1. No category

UNIVERZA V LJUBLJANI
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
Urška SIVKA
GENETSKO OZADJE PROCESA OBARVANJA IN
NASTANKA BARVNEGA VZORCA PRI
POSTRVEH
DOKTORSKA DISERTACIJA
Ljubljana, 2012
UNIVERZA V LJUBLJANI
BIOTEHNIŠKA FAKULTETA
Urška SIVKA
GENETSKO OZADJE PROCESA OBARVANJA IN NASTANKA
BARVNEGA VZORCA PRI POSTRVEH
DOKTORSKA DISERTACIJA
GENETIC BACKGROUND OF COLOURATION AND COLOUR
PATTERN FORMATION IN TROUT
DOCTORAL DISSERTATION
Ljubljana, 2012
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Na podlagi Statuta Univerze v Ljubljani ter po sklepu Senata Biotehniške fakultete in
sklepa Senata Univerze z dne 29. oktobra 2007, je bilo potrjeno, da kandidatka
izpolnjuje pogoje za neposreden prehod na doktorski Podiplomski študij bioloških in
biotehniških znanosti s področja zootehnike. Za mentorja je bila imenovana doc. dr.
Simona Sušnik Bajec.
Komisija za oceno in zagovor:
Predsednik:
prof. dr. Simon Horvat
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za
zootehniko
Član:
doc. dr. Simona Sušnik Bajec
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za
zootehniko
Član:
prof. dr. Radovan Komel
Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta
Član:
prof. dr. Jurij Pohar
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Oddelek za
zootehniko
Datum zagovora: 16.10.2012
Delo je rezultat lastnega raziskovalnega dela.
Urška Sivka
II
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
KLJUČNA DOKUMENTACIJSKA INFORMACIJA
ŠD
DK
KG
KK
AV
SA
KZ
ZA
LI
IN
TD
OP
IJ
JI
AI
Dd
UDK 597.2/.5:575(043.3)=163.6
ribe/marmorirana postrv/Salmo marmoratus/genetika/obarvanost/wnt signalna
pot
AGRIS L10/8130
SIVKA, Urška, univ. dipl. inž. zoot.
SUŠNIK BAJEC, Simona (mentorica)
SI-1230 Domžale, Groblje 3
Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, Podiplomski študij bioloških in
biotehniških znanosti, področje zootehnike
2012
GENETSKO OZADJE PROCESA OBARVANJA IN NASTANKA
BAVNEGA VZORCA PRI POSTRVEH
Doktorska disertacija
XVII, 98, 13 pregl., 34 sl., 7 pril., 124 vir.
sl
sl/en
Osnovni namen doktorske disertacije je identificirati kandidatne gene,
odgovorne za obarvanost in nastanek barvnega vzorca pri marmorirani postrvi.
Ker je nastanek barvnega vzorca odvisen od vrste in števila pigmentnih celic,
smo raziskavo razširili na področje histologije kože, kjer nas je zanimala
morfologija, gostota in porazdelitev melanofor v koži marmorirane postrvi. Za
identifikacijo in karakterizacijo kandidatnih genov smo poleg primerjalne
genomike uporabili tudi subtraktivno cDNA knjižnico ter cGRASP 32K
cDNA mikromreže. Histološke analize kože so pokazale, da so melanofore
marmorirane postrvi v povprečju večje kot pri potočni postrvi. Njihova gostota
se s starostjo ne spreminja in je za trikrat manjša kot pri potočni postrvi. S
pomočjo primerjalne genomike smo na dveh kandidatnih genih našli vrstno
specifične polimorfizme, ki sicer niso bili povezani z obarvanostjo, so se pa
izkazali za uspešno orodje pri genetskem razločevanju med marmorirano in
potočno postrvjo. Iz subtraktivne cDNA knjižnice smo identificirali dva gena,
kita in eif3ea, ki imata pomembno vlogo pri ohranjanju melanofor in
posledično barvnega vzorca. S pomočjo analize mikromrež smo identificirali
pet različno izraženih genov – hdac1, vps18, gnaq, dct in scg2a, ki so
vključeni v biološki proces pigmentacije pri živalih. Od petih so kar trije
(hdac1, gnaq in dct) posredno ali neposredno vključeni v wnt signalno pot.
Glede na fenotipsko podobnost marmoriranega in labirintnega vzorca, ki ga
napoveduje reakcijsko-difuzijski model, in vključenost različno izraženih
genov v wnt signalno pot, predpostavljamo, da je nastanek marmoriranega
vzorca odvisen od wnt signalne poti in temelji na reakcijsko-difuzijskem
mehanizmu.
III
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
KEY WORDS DOCUMENTATION
DN
DC
CX
Dd
UDC 597.2/.5:575(043.3)=163.6
fish/marble trout/Salmo marmoratus/genetics/pigmentation/wnt signaling
pathway
CC
AGRIS L10/8130
AU
SIVKA, Urška
AA
SUŠNIK BAJEC, Simona (supervisor)
PP
SI-1230 Domžale, Groblje 3
PB
University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Postgraduate study of
Biological
and Biotechnical Sciences, Field: Animal Production
PY
2012
TI
GENETIC BACKGROUND OF COLOURATION AND COLOUR
PATTERN FORMATION IN TROUT
DT
Doctoral Dissertation
NO
XVII, 98 p., 13 tab., 34 fig., 7 ann., 124 ref.
LA
sl
AL
sl/en
AB
The aim of this dissertation is to identify candidate genes, responsible for
colour and colour pattern formation in marble trout. Since the formation of
colour pattern depends on the type and number of pigment cells, we extended
our field of research to the histology, more specifically to morphology, density
and distribution of melanophores in marble trout skin. For identification and
characterization of candidate genes we used comparative genomics,
subtractive cDNA library and cDNA cGRASP 32K microarrays. Histological
analysis revealed that melanophores are larger in marble trout than in brown
trout. Their average density was more or less constant across all age classes
and was three times lower when compared to brown trout. With comparative
genomics we identified two candidate genes with species specific
polymorphisms, which proved to be a useful tools for genetic differentiation
between marble and brown trout. Using SSH, we identified two differentially
expressed genes, kita and eif3ea, which play an important role in survival of
melanophores and maintaining the colour pattern. Microarray analysis of
transcripts isolated from the skin of marble and brown trout and F3 hybrids,
revealed five differentially expressed genes, hdac1, vps18, gnaq, dct and scg2a
involved in biological process of pigmentation in animals. Out of five, three
(hdac1, gnaq and dct) are directly or indirectly involved in wnt signaling
pathway. Given the phenotypic similarity between marble and labyrinthine
pattern, which is predicted by reaction-diffusion mathematical model, and the
involvement of differentially expressed genes in wnt signaling pathway,
marble pattern formation depends on wnt signaling pathway and is based on
reaction-diffusion mechanism.
IV
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
KAZALO VSEBINE
str.
Ključna dokumentacijska informacija (KDI) ..................................................................III
Key words documentation (KWD) ................................................................................. IV
Kazalo preglednic ......................................................................................................... VIII
Kazalo slik ...................................................................................................................... IX
Kazalo prilog ................................................................................................................ XIII
Okrajšave in simboli .....................................................................................................XIV
1
UVOD ......................................................................................................................1
2
PREGLED OBJAV ................................................................................................3
KOŽA ................................................................................................................3
2.1
2.1.1
Povrhnjica (epidermis) ..............................................................................4
2.1.2
Usnjica (dermis)..........................................................................................5
2.1.3
Podkožje (hipodermis) ...............................................................................6
2.2
PIGMENTNE CELICE .....................................................................................6
2.3
OBARVANOST ................................................................................................9
2.3.1
Fiziološke barvne spremembe .................................................................10
2.3.2
Morfološke barvne spremembe............................................................... 12
2.4
GENETSKO OZADJE NASTANKA BARVNEGA VZORCA ....................15
2.4.1
Mehanizmi obarvanja pri ličinkah (zarod z mešičkom) .......................16
2.4.2
Mehanizmi obarvanja pri odraslih osebkih ...........................................18
2.4.3
Signalne poti pri obarvanju .....................................................................22
2.5
OBARVANOST PRI SALMONIDIH ............................................................26
2.5.1
3
Obarvanost pri postrveh ..........................................................................27
MATERIAL IN METODE .................................................................................31
3.1
MATERIAL ....................................................................................................31
3.2
METODE ........................................................................................................34
3.2.1
Histološke analize kože ............................................................................34
3.2.1.1
Izdelava in barvanje tkivnih rezin ......................................................34
3.2.1.2
Meritve in obdelava podatkov ............................................................34
V
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
3.2.2
Določevanje polimorfizmov posameznih nukleotidov (metoda SNP)..35
3.2.2.1
Identifikacija kandidatnih genov, vključenih v obarvanost ...............35
3.2.2.2
Izolacija jedrne DNA .........................................................................36
3.2.2.3
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in PIRA-PCR (angl.
"primer-introduced restriction analysis PCR") .................................37
3.2.2.4
Restrikcijska (RFLP) analiza .............................................................38
3.2.2.5
Statistična analiza ...............................................................................39
3.2.3
Izdelava subtraktivne cDNA knjižnice (metoda SSH) ..........................39
3.2.3.1
Izolacija celokupne RNA in mRNA ..................................................39
3.2.3.2
Supresijska subtraktivna hibridizacija (SSH) .....................................40
3.2.3.3
Ligacija ............................................................................................... 43
3.2.3.4
Transformacija s toplotnim šokom.....................................................43
3.2.3.5
Gojenje transformiranih celic .............................................................44
3.2.3.6
Liza bakterijskih celic in denaturacija cDNA ....................................44
3.2.3.7
Označevanje in detekcija pozitivnih kolonij ......................................45
3.2.3.8
Detekcija signala na rentgenskem filmu ............................................46
3.2.3.9
Izolacija plazmidov in sekvenciranje insertov v plazmidu ................47
3.2.4
Analiza mikromrež in kvantitativen PCR v realnem času (qRTPCR) ..........................................................................................................47
3.2.4.1
Analiza mikromrež .............................................................................47
3.2.4.1.1 Izolacija celokupne RNA iz tkiva...................................................48
3.2.4.1.2 Posredno označevanje RNA ...........................................................48
3.2.4.1.3 Hibridizacija mikromrež .................................................................50
3.2.4.1.4 Bioinformacijska analiza podatkov ................................................50
3.2.4.2
Kvantitativen PCR v realnem času (qRT-PCR) .................................51
3.2.4.2.1 Obratno prepisovanje celokupne RNA ...........................................51
VI
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
3.2.4.2.2 Določevanje oligonukleotidnih začetnikov in kvantitativen
PCR v realnem času (qRT-PCR) ....................................................52
3.2.4.2.3 Statistična analiza podatkov qRT-PCR ..........................................53
4
REZULTATI ........................................................................................................54
4.1
HISTOLOŠKE ANALIZE KOŽE ..................................................................54
4.2
DOLOČEVANJE POLIMORFIZMOV POSAMEZNIH NUKLEOTIDOV
(METODA SNP).............................................................................................59
4.3
SUPRESIJSKA SUBTRAKTIVNA cDNA KNJIŽNICA ..............................62
4.4
ANALIZA MIKROMREŽ IN KVANTITATIVEN PCR V REALNEM
ČASU (qRT-PCR) .........................................................................................64
4.4.1
Razlike v izražanju genov med marmorirano in potočno postrvjo
(M vs. P) ....................................................................................................65
4.4.2
Razlike v izražanju genov med F3 križanci in potočno postrvjo
(K vs. P) .....................................................................................................66
4.4.3
Razlike v izražanju genov med marmorirano postrvjo in F3
križanci (M vs. K) .....................................................................................67
4.4.4
Kvantitativen PCR v realnem času (qRT-PCR)....................................67
5
RAZPRAVA .........................................................................................................70
5.1
HISTOLOŠKE ANALIZE KOŽE ..................................................................70
5.2
GENETSKO OZADJE MARMORIRANEGA BARVNEGA VZORCA ......73
5.2.1
SNP označevalci ........................................................................................73
5.2.2
Nastanek in ohranitev marmoriranega vzorca ......................................76
6
7
POVZETEK (SUMMARY) ................................................................................84
6.1
POVZETEK ....................................................................................................84
6.2
SUMMARY ....................................................................................................86
VIRI .......................................................................................................................89
ZAHVALA
PRILOGE
VII
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
KAZALO PREGLEDNIC
str.
Preglednica 1: Barvni fenotipi homozigotnih odraslih barvnih mutantov. ZM –
zgodnjemetamorfne melanofore, PM – poznometamorfne melanofore
(Kelsh, 2004; Kelsh in sod., 2009) ..........................................................19
Preglednica 2: Telesni parametri pri marmorirani in potočni postrvi. Vrednosti
predstavljajo srednjo vrednost ± SD (n = 3) (Sivka in sod., 2012) ..........32
Preglednica 3: Začetni oligonukleotidi 14 kandidatnih genov ........................................36
Preglednica 4: Začetni oligonukleotidi, uporabljeni v PIRA-PCR..................................38
Preglednica 5: Gojišča za bakterijske kulture..................................................................44
Preglednica 6: Pufri za lizo bakterijskih celic in denaturacijo ter renaturacijo cDNA....45
Preglednica 7: Pufri za imunološko detekcijo .................................................................46
Preglednica 8: Nukleotidna zaporedja začetnih oligonukleotidov petih različno
izraženih genov ter referenčnega gena .....................................................52
Preglednica 9: Absolutna in relativna debelina povrhnjice glave. Vrednosti so
predstavljene kot povprečje treh meritev s standardnim odklonom. M
– označuje marmoriano postrv, P – označuje potočno postrv (Sivka in
sod., 2012)................................................................................................ 54
Preglednica 10: Gostota in premer melanofor v usnjici škržnega poklopca
marmorirane (M) in potočne (P) postrvi. Vrednosti so predstavljene
kot povprečje treh meritev s standardnim odklonom (Sivka in sod.,
2012). .......................................................................................................55
Preglednica 11: Frekvenca alelov na obeh lokusih pri vzorcih marmorirane (MP) in
potočne postrvi (PP) (prirejeno po Susnik in sod., 2008) ........................62
Preglednica 12: Biološki procesi in število genov iz cDNA knjižnice marmorirane
postrvi ......................................................................................................63
Preglednica 13: Biološki procesi in število genov iz cDNA knjižnice potočne postrvi ..64
VIII
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
KAZALO SLIK
str.
Slika 1: Prerez kože rib (povzeto po Seegers in Meyer, 2009) .........................................4
Slika 2: Elasmoidne luske pri teleostih. a) Cikloidna oblika, b) Ktenoidna oblika
(Seegers in Meyer, 2009) ....................................................................................6
Slika 3: Fiziološko stanje dermalnih melanofor: a) "razpršeno" stanje, b) začetki
kopičenja ter c) skoraj popolnoma "nakopičeno" stanje (povzeto po Schliwa,
1986) ....................................................................................................................7
Slika 4: Dejavniki, ki določajo obarvanost pri ribah (povzeto po Colihueque, 2010) ....10
Slika 5: Shematski prikaz migracijskih poti melanoblastov pri miši ter
kromatoblastov pri cebrici (Kelsh, 2004) ..........................................................16
Slika 6: Barvni vzorec ličinke cebrice. DS – hrbtna proga, LS – stranska proga, VS –
trebušna proga, YSS – proga na rumenjakovi vrečki (Kelsh in sod., 2009) .....17
Slika 7: Odrasli barvni mutanti cebrice (Kelsh in sod., 2009; Parichy, 2003) ................19
Slika 8: Preoblikovanje barvnega vzorca pri odraslih osebkih iz barvnega vzorca
ličinke. Velike rjave celice – ličinkine melanofore, prazne celice – apoptoza
ličinkinih melanofor, rumene male celice – ksantofore, sive male celice –
metamorfne melanofore, črne male celice – melanofore (Parichy, 2006) ........20
Slika 9: Mreža signalnih poti pri melanoforah cebrice (prirejeno po Braasch in sod.,
2009; KEGG, 2012; Lin in Fisher, 2007)..........................................................23
Slika 10: Dejavniki vključeni v razvoj melanofor ličink (A – nepigmentirani
melanoblasti, B – melanofore na začetku produkcije melanina (nezrele), C –
zrele melanofore, z visoko vsebnostjo melanina, D – spreminjanje oblik
(kopičenje, razpršenost melanina) melanofor glede na zunanje signale in E –
preživetje melanofor, brez signalne poti kita pride do apoptoze (prirejeno
po Cooper in Raible, 2009) ...............................................................................24
IX
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 11: Marmorirani vzorec pri postrveh jadranskega in atlantskega porečja. Od
zgoraj navzdol; marmorirana postrv iz Trebuščice (pritok Soče; foto: Dušan
Jesenšek), marmorirana postrv iz Zete (Črna gora; foto: Johannes
Schöffmann), marmorirana postrv iz Neretve (Bosna in Hercegovina; foto:
Aleš Snoj) in potočna postrv z marmoriranim vzorcem iz reke Otre
(Norveška; foto: Øystein Skaala) ......................................................................29
Slika 12: Obarvanost ličinke marmorirane postrvi (foto: Arne Hodalič) ........................30
Slika 13: Shema križanja med marmorirano in potočno postrvjo ...................................31
Slika 14: Skica mesta vzorčenja pri marmorirani in potočni postrvi za histološke
analize................................................................................................................32
Slika 15: Obarvanost F2 križancev. Z leve proti desni: marmorirana obarvanost,
leopardni vzorec ter obarvanost potočne postrvi ...............................................33
Slika 16: Mesto vzorčenja pri metodi SSH in mikromrežah ...........................................33
Slika 17: Priprava "tester cDNA" za hibridizacijo in PCR (PCR-Select™ cDNA
Subtraction Kit User Manual, Clontech) ...........................................................40
Slika 18: Prečni prerez kože potočne (levo) in marmorirane postrvi (desno). M –
melanofore, D – usnjica (dermis) (Sivka in sod., 2012)....................................55
Slika 19: Povprečna gostota melanofor pri marmorirani in potočni postrvi ...................56
Slika 20: Največji premer melanofor pri marmorirani in potočni postrvi .......................56
Slika 21: Različna fiziološka stanja melanofor v škržnem poklopcu marmorirane
postrvi. a – popolno nakopičeno stanje, b – delno nakopičeno/delno
razpršeno stanje, c – razpršeno stanje, d – popolnoma razpršeno stanje
(Sivka in sod., 2012)..........................................................................................57
Slika 22: Koža škržnega poklopca marmorirane postrvi s svetlimi in temnimi predeli
(Sivka in sod., 2012)..........................................................................................58
Slika 23: Prečni prerez usnjice škržnega poklopca marmorirane postrvi. Meja med
svetlimi in temnimi področji (Sivka in sod., 2012) ...........................................58
Slika 24: Koža škržnega poklopca potočne postrvi. a – prevladujoča razporeditev in
fiziološko stanje melanofor, b – razporeditev in fiziološko stanje melanofor
v črnih pikah (Sivka in sod., 2012) ...................................................................59
X
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 25: Restrikcijski profili encimov HpaII in TaqI marmoriranega, potočnega ter
heterozigotnega genotipa. M – velikostni marker 100 bp (Fermentas), A in
D – marmorirani genotip, B in E – potočni genotip ter C in F-heterozigotni
genotip ...............................................................................................................61
Slika 26: Vennov diagram prikazuje število različno izraženih genov (p < 0,05) med
marmorirano in potočno postrvjo (M vs. P), marmorirano postrvjo in F3
križanci (M vs. K) ter F3 križanci in potočno postrvjo (K vs. P). Števila
predstavljajo različno izražene gene v vsaki skupini in različno izražene
gene, ki so skupni med skupinami.....................................................................65
Slika 27: Izstopajoči biološki procesi s seznama različno izraženih genov med
marmorirano in potočno postrvjo (M vs. P), marmorirano postrvjo in F3
križanci (M vs. K) ter F3 križanci in potočno postrvjo (K vs. P). Delež
genov predstavlja število genov, vključenih v biološki proces, glede na
število genov vključenih v analizo ....................................................................66
Slika 28: qRT-PCR validacija petih izbranih genov: hdac1, vps18, gnaq, dct ter
scg2a. Rezultati so predstavljeni kot log10 relativnega izražanja med
marmorirano in potočno postrvjo (M vs. P). Stolpci nad 1 označujejo
povečano raven, medtem ko stolpci pod 1 označujejo zmanjšano raven
izražanja genov pri marmorirani postrvi v primerjavi s potočno postrvjo. *-p
< 0,05 .................................................................................................................68
Slika 29: qRT-PCR validacija petih izbranih genov: hdac1, vps18, gnaq, dct ter
scg2a. Rezultati so predstavljeni kot log10 relativnega izražanja med F3
križanci in potočno postrvjo (K vs. P). Stolpci nad 1 označujejo povečano
raven, medtem ko stolpci pod 1 označujejo zmanjšano raven izražanja
genov pri F3 križancih v primerjavi s potočno postrvjo. *-p < 0,05 .................69
Slika 30: Časovni trak oblikovanja marmoriranega vzorca.............................................71
Slika 31: Nastajanje marmoriranega vzorca na škržnem poklopcu marmorirane
postrvi. a - februar 2009, b - junij 2009, c - avgust 2009 in d - november
2009 (foto: Urška Sivka) ...................................................................................72
Slika 32: Uravnavanje delovanja transkripcijskega faktorja Lef1 preko interakcij βkatenin-Hdac1 ...................................................................................................79
XI
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 33: Labirinten vzorec pri napihovalki (Tetradon mbu) (zgoraj) in cebrici
(spodaj). Vmes je prikazana primerjava med labirintnim vzorcem
napihovalke (levo) in labirintnim vzorcem cebrice (desno). Zgoraj v levem
kotu je prikazan labirinten vzorec, napovedan s strani modela RD (povzeto
po Watanabe in Kondo, 2012) ...........................................................................81
Slika 34: Labirinten vzorec pri križancih med belo pikčasto zlatovčico in črno
pikčastim masu lososom ter labirinten vzorec kot ga napoveduje model RD
(spodaj desno) (povzeto po Miyazawa in sod., 2010) .......................................83
XII
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
KAZALO PRILOG
Priloga A: Telesni parametri predstavnikov marmorirane in potočne postrvi
Priloga B: SNP mesta petih izbranih genov pri potočni postrvi iz štirih evropskih
porečij, marmorirani postrvi, belvici in mehkoustni postrvi
Priloga C: Seznam genov iz cDNA knjižnice marmorirane postrvi, vključenih v različne
biološke procese
Priloga D: Seznam genov iz cDNA knjižnice potočne postrvi, vključenih v različne
biološke procese
Priloga E: 303 različno izraženi geni med marmorirano in potočno postrvjo (M vs. P)
Priloga F: 240 različno izraženih genov med F3 križanci in potočno postrvjo (K vs. P)
Priloga G: 305 različno izraženih genov med marmorirano postrvjo in F3 križanci
(M vs. K)
XIII
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
OKRAJŠAVE IN SIMBOLI
ACTH
adrenokortikotropni hormon
Amp
ampicilin
aRNA
protismerna (angl. antisense) RNA
bp
bazni par
BSA
goveji serumski albumin (angl. bovine serum albumin)
cAMP
ciklični adenozinmonofosfat
cDNA
komplementarna DNA
cGRASP
consortium for Genomic Research on All Salmon Project
Creb
vezavni protein za odzivni element za cAMP (angl. cAMP response
element-binding)
csf1ra
receptor spodbujevalnega dejavnika rasti kolonij 1 a (angl. colony
stimulating factor 1 receptor, a)
cx41.8
koneksin 41.8 (angl. connexin 41.8)
DMSO
dimetil sulfoksid (angl. dimethyl sulfoxide)
DNA
deoksiribonukleinska kislina
dNTP
deoksinukleotidfosfat
dct
dopakrom tautomeraza (angl. dopachrome tautomerase)
DEPC
dietilpirokarbonat (angl. diethylpyrocarbonate)
dpo
dan po oploditvi
edn3b
endotelin 3b (angl. endothelin 3b)
ednrb1a
receptor endotelina B1a (angl. endothelin receptor B1a)
EDTA
etilen diamin tetraacetat
eef1a1l1
evkariontski elongacijski dejavnik prevajanja 1 alfa 1 (angl. eukaryotic
translation elongation factor 1 alpha 1, like 1)
eif3ea
evkariontski začetni dejavnik prevajanja 3, podenota E, a (angl.
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit E, a)
erbb3b
v-erb-b2 eritroblastni levkemični virusni onkogen, homolog 3b (angl. verb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3b)
fad
angl. fade out
XIV
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
fbxw4
F-zaporedje in protein z WD-40 domeno 4 (angl. F-box and WD-40
domain protein 4)
gchfr
povratni regulator GTP ciklohidrolaza I (angl. GTP cyclohydrolase I
feedback regulator)
gch1
GTP ciklohidrolaza 1 (angl. GTP cyclohydrolase 1)
gnaq
vezavni protein za nukleotid gvanin (G protein), q polipeptid (angl.
guanine nucleotide binding protein (G protein), q polypeptide)
hdac1
histon deacitilaza 1 (angl. histone deacetylase 1)
IPTG
izopropil
ß-D-1
tiogalaktopiranozid
(angl.
isopropyl
ß-D-1-
thiogalactopyranoside)
kcnj13
angl. potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 13
kita
receptor kit a (angl. kit receptor a)
Kitlga
ligand kit a (angl. kit ligand a)
LB
angl. lysogeny broth
lef1
dejavnik vezave za limfatični ojačevalec 1 (angl. lymphocyte enhancer
binding factor 1)
ltk
levkocitna tirozinska kinaza (angl. leukocyte tyrosine kinase)
Mapk
kinaze z mitogenom aktiviranih proteinov (angl. mitogen-activated
protein kinases)
mc1r
receptor melanokortina 1 (angl. melanocortin 1 receptor)
MCH
melanin-koncentrirajoči hormon
mitfa
angl. microphthalmia-associated transcription factor a
MSH
melanocite-spodbujajoči hormon
mRNA
informacijska (angl. messenger) RNA
MT
melatonin
mtDNA
mitohondrijska DNA
mycbp2
MYC vezavni protein 2 (angl. MYC binding protein 2)
paics
fosforibozilaminoimidazol
karboksilaza
phosphoribosylaminoimidazole
(angl.
carboxylase,
phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase)
PAS
angl. periodic acid-Schiff
pax3a
angl. paired box gene 3a
XV
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
pcbd1
angl. 6-pyruvoyl-tetrahydropterin synthase/dimerization cofactor of
hepatocyte nuclear factor 1 alpha (TCF1)
PCR
verižna reakcija s polimerazo (angl. polymerase chain reaction)
pfe
angl. pfeffer
PIRA-PCR
angl. primer-introduced restriction analysis PCR
pomc
proopiomelanokortin (angl. proopiomelanocortin)
pmela
angl. premelanosome protein a
PM
poznometamorfne melanofore
pts
6-piruvoiltetrahidropterin
sintaza
(angl.
6-pyruvoyltetrahydropterin
synthase)
qdpr
guinoid dihidropteridin reduktaza (angl. quinoid dihydropteridine
reductase)
qRT-PCR
kvantitativni PCR v realnem času
RD
reakcijsko-difuzijski
RFLP
polimorfizem dolžin restrikcijskih elementov (angl. restriction fragment
length polymorphism)
RNA
ribonukleinska kislina
sal
angl. salz
scg2a
sekretogranin
II
(kromogranin
C)
a
(angl.
secretogranin
II
(chromogranin C) a)
SDS
natrijev dodecil sulfat (angl. sodium dodecil sulphate)
slk
angl. sparse-like
smtl
somatolaktin (angl. somatolactin)
SNP
polimorfizem
posameznih
nukleotidov
(angl.
single
nucleotide
polymorphism)
SOB
izjemno ugodno gojišče (angl. super optimal broth)
SOC
izjemno ugodno gojišče s katabolno represijo (angl. super optimal broth
with catabolite repression)
sox10
angl. SRY-box containing gene 10
spra
sepiapterin reduktaza a (angl. sepiapterin reductase a)
SSC
angl. saline sodium citrate
SSH
supresijska subtraktivna hibridizacija
XVI
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
TR
tiroidni hormon
TRIS
2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol
txndc17
angl. thioredoxin domain containing 17
tyr
tirozinaza (angl. tyrosinase)
tyrp1b
angl. tyrosinase-related protein 1b
tuba8l3
tubulin, alfa 8 kot 3 (angl. tubulin, alpha 8 like 3)
vps18
angl. vacuolar protein sorting protein 18
wnt
angl. wingless-type MMTV integration site family
X-gal
5-bromo-4-kloro-indolil-ß-D-galaktopiranozid (angl. 5-bromo-4-chloroindolyl-β-D-galactopyranoside)
ZM
zgodnjemetamorfne melanofore
XVII
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
1
UVOD
Barvna diverziteta je med vretenčarji zelo velika. Če primerjamo na eni strani sesalce in
ptiče ter na drugi strani ribe, dvoživke in kuščarje, ugotovimo, da so slednji veliko bolj
barviti in raznoliki. Vzrok za to razliko v barvitosti je v raznolikosti t.i. pigmentnih
celic. Vsem vretenčarjem so skupne temne pigmentne celice, ki se pri sesalcih in ptičih
imenujejo melanociti. Ker so melanociti edine pigmentne celice pri kopenskih sesalcih
in proizvajajo dve vrsti barvil, črno-rjavi eumelanin in rdeče-oranžni feomelanin, je
obarvanost pri kopenskih sesalcih omejena predvsem na odtenke oranžno-rjave, črne in
bele barve. Poleg temnih pigmentnih celic, ki se pri ribah, dvoživkah in kuščarjih
imenujejo melanofore in proizvajajo samo črno-rjavi eumelanin, najdemo pri teh
skupinah živali še rumene ksantofore, rdeče eritrofore, lesketajoče se iridofore, bele
leukofore ter modre cianofore. Zaradi prisotnosti večjega števila različnih pigmentnih
celic je barvna paleta pri ribah, dvoživkah in kuščarjih pestrejša in omogoča raznovrsten
nabor barv in barvnih odtenkov.
Fenotipska barvna pestrost je povezana tudi z genetsko pestrostjo pigmentnih genov.
Genetska pestrost pigmentnih genov je pri ribah za 30 % večja kot pri sesalcih, kar se
pripisuje njihovemu podvojenemu genomu. Cebrica (Danio rerio) in medaka (Oryzias
latipes) predstavljata modelna organizma za genetske študije procesa obarvanja in
nastanka barvnega vzorca pri ribah. Do danes je bilo identificiranih več kot 40
pigmentnih genov pri medaki in nekaj več kot 150 genov pri cebrici.
Postrvi iz rodu Salmo in Oncorhynchus s svojo različno obarvanostjo najbolj izstopajo
med predstavniki družine Salmonidae. Za razlago genetskega ozadja procesa obarvanja
in nastanka barvnega vzorca pri postrveh smo izbrali marmorirano postrv (Salmo
marmoratus) zaradi njenega izstopajočega marmoriranega vzorca, endemičnosti v
jadranskem porečju ter ogroženosti zaradi genetskega mešanja z vneseno potočno
postrvjo (S. trutta).
Glavni namen doktorske disertacije je identificirati kandidatne gene za specifično
obarvanost pri marmorirani postrvi. Poleg genetskega ozadja barvnega vzorca nas je
1
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
zanimala tudi morfologija, gostota in porazdelitev melanofor v koži marmorirane
postrvi. Doktorska disertacija temelji na naslednjih hipotezah:

Med marmorirano in potočno postrvjo obstajajo razlike v strukturi kože, ki se
kažejo v različni debelini povrhnjice ter različni morfologiji, gostoti in
porazdelitvi melanofor.

Med marmorirano in potočno postrvjo obstajajo razlike v nukleotidnem
zaporedju in izražanju kandidatnih genov. Kandidatne gene za nastanek
marmoriranega vzorca pri marmorirani postrvi bomo poskušali identificirati z
različnimi pristopi, ki vključujejo primerjalno genomiko, subtraktivno
hibridizacijo cDNA ter mikromreže.

Nukleotidno zaporedje in/ali izražanje nekaterih genov sovpada z obarvanostjo
(marmoriranostjo) postrvi. Polimorfizem v kandidatnih genih bomo testirali na
vzorcih F2 in F3 generacije križancev med marmorirano in potočno postrvjo in s
pomočjo bioinformacijske analize poiskali tiste SNP genetske označevalce
(angl. single nucleotide polymorphism, SNP), ki so v statistično značilni
povezavi z obarvanostjo pri marmorirani postrvi.

Pri nastanku marmoriranega pigmentnega vzorca sodeluje manjše število genov.
Hipoteza temelji na dejstvu, da je podobna pigmentacija značilna za filogenetsko
nesorodne populacije postrvi. Marmoriran vzorec so namreč razen pri
marmorirani postrvi zasledili tudi pri potočnih postrvih iz reke Otre na
Norveškem. Naša predpostavka je, da se je ta lastnost razvila konvergentno.
2
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
2
PREGLED OBJAV
2.1
KOŽA
Pri vretenčarjih je koža največji organ. Njena naloga je, da varuje organizem pred
zunanjimi kemičnimi in fizičnimi dejavniki in hkrati omogoča komunikacijo z zunanjim
okoljem. Kot multifunkcionalen organ ima pomembno vlogo pri termoregulaciji,
čutilnem zaznavanju, sintezi hormonov, osmotski homeostazi, komunikaciji med
organizmi (obarvanost), nastajanju kožnih struktur (luske, kremplji, nohti, dlaka) ter
produkciji različnih substanc, kot so feromoni in antimikrobni peptidi (Rakers in sod.,
2010).
Ribe živijo v vodnem okolju, ki je bogatejše s patogenimi mikroorganizmi kot okolje, v
katerem živijo kopenski sesalci. Koža rib ima zato pomembno vlogo pri obrambi pred
patogenimi mikroorganizmi, katerim so ribe izpostavljene. Obramba se kaže kot
neprestano izločanje sluzi, ki vsebuje raznorazne imunoglobuline, lizocime, lektine in
antimikrobne peptide. Poleg sluzi se iz kože izločajo tudi kisli in nevtralni
glikokonjugati,
ki
neposredno
ščitijo
organizem
pred
vdorom
patogenih
mikroorganizmov. Pri poškodbi kože pride do takojšnega izločanja sluzi iz celic, ki se
nahajajo na robu poškodovanega predela. Sluz zaščiti rano in hkrati omogoči prenos
limfocitov na poškodovan predel (Rakers in sod., 2010; Zaccone in sod., 2001).
Preko kože so ribe sposobne zaznavati v vodi topne kemične substance, s pomočjo
katerih lahko prepoznajo spolne partnerje, vrstnike ter plenilce in plen. Eni takšnih
kemičnih substanc so feromoni, ki se izločijo iz alarmnih celic pri poškodbi, povzročeni
s strani plenilca. Ti feromoni, ki se sprostijo v vodo, nato opozorijo vrstnike na
prisotnost plenilca in jim omogočajo umik na varno (Rakers in sod., 2010).
Koža in njena obarvanost igrata pomembno vlogo pri preživetju in komunikaciji rib. Za
preživetje organizma je sposobnost prilagoditve na barvno ozadje bistvenega pomena.
Poleg tega različna obarvanost kože omogoča komunikacijo med vrstniki. V času
drstitve obarvanost omogoča vizualno prepoznavanje spolnega partnerja kot tudi
odločitev glede izbire spolnega partnerja. Prav tako je obarvanost kože pomembna pri
3
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
sporazumevanju in obnašanju rib v jatah. V tekmovanju za teritorij samci komunicirajo
s svojimi tekmeci s pomočjo obarvanosti kože, ki postane intenzivnejša (Leclercq in
sod., 2010; Parichy, 2006).
Koža kot multifunkcionalen organ je pri ribah sestavljena iz treh plasti. Zunanja plast, ki
je v neposrednem stiku z zunanjim okoljem in predstavlja naravno bariero med
notranjim in zunanjim okoljem, se imenuje povrhnjica ali epidermis. Pod povrhnjico
najdemo nekoliko debelejšo plast kože, sestavljeno iz rahlega in čvrstega vezivnega
tkiva, ki jo imenujemo usnjica ali dermis. Zadnja plast kože se imenuje podkožje ali
hipodermis in vsebuje predvsem maščobno tkivo (Seegers in Meyer, 2009).
2.1.1 Povrhnjica (epidermis)
Povrhnjica pri ribah kostnicah dosega debelino do 300 pm in je sestavljena iz
površinske (stratum superficiale), trnaste (stratum spinosum) ter bazalne plasti (stratum
basale) (slika 1).
Slika 1: Prerez kože rib (povzeto po Seegers in Meyer, 2009)
Figure 1: Fish skin section (summarized from Seegers and Meyer, 2009)
4
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
V površinski plasti se nahajajo ploščate epitelijske celice, ki za razliko od sesalskih niso
mrtve (keratinizirane), temveč so metabolno aktivne. Epitelijske celice se ne luščijo
neprestano, tako kot se to dogaja pri sesalcih, temveč jih pri odmrtju ali poškodbi
zamenjajo celice iz trnaste plasti. Površinsko plast povrhnjice oblikujejo vrstno
specifični z aktinom bogati mikrogrebeni, pomembni za ohranjanje sluzi na površini
kože. Trnasta plast je srednja plast povrhnjice, v kateri se nahajajo čašaste celice.
Čašaste celice izločajo sluz, ki obdaja organizem. Ko čašaste celice izločijo
glikokonjugate, odmrejo, kar vodi do nastajanja novih celic in s tem neprestanega
obnavljanja zunanjih plasti povrhnjice (Rakers in sod., 2010). Število čašastih celic je
odvisno od vrste, razmnoževalnega ciklusa in predela telesa (Seegers in Meyer, 2009).
