה מקיימים סימביוזה‪.‬‬ ‫סוגים נוספים של סימביוזה לקיבוע חנקן‬ ‫•‬ ‫בקטניות טרופיות צומחות הפקעיות בגבעולים ולא בשורשים‪ .‬תופעה זו נפוצה בסביבה מאוד‬ ‫רטובה ואיזורים עם אדמה ענייה מאוד בחנקן‪ .‬מיני הריזוביה בגבעולים יכולים גם לעשות‬ ‫פוטוסינטזה – הם מסוגלים לנצל את אנרגיית האור ובכך לעזור לדרישות האנרגטיות הקשות של‬ ‫קיבוע החנקן‪.‬‬ ‫•‬ ‫מיני שרכים מימיים מסויימים של מים מתוקים מכילים ציאנובקטריה היוצרת הטרוציסטים‪.‬‬ ‫השרך גדל ובתוך עליו גדלות אוכלוסיות הבקטריה‪ ,‬המספקות לו חנקן‪ .‬עובדה זו משמשת במזרח‬ ‫הרחוק להעשרת קרקעות לפני גידול אורז‪ ,‬הגדל על קרקעות דלות בחנקן בעודן מוצפות מים‪.14‬‬ ‫השרכים המתים המכילים חנקן מכניסים אותו למערכת‪.‬‬ ‫ניצול האמוניה על ידי מיקרואורגניזמים – אסימילציה של אמוניה‬ ‫אסימילציה של אמוניה נעשית דרך חומצות אמינו‪ ,‬בעיקר גלוטמין וגלוטמאט‪ .‬לשם כך קיימים שני‬ ‫אנזימים המסוגלים לצרוך אמוניה ולקשור אותה לאלפא‪-‬קטו גלוטראט )גלוטאמאט דה‪-‬הידרוגנאז הופך‬ ‫אלפא‪-‬קטוגלוטראט‬ ‫לגלוטמאט(‬ ‫או‬ ‫לגלוטמאט )גלוטאמין סינטטאז הופך‬ ‫גלוטאמאט‬ ‫לגלוטאמין(‪.‬‬ ‫לאחר‬ ‫שמתקבלות שתי מולקולות בסיס אלו‬ ‫)גלוטמאט‪/‬גלוטמין( ניתן לתעל אותן‬ ‫לייצור שאר המולקולות‬ ‫מכילות‪-‬החנקן של התא‪.‬‬ ‫‪ 14‬מצב זה בעייתי לדישון היום‪ ,‬ובטח שהיה בעייתי לפני ‪.1918‬‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫מיקרוביולוגיה ‪ -‬שיעור‪1‬‬ ‫‪28‬‬ ‫ניטריפיקציה‬ ‫תהליך זה מורכב משני שלבים‪:‬‬ ‫•‬ ‫ניטרוסיפיקציה – חימצון אמוניה לניטריט‪.‬‬ ‫•‬ ‫ניטריפיקציה – חימצון ניטריט לניטראט‪.‬‬ ‫חיידקי ניטריפיקציה מסוגלים לנצל אמוניה )‪(NH3‬‬ ‫– לא אמוניום )‪ – (NH4+‬ישירות בעזרת תהליכי‬ ‫הניטרוסיפיקציה והניטריפיקציה‪ ,‬למרות שאין חיידק אחד המסוגל לבצע את שני התהליכים במקביל‪.‬‬ ‫לצורך כך חיידקים ניטרוסיפיקטים )‪ (i.e., Nitrosomonas‬מתקיימים עצמאית על ידי חימצון אמוניה‬ ‫לניטריט )התוצר מסיס ומורחק מגוף החיידק באופן טבעי( וחיידקים ניטריפיקטים )‪(i.e., Nitrobacter‬‬ ‫חייבים להתקיים בסמיכות לחיידקים ניטרוסיפיקטים על מנת לקבל אספקה של ניטריט‪.‬‬ ‫אוכלוסיות חיידקים כאלו בקרקע חקלאית יחמצנו את האמוניום לניטריט וניטראט‪ ,‬המסיסים מאוד ועשויים‬ ‫להישטף מאיזור הצמחים או להגיע למי תהום ולגרום מגוון בעיות בריאותיות וסרטן‪ .‬כדי להקטין את הנזק‬ ‫מוסיפים חומר כימי – ניטרופירין המעכב את השלב הראשון של חימצון האמוניה לניטריט‪.‬‬ ‫ארכיאה ניטרוסיפיקטית‬ ‫הפעילות של חימצון אמוניה לניטריט נחשבה חיידקית בלבד; מחקרים נוספים בתחום חשפו ארכיאה שגם‬ ‫מסוגלים לתהליכים אלו‪ .‬הללו משתייכים לקרנארכיאה הימיים )תאומרכיאה(‪.