Poleg čašastih celic se v trnasti plasti nahajajo tudi senzorične, alarmne in Merklove
celice, ki delujejo kot mehanoreceptorji. Bazalna plast sestoji iz bazalnih celic in
bazalne membrane. Bazalne celice se neprestano delijo in prehajajo v trnasto plast, kjer
se dokončno izoblikujejo in potujejo navzgor proti zunanjim plastem povrhnjice. V
povrhnjici se v različnih plasteh nahajajo tudi pigmentne celice, ki so, za razliko od
pigmentih celic v usnjici, različnih oblik (Schliwa, 1986).
Debelina posameznih plasti povrhnjice je odvisna od ekoloških dejavnikov, sezonskih
vplivov ter spola. Število in vrsta epidermalnih celic se razlikuje glede na vrsto rib,
starost rib, predela telesa, debeline povrhnjice ter števila epidermalnih slojev (Whitear,
1986b).
2.1.2 Usnjica (dermis)
Usnjico omejujeta dva različna endotelijska sloja. Zgoraj usnjico omejuje in hkrati
ločuje od povrhnjice bazalna membrana, spodaj pa se nahaja t.i. dermalni endotelij, ki
ločuje usnjico od hipodermisa (Whitear, 1986a). Podobno kot povrhnjico tudi usnjico
sestavlja več plasti. Takoj pod bazalno membrano leži plast rahlega vezivnega tkiva
(stratum laxum), v katerem so krvne in limfne žile, živčna vlakna ter luske. Teleosti,
kamor spadajo tudi postrvi, imajo elasmoidne luske. Elasmoidne luske so lahko
cikloidne ali ktenoidne oblike. Cikloidne luske imajo gladek rob in koncentrične kroge,
ki podobno kot letnice pri drevesu prikazujejo starost ribe (slika 2a). Ktenoidne luske
nimajo gladkega roba, temveč je ta nazobčan (slika 2b).
5
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 2: Elasmoidne luske pri teleostih. a) Cikloidna oblika, b) Ktenoidna oblika (Seegers in Meyer,
2009)
Figure 2: Elasmoid scales of Teleosts. a) Cycloid scale, b) Ctenoid scale (Seegers and Meyer, 2009)
Pod plastjo rahlega vezivnega tkiva leži plast čvrstega vezivnega tkiva (stratum
compactum), ki jo sestavljajo predvsem kolagenska vlakna. Za usnjico so značilni
fibroblasti, med katere se prepletajo različne pigmentne celice. Pigmentne celice se v
usnjici nahajajo v dveh plasteh. Prva plast se nahaja tik pod bazalno membrano
povrhnjice, kjer se prepletajo enakomerno debela kolagenska vlakna. Dermalne
kromatofore se nahajajo pod kolagenskimi vlakni in niso v neposrednem stiku s
povrhnjico (Fujii, 2000). Druga plast pigmentih celic se nahaja pod plastjo čvrstega
vezivnega tkiva na spodnji meji usnjice, v t.i. stratum argenteum. V stratum argenteum
se nahajajo iridofore med katere so razpršene melanofore (Leclercq in sod., 2010).
2.1.3 Podkožje (hipodermis)
Pod dermalnim endotelijem se nahaja še zadnja plast kože, t.j. podkožje (slika 1). V
podkožju potekajo debelejše žile in živci, ki potem prehajajo v zgornje plasti kože. V tej
plasti se nahaja tudi maščobno tkivo.
2.2
PIGMENTNE CELICE
Pigmentne celice pri ribah, dvoživkah, plazilcih, rakih in glavonožcih se imenujejo
kromatofore in se sintetizirajo v času embrionalnega razvoja v nevralni cevi.
Kromatofore so odgovorne za obarvanost kože in oči.
Glede na barvni odtenek delimo kromatofore v naslednje skupine: melanofore
(črna/rjava),
ksantofore
(oker/rumena),
eritrofore
(rdeča),
(kovinska/mavrična), leukofore (bela) in cianofore (modra) (Fujii, 2000).
6
iridofore
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Barvila se v pigmentni celici nahajajo v celičnih organelih-kromatosomih, ki se glede na
barvilo, ki ga vsebujejo, imenujejo melanosomi, ksantosomi, eritrosomi, leukosomi ter
cianosomi. Kromatofore lahko vsebujejo od nekaj sto (iridofore) ali nekaj tisoč
(melanofore), do več deset tisoč (ksantofore) kromatosomov. Oblika kromatofor v
epidermisu je zelo raznolika, medtem ko so kromatofore v dermisu, razen okroglih
iridofor, zvezdaste oblike. Dermalne kromatofore so ploščate, debele nekaj
mikrometrov, njihov premer pa je od 10 do nekaj 100 µm. Glede na razporeditev
kromatosomov v kromatofori razlikujemo različna fiziološka stanja kromatofor (slika
3). Kadar so kromatosomi bolj ali manj enakomerno razporejeni po celici, je celica v
"razpršenem" stanju (slika 3a). Pri kopičenju prehajajo kromatosomi iz izrastkov v
središče celice, tako da v celičnih izrastkih ni prisotnih kromatosomov, celica pa je v t.i.
"nakopičenem" stanju (slika 3c). Čas, ki je potreben za prehod iz enega stanja v drugo,
se razlikuje med kromatoforami ter vrstami organizmov in lahko traja od nekaj sekund
do nekaj ur (Schliwa, 1986).
Slika 3: Fiziološko stanje dermalnih melanofor: a) "razpršeno" stanje, b) začetki kopičenja ter c) skoraj
popolnoma "nakopičeno" stanje (povzeto po Schliwa, 1986)
Figure 3: Physiological state of dermal melanophores: a) dispersed state, b) start of aggregation and c)
almost completely aggregated state (summarized from Schliwa, 1986)
Mehanizem kopičenja ali razpršenosti kromatosomov je odvisen od koncentracije
cAMP v celici. Pri povišani koncentraciji cAMP se kromatosomi razpršijo po
citoplazmi, medtem ko se pri znižani koncentraciji cAMP nakopičijo v središču celice.
Kromatofore so v koži različno razporejene, lahko so izolirane ena od druge ali pa
povezane v tridimenzionalno strukturo, imenovano kromatoforna enota (Hawkes,
1974a). Melanofore se pogosto povezujejo z iridoforami in tvorijo melano-iridoformni
kompleks. V tem kompleksu se nahajajo pod okroglimi iridoforami in jih s svojimi
izrastki objemajo. Ko so melanofore v "nakopičenem" stanju, je vidna samo svetloba, ki
7
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
jo odbijajo iridofore, preostanek valovne dolžine absorbira melanin v spodaj ležečih
melanoforah. V "razpršenem" stanju melanofore preprečujejo dostop svetlobe do
iridofor, kar vodi do potemnitve kože. Pri salmonidih so ksantofore in eritrofore
razporejene nad ali pod melano-iridoformnem kompleksom, ki se nahaja takoj pod
bazalno membrano epidermisa. V nižjih plasteh dermisa se pigmentne celice nahajajo
pod plastjo čvrstega vezivnega tkiva (Leclercq in sod., 2010).
Zvezdaste melanofore se v večji meri nahajajo v dermisu, zato jih imenujemo tudi
dermalne melanofore. Pri mnogih vrstah rib imajo melanofore glavno vlogo pri
fiziološki spremembi barve. Melanosomi melanofor vsebujejo barvilo melanin, ki je
polimorfen in multifunkcionalen biopolimer z visoko molekulsko maso, ki se uvršča
med najbolj stabilne in netopljive biokemikalije (Jacobson, 2000). Poznane so štiri vrste
melaninov; (i) alomelanin je prisoten pri glivah, rastlinah in bakterijah, (ii)
nevromelanin se nahaja v centralnem živčevju višjih vretenčarjev, (iii) feomelanin, ki ga
sintetizirajo melanociti sesalcev in ptičev, ter (iv) eumelanin, ki ga prav tako
sintetizirajo melanociti sesalcev in ptičev in je hkrati edini, ki ga sintetizirajo
melanofore rib (Adachi in sod., 2005; Fedorow in sod., 2005). Eumelanin je svetloboabsorbirajoč pigment, ki ima vlogo pri foto zaščiti, kamuflaži in komunikaciji.
Biosintezna pot eumelanina je zelo ohranjena med vretenčarji in poteka v melanosomih
(Hoekstra, 2006).
V ksantosomih ksantofor so prisotni pteridini in so sestavljeni iz pirimidinskih in
pirazinskih obročov ter klasificirani glede na strukturo kot pterini ali flavini. Večina
naravnih pteridinov je enostavno oksidirajočih, svetlobno občutljivih ter slabo topnih v
vodi. Vrsta in pogostnost ptiridinov v koži teleostov je odvisna od vrste rib, razvojnega
stadija in predela telesa (Leclercq in sod., 2010).
Teleosti niso zmožni sintetizirati karotenoidov, temveč jih pridobijo s pomočjo zaužite
hrane in tako zagotovijo rdeče-oranžno obarvanost eritrofor. Karotenoidi so v maščobi
topni organski pigmenti, ki se tvorijo v fotosinteznih tkivih rastlin. Okoli 600
karotenoidov je bilo izoliranih iz naravnih virov, od tega je bilo 23 najdenih v različnih
ribjih tkivih kot so mišice, gonade, koža, jetra, črevo in ledvice. Astaksantin (Ax) je
8
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
najbolj pogost karotenoid v vodnem ekosistemu in je naravno sintetiziran v
fitoplanktonu (Leclercq in sod., 2010; Storebakken in No, 1992).
Leukofore ne vsebujejo barvila, temveč kristale purinov, ki razpršujejo svetlobo širšega
spektra valovnih dolžin in tako dajejo videz bele barve. Ploščice purinov se nahajajo v
leukosomih, ki potem potujejo po zvezdasti leukofori. Podobno kot leukofore tudi
iridofore ne vsebujejo barvila, so okrogle oblike in vsebujejo prosojne tanke kristale
gvanina v citoplazmi. Tanke plošče gvanina so v citoplazmi zložene vodoravno ena na
drugo in združene v t.i. refraktosome. Sprememba v medsebojni razdalji ploščic vodi do
nastanka odseva mavrično-metalne barve (Fujii, 2000; Leclercq in sod., 2010).
2.3
OBARVANOST
Obarvanost je pri ribah zelo raznolika in je tako pod okoljskim kot genetskim vplivom
(slika 4). Pod vplivom okolja, npr. ob prilagoditvi na ozadje, prihaja do hitrih
fizioloških ali počasnih morfoloških barvnih sprememb. Hitre fiziološke spremembe
nastanejo kot odgovor na zunanje dražljaje in so rezultat dvosmernega transporta
kromatosomov znotraj kromatofor. Morfološke spremembe so dolgotrajnejše ter
počasnejše in so rezultat spremenjenega števila kromatofor in/ali vsebnosti barvila v
notranjosti kromatofor.
9
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 4: Dejavniki, ki določajo obarvanost pri ribah (povzeto po Colihueque, 2010)
Figure 4: Factors that determine skin color in fish (summarized from Colihueque, 2010)
Colihueque (2010) pravi, da je nastanek barvnega vzorca genetsko določen in se kaže
kot monogenska ali poligenska kontrola. V monogensko kontrolo je vključen en lokus
ali manjše število lokusov. Pod monogensko kontrolo je barvni vzorec v času razvoja
organizma stabilen in se ne razlikuje med vrstniki znotraj populacije. V monogensko
kontrolo so vključeni predvsem geni za specifikacijo, preživetje, proliferacijo in
diferenciacijo kromatofor. Poligensko kontrolo predstavlja večje število lokusov z
manjšim vplivom. Pri poligenski kontroli se barvni vzorec, predvsem njegova
intenziteta, spreminja v času razvoja organizma. Sprememba barvnega vzorca je rezultat
različnih fizioloških procesov (npr. spolno dozorevanje) ter genetsko-okoljskih
interakcij.
2.3.1 Fiziološke barvne spremembe
Fiziološke barvne spremembe so posledica kopičenja ali razpršitve barvnih
kromatosomov znotraj pigmentne celice in se delijo na primarne in sekundarne barvne
spremembe. V času embrionalnega in ličinkinega razvoja, ko delovanje kromatofor še
ni živčno in hormonsko uravnavano, te reagirajo neposredno na svetlobo s kopičenjem
ali razpršitvijo kromatosomov, kar imenujemo primarni barvni odziv. Sekundarne
10
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
barvne spremembe nastopijo kasneje, ko postane delovanje kromatofor živčno in
hormonsko uravnavano in te na svetlobo reagirajo posredno preko živčnih dražljajev
in/ali hormonov.
Kromatofore se na svetlobo odzovejo različno. Melanofore in leukofore se na svetlobo
odzovejo z razpršitvijo melanosomov oziroma leukosomov (Negishi, 1985; Ohta in
Sugimoto, 1980). Za razliko od melanofor in leukofor, se ksantofore na svetlobo
odzovejo s kopičenjem pigmenta (Oshima in sod., 1998). Pri iridoforah pride pri
osvetlitvi do povečanega razmika med ploščicami gvanina, kar vodi do sevanja svetlobe
daljših valovnih dolžin (Nagaishi in Oshima, 1989). Eritrofore se neposredno odzovejo
na svetlobo s kopičenjem ali razpršitvijo eritrosomov. Med valovnimi dolžinami 400 in
440 nm ter 550 in 600 nm pride do kopičenja eritrosomov, medtem ko se razpršitev
pojavi med 470 in 530 nm (Oshima in Yokozeki, 1999).
Glede hitrosti odziva so fiziološke barvne spremembe, nadzorovane preko živčnega
sistema, hitrejše od sprememb z nadzorom preko endokrinega sistema. Na spremenjeno
okolje, ki ga riba zazna, mora le-ta hitro odreagirati in zato mora biti kromatska
sprememba hitra. Živčna spodbuda pri melanoforah in ksantoforah sproži kopičenje
kromatosomov. V primerjavi z melanoforami je živčni vpliv na eritrofore in ksantofore
šibkejši. Pri levkoforah živčna spodbuda sproži razpršitev svetlobo-sipajočih organelov.
Od hormonov, ki nadzorujejo kromatofore, je najbolj poznan melanofore-spodbujajoči
hormon (MSH), ki nastaja v intermedianem režnju hipofize. V literaturi je MSH poznan
tudi kot melanotropin ali intermedin. MSH ima poleg tega, da sproži razpršitev
melanosomov znotraj melanofor (fiziološka sprememba barve), tudi vlogo pri
morfološki spremembi barve in sicer spodbuja povečanje števila melanofor in
koncentracije melanina v njih (Bagnara, 1973, cit. po Fujii, 2000). α-MSH ima glavno
vlogo pri uravnavanju kromatofor pri nižje razvitih vretenčarjih, vključno z ribami, ter
pri uravnavanju melanocitov pri homeotermnih organizmih. Pod vplivom α-MSH v
melanoforah, ksantoforah in eritroforah pride do razpršitve pigmenta. Odziv
kromatofor, ki absorbirajo svetlobo, (melanofore, ksantofore in eritrofore) in
kromatofor, ki sipajo svetlobo (leukofore), na MSH je vzajemen, kar pomeni, da
11
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
simpatični signali sprožijo kopičenje svetlobo-absorbirajočih kromatofor in razpršitev
svetlobo-sipajočih leukosomov (Fujii, 1993, 2000; Fujii in Oshima, 1986; Visconti in
sod., 1999).
Melanin-koncentrirajoči hormon (MCH), ki je antagonist MSH, in melatonin (MT) pri
ribah sprožata kopičenje tako melanosomov v melanoforah kot tudi kromatosomov pri
svetlo obarvanih kromatoforah. Pri nekaterih vrstah melanofore niso občutljive na MT,
medtem ko ima MCH pri dvoživkah in plazilcih nasproten učinek, saj spodbuja
razpršitev pigmenta. Dovzetnost kromatofor na delovanje MT je različna na različnih
predelih kože. Te karakteristike nakazujejo na vključenost hormona v nastanek in
izginotje različnih barvnih vzorcev pri ribah (Fujii, 1993, 2000; Nagai in sod., 1986;
Oshima in sod., 1986; Visconti in Castrucci, 1993).
Poleg
zgoraj
naštetih
hormonov
so
v
endokrin
nadzor
vključeni
tudi
adrenokortikotropni hormon (ACTH), prolaktin, somatolaktin in kateholamini. ACTH
in prolaktin sodelujeta pri razpršitvi melanosomov. Učinek ACTH na ksantofore in
eritrofore je enak kot pri melanoforah. V nasprotju z ACTH in prolaktinom,
somatolaktin sodeluje pri kopičenju melanosomov. Od kateholaminov je norepinefrin
(NE) najbolj pomemben nevrotransmiter, ki uravnava transport kromatosomov znotraj
kromatofor. Tudi epinefrin deluje kot hormon na barvne spremembe pri ribah. Pri
fizioloških koncentracijah epinefrin razprši kromatosome preko β-adrenoceptorjev
(Fujii, 2000).
2.3.2 Morfološke barvne spremembe
Morfološke barvne spremembe so počasnejše kot fiziološke barvne spremembe in so
rezultat spremenjenega števila in porazdelitve kromatofor v koži. Podobno kot
fiziološka barvna sprememba se morfološka barvna sprememba tudi deli na dva tipa.
Prvi tip se pojavi ob prehodu organizma iz enega življenjskega obdobja v drugega (npr.
prehod med ličinko/mladico, mladico/odraslo žival, nezrelo/spolno zrelo) in se imenuje
trajna morfološka barvna sprememba. Drugi tip morfološke barvne spremembe se
pojavi v določenem življenjskem obdobju kot odgovor na biotične in abiotične okoljske
dejavnike in se imenuje začasna morfološka sprememba barve.
12
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Na začasno morfološko spremembo barve vplivajo štirje okoljski dejavniki: prehrana,
sončno sevanje, prilagoditev na ozadje ter socialne interakcije. Od teh sta prehrana in
UV sevanje primarna dejavnika, medtem ko sta prilagoditev na ozadje in socialne
interakcije sekundarna dejavnika začasne morfološke spremembe. Prehrana ima velik
vpliv na obarvanost kože pri teleostih. Neprimerna prehrana lahko omejuje
melanogenezo, kar vodi do barvnih anomalij kože. Poleg v maščobi topnih vitaminov in
maščob (esencialne maščobne kisline, vitamin A in D) so za normalno obarvanost kože
potrebni tudi karotenoidi in riboflavin (Hamre in sod., 2005). UV sevanje pri ribah
povzroča spremembe v usnjici, ki se kažejo kot zmanjšana gostota čašastih in sluznih
celic, spremenjeno izločanje sluzi ter luščenje usnjice (Kaweewat in Hofer, 1997).
Morfološka sprememba barve zaradi UV sevanja se kaže kot povečanje koncentracije
melanina in s tem potemnitev kože.
Pri kratkotrajni prilagoditvi na ozadje je sprememba obarvanosti organizma zgolj
posledica fiziološke barvne spremembe (migracija melanosomov v notranjosti
pigmentne celice). Pri dolgotrajni prilagoditvi na ozadje pa prihaja do spremembe v
velikosti in gostoti melanofor ter vsebnosti melanina, kar kaže na morfološko
spremembo barve (Sugimoto, 2002). Kako pri prilagoditvi barve na ozadje delujejo
ostale kromatofore, ni veliko znanega. Pri medaki je bilo opaženo, da se pri
izpostavljenosti svetlemu ozadju gostota leukofor poveča, gostota melanofor in
ksantofor pa zmanjša, medtem ko pride pri izpostavljenosti temnemu ozadju do
obratnega procesa (Fukamachi in sod., 2004; Sugimoto in sod., 2000). Podobno je bilo
ugotovljeno tudi pri cebrici, kjer se je gostota iridofor in melanofor spreminjala glede na
obarvanost ozadja (Sugimoto in sod., 2005). Vse te ugotovitve kažejo na to, da pri
prilagoditvi na ozadje s spreminjanjem svoje gostote sodelujejo vsi tipi pigmentnih
celic.
Nastanek barvnega vzorca je končna morfološka sprememba barve. Še posebno pri
ribah prihaja do barvnih in strukturnih sprememb kože v času spolnega dozorevanja.
Zelo izrazito se kaže ta sprememba pri salmonidih, ki pri svoji spolni zrelosti razvijejo
izrazito črno-rdečo obarvanost, v primerjavi s srebrno obarvanimi nezrelimi organizmi.
V času spolnega dozorevanja prihaja do sprememb v nalaganju barvil v organizmu. Pri
13
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
spolno nezrelih predstavnikih tako ženskega kot moškega spola je več kot 90 %
celokupnih karotenoidov prisotnih v mišicah (Bjerkeng in sod., 2000). Karotenoidi s
spolnim dozorevanjem prehajajo iz mišic v kožo in gonade. V mišicah spolno zrelih
šarenk (Oncorhyncus mykiss) se tako nahaja od 73 do 79 % celokupnih karotenoidov pri
samicah in od 18 do 19 % pri samcih (Bjerkeng in sod., 1992). Vsebnost purinov, ki se
nahajajo v iridiforah in so odgovorni za srebrn lesk, se pri spolno zrelih lososih zmanjša
za 50 % v primerjavi z nezrelimi srebrno obarvanimi posamezniki. O spremembah v
gostoti in vsebnosti melanina in pteridinov med spolnim dozorevanjem ni veliko
znanega. Pri lososih se vsebnost melanina ne spreminja s spolnim dozorevanjem.
Nastanek svetlega trebuha je tako verjetno posledica zmanjšanja vsebnosti purinov in
njihove prerazporeditve (Leclercq in sod., 2010).
Morfološke barvne spremembe so, podobno kot fiziološke barvne spremembe, tudi pod
hormonskim nadzorom. Mnogo hormonov, ki so vključeni v fiziološko spremembo
barve, igra vlogo tudi pri morfološki spremembi barve. Najbolj učinkovit hormon za
razpršitev pigmentov, α-MSH, je odgovoren tudi za povečanje števila in velikosti
melanofor ter vsebnosti melanina. Med diferenciacijo melanoblastov tako α- kot β-MSH
spodbujata razvoj melanofor. MCH, ki je antagonist α-MSH in katerega izločanje je
povečano pri svetlem ozadju, sproži kopičenje kromatosomov pri kromatoforah in
obenem zavira nalaganje melanina v kožo (Sugimoto, 2002). MT, ki sproži kopičenje
kromatosomov pri teleostih, pri morfoloških spremembah barve zmanjšuje aktivnost
tirozinaze in zavira melanogenezo, sproženo s strani α-MSH (Leclercq in sod., 2010).
Podobno kot α-MSH, ACTH povečuje melanogenezo in pospešuje izoblikovanje
melanofor iz melanoblastov.
Na morfološke spremembe barve, ki se dogajajo v času spolnega dozorevanja, vplivajo
tudi hormoni, ki jih izločajo spolne žleze. Vpliv spolnih steroidov na karotenoide,
melanine, pteridine in purine se razlikuje glede na vrsto, spol in predel telesa. Pod
nadzorom androgenih steroidov med spolnim dozorevanjem je tudi debelina kože pri
samcih, kar preko spremenjene strukture kože sproži morfološko barvno spremembo.
Pri obarvanju med spolnim dozorevanjem sodelujeta tudi prolaktin in somatolaktin,
katerih vloga pri fiziološki spremembi barve je že bila dokazana. Pri salmonidih se med
14
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
spolnim dozorevanjem poveča vsebnost somatolaktina v plazmi. Oba sodelujeta pri
procesih osmoregulacije, spolnega razvoja in metabolizma energije, ki potekajo hkrati z
morfološko spremembo barve. Sprememba koncentracije prolaktina in somatolaktina v
plazmi med diadromno migracijo (migracija rib med sladko in slano vodo) in/ali med
drstno sezono nakazuje na vpletenost teh dveh hormonov v morfološko spremembo
barve (Leclercq in sod., 2010). Pri morfoloških spremembah barve je potrebno omeniti
še tiroidni hormon (TH). TH je bil identificiran kot nujno potreben hormon za nastanek
barvnega vzorca (migracija in/ali diferenciacija kromatofor) pri odraslih ribah (Hamre
in sod., 2007).
Morfološke spremembe barve v določenem življenjskem obdobju so pod močnim
genetskim vplivom. Identificiranih je bilo veliko genov, ki so vključeni v specifikacijo,
preživetje, širitev, diferenciacijo in porazdelitev kromatofor. Pri ribah se v
embrionalnem času izoblikuje barvni vzorec, ki se razlikuje od barvnega vzorca odrasle
živali. Iz embrionalnega vzorca se nato razvije barvni vzorec odrasle živali. Za nastanek
barvnega vzorca pri odraslih ribah naj bi bila odgovorna dva mehanizma; (i)
izoblikovanje metamorfnih kromatofor iz latentnih predhodnih celic in/ali (ii)
prerazporeditev embrionalnih kromatofor, katerih število variira med vrstami (Parichy,
2006).
2.4
GENETSKO OZADJE NASTANKA BARVNEGA VZORCA
Vse kromatofore izvirajo iz nevralne cevi, od koder migrirajo v kožo. Pri sesalcih in
pticah migracija prekurzorjev melanocitov poteka pod razvijajočo se povrhnjico
(hrbtno-bočna migracijska pot) (slika 5). Pri ribah kromatoblasti, ki so prekurzorji
kromatofor, potujejo po dveh migracijskih poteh. Ena je hrbtno-bočna migracijska pot,
druga pa je srednja migracijska pot, ki poteka med somiti in nevralno cevjo. Melanofore
potujejo po bočni in srednji migracijski poti, ksantofore potujejo le po bočni, medtem
ko iridofore potujejo le po srednji migracijski poti (slika 5). Pri sesalcih in ribah
pigmentne celice v času migracije potujejo v nepigmentni obliki (celice ne vsebujejo
pigmenta), vendar pri ribah diferenciacija pigmentnih celic poteka že zelo zgodaj, tako
da je veliko migrirajočih kromatoblastov delno pigmentiranih.
15
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 5: Shematski prikaz migracijskih poti melanoblastov pri miši ter kromatoblastov pri
cebrici (Kelsh, 2004)
Figure 5: Schematics of chromatoblast migration routes in trunk of mouse and zebrafish (Kelsh, 2004)
Do sedaj so bili podani trije modeli obarvanja pri ribah. Prvi model temelji na
reakcijsko-difuzijskem mehanizmu (Turing, 1952, cit. po Kelsh, 2004). Razporeditev
pigmentnih celic je pri tem modelu odvisna od difuzije aktivatorjev in inhibitorjev, kar
ima lahko za posledico črtast ali pikčast vzorec. Pri drugem modelu pigmentne celice
vstopajo v interakcijo s tkivom, ki obdaja celico (Jesuthasan, 1996; Santiago in
Erickson, 2002). V koži se nahajajo mesta, ki so privlačna ali odbijajoča za pigmentno
celico, kar se odraža v različni razporeditvi le-teh ter različnem obarvanju ribe. Različno
obarvanje pri ribah je lahko tudi posledica interakcij med različnimi pigmentnimi
celicami, na čemer temelji tretji model (Foty in sod., 1996).
2.4.1 Mehanizmi obarvanja pri ličinkah (zarod z mešičkom)
Teorija nastanka barvnega vzorca pri ličinkah govori o tem, da obstajajo lokalni signali,
ki usmerjajo melanofore in iridofore do določenega mesta, ksantofore pa zasedejo
preostala mesta v koži (Kelsh in sod., 1996). Poleg lokalnih signalov pa na nastanek
vzorca vplivajo tudi interakcije med različnimi kromatoforami. Pri cebrici se barvni
vzorec ličinke izoblikuje peti dan po oploditvi (dpo) in je sestavljen iz štirih
melanofornih prog (slika 6). Ksantofore v tem času še ne tvorijo prog in so naključno
razpršene po boku. Iridofore skupaj z melanoforami tvorijo hrbtno, stransko in trebušno
progo (Kelsh, 2004).
16
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 6: Barvni vzorec ličinke cebrice. DS – hrbtna proga, LS – stranska proga, VS – trebušna proga, YSS
– proga na rumenjakovi vrečki (Kelsh in sod., 2009)
Figure 6: Zebrafish early larval pigment pattern. DS – dorsal stripe, LS – lateral stripe, VS – ventral
stripe, YSS – yolk sac stripe (Kelsh et al., 2009)
S pomočjo ličink cebrice, ki predstavlja modelni organizem za iskanje kandidatnih
genov, odgovornih za obarvanje pri ribah, je bilo najdenih 285 mutantov, ki so imeli
prisotne mutacije na genih, vključenih v razvoj pigmentnih celic. Skupno je bilo
identificiranih 94 pigmentnih genov (Kelsh in sod., 1996). Število identificiranih
pigmentnih genov pri cebrici je do danes naraslo na 166 (http://zfin.org).
Za specifikacijo pigmentnih celic iz nevralne cevi je odgovoren sox10 (angl. SRY-box
containing gene 10). sox10 skupaj z lef1 (angl. lymphocyte enhancer binding factor 1)
in
ostalimi
regulatorji
aktivira
izražanje
transkripcijskega
faktorja
Mitfa
(angl. microphthalmia-associated transcription factor a), ki je pomemben za razvoj
melanofor (Elworthy in sod., 2003; Hou in sod., 2006). Pri sox10 mutantih prihaja do
več kot 95% zmanjšanja števila kromatofor, kar nakazuje na napake v zgodnji fazi
razvoja nevralne cevi pred migracijo kromatoblastov (Kelsh in sod., 1996). V času
migracije kromatoblastov se izražanje sox10 hitro zmanjšuje (Hou in sod., 2006). Za
specifikacijo ksantofor sta pomembna sal (angl. salz) in pfe (angl. pfeffer), medtem ko
je ltk (angl. leukocyte tyrosine kinase) pomemben za iridiforno specifikacijo (Kelsh in
sod., 1996).
Nastanek barvnega vzorca ličinke vključuje nadzor migracije kromatoblastov ter
njihovo razvrstitev. Melanofore pri cebrici naseljujejo stransko temno progo v dveh
valovih, najprej v pigmentni obliki, nato pa kot nepigmentirani melanoblasti (Kelsh,
2004). Prisotnost melanofor v pigmentni obliki iz prvega vala onemogoči razvrstitev
melanoblastov iz drugega vala na skupno mesto, kar nakazuje, da medcelična
interakcija vpliva na migracijo melanoblastov. Poznana je tudi celična interakcija med
17
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
različnimi tipi kromatofor. Ksantofore so razpršene po celem telesu, vendar je njihova
prisotnost izključena iz mest, kjer se nahajajo melanofore, kar je lepo razvidno pri
mutantnih z zmanjšano sintezo melanina (albino). Po drugi strani pa pri kita (angl. kit
receptor a) mutantih, kjer je število melanofor zmanjšano, najdemo ektopične
ksantofore na mestih manjkajočih melanofor (Kelsh in sod., 1996).
V migracijo melanoblastov sta vključena kita in slk (angl. sparse-like) gena. kita igra
pomembno vlogo pri migraciji in preživetju melanofor ter nastanku barvnega vzorca pri
ličinkah. Ob odsotnosti kita pride pri melanoforah do celične smrti in posledično
zmanjšanja njihovega števila v koži. Pri diferenciaciji melanofor kita nima esencialnega
pomena (Kelsh in sod., 1996; Parichy in sod., 1999; Rawls in Johnson, 2003). Poleg
kita na proces preživetja pigmentih celic vplivajo tudi drugi geni. Kelsh in sodelavci
(1996) so identificirali 23 genov (fad (angl. fade out), pmela (angl. premelanosome
protein a) in drugi), ki so odgovorni za izgubo pigmenta in hitro zmanjšanje števila
kromatofor, kar nakazuje na njihov vpliv na celično smrt.
2.4.2 Mehanizmi obarvanja pri odraslih osebkih
Podobno kot pri študijah mehanizmov obarvanja ličink, se tudi pri študijah mehanizmov
obarvanja odraslih osebkov uporabljajo mutanti cebrice, ki fenotipsko izražajo različne
barvne vzorce. Do sedaj je bilo proučevanih osem odraslih barvnih mutantov (slika 7,
preglednica 1).
18
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 7: Odrasli barvni mutanti cebrice (Kelsh in sod., 2009; Parichy, 2003)
Figure 7: Adult zebrafish pigment pattern mutants (Kelsh et al., 2009, Parichy, 2003)
Preglednica 1: Barvni fenotipi homozigotnih odraslih barvnih mutantov. ZM – zgodnjemetamorfne
melanofore, PM – poznometamorfne melanofore (Kelsh, 2004; Kelsh in sod., 2009)
Pigmentation phenotypes of homozygous asult pigmentation mutants. ZM – early
metamorphic melanophores, PM – late metamorphic melanophores (Kelsh, 2004,
Kelsh et al., 2009)
Mutant/Gen
Melanofora
Ksantofora
Iridofora
ZM odsotne
sparse/kita
divji tip
prisotne
PM normalne
ZM normalne
rose/ednrb1a
nakopičene
odsotne
PM odsotne
puma/tuba8l3
ZM in PM odsotne
zmanjšano število
prisotne
nacre/mitfa
ZM in PM odsotne
nakopičene
prisotne
zmanjšano število
panther/csf1ra
odsotne
prisotne
razpršene
picasso/erbb3b
ZM in PM odsotne
zmanjšano število
/
jaguar/obelix/kcnj13
širše proge
podobne kot divji tip
prisotne
ZM normalne
PM odsotne
zgoščene okoli melanfornih
leopard/cx41.8
prisotne
progast fenotip zamenja pikčast
pik
vzorec
Table 1:
S proučevanjem odraslih mutantov je bilo ugotovljeno, da so za nastanek barvnega
vzorca odgovorni trije mehanizmi: (i) ponovna produkcija kromatofor, (ii) interakcija
med kromatoforami ter (iii) pred-vzorčni signali, ki usmerjajo in koordinirajo barvne
proge (Kelsh, 2004). Preoblikovanje barvnega vzorca pri odraslih osebkih iz barvnega
19
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
vzorca ličinke vključuje izgubo melanofor ličinke in pojav metamorfnih melanofor, ki
se razvijejo iz latentnih predhodnih celic. Zgodnjemetamorfne (ZM) melanofore, ki se
pojavijo 14-21 dni po oploditvi, so sprva razpršene po boku in kasneje migrirajo ter
tvorijo začetek prvih dveh prog. Kasneje, 21-28 dni po oploditvi, se znotraj nastajajočih
prog naknadno razvijejo poznometamorfne (PM) melanofore (slika 8) (Kelsh, 2004;
Mills in sod., 2007).
Slika 8: Preoblikovanje barvnega vzorca pri odraslih osebkih iz barvnega vzorca ličinke. Velike rjave
celice – ličinkine melanofore, prazne celice – apoptoza ličinkinih melanofor, rumene male celice –
ksantofore, sive male celice – metamorfne melanofore, črne male celice – melanofore (Parichy, 2006)
Figure 8: Pigment pattern metamorphosis from early larval to adult pigment pattern. Large brown cells –
early larval melanophores, empty cells – apoptosis of early larval melanophores, yellow cells –
xanthophores, small grey cells – metamorphic melanophores, small black cells – melanophores (Parichy,
2006)
Za ponovno sintezo melanofor pri odraslih osebkih sta potrebna tako kita kot ednrb1a
(angl. endothelin receptor B1a), kar je bilo ugotovljeno s pomočjo sparse/kita in
rose/ednrb1a mutantov (slika 7). Sparse/kita mutanti izgubijo vse melanofore pred
metamorfozo, vendar se kljub temu pri njih izoblikuje progast vzorec, ki vsebuje manjše
število melanofor kot pa vzorec pri divjem tipu. Sparse/kita mutanti nimajo ZM
melanofor, imajo pa normalno prisotne PM melanofore, kar nakazuje na to, da so ZM
melanofore odvisne od delovanja kita (Mills in sod., 2007). Nasprotno, rose/ednrb1a
mutanti nimajo prisotnih PM melanofor, imajo pa prisotne ZM melanofore. Fenotipsko
rose/ednrb1a mutanti izgledajo v času embrionalnega in ličinkinega razvoja normalno,
medtem ko imajo odrasli osebki le 50 % dermalnih melanofor, ki so ZM izvora (slika
7).
Poleg PM melanofor so v odraslih osebkih rose/ednrb1a mutantov odsotne tudi
iridofore. V embrijih se rose/ednrb1a prvotno izraža v vseh treh pigmentih prekurzorjih
(melanoblastih, ksantoblastih in iridoblastih), kasneje v času metamorfoze pa je njegovo
izražanje omejeno na iridofore in delno na melanofore (Parichy in sod., 2000). Poleg
20
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
kita in ednrb1a sta za ponovno produkcijo melanofor odgovorna tudi puma/tuba8l3 in
picasso/erbb3b. Pri puma/tuba8l3 in picasso/erbb3b mutantih so melanofore v ličinkah
normalno razvite, vendar pa pri obeh mutantih pride do pomanjkanja metamorfnih (ZM
in PM) melanofor. tuba8l3 (tubulin, alpha 8 like 3) je pomemben za širjenje latentnih
prekurzorjev in preoblikovanje le-teh v melanofore, medtem ko je erbb3b (v-erb-b2
erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 3b) pomemben za vzpostavitev zaloge
latentnih prekurzorjev (Budi in sod., 2011).
Za nastanek barvnega vzorca pri odraslih osebkih je pomembna tudi interakcija med
kromatoforami. Pri cebrici je nastanek progastega vzorca odvisen od interakcije med
melanoforami in ksantoforami, kar je bilo dokazano s pomočjo panther/csf1ra mutantov
(slika 7). Tirozin kinazni receptor panther/csf1ra, ki je soroden sparse/kita, ima
bistveno vlogo pri nastanku in ohranitvi ksantofor v progastem vzorcu. V mutantih
panther/csf1ra, predhodno poznanih kot salz in pfeffer (Maderspacher in NussleinVolhard, 2003), se razvije manj ksantofor, čeprav je obarvanost v embrionalnem
razvoju normalna. Pri odraslih osebkih so ksantofore odsotne, melanofore in iridofore
pa so raztresene (Maderspacher in Nusslein-Volhard, 2003; Parichy in sod., 2000).
Vpliv mutantov panther/csf1ra na melanofore je raznolik, csf1ra (angl. colony
stimulating factor 1 receptor, a) je potreben tako za vzorčenje ZM melanofor, ki so pri
mutaciji razpršene, kot za preživetje PM melanofor, ki so povečini odsotne pri mutantih.
Izguba funkcije csf1ra v času metamorfoze vodi do apoptotične izgube ksantofor in
posledično razpršitve melanofor in razpada progastega vzorca.
Popolno pomanjkanje melanofor pri odraslih osebkih je opaženo pri mutantih
nacre/mitfa (slika 7), medtem ko so ksantofore nakopičene. Na začetku metamorfoze se
ksantofore pravilno razporedijo v progast vzorec, vendar zaradi manjše gostote kot pri
divjem tipu ne uspejo oblikovati razločne proge (Maderspacher in Nusslein-Volhard,
2003). Kopičenje ksantofor je neodvisno od melanofor, vendar je pravilno izoblikovanje
prog odvisno od interakcij med melanoforami in ksantoforami.
Mutanti jaguar/obelix/kcnj13 imajo manj prog, ki so širše kot pri divjem tipu (slika 7).
Pri heterozigotih so proge tudi prekinjene, medtem ko imajo homozigoti samo dve progi
21
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
(Maderspacher in Nusslein-Volhard, 2003). Vzorec pri ličinkah in prvoten vzorec pri
odraslih osebkih je normalen pri mutantih jaguar/obelix/kcnj13. Kasneje melanofore pri
odraslih ne uspejo migrirati in se kopičiti, temveč ostanejo razpršene. Podobno kot pri
mutantih jaguar/obelix/kcnj13, je tudi pri mutantih leopard/cx41.8 vzorčenje pri
ličinkah in v zgodnji fazi pri odraslih normalno, vendar kasneje do nastanka PM
melanofor ne pride. ZM melanofore se, podobno kot pri mutantih jaguar/obelix/kcnj13,
ne združujejo in ostanejo razpršene. Fenotipsko se to izraža kot pikčast barvni vzorec.
Organiziranost melanofor v progast vzorec je odvisna od interakcije med ksantoforami
in melanoforami, medtem ko iridofore pri organiziranosti vzorca nimajo večjega
pomena, kar dokazuje mutant rose/ednrb1a, pri katerem so iridofore skoraj popolnoma
odsotne, vendar se kljub temu še vedno formira progast barvni vzorec.
Kljub temu, da zgoraj našteti mutanti dokazujejo primarno vlogo interakcij med
melanoforami in ksantoforami pri nastanku in ohranjanju barvnega vzorca pri odraslih
osebkih, pa mutanti nacre/mitfa nakazujejo na pred-vzorčne signale, ki usmerjajo in
usklajujejo barvne proge (Lister in sod., 1999). Čeprav so melanofore odsotne pri
mutantih nacre/mitfa, ksantofore niso naključno razpršene po boku, temveč so zbrane
na mestih med progami, ki bi potekale pri normalnem fenotipu. Na trebušnem predelu
so ločene na tistih mestih, kjer bi se nahajale melanofore (Kelsh, 2004). O prisotnosti
pred-vzorčnih signalov poročajo tudi Yamaguchi in sodelavci (2007), ki so s pomočjo
laserja odstranili del pigmentnega vzorca, ki se je kasneje ponovno vzpostavil v skoraj
identično obliko, kot je bila pred odstranitvijo.
2.4.3 Signalne poti pri obarvanju
Vse signalne poti v melanoforah vodijo do aktivacije transkripcijskega faktorja Mitfa.
Mitfa je glavni usmerjevalec razvoja melanofor v času embrionalnega in metamorfnega
razvoja in je aktiviran s strani transkripcijskih faktorjev Sox10, Pax3a, Lef1 in Creb
(slika 9).
22
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 9: Mreža signalnih poti pri melanoforah cebrice (prirejeno po Braasch in sod., 2009; KEGG, 2012;
Lin in Fisher, 2007)
Figure 9: Signaling network in zebrafish melanophores (adapted from Braasch et al., 2009, KEGG, 2012,
Lin and Fisher, 2007)
Mitfa usmerja izražanje velikega števila genov vključenih v nastajanje barvil ter v
preseljevanje, diferenciacijo in preživetje pigmentnih celic. ednrb1a, kita, tyr
(angl. tyrosinase), tyrp1b (angl. tyrosinase-related protein 1b), dct (angl. dopachrome
tautomerase), pmela (angl. premelanosome protein a) so med mnogimi geni, katerih
izražanje je odvisno od delovanja transkripcijskega faktorja Mitfa (Hoek in sod., 2008).
Do sedaj so bile v melanoforah dokazane tri signalne poti, ki so sprožene s strani štirih
različnih proteinov in so vključene v specifikacijo, diferenciacijo, prilagajanje ter
ohranjanje pigmentnih celic (slika 10).
23
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 10: Dejavniki vključeni v razvoj melanofor ličink (A – nepigmentirani melanoblasti, B –
melanofore na začetku produkcije melanina (nezrele), C – zrele melanofore, z visoko vsebnostjo
melanina, D – spreminjanje oblik (kopičenje, razpršenost melanina) melanofor glede na zunanje signale
in E – preživetje melanofor, brez signalne poti kita pride do apoptoze (prirejeno po Cooper in Raible,
2009)
Figure 10: Factors involved in melanophore development in larvae (A – unpigmented melanoblasts, B –
melanophores in the early stages of melanin production, C – mature melanophore with high levels of
melanin, D – alteration in melanophore appearance in response to evnironmental cues and E – survival of
melanophores; without kita signaling, larval melanophores undergo apoptosis (adapted from
Cooper and Raible, 2009)
Signalna pot wnt je nujno potrebna in zadostna za spodbujanje specifikacije melanofor
iz nevralnega grebena (Dorsky in sod., 2000). Z vezavo Wnt (angl. wingless-type
MMTV integration site family) proteinov na receptor "Frizzled" pride do inaktivacije
kompleksa Gsk3β/Axin/Apc (pri tem sodelujejo tudi proteini Gnaq/Gna11 (Liu in sod.,
2005)) in posledično do akumulacije β-katenina. Po stabilizaciji β-katenina v
citoplazmi, le-ta prehaja v jedro, kjer se veže na transkripcijski faktor Lef1, ki sproži
transkripcijo mitfa (slika 9). Z vezavo Lef1 na transkripcijski faktor Mitfa pride do
sinergistične transaktivacije dct promotorja (Yasumoto in sod., 2002).
Diferenciacija melanofor vključuje spremenjeno izražanje genov, ki so odgovorni za
produkcijo barvila, transport melanosomov v celici in celično morfologijo. Mitfa
uravnava izražanje nekaterih ključnih genov, vključenih v produkcijo melanina (Hoek
in sod., 2008). Poleg Mitfa so za uspešno diferenciacijo melanofor potrebni tudi njegovi
aktivatorji Wnt, Sox10 in Pax3a. Mitfa v sodelovanju s signalno potjo wnt uravnava
izražanje genov, vključenih v sintezo barvila, neposredno preko interakcij z Lef1 in βkateninom (Yasumoto in sod., 2002). Sox10 v sinergistični povezavi z Mitfa uravnava
24
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
izražanje genov, vključenih v razvoj melanocitov (Hou in sod., 2006). V uravnavanje
diferenciacije melanofor je vključen tudi pax3a, ki sproži izražanje transkripcijskega
faktorja mitfa in obenem z njim tekmuje za vezavo na dct promotor. Aktivacija signalne
poti wnt vodi do zamenjave Pax3a z Mitfa in posledično na izražanje gena dct (Lang in
sod., 2005).
Odziv melanofor na zunanje dražljaje se kaže v kopičenju ali razpršitvi melanosomov.
cAMP signalna pot je ključna pri prilagajanju melanofor na zunanje dražljaje. Z vezavo
α-MSH na Mc1r receptor pride do aktivacije cAMP v celici. Znotraj celice se cAMP
veže na protein kinazo A (Pka), ki po vstopu v jedro fosforilira Creb transkripcijski
faktor (Busca in Ballotti, 2000). Povečano izražanje mitfa transkripcijskega faktorja je
posledica povečane cAMP koncentracije in je uravnavano s Sox10 in Creb
transkripcijskima faktorjema (slika 9).
Protein edn3b igra pomembno vlogo pri preživetju, širjenju, diferenciaciji in
preseljevanju melanofornih prekurzorjev. Diferenciacija melanofor poteka preko
interakcij med signalnimi potmi ednrb1a in kita. ednrb1a je pomemben predvsem v
končnem delu diferenciacije in ne toliko v začetku specifikacije melanofor (SaldanaCaboverde in Kos, 2010). Z vezavo Edn3b na receptor Ednrb1a v membrani pride do
prenosa signala preko proteinov Gnai/Gnao ter aktivacije cAMP in mapk poti. cAMP
signalna pot se, kot je že bilo omenjeno, zaključi s fosforilacijo transkripcijskega
faktorja Creb in posledično aktivacijo Mitfa, medtem ko se signalna pot mapk preko
Ras aktivacije zaključi z neposredno fosforilacijo transkripcijskega faktorja Mitfa (slika
9). Podobno kot signalna pot ednrb1a igra tudi kita signalna pot pomembno vlogo pri
ohranjanju diferenciacije melanofor. Aktivacija Kita preko njegovega liganda Kitlga je
nujna za ohranitev obarvanosti (Cooper in Raible, 2009). Aktivacija signalne poti kita
vodi do fosforilacije Mitfa preko mapk poti (slika 9). Po aktivaciji Mitfa sproži
izražanje tyr, tyrp1b in dct. Ti encimi se nahajajo v melanosomih in katalizirajo sintezo
melanina.
25
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
2.5
OBARVANOST PRI SALMONIDIH
Barvna raznolikost, ki se pojavlja pri ribah, je posledica večjega števila različnih tipov
pigmentnih celic in obenem tudi večjega nabora genov zaradi podvojitve genoma, ki se
je pri teleostih dogodila pred 320-350 milijoni let. Salmonidi, kamor se uvrščajo tudi
postrvi, so fenotipsko zelo raznoliki tudi zaradi tetraploidizacije genoma, ki se je
zgodila pred ~ 100 milijoni let (Allendorf in Thorgaard, 1984, cit. po Braasch in sod.,
2008).
O razlikah v obarvanosti kože ali barvnem vzorcu pri salmonidih je znanega zelo malo.
Različne vrste znotraj te družine kažejo vrstno specifičen barvni vzorec, ki se
popolnoma vzpostavi šele pri odraslih osebkih. Pri osebkih do drugega leta starosti pa je
ne glede na vrsto barvni vzorec zelo podoben in je sestavljen iz pretežno črnih
navpičnih prog, imenovanih juvenilne proge. Barvni vzorec se pri odraslih živalih
razlikuje glede na porazdelitev in barvo pik (črna, bela ali rdeča) ter velikost in
intenziteto rdečega pasu, ki se nahaja na boku rib. Kljub temu, da je za vsako vrsto
značilna zanjo karakteristična obarvanost, pa lahko pride tudi do širokega spektra
variabilnosti znotraj posamezne vrste, kot je to opaženo pri potočni postrvi glede števila
črnih in rdečih pik (Blanc in sod., 1994). Kljub različnosti barvnega vzorca pa je
obarvanost hrbta pri salmonidih vedno temnejša od obarvanosti trebuha (Colihueque,
2010).
Za obarvanost salmonidov so odgovorni trije tipi kromatofor; melanofore, ksantofore in
iridofore, ki se lahko nahajajo v usnjici kot samostojne enote, ali pa so povezane v t.i.
kromatoforno enoto (Hawkes, 1974a). Glede na mutacijo, ki vpliva na določen tip
kromatofor, so bili pri salmonidih opisani naslednji barvni mutanti: albino (Nakamura
in sod., 2001), golden (Yamamoto in sod., 1999) in modre različice, ki so lahko
mavrično metalno modre (Kincaid, 1975), kobaltovo modre (Yamaski, 1974, cit. po
Colihueque, 2010) ali mavrično modre (Blanc in sod., 2006). albino in golden mutanta
sta rezultat depigmentacije melanofor, medtem ko so modre različice rezultat strukturne
spremembe pigmentov v določenem tipu pigmentne celice (Colihueque, 2010).
26
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
S pomočjo mutantov je bilo do danes pri salmonidih identificirano 13 genov, ki so
vključeni v obarvanost in nastanek barvnega vzorca. Od teh štirje sodelujejo pri sintezi
melanina (tyr, tyrp1b, dct in pmela), osem pri sintezi pteridina (gch1 (angl. GTP
cyclohydrolase 1), gchfr (angl. GTP cyclohydrolase I feedback regulator), pts (angl. 6pyruvoyltetrahydropterin synthase), spra (angl. sepiapterin reductase a), txndc17 (angl.
thioredoxin domain containing 17), pcbd1 (angl. 6-pyruvoyl-tetrahydropterin
synthase/dimerization cofactor of hepatocyte nuclear factor 1 alpha (TCF1)), qdpr
(angl. quinoid dihydropteridine reductase) in mycbp2 (angl. MYC binding protein 2)) in
eden pri specifikaciji ksantofor (csf1ra) (Braasch in sod., 2007; Parichy in sod., 2000).
Več kot pol teh genov je v genomu podvojenih (tyr, pmela, gch1, gchfr, qdpr, pcbd1 in
mycbp2) (Braasch in sod., 2007). S pomočjo filogenetske analize je bilo ugotovljeno, da
nekaj teh podvojenih genov (npr. tyr) izvira iz podvajanja genoma pred 320-350
milijoni let, medtem ko so kopije preostalih (npr. gch1) nastale kot rezultat
avtotetraploidizacije pred ~100 milijoni let (Braasch in sod., 2007). Podvajanje genoma
je imelo zelo pomemben učinek na evolucijo pigmentnih genov in bi lahko razložilo
raznovrstnost in kompleksnost obarvanja ter nastanka barvnega vzorca pri salmonidih.
2.5.1 Obarvanost pri postrveh
Potočna postrv je sladkovodna vrsta rib, ki naseljuje območja vse od Norveške na
severu do Maroka na jugu ter od Irske in Islandije na vzhodu do Afganistana in
Kirgizistana na zahodu. Po videzu in obnašanju ji je podobna šarenka (Oncorhynchus
mykiss), ki je avtohtona v nekaterih vodotokih in jezerih Severne in Južne Amerike
(Behnke, 1992). Na osnovi morfologije je bilo v rodu Salmo in Oncorhynchus skupaj
opisanih več kot 50 vrst postrvi (Kottelat in Freyhof, 2007), kar uvršča postrvi med
najbolj raznolike organizme med vretenčarji. Potrjena je bila tudi velika variabilnost na
genetski ravni, kjer so raziskovalci ugotovili, da je pri postrveh iz rodu Salmo
genotipska različnost povezana z geografsko porazdelitvijo (Bernatchez, 2001; Cortey
in sod., 2004). Glede na geografsko porazdelitev se postrvi uvrščajo v štiri evropska
porečja: atlantsko, donavsko, sredozemsko in jadransko porečje.
Marmorirana postrv s svojim karakterističnim barvnim vzorcem naseljuje reke
jadranskega porečja (slika 11). V severnem predelu Jadrana naseljuje reko Sočo s
27
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
pritoki ter zgornje porečje reke Pad v Italiji. V južnejšem predelu Jadrana najdemo
marmorirano postrv v reki Neretvi (Bosna in Hercegovina) ter Zeti (Črna Gora).
Marmoriran vzorec pa ni prisoten samo pri marmoriranih postrveh jadranskega porečja,
ampak ga lahko najdemo tudi pri nekaterih potočnih postrveh atlantskega porečja, npr. v
reki Otri na Norveškem, kjer so našli potočno postrv s podobnim marmoriranim
vzorcem, kot ga imajo marmorirane postrvi jadranskega porečja (slika 11). Genetske
analize, ki so bile opravljene na marmoriranih predstavnikih atlantskega porečja, niso
potrdile neposredne sorodnosti z marmorirano postrvjo jadranskega porečja (Skaala in
Solberg, 1997).
28
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 11: Marmorirani vzorec pri postrveh jadranskega in atlantskega porečja. Od zgoraj navzdol;
marmorirana postrv iz Trebuščice (pritok Soče; foto: Dušan Jesenšek), marmorirana postrv iz Zete (Črna
gora; foto: Johannes Schöffmann), marmorirana postrv iz Neretve (Bosna in Hercegovina; foto: Aleš
Snoj) in potočna postrv z marmoriranim vzorcem iz reke Otre (Norveška; foto: Øystein Skaala)
Figure 11: Marble pattern in trout from Adriatic and Atlantic drainage. From top; marble trout from
Trebuščica (Soča tributary; photo: Dušan Jesenšek), marble trout from Zeta (Montenegro; photo:
Johannes Schöffmann), marble trout from Neretva (Bosnia and Herzegovina; photo: Aleš Snoj) and
marbled brown trout from river Otra (Norway; photo: Øystein Skaala)
V primerjavi s cebrico, pri kateri se barvni vzorec odrasle ribe izoblikuje v štirih tednih,
se barvni vzorec marmorirane postrvi oblikuje več let. Pri ličinki marmorirane postrvi se
melanofore nahajajo predvsem na glavi, od koder se nato širijo naprej po hrbtu vse do
repa (slika 12).
29
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 12: Obarvanost ličinke marmorirane postrvi (foto: Arne Hodalič)
Figure 12: Colouration of marble trout larvae (photo: Arne Hodalič)
Ob spolni zrelosti, ki jo marmorirana postrv doseže v starosti treh let (samci) oz. štirih
let (samice), se od hrbta navzdol po bokih razpreda temnejša marmoriranost v rumeno
olivno zelenih barvah, ki nemalokrat sega tudi pod pobočnico. Trebuh je vedno, kot je
to značilno za salmonide, svetlejši in je belo-rumene barve (Povž in sod., 1996).
30
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
3
3.1
MATERIAL IN METODE
MATERIAL
V raziskavo smo vključili predstavnike marmorirane in potočne postrvi ter križance
med marmorirano in potočno postrvjo F2 in F3 generacije. F1 generacija križancev je
bila pripravljena iz dveh skupin križanj: samica potočna × samec marmorirana postrv (I.
skupina) ter samica marmorirana × samec potočna postrv (II. skupina). Ob spolni
zrelosti F1 generacije je bila pripravljena F2 generacija kot prikazuje slika 13. F3
generacija je bila pripravljena z naključnim križanjem predstavnikov F2 generacije.
Slika 13: Shema križanja med marmorirano in potočno postrvjo
Figure 13: Diagram of crossing between marble and brown trout
V histološko analizo kože je bilo vključenih 12 predstavnikov marmoriranih postrvi
različnih starosti (0+, 1+, 2+ in 3+) ter devet pripadnikov potočne postrvi treh starostnih
skupin (0+, 1+ in 2+). Pred vzorčenjem smo pri vsaki ribi opravili meritev telesne mase
in dolžine (preglednica 2).
31
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Preglednica 2: Telesni parametri pri marmorirani in potočni postrvi. Vrednosti predstavljajo srednjo
vrednost ± SD (n = 3) (Sivka in sod., 2012)
Table 2:
Starost
0+
1+
2+
3+
Body-size parameters in marble and brown trout. Values represent mean ± SD (n = 3)
(Sivka et al., 2012)
Telesna masa (g)
Telesna dolžina (cm)
marmorirana p.
potočna p.
marmorirana p
potočna p.
2,6±0,3
2,1±0,1
6,4±0,2
5,9±0,2
70,5±8,8
70,0±17,3
18,0±0,5
17,9±1,0
413,3±80,2
138,7±20,6
32,6±2,3
23,8±1,4
623,3±197,3
36,4±3,3
Vzorce kože, velike 1 mm2, smo odvzeli na zgornjem predelu glave ter škržnem
poklopcu (slika 14) in jih fiksirali v 10% formalinu. Po fiksaciji v formalinu smo vzorce
prestavili in shranili v 70% etanolu.
Slika 14: Skica mesta vzorčenja pri marmorirani in potočni postrvi za histološke analize
Figure 14: Sketch of sampling place in marble and brown trout for histological analysis
Za določevanje polimorfizmov posameznih nukleotidov (SNP) v kandidatnih genih smo
uporabili 12 marmoriranih postrvi iz jadranskega porečja, 5 potočnih postrvi z
marmoriranim vzorcem iz atlantskega porečja, 12 potočnih postrvi iz vseh štirih
evropskih porečij (donavsko (Da), n=4; jadransko (Ad), n=3; atlantsko (At), n=3 in
sredozemsko (Me), n=2) dve mehkoustni postrvi (S. obtusirostris) iz jadranskega
porečja ter eno ohridsko postrv (S. ohridanus).
Kandidatne gene smo uporabili za genotipizacijo 140 postrvi, od katerih je bilo 36
marmoriranih postrvi iz šestih genetsko čistih populacij soškega porečja (Predelica,
Lipovšček, Zadlaščica, Trebuščica, Idrijca in Studenec), 40 postrvi iz Soče (hibridna
cona), 10 marmoriranih postrvi iz ribogojnice v Tagliamentu (Italija), 22 križancev med
32
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
marmorirano in potočno postrvjo F2 generacije ter 32 potočnih postrvi iz različnih
porečij.
Za testiranje povezave med fenotipom in genotipom smo uporabili 108 križancev med
marmorirano in potočno postrvjo F2 generacije. F2 križance smo glede na fenotip
razdelili na pet fenotipskih razredov: od popolnoma marmoriranega vzorca (1. razred),
preko leopardnega vzorca (3. razred), do barvnega vzorca potočne postrvi (5. razred)
(slika 15).
Slika 15: Obarvanost F2 križancev. Z leve proti desni: marmorirana obarvanost, leopardni vzorec ter
obarvanost potočne postrvi
Figure 15: Colouration of F2 hybrids. From left to right: marble colouration, leopard pattern and
colouration of brown trout
Za izdelavo subtraktivne cDNA knjižnice (metoda SSH) smo uporabili po enega
predstavnika marmorirane in potočne postrvi. Kožo smo odvzeli z boka (slika 16) in jo
shranili pri -70°C.
Slika 16: Mesto vzorčenja pri metodi SSH in mikromrežah
Figure 16: Sampling place for SSH method and microarrays
V analizo mikromrež smo vključili po tri predstavnike marmorirane postrvi, potočne
postrvi in F3 križancev s fenotipskim izražanjem marmoriranega vzorca. Za potrditev
rezultatov mikromrež smo uporabili kvantitativen PCR v realnem času (qRT-PCR), v
katerega smo poleg predstavnikov vključenih v analizo mikromrež vključili še po dva
33
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
predstavnika marmorirane postrvi, potočne postrvi in F3 križancev s fenotipskim
izražanjem marmoriranega vzorca, tako da je na koncu bilo v analizo qRT-PCR
vključenih po pet predstavnikov na skupino. Ribe so bile mesec dni pred vzorčenjem
preseljene v skupen bazen, kjer so bile podvržene enakim vplivom okolja. Po mesecu
dni smo ribe evtanazirali, odvzeli kožo z boka (slika 16) in to takoj prestavili v
RNAlater™ ter shranili pri -20°C.
3.2
METODE
3.2.1 Histološke analize kože
3.2.1.1
Izdelava in barvanje tkivnih rezin
Vzorce kože iz glave, ki se uporabljajo za študije povrhnjice pri ribah, smo vstavili v
parafinski vosek in razrezali prečno na 7 µm debele rezine. Histološke rezine smo
barvali s hematoksilin-eozinom in po metodi Mallory in Papanicolau (Wolf, 1954).
Rezine iz škržnega poklopca, pobarvane s ksilenom, smo uporabili za določevanje
velikosti, gostote in fiziološkega stanja melanofor.
3.2.1.2
Meritve in obdelava podatkov
Debelino povrhnjice smo določili kot povprečno vrednost debeline 25 naključno
izbranih mest v vzorcu. Relativno debelino povrhnjice smo izračunali z deljenjem
absolutne debeline povrhnjice s povprečno telesno maso osebkov istega starostnega
razreda.
Na rezinah škržnega poklopca smo s pomočjo 16 mm2 velike mreže, sestavljene iz 16
kvadratov velikosti mm2, prešteli melanofore in ocenili njihovo gostoto. Največji
premer melanofor smo določili kot povprečje povprečij 10 največjih melanofor v
posameznem kvadratu.
Za statistično analizo smo uporabili metodo najmanjših kvadratov v statističnem
programskem paketu SAS/STAT (SAS Institute Inc., 2002). V model smo vključili
vrsto in starostno skupino kot sistematska vpliva ter žival kot naključni vpliv. S
34
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
pomočjo Tukey-Kramer testa smo ovrednotili statistično značilne razlike (p < 0,05) med
vrsto in starostno skupino osebkov.
Statistični model:
yijkl    Vi  S j  aijk  eijkl
...(1)
Kjer je:
yijkl = gostota melanofor (mm-2), najmanjša gostota melanofor (mm-2), največja gostota
melanofor (mm-2) in največji premer melanofor (µm)
µ=
srednja vrednost
Vi =
vrsta; i = 1 in 2
Sj =
starostna skupina; j = 1, 2, 3 in 4
aijk = žival; k = 1, 2 in 3
eijkl = ostanek
3.2.2 Določevanje polimorfizmov posameznih nukleotidov (metoda SNP)
3.2.2.1
Identifikacija kandidatnih genov, vključenih v obarvanost
Za identifikacijo kandidatnih genov, vključenih v obarvanost in nastanek barvnega
vzorca, smo uporabili pristop primerjalne genomike. S pomočjo podatkovnih baz
cebrice (http://zfin.org), ki je modelni organizem za genomske študije teleostov, smo
naredili nabor kandidatnih genov, ki so vključeni v proces izoblikovanja in nastajanja
barvnega vzorca. Sekvencam kandidatnih genov smo s pomočjo EST podatkovne baze
salmonidov
(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/gimain.pl?gudb=salmon)
nato poskušali poiskati homologne odseke pri atlantskem lososu (S. salar) in šarenki.
Glede na homolognost odsekov smo s pomočjo prosto dostopnega programa Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/) določili začetne oligonukleotide 11 kandidatnim genom
(preglednica 3).
Poleg podatkovnih baz smo se za identifikacijo kandidatnih genov poslužili tudi
pregledovanja literature. S pregledovanjem le-te, smo v naš nabor kandidatnih genov
dodali še tri gene: smtl (Ford, 2000) in tyr (Thorsen in sod., 2006), ki sta že bila opisana
35
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
pri samonidih ter csf1r, ki je bil opisan pri ciklidih (Astatotilapia burtoni) (Braasch in
sod., 2006) (preglednica 3).
Preglednica 3: Začetni oligonukleotidi 14 kandidatnih genov
Table 3: Primers of 14 candidate genes
Gen
asip
slc24a5
paics
hdac1
fbxw4
dlat
nsfb
trim33
kcnj13
scarb1
pmela
smtl
tyr
csf1r
3.2.2.2
Ime začetnega
oligonukleotida
asp1-F
asp1-R
slc24a5-F
slc24a5-R
paics-F
paics-R
hdac1-F
hdac1-R
fbxw4-F
fbxw4-R
dlat-F
dlat-R
nsfb-F
nsfb-R
trim33-F
trim33-R
kcnj13-F
kcnj13-R
scarb1-F
scarb1-R
pmela-F
pmela-R
smtl-F
smtl-R
tyr-F
tyr-R
csf1r-F
csf1r-R
Nukleotidno zaporedje
5'- CCCTTTCTGAATTTCCTGACTAC-3'
5'- CATCTGTTTGGTTATTTGCTTGTA-3'
5'-TGAGGACAGACGTGTTTCTC-3'
5'- GCAGAACTCGAACCCTGGAA-3'
5'-CACGAGCTGTGTTTTCAAGTT-3'
5'-TTCAGAGGGGAGAACCTGTAG-3'
5′-GYATGACMCACAACCTCYTG-3′
5′-TGYTTGCTGTRYTCTGACAT-3′
5′-ACCCACCTCATCTCTGGTAAC-3′
5′-GCGTTGATGTTCTGGATCTTA-3′
5'- TCACCAGGAAAGACATTGAGA-3'
5'-CCGTCGGATGTTGCTGAC-3'
5'- AGATTGACATTGGCCTGCTG-3'
5'- ATCTGTTCCACGATGTCAGGA-3'
5'- GAGAAGGACACCAGTGAGCAG-3'
5'- TAGGCTGCACAAACTCATCCT-3'
5'- CTTCCAATACAACCATCCAAAGT-3'
5'- CCAATAGTATCTGAACCCAGGTC-3'
5' AAGTCAGCGACAAACCAGAG-3'
5'- GGAAACCCAGAGTTGGTTCT-3'
5'-CATACAACTGGGACTTTGGTG-3'
5'-TTACTGTAGCTCCCTGTGTGG-3'
5′-TGGCCCGTTGAATCCATATAAAG-3′
5′-ACTGTGAAACACTAAGCTCTCCA-3′
5'- TGTGATGTATTGCGATGCCGCTC-3'
5'- TGTTTGCGGTTCTCCCAGCAG-3'
5'-ARATGTGCTGGAAYCTGGA-3'
5'-AYTGRTAGTTRTTGGKCTTCA-3'
Vir
(Susnik in sod., 2008)
(Ford, 2000)
(Thorsen in sod., 2006)
(Braasch in sod., 2006)
Izolacija jedrne DNA
Za izolacijo jedrne DNA smo ribam odrezali del analne plavuti in jo shranili v 96%
alkoholu. Delu odvzetega vzorca smo dodali 600 µl ekstrakcijskega pufra (0,5 M TRIS,
0,1 M EDTA in 2% SDS) in 5 µl proteinaze K. Suspenzijo smo inkubirali preko noči pri
37°C in jo po končani inkubaciji postavili na led. Ohlajenim vzorcem smo dodali 350 µl
5 M amonijevega acetata in dobro premešali ter ponovno postavili na led. Po
centrifugiranju (15 min pri 13.000 rpm) smo supernatant odpipetirali v novo
centrifugirko in mu dodali 600 µl ledeno hladnega izopropanola. Po dodatku
izopropanola smo vzorce rahlo premešali in jih postavili na led za pol ure. Po inkubaciji
36
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
smo vzorce centrifugirali 10 min pri 13.000 rpm. Supernatant smo po centrifugiranju
zavrgli, DNA pa sprali s 70% etanolom, posušili ter raztopili v 30 µl mili-Q vode.
3.2.2.3
Verižna reakcija s polimerazo (PCR) in PIRA-PCR (angl. "primer-introduced
restriction analysis PCR")
Verižno reakcijo s polimerazo smo opravili na petih kandidatnih genih: paics
(angl. phosphoribosylaminoimidazole
carboxylase,
phosphoribosylaminoimidazole
succinocarboxamide synthetase), pmela (angl. premelanosome protein a), smtl (angl.
somatolactin), hdac1 (angl. histone deacetylase 1) in fbxw4 (angl. F-box and WD-40
domain protein 4). Za pomnoževanje genov smo uporabili začetne oligonukleotide
predstavljene v preglednici 3.
Reakcija PCR je potekala v cikličnem termostatu GeneAmp®PCR System 2720 (AB
Applied Biosystems) in se je začela s 3 min začetne denaturacije DNA pri 94°C, kateri
je sledilo 35 ciklov s sledečim temperaturnim profilom:
 denaturacija
94°C, 45 s
 prileganje
60°C (paics, pmela in hdac1), 55°C (fbxw4) in 52°C (smtl), 20 s
 podaljševanje 72°C, 45 s
Reakcijo smo zaključili z 2-min podaljševanjem DNA-odseka pri 72°C in ohlajanjem na
4°C. Vsaka 25-µl reakcija je vsebovala naslednje komponente:
 50 ng jedrne DNA
 0,5 µM začetnih oligonukleotidov F in R
 0,2 mM dNTP
 1,5 mM MgCl2
 1× PCR pufer
 1 enoto Taq polimeraze (Fermentas)
Nukleotidno zaporedje pomnoženih odsekov so določili v podjetju Macrogen Inc.
(Koreja). Za določitev nukleotidnega zaporedja so bili uporabljeni začetni
oligonukleotidi na 5'-koncu. Pridobljena nukleotidna zaporedja smo poravnali s
pomočjo računalniškega programa ClustalX (Thompson in sod., 1994). Na osnovi
poravnanih nukleotidnih zaporedij smo določili mesta SNP, ki so razlikovala
marmorirano postrv od potočne postrvi.
37
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Za SNP genotipizacijo smo pri pmela in smtl uporabili PIRA-PCR. PIRA-PCR v PCR
produkt vključi umetno restrikcijsko mesto s pomočjo začetnih oligonukleotidov z
neujemanjem v enem baznem paru blizu 3'-konca (Ke in sod., 2001). Za PIRA-PCR
smo uporabili začetne oligonukleotide, ki so jih objavili Sušnik in sodelavci (2008) in
so predstavljeni v preglednici 4.
Preglednica 4: Začetni oligonukleotidi, uporabljeni v PIRA-PCR
Table 4:
Gen
pmela
smtl
Primers used in PIRA-PCR
Ime začetnega oligonukleotida
pmela -PIRA-F
pmela -PIRA-R
smtl-PIRA-F
smtl-PIRA-R
Nukleotidno zaporedje
5′-ATTTCCTATTTTCTTGGTCAATTCCG-3′
5′-AAGGCTTTACTTGGGTTCCTTGC-3′
5′-TACACATGGTTAGCAGATGTTAATTC-3′
5′-GGATGCGTCCAATATCTTTCTA-3′
Reakcija PIRA-PCR je prav tako potekala v cikličnem termostatu GeneAmp®PCR
System 2720 (AB Applied Biosystems) in se je začela s 3 min začetne denaturacije
DNA pri 94°C, kateri je sledilo 35 ciklov s sledečim temperaturnim profilom:
 denaturacija
94°C, 30 s
 prileganje
60°C, 20 s
 podaljševanje
72°C, 20 s
Reakcijo smo zaključili z 2-min podaljševanjem DNA-odseka pri 72°C in ohlajanjem na
4°C. Končni volumen reakcije je znašal 15 µl in je vseboval enake koncentracije
reagentov kot so opisane zgoraj.
3.2.2.4
Restrikcijska (RFLP) analiza
Na osnovi polimorfnih mest v odsekih kandidatnih genov smo izbrali dva restrikcijska
encima (TaqI za gen smtl in HpaII za gen pmela; Fermentas), s katerima smo z
restrikcijsko analizo produktov PCR ugotavljali posamezne genotipe lokusov.
Restrikcija je potekala v 15-µl reakcijah, ki so vsebovale po 10 µl produkta PCR, 1×
restrikcijski pufer ter 1U restrikcijskega encima. Inkubacija je potekala 3 ure pri 65°C
(TaqI) ali 37°C (HpaII).
38
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
3.2.2.5
Statistična analiza
Frekvenco alelov in ocenitev vezavnega neravnovesja smo izračunali s pomočjo prosto
dostopnega programa FSTAT (Goudet, 2001). Vezavno neravnovesje med jedrnimi
označevalci je bilo testirano na vzorcih iz hibridne cone in na F2 križancih.
Povezavo med fenotipom in genotipom smo izračunali s Spearmanovo metodo v
statističnem programskem paketu SAS/STAT (SAS Institute Inc., 2002).
3.2.3 Izdelava subtraktivne cDNA knjižnice (metoda SSH)
Supresijska subtraktivna hibridizacija je metoda, ki nam omogoča primerjavo mRNA iz
dveh sorodnih virov. Deluje po metodi izključevanja homolognih fragmentov,
posledično kot končni rezultat dobimo specifično izražene fragmente oziroma
transkripte (glej 3.2.3.2).
3.2.3.1
Izolacija celokupne RNA in mRNA
S pomočjo terilnice in tekočega dušika smo razdrobili od 50 do 100 mg vzorca tkiva.
Razdrobljenemu tkivu smo dodali 1 ml reagenta TRIzol™. Po dodatku reagenta smo
homogenizirane vzorce inkubirali 5 min pri sobni temperaturi. Po inkubaciji smo dodali
200 µl kloroforma, močno pretresli 15 s in inkubirali pri sobni temperaturi 2 do 3
minute. Vzorce smo po inkubaciji centrifugirali 15 min pri 12.000 × g in 4°C. Po
centrifugiranju nastanejo tri faze: spodnja rdeča fenol-kloroform faza, srednja bela faza,
v kateri se nahajajo proteini in ostale nečistoče, ter zgornja vodna faza, v kateri se
nahaja RNA. Volumen vodne faze predstavlja ~60 % volumna TRIzol™ reagenta,
uporabljenega za homogenizacijo tkiva. Vodno fazo smo prenesli v novo centrifugirko
in dodali 500 µl izopropanola ter inkubirali 10 min pri sobni temperaturi. Po inkubaciji
smo vzorce centrifugirali 10 min pri 12.000 × g in 4°C. Po končanem centrifugiranju
smo odstranili supernatant in sprali RNA s 75% etanolom. Po spiranju smo RNA
posušili na zraku in jo raztopili v 50 µl pufra RM1 (NucleoTrap® mRNA Mini Kit,
Macherey-Nagel).
39
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Izolacija mRNA iz celokupne RNA je potekala s kompletom "NucleoTrap® mRNA
Mini Kit" (Macherey-Nagel), po navodilih proizvajalca. Po izolaciji smo mRNA vzorce
shranili pri -70°C.