‬‬ ‫בעבודות סביבתיות שונות של שיטות מטבוליות מתוחכמות הראו שהארכיאה הימית מסוגלת לחמצן‬ ‫אמוניה‪ .‬טענה זו קשה להוכחה מדוגמאות שקיימות בטבע ולכן רק כאשר בודד קרנארכיאון כזה לתרבית‬ ‫במעבדה )‪ (Nitrosopumilus maritimus‬ניתן היה להוכיח את הטענה בנוגע למטבוליזם שלהם‪.‬‬ ‫משמאל‪ :‬הניטרוזופומילוס וקרוביו יכולים‬ ‫ככל הנראה לחמצן אמוניום לניטריט‬ ‫בנוכחות ‪ .CO3-2‬בניסוי המתואר באיור‪,‬‬ ‫לאחר כ‪ 12-‬יום הארכיאה החלו לגדול‬ ‫ועם‬ ‫העלייה‬ ‫בגידול‬ ‫הייתה‬ ‫ירידה‬ ‫באמוניום בתאימות לעלייה בניטריט‪.‬‬ ‫הדבר הוביל למסקנה שהקרנארכיאון‬ ‫מסוגל לקבע פחמן כמקור אורגני לצד‬ ‫חימצון אמוניה לניטריט‪.‬‬ ‫חמוטל בן דב‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫‪/‬שיעור ‪ :04‬מחזור החנקן‬ ‫‪29‬‬ ‫‪ – ANAMMOX‬חימצון אמוניה אנאירובי‬ ‫חיידקים כימוליטותרופיים – גדלים על חומר אנאורגני ומקבעים פחמן – יכולים גם לחמצן אמוניה בצורה‬ ‫אנאירובית להפקת חנקן אטמוספרי ומים‪ .‬הריאקציה מבחינה אנרגטית מאוד מועדפת ואפילו מיושמת‬ ‫בתעשייה‪.‬‬ ‫המינים שזוהו בפעולה זו הם הפלנקטומיצטים )‪ – (Planctomycetes, species Brocadia‬אשר מידור‬ ‫איזור חימצון האמוניה מזכיר מבנה גרעיני‪ :‬איזורים קטנים של אנאמוקסוזומים )‪– (anammoxosome‬‬ ‫וזיקולות או איזורים ממודרים קטנים בהם מתבצע התהליך הרגיש לחמצן‪.‬‬ ‫התהליך הוא אנאירובי‪ ,‬אולם כדי לקבל ניטריט המגיבה עם האמוניום צריך לחמצן אמוניה – לבצע‬ ‫ניטרוסיפיקציה‪ .‬ייצור הניטריט יכול להיעשות על ידי חיידק חיצוני‪ ,‬כמו ניטרוזומונס‪ ,‬אבל הוא צורך‬ ‫חמצן – כלומר סביבה אירובית‪ ,‬שסותרת את הסביבה של ה‪.ANAMMOX-‬‬ ‫לצורך כך יכולים להתקיים שכבות ביולוגיות )‪ (biofilms‬בהן מלמעלה יש ניטרוזומונס ומלמטה נמצאים‬ ‫חיידקי ‪ .ANAMMOX‬המקום בו משתמשים בתהליך זה הוא בטיפול בשפכים‪ :‬אחד הדברים שצריך‬ ‫לטפל בה בשפכים הוא הרחקת חנקות מהמים‪ ,‬לפני שהם נשפכים לנחלים‪ .‬תהליך ה‪ANAMMOX-‬‬ ‫יעיל במיוחד לצורך זה כי הוא נפטר מאמוניה ומניטריט בבת אחת‪ .‬היום מנסים לבנות במתקני טיהור‬ ‫שפכים איזורים מיוחדים המעשירים אוכלוסיות ‪.ANAMMOX‬‬ ‫מחמצני הניטריט האירובים הנמצאים ברוב מתקני הטיהור מתחרים בחיידקי ה‪ ,ANAMMOX-‬ופעילותם‬ ‫פחות יעילה; המתקן צריך לאפשר פעילות של החיידקים באופן כזה שיתעדף את חיידקי ה‪.ANAMMOX-‬‬ ‫תופעה זו חשובה לא רק בטיפול בשפכים אלא גם בסדימנט ימי‪ :‬עולה השאלה מדוע יש כה מעט אמוניה‬ ‫בים למרות כל החומר המת הקיים בה? הסיבה היא שחלק מהאמוניה והניטריט מגיבים בתגובת‬ ‫‪ ANAMMOX‬והחנקן מהסדימנט מועברלמצב חנקן גזי‪ ,‬המבעבע מעלה לאטמוספרה‪.‬‬ ‫סיכום‬ ‫הפקולטה למדעי החיים‪ ,‬אוניברסיטת תל אביב ‪2011‬‬ ‫חמוטל בן דב‬