3.2.3.2
Supresijska subtraktivna hibridizacija (SSH)
SSH je potekala s kompletom "PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit" (Clontech), po
navodilih proizvajalca. Postopek subtraktivne hibridizacije smo pričeli s transkripcijo
mRNA in nadaljevali z restrikcijsko cepitvijo cDNA z restrikcijskim encimom RsaI, po
kateri so nastali na cDNA t.i. topi konci, ki so omogočali vezavo adapterjev. cDNA smo
nato razdelili na dva dela in naredili ligacijo z različnima adapterjema. Vzorec, ki ima
vezan adapter, se imenuje "tester", vzorci brez adapterjev se imenujejo "driver" in
predstavljajo referenčno cDNA. Subtrakcija je potekala v obe smeri. Najprej smo
uporabili vzorec marmorirane postrvi kot "tester 1" in vzorec potočne kot "driver", nato
pa smo vlogi zamenjali, tako da je potočna postrv postala "tester 2" in marmorirana
postrv "driver" (slika 17).
Slika 17: Priprava "tester cDNA" za hibridizacijo in PCR (PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit User
Manual, Clontech)
Figure 17: Preparing tester cDNAs for hybridization and PCR (PCR-Select™ cDNA Subtraction Kit User
Manual, Clontech)
40
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Po ligaciji smo razredčili 1 µl vsakega vzorca v 1000 µl vode. Ti razredčeni vzorci so
predstavljali nesubtraktivno kontrolo "tester" vzorcev. Za preverjanje uspešnosti ligacije
smo cDNA razredčili z vodo v razmerju 1:200 in od te redčine uporabili 1 µl za PCR
analizo. S PCR analizo smo preverili, če ima vsaj 25 % cDNA vezane adapterje na 5' in
3' koncih. Koncentrirana PCR mešanica je vsebovala 18,5 µl sterilne vode, 2,5 µl 10×
PCR reakcijskega pufra, 0,5 µl mešanice dNTP (10 mM) in 0,5 µl 50× cDNA mešanice
s polimerazo. Za pomnoževanje smo uporabili naslednje začetne oligonukleotide:
ß-aktin F
5'- CCAAAGCCAACAGGGAGAAG-3'
ß-aktin R
5'- AGGGACAACACTGCCTGGAT-3'
"PCR Primer 1"
5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3'.
Reakcija PCR je potekala v cikličnem termostatu GeneAmp®PCR System 2720 (AB
Applied Biosystems) in se je pričela z inkubacijo pri 75°C 5 min in nato nadaljevala z
denaturacijo pri 94°C 30 sek. Po denataruciji je sledilo 20 ciklov z naslednjim
temperaturnim profilom:
 denaturacija
94°C, 10 sek
 prileganje
65°C, 30 sek
 podaljševanje 68°C, 2,5 min
PCR produkte smo analizirali s pomočjo elektroforeze na 2% agaroznem gelu.
Po ligaciji je sledila primarna in sekundarna hibridizacija. Po hibridizaciji je različno
izražena cDNA selektivno pomnožena z dvema zaporednima PCR reakcijama. Pri
prvem pomnoževanju je eksponentno pomnožena dvoverižna cDNA, ki ima različne
sekvence adapterjev na obeh koncih. Pri drugem pomnoževanju z uporabo vgnezdenih
začetnih oligonukleotidov zmanjšamo nespecifično ozadje in nadalje pomnožimo
različno izražene fragmente cDNA.
Pri prvem pomnoževanju smo uporabili 1 µl vzorcev po hibridizaciji (subtraktivna
cDNA), 1 µl razredčenih vzorcev po vezavi adapterjev (nesubtraktivna "tester"
kontrola) ter 1 µl kontrolne subtraktivne cDNA. Koncentracijska mešanica je vsebovala:
41
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
 19,5 µl sterilne vode
 2,5 µl 10× PCR reakcijskega pufra
 0,5 µl dNTP mešanice (10 mM)
 1,0 µl PCR Primer 1 (10 µM)
 0,5 µl 50× cDNA mešanice s polimerazo
Vzorcem smo dodali 24 µl dobro premešane koncentracijske mešanice ter prekrili s 50
µl mineralnega olja. Verižna reakcija s polimerazo je potekala v cikličnem termostatu
GeneAmp®PCR System 2720 (AB Applied Biosystems) in se je pričela z inkubacijo pri
72°C 5 min in nato nadaljevala z denaturacijo pri 94°C 25 sek. Po denataruciji je sledilo
27 ciklov z naslednjim temperaturnim profilom:
 denaturacija
94°C 10 sek
 prileganje
66°C 30 sek
 podaljševanje 72°C 1,5 min
Za drugo pomnoževanje smo 2 µl primarnega PCR produkta razredčili z 8 µl sterilne
vode. Za sekundarno pomnoževanje smo uporabili vgnezdena začetna oligonukleotida:
"Nested PCR primer 1"
5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
"Nested PCR primer 2R"
5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'
Razredčenemu produktu PCR (1 µl) smo dodali 2,5 µl 10× PCR reakcijskega pufra, 1 µl
"Nested PCR primer 1" (10 µM), 1 µl "Nested PCR primer 2R" (10 µM), 0,5 µl
mešanice dNTP (10 mM), 0,5 µl 50× cDNA mešanice s polimerazo ter 18,5 µl sterilne
vode. Vzorce smo premešali in prekrili s kapljico mineralnega olja. PCR reakcija je
potekala v cikličnem termostatu GeneAmp®PCR System 2720 (AB Applied
Biosystems) in je bila sestavljena iz 15 ciklov:
 denaturacija
94°C 10 sek
 prileganje
68°C 30 sek
 podaljševanje 72°C 1,5 min
Vzorce primarnega in sekundarnega PCR smo preverili na 2% agaroznem gelu. Za
nadaljnje analize smo vzorce shranili pri -20°C.
42
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
3.2.3.3
Ligacija
Fragmente pridobljene s supresijsko subtraktivno hibridizacijo, smo uporabili za
ligacijo v vektor pGEM®-T. Ligacija je potekala po protokolu "pGEM®-T and pGEM®T Easy Vector Systems" (Promega). Ligacijska mešanica je vsebovala:
 5 µl 2× ligacijskega pufra,
 50 ng vektorja,
 3 µl sekundarnega PCR produkta,
 3 enote T4 DNA-ligaze,
 bidestilirano vodo do 10 µl.
Ligacija je potekala preko noči pri 4°C. Po končani ligaciji smo vzorce shranili pri 20°C.
3.2.3.4
Transformacija s toplotnim šokom
Kompetentne celice (JM109 High Efficiency Competent Cells, Promega) smo odtalili
na ledu in v vsako centrifugirko s 50 µl njihove suspenzije dodali 2 µl ligacijske
mešanice. Suspenzijo smo rahlo premešali in inkubirali 20 min na ledu. Sledila je 50sek inkubacija v vodni kopeli, ogreti na 42°C. Iz vodne kopeli smo vzorce prenesli takoj
na led in jih na ledu inkubirali še 2 min. Celični suspenziji smo dodali 950 µl gojišča
SOC (preglednica 5), ogretega na sobno temperaturo, in jo inkubirali 1,5 ure na
stresalniku (37°C, ~150 rpm).
43
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Preglednica 5: Gojišča za bakterijske kulture
Table 5:
Medium for bacterial cultures
Gojišče
gojišče SOB (1 l)
Sestava
20 g bakto triptona
5 g kvasnega ekstrakta
0,5 g NaCl
10 ml KCl (250 mM)
destilirana voda do 1 l
pH 7,0
gojišče SOC
gojišče SOB
20 mM glukoze
tekoče gojišče LB (1 l)
10 g peptona
5 g kvasnega ekstrakta
destilirana voda do 1 l
pH 8,2
trdno gojišče LB
tekoče gojišče LB
20 g bakto agarja
gojišče LB/Amp
gojišče LB
100 µg/ml ampicilina
3.2.3.5
Gojenje transformiranih celic
Transformirane celice smo enakomerno razmazali na trdnem gojišču LB Amp,
premazanem s 40 µl raztopine X-gal (20 mg/ml, Gibco BRL) in 25 µl 100 mM vodne
raztopine IPTG (Gibco BRL). Dodatek substrata X-gal na trdno gojišče omogoča
belo/modro selekcijo kolonij. Celice, ki vsebujejo vektor z insertom, so bele, celice z
vektorjem brez inserta pa se obarvajo modro. Celice smo gojili 24 ur pri 37°C v
inkubatorju. Bele kolonije smo prenesli na sveže trdno gojišče LB Amp in jih do
primerne velikosti za preslikavo na membrano inkubirali pri 37°C.
3.2.3.6
Liza bakterijskih celic in denaturacija cDNA
Na bakterijske kolonije smo za 15 sek položili membrano (Amersham, Hybond-N+ 0,45
µm, Ф 82 mm) in jih s tem prenesli nanjo. Tri trakove filtrskega papirja smo prepojili z
liznim, denaturacijskim oziroma renaturacijskim pufrom (preglednica 6). Na trakove
smo zaporedoma za ~5 min položili membrane, obrnjene s kolonijami navzgor. Po
renaturaciji smo membrane posušili pri sobni temperaturi in jih nato inkubirali 30 min
pri 90°C. Sledila je enourna inkubacija membrane s stresanjem v raztopini proteinaze K
44
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
pri 37°C in nato 3 ure v 50 ml pufra za spiranje pri 65°C. Na koncu smo membrane
dvakrat spirali po 5 min v 30 ml pufra 2x SSC pri 55°C.
Preglednica 6: Pufri za lizo bakterijskih celic in denaturacijo ter renaturacijo cDNA
Table 6:
Pufer
Lizni pufer
Buffers for lysis of bacterial cells and denaturation and renaturation of cDNA
Sestava
10% SDS
Denaturacijski pufer
0,5 M NaOH
1,5 M NaCl
Renaturacijski pufer
1 M HCl
1,5 M NaCl
10 mM MgCl2
pH 7,7
Hibridizacijski pufer (20× SSC)
3 M NaCl
0,3 M Na-citrat
2× SSC
0,5 % SDS
10 % proteinaza K
Raztopina proteinaze K
2× SSC
0,5% SDS
Pufer za spiranje
3.2.3.7
Označevanje in detekcija pozitivnih kolonij
Za označevanje in detekcijo pozitivnih kolonij smo uporabili komplet "DIG High Prime
DNA Labeling and Detection Starter Kit II" (Roche Applied Science), ki temelji na
kemiluminiscenčni detekciji signala. Za označevanje smo uporabili sekundarni PCR
produkt subtraktivne hibridizacije tako marmorirane (T1-1) kot potočne postrvi (T2-1),
ki smo ga predhodno očistili s kompletom "High Pure PCR Product Purification Kit"
(Roche). 16 µl očiščene cDNA (T1-1 in T2-1) smo denaturirali v vreli vodi 10 min. Po
denaturaciji smo vzorce prestavili na led in dodali 4 µl mešanice DIG-High Prime.
Sledila je inkubacija pri 37°C preko noči in nato ustavitev reakcije s segrevanjem
vzorcev na 65°C 10 min. Po kontroli učinkovitosti označevanja cDNA, ki je potekalo po
navodilih proizvajalca, je sledila hibridizacija. Prehibridizacijsko raztopino DIG Easy
Hub smo ogreli na 37°C. Sprane membrane, ki so ostale po lizi bakterijskih celic in
denaturaciji cDNA, smo potopili v 30 ml ogrete prehibridizacijske raztopine in jih
inkubirali pri 37°C pol ure z nenehnim mešanjem. Hibridizacijsko raztopino smo
pripravili iz ~19 µl označene cDNA potočne postrvi (T2-1), ki smo jo predhodno 5 min
45
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
denaturirali v vreli vodi in 25 ml ogrete (37°C) prehibridizacijske raztopine. Membrane
smo prestavili iz prehibridizacijske v hibridizacijsko raztopino in inkubirali preko noči
pri 37°C s stalnim mešanjem. Po inkubaciji smo membrane spirali 2-krat po 5 min pri
20°C v 2× SSC in 0,1% SDS in nato še 2-krat po 15 min pri 20°C v 0,5× SSC in 0,1%
SDS. Po spiranju je sledila imunološka detekcija.
Imunološka detekcija se je pričela s 5-min inkubacijo (25°C) v 50 ml pufra za spiranje
(preglednica 7). Sledila je inkubacija v 100 ml raztopine za blokiranje (30 min, 38°C) in
kasneje še inkubacija v 25 ml protitelesne raztopine (30 min, 25°C). Po inkubaciji je
sledilo 2-kratno spiranje membran po 15 min v 100 ml pufra za spiranje. Po spiranju
smo inkubirali membrane 5 min v 20 ml detekcijskega pufra. Membrane smo iz
detekcijskega pufra prestavili na PVC folijo in jih prepojili z 1 ml CSPD in nato takoj
prekrili z drugim kosom PVC folije. Sledila je detekcija na rentgenskem filmu.
Preglednica 7: Pufri za imunološko detekcijo
Table 7:
Buffers for immunological detection
Pufer
Pufer za spiranje
Sestava
0,1 M maleinska kislina
0,15 M NaCl
pH 7,5
0,3% (v/v) Tween 20
Pufer maleinske kisline
0,1 M maleinska kislina
0,15 M NaCl
pH 7,5
Detekcijski pufer
3.2.3.8
0,1 M Tris-HCl
0,1 M NaCl
pH 9,5
Detekcija signala na rentgenskem filmu
Kemiluminiscenčni signal pozitivnih kolonij na membranah po hibridizaciji smo
ugotavljali z ekspozicijo membran na rentgenskem filmu. Po ročnem razvijanju smo
signal kolonij, ki so hibridizirale z insertom potočne postrvi, zaznali kot temne lise na
filmu. Iz položaja lis pa smo lahko identificirali pozitivne kolonije na trdnem gojišču.
46
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
3.2.3.9
Izolacija plazmidov in sekvenciranje insertov v plazmidu
Pozitivne kolonije smo raztopili v 20 µl Mili-Q vode. Vzorce smo denaturirali pri 95°C
5 min. Za pomnoževanje smo uporabili 1 µl denaturiranega vzorca ter univerzalna
začetna oligonuklepotida SP6 in T7.
SP6
5'-ATTTAGGTGACACTATAG-3'
T7
5'- AATACGACTCACTATAG-3'
Reakcija PCR je potekala v cikličnem termostatu GeneAmp®PCR System 2720 (AB
Applied Biosystems) in se je začela s 3 min začetne denaturacije DNA pri 94°C, kateri
je sledilo 35 ciklov s sledečim temperaturnim profilom:
 denaturacija
94°C, 10 s
 prileganje
68°C, 30 s
 podaljševanje 72°C, 1,5 min
Reakcijo smo zaključili z 2-min podaljševanjem DNA-odseka pri 72°C in ohlajanjem na
4°C. Vsaka 25-µl reakcija je vsebovala naslednje komponente:
 1 µl cDNA
 0,5 µM začetnih oligonukleotidov (SP6 in T7)
 0,2 mM dNTP
 1,5 mM MgCl2
 1× PCR pufer
 1 enoto Taq polimeraze (Fermentas)
 bidestilirano vodo do 25 µl.
Nukleotidno zaporedje pomnoženih odsekov je bilo določeno v podjetju Macrogen Inc.
(Koreja).
3.2.4 Analiza mikromrež in kvantitativen PCR v realnem času (qRT-PCR)
3.2.4.1
Analiza mikromrež
Za identifikacijo transkriptov z različnim izražanjem pri marmorirani in potočni postrvi
ter F3 križancih s fenotipskim izražanjem marmoriranega barvnega vzorca smo
uporabili cDNA mikromrežo cGRASP 32K (Koop in sod., 2008). Mikromreža je bila
izdelana s pomočjo cDNA knjižnic različnih tkiv (koža, skeletne mišice, možgani, srce,
47
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
ledvice, jetra,..) atlantskega lososa in šarenke; vsebuje 33.696 cDNA sekvenc. Za
analizo mikromrež smo izbrali referenčni model, ki temelji na združevanju vzorcev
RNA in sintezi referenčne RNA. Vsak vzorec je nato hibridiziran proti referenčnemu
vzorcu in s tem je omogočena posredna primerjava vzorcev med sabo. Skupno je bilo
hibridiziranih devet mikromrež; tri z RNA, izolirano iz kože marmorirane postrvi, tri z
RNA, izolirano iz kože potočne postrvi in tri z RNA, izolirano iz kože F3 križancev s
fenotipskim izražanjem marmoriranega barvnega vzorca.
3.2.4.1.1 Izolacija celokupne RNA iz tkiva
Izolacija celokupne RNA iz kože je potekala s kompletom "RNeasy Mini Kit" (Qiagen).
S pomočjo aparata TissueLyser (Qiagen) smo razdrobili in homogenizirali ~30 mg
vzorca tkiva, kateremu smo predhodno dodali 1 ml reagenta TRIzol™. Po dodatku
reagenta smo homogenizirane vzorce inkubirali 5 min pri sobni temperaturi. Po
inkubaciji smo dodali 200 µl kloroforma, močno pretresli 15 s in inkubirali pri sobni
temperaturi 2 do 3 minute. Vzorce smo po inkubaciji centrifugirali 15 min pri 12.000 ×
g in 4°C. Vodno fazo smo prenesli v novo centrifugirko, dodali enak volumen 70%
etanola ter premešali. Vzorce smo prenesli na kolone RNeasy in centrifugirali 15 s pri
8.000 × g. Kolone smo nato spirali s 700 µl pufra RW1 (8.000 × g, 15 s), 500 µl pufra
RPE (8.000 × g, 15 s) in 500 µl pufra RPE (8.000 × g, 2 min). Po spiranju smo kolone
prestavili v nove cenrifugirke in dodali 50 µl RNaze proste vode ter centrifugirali pri
8.000 × g, 1 min. Vzorce smo shranili pri -70°C za nadaljne analize. Koncentracijo
celokupne RNA smo izmerili na spektrofotometru NanoDrop. Za določevanje
razgrajenosti celokupne RNA smo uporabili 2100 Bioanalyzer (Agilent).
3.2.4.1.2 Posredno označevanje RNA
Označevanje RNA je lahko neposredno ali posredno. Pri neposrednem označevanju je
barvilo vezano na nukleotide neposredno, medtem ko je pri posrednem označevanju
barvilo vezano na nukleotide preko amino skupine. Za posredno označevanje smo
uporabili komplet "Amino Allyl MessageAmp™ Kit" (Ambion), ki temelji na
pomnoževanju RNA in vključitvi modificiranega nukleotida 5-(3-aminoalil)-UTP
(aaUTP) v aRNA (angl. antisense RNA) med in vitro prepisovanjem. aaUTP ima na
mestu C5 v uracilu vezano amino skupino, na katero se vežejo barvila. Pomnoževanje
48
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
RNA se prične z obratnim prepisovanjem, pri katerem uporabimo oligo(dT) začetni
oligonukleotid s T7 promotorsko sekvenco, in nadaljuje z in vitro prepisovanjem cDNA
s T7 RNA polimerazo, ki proizvede več tisoč kopij protismerne RNA (aRNA) iz vsake
mRNA molekule v vzorcu.
Posredno označevanje je potekalo po naslednjem protokolu:
 dodajanje 1 µl T7 Oligo(dT) začetnega oligonukleotida k 1 µg celokupne RNA
 dodajanje nukleaze-proste vode do končnega volumna 12 µl
 inkubacija pri 70°C 10 min v cikličnem termostatu
 kratko centrifugiranje in ohladitev vzorcev na ledu
 dodajanje 8µl koncentrirane mešanice (2 µl 10× pufra prve verige cDNA, 1 µl
ribonukleaznega inhibitorja, 4 µl mešanice dNTP in 1 µl reverzne transkriptaze),
temeljito mešanje in inkubacija pri 42°C, 2 uri
 kratko centrifugiranje in postavitev vzorcev na led
Po sintezi prve verige cDNA je takoj sledila sinteza druge verige cDNA:
 dodajanje 80 µl koncentrirane mešanice (63 µl nukleaze-proste vode, 10 µl
10× pufra druge verige cDNA, 4 µl mešanice dNTP, 2 µl DNA polimeraze in 1
µl RNaze H)
 inkubacija pri 16°C, 2 uri v cikličnem termostatu
 shranitev vzorcev pri -20°C
Pred sintezo aRNA smo cDNA očistili po navodilih proizvajalca. Sinteza aRNA z in
vitro transkripcijo je potekala po naslednjem protokolu:
 dodajanje 26 µl koncentrirane mešanice (3 µl aaUTP raztopine (50 mM), 12 µl
mešanice (25 mM)ATP, CTP, GTP, 6 µl raztopine UTP (50 mM), 4 µl T7 10×
reakcijskega pufra in 4 µl T7 encimske mešanice) k 14 µl očiščene cDNA
 inkubacija pri 37°C, 6 ur
Po inkubaciji smo aRNA očistili po navodilih proizvajalca in analizirali na
spektrofotometru NanoDrop in na agaroznem gelu. Po analizi aRNA je sledilo posredno
označevanje s fluorescentnimi barvili Cy3 in Cy5. Fluorescentna barvila smo vedno
pripravili sveža z dodajanjem 45 µl DMSO k barvilu Cy3 ali Cy5 (Amersham
49
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Biosciences). Za označevanje smo uporabili 20 µg amino alil aRNA, ki smo jo
predhodno vakuumsko posušili in resuspendirali v 4,5 µl pufra za sklapljanje. Po
dodatku 5,5 µl sveže pripravljenega barvila Cy3 oz. Cy5 smo vzorce inkubirali pol ure v
temi pri sobni temperaturi. Reakcijo smo ustavili z dodatkom 4,5 µl 4M hidroksilamina
in 15-min inkubacijo v temi pri sobni temperaturi. Označeno RNA smo očistili s
kolonami S.N.A.P.™ (Invitrogen), po navodilih proizvajalca. Učinkovitost označevanja
smo preverili spektrofotometrično.
3.2.4.1.3 Hibridizacija mikromrež
Pred hibridizacijo smo mikromreže spirali 2-krat po 5 min v 0,2% SDS in 5-krat po 1
min v Mili-Q vodi ter jih posušili s centrifugiranjem (5 min pri 514 × g).
Prehibridizacija mikromrež je potekala pri 49°C 90 min v 5× SSC, 0,1% SDS in 3%
BSA. Sledilo je 3-kratno spiranje (20 s) v Mili-Q vodi in sušenje s centrifugiranjem.
Hibridizacijska raztopina je vsebovala 30 µl 2× formamidnega pufra (50% formamid,
8× SSC, 1% SDS in 4× Denhartova raztopina), 26 µl označene cDNA in 4 µl dT
zaviralca LNA (Geniphere). Hibridizacijsko raztopino smo inkubirali pri 80°C 10 min
in nato pri 65°C, dokler je nismo dodali mikromrežam. Hibridizacija je potekala pri
49°C 16 ur. Po hibridizaciji smo mikromreže spirali enkrat 10 min pri 49°C v 2× SSC in
0,1% SDS, dvakrat po 5 min na sobni temperaturi v 2 × SSC in 0,1% SDS, dvakrat po 5
min pri sobni temperaturi v 1× SSC in trikrat po 5 min pri sobni temperaturi v 0,1× SSC
ter jih posušili s centrifugiranjem.
3.2.4.1.4 Bioinformacijska analiza podatkov
Fluorescentni signal hibridiziranih mikromrež smo izmerili z optičnim čitalnikom
(ScanArray Express, PerkinElmer) pri 10 µm resoluciji. Sliko mikromreže smo dobili s
pomočjo programa Imagene 5.6.1 (Biodiscovery, El Segundo, CA, USA), s katerim smo
tudi analizirali intenziteto signala. Obdelava podatkov je bila opravljena v programu
GeneSpring 7.3.1 (Agilent Technologies, Redwood City, CA, USA). Podatke smo
filtrirali glede na njihovo intenziteto in kvaliteto. Po filtraciji podatkov je sledila
normalizacija podatkov z uporabo nelinearne normalizacije LOWESS. Z normalizacijo
smo odstranili razlike v intenzitetah signalov, ki nastanejo pri pripravi označene cDNA,
hibridizaciji, spiranju mikromrež po hibridizaciji... Za testiranje statistično značilnih
50
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
razlik v izražanju genov med skupinami smo uporabili ANOVA test. Na seznam
različno izraženih genov smo vključili gene, ki so imeli najmanj 2-kratno spremembo v
izražanju in p < 0,05.
Za analizo skupin različno izraženih genov smo uporabili prosto dostopen program
DAVID (Huang in sod., 2009). Program DAVID nam omogoča iz seznama genov
določiti funkcionalno povezane (vključene v določen biološki proces, molekularno
funkcijo ali celično komponento) skupine genov. Statistično značilna zastopanost
bioloških procesov je bila določena pri p < 0,05.
3.2.4.2
Kvantitativen PCR v realnem času (qRT-PCR)
Rezultate mikromrež smo validirali s qRT-PCR na petih različno izraženih tarčnih genih
(hdac1, vps18, gnaq, dct in scg2a). Obratno prepisovanje smo izvedli na petih bioloških
ponovitvah treh različnih skupin.
3.2.4.2.1 Obratno prepisovanje celokupne RNA
Za obratno prepisovanje smo uporabili 1 µg celokupne RNA, ki smo jo predhodno
tretirali z DNAzo ("RQ1 RNase-Free DNase Kit"; Promega) po navodilih proizvajalca.
Obratno prepisovanje je potekalo z reverzno transkriptazo M-MuLV (Fermentas), po
naslednjem protokolu:
 dodajanje 1,5 µl koncentrirane mešanice (0,5 µg Oligo dT (100 pmol), 0,5 µl
DEPC vode) k 11 µl RNA
 inkubacija pri 65°C, 5 min
 ohladitev na ledu in kratko centrifugiranje
 dodajanje 8,5 µl koncentrirane mešanice (4 µl 5× reakcijskega pufra, 0,5 µl
RNAznega inhibitorja RiboLock, 2 µl mešanice dNTP (10 mM), 2 µl reverzne
transkriptaze M-MuLV)
 mešanje in kratko centrifugiranje
 inkubacija pri 45°C, 60 min
 ustavitev reakcije z 10-min inkubacijo pri 70°C
 ohladitev na ledu in shranitev pri -20°C
51
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Za negativno kontrolo prisotnosti DNA v vzorcih smo opravili tudi reverzno
transkripcijo brez reverzne transkriptaze.
3.2.4.2.2 Določevanje oligonukleotidnih začetnikov in kvantitativen PCR v realnem
času (qRT-PCR)
Za načrtovanje oligonukleotidnih začetnikov smo uporabili anotirane sekvence iz cDNA
mikromreže cGRASP 32K. Načrtovanje oligonukleotidnih začetnikov je potekalo s
programom Beacon Designer™ (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, USA)
(preglednica 8). Za referenčni gen smo izbrali evkariontski elongacijski faktor
translacije 1A (eef1a1l1).
Preglednica 8: Nukleotidna zaporedja začetnih oligonukleotidov petih različno izraženih genov ter
referenčnega gena
Table 8:
Gen
hdac1 F
hdac1 R
vps18 F
vps18 R
gnaq F
gnaq R
dct F
dct R
scg2a F
scg2a R
eef1a1l1 F
eef1a1l1 R
Description of primers for five differentialy expressed genes and reference gene
Nukleotidno zaporedje
5'-TTGCCCTGTGTTTGATGG-3'
5'-GACGCCTCAGACTTCTTGG-3'
5'-GATGAGGAGTTGAGGAAG-3'
5'-TATCTTGAGCAGGTTACAG-3'
5'-TAAGGATACACCAGGAGATT-3'
5'-CTCTCACCAGTCCCTAAA-3'
5'-CAAGTAGAGCACCAGGACAA-3'
5'-ATGCTACAGACGGTGGAATC-3'
5'-AAACGCAACACCCAATCTC-3'
5'-TCCACTACCTCCTCATTACCC-3'
5'-CCCCTCCAGGACGTTTACAAA-3'
5'-CACACGGCCCACAGGTACA-3'
Reakcija qRT-PCR je potekala v cikličnem termostatu Mx3000P® QPCR System
(Stratagene) in se je začela z 10-min denaturacijo pri 95°C, kateri je sledilo 40 ciklov z
naslednjim temperaturnim profilom:
 denaturacija 95°C, 20 s
 prileganje
55°C (vps18), 60°C (hdac1 in dct), 62°C (scg2a) in 65°C (gnaq),
20s
 podaljševanje 72°C, 20 s
Sledila je disociacija produkta PCR in nastanek disociacijske krivulje, s katero smo
potrdili specifično pomnoževanje produkta PCR. Vsaka 20-µl reakcija je vsebovala
naslednje komponente:
52
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
 10 µl Express SYBR® GreenER™ qPCR SuperMix Universal (Invitrogen)
 10 µM raztopino začetnih oligonukleotidov
 1 µl razredčene cDNA
 DEPC vodo do 20 µl.
V vsako qRT-PCR reakcijo smo vključili tudi negativno kontrolo. Analizo vsakega
vzorca smo izvedli v treh ponovitvah.
3.2.4.2.3 Statistična analiza podatkov qRT-PCR
Relativne razlike v izražanju genov med proučevanimi skupinami smo izračunali s
programom REST 2009 (Pfaffl in sod., 2002). REST 2009 uporablja matematični
model, ki vključuje učinkovitost PCR pomnoževanja posameznega tarčnega gena in
referenčnega gena (2):
ETGKTG VTG
relativno izražanje 
E REFK REF VREF
...(2)
Kjer je:
ETG = učinkovitost tarčnega gena
KTG = pražni cikel tarčnega gena kontrole
VTG = pražni cikel tarčnega gena vzorca
EREF = učinkovitost referenčnega gena
KREF = pražni cikel referenčnega gena kontrole
VREF = pražni cikel referenčnega gena vzorca
Izražanje tarčnih genov smo normalizirali z izražanjem referenčnega gena.
53
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
4
REZULTATI
4.1
HISTOLOŠKE ANALIZE KOŽE
Absolutna debelina povrhnjice se je pri obeh vrstah povečevala (p < 0,05) s starostjo
osebkov (preglednica 9). Povprečna absolutna debelina povrhnjice je pri marmorirani
postrvi variirala od 34,7±4,0 µm (0+) do 150,3±24,4 µm (3+). V obdobju od 0+ do 2+
se je absolutna debelina povrhnjice pri potočni postrvi povečala za 82,7±25,8 µm (p <
0,05). Relativna debelina povrhnjice se je s starostjo zmanjševala pri obeh vrstah (p <
0,05). Signifikantna razlika v relativni debelini povrhnjice med vrstama je bila opažena
pri dve leti starih osebkih.
Preglednica 9: Absolutna in relativna debelina povrhnjice glave. Vrednosti so predstavljene kot povprečje
treh meritev s standardnim odklonom. M – označuje marmoriano postrv, P – označuje
potočno postrv (Sivka in sod., 2012)
Table 9:
Starost
0+
Absolute and relative thickness of head epidermis. Values represent mean ± SD (n=3). M
– marble tout, P – brown trout (Sivka et al., 2012)
Absolutna debelina (µm)
Relativna debelina
M
P
M
P
34,7a*
28,0a
13,6a
13,3a
(±4,0)
(±3,6)
(±1,9)
(±1,1)
1+
94,7b
(±8,1)
88,0b
(±15,1)
1,4b
(±0,3)
1,3b
(±0,2)
2+
128,7bc
(±18,6)
110,7b
(±25,6)
0,3cA
(±0,1)
0,8bB
(±0,2)
3+
150,3c
(±24,4)
0,2c
(±0,0)
*abc
AB
- različne črke označujejo statistično značilno razliko med starostnimi razredi znotraj vrste
- različni črki označujeta statistično značilno razliko med vrstama znotraj starostnega razreda
Melanofore so bile prisotne samo v usnjici tik pod bazalno plastjo (slika 18). Povprečna
gostota melanofor pri mladicah in enoletnicah marmorirane postrvi je bila nižja (p <
0,05) od gostote melanofor potočne postrvi (preglednica 10). V povprečju se gostota
melanofor pri marmorirani postrvi s starostjo ni spreminjala in se je gibala od 19,0±8,5
melanofor/mm2 do 20,7±5,5 melanofor/mm2. Pri potočni postrvi se je gostota
melanofor s starostjo zniževala in je bila pri dvoletnicah za tretjino nižja (p > 0,05) kot
pri mladicah (slika 19).
54
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 18: Prečni prerez kože potočne (levo) in marmorirane postrvi (desno). M – melanofore, D – usnjica
(dermis) (Sivka in sod., 2012)
Figure 18: Head skin, section perpendicular to surface, from brown (left) and marble trout (right). M –
melanophores, D – dermis (Sivka et al., 2012)
Preglednica 10: Gostota in premer melanofor v usnjici škržnega poklopca marmorirane (M) in potočne
(P) postrvi. Vrednosti so predstavljene kot povprečje treh meritev s standardnim
odklonom (Sivka in sod., 2012).
Table 10:
Starost
0+
Density and diameter of melanophores in gill cover dermis of marble trout (M) and
brown trout (P) of different age-classes. Values represent mean ± SD (n=3) (Sivka et al.,
2012)
Gostota melanofor
Najmanjša in največja gostota melanofor
Največji premer
(mm-2)
(mm-2)
melanofor (µm)
M
P
M
P
Min
Max
Min
Max
M
P
19,0A*
75,3B
6,3aA
32,0A
45,3B
83,3abB
310,3
239,3
(±8,5)
(±27,3)
(±2,5)
(±11,4)
(±4,5)
(±6,1)
(±88,6)
(±69,8)
1+
19,0A
(±5,6)
71,7B
(±35,5)
6,0aA
(±6,9)
31,7A
(±7,6)
57,3B
(±27,2)
101,7aB
(±27,8)
382,0
(±49,1)
234,3
(±47,6)
2+
19,3
(±3,0)
45,7
(±19,2)
9,0a
(±2,0)
35,0
(±7,0)
35,7
(±19,8)
49,3b
(±20,8)
413,7
(±95,8)
260,0
(±74,6)
3+
20,7
(±5,5)
0,0b
(±0,0)
38,0
(±5,0)
485,7
(±24,4)
*abc
AB
- različne črke označujejo statistično značilno razliko med starostnimi razredi znotraj vrste
- različni črki označujeta statistično značilno razliko med vrstama znotraj starostnega razreda
Največja gostota melanofor pri marmoriranih mladicah in enoletnicah je bila nižja
(p < 0,05) od največje gostote melanofor pri potočnicah. Pri troletnicah marmorirane
postrvi je bila najmanjša gostota melanofor 0,0±0,0 melanofor/mm2. Na splošno je bila
najmanjša in največja gostota melanofor pri potočnih postrveh večja kot pri
marmoriranih postrveh.
55
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Povprečna gostota melanofor
(mm-2)
120
100
80
60
40
20
0
0+
1+
Marmorirana postrv
2+
3+
Potočna postrv
Slika 19: Povprečna gostota melanofor pri marmorirani in potočni postrvi
Figure 19: Mean density of melanophores of marble and brown trout
Največji premer melanofor je bil pri marmoriranih postrveh večji kot pri potočnih
postrveh in se je s starostjo povečeval (p > 0,05) (slika 20). Pri potočnicah se največji
premer melanofor s starostjo ni spreminjal in se je gibal od 234,3±47,6 µm pri
enoletnicah do 260,0±74,6 µm pri dvoletnicah (preglednica 10). V primerjavi z
dvoletnicami potočne postrvi je bila največja velikost melanofor pri marmoriranih
Največji premer melanofor (µm)
postrveh za tretjino večja in je znašala 413,7±95,8 µm (preglednica 10).
600
500
400
300
200
100
0
0+
1+
Marmorirana postrv
2+
3+
Potočna postrv
Slika 20: Največji premer melanofor pri marmorirani in potočni postrvi
Figure 20: Maximum diameter of melanophores of marble and brown trout
Melanofore v usnjici marmorirane postrvi so bile zastopane v štirih različnih stanjih
(slika 21). Marmorirani vzorec je sestavljen iz temnih in svetlih prog, ki se prepletajo
med sabo. V svetlih predelih so bile melanofore v popolnoma nakopičenemu stanju
(slika 21a), s povprečnim premerom 50 µm in medsebojno razdaljo okoli 300 µm. Pri
56
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
opazovanju svetlih predelov smo zasledili tudi mesta brez melanofor (slika 22, slika
23). V temnih predelih so bile melanofore prisotne v treh različnih fizioloških stanjih.
Na meji med temnim in svetlim predelom so bile melanofore v delno
nakopičenem/delno razpršenem stanju (slika 21b), v temnem predelu so bile melanofore
v razpršenem stanju (slika 21c), v sivih predelih pa so bile melanofore v popolnoma
razpršenem stanju s svetlim (izpraznjenim) središčem (slika 21d). V temnem in sivem
predelu je bila medsebojno razdalja med melanoforami od 200 do 400 µm, kar je
podobno kot v svetlem predelu. Premer melanofor v temnih predelih je bil v povprečju
10-krat večji kot pri melanoforah v svetlih predelih.
Slika 21: Različna fiziološka stanja melanofor v škržnem poklopcu marmorirane postrvi. a – popolno
nakopičeno stanje, b – delno nakopičeno/delno razpršeno stanje, c – razpršeno stanje, d – popolnoma
razpršeno stanje (Sivka in sod., 2012)
Figure 21: Different phisiological states of melanophore in gill cover dermis of marble trout. a –
completely aggregated state, b – aggregated/dispersed state, c – completely full-area dispersed state, d –
maximally dispersed state with light centre (Sivka et al., 2012)
57
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 22: Koža škržnega poklopca marmorirane postrvi s svetlimi in temnimi predeli (Sivka in sod., 2012)
Figure 22: Skin from gill cover of marble trout with light and dark areas (Sivka et al., 2012)
Slika 23: Prečni prerez usnjice škržnega poklopca marmorirane postrvi. Meja med svetlimi in temnimi
področji (Sivka in sod., 2012)
Figure 23: Dermis of gill cover, section perpendicular to the surface, border between light and dark areas
in marble trout (Sivka et al., 2012)
V usnjici potočne postrvi so prevladovale melanofore v delno nakopičenem/delno
razpršenem stanju (slika 24a). V povprečju so bile melanofore velike od 100 do 200 µm
z medsebojno razdaljo 200 µm. Popolnoma razpršene melanofore s povprečnim
premerom 250 µm so bile prisotne samo v črnih pikah (slika 24b).
58
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 24: Koža škržnega poklopca potočne postrvi. a – prevladujoča razporeditev in fiziološko stanje
melanofor, b – razporeditev in fiziološko stanje melanofor v črnih pikah (Sivka in sod., 2012)
Figure 24: Skin from gill cover of brown trout. a – predominant melanophore distribution, b – distribution
of melanophores in black spots (Sivka et al., 2012)
4.2
DOLOČEVANJE
(METODA SNP)
POLIMORFIZMOV
POSAMEZNIH
NUKLEOTIDOV
Iz zbirke 14 kandidatnih genov (preglednica 3) smo uspešno pomnožili odseke petih
kandidatnih genov, na katerih smo iskali polimorfizme posameznih nukleotidov. Iskanje
polimorfizmov posameznih nukleotidov pri vzorcih marmorirane in potočne postrvi je
potekalo na različno dolgih odsekih posameznih genov; 722 bp (paics), 410 bp (pmela),
400 bp (smtl), 220 bp (hdac1) in 400 bp (fbxw4). paics je bil najbolj polimorfen gen z
18 polimorfizmi, sledili so smtl s petimi, pmela in fbxw4 s štirimi in hdac1 z enim
polimorfizmom.
Kljub temu, da je bil paics najbolj polimorfen, pa noben od polimorfizmom ni bil
specifičen za razlikovanje med marmorirano in potočno postrvjo. Od 18 polimorfizmov
je bilo kar 8 polimorfizmov specifičnih za belvico (glej prilogo A). Identificirani so bili
trije polimorfizmi, ki omogočajo ločevanje postrvi z donavskega porečja od postrvi
ostalih evropskih porečij. Pri fbxw4 smo identificirali dva polimorfizma, s katerima
lahko razlikujemo mehkoustno postrv od postrvi jadranskega, donavskega in
sredozemskega porečja. Na 370. mestu proučevanega fbxw4 odseka smo našli
polimorfizem, ki je specifičen za postrvi atlantskege porečja, vendar ne za potočno
postrv z marmoriranim vzorcem iz reke Otre. Pri hdac1 je bilo prisotno eno polimorfno
59
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
mesto, ki omogoča razlikovanje marmoriranih postrvih iz Predelice, Zadlaščice in
Lipovščka od marmoriranih postrvi iz Idrijce, Trebuščice ter Studenca.
pmela in smtl sta bila tako edina gena, pri katerih smo odkrili specifične polimorfizme
za razlikovanje med marmorirano postrvjo jadranskega porečja in potočno postrvjo.
Polimorfizem na pmela odseku (označen z rdečo) je značilen za marmorirane postrvi iz
jadranskega porečja in omogoča razlikovanje od potočne postrvi.
Sekvenca odseka pmela gena marmorirane postrvi s polimorfizmi posameznih
nukleotidov:
C
CCCATACCTACATAGTGGCTGGCGGCTTCAAGCCCCAGGTGGTTGTACAGGCCG
TTATCCCTGATAAAGCATGTGCCACACCAGCTGGTGTTATCCCCACTGGTAGCA
CTGTCACTATTGGGCCTGCAAACCTGGCAGGCACGACAGGTAATTCTCATCTTG
AAACGCTGTAGTCCAGAAGTGAATGTCAAAAGGCTTTACTTGGGTTCCTTGCAT
CCTTAGTCTCGTCAAGGAGAGAGGACGTGATGACTCGTGGGAAAATACTTTTGA
A
C
271 CGTTCACCCAATACGTAGTAGGCTATGTCAGAATTGACCAAGAAAATAGGAAAT
325 TGAATGGTCATGTTTCTCTCTCCAGTGAGAGCTCCTGCTGCGGATGCGTCGGCT
A
379 GCTCCAGTAACGGCGGCCACACAGGGAGCTAC
1
55
109
163
217
Na smtl odseku sta dva polimorfizma (označena z zeleno), ki omogočata razlikovanje
marmorirane postrvi jadranskega porečja od potočne postrvi. Eden od teh
polimorfizmov je skupen tudi potočni postrvi z marmoriranim vzorcem iz reke Otre
(glej prilogo A) in omogoča razlikovanje med marmorirano postrvjo jadranskega ter
potočno postrvjo z marmoriranim vzorcem atlantskega porečja in potočno postrvjo
jadranskega, donavskega in sredozemskega porečja.
60
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Sekvenca odseka smtl gena marmorirane postrvi s polimorfizmi posameznih
nukleotidov:
1 AATACTCCCTTCAGAGAGAATGTACGATATGATCAATAATTTTATGAGCAATTT
T
G
55 AATCAAATCAAATGTATTTGTCACATACACATGGTTAGCAGATGTTAATGCAAG
109 TGTAGTGAAATGCTTGTGCTTCTAGTTCCGACCGTGCAGTAATATAAAACAAAA
T
T
163 TATTGCATAGTTTCCTAGGAACGCGAAGCGAGGCGGCCATCTCTGTCGGCGCCG
217 GAAGTACAATACCATTACTAGAAAGATATTGGACGCATCCTTTGCTATCTGTAG
271 GTCTATTGTTGGTAATGCAATTAGAGAAAATAACTATAGACATTGCTGGCTAAT
C
325 TGTATAGCTATATTGGTTCTGGGTATTTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
379 TGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
S PIRA-PCR smo pridobili produkte, dolge 133 bp (pmela) in 177 bp (smtl).
Restrikcijska encima HpaII in TaqI, ki smo ju uporabili za RFLP analizo, sta pri obeh
genih rezala fragmente, značilne za potočni genotip, fragmentov značilnih za
marmorirani genotip, pa zaradi odsotnosti restrikcijskega mesta nista rezala. RFLP
profil za gen pmela je bil sledeč: potočni genotip 106 bp in 27 bp, marmorirani genotip
133 bp in heterozigotni genotip 133 bp, 106 bp in 27 bp (slika 25). Za gen smtl je bil
RFLP profil sledeč: marmorirani genotip 177 bp, potočni genotip 149 bp in 28 bp in
heterozigotni genotip 177 bp, 149 bp in 28 bp (slika 25).
Slika 25: Restrikcijski profili encimov HpaII in TaqI marmoriranega, potočnega ter heterozigotnega
genotipa. M – velikostni marker 100 bp (Fermentas), A in D – marmorirani genotip, B in E – potočni
genotip ter C in F-heterozigotni genotip
Figure 25: The restriction enzyme profile of HpaII in TaqI marbled, brown and heterozygous genotype.
M – marker 500 bp, A and D – marbled trout genotype, B and E – brown trout genotype and C and F –
heterozygous genotype
61
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Genotipizacija 36 marmoriranih postrvi iz gensko čistih populacij je potrdila genetsko
čistost marmoriranih postrvi, saj so bili pri njih prisotni samo aleli, značilni za
marmorirano postrv (preglednica 11). V vzorcih iz hibridne cone reke Soče je bilo na
lokusu pmela 8,8 % alelov potočne postrvi, na lokusu smtl pa nekoliko manj, 7,5 %.
Aleli potočne postrvi so bili tudi prisotni v vzorcih iz ribogojnice v Tagliamentu, ki naj
bi vzrejela marmorirano postrv. Pri F2 križancih je bila frekvenca alelov potočne postrvi
pričakovano višja, medtem ko je bila pri potočnih postrveh različnih porečij 100%.
Preglednica 11: Frekvenca alelov na obeh lokusih pri vzorcih marmorirane (MP) in potočne postrvi (PP)
(prirejeno po Susnik in sod., 2008)
Table 11:
Frequency of alleles at both loci in samples
(adopted from Susnik et al., 2008)
pmela
MP
Predelica (n=6)
100
Lipovšček (n=6)
100
Zadlaščica (n=6)
100
Trebuščica (n=6)
100
Idrijca (n=6)
100
Studenec (n=6)
100
Hibridna cona v reki Soči (n=40)
91,2
Ribogojnica v Tagliamentu (n=10)
75
F2 križanci (n=22)
59
of marble (MP) and brown trout (PP)
smtl
PP
8,8
25
41
MP
100
100
100
100
100
100
92,5
95
74
PP
7,5
5
36
Za gena pmela in smtl smo izračunali tudi povezavo med fenotipom in genotipom, ki
pa ni bila statistično značilna. Pri genu pmela je bila povezava 0,063 (p=0,512), pri smtl
pa 0,005 (p=0,959).
4.3
SUPRESIJSKA SUBTRAKTIVNA cDNA KNJIŽNICA
Na osnovi belo/modre selekcije kolonij smo identificirali približno 800 transformiranih
klonov E. coli, od katerih je polovica klonov vsebovala inserte cDNA knjižnice
marmorirane postrvi, druga polovica klonov pa inserte cDNA knjižnice potočne postrvi.
Pri marmorirani postrvi pri 361 klonih ni prišlo do hibridizacije s cDNA sondo potočne
postrvi, medtem ko je pri potočni postrvi prišlo pri vseh klonih do pozitivne
hibridizacijske reakcije. Izmed 361 klonov marmorirane postrvi smo za sekvenciranje
naključno izbrali 202 klona. Pri potočni postrvi pa smo za sekvenciranje naključno
izbrali 116 klonov. Velikost sekvenciranih cDNA insertov se je gibala med ~100 in
~1000 bp.
62
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Od 202 sekvenc marmorirane postrvi, ki smo jih pregledali s podatkovno bazo NCBI,
smo uspešno anotirali 111 sekvenc. Od teh 111 genov smo po odstranitvi duplikatov
pridobili 77 genov, ki smo jih poskušali uvrstiti v različne biološke procese v celici
(preglednica 12). Uspešno smo v biološke procese uvrstili 46 genov, medtem ko 31
genov ni imelo določenega biološkega procesa. Največ genov je bilo vključenih v
metabolni proces celice, ki vključuje primarne metabolne procese, metabolne procese
makromolekul in biosintezne procese. Deset genov je bilo vključenih v biološko
uravnavanje, po en gen pa v reproduktivni proces, reprodukcijo in smrt. Iz seznama
genov marmorirane postrvi še posebej izstopata dva; kit receptor a (kita) in evkariontski
začetni dejavnik prevajanja 3, podenota E, a (eif3ea), ki sta vključena v biološki proces
pigmentacije.
Preglednica 12: Biološki procesi in število genov iz cDNA knjižnice marmorirane postrvi
Table 12:
Biological processes and number of genes from cDNA library of marble trout
Biološki proces
GO ID
Število genov
Metabolni proces
GO:0008152
27
Biološko uravnavanje
GO:0065007
10
Odgovor na dražljaj
GO:0050896
8
Večcelični proces v organizmu
GO:0032501
7
Proces razvoja
GO:0032502
7
Lokalizacija
GO:0051179
6
Vzpostavitev lokalizacije
GO:0051234
5
Organizacija celične komponente
GO:0016043
4
Pigmentacija
GO:0043473
2
Biogeneza celične komponente
GO:0044085
2
Proces imunskega sistema
GO:0002376
2
Reproduktivni proces
GO:0022414
1
Smrt
GO:0016265
1
Reprodukcija
GO:0000003
1
Pri potočni postrvi smo 116 zaporedij pregledali s podatkovno bazo NCBI. Od teh smo
jih 78 uspešno anotirali. Po odstranitvi duplikatov smo razpolagali z 48 geni, ki smo jih
poskušali uvrstiti v biološke procese (preglednica 13). Uspešno smo v biološke procese
uvrstili le 11 genov, ki so se vključevali v enake biološke procese kot pri marmorirani
postrvi. Največ genov potočne postrvi se je kot pri marmorirani postrvi uvrstilo v
metabolne procese. V celične procese je bilo vključenih pet genov, medtem ko sta bila
gena c3-1 (angl. complement component C3) in arhgef3l (angl. Rho guanine nucleotide
exchange factor (GEF) 3) vključena v biološki proces odgovora na dražljaj. V
večcelični proces v organizmu, lokalizacijo, vzpostavitev lokalizacije in proces
63
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
imunskega sistema je bil vključen le en gen. Iz seznama genov potočne postrvi, noben
gen ni bil vključen v biološki proces pigmentacije.
Preglednica 13: Biološki procesi in število genov iz cDNA knjižnice potočne postrvi
Table 13:
Biological processes and number of genes from cDNA library of brown trout
Biološki proces
GO ID
Število genov
Metabolni proces
GO:0008152
7
Celični proces
GO:0009987
5
Odgovor na dražljaj
GO:0050896
2
Večcelični proces v organizmu
GO:0032501
1
Lokalizacija
GO:0051179
1
Vzpostavitev lokalizacije
GO:0051234
1
Proces imunskega sistema
GO:0002376
1
4.4
ANALIZA MIKROMREŽ IN KVANTITATIVEN PCR V REALNEM ČASU
(qRT-PCR)
Skupaj smo identificirali 848 transkriptov z dva- ali več-kratnim različnim izražanjem
(p < 0,05). Od teh je bilo 35,7 % (303) genov različno izraženih med marmorirano in
potočno postrvjo (M vs. P), 36,0 % (305) genov različno izraženih med marmorirano
postrvjo in F3 križanci (M vs. K) ter 28,3 % (240) genov različno izraženih med F3
križanci in potočno postrvjo (K vs. P). Od 303 različno izraženih genov med M vs. P je
bilo skupnih 44 genov, ki so bili različno izraženi tudi med K vs. P ter 28 genov, ki so
bili različno izraženi tudi med M vs. K. Od 205 različno izraženih genov med M vs. K
je bilo 38 različno izraženih genov tudi med K vs. P (slika 26). Vsi skupni geni med M
vs. P in K vs. P (44) so imeli vzporeden vzorec izražanja, kar pomeni, da je gen s
povečanim izražanjem pri marmorirani postrvi imel povečano izražanje tudi pri F3
križancih in obratno.
64
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 26: Vennov diagram prikazuje število različno izraženih genov (p < 0,05) med marmorirano in
potočno postrvjo (M vs. P), marmorirano postrvjo in F3 križanci (M vs. K) ter F3 križanci in potočno
postrvjo (K vs. P). Števila predstavljajo različno izražene gene v vsaki skupini in različno izražene gene,
ki so skupni med skupinami
Figure 26: Venn diagram showing number of genes with significant differences (p < 0.05) between
marble trout and brown trout (M vs. P), marble trout and hybrids (M vs. K) and hybrids and brown trout
(K vs. P). Numbers represent differently expressed genes from each group and genes shared between
groups
Pri bolj strogih pogojih (p < 0,01) so od 44 genov ostali samo trije različno izraženi geni
med M vs. P in K vs. P; scg2a (angl. secretogranin II), mrps33 (angl. mitochondrial
28S ribosomal protein S33) in polr2a (angl. DNA-directed RNA polymerase II subunit
RPB1). scg2a in mrps33 sta imela povečano raven izražanja pri marmorirani postrvi,
medtem ko je imel polr2a zmajšano raven izražanja.
4.4.1 Razlike v izražanju genov med marmorirano in potočno postrvjo (M vs. P)
Med marmorirano in potočno postrvjo so bili različno izraženi 303 geni, od katerih je
bila približno tretjina (103) neanotiranih. V primerjavi s potočno postrvjo je pri
marmorirani postrvi 116 genov imelo povečano in 187 genov zmanjšano izražanje (p <
0,05). Raven izražanja je segala vse od 9,3-kratnega povečanja do 0,03-kratnega
zmanjšanja izražanja genov. Funkcijska analiza s programom DAVID je razdelila
različno izražene gene v 16 izstopajočih bioloških procesov (EASE < 0,05) (slika 27).
Med izstopajoče biološke procese se je uvrstila tudi pigmentacija v času razvoja, v
katero so bili vključeni naslednji trije geni; hdac1 (angl. histone deacetylase 1), vps18
(angl. vacuolar protein sorting protein 18) in gnaq (angl. guanine nucleotide binding
65
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
protein, alpha q polypeptide). Vsi trije geni so imeli zmanjšano raven izražanja pri
marmorirani postrvi v primerjavi s potočno postrvjo. Najnižjo raven izražanja smo
zasledili pri hdac1 (0,147), sledila sta gnaq z 0,345 in vps18 z 0,459.
translacija
uravnavanje aktivnosti hidrolaze
razvoj srca
proces cirkulatornega sistema
cirkulacija krvi
krčenje progastih mišic
uravnavanje krčenja srca
srčni proces
morfogeneza srca
krčenje srca
razvoj srčno-mišičnega tkiva
morfogeneza ventrikularne srčne mišice
pigmentacija v času razvoja
morfogeneza mišičnega tkiva
morfogeneza srčno-mišičnega tkiva
srčno-mišično krčenje
M vs P
translacija
razvoj placente
embrionalni razvoj placente
K vs P
proces mišičnega sistema
mišično krčenje
odgovor na stres endoplazmatskega retikuluma
M vs K
0
1
2
3
4
5
Delež genov (%)
6
7
8
9
Slika 27: Izstopajoči biološki procesi s seznama različno izraženih genov med marmorirano in potočno
postrvjo (M vs. P), marmorirano postrvjo in F3 križanci (M vs. K) ter F3 križanci in potočno postrvjo
(K vs. P). Delež genov predstavlja število genov, vključenih v biološki proces, glede na število genov
vključenih v analizo
Figure 27: Biological processes that were over-represented in list of genes differently expressed between
marble trout and brown trout (M vs. P), marble trout and hybrids (M vs. K) and hybrids and brown trout
(K vs. P). The proportion of genes represents number of genes involved in annotation category relative to
the entire number of genes in the analysis
4.4.2 Razlike v izražanju genov med F3 križanci in potočno postrvjo (K vs. P)
Od 240 različno izraženih genov med F3 križanci in potočno postrvjo je bilo 83 genov
neanotiranih. Več kot polovica genov (127) F3 križancev je imelo povečano raven
izražanja, medtem ko je imelo 113 genov v primerjavi s potočno postrvjo zmanjšano
izražanje (p < 0,05). Razpon ravni izražanja je bil nekoliko večji kot pri M vs. P in je
66
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
segal od 25,9-kratnega povečanja do 0,03-kratnega zmanjšanja izražanja genov.
Funkcijska analiza je izpostavila samo tri biološke procese; translacijo, razvoj placente
in embrionalni razvoj placente (slika 27). Čeprav biološki proces pigmentacija v času
razvoja ni bil signifikanten (EASE=0,14) sta bila vanj vključena dva, za nas zanimiva
gena; dct (angl. dopachrome tautomerase) in hdac1 (angl. histone deacetylase 1).
Raven izražanja gena dct je bila 2,6-krat povečana pri F3 križancih, medtem ko je bilo
izražanje hdac1 zmanjšano (0,123) pri F3 križancih in je bilo podobno kot pri
marmorirani postrvi.
4.4.3 Razlike v izražanju genov med marmorirano postrvjo in F3 križanci
(M vs. K)
Od 305 različno izraženih genov med M vs. K tudi v tej skupini približno tretjina genov
(99) ni bilo anotiranih. Glede na F3 križance, je bilo pri marmorirani postrvi 126 genov
s povečano in 179 genov z zmanjšano ravnjo izražanja (p < 0,05). Raven izražanja
različno izraženih genov je segala od največ 4,8-kratnega povečanja do 0,02-kratnega
zmanjšanja. Podobno kot pri K vs. P, je tudi v tej skupini funkcijska analiza s
programom DAVID izpostavila tri biološke procese; proces mišičnega sistema, mišično
krčenje ter odgovor na stres endoplazmatskega retikuluma (slika 27). Noben od različno
izraženih genov ni bil povezan z biološkim procesom pigmentacije v času razvoja.
4.4.4 Kvantitativen PCR v realnem času (qRT-PCR)
Za validacijo rezultatov mikromrež smo izbrali štiri gene, povezane z biološkim
procesom pigmentacija v času razvoja; hdac1, vps18, gnaq in dct. Poleg teh štirih genov
smo zaradi vzporednega izražanja s prohormonom Pomc (Van Horssen in Martens,
1999) in vzporednim vzorcem izražanja med M vs. P ter K vs. P za validacijo rezultatov
uporabili tudi scg2a.
Kljub temu, da pri določenih izbranih genih rezultati qRT-PCR niso bili signifikantni,
nakazujejo enak trend ekspresijskih profilov mikromrež tako pri M vs. P (slika 28) kot
pri K vs. P (slika 29). Pri M vs. P je bilo izražanje hdac1, vps18 in gnaq manjše kot pri
mikromrežah, medtem ko je bil pri dct in scg2a ekspresijski profil višji kot pri
67
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
mikromrežah. Raven izražanja pri dct je bila pri marmorirani postrvi povečana za 1,8krat (p < 0,05), pri scg2a pa za kar 8,1-krat (p < 0,05).
Relativno izražanje M vs. P (log)
100
qRT-PCR
microarray
*
10
*
*
1
*
0,1
*
*
*
0,01
hdac1
vps18
gnaq
dct
scg2a
Slika 28: qRT-PCR validacija petih izbranih genov: hdac1, vps18, gnaq, dct ter scg2a. Rezultati so
predstavljeni kot log10 relativnega izražanja med marmorirano in potočno postrvjo (M vs. P). Stolpci nad
1 označujejo povečano raven, medtem ko stolpci pod 1 označujejo zmanjšano raven izražanja genov pri
marmorirani postrvi v primerjavi s potočno postrvjo. *-p < 0,05
Figure 28: Quantitative real-time PCR validation of five selected genes: hdac1, vps18, gnaq, dct and
scg2a. Results are expressed as log10 of the ratio of marble trout to brown trout (M vs. P). Bars above zero
indicate over expression in marble trout, while bars below zero indicate under expression in marble trout
relative to brown trout. *-p < 0.05
Pri K vs. P je bilo pri vseh testiranih genih, razen pri vps18, izražanje manjše kot pri
mikromrežah (slika 29). Pri hdac1 in vps18 je bila raven izražanja pri F3 križancih
zmanjšana za ~0,5-krat (p < 0,05). Podobno kot pri M vs. P je bila tudi pri K vs. P raven
izražanja dct gena povečana za 1,8-krat (p < 0,05).
68
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Relativno izražanje K vs. P (log)
10
*
* *
1
*
*
0,1
*
qRT-PCR
Microarray
0,01
hdac1
vps18
gnaq
dct
scg2a
Slika 29: qRT-PCR validacija petih izbranih genov: hdac1, vps18, gnaq, dct ter scg2a. Rezultati so
predstavljeni kot log10 relativnega izražanja med F3 križanci in potočno postrvjo (K vs. P). Stolpci nad 1
označujejo povečano raven, medtem ko stolpci pod 1 označujejo zmanjšano raven izražanja genov pri F3
križancih v primerjavi s potočno postrvjo. *-p < 0,05
Figure 29: Quantitative real-time PCR validation of five selected genes: hdac1, vps18, gnaq, dct and
scg2a. Results are expressed as log10 of the ratio of hybrids to brown trout (K vs. P). Bars above zero
indicate over expression in hybrids, while bars below zero indicate under expression in hybrids relative to
brown trout. *-p < 0.05
69
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
5
RAZPRAVA
Osnovni namen raziskave je bil poiskati kandidatne gene, odgovorne za obarvanost in
nastanek barvnega vzorca pri marmorirani postrvi. Ker je nastanek barvnega vzorca
odvisen od vrste in števila pigmentnih celic, smo raziskavo razširili na področje
histologije kože, kjer smo ugotovili, da obstajajo razlike v strukturi kože marmorirane
in potočne postrvi, še posebno s strani fiziološkega stanja in porazdelitve melanofor. S
pomočjo ekspresijskih študij smo ugotovili, da obstaja določen niz genov, vključenih v
eno od signalnih poti pigmentne celice, katerih transkripcijski profil se razlikuje med
marmorirano in potočno postrvjo. Transkripcijski profil genov, vključenih v signalno
pot, se med marmorirano postrvjo in F3 križanci s fenotipskim izražanjem
marmoriranega vzorca ni razlikoval, kar nakazuje na kosegregacijo genov, vključenih v
nastanek marmoriranega vzorca.
5.1
HISTOLOŠKE ANALIZE KOŽE
Kljub razlikam v strukturi kože osnovna struktura kože marmorirane in potočne postrvi
sovpada s karakteristikami, opisanimi pri ostalih salmonidih. Povrhnjica odraslih
osebkov je v povprečju presegala 100 µm in se ujema z debelino povrhnjice, izmerjeno
pri drugih salmonidih (Harris in Hunt, 1975; Hawkes, 1974a; Hawkes, 1974b; Knoz in
sod., 1990; Witkowski in sod., 2004). Poleg razlik v debelini povrhnjice so razlike v
strukturi kože med marmorirano in potočno postrvjo omejene na razlike v velikosti in
pogostnosti melanofor v usnjici. Morfološke analize kromatofor v koži potočne postrvi,
šarenke in zlatovčice (Salvelinus fontinalis) so pokazale, da so melanofore najpogostejši
tip kromatofor v koži salmonidov (Kaleta, 2009). Melanofore marmorirane postrvi so
bile v povprečju večje kot pri potočni postrvi, medtem ko se njihova gostota s starostjo
ni spreminjala in je bila v primerjavi z gostoto melanofor pri potočni postrvi za trikrat
manjša. Zaradi nespremenjene gostote melanofor in povečevanja premera melanofor s
starostjo marmorirane postrvi zaključujemo, da je nastanek marmoriranega vzorca v
večji meri posledica hipertrofije kot pa hiperplazije pigmentnih celic.
Med več–mesečnim opazovanjem nastajanja marmoriranega vzorca smo prišli do
spoznanja, da je marmorirani barvni vzorec odvisen od ontogeneze in da pride do
barvne spremembe predvsem v obdobju prehoda med nezrelim in zrelim/odraslim
70
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
organizmom. Pri mladicah (0+) se začnejo melanofore združevati na boku in tvorijo
juvenilne proge, kar je značilno za salmonide pri tej starosti. Pri eno leto starih mladicah
so juvenilne proge še vedno vidne. V tem času pride do prvega formiranja barvnega
vzorca, ki se širi od hrbta proti pobočnici. Barvni vzorec v večji meri sestavljajo pike in
manjše proge. Pri dvoletnicah je marmorirani vzorec izoblikovan in se širi vse od hrbta
preko pobočnice do trebuha ter od škržnega poklopca do repa (slika 30).
Slika 30: Časovni trak oblikovanja marmoriranega vzorca
Figure 30: Timeline of marble pattern formation
Najkasneje pride do formiranja marmoriranega barvnega vzorca na škržnem poklopcu
(slika 31), kjer se krajše lise združujejo v proge na osnovi povečevanja velikosti in
števila melanofor.
71
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 31: Nastajanje marmoriranega vzorca na škržnem poklopcu marmorirane postrvi. a - februar 2009,
b - junij 2009, c - avgust 2009 in d - november 2009 (foto: Urška Sivka)
Figure 31: Formation of mable pattern on gill cover of marble trout. a - Februar 2009, b - June 2009, c August 2009 and d - November 2009 (photo: Urška Sivka)
Pri odraslih organizmih je bila gostota melanofor v svetlih predelih marmoriranega
vzorca zelo nizka, ponekod so bile melanofore odsotne, kar nakazuje na dejstvo, da je
nastanek marmoriranega barvnega vzorca posledica postopne izgube melanofor v
svetlih predelih in povečanja števila melanofor v temnih predelih. Prav to povečanje
melanofor in njihova porazdelitev v koži je odgovorna za značilen marmorirani barvni
vzorec, po katerem je marmorirana postrv tudi dobila ime.
Številne študije so pokazale, da je koža rib zelo raznolik organ z velikimi razlikami na
medvrstnem in znotrajvrstnem nivoju. Veliko teh študij se je zaradi preprostosti izvedbe
in velike raznolikosti parametrov (debelina povrhnjice, prisotnost in število izločevalnih
celic) omejilo predvsem na proučevanje povrhnjice. Naša histološka analiza kaže
potrebo po razširitvi teh histoloških študij in vključitvi proučevanja usnjice.
72
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
5.2
GENETSKO OZADJE MARMORIRANEGA BARVNEGA VZORCA
5.2.1 SNP označevalci
Za genetsko medvrstno razlikovanje so se do danes uporabljali alocimi, mitohondrijska
DNA (mtDNA), mikrosateliti in naključno pomnoževanje polimorfne DNA (RAPD).
Nobeden od teh se ni dokazal kot dober diagnostični označevalec pri marmorirani
postrvi (Jug in sod., 2004). Polimorfizmi posameznih nukleotidov (SNP) omogočajo
alternativni pristop genetskega razločevanja (Rapley in Harbron, 2004).
Za iskanje SNP označevalcev smo uporabili pet kandidatnih genov, za katere smo iz
študij modelnih organizmov vedeli, da so povezani z obarvanostjo. S kandidatnimi geni
uporabljamo bolj ciljan pristop, s katerim poskušamo določiti regije genoma, ki
neposredno ali posredno vplivajo na določeno fenotipsko lastnost. Izmed petih
kandidatnih genov smo na dveh genih našli vrstno specifične polimorfizme, ki so se
izkazali za uspešno orodje pri genetskem razločevanju med marmorirano in potočno
postrvjo. Odkrili smo specifične alele pri marmoriranih postrveh, ki so izvirale iz
geografsko ločenih področij soškega porečja, in marmoriranih postrveh iz ribogojnice
Tagliamento. Dejstvo, da ti aleli niso bili prisotni pri potočnih postrveh iz štirih
različnih evropskih porečij, nakazuje, da so specifični za marmorirano postrv.
Eden od teh dveh genov z vrstno specifičnimi polimorfizmi je gen premelanosomni
protein a ali krajše pmela. Na proučevanem odseku gena pmela smo našli štiri
polimorfizme, ki so se pojavljali na vsakih ~100 bp. Pri pregledovanju dbSNP baze
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp) nismo našli podatkov o polimorfizmih gena pmela
pri salmonidih, medtem ko smo pri cebrici našli podatke o dveh polimorfizmih. Eden od
polimorfizmov se nahaja v intronu, kjer gre za zamenjavo T/G, medtem ko gre pri
drugem za sinonimno zamenjavo A/G v eksonu 12. Vsi štirje polimorfizmi, o katerih
poročamo, se nahajajo v intronu. Polimorfizem T/C na 298. mestu proučevanega odseka
pmela se je izkazal kot diagnostični označevalec za marmorirano postrv, saj omogoča
genetsko razločevanje med marmorirano postrvjo in potočno postrvjo.
73
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Drugi diagnostični označevalec marmorirane postrvi je smtl. smtl je nekoliko bolj
polimorfen od gena pmela, saj smo pri njem našli polimorfizem na vsakih 80 bp.
Podobno kot pri pmela tudi pri smtl v dbSNP bazi nismo našli podatkov o
polimorfizmih pri salmonidih. Pri cebrici poročajo o štirih polimorfizmih (dva
polimorfizma/transkript), ki se nahajajo v intronih. Na 104. mestu odseka smtl smo našli
polimorfizem A/G, ki nam omogoča genetsko razločevanje med marmorirano postrvjo
in potočno postrvjo. Vsi polimorfizmi so se tako kot pri pmela nahajali v intronih.
Pri ostalih treh genih noben od polimorfizmov ni omogočal genetskega razlikovanja
med marmorirano in potočno postrvjo. paics je bil najbolj polimorfen gen s prisotnim
polimorfizmom na vsakih ~40 bp. Tudi pri cebrici je paics v primerjavi s pmela in smtl
veliko bolj polimorfen, saj je v bazi dbSNP zabeleženih 36 polimorfizmov
(devet polimorfizmov/transkript), od katerih je osem nesinonimnih in 12 sinonimnih
zamenjav. Če je bil paics najbolj polimorfen gen, pa tega ne moremo trditi za gen
hdac1, saj smo pri njemu našli samo eno polimorfno mesto. Na tem polimorfnem mestu
je bil pri marmorirani postrvi iz Predelice, Zadlaščice in Lipovščka citozin, pri
marmoriranih postrveh iz Idrijce, Trebuščice ter Studenca kot tudi pri vseh ostalih
testiranih potočnicah pa gvanin. V primerjavi s postrvmi pa je hdac1 pri cebrici veliko
bolj polimorfen, saj je bilo do danes najdenih 27 polimorfnih mest, ki so porazdeljena
med tri transkripte. Od teh sta dva sinonimna in dva nesinonimna polimorfizma. Na
zadnjem proučevanem genu, fbxw4, smo našli, podobno kot pri pmela, polimorfizem na
vsakih ~100 bp. Niz polimorfizmov ni omogočal razlikovanja med marmorirano in
potočno postrvjo, temveč nam je omogočal razlikovanje med mehkoustno postrvjo iz
reke Zete in potočno postrvjo iz jadranskega, donavskega in sredozemskega porečja.
Tako kot paics in hdac1 je tudi fbxw4 veliko bolj polimorfen pri cebrici kot pri
postrveh. V bazi dbSNP je zabeleženih 16 polimorfnih mest, od katerih jih je kar 12 v
intronih, dva sta sinonimna polimorfizma, dva pa se nahajata na 5'- in 3'-neprevajani
regiji.
Z genotipizacijo, ki smo jo izvedli na vzorcih iz hibridne cone reke Soče in F2
križancih, smo pri vzorcih našli tako alele marmorirane postrvi kot alele potočne
74
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
postrvi. Po drugi strani pa smo alele potočne postrvi našli tudi v vzorcih iz ribogojnice
Tagliamento, ki vzreja marmorirano postrv.
Poleg genotipizacije, ki smo jo opravili na 108 F2 križancih, smo naredili tudi analizo
povezave med marmoriranim vzorcem in genotipom na lokusih pmela in smtl.
Spearmanov koeficient korelacije je bil zelo majhen tako pri pmela (0,063) kot pri smtl
(0,005). Rezultati ne presenečajo, saj gre pri obeh genih za polimorfizme, ki se nahajajo
v nekodirajoči regiji. Kljub temu, da nismo našli povezave med marmoriranim vzorcem
ter genoma pmela in smtl, ne moremo na tej stopnji trditi, da nista vključena v proces
nastanka marmoriranega vzorca.
Pri izbiri novih označevalcev za genotipizacijo iz jedrne DNA je zelo pomembno, da so
le-ti razpršeni po genomu ter, da jih je v genotipizacijo vključenih zadostno število. Za
pmela in smtl vezavno nesorazmerje (angl. linkage disequilibrium) med kombinacijami
alelov ni bilo prisotno. Pri genu smtl je že določeno mesto na kromosomu, ki pripada
vezani skupini BT-14 (Gharbi in sod., 2006).
Glavno vprašanje, ki se poraja na tem mestu, je, ali je na osnovi molekularne analize
mogoče razlikovati med starši in njihovimi hibridnimi potomci? Teoretično je to
možno, če še ni prišlo do panmiksije v hibridizirani populaciji. Na osnovi statističnih
modelov, ki sta jih predstavila Boecken in Howard (1997), je za grobo klasifikacijo
posameznikov v hibridni coni dovolj od štiri do pet označevalcev, medtem ko je za
razlikovanje med genetsko čistimi vrstami in hibridi potrebno vsaj 70 označevalcev. V
primeru marmorirane postrvi v populaciji iz hibridne cone reke Soče še ni prišlo do
dokončnega genetskega mešanja med marmorirano in potočno postrvjo in tako še vedno
obstajajo genetsko čisti osebki marmoriranih postrvi (Jug in sod., 2005). Zaradi tega je
molekularna karakterizacija genetsko čistih posameznikov ali hibridov v primeru
marmorirane postrvi upravičena. Čeprav poročamo o majhnem številu polimorfizmov v
svoji študiji in kljub temu, da le-ti ne zagotavljajo zanesljive identifikacije genetsko
čiste marmorirane postrvi, pa ti novi jedrni označevalci predstavljajo koristne
diagnostične označevalce za karakterizacijo posameznikov v hibridnih conah
marmorirane in potočne postrvi. Jedrna označevalca, ki sta rezultat našege dela, se že
75
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
nekaj let, skupaj s preostalimi diagnostičnimi označevalci iz predhodnih študij,
uporabljata za vsakoletno testiranje fenotipsko ustreznih marmoriranih postrvi iz
hibridne cone soškega porečja. V primeru, da diagnostični označevalci potrdijo
genetsko čistost marmoriranih postrvi, se te uporabijo za povečanje genetske pestrosti
plemenske jate.
5.2.2 Nastanek in ohranitev marmoriranega vzorca
Za iskanje kandidatnih genov, ki bi lahko bili vključeni v proces nastanka
marmoriranega vzorca, smo se poslužili tudi t.i. ekspresijskih študij. Vemo, da so za
barvne vzorce odgovorne aminokislinske zamenjave v genih, vključenih v razvoj
pigmentnih celic. Predvidevamo pa, da so razlike v barvnem vzorcu lahko tudi
posledica različnega izražanja genov, vključenih v obarvanje in nastanek barvnega
vzorca. Za neposredno primerjavo in izolacijo transkriptov, ki se različno izražajo v
koži marmorirane in potočne postrvi, smo zato uporabili subtraktivno cDNA knjižnico
in mikromreže.
Pri obeh metodah smo dobili določen niz genov, ki so vključeni v biološki proces
pigmentacije. S pomočjo subtraktivne hibridizacije smo identificirali dva gena, kita
(angl. kit receptor a) in eif3ea (angl. eukaryotic translation initiation factor 3, subunit
E, a). Oba poleg procesa pigmentacije sodelujeta tudi v celičnem metabolizmu
proteinov; eif3ea sodeluje pri sprožitvi prevajanja, medtem ko kita sodeluje pri
fosforilizaciji proteinov v celici.
V proces pigmentacije je kita vključen že v embrionalnem razvoju, saj je odgovoren za
širjenje melanoblastov in kasneje za migracijo in preživejte melanofor pri larvah.
Kasneje v času metamorfoze pride do preoblikovanja barvnega vzorca iz barvnega
vzorca ličinke, pri čemer sodelujejo zgodnje in poznometamorfne melanofore.
Zgodnjemetamorfne melanofore so sprva razpršene po boku in kasneje migrirajo na
mesta nastanka prog, medtem ko poznometamorfne melanofore nastajajo znotraj
melanofornih prog (Mills in sod., 2007). kita vpliva na zgodnjemetamorfne melanofore,
medtem ko so poznometamorfne melanofore neodvisne od njegovega delovanja
(Parichy in sod., 2003). Če so zgodnjemetamorfne melanofore sprva razpršene po boku
76
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
in kasneje migrirajo na mesto nastanka prog, potem lahko predpostavljamo, da je kita
tisti, ki "zariše" potek proge. Kljub temu, da mutanti sparse/kita pri cebrici nimajo
zgodnjemetamorfnih melanofor, pa se pri njih še vedno izoblikuje progast vzorec iz
poznometamorfnih melanofor, ki pa za razliko od barvnega vzorca divjega tipa vsebuje
manjše število prog in melanofor. V nastanek progastega vzorca mora tako biti
vključenih več genov, ki imajo aditiven učinek, kar je bilo tudi potrjeno z mutanti
rose/ednrb1a in panther/csf1ra. Oba mutanta namreč vplivata na poznometamorfne
melanofore in pri dvojnih mutantih sparse/kita in rose/ednrb1a ali sparse/kita in
panther/csf1ra pride do skoraj popolnega pomanjkanja melanofor (Parichy in sod.,
2003).
V proces pigmentacije je bil poleg kita vključen tudi eif3ea gen. eif3ea je translacijski
faktor, s katerim je povezan int6 onkogen (Grzmil in sod., 2007). Pri pregledu literature
nismo nikjer zasledili neposredne povezave med nastankom barvnega vzorca in
translacijskim faktorjem eif3ea. Grzmil in sodelavci (2007) so z uporabo morfolino
oligonukleotidov, ki so zmajšali sintezo proteina Int6, dokazali razvojne okvare pri
cebrici, ki so se kazali v zmanjšani melanizaciji (melanofore so svetlejše) in napačni
namestitvi pigmentih celic v repu cebrice. int6 verjetno vpliva na razvoj sekundarnih
celic nevralnega žleba, kamor se uvrščajo tudi pigmentne celice.
Kljub temu, da smo identificirali dva gena, ki sta vključena v biološki proces
pigmentacije, ne moremo z zagotovostjo trditi, da sta odgovorna za nastanek barvnega
vzorca pri marmoriranih postrveh. Njuno vključenost v proces nastanka marmoriranega
vzorca je težko potrditi na osnovi enega biološkega vzorca marmorirane postrvi. Za bolj
oprijemljive rezultate bi morali v študijo predvsem vključiti večjo število bioloških
ponovitev ter rezultate subtraktivne hibridizacije preveriti s qRT-PCR metodo.
S pomočjo analize mikromrež smo iz množice transkriptov, izoliranih iz kože
marmorirane in potočne postrvi, ter F3 križancev, identificirali pet različno izraženih
genov – hdac1, vps18, gnaq, dct in scg2a, ki so vključeni v biološki proces
pigmentacije pri živalih. Od teh petih genov sta hdac1 in vps18 že bila identificirana kot
"pigmentna" gena pri cebrici (Ignatius in sod., 2008; Maldonado in sod., 2006) in Gnaq
77
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
ter Dct pri miših (Mus musculus) (Guyonneau in sod., 2004; Van Raamsdonk in sod.,
2004). scg2a se izraža v nevroendokrinih celicah in je preko pakiranja in sortiranja
peptidnih hormonov in nevrohormonov v sekretorne granule (Peinado in sod., 2006)
vključen
kot
nosilec
melanin
koncentrirajočega
hormona
(MCH)
in
proopiomelanokortina (POMC) (Hotta in sod., 2009), hormona, ki nadzorujeta
pigmentacijo na endokrini ravni. Glede na to, da so ti geni vključeni v proces
pigmentacije pri cebrici in pri miši, so verjetno vključeni tudi v obarvanost pri
salmonidih. Do danes je bil pri salmonidih samo dct opisan kot ključni gen pri pretvorbi
L-tirozina v melanin (Thorsen in sod., 2006).
Od petih različno izraženih genov, vključenih v proces pigmentacije, so kar trije (hdac1,
gnaq in dct) posredno ali neposredno vključeni v signalno pot wnt. Aktivacija signalne
poti se prične z vezavo proteinov Wnt na membranske receptorje "Frizzled", kar sproži
deaktivacijo več-proteinskega kompleksa (Gsk3β-Axin-Apc) in posledično akumulacijo
β-katenina v citoplazmi. Z naraščanjem koncentracije β-katenina v citoplazmi nekaj βkatenina preide v celično jedro, kjer se veže na transkripcijska faktorja Lef1/Tcf, kar
vodi do izražanja specifičnih genov (Cadigan in Nusse, 1997). Znano je, da je
melanogeneza pri živalih odvisna od signalne poti wnt. V embrijih cebrice wnt signalna
pot neposredno aktivira gen nacre, ki kodira transkripcijski faktor Mitfa, kar vodi do
diferenciacije pigmentih celic v embrijih (Dorsky in sod., 2000).
Signalna pot wnt je zelo pomembna za normalen razvoj organizma in je zato zelo
natančno uravnavana z različnimi zunajceličnimi in celičnimi mehanizmi. Eden takih
celičnih mehanizmov vključuje interakcijo med β-kateninom in Hdac1, ki uravnava
delovanje
transkripcijskega
faktorja
Lef1
iz
transkripcijskega
represorja
do
transkripcijskega aktivatorja (Billin in sod., 2000). Hdac1 hipoacetilira promotorsko
regijo Lef1 transkripcijskega faktorja in ga tako pretvori v transkripcijski represor.
Aktivacija Lef1 in od njega odvisnih genov, kot je mitfa, poteka preko β-katenina v
dveh korakih (slika 32). Najprej β-katenin odcepi Hdac1 od Lef1 z vezavo na Hdac1 in
tvorbo kompleksa β-katenin-Hdac1. V tem koraku se Lef1 derepresira. V drugem
koraku pa se β-katenin veže na Lef1, kar vodi do nastanka transkripcijsko aktivnega
kompleksa β-katenin-Lef1 (Billin in sod., 2000). Ta kompleks omogoča transkripcijo
78
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
transkripcijskega faktorja Mitfa in posledično aktivacijo promotorja dct (Yasumoto in
sod., 2002).
Slika 32: Uravnavanje delovanja transkripcijskega faktorja Lef1 preko interakcij β-katenin-Hdac1
Figure 32: Regulation of Lef1 transcription factor through β-catenin-Hdac1 interactions
Zmanjšano izražanje hdac1, ki smo ga opazili pri marmorirani postrvi in F3 križancih,
verjetno nakazuje na aktivacijo transkripcije gena mitfa s strani signalne poti wnt in
posledično diferenciacijo pigmentnih celic. Hkrati pa je tudi povečano izražanje dct pri
marmorirani postrvi in F3 križancih verjetno posledica aktivacije transkripcije mitfa s
strani wnt signalne poti. Do podobnih zaključkov so prišli pri proučevanju sesalskih
celic, pri katerih je wnt signalna pot preko Lef1 povečala izražanje transkripcijskega
faktorja Mitfa, čemur je sledila transkripcija gena dct (Lang in sod., 2005; Yasumoto in
sod., 2002).
Pri signalni poti wnt so v inaktivacijo Gsk3β in akumulacijo β-katenina vključeni tudi G
proteini. Gnaq je podenota Gaq, ki sodeluje pri uravnavanju signalne poti wnt preko
stabilizacije β-katenina (Liu in sod., 2005). Pri miših je število melanoblastov,
prekurzorjev pigmentnih celic, v usnjici nadzorovano neposredno preko aktivnosti Gaq
79
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
(Van Raamsdonk in sod., 2009). Naknadno je bilo dokazano, da mutacije v genu gnaq
vodijo do povečanega števila melanocitov v usnjici in posledično do temnejšega
fenotipa (Van Raamsdonk in sod., 2004). Pri potočni postrvi so histološke analize kože
pokazale večjo gostoto melanofor v usnjici kot pri marmorirani postrvi. Vzporedno so
transkripcijske analize pokazale povečano izražanje gena gnaq pri potočni postrvi v
primerjavi z marmorirano postrvjo. Povečano izražanje gena gnaq je verjetno
odgovorno za povečano število melanofor v usnjici potočne postrvi.
vps18 sodeluje pri nastajanju zgodnjih in poznih endosomov ter lizosomov in obenem
sodeluje pri nastajanju melanosomov v procesu pigmentacije (Maldonado in sod.,
2006). Pri proučevanju mutanta vps18hi2499A pri cebrici, pri katerem je funkcija vps18
onemogočena, so ugotovili, da se rezultat nefunkcionalnosti vps18 kaže v zmanjšani
pigmentaciji. Čeprav so melanofore slabše obarvane pri mutantih, pa mutacija ne vpliva
na njihovo velikost, obliko in porazdelitev (Maldonado in sod., 2006). Glede na
transkripcijski profil vps18 je biogeneza melanosomov zmanjšana pri marmorirani
postrvi in F3 križancih, vendar pa velikost, oblika in porazdelitev melanofor niso
prizadeti. vps18 deluje na celični ravni v kompleksu HOPS in njegov vpliv na
medcelični ravni še ni bil raziskan. Zaradi vsega zgoraj povedanega težko opredelimo
neposredno povezavo med izražanjem vps18 in nastankom barvnega vzorca.
Pri ribah so do sedaj poročali o izražanju gena scg2a v možganih, hipofizi in gonadah
(Miot in sod., 1998; Zhao in sod., 2006). Naša študija je prva, ki kaže na izražanje
scg2a v koži rib. V primerjavi s potočno postrvjo je pri marmorirani postrvi in F3
križancih izražanje gena scg2a povečano. Čeprav neposredna vloga scg2a v
pigmentaciji še ni bila dokazana, je pri adaptaciji živali na temno ozadje izražanje scg2a
povečano in vzporedno z izražanjem pomc v intermedianem predelu hipofize (MonteroHadjadje in sod., 2008). Proteini, kodirani s strani pomc, so prekurzorji hormona αMSH in se poleg hipofize in centralnega živčnega sistema izražajo tudi v melanocitih
(Chakraborty in sod., 1996). Glede na to, da hormon α-MSH sodeluje pri fiziološki
spremembi barve, predvidevamo, da v koži deluje scg2a kot fiziološki dejavnik barvne
spremembe in pomaga pri pakiranju in granulogenezi prekurzorja Pomc (Van Horssen
in Martens, 1999).
80
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Večina molekularnih genetskih študij pigmentnih mutantov je osredotočena na izražanje
genov v embrionalnem času. Zelo malo študij je osredotočenih na spremembo barve pri
odraslih osebkih, ki se dogaja pri marmorirani in potočni postrvi. Pri cebrici sta poznana
dva mutanta, jaguar/obelix/kcnj13 (Iwashita in sod., 2006) in leopard/cx41.8 (Watanabe
in sod., 2006), ki vplivata na barvni vzorec pri odrasli ribi. Fenotipsko sta ta dva
mutanta podobna marmoriranem vzorcu marmorirane postrvi. Pred kratkim sta
Watanabe in Kondo (2012) dokazala, da je delecija šestih aminokislin na N-koncu
proteina Cx41.8, ki ga kodira gen cx41.8, odgovorna za nastanek labirintnega vzorca pri
cebrici (slika 33).
Slika 33: Labirinten vzorec pri napihovalki (Tetradon mbu) (zgoraj) in cebrici (spodaj). Vmes je
prikazana primerjava med labirintnim vzorcem napihovalke (levo) in labirintnim vzorcem cebrice
(desno). Zgoraj v levem kotu je prikazan labirinten vzorec, napovedan s strani modela RD (povzeto po
Watanabe in Kondo, 2012)
Figure 33: Labyrinth pattern of puffer fish (Tetradon mbu) (above) and zebrafish (below). Comparison
between labyrinth pattern of puffer fish (left) and zebrafish (right) is presented in the middle. Labyrinth
pattern predicted by RD model is shown in upper left corner (adopted from Watanabe and Kondo, 2012)
Nastanek labirintnega vzorca je posledica oviranega delovanja N-konca proteina
Cx41.8, ki deluje kot nekakšen zamašek presledkovnega stika (angl. gap junction)
(Maeda in sod., 2009; Oshima in sod., 2007). Presledkovni stik, ki ga tvorita dva
Cx41.8 proteina, omogoča medcelično interakcijo med pigmentnimi celicami in
posledično nastajanje barvnega vzorca (Watanabe in Kondo, 2012).
81
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Gena kcnj13 in cx41.8, ki sta odgovorna za mutiran labirinten vzorec, nismo našli na
32K cDNA mikromreži, ki smo jo uporabili za našo študijo. Kljub temu, da tako
jaguar/obelix/kcnj13 kot leopard/cx41.8 mutanti nakazujejo na to, da sta gena kcnj13 in
cx41.8 verjetno odgovorna za nastanek marmoriranega vzorca, pa tega za marmorirano
postrv na podlagi svoje študije nismo uspeli potrditi.
Med mnogimi matematičnimi modeli, ki so jih razvili za napovedovanje oblikovanja
barvnega vzorca, najdemo model na osnovi reakcijsko-difuzijskega (RD) mehanizma, ki
nastanek barvnega vzorca razloži kot posledico enostavnega molekularnega mehanizma
(Turing, 1952, cit. po Kelsh, 2004). V RD modelu sta prisotni dve molekuli z različnima
vlogama; ena deluje kot aktivator, druga kot inhibitor. Aktivator sproža lastno sintezo in
sintezo inhibitorja, medtem ko inhibitor zavira sintezo aktivatorja. Obe molekuli nato
prehajata v sosednje celice v smeri koncentracijskega gradienta. Razmerje med
difuzijskimi konstantami teh dveh molekul igra pomembno vlogo pri obnašanju RD
modela (Kondo, 2002).
Pred kratkim je bila hipoteza mehanizma RD preverjena tudi na živih organizmih
(Miyazawa in sod., 2010). Hipotezo so avtorji preverili s križanjem dveh salmonidnih
vrst: belo pikčaste zlatovčice (S. leucomaenis) in črno pikčastega masu lososa (O.
masou masou). Rezultat križanja so bili potomci-križanci z nenavadnim labirintnim
vzorcem, ki je bil enak, kot ga je napovedal RD model (slika 34). Sick in sodelavci
(2006) so v svoji raziskavi šli še nekoliko dlje in so dokazali, da je razporeditev dlačnih
foliklov pri miših posledica delovanja wnt signalne poti in da je razporeditev dlačnih
foliklov enaka, kot jo je napovedal RD model.
82
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Slika 34: Labirinten vzorec pri križancih med belo pikčasto zlatovčico in črno pikčastim masu lososom
ter labirinten vzorec kot ga napoveduje model RD (spodaj desno) (povzeto po Miyazawa in sod., 2010)
Figure 34: Labyrinthine pattern in hybrids of white-spotted charr and black spotted masu salmon and
labyrinthine pattern predicted by RD model (bottom right) (summarized from Miyazawa et al., 2010)
Glede na fenotipsko podobnost marmoriranega in labirintnega vzorca in vključenost
različno izraženih genov v wnt signalni poti, lahko zaključimo, da nastanek
marmoriranega vzorca po vsej verjetnosti temelji na reakcijsko-difuzijskem mehanizmu
in je odvisen od wnt signalne poti. Čeprav smo našli le tri različno izražene gene
vključene v signalno pot wnt, vključenost nekaterih ključnih genov te signalne poti
(wnt, β-katenin, mitfa,...) pri nastanku marmoriranega vzorca ostaja neznanka. Za
natančno opredelitev regulatorne poti, ki sproži in ohranja marmorirani vzorec, so
potrebne še nadaljnje analize kandidatnih genov, ki smo jih identificirali v naši študiji,
ter ostalih ključnih genov v signalni poti wnt. Prav tako ostajata neznanki gena cx41.8 in
kcnj13, ki smo ju že poskušali pomnožiti in pridobiti sekvenco, vendar žal neuspešno.
83
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
6
POVZETEK (SUMMARY)
6.1
POVZETEK
Barvna raznolikost, ki se pojavlja pri ribah, je posledica večjega števila različnih tipov
pigmentnih celic in obenem tudi večjega nabora genov zaradi podvojitve genoma, ki se
je pri teleostih dogodila pred 320-350 milijoni let. Salmonidi, kamor se uvrščajo tudi
postrvi iz rodu Salmo in Oncorhyncus, so fenotipsko zelo raznoliki tudi zaradi
tetraploidizacije genoma, ki se je zgodila pred ~100 milijoni let (Allendorf in
Thorgaard, 1984, cit. po Braasch in sod., 2008). Zelo malo je znanega o razlikah v
obarvanosti kože ali barvnem vzorcu pri salmonidih. Za obarvanost salmonidov so
odgovorni trije tipi kromatofor; melanofore, ksantofore in iridofore, ki se lahko nahajajo
v usnjici kot samostojne enote ali pa so povezane v t.i. kromatoforno enoto (Hawkes,
1974a). S pomočjo mutantov je bilo do danes pri salmonidih identificiranih 13 genov, ki
so vključeni v obarvanost in nastanek vzorca (Braasch in sod., 2007; Parichy in sod.,
2000).
Na osnovi morfologije je bilo v rodu Salmo in Oncorhynchus skupaj opisanih več kot
50 vrst postrvi (Kottelat in Freyhof, 2007), kar uvršča postrvi med najbolj raznolike
organizme med vretenčarji. Potrjena je bila tudi velika variabilnost na genetskem
nivoju, kjer so raziskovalci ugotovili, da je pri postrveh iz rodu Salmo genotipska
različnost povezana z geografsko porazdelitvijo (Bernatchez, 2001; Cortey in sod.,
2004). Za proučevani model smo izbrali marmorirano postrv, ki je zaradi njenega
karakterističnega barvnega vzorca in razpoložljivosti vzorcev F2 in F3 generacije
nadzorovanega križanja med marmorirano in potočno postrvjo zelo primerna za
proučevanje obarvanosti in nastanka barvnega vzorca. Namen naše študije je bil
identificirati kandidatne gene za specifično obarvanost pri marmorirani postrvi. Obenem
nas je zanimalo, če se različna obarvanost pri postrveh kaže tudi v strukturni različnosti
kože.
Strukturna različnost kože se je kazala v nekoliko debelejši povrhnjici pri marmorirani
postrvi kot pri potočni postrvi, ki se je pri obeh vrstah s starostjo postopoma debelila
(p < 0,05). Poleg razlik v debelini povrhnjice so razlike v strukturi kože med
84
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
marmorirano in potočno postrvjo omejene na razlike v velikosti in pogostnosti
melanofor v usnjici. V naši študiji so bile melanofore marmorirane postrvi v povprečju
večje kot pri potočni postrvi. Njihova gostota se s starostjo ni spreminjala in je bila za
trikrat manjša kot pri potočni postrvi. Zaradi nespremenjene gostote melanofor in
povečevanja premera melanofor s starostjo marmorirane postrvi, je nastanek
marmoriranega vzorca v večji meri posledica hipertrofije kot pa hiperplazije pigmentnih
celic. Pri odraslih organizmih je bila v svetlih predelih marmoriranega vzorca gostota
melanofor zelo nizka, ponekod so bile celo odsotne.
Fenotipsko strukturno različnost smo preverili še z genetskega stališča, kjer smo za
genetsko medvrstno razlikovanje uporabili SNP označevalce. Na dveh lokusih smo
odkrili specifične alele pri marmoriranih postrveh, ki so izvirale iz geografsko ločenih
populacij soškega porečja in marmoriranih postrveh iz ribogojnice Tagliamento.
Dejstvo, da ti aleli niso bili prisotni pri potočnih postrveh iz štirih različnih evropskih
porečij, nakazuje, da so specifični za marmorirano postrv. Fenotipska in genotipska
povezava je bila zelo nizka pri obeh lokusih, kar niti ne preseneča, saj je pri obeh genih
šlo za polimorfizme, ki se nahajajo v nekodirajoči regiji. Čeprav v naši študiji poročamo
o malem številu polimorfizmov, pa ti novi jedrni označevalci predstavljajo koristne
diagnostične označevalce za karakterizacijo posameznikov v hibridnih conah
marmorirane in potočne postrvi.
S pomočjo transkripcijskih analiz smo identificirali sedem genov. Za dva (kita in eif3ea)
od teh sedmih genov ne moremo zaključiti, da sta vključena v proces nastanka
marmoriranega vzorca. Od preostalih petih genov so bili trije geni (hdac1, gnaq in dct)
vključeni neposredno ali posredno v wnt signalno pot, ki je pri živalih odgovorna za
melanogenezo. Delovanje signalne poti wnt je bilo teoretično podprto z računalniškim
modelom, ki temelji na reakcijsko-difuzijskem mehanizmu (Miyazawa in sod., 2010;
Sick in sod., 2006). Glede na fenotipsko podobnost marmoriranega in labirintnega
vzorca, ki ga napoveduje reakcijsko-difuzijski model, in vključitve signalne poti wnt,
nastanek marmoriranega vzorca po vsej verjetnosti temelji na reakcijsko-difuzijskem
mehanizmu in je odvisen od signalne poti wnt.
85
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Preostala dva gena (vps18 in scg2a), katerih transkripcijski profil se je razlikoval med
marmorirano in potočno postrvjo, pa sta po vsej verjetnosti vključena kot dejavnika
fiziološke barvne spremembe. vps18 se vključuje v sintezo melanosomov, medtem ko je
scg2a odgovoren za pakiranje in granulogenezo proopiomelanokortina (Pomc),
prekurzorja α-MSH, ki igra glavno vlogo pri razpršitvi melanosomov v melanoforah.
V naši študiji smo dokazali strukturno različnost kože med osebkoma, ki sta si
fenotipsko raznolika, a filogenetsko zelo sorodna. Seveda se ta različnost kaže tudi v
različnem izražanju genov, vključenih v procese obarvanja in nastanka barvnih vzorcev.
V delu smo uspešno prikazali različno izražanje genov vključenih v proces obarvanja,
med katerimi je nekaj genov vključenih v wnt signalno pot. Nastanek marmoriranega
barvnega vzorca je po vsej verjetnosti posledica delovanja wnt signalne poti in temelji
na reakcijsko-difuzijskem mehanizmu.
6.2
SUMMARY
The colour diversity in fish is due to a different types of pigment cells and the large
number of pigment genes resulting of fish genome duplication that occured ~320 to 350
million years ago. Salmonids, including trout, were subjected to another genome
duplication event that took place ~100 million years ago, and is responsible for
extensive phenotypic diversity of the whole family. Very little is known about
differences in skin colouration and colour pattern formation in salmonids, for which,
three types of chromatophores (melanophores, xanthophores and iridophores) are
responsible. These pigment cells are either located in dermis as a single unit or they
form a chromatophore unit (Hawkes, 1974a). Until today, 13 genes were identified in
salmonids that are involved in the colouration and pattern formation (Braasch in sod.,
2007; Parichy in sod., 2000).
Based on morphology more than 50 species of trout were described together in genus
Salmo and Oncorhynchus (Kottelat in Freyhof, 2007). The genetic diversity was
confirmed by different authors, who found that genetic differences are geographical
determined (Bernatchez, 2001; Cortey in sod., 2004). Marble trout was used in our
study due to its characteristic colour pattern and availability of samples of F1, F2 and
86
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
F3 generations of crosses between marble and brown trout. The aim of our study are
identification of candidate genes responsible for marble pattern formation in marble
trout. We also tended to perform histological analysis of skin to investigate if different
colouration in trout is attributed to structural diversity of skin.
Comparing marble and brown trout skin, we showed that structural diversity of skin in
marble trout was characterized by slightly thicker epidermis than in brown trout, which
gradually increased with age in both species (p < 0.05). Beside the differences in
thickness of epidermis, structural diversity of skin in marble and brown trout was
limited to differences in size and density of melanophores in the dermis. The present
study reveales that melanophores are larger in marble trout than in brown trout. Their
average density was more or less constant across all age classes and was three times
lower when compared to brown trout. Maximum diameter of melanophores in marble
trout increases with age, while the density of melanophores is more or less the same,
which most likely indicates that marble colour pattern formation is more the result of
hypertrophy than hyperplasia of pigment cells. In adult marbled individuals in light
areas of marble pattern melanophores at low density are present or even absent.
To assess phenotypic structural diversity from genetic perspective, SNP markers
selected from five candidate genes with possible impact on colour pattern formation in
model organisms (e.g., D. rerio) were tested for differences between the species. At two
loci (pmela, smtl), we found specific alleles for geographicaly seperate populations of
marble trout in the Soča basin and in the fish farm in Tagliamento, Italy. These alleles
were not present in brown trout of any of four different lineages, indicating that they are
private for marble trout. Correlation between colour pattern and genotypes was not
significant at either loci, which is not suprising, since polymorphisms in both genes
were located in non-coding region. Although we report on a small number of SNPs,
these new markers represent a valuable and useful diagnostic contribution for discerning
marble trout from their hybrids with brown trout.
With transcription analysis, we identified seven genes that are differentialy expressed
between marble and brown trout and are involved in the biological process of
87
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
pigmentation. For two (kita and eif3ea) of these seven genes we can not conclude that
are involved in marble pattern formation. Of the remaining five genes, three (hdac1,
gnaq and dct) were involved directly or indirectly in the wnt signaling pathway, which
is known to influence melanogenesis in animals. Function of the wnt signaling pathway
has been theoretically supported by computer model based on reaction-diffusion
mechanism (Miyazawa in sod., 2010; Sick in sod., 2006). Due to phenotypic similarity
of marble colour pattern and labyrinthine colour pattern, and participation of
differentially expressed genes in wnt signaling pathway, it can be concluded that
formation of marble colour pattern is probably based on a raction-diffusion mechanism
and depends upon wnt signaling pathway.
The remainig two genes (vps18 and scg2a), whose transcription profile differed between
marble and brown trout, are probably involved as factors of physiological colour
change. vps18 is involved in the synthesis of melanosomes, while scg2a is responsible
for packaging and granulogenesis of proopiomelanocortin (Pomc) the precursor of a αMSH, which plays a major role in the dispersion of melanosomes in melanophores.
In our study, we demonstrated structural difference of skin between two phenotipically
diverse but phylogenetically closely related species. This diversity is also reflected
through different expression of genes involved in the colouration and formation of
colour pattern. We demonstrated that the formation of marble colour pattern depends on
wnt signaling pathway and that origin of marble colour pattern is based on reactiondiffusion mechanism.
88
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
7
VIRI
Adachi K., Kato K., Wakamatsu K., Ito S., Ishimaru K., Hirata T., Murata O., Kumai H.
2005. The histological analysis, colorimetric evaluation, and chemical
quantification of melanin content in 'suntanned' fish. Pigment Cell Research, 18,
6: 465-468
Behnke R.J. 1992. Native trout of western North America. American Fisheries Society:
275 str.
Bernatchez L. 2001. The evolutionary history of brown trout (Salmo trutta L.) inferred
from phylogeographic, nested clade, and mismatch analyses of mitochondrial
DNA variation. Evolution, 55: 351-379
Billin A.N., Thirlwell H., Ayer D.E. 2000. beta-catenin-histone deacetylase interactions
regulate the transition of LEF1 from a transcriptional repressor to an activator.
Molecular and Cellular Biology, 20, 18: 6882-6890
Bjerkeng B., Hatlen B., Jobling M. 2000. Astaxanthin and its metabolites idoxanthin
and crustaxanthin in flesh, skin, and gonads of sexually immature and maturing
Arctic charr (Salvelinus alpinus (L.)). Comparative Biochemistry and Physiology
B-Biochemistry & Molecular Biology, 125, 3: 395-404
Bjerkeng B., Storebakken T., Liaaenjensen S. 1992. Pigmentation of rainbow trout from
start feeding to sexual-maturation. Aquaculture, 108, 3-4: 333-346
Blanc J.M., Chevassus B., Krieg F. 1994. Inheritance of the number of red spots on the
skin of the brown trout. Aquatic Living Resources, 7, 2: 133-136
Blanc J.M., Poisson H., Quillet E. 2006. A blue variant in the rainbow trout,
Oncorhynchus mykiss Walbaum. Journal of Heredity, 97, 1: 89-93
Boecklen W.J., Howard D.J. 1997. Genetic analysis of hybrid zones: Numbers of
markers and power of resolution. Ecology, 78, 8: 2611-2616
Braasch I., Brunet F., Volff J.N., Schartl M. 2009. Pigmentation pathway evolution after
whole-genome duplication in fish. Genome Biology and Evolution, 1: 479-493
Braasch I., Salzburger W., Meyer A. 2006. Asymmetric evolution in two fishspecifically duplicated receptor tyrosine kinase paralogons involved in teleost
coloration. Molecular Biology and Evolution, 23, 6: 1192-1202
Braasch I., Schartl M., Volff J.-N. 2007. Evolution of pigment synthesis pathways by
gene and genome duplication in fish. BMC Evolutionary Biology, 7, 1: 74
Braasch I., Volff J.N., Schartl M. 2008. The evolution of teleost pigmentation and the
fish-specific genome duplication. Journal of Fish Biology, 73, 8: 1891-1918
89
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Budi E.H., Patterson L.B., Parichy D.M. 2011. Post-embryonic nerve-associated
precursors to adult pigment cells: Genetic requirements and dynamics of
morphogenesis and differentiation. Plos Genetics, 7, 5: e1002044
Busca R., Ballotti R. 2000. Cyclic AMP a key messenger in the regulation of skin
pigmentation. Pigment Cell Research, 13, 2: 60-69
Cadigan K.M., Nusse R. 1997. Wnt signaling: a common theme in animal development.
Genes & Development, 11, 24: 3286-3305
Chakraborty A.K., Funasaka Y., Slominski A., Ermak G., Hwang J., Pawelek J.M.,
Ichihashi M. 1996. Production and release of proopiomelanocortin (POMC)
derived peptides by human melanocytes and keratinocytes in culture: Regulation
by ultraviolet B. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular Cell Research, 1313,
2: 130-138
Colihueque N. 2010. Genetics of salmonid skin pigmentation: clues and prospects for
improving the external appearance of farmed salmonids. Reviews in Fish Biology
and Fisheries, 20, 1: 71-86
Cooper C.D., Raible D.W. 2009. Mechanisms for reaching the differentiated state:
Insights from neural crest-derived melanocytes. Seminars in Cell &
Developmental Biology, 20, 1: 105-110
Cortey M., Pla C., García-Marín J.L. 2004. Historical biogeography of Mediterranean
trout. Molecular Phylogenetics and Evolution, 33, 3: 831-844
Dorsky R.I., Raible D.W., Moon R.T. 2000. Direct regulation of nacre, a zebrafish
MITF homolog required for pigment cell formation, by the Wnt pathway. Genes
& Development, 14, 2: 158-162
Elworthy S., Lister J.A., Carney T.J., Raible D.W., Kelsh R.N. 2003. Transcriptional
regulation of mitfa accounts for the sox10 requirement in zebrafish melanophore
development. Development, 130, 12: 2809-2818
Fedorow H., Tribl F., Halliday G., Gerlach A., Riederer P., Double K.L. 2005.
Neuromelanin in human dopamine neurons: Comparison with peripheral melanins
and relevance to Parkinson's disease. Progress in Neurobiology, 75, 2: 109-124
Ford M.J. 2000. Effects of natural selection on patterns of DNA sequence variation at
the transferrin, somatolactin, and p53 genes within and among chinook salmon
(Oncorhynchus tshawytscha) populations. Molecular Ecology, 9, 7: 843-855
Foty R.A., Pfleger C.M., Forgacs G., Steinberg M.S. 1996. Surface tensions of
embryonic tissues predict their mutual envelopment behavior. Development, 122,
5: 1611-1620
90
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Fujii R. 1993. Cytophysiology of fish chromatophores. International Review of
Cytology, 143: 191-255
Fujii R. 2000. The regulation of motile activity in fish chromatophores. Pigment Cell
Research, 13, 5: 300-319
Fujii R., Oshima N. 1986. Control of chromatophore movements in teleost fish.
Zoological Science, 3: 13-47
Fukamachi S., Sugimoto M., Mitani H., Shima A. 2004. Somatolactin selectively
regulates proliferation and morphogenesis of neural-crest derived pigment cells in
medaka. PNAS, 101, 29: 10661-10666
Gharbi K., Gautier A., Danzmann R.G., Gharbi S., Sakamoto T., Hoyheim B., Taggart
J.B., Cairney M., Powell R., Krieg F., Okamoto N., Ferguson M.M., Holm L.E.,
Guyomard R. 2006. A linkage map for brown trout (Salmo trutta): Chromosome
homeologies and comparative genome organization with other salmonid fish.
Genetics, 172, 4: 2405-2419
Goudet J. 2001. FSTAT, a program to estimate and test gene diversities and fixation
indices. http://www2.unil.ch/popgen/softwares/fstat.htm (23. jul. 2007)
Grzmil M., Whiting D., Maule J., Anastasaki C., Amatruda J.F., Kelsh R.N., Norbury
C.J., Patton E.E. 2007. The INT6 cancer gene and MEK signaling pathways
converge during zebrafish development. Plos One, 2, 9: e959
Guyonneau L., Murisier F., Rossier A., Moulin A., Beermann F. 2004. Melanocytes and
pigmentation are affected in dopachrome tautomerase knockout mice. Molecular
and Cellular Biology, 24, 8: 3396-3403
Hamre K., Holen E., Moren M. 2007. Pigmentation and eye migration in Atlantic
halibut (Hippoglossus hippoglossus L.) larvae: new findings and hypotheses.
Aquaculture Nutrition, 13, 1: 65-80
Hamre K., Moren M., Solbakken J., Opstad I., Pittman K. 2005. The impact of nutrition
on metamorphosis in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L.).
Aquaculture, 250, 3-4: 555-565
Harris J.E., Hunt S. 1975. The fine structure of the epidermis of two species of salmonid
fish, the Atlantic salmon (Salmo salar L.) and the brown trout (Salmo trutta L.).
Cell and Tissue Research, 163, 4: 535-543
Hawkes J.W. 1974a. The structure of fish skin II. The chromatophore unit. Cell and
Tissue Research, 149: 159-172
Hawkes J.W. 1974b. Structure of fish skin: I. General organization. Cell and Tissue
Research, 149, 2: 147-158
91
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Hoek K.S., Schlegel N.C., Eichhoff O.M., Widmer D.S., Praetorius C., Einarsson S.O.,
Valgeirsdottir S., Bergsteinsdottir K., Schepsky A., Dummer R., Steingrimsson E.
2008. Novel MITF targets identified using a two-step DNA microarray strategy.
Pigment Cell & Melanoma Research, 21, 6: 665-676
Hoekstra H.E. 2006. Genetics, development and evolution of adaptive pigmentation in
vertebrates. Heredity, 97, 3: 222-234
Hotta K., Hosaka M., Tanabe A., Takeuchi T. 2009. Secretogranin II binds to
secretogranin III and forms secretory granules with orexin, neuropeptide Y, and
POMC. Journal of Endocrinology, 202, 1: 111-121
Hou L., Arnheiter H., Pavan W.J. 2006. Interspecies difference in the regulation of
melanocyte development by SOX10 and MITF. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 103, 24: 9081-9085
Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A. 2009. Systematic and integrative analysis
of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nature Protocols, 4, 1:
44-57
Ignatius M.S., Moose H.E., El-Hodiri H.M., Henion P.D. 2008. colgate/hdac1
repression of foxd3 expression is required to permit mitfa-dependent
melanogenesis. Developmental Biology, 313, 2: 568-583
Iwashita M., Watanabe M., Ishii M., Chen T., Johnson S.L., Kurachi Y., Okada N.,
Kondo S. 2006. Pigment pattern in jaguar/obelix zebrafish is caused by a Kir7.1
mutation: Implications for the regulation of melanosome movement. Plos
Genetics, 2, 11: 1861-1870
Jacobson E.S. 2000. Pathogenic roles for fungal melanins. Clinical Microbiology
Reviews, 13, 4: 708-717
Jesuthasan S. 1996. Contact inhibition collapse and pathfinding of neural crest cells in
the zebrafish trunk. Development, 122, 1: 381-389
Jug T., Berrebi P., Snoj A. 2005. Distribution of non-native trout in Slovenia and their
introgression with native trout populations as observed through microsatellite
DNA analysis. Biological Conservation, 123, 3: 381-388
Jug T., Dovc P., Pohar J., Snoj A. 2004. RAPD analysis as a tool for discriminating
marble trout from hybrids (marble trout x brown trout) in the zones of
hybridization. Journal of Animal Breeding and Genetics, 121, 3: 156-162
Kaleta K. 2009. Morphological analysis of chromatophores in the skin of trout. Bulletin
of the Veterinary Institute in Pulawy, 53, 1: 117-121
92
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Kaweewat K., Hofer R. 1997. Effect of UV-B radiation on goblet cells in the skin of
different fish species. Journal of Photochemistry and Photobiology B-Biology, 41,
3: 222-226
Ke X.Y., Collins A., Ye S. 2001. PIRA PCR designer for restriction analysis of single
nucleotide polymorphisms. Bioinformatics, 17, 9: 838-839
KEGG. 2012. KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. http://www.kegg.jp/
(13. jan. 2012)
Kelsh R.N. 2004. Genetics and Evolution of Pigment Patterns in Fish. Pigment Cell
Research, 17, 4: 326-336
Kelsh R.N., Brand M., Jiang Y.J., Heisenberg C.P., Lin S., Haffter P., Odenthal J.,
Mullins M.C., van Eeden F.J., Furutani-Seiki M., Granato M., Hammerschmidt
M., Kane D.A., Warga R.M., Beuchle D., Vogelsang L., Nüsslein-Volhard C.
1996. Zebrafish pigmentation mutations and the processes of neural crest
development. Development, 123: 369-389
Kelsh R.N., Harris M.L., Colanesi S., Erickson C.A. 2009. Stripes and belly-spots-A
review of pigment cell morphogenesis in vertebrates. Seminars in Cell &
Developmental Biology, 20, 1: 90-104
Kincaid H.L. 1975. Iridescent metallic blue color variant in rainbow trout. Journal of
Heredity, 66, 2: 100-101
Knoz J., Halacka K., Brabec H. 1990. Morphometry of the epidermis of brown trout
(Salmo trutta m. fario). Folia Zoologica, 39, 3: 269-278
Kondo S. 2002. The reaction-diffusion system: a mechanism for autonomous pattern
formation in the animal skin. Genes to Cells, 7, 6: 535-541
Koop B.F., von Schalburg K.R., Leong J., Walker N., Lieph R., Cooper G.A., Robb A.,
Beetz-Sargent M., Holt R.A., Moore R., Brahmbhatt S., Rosner J., Rexroad C.E.,
McGowan C.R., Davidson W.S. 2008. A salmonid EST genomic study: genes,
duplications, phylogeny and microarrays. BMC Genomics, 9: 545
Kottelat M., Freyhof J. 2007. Handbook of European freshwater fishes. Cornol,
Switzerland and Berlin, Germany, Kottelat and Freyhof: 646 str.
Lang D., Lu M.M., Huang L., Engleka K.A., Zhang M.Z., Chu E.Y., Lipner S.,
Skoultchi A., Millar S.E., Epstein J.A. 2005. Pax3 functions at a nodal point in
melanocyte stem cell differentiation. Nature, 433, 7028: 884-887
Leclercq E., Taylor J.F., Migaud H. 2010. Morphological skin colour changes in
teleosts. Fish and Fisheries, 11, 2: 159-193
93
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Lin J.Y., Fisher D.E. 2007. Melanocyte biology and skin pigmentation. Nature, 445,
7130: 843-850
Lister J.A., Robertson C.P., Lepage T., Johnson S.L., Raible D.W. 1999. nacre encodes
a zebrafish microphthalmia-related protein that regulates neural-crest-derived
pigment cell fate. Development, 126, 17: 3757-3767
Liu X.X., Rubin J.S., Kimmel A.R. 2005. Rapid, Wnt-induced changes in GSK3 beta
associations that regulate beta-catenin stabilization are mediated by G alpha
proteins. Current Biology, 15, 22: 1989-1997
Maderspacher F., Nusslein-Volhard C. 2003. Formation of the adult pigment pattern in
zebrafish requires leopard and obelix dependent cell interactions. Development,
130, 15: 3447-3457
Maeda S., Nakagawa S., Suga M., Yamashita E., Oshima A., Fujiyoshi Y., Tsukihara T.
2009. Structure of the connexin 26 gap junction channel at 3.5 angstrom
resolution. Nature, 458, 7238: 597-U61
Maldonado E., Hernandez F., Lozano C., Castro M.E., Navarro R.E. 2006. The
zebrafish mutant vps18 as a model for vesicle-traffic related hypopigmentation
diseases. Pigment Cell Research, 19, 4: 315-326
Mills M.G., Nuckels R.J., Parichy D.M. 2007. Deconstructing evolution of adult
phenotypes: genetic analyses of kit reveal homology and evolutionary novelty
during adult pigment pattern development of Danio fishes. Development, 134, 6:
1081-1090
Miot S., Le Goff P., Duval J. 1998. Evidence for the presence of a secretogranin IIrelated protein in rainbow trout pituitary. V: Trends in Comparative
Endocrinology and Neurobiology - from Molecular to Integrative Biology.
Vaudry H., Tonon M.C., Roubos E.W., deLoof A. (eds.). New York, The New
York Academy of Sciences: 508-509
Miyazawa S., Okamoto M., Kondo S. 2010. Blending of animal colour patterns by
hybridization. Nature Communications, 1: 66
Montero-Hadjadje M., Vaingankar S., Elias S., Tostivint H., Mahata S.K., Anouar Y.
2008. Chromogranins A and B and secretogranin II: evolutionary and functional
aspects. Acta Physiologica, 192, 2: 309-324
Nagai M., Oshima N., Fujii R. 1986. A comparative study of melanin-concentrating
hormone (MCH) action on teleost melanophores. Biological Bulletin, 171, 2: 360370
Nagaishi H., Oshima N. 1989. Neural control of motile activity of light-sensitive
iridophores in the neon tetra. Pigment Cell Research, 2, 6: 485-492
94
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Nakamura K., Ozaki A., Akutsu T., Iwai K., Sakamoto T., Yoshizaki G., Okamoto N.
2001. Genetic mapping of the dominant albino locus in rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Molecular Genetics and Genomics, 265, 4: 687-693
Negishi S. 1985. Light response of cultured melanophores of teleost adult fish, Oryzias
latipes. Journal of Experimental Zoology, 236, 3: 327-333
Ohta T., Sugimoto S. 1980. Leucosome dispersion under light in medaka leucophores.
Japanese Journal of Ichthyology, 27, 1: 72-76
Oshima A., Tani K., Hiroaki Y., Fujiyoshi Y., Sosinsky G.E. 2007. Three-dimensional
structure of a human connexin26 gap junction channel reveals a plug in the
vestibule. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America, 104, 24: 10034-10039
Oshima N., Kasukawa H., Fujii R., Wilkes B.C., Hruby V.J., Hadley M.E. 1986. Action
of melanin-concentrating hormone (MCH) on teleost chromatophores. General
and Comparative Endocrinology, 64, 3: 381-388
Oshima N., Nakata E., Kamagata M.S. 1998. Light-induced pigment aggregation in
xanthophores of the medaka, Oryzias latipes. Pigment Cell Research, 11, 6: 362367
Oshima N., Yokozeki A. 1999. Direct control of pigment aggregation and dispersion in
tilapia erythrophores by light. Zoological Science, 16: 51-54
Parichy D.M. 2003. Pigment patterns: fish in stripes and spots. Current Biology, 13, 24:
R947-R950
Parichy D.M. 2006. Evolution of danio pigment pattern development. Heredity, 97, 3:
200-210
Parichy D.M., Ransom D.G., Paw B., Zon L.I., Johnson S.L. 2000. An orthologue of the
kit-related gene fms is required for development of neural crest-derived
xanthophores and a subpopulation of adult melanocytes in the zebrafish, Danio
rerio. Development, 127, 14: 3031-3044
Parichy D.M., Rawls J.F., Pratt S.J., Whitfield T.T., Johnson S.L. 1999. Zebrafish
sparse corresponds to an orthologue of c-kit and is required for the morphogenesis
of a subpopulation of melanocytes, but is not essential for hematopoiesis or
primordial germ cell development. Development, 126, 15: 3425-3436
Parichy D.M., Turner J.M., Parker N.B. 2003. Essential role for puma in development
of postembryonic neural crest-derived cell lineages in zebrafish. Developmental
Biology, 256, 2: 221-241
95
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Peinado J.R., Vazquez-Martinez R., Cruz-Garcia D., Ruiz-Navarro A., Anouar Y.,
Tonon M.C., Vaudry H., Gracia-Navarro F., Castano J.P., Malagon M.M. 2006.
Differential expression and processing of chromogranin a and secretogranin II in
relation to the secretory status of endocrine cells. Endocrinology, 147, 3: 14081418
Pfaffl M.W., Horgan G.W., Dempfle L. 2002. Relative expression software tool (REST
(c)) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression
results in real-time PCR. Nucleic Acids Research, 30, 9: e36
Povž M., Jesenšek D., Berrebi P., Crivelli A.J. 1996. The marble trout, Salmo trutta
marmoratus; Cuvier 1817, in the Soča river basin, Slovenia. Le Sambuc, Tour
duValat: 65 str.
Rakers S., Gebert M., Uppalapati S., Meyer W., Maderson P., Sell A.F., Kruse C., Paus
R. 2010. 'Fish matters': the relevance of fish skin biology to investigative
dermatology. Experimental Dermatology, 19, 4: 313-324
Rapley R., Harbron S. 2004. Molecular analysis and genome discovery. West Sussex,
John Wiley & Sons Ltd: 372 str.
Rawls J.F., Johnson S.L. 2003. Temporal and molecular separation of the kit receptor
tyrosine kinase's roles in zebrafish melanocyte migration and survival.
Developmental Biology, 262, 1: 152-161
Saldana-Caboverde A., Kos L. 2010. Roles of endothelin signaling in melanocyte
development and melanoma. Pigment Cell & Melanoma Research, 23, 2: 160-170
Santiago A., Erickson C.A. 2002. Ephrin-B ligands play a dual role in the control of
neural crest cell migration. Development, 129, 15: 3621-3632
SAS Institute Inc. 2002. Statistical Analysis System. The SAS System for Windows,
Version 90. Cary, NC, USA
Schliwa M. 1986. Pigment Cells. V: Biology of the Integument 2, Vertebrates. BereiterHahn J., Matoltsy A.G., Richards K.S. (eds.). Berlin Heidelberg, Springer-Verlag:
65-77
Seegers U., Meyer W. 2009. A comparative view of the fundamentals of the structure
and function of fish skin. Kleintierpraxis, 54, 2: 73-87
Sick S., Reinker S., Timmer J., Schlake T. 2006. WNT and DKK determine hair follicle
spacing through a reaction-diffusion mechanism. Science, 314, 5804: 1447-1450
Sivka U., Halačka K., Sušnik Bajec S. 2012. Morphological differences in skin of
marble trout Salmo marmoratus and of brown trout Salmo trutta. Folia
Histochemica et Cytobiologica, 50, 2: 255-262
96
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Skaala Ø., Solberg G. 1997. Biocheical genetic variability and taxonomy of a
marmorated salmonid in River Otra, Norway. Nordic Journal of Freshwater
Research, 73: 3-12
Storebakken T., No H.K. 1992. Pigmentation of rainbow-trout. Aquaculture, 100, 1-3:
209-229
Sugimoto M. 2002. Morphological color changes in fish: Regulation of pigment cell
density and morphology. Microscopy Research and Technique, 58, 6: 496-503
Sugimoto M., Uchida N., Hatayama M. 2000. Apoptosis in skin pigment cells of the
medaka, Oryzias latipes (Teleostei), during long-term chromatic adaptation: the
role of sympathetic innervation. Cell and Tissue Research, 301, 2: 205-216
Sugimoto M., Yuki M., Miyakoshi T., Maruko K. 2005. The influence of long-term
chromatic adaptation on pigment cells and striped pigment patterns in the skin of
the zebrafish, Danio rerio. Journal of Experimental Zoology Part a-Comparative
Experimental Biology, 303A, 6: 430-440
Susnik S., Sivka U., Snoj A. 2008. A set of nuclear DNA markers diagnostic for marble
trout, Salmo marmoratus. Aquaculture, 285, 1-4: 260-263
Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. 1994. CLUSTAL-W: improving the
sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic
Acids Research, 22, 22: 4673-4680
Thorsen J., Hoyheim B., Koppang E.O. 2006. Isolation of the Atlantic salmon
tyrosinase gene family reveals heterogenous transcripts in a leukocyte cell line.
Pigment Cell Res, 19, 4: 327-336
Van Horssen A.M., Martens G.J.M. 1999. Biosynthesis of secretogranin II in Xenopus
intermediate pituitary. Molecular and Cellular Endocrinology, 147, 1-2: 57-64
Van Raamsdonk C.D., Barsh G.S., Wakamatsu K., Ito S. 2009. Independent regulation
of hair and skin color by two G protein-coupled pathways. Pigment Cell &
Melanoma Research, 22, 6: 819-826
Van Raamsdonk C.D., Fitch K.R., Fuchs H., de Angelis M.H., Barsh G.S. 2004. Effects
of G-protein mutations on skin color. Nature Genetics, 36, 9: 961-968
Visconti M.A., Castrucci A.M. 1993. Melanotropin receptors in the cartilaginous fish,
Potamotrygon reticulatus and in the lungfish, Lepidosiren paradoxa. Comparative
Biochemistry and Physiology, 106: 523-528
Visconti M.A., Ramanzini G.C., Camargo C.R., Castrucci A.M.L. 1999. Elasmobranch
color change: A short review and novel data on hormone regulation. Journal of
Experimental Zoology, 284, 5: 485-491
97
Sivka U. Genetsko ozadje procesa obarvanja in nastanka barvnega vzorca pri postrveh.
Dokt. disertacija. Ljubljana, Univ. v Ljubljani, Biotehniška fakulteta, 2012
Watanabe M., Iwashita M., Ishii M., Kurachi Y., Kawakami A., Kondo S., Okada N.
2006. Spot pattern of leopard Danio is caused by mutation in the zebrafish
connexin41.8 gene. Embo Reports, 7, 9: 893-897
Watanabe M., Kondo S. 2012. Changing clothes easily: connexin41.8 regulates skin
pattern variation. Pigment Cell & Melanoma Research: doi: 10.1111/j.1755148X.2012.00984.x
Whitear M. 1986a. Dermis. V: Biology of the Integument 2, Vertebrates. Bereiter-Hahn
J., Matoltsy A.G., Richards K.S. (eds.). Berlin Heidelberg, Springer-Verlag: 39-64
Whitear M. 1986b. Epidermis. V: Biology of the Integument 2, Vertebrates. BereiterHahn J., Matoltsy A.G., Richards K.S. (eds.). Berlin Heidelberg, Springer-Verlag:
8-38
Witkowski A., Kaleta K., Kuryszko J., Kusznierz J. 2004. Histological structure of the
skin of Arctic charr, Salvelinus alpinus (L.) from Spitsbergen. Acta Ichthyologica
et Piscatoria, 34: 241-251
Wolf J. 1954. Mikroskopická technika. Praha, SZdN: 428
Yamaguchi M., Yoshimoto E., Kondo S. 2007. Pattern regulation in the stripe of
zebrafish suggests an underlying dynamic and autonomous mechanism. PNAS,
104, 12: 4790-4793
Yamamoto A., Nagura J., Omori Y., Haga M. 1999. Albinism in the cultured Amago
Salmon, Oncorhynchus masou ishikawai. Suisan Zoshoku, 47: 43-47
Yasumoto K., Takeda K., Saito H., Watanabe K., Takahashi K., Shibahara S. 2002.
Microphthalmia-associated transcription factor interacts with LEF-1, a mediator
of Wnt signaling. Embo Journal, 21, 11: 2703-2714
Zaccone G., Kapoor B.G., Fasulo S., Ainis L. 2001. Structural, histochemical and
functional aspects of the epidermis of fishes. Advances in Marine Biology, Vol
40, 40: 253-348
Zhao E., Basak A., Crump K., Trudeau V.L. 2006. Proteolytic processing and
differential distribution of secretogranin-II in goldfish. General and Comparative
Endocrinology, 146, 2: 100-107
98
ZAHVALA
Najprej bi se zahvalila svoji družini, tisti pravi družini, ki je tiho trpela moje žolčne
izlive in me bodrila v trenutkih, ko je morala pometala z mano po tleh. Hvala Iztoku in
najinama sončkoma Eonu in Naji, ki sta me spomnila na pozabljen, čarobni, otroški
svet.
Hvala rodiški ribiški družini, v prvi vrsti moji mentorici Simoni Sušnik Bajec in Alešu
Snoju, ki je pogumno vskočil na mesto mentorja ob odsotnosti Simone. Hvala vama za
vse kažipote in podporo na mojem doktorskem popotovanju. Hvala preostali ribiški
klapi za smeh in tarnanje nad zlobno usodo.
Hvala Dušanu Jesenšku in RD Tolmin za vzorce marmorirane postrvi in križance F2 in
F3 generacije. Zahvala gre tudi RD Bled in ribogojnici Povodje za vzorce potočne
postrvi.
In nenazadnje hvala članom komisije, da so si vzeli čas za pregled in kritiko mojega
doktorskega dela.
PRILOGE
Priloga A:
Telesni parametri predstavnikov marmorirane in potočne postrvi
Starost
0+
Telesna masa (g)
marmorirana p.
potočna p.
2,5
2,2
2,3
2,0
2,9
2,1
Telesna dolžina (cm)
marmorirana p.
potočna p.
6,5
6,0
6,2
5,7
6,5
6,0
1+
68,3
80,2
63,0
80,0
50,0
80,0
17,6
18,5
18,0
18,5
16,7
18,5
2+
490,0
330,0
420,0
162,0
131,0
123,0
35,0
30,5
32,3
25,1
24,0
22,3
3+
850,0
490,0
530,0
40,2
34,7
34,2
Priloga B:
SNP mesta petih izbranih genov pri potočni postrvi iz štirih evropskih porečij,
marmorirani postrvi, belvici in mehkoustni postrvi
Potočna postrv
Marmorirana postrv
Belvica
Mehkoustna
postrv
SNP
mesto
Gen
paics
Ad
A
A
T
A
T
G
A
C
G
G
T
T
G
G
A
G
G
G
Da
G
C
T
T
T
G
A
C
G
G
T
T
G
G
G
G
G
G
At
A
A
C
A
T
G
A
C
G
G
T
T
G
G
A
G
G
G
Me
A
A
T
A
T
G
A
C
G
G
T
T
G
G
A
G
G
G
Soča
A
A
T
A
T
G
A
C
G
G
T
T
G
G
A
G
G
G
Ner.
A
A
T
/
T
G
A
C
G
A
T
T
G
G
A
G
G
G
Zeta
A
A
T
A
T
G
A
C
G
G
T
T
G
G
A
G
G
G
Otra
A
A
C
A
T
G
A
C
G
G
T
T
G
G
A
G
G
G
A
A
T
A
G
G
A
G
T
G
C
A
A
T
A
A
A
A
A
A
T
T
T
A
T
G
T
A
T
T
G
G
A
G
G
G
23
41
55
61
135
187
212
289
292
312
377
388
405
519
522
559
567
682
pmela
T
G
C
C
T
G
C
C
T
G
C
C
T
G
C
C
T
G
T
C
T
G
C
C
T
G
C
C
T
G
C
C
C
A
C
C
T
G
C
A
44
272
298
383
smtl
T
G
G
C
T
T
G
G
C
T
G
G
G
T
C
T
G
G
C
T
G
A
G
C
T
G
A
G
C
T
G
A
G
C
T
G
G
G
T
C
T
G
G
C
T
T
A
T
C
T
66
104
196
213
353
hdac1
G
G
G
G
C
G
G
G
G
G
27
fbxw4
Y
T
T
G
Y
T
T
A
Y
T
C
G
T
T
T
G
T
T
C
G
C
T
C
G
T
T
C
G
T
T
C
G
C
T
C
G
T
G
C
G
48
56
183
370
Priloga C:
Seznam genov iz cDNA knjižnice marmorirane postrvi, vključenih v različne biološke procese
GO:0008152 Metabolni proces
GenBank
Accession no.
BT048130
BT049305
BT048216
BT058870
BT057959
NM_001140596
BT048577
BT059620
BT056773
BT072233
NM_001160700
NM_001146426
BT072303
BT050391
NM_001141695
BT046477
XM_001923765
BC162502
BT045066
NM_001165047
BT060129
Geni (angleški izrazi)
peptidylprolyl isomerase B (cyclophilin B) [Salmo salar]
ribosomal protein L22-like 1 [Salmo salar]
malate dehydrogenase 2-2, NAD (mitochondrial) [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-509-232 Splicing factor arginine/serine-rich 11 putative mRNA,
complete cds
splicing factor, arginine/serine-rich 3 [Salmo salar]
ubiquitin-like protein FUBI [Salmo salar]
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
T-complex protein 1 subunit epsilon [Salmo salar]
cold inducible RNA binding protein [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-517-341 Hypoxia-inducible factor 1 alpha putative mRNA
dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit STT3A
[Oncorhynchus mykiss]
transaldolase [Salmo salar]
calpain 1, (mu/I) large subunit [Oncorhynchus mykiss]
6-phosphogluconate dehydrogenase, decarboxylating [Salmo salar]
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit E, a [Salmo salar]
ribosomal protein L9 [Salmo salar]
titin a [Danio rerio]
kit receptor a [Danio rerio]
Salmo salar clone ssal-rgf-511-028 Repressor of RNA polymerase III transcription MAF1
homolog putative mRNA, complete cds
60S ribosomal protein L31 [Oncorhynchus mykiss]
40S ribosomal protein S2 [Salmo salar]
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Accession no.
BT125291
BT045217
BT072333
NM_001140540
BT072051
NM_001146546
GO:0065007 Biološka regulacija
BT125291
XM_001923765
BT057804
BT060119
BT045217
BT048577
BT045066
BT125425
BT059031
BT072233
GO:0032501 Večcelični proces v organizmu
BT125291
NM_001141695
NM_001004110
BT125425
NM_001142717
Geni (angleški izrazi)
ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1like 2 [Salmo salar]
eukaryotic translation initiation factor 2A [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-521-207 Phosphatidylinositol-specific phospholipase C X domaincontaining protein 1 putative mRNA
DnaJ homolog subfamily B member 14 [Salmo salar]
atlastin-2 [Salmo salar]
cathepsin L1 [Salmo salar]
ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1like 2 [Salmo salar]
titin a [Danio rerio]
Salmo salar clone ssal-rgb2-644-289 Activated RNA polymerase II transcriptional
coactivator p15 putative mRNA
ferritin heavy subunit [Salmo salar]
eukaryotic translation initiation factor 2A [Salmo salar]
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-511-028 Repressor of RNA polymerase III transcription MAF1
homolog putative mRNA, complete cds
mal, T-cell differentiation protein [Salmo salar]
ferritin, heavy polypeptide 1-1 [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-517-341 Hypoxia-inducible factor 1 alpha putative mRNA
ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1like 2 [Salmo salar]
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit E, a [Salmo salar]
myosin VIb [Danio rerio]
mal, T-cell differentiation protein [Salmo salar]
gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein [Salmo salar]
se nadaljuje
nadaljevanje
GO:0050896 Odgovor na dražljaj
GenBank
Accession no.
XM_001923765
BT048577
NM_001004110
NM_001140865
XM_001923765
BT048577
BT049609
BT056773
BT072233
BT058788
Geni (angleški izrazi)
titin a [Danio rerio]
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
myosin VIb [Danio rerio]
C-C motif chemokine 25 [Salmo salar]
titin a [Danio rerio]
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-evd-530-172 Heat shock protein beta-11 putative mRNA, complete
cds
cold inducible RNA binding protein [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-517-341 Hypoxia-inducible factor 1 alpha putative mRNA
Salmo salar clone ssal-rgf-503-053 Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2 precursor
putative mRNA
GO:0032502 Proces razvoja
BT125291
NM_001141695
NM_001004110
XM_001923765
BT048577
BT125425
BC162502
ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1like 2 [Salmo salar]
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit E, a [Salmo salar]
myosin VIb [Danio rerio]
titin a [Danio rerio]
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
mal, T-cell differentiation protein [Salmo salar]
kit receptor a [Danio rerio]
GO:0051179 Lokalizacija
NM_001142717
BT060119
BT048577
BT059031
gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein [Salmo salar]
ferritin heavy subunit [Salmo salar]
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
ferritin, heavy polypeptide 1-1 [Salmo salar]
se nadaljuje
nadaljevanje
GO:0051234 Vzpostavitev lokalizacije
GO:0016043 Organizacija celične komponente
GO:0043473 Pigmentacija
GenBank
Accession no.
BT125425
NM_001140122
BT048577
NM_001142717
BT060119
BT059031
BT060076
Geni (angleški izrazi)
BT125291
NM_001142717
XM_001923765
BT125425
ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1like 2 [Salmo salar]
BC162502
NM_001141695
kit receptor a [Danio rerio]
eukaryotic translation initiation factor 3, subunit E, a [Salmo salar]
mal, T-cell differentiation protein [Salmo salar]
ER lumen protein retaining receptor 2 [Salmo salar]
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein [Salmo salar]
ferritin heavy subunit [Salmo salar]
ferritin, heavy polypeptide 1-1 [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgg-520-243 Hemoglobin subunit alpha-4 putative mRNA
gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein [Salmo salar]
titin a [Danio rerio]
mal, T-cell differentiation protein [Salmo salar]
GO:0022414 Reproduktivni proces
BT048577
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
GO:0016265 Smrt
BT125291
ubiquitin A-52 residue ribosomal protein fusion product 1like 2 [Salmo salar]
GO:0000003 Reprodukcija
BT048577
plasma retinol-binding protein 1 [Salmo salar]
GO:0044085 Biogeneza celične komponente
XM_001923765
BT057487
titin a [Danio rerio]
thymosin beta-a [Salmo salar]
se nadaljuje
nadaljevanje
GO:0002376 Proces imunskega sistema
GenBank
Accession no.
NM_001140865
BT072143
Geni (angleški izrazi)
XM_003214830
FJ710886
FJ710874
U34341
EF467297
XM_003454957
AM910409
XM_003439085
NM_001124743
mucin-5AC-like [Anolis carolinensis]
Salmo trutta 18S ribosomal RNA gene
Oncorhynchus mykiss 18S ribosomal RNA gene
Oncorhynchus mykiss 28S ribosomal RNA gene
Salmo salar clone 36P16 TCR-alpha/delta locus, genomic sequence
alpha-synuclein-like [Oreochromis niloticus]
Salmo trutta trutta complete mitochondrial genome
PREDICTED: Oreochromis niloticus hypothetical protein LOC100690432
type II keratin E1 [Oncorhynchus mykiss]
Salmo salar clone ssal-rgf-537-288 Succinate-semialdehyde dehydrogenase, mitochondrial
precursor putative mRNA, complete cds
Salmo salar clone 249L01 TCR-alpha/delta locus, genomic sequence
RNA binding motif protein 5 [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-519-116 Variant surface antigen E precursor
Salmo salar IgH locus A genomic sequence
Salmo salar 18S rRNA gene
xin actin-binding repeat-containing protein 2-like [Danio rerio]
VAMP (vesicle-associated membrane protein)-associated protein A [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-508-258 Zinc finger CCCH domain-containing protein 13 putative
mRNA
Salmo salar clone ssal-rgf-521-137 Transcriptional activator protein Pur-beta putative mRNA
hyperosmotic glycine rich protein [Salmo salar]
se nadaljuje
C-C motif chemokine 25 [Salmo salar]
ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 2 [Salmo salar]
Ostali
BT045961
EF467299
BT072055
BT072271
GU129139
AJ427629
XM_003199247
BT049882
BT072039
BT072324
AF533016
nadaljevanje
GenBank
Accession no.
NM_001003509
BT072044
XM_002663368
BT058855
BT071890
AC148606
HQ167672
HM133633
BT125516
HQ167684
BT059124
Geni (angleški izrazi)
glutamate-rich WD repeat containing 1 [Danio rerio]
myosin, heavy chain 9, non-muscle [Salmo salar]
nebulin [Danio rerio]
Salmo salar clone ssal-rgf-508-015 CD9 antigen putative mRNA
periostin, osteoblast specific factor [Salmo salar]
Gasterosteus aculeatus clone ch213-264l24
Salmo trutta voucher St002 16S ribosomal RNA gene, partial sequence; mitochondrial
Salmo salar olfactory receptor family C subfamily 4 member 2 gene
natterin-like protein [Salmo salar]
Salmo trutta voucher St004 cytochrome oxidase subunit I (COI) gene
Salmo salar clone ssal-rgf-526-272 Cytokine receptor-like factor 3 putative mRNA, complete
cds
Priloga D:
Seznam genov iz cDNA knjižnice potočne postrvi, vključenih v različne biološke procese
GenBank
Accession no.
GO:0008152 Metabolni proces
GO:0009987 Celični proces
Geni (angleški izrazi)
NM_001139763
BT060285
NM_001140843
AF465782
AM259605
NM_001165395
Salmo salar clone ssal-rgf-510-071 NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 2,
mitochondrial precursor putative mRNA
elongation factor 1 gamma [Salmo salar]
proteasome subunit beta type 7b [Salmo salar]
40S ribosomal protein S20 [Salmo salar]
Oncorhynchus mykiss ubiquinol-cytochrome c reductase core I protein mRNA
ubiquitin/ribosomal fusion protein homologue [Salmo salar]
legumain [Salmo salar]
BT060285
NM_001140843
AM259605
NM_001139763
BC165626
proteasome subunit beta type 7b [Salmo salar]
40S ribosomal protein S20 [Salmo salar]
ubiquitin/ribosomal fusion protein homologue [Salmo salar]
elongation factor 1 gamma [Salmo salar]
rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 3, like [Danio rerio]
BT045028
GO:0032501 Večcelični proces v organizmu
BT043498
creatine kinase, mitochondrial 2 (sarcomeric) [Salmo salar]
GO:0050896 Odgovor na dražljaj
L24433
BC165626
complement component C3 [Oncorhynchus mykiss]
rho guanine nucleotide exchange factor (GEF) 3, like [Danio rerio]
GO:0051179 Lokalizacija
NM_001123673
transport-associated protein [Salmo salar]
GO:0051234 Vzpostavitev lokalizacije
NM_001123673
transport-associated protein [Salmo salar]
GO:0002376 Proces imunskega sistema
L24433
complement component C3 [Oncorhynchus mykiss]
se nadaljuje
nadaljevanje
Ostali
GenBank
Accession no.
XM_003480999
BT046203
U34341
AY785950
HM159471
FJ710874
XM_002198172
HQ167672
XM_003442522
BT072251
BT125535
BT045906
BC049332
BT071961
BC047846
EU481821
BT125206
XM_003449634
HQ287747
NM_001124352
BT072149
NM_001124472
GU129140
AF247395
AF249730
Geni (angleški izrazi)
cut-like homeobox 1 [Sus scrofa]
Salmo salar clone ssal-eve-578-149 Vacuolar ATP synthase subunit e 1 putative mRNA
Oncorhynchus mykiss 28S ribosomal RNA gene
Salmo salar zonadhesin-like gene,
Salmo salar clone BAC 217E24 Foxl2 pseudogene
Oncorhynchus mykiss 18S ribosomal RNA gene
mucin 5B, oligomeric mucus/gel-forming [Taeniopygia guttata]
Salmo trutta voucher St002 16S ribosomal RNA gene, partial sequence; mitochondrial
TBC1 domain family, member 17 [Oreochromis niloticus]
Salmo salar clone ssal-rgf-518-187 Collagen alpha-1I chain precursor putative mRNA
Salmo salar clone ssal-evf-530-292 Lipocalin precursor putative mRNA
Salmo salar clone ssal-rgf-536-166 SPARC precursor putative mRNA
stromal cell derived factor 4 [Danio rerio]
Salmo salar clone ssal-rgf-505-086 Collagen alpha-2I chain precursor putative mRNA
YTH domain family 2 [Danio rerio]
Salmo salar physical map contig 483, genomic sequence
Salmo salar clone ssal-evf-501-203 60S ribosomal protein L7 putative mRNA
collagen alpha-1(V) chain-like [Oreochromis niloticus]
Coregonus clupeaformis malate dehydrogenase, cytoplasmic (MDH) gene
type II keratin E2 [Oncorhynchus mykiss]
Salmo salar clone ssal-rgf-514-006 Type II inositol-1,4,5-trisphosphate 5-phosphatase
precursor putative mRNA
14-3-3E1 protein [Oncorhynchus mykiss]
Salmo salar IgH locus B genomic sequence
Salmo trutta muscle glucose transporter mRNA
nucleolin [Oncorhynchus mykiss]
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Accession no.
BT072738
XR_117979
AF327708
XM_003443888
NM_001139728
AF074093
BT046073
BT072687
BT046051
XM_003449134
NM_001083840
BT072786
Geni (angleški izrazi)
Salmo salar clone ssal-rgf-538-304 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit B
putative mRNA
uncharacterized LOC100536523 [Danio rerio]
Salmo salar retinoic acid receptor gamma a
transcription initiation factor TFIID subunit 3-like [Oreochromis niloticus]
myosin, light polypeptide 3-3 [Salmo salar]
Salvelinus namaycush clone A1 28S ribosomal RNA gene
Salmo salar clone ssal-rgf-540-376 Transmembrane protein C1orf78 homolog putative
mRNA
astrotactin-1 [Salmo salar]
Salmo salar clone ssal-rgf-540-101 Profilin-2 putative mRNA
DENN/MADD domain containing 2C
Smith-Magenis syndrome chromosome region, candidate 7a [Danio rerio]
superkiller viralicidic activity 2-like 2 [Salmo salar]
Priloga E:
303 različno izraženi geni med marmorirano in potočno postrvjo (M vs. P)
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
CA050078
9,346 60 kDa lysophospholipase
DY704638
5,587 unknown
DY738924
5,376 unknown
EG801956
4,167 ankyrin repeat domain-containing protein 1
CB496898
3,824 barrier-to-autointegration factor
CA345164
3,802 unknown
CK990276
3,623 myosin regulatory light chain 2B, cardiac muscle isoform
CB502619
3,571 ATP-binding cassette sub-family G member 2
CB514237
3,497 60S ribosomal protein L28
CA064436
3,436 tropomyosin-1 alpha chain
CA041521
3,356 unknown
CX260531
3,257 myosin-binding protein C, fast-type
CB493388
3,155 myosin light chain 3
EG782703
3,135 pancreatic progenitor cell differentiation and proliferation factor
EG761234
3,115 heat shock protein beta-7
CA061955
3,030 60S ribosomal protein L30
CB498291
3,003 heat shock protein 30
EG787012
2,976 Oncorhynchus mykiss red muscle myosin heavy chain mRNA, partial cds
EG935298
2,959 unknown
DW536930
2,946 Salmo salar mRNA for myostatin 1b (GDF-8 gene)
EG793186
2,924 creatine kinase M-type
DW581930
2,841 novel immune type receptor [Cyprinus carpio]
CB515535
2,825 probable E3 ubiquitin-protein ligase RNF144A-A
CX719038
2,809 LOC407656 protein [Danio rerio]
DY734144
2,740 unknown
EG812773
2,725 unknown
EG922597
2,703 Danio rerio zinc and ring finger 1 (znrf1), mRNA
EG773994
2,632 heat shock protein beta-11
DY734725
2,625 unknown
DY733317
2,618 unknown
EG880346
2,604 unknown
CK990224
2,597 ATP synthase subunit g, mitochondrial
DW543360
2,577 unknown
DW567719
2,564 unknown
CA054657
2,564 unknown
CK990885
2,513 glutamine synthetase, mitochondrial precursor
CB510827
2,445 collagen alpha-1(X) chain precursor
EG889310
2,445 polycomb complex protein BMI-1-B
succinate dehydrogenase [ubiquinone] iron-sulfur subunit, mitochondrial
EG804107
2,439
precursor
DW553405
2,410 XK-related protein 4
DY735594
2,404 secretogranin II [Ctenopharyngodon idella]
EG923425
2,404 unknown
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
DY719234
2,404 unknown
EG896170
2,387 CG32603
CA063945
2,364 asparaginyl-tRNA synthetase, cytoplasmic
EG904563
2,353 G patch domain and KOW motifs-containing protein
EG847959
2,347 CD276 antigen precursor
DY733311
2,347 unknown
EG817556
2,336 fibrinogen-like protein 1 precursor
EG767125
2,331 long-chain-fatty-acid--CoA ligase ACSBG2
Homo sapiens dual-specificity tyrosine-(Y)-phosphorylation regulated kinase
CB493936
2,309
1A (DYRK1A), transcript variant 2, mRNA
DW578121
2,304 protein DGCR14
PREDICTED: similar to Cytochrome c oxidase polypeptide VIII-heart,
CA037332
2,299
mitochondrial precursor (Cytochrome c oxidase subunit 8-1) [Danio rerio]
EG900636
2,283 mitochondrial 28S ribosomal protein S33
FC072825
2,278 unknown
CK990660
2,273 unknown
CB502129
2,257 acidic mammalian chitinase precursor
CA055788
2,255 6-phosphofructokinase type C
CK990883
2,252 hemoglobin subunit beta-2
DW571456
2,242 unknown
CA054422
2,232 AMP deaminase 2
EG854610
2,232 unknown
CA361992
2,217 unknown
DW575569
2,215 65787 pfam02029, Caldesmon, Caldesmon,,
CA052401
2,212 69843 pfam06346, Drf_FH1, Formin Homology Region 1
CB508780
2,212 unknown
CA060680
2,208 Nucleolar GTP-binding protein 2
DY729360
2,208 Uncharacterized protein C20orf96
EG823993
2,198 unknown
DY701957
2,193 inner centromere protein
CA062832
2,174 unknown
DW554700
2,165 unknown
CB496664
2,160 myelin expression factor 2
CB497374
2,155 complement C3-1
CA064277
2,151 hemoglobin subunit alpha
PREDICTED: Bos taurus similar to estrogen-related receptor gamma,
EG818215
2,151
transcript variant 2 (LOC536732), mRNA
CX028894
2,151 unknown
DW541110
2,146 unknown
CB507815
2,141 unknown
CK991308
2,132 ATP synthase lipid-binding protein, mitochondrial precursor
DY696685
2,132 interferon-stimulated 20 kDa exonuclease-like 2
CA057346
2,128 DUF1445 family protein
EG819628
2,128 unknown
EG775910
2,123 myosin-6
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
EG820756
2,123 titin
CB500571
2,123 unknown
45784 pfam05891, DUF858, Eukaryotic protein of unknown function
CB494688
2,119
(DUF858)
EG861088
2,119 retinoid-binding protein 7
CB514370
2,119 tripartite motif-containing protein 16
EG839623
2,083 unknown
CB511884
2,075 MIT domain-containing protein 1
CB499530
2,066 gamma-adducin
CA768258
2,062 guanylin precursor
CA062412
2,058 serine protease HTRA1 precursor
DY713638
2,058 UDP-GlcNAc:betaGal beta-1,3-N-acetylglucosaminyltransferase 5A
FC072790
2,058 unknown
DW556328
2,053 hematopoietically-expressed homeobox protein hhex
CX029838
2,053 PREDICTED: similar to ubiquitin specific protease 11 [Danio rerio]
EG756203
2,053 zinc finger protein 436
CK990597
2,049 unknown
FC072859
2,041 AF228581_1 IgM-B heavy chain constant region [Salmo trutta]
CK990361
2,028 unknown
DY732776
2,024 unknown
CB493676
2,020 gamma-crystallin M3
DW583303
2,008 unknown
CB516976
2,004 28982 cd00099, IGv, Immunoglobulin domain variable region (v) subfamily
CB499194
2,004 5-aminolevulinate synthase, nonspecific, mitochondrial precursor
CB506497
2,004 cytochrome c oxidase polypeptide VIIb2, mitochondrial precursor
EG766310
2,004 Kelch domain-containing protein 6
CB516715
2,000 unknown
DY705370
0,500 unknown
CB514731
0,499 putative heparin-binding growth factor 1
CA054240
0,498 DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1
CX261344
0,497 45217 pfam05316, VAR1, Mitochondrial ribosomal protein (VAR1)
CA061476
0,497 60S ribosomal protein L23
DY716344
0,496 unknown
DY713086
0,495 isochorismatase domain-containing protein 1
CA049936
0,495 unknown
DW566116
0,494 unknown
CA053174
0,494 unknown
DW569709
0,493 exportin-1
CA062279
0,493 unknown
CK990700
0,492 unknown
DY695505
0,492 unknown
CA043157
0,490 U4/U6 small nuclear ribonucleoprotein Prp4
CA060942
0,489 alpha-L-iduronidase precursor
DY740307
0,489 unknown
CA056106
0,489 serine/threonine-protein kinase OSR1
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
EG845489
0,488 Krev interaction trapped protein 1
CA057360
0,485 leukocyte surface antigen CD53
CB509763
0,483 activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15
CX032626
0,482 unknown
EG829520
0,478 guanine nucleotide-binding protein G(q) subunit alpha
CA042507
0,478 actin, cytoplasmic 1
CB517751
0,478 unknown
DY734880
0,476 unknown
CA047956
0,473 GCN1-like protein 1
DY709433
0,472 coagulation factor V precursor
CA058162
0,471 cysteine and glycine-rich protein 1
CA056843
0,466 probable E3 ubiquitin-protein ligase HECTD2
CB498819
0,466 transposable element Tcb1 transposase
CB492926
0,465 keratin, type II cytoskeletal 8
EG803753
0,464 unknown
EG783635
0,464 unknown
CA040183
0,464 septin-7
EG939074
0,461 unknown
CB517738
0,460 unknown
EG832177
0,459 vacuolar protein sorting-associated protein 18 homolog
EG760311
0,459 lecithin retinol acyltransferase
DW566877
0,458 protein BTG1
DW575140
0,458 unknown
DW555613
0,456 unknown
EG931957
0,453 unknown
CA050348
0,453 Oncorhynchus mykiss anp mRNA for atrial natriuretic peptide, complete cds
CA058685
0,453 60S ribosomal protein L35a
CA051349
0,451 complement C1q tumor necrosis factor-related protein 2 precursor
DY719895
0,451 copia protein
DY739964
0,449 probable ATP-dependent RNA helicase DDX5
34653 COG5048, COG5048, FOG: Zn-finger [General function prediction
CA060438
0,449
only],
CK991027
0,445 T-complex protein 1 subunit epsilon
CB515417
0,442 protein HEXIM
CA060968
0,440 60S ribosomal protein L18a
DY708413
0,439 protein FAM44B
EG942780
0,439 mucin-like protein 1 precursor
CA053420
0,438 Ig kappa-b4 chain C region
CA055707
0,437 uncharacterized protein CXorf38 homolog
CX026853
0,436 29261 cd00204, ANK, ankyrin repeats
CA767874
0,436 epithelial cadherin precursor
CA043909
0,436 probable carboxypeptidase PM20D1 precursor
DY705780
0,435 45362 pfam05462, Dicty_CAR, Slime mold cyclic AMP receptor
Oncorhynchus mykiss OSU-142 tapasin-B (TAPBP) pseudogene, partial
DW558454
0,434
sequence
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
CB515760
0,433 coatomer subunit gamma-2
DY693698
0,432 X/potassium-transporting ATPase subunit beta-m
CA062894
0,428 unknown
DY703649
0,428 unknown
CA059122
0,427 unknown
DW556098
0,412 probable ATP-dependent RNA helicase DDX59
CA056277
0,411 60S ribosomal protein L32
EG938590
0,411 microtubule-actin cross-linking factor 1, isoform 4
DW577566
0,411 TBC1 domain family member 15
CA050472
0,411 unknown
DW547498
0,410 unknown
CB501475
0,408 ubiquitin
CA063821
0,406 NMDA receptor-regulated protein 1
CA061601
0,405 unknown
DW564098
0,403 cell division cycle-associated protein 7
CA044684
0,403 protein NipSnap homolog 2
EG864724
0,401 cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1
DY738818
0,398 unknown
DW569099
0,397 unknown
CA053440
0,395 1-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2
CB503310
0,394 rab GDP dissociation inhibitor beta
CB511037
0,394 intestinal mucin-like protein
EG919346
0,392 ictacalcin
CA044041
0,390 Oncorhynchus mykiss C5a receptor mRNA, complete cds
CB510331
0,387 D-dopachrome decarboxylase
CA050090
0,386 guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1
CB489812
0,386 Oncorhynchus kisutch 5S ribosomal RNA gene, partial sequence
DW537606
0,386 unknown
EG797651
0,386 unknown
DY724897
0,385 unknown
EG787335
0,383 coiled-coil domain-containing protein 23
EG923005
0,382 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 5
CK990698
0,382 unknown
CK990492
0,376 sodium/potassium-transporting ATPase subunit alpha-1 precursor
EG765038
0,375 Oncorhynchus mykiss cyp19b-I gene for P450aromB-I, exons 1-10
DW547663
0,375 unknown
CA059056
0,373 6-phosphogluconolactonase
EG905662
0,372 retrotransposable element Tf2 155 kDa protein type 1
EG850121
0,370 oxysterol-binding protein-related protein 3
DW554417
0,370 unknown
DY695166
0,369 unknown
CA043522
0,368 polyadenylate-binding protein 1
CB507638
0,362 unknown
AF180483 Salmo salar clone BA5 beta-2 microglobulin (B2m) mRNA, partial
CK990695
0,361
cds
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
CA063903
0,358 unknown
CB489118
0,358 dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2
CA063656
0,357 cyclin-L1
DW551519
0,353 E3 ubiquitin-protein ligase RNF128 precursor
CB494127
0,349 nuclear RNA export factor 1
EG933537
0,347 syntaxin-5
EG879541
0,346 sickle tail protein homolog
CA052388
0,345 MKI67 FHA domain-interacting nucleolar phosphoprotein-like
DY702637
0,345 RNA-binding protein 45
CA049935
0,345 GTP-binding protein 10
0,343 estrogen receptor alpha
CA042402
0,340 apolipoprotein B-100 precursor
CA040798
0,338 intermediate filament protein ON3
DW544953
0,336 unknown
EG942962
0,335 Ig kappa chain V region K29-213
0,333 unknown
CB489777
0,328 transposable element Tc1 transposase
CA050789
0,327 unknown
CB494380
0,327 26S protease regulatory subunit S10B
EG883461
0,324 homeobox protein MSX-2
EG851913
0,321 coregonus artedi growth hormone II gene, intron d
CA059587
0,319 unknown
DY712936
0,318 unknown
CA770673
0,310 unknown
CB515823
0,300 dipeptidyl-peptidase 3
CA062105
0,300 zinc finger protein 622
DY723322
0,298 nuclear distribution protein nudE-like 1-B
DY740533
0,295 unknown
CX251659
0,294 unknown
DW579682
0,290 next to BRCA1 gene 1 protein
EG799425
0,287 keratin, type I cytoskeletal 13
DY727898
0,286 unknown
CK990245
0,278 60S ribosomal protein L38
CA042106
0,278 39S ribosomal protein L46, mitochondrial precursor
DW561222
0,269 uncharacterized protein KIAA0406
DW549765
0,265 bromodomain-containing protein 3
EG875944
0,259 DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1
CB518116
0,256 spectrin alpha chain, brain
CB516848
0,254 nuclear factor erythroid 2-related factor 2
DW579291
0,251 isoleucyl-tRNA synthetase, cytoplasmic
DY717867
0,249 claudin domain-containing protein 1
CB516803
0,247 unknown
DW558977
0,246 calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase 2
CA043326
0,239 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K
DW552631
0,232 unknown
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
DY693343
0,229 TBC1 domain family member 2A
EG844738
0,219 butyrophilin subfamily 1 member A1 precursor
DW574326
0,207 fidgetin-like protein 1
CA063654
0,193 unknown
CA058232
0,185 spermatogenesis-associated protein 2
CB499544
0,174 TAR DNA-binding protein 43
CB510609
0,163 eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J
CX246341
0,157 unknown
CB492049
0,147 probable histone deacetylase 1-B
CB517914
0,122 methylosome subunit pICln
DW578963
0,121 liprin-alpha-4
EG773721
0,117 unknown
DY725946
0,113 Oncorhynchus mykiss genes, MHC class I b region, complete cds
CB500108
0,090 60S ribosomal protein L35
CA061047
0,074 unknown
CA062838
0,066 unknown
DY732026
0,064 zinc finger SWIM domain-containing protein 6
CA057913
0,047 unknown
CA063986
0,039 signal recognition particle 54 kDa protein
CA062046
0,034 unknown
CA061046
0,030 unknown
Priloga F:
240 različno izraženih genov med F3 križanci in potočno postrvjo (K vs. P)
GenBank
Accession
no.
CA053911
Raven
Gen (angleški izrazi)
izražanja
25,907
CB491795
19,646
DY726481
CA040614
CX041826
CB510193
CK990871
CA057620
DW537469
CA038735
DW584078
DW545180
CB488562
DY733707
CB516151
CB502619
EG761234
CB499743
DW564443
EG935728
DW551849
DY735594
DY728208
CA054215
EG870747
DW578490
DW566733
DW576375
DW581582
CB514950
CB511124
EG942217
EG922808
DW553028
DW569954
DW578121
DW577823
EG829779
CA052401
CA063945
DY706928
18,939
10,235
7,692
6,623
6,061
5,780
5,556
5,495
5,263
5,128
4,808
4,717
4,425
3,968
3,802
3,546
3,497
3,484
3,436
3,300
3,195
3,195
3,115
3,086
3,067
3,067
3,058
3,030
2,994
2,994
2,924
2,924
2,907
2,907
2,899
2,890
2,882
2,882
2,882
cingulin
AF329716 Oncorhynchus mykiss clone OSU9 T cell receptor beta chain
variable region gene, partial cds
S-adenosylmethionine synthetase isoform type-2
unknown
PREDICTED: similar to kelch-like 17 [Danio rerio]
C-jun-amino-terminal kinase-interacting protein 4
collagenase 3 precursor
unknown
unknown
tRNA selenocysteine-associated protein 1
unknown
unknown
unknown
hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2
frizzled-9 precursor
ATP-binding cassette sub-family G member 2
heat shock protein beta-7
mitochondrial ribosomal protein S23
ORF2-encoded protein [Danio rerio]
unknown
phospholipase A-2-activating protein
secretogranin II [Ctenopharyngodon idella]
sialidase
spermine synthase
proto-oncogene tyrosine-protein kinase MER precursor
unknown
unknown
unknown
G1/S-specific cyclin-D1
unknown
sarcoplasmic reticulum histidine-rich calcium-binding protein precursor
unknown
1-phosphatidylinositol phosphodiesterase precursor
unknown
AF290477_1 VIG-2 [Oncorhynchus mykiss]
protein DGCR14
unknown
unknown
69843 pfam06346, Drf_FH1, Formin Homology Region 1
asparaginyl-tRNA synthetase, cytoplasmic
unknown
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
a, thaliana ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit
U91966
2,825
(521 bp) (rbcL)
DW558420
2,825
unknown
EG859447
2,809
lin-9 homolog
unknown
EG908406
2,717
unknown
DY705262
2,717
unknown
DY709961
2,667
DW560998
2,611
GTPase IMAP family member 7
DY738668
2,584
L-dopachrome tautomerase precursor
EG877610
2,577
uncharacterized protein C9orf85 homolog
CB502402
2,519
glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
unknown
DY734725
2,519
unknown
CA062880
2,500
EG793873
2,488
myosin light chain 4
CX031514
2,475
47046 pfam07162, B9, B9 protein
CB514237
2,445
60S ribosomal protein L28
EG873768
2,445
tissue-type plasminogen activator precursor
EG799196
2,439
probable C->U-editing enzyme APOBEC-2
CB496540
2,415
40S ribosomal protein S3-B
EG773994
2,381
heat shock protein beta-11
CA053171
2,381
RING finger protein 213
CB510312
2,370
protein C14orf166
DW553405
2,370
XK-related protein 4
CA048127
2,358
unknown
CB510634
2,353
putative ferric-chelate reductase 1
CA052608
2,347
unknown
DW550814
2,326
nucleoredoxin
DY697849
2,315
MAGUK p55 subfamily member 6
DY728171
2,315
structural maintenance of chromosomes protein 4
unknown
DY696295
2,315
unknown
EG873532
2,294
DW567737
2,262
SH3 domain-binding protein 2
CA059312
2,262
unknown
CB512509
2,257
B-cell receptor-associated protein 29
CA047151
2,252
40S ribosomal protein S21
CA059107
2,247
leukocyte elastase inhibitor
EG758498
2,247
unknown
CB499798
2,242
myb-binding protein 1A-like protein
DW541110
2,242
unknown
CX029838
2,232
PREDICTED: similar to ubiquitin specific protease 11 [Danio rerio]
CB500571
2,232
unknown
CA049845
2,227
small ubiquitin-related modifier 1 precursor
EG785785
2,227
unknown
CB510364
2,222
eukaryotic translation initiation factor 1A, X-chromosomal
CA050739
2,222
unknown
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
Oncorhynchus mykiss nonclassical MHC class I antigen (Onmy-LAA) gene,
CA050351
2,217
Onmy-LAA*0101 allele, complete cds
EG942614
2,212
31389 COG1196, Smc, Chromosome segregation ATPases
EG756203
2,212
zinc finger protein 436
EG929910
2,183
unknown
CB510693
2,179
vacuolar protein sorting-associated protein 26A
CA060680
2,169
nucleolar GTP-binding protein 2
EG830931
2,169
unknown
DY715277
2,165
uncharacterized protein C15orf29
EG854893
2,160
homeobox protein Hox-A2a
EG887103
2,155
unknown
CB498291
2,146
heat shock protein 30
EG807127
2,141
unknown
CA052236
2,132
vasculin-like protein 1
CA059583
2,114
CG10958
CX260531
2,110
myosin-binding protein C, fast-type
DY724301
2,110
neurofascin precursor
CB512768
2,105
succinate-semialdehyde dehydrogenase, mitochondrial precursor
CB511877
2,096
ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 48
unknown
DY715510
2,096
unknown
CB511698
2,092
CA055521
2,083
CCAAT/enhancer-binding protein beta
CA044290
2,075
unknown
EG787012
2,070
Oncorhynchus mykiss red muscle myosin heavy chain mRNA, partial cds
EG909708
2,066
zinc finger protein 234
Oncorhynchus mykiss metal response element-binding transcription factor
DY718486
2,062
isoform H (MTF) mRNA, complete cds; alternatively spliced
FC072851
2,058
unknown
CB517033
2,049
adenosine 3'-phospho 5'-phosphosulfate transporter 2
EG900636
2,041
mitochondrial 28S ribosomal protein S33
DW567233
2,037
90258 pfam05699, hATC, hAT family dimerisation domain
CB511884
2,037
MIT domain-containing protein 1
DY740487
2,016
stereocilin precursor
unknown
CA053026
2,016
unknown
EG824881
2,008
DW581558
2,004
hydroxymethylglutaryl-CoA lyase, mitochondrial precursor
CA051467
2,004
nuclear nucleic acid-binding protein C1D
EG810930
1,126
45217 pfam05316, VAR1, Mitochondrial ribosomal protein (VAR1)
DW545429
0,716
34653 COG5048, COG5048, FOG: Zn-finger
CB492567
0,500
phosphate carrier protein, mitochondrial precursor
EG896190
0,500
unknown
EG755225
0,499
poly(ADP-ribose) glycohydrolase
EG935300
0,498
Oncorhynchus mykiss genes, MHC class I b region, complete cds
CA058685
0,497
60S ribosomal protein L35a
CA052620
0,494
plasma membrane calcium-transporting ATPase 3
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
unknown
EG760086
0,494
unknown
DY695166
0,494
unknown
CB508781
0,494
CB498535
0,493
collagen alpha-3(VI) chain precursor
CA059056
0,487
6-phosphogluconolactonase
CB509794
0,486
retinoblastoma-binding protein 8
CN442556
0,486
NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 2
CB509763
0,485
activated RNA polymerase II transcriptional coactivator p15
coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 3,
CB517061
0,484
mitochondrial precursor
EG905675
0,481
45362 pfam05462, Dicty_CAR, Slime mold cyclic AMP receptor
unknown
EG794104
0,477
unknown
CB496957
0,476
DW559355
0,476
nucleolar complex protein 3 homolog
CA054760
0,474
unknown
CA064538
0,473
protein NEL precursor
CA056406
0,472
transmembrane protease, serine 2
EG789782
0,472
RING finger protein 133
unknown
CX032870
0,465
unknown
CA059801
0,464
CA047661
0,464
guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-3
EG797651
0,461
unknown
DY713883
0,459
protein SLC7A6OS
CB492747
0,458
hemoglobin embryonic subunit alpha
DY740417
0,456
actin filament-associated protein 1-like 1
unknown
CB498270
0,455
unknown
CA053482
0,453
unknown
CA045462
0,450
unknown
CB508518
0,449
CA063656
0,449
cyclin-L1
CA770402
0,448
60S ribosomal protein L15
CA042023
0,447
Ig kappa chain V-V region MOPC 21 precursor
unknown
DY703998
0,446
unknown
DY724897
0,437
CB509453
0,437
60S ribosomal protein L3
DY703649
0,436
unknown
CB499582
0,435
lamin-B2
CK990278
0,433
Oncorhynchus mykiss invariant chain S25-7 mRNA, complete cds
CA045252
0,433
unknown
CX026190
0,432
insulin-like growth factor-binding protein 4 precursor
DY735470
0,428
P2Y purinoceptor 5
CB496450
0,427
MGC79016 protein [Xenopus laevis]
CA042310
0,427
unknown
EG904117
0,425
neuronal calcium sensor 1
unknown
EG790694
0,424
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
unknown
CA061601
0,417
CB496691
0,415
ATP synthase subunit alpha, mitochondrial precursor
CB492815
0,412
zinc finger HIT domain-containing protein 3
unknown
CK991114
0,403
CA054240
0,399
DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1
CX151881
0,399
homeobox protein Nkx-3,2
unknown
CB504376
0,397
unknown
CA057114
0,396
unknown
DY739487
0,393
unknown
CB502332
0,386
CX253777
0,386
vascular cell adhesion protein 1 precursor
EG863202
0,386
unknown
CX254486
0,383
BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 3
DW546492
0,373
unknown
CA054578
0,371
RNA-binding protein with multiple splicing
CB511749
0,368
bifunctional purine biosynthesis protein PURH
CB497358
0,368
ADP/ATP translocase 2
DW579682
0,363
next to BRCA1 gene 1 protein
CX251659
0,357
unknown
CK990912
0,350
trypsin precursor
DY720073
0,348
unknown
CA362783
0,340
solute carrier family 35 member E1
CA038358
0,332
proteasome subunit alpha type-2
unknown
CA063471
0,316
unknown
CA053884
0,315
DY722639
0,310
hypoxia-inducible factor 1 alpha
CB492485
0,299
collagen alpha-2(I) chain precursor
CA051937
0,298
unknown
CA062105
0,296
zinc finger protein 622
EG802680
0,295
collagen alpha-1(I) chain precursor
CX033217
0,294
PREDICTED: similar to FNBP4 protein [Danio rerio]
CA056666
0,293
splicing factor, arginine/serine-rich 16
unknown
DY735312
0,284
unknown
DY727614
0,264
CX248622
0,247
uroplakin-1b
CB487733
0,246
clusterin precursor
CB499544
0,241
TAR DNA-binding protein 43
CA051679
0,241
sorting nexin-1
CB499706
0,236
transposable element Tcb1 transposase
DW559010
0,233
H-2 class I histocompatibility antigen, Q10 alpha chain precursor
EG773721
0,224
unknown
CA050114
0,218
myosin-9
DW550026
0,208
nudC domain-containing protein 1
CB497924
0,201
galectin-2
CB497935
0,194
collagen alpha-1(XVIII) chain precursor
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
CA044982
0,186
ES1 protein homolog, mitochondrial precursor
unknown
DY727898
0,186
unknown
DW537484
0,181
DW578963
0,151
liprin-alpha-4
DW574326
0,139
fidgetin-like protein 1
CB492049
0,123
probable histone deacetylase 1-B
CB512691
0,027
glycogen phosphorylase, muscle form
Priloga G:
305 različno izraženih genov med marmorirano postrvjo in F3 križanci (M vs. K)
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
CA051679
4,824 sorting nexin-1
EG813037
4,580 phytanoyl-CoA dioxygenase, peroxisomal precursor
DY727614
4,480 unknown
CK991282
4,290 protein CutA homolog precursor
CB493496
4,029 44795 pfam04889, Cwf_Cwc_15, Cwf15/Cwc15 cell cycle control protein
CA041521
3,921 unknown
CB510137
3,880 unknown
CX717629
3,739 wu:fj80h11 protein [Danio rerio]
CA057340
3,725 zinc transporter ZIP3
EG798486
3,665 unknown
EG802680
3,552 collagen alpha-1(I) chain precursor
CB510670
3,462 unknown
CB512528
3,459 86791 pfam05110, AF-4, AF-4 proto-oncoprotein
CA372174
3,447 ryanodine receptor 3
CA362783
3,419 solute carrier family 35 member E1
EG904117
3,296 neuronal calcium sensor 1
CA054578
3,267 RNA-binding protein with multiple splicing
EG841242
3,223 caspase recruitment domain-containing protein 6
CX248622
3,210 uroplakin-1b
CA057457
3,202 lysosome-associated membrane glycoprotein 3 precursor
CB493770
3,122 arginase-1
CA051941
3,032 peptidyl-prolyl cis-trans isomerase H
CB493730
3,008 beta-crystallin B2
CA063034
3,002 transient receptor potential cation channel subfamily M member 5
CA044982
2,967 ES1 protein homolog, mitochondrial precursor
CB508925
2,958 galactocerebrosidase precursor
DW542119
2,957 unknown
DW582576
2,932 EGF-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 precursor
DY733929
2,907 unknown
coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain-containing protein 3, mitochondrial
CB517061
2,903
precursor
Oncorhynchus mykiss MHC class Ib antigen (UDA) mRNA, UDA*0102 allele,
CA044407
2,899
complete cds
CX254486
2,890 BRCA1/BRCA2-containing complex subunit 3
CA059026
2,873 cytochrome b5 domain-containing protein 2
CA060971
2,821 signal peptide peptidase-like 2A
asparagine-linked glycosylation 8 homolog (yeast, alpha-1,3DY739736
2,809
glucosyltransferase)
CK991084
2,789 unknown
CX251456
2,763 unknown
CA051937
2,752 unknown
CA037887
2,719 maleylacetoacetate isomerase
CA054820
2,702 unknown
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
EG795837
2,695 unknown
CA063798
2,693 hepatocyte growth factor activator precursor
CB496450
2,670 MGC79016 protein [Xenopus laevis]
CA055626
2,660 isoleucyl-tRNA synthetase, cytoplasmic
DW551302
2,592 ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 2
EG905121
2,574 relaxin-3
CB515588
2,568 upstream stimulatory factor 1
PREDICTED: Danio rerio similar to hCG1982388,, transcript variant 5
CB496396
2,546
(LOC563327), mRNA
CA059190
2,481 leukotriene B4 receptor 1
CA050289
2,454 retrograde Golgi transport protein RGP1 homolog
CB492485
2,436 collagen alpha-2(I) chain precursor
CB492815
2,418 zinc finger HIT domain-containing protein 3
CB494221
2,415 inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H2 precursor
EG911726
2,406 unknown
CA062164
2,377 fibronectin type III and SPRY domain-containing protein 1
CA054610
2,364 COP9 signalosome complex subunit 6
CA057584
2,344 complement factor D precursor
EG790138
2,320 unknown
CB513869
2,313 unknown
EG795869
2,312 titin
CB514313
2,296 delta-like protein B precursor
EG770840
2,295 unknown
CB511869
2,293 rhombotin-2
CB494563
2,292 unknown
CX140491
2,287 alpha-1,6-mannosylglycoprotein 6-beta-N-acetylglucosaminyltransferase A
CA059803
2,283 acetyl-coenzyme A synthetase, cytoplasmic
CB518091
2,279 general transcription factor 3C polypeptide 6
DY733452
2,266 oligonucleotide/oligosaccharide-binding fold-containing protein 1
CA055217
2,232 putative uncharacterized protein C7orf47
EG776901
2,225 epidermal retinal dehydrogenase 2
CA051864
2,215 protein OS-9 precursor
CB510432
2,214 bolA-like protein 2
CX151881
2,209 homeobox protein Nkx-3,2
CA053515
2,206 zinc finger MYM-type protein 1
EG887753
2,184 unknown
CA052648
2,176 trans-1,2-dihydrobenzene-1,2-diol dehydrogenase
CA047235
2,163 unknown
CA038358
2,160 proteasome subunit alpha type-2
CA057020
2,160 unknown
CA052426
2,154 deoxyhypusine synthase
DW551526
2,153 unknown
CX253418
2,148 unknown
EG856755
2,145 unknown
DW542862
2,142 long-chain fatty acid transport protein 1
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
CA060212
2,138 immunoglobulin lambda-like polypeptide 1 precursor
EG921145
2,137 U4/U6,U5 tri-snRNP-associated protein 3
CA056997
2,132 protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2
EG904563
2,116 G patch domain and KOW motifs-containing protein
DW545410
2,115 hemicentin-1 precursor
DW553982
2,113 putative adenylate kinase-like protein C9orf98 homolog
CB501465
2,111 collagen alpha-2(V) chain precursor
CA060748
2,103 histone-lysine N-methyltransferase, H3 lysine-9 specific 3
DW566879
2,103 unknown
EG867023
2,101 vascular endothelial growth factor D precursor
CA062412
2,086 serine protease HTRA1 precursor
CB500891
2,086 unknown
EG920887
2,082 interferon-induced GTP-binding protein Mx
CB515632
2,078 serine/threonine-protein kinase 25
CX246509
2,075 ribosome assembly protein 1
DW545739
2,072 unknown
CK990778
2,071 type-4 ice-structuring protein precursor
CA052622
2,067 unknown
CA050701
2,066 class B basic helix-loop-helix protein 2
EG778196
2,064 unknown
CA063094
2,059 39S ribosomal protein L28, mitochondrial precursor
CB497158
2,059 transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 precursor
DW572225
2,059 unknown
CB493954
2,045 NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 beta subcomplex subunit 7
CA057192
2,044 caprin-1
CA053169
2,039 unknown
EG771113
2,020 unknown
CB510652
2,016 protein NipSnap homolog 2
CB498482
2,012 ependymin precursor
CB493612
2,011 ATP synthase subunit a
Oncorhynchus mykiss tnfrsf1a-associated via death domain protein mRNA,
DW578803
2,009
complete cds
CB514415
2,006 WD40 repeat-containing protein SMU1
EG865809
2,003 unknown
CX149892
1,522 45217 pfam05316, VAR1, Mitochondrial ribosomal protein (VAR1)
CB500673
1,071 45362 pfam05462, Dicty_CAR, Slime mold cyclic AMP receptor
34653 COG5048, COG5048, FOG: Zn-finger [General function prediction
EG827321
0,993
only],
CB515747
0,498 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein Q
DY709188
0,498 unknown
EG838712
0,496 transcription factor Sox-2
CA387360
0,495 importin subunit alpha-4
DY733115
0,493 tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 5
DW540374
0,493 unknown
EG875440
0,490 interleukin-10 receptor beta chain precursor
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
CB492945
0,490 transmembrane emp24 domain-containing protein 10 precursor
DY728208
0,489 sialidase
CB515231
0,488 60S ribosomal protein L18
CB498959
0,488 EH domain-containing protein 1
DY713355
0,483 unknown
DW548996
0,482 protein tyrosine phosphatase-like protein ptplad1
EG756513
0,482 unknown
CA052111
0,481 60S ribosomal export protein NMD3
Oncorhynchus mykiss Onmy-LDA gene for MHC class I antigen, allele:
DY696044
0,480
Onmy-LDA*0101, and other genes, complete cds
CB511609
0,479 cathepsin L1 precursor
BU965663
0,478 transcription elongation factor B polypeptide 1
EG785738
0,475 unknown
DW553249
0,473 coatomer subunit gamma-2
CA062092
0,471 unknown
DW555694
0,471 unknown
DW561066
0,471 unknown
CA048454
0,470 guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1
EG935746
0,470 unknown
CA039636
0,470 unknown
CB493119
0,469 40S ribosomal protein S13
DW583494
0,469 endoplasmic reticulum metallopeptidase 1
DY707603
0,469 unknown
CA052578
0,469 unknown
CA053412
0,468 cytosolic non-specific dipeptidase
Bos taurus B-cell translocation gene 1, anti-proliferative, mRNA (cDNA clone
CA052552
0,467
MGC:148375 IMAGE:8183557), complete cds
DY700075
0,466 cartilage acidic protein 1 precursor
EG877610
0,463 uncharacterized protein C9orf85 homolog
DY739651
0,458 tumor necrosis factor receptor superfamily member 13B
CA056832
0,458 unknown
DY696187
0,456 unknown
CA063718
0,451 unknown
CB499764
0,450 SMEK homolog 1
CB497704
0,449 prefoldin subunit 2
CA053896
0,448 coagulation factor V precursor
CA052218
0,448 protein MAL2
EG870882
0,447 calponin-3
DW564098
0,447 cell division cycle-associated protein 7
EG831300
0,446 uncharacterized protein C14orf119 homolog
EG887103
0,443 unknown
CA052102
0,442 cell division cycle protein 23 homolog
CA056294
0,440 unknown
CA058162
0,439 cysteine and glycine-rich protein 1
DY716300
0,438 phospholipase A2, major isoenzyme precursor
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
EG833484
0,437 alpha-parvin
EG882525
0,435 unknown
EG863963
0,434 glioma tumor suppressor candidate region gene 2 protein
CX030842
0,428 protein FRG1
EG818867
0,428 transposable element Tc1 transposase
DY725729
0,427 PREDICTED: Danio rerio hypothetical LOC571621 (LOC571621), mRNA
DW568561
0,426 unknown
CA059367
0,425 Salmo salar zonadhesin-like gene, complete cds and 3' UTR
CB499822
0,424 programmed cell death protein 5
EG926876
0,424 unknown
EG851345
0,424 unknown
DY707058
0,423 unknown
CA359994
0,421 ubiquitin-conjugating enzyme E2 A
DY719895
0,414 copia protein
0,410 unknown
CA040183
0,409 septin-7
DW577298
0,408 histone-lysine N-methyltransferase SETDB1-B
PREDICTED: Danio rerio similar to RAD23 homolog B (S. cerevisiae)
EG863400
0,408
(LOC100003172), mRNA
CB516592
0,408 unknown
CA057832
0,407 unknown
DY706021
0,405 pre-mRNA-processing factor 40 homolog A
CA056536
0,405 probable Bax inhibitor 1
DY702356
0,405 unknown
CA062975
0,405 unknown
CA043326
0,404 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K
DY739625
0,403 unknown
EG757600
0,400 unknown
CA052608
0,399 unknown
DW544501
0,397 unknown
EG942744
0,396 unknown
EG837206
0,394 unknown
EG862097
0,394 unknown
EG863061
0,393 unknown
EG796503
0,391 GTPase IMAP family member 7
DY723322
0,390 nuclear distribution protein nudE-like 1-B
CA040587
0,388 forkhead box protein P4
CA052294
0,385 eukaryotic translation initiation factor 3 subunit J
CB509809
0,381 alanyl-tRNA synthetase, cytoplasmic
EG891624
0,371 unknown
DW550012
0,367 recoverin
DY738818
0,366 unknown
CB497640
0,365 lysosomal acid lipase/cholesteryl ester hydrolase precursor
EG929467
0,365 unknown
EG879541
0,363 sickle tail protein homolog
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
EG936981
0,362 FK506-binding protein 5
CA059018
0,360 brain protein 44-like protein
CB497864
0,360 PRA1 family protein 3
EG942962
0,352 Ig kappa chain V region K29-213
DW549759
0,351 zinc-binding protein A33
CB513714
0,349 zinc finger protein ubi-d4
DW576815
0,348 tripartite motif-containing protein 35
CB516848
0,347 nuclear factor erythroid 2-related factor 2
EG845411
0,346 uncharacterized protein F13E9,13, mitochondrial precursor
CB515823
0,345 dipeptidyl-peptidase 3
EG875528
0,343 periplakin
CA360146
0,343 unknown
DY697849
0,341 MAGUK p55 subfamily member 6
DW582629
0,339 unknown
DY705699
0,335 unknown
EG942614
0,334 31389 COG1196, Smc, Chromosome segregation ATPases
PREDICTED: similar to Protein UNQ655/PRO1286 homolog precursor
CB510764
0,328
[Danio rerio]
CB487760
0,326 metalloproteinase inhibitor 2 precursor
CA048864
0,326 serine/threonine-protein kinase VRK3
CA053581
0,317 heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A0
DW560726
0,312 unknown
DY716344
0,307 unknown
EG864724
0,295 cyclin-dependent kinase 2-associated protein 1
EG935728
0,295 unknown
CA350788
0,293 collagen type IV alpha-3-binding protein
EG868513
0,293 serine/threonine-protein kinase Nek1
DW569954
0,292 AF290477_1 VIG-2 [Oncorhynchus mykiss]
CB516141
0,292 nucleoside diphosphate-linked moiety X motif 22
DY712936
0,284 unknown
CA054913
0,282 unknown
DW537606
0,282 unknown
CA058814
0,276 unknown
EG925394
0,262 NTPase KAP family P-loop domain-containing protein 1
DW560304
0,261 unknown
DW537469
0,260 unknown
DY713679
0,259 unknown
AF180483 Salmo salar clone BA5 beta-2 microglobulin (B2m) mRNA, partial
CK990695
0,257
cds
CA058595
0,256 lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1 precursor
Salmo salar clone CH214-714P22 MHC Class I (Sasa-UBA) gene, SasaCA058288
0,252
UBA*0601 allele, partial cds
DY733707
0,241 hairy/enhancer-of-split related with YRPW motif protein 2
CX035231
0,239 unknown
CB510341
0,237 unknown
se nadaljuje
nadaljevanje
GenBank
Raven
Accession
Gen (angleški izrazi)
izražanja
no.
DY740533
0,234 unknown
EG873251
0,231 mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 3
DY735646
0,227 kinesin light chain 1
CA058876
0,224 nuclear autoantigenic sperm protein
CA038735
0,189 tRNA selenocysteine-associated protein 1
CA060641
0,188 unknown
DY724713
0,187 unknown
CB499183
0,184 WD repeat-containing protein 23
CB494125
0,180 unknown
DW577713
0,177 poliovirus receptor-related protein 1 precursor
DW573804
0,176 proteasome subunit beta type-8 precursor
AF329716 Oncorhynchus mykiss clone OSU9 T cell receptor beta chain
CB491795
0,174
variable region gene, partial cds
CB493433
0,172 splicing factor, arginine/serine-rich 2
CB499215
0,167 lithognathus mormyrus clone lithmor814 mRNA sequence
CA054215
0,167 spermine synthase
PREDICTED: similar to Ras association and pleckstrin homology domains 1
CX253483
0,163
isoform 2 [Danio rerio]
0,159 3xSSC/1M Betaine
CA062838
0,158 unknown
CB487964
0,157 46278 pfam06388, DUF1075, Protein of unknown function (DUF1075)
CA053671
0,150 putative uncharacterized O-acetyltransferase YER024W
CB502109
0,149 pumilio homolog 1
DY714992
0,147 protection of telomeres protein 1
DY736530
0,145 NADPH--cytochrome P450 reductase
DY713720
0,122 B-cell CLL/lymphoma 9-like protein
CB498702
0,111 regulator of nonsense transcripts 2
CA057970
0,106 mediator of RNA polymerase II transcription subunit 15
CB499743
0,064 mitochondrial ribosomal protein S23
CA053911
0,017 cingulin