1. No category

© Steve Wilson
Osvetljevanje
notranjosti
organizmov
Vsako odkritje v zgodovini bioznanosti je prispevalo košček
h končnemu razumevanju delovanja organizmov. Posebno
velik del k razrešitvi te sestavljanke pa so – in bodo tudi
v prihodnosti – prispevali fluorescentni proteini. Z njihovo
pomočjo so številni biološki procesi dobesedno stopili
iz teme na svetlo.
David Dobnik
Z
godba o fluorescentnih proteinih se je
začela leta 1960, ko se je japonski raziskovalec Osamu Šimomura pridružil
profesorju Franku Johnsonu na univerzi Princeton. Njegov cilj je bil pojasniti molekularne
mehanizme bioluminiscentne meduze Aequorea victoria, ki jo lahko najdemo ob zahodnih
obalah Severne Amerike. Njena posebnost je,
da v vidnem spektru oddaja zeleno svetlobo.
Prvi proteinski ekstrakti, pridobljeni iz meduze, so se že na začetku pokazali kot izredno
zanimivi za nadaljnje raziskave, zato so potre
bovali večje količine proteinov iz te meduze.
Šimomurova skupina je tako naslednjih 19
poletij v zalivu Friday Harbor na tihomorski
obali ameriške zvezne države Washington
ujela približno 850.000 meduz. Pri delu v laboratoriju so se najprej osredotočili na protein
ekvorin, ki so ga identificirali kot aktivno
komponento bioluminiscence meduze. Kmalu
so začudeni ugotovili, da le-ta oddaja svetlobo modre barve in ne značilno zelene, kot so
pričakovali. Da bi razrešili uganko, so Šimomura in sodelavci nadaljevali raziskave ter iz
proteinskega ekstrakta izolirali še en protein,
ki pa je pokazal močno zeleno fluorescenco.
Ta protein so pozneje poimenovali GFP (angl.
green fluorescent protein) – zeleni fluorescentni protein. Z nadaljnjim raziskovanjem
januar2010•Življenje in tehnika
13
Osamu Šimomura
Bioluminiscenca meduze Aequorea victoria
(Vir: marbyonline.org)
so ugotovili, da oddana modra svetloba ekvorina sovpada z vzbujevalnim spektrom GFP,
kar nakazuje, da se oddana svetloba ekvorina porabi za vzbuditev zelene fluorescence
v GFP. Eksperimentalni dokaz te hipoteze je
Šimomurova ekipa objavila leta 1974.
V raziskavah, ki so sledile, so se osredotočili na kemijsko strukturo kromofora GFP.
Ker takrat primarna struktura GFP še ni bila
poznana, so se dela lotili s klasičnimi biokemijskimi metodami. Z encimom papain, ki
razcepi peptidne vezi med aminokislinami v
proteinu, so GFP razrezali na manjše koščke,
zaradi česar je fluorescenca izginila. Le pri
Slovarček pojmov
bioluminiscenca – v splošnem oddajanje
svetlobe pri živih bitjih, ki nastane pri pretvorbi kemične energije v svetlobno
fluorescenca – fizikalni pojav, pri katerem
snov ob vzbuditvi (obsevanjem) s krajšo
valovno dolžino svetlobe odda svetlobo z
daljšo valovno dolžino
fluorescentni protein – v tem članku se pojem specifično nanaša na proteine, ki so po
strukturi podobni zelenemu fluorescentnemu proteinu iz meduze Aequorea victoria
kromofor – del molekule, sposoben selektivne absorpcije svetlobe, odgovoren za barvo, ki jo vidimo oz. zaznamo
14
Življenje in tehnika•januar2010
se je rodil leta 1928 v Fukučijami pri Kjotu na
Japonskem. Kot otrok je živel dobrih 20 km
iz Nagasakija. Pri šestnajstih letih je bil priča eksploziji atomske bombe in kljub močni
radioaktivni kontaminaciji je preživel. Leta
1951 je prejel diplomo iz farmacije na Univerzi v Nagasakiju, kjer je naslednja štiri leta
delal kot laboratorijski asistent. Leta 1956
se je zaposlil na Univerzi Nagoja in tam leta
1960 doktoriral na področju organske kemije.
Njegovo delo je navdušilo profesorja Franka
Johnsona, ki ga je nato povabil na univerzo
Princeton. Tam se je sprva posvetil delu z bioluminiscentnimi proteini in nato še posebej
delu z GFP. Leta 1980 je postal profesor na
Univerzi v Bostonu, dve leti pozneje pa se je
pridružil še Morskemu biološkemu laboratoriju v kraju Woods Hole, Massachusetts (ZDA).
Čeprav je od leta 2001 naprej v pokoju, v kletnem laboratoriju svoje hiše še vedno nadaljuje raziskovalno delo.
enem koščku je spekter sprejete in oddane
svetlobe ostal enak. Po primerjavi fizikalnokemijskih lastnosti tega koščka s celotnim
proteinom se je pokazalo, da so pridobili kromofor GFP in mu pozneje tudi določili kemijsko zgradbo.
KLONIRANJE IN IZRAŽANJE GFP
Novoodkriti protein bi lahko pomenil pravo revolucijo na področju spremljanja molekularnih procesov v času in prostoru znotraj
živih celic. Za takšne raziskave pa je treba
poznati gen, ki protein kodira, saj ga le tako
lahko vnesemo v druge organizme. Leta 1992
je raziskovalcu Douglasu Prasherju uspelo
izolirati in klonirati gen za GFP, vendar pa je
bil prepričan, da in vitro proizvedeni protein
ne bo fluoresciral, saj mehanizem zvijanja
proteina še ni bil poznan. Mislil je, da jim
bo uspelo pridobiti le nefluorescentno obliko
GFP, ki bi jo uporabili kot reagent za prihodnje biokemijske raziskave kromofora. Zdelo
se jim je skrajno neverjetno, da bi se kromofor tvoril spontano, saj so za podobne procese
znotraj organizmov potrebni zapleteni encimski sistemi.
relativna fluorescenca [arbitarne enote]
Martin Chalfie je gen še
1400
isto leto izrazil v bakteriji
vzbujanje
Escherichia coli in sintetizi1200
oddajanje
ran protein je znotraj bakterije
oddajal svetlo zeleno svetlo1000
bo. Ta rezultat je pokazal, da
bi lahko GFP kot označevalec
800
uporabljali v praktično vseh
organizmih. Chalfie je gen
600
za GFP vnesel tudi v glisto
400
Caenorhabditis elegans, kjer
je bil pod nadzorom promo200
torja gena za β-tubulin. Glista je uspešno izražala GFP
0
v določenih delih in stopnjah
razvoja, in sicer takrat, ko je
300
350
400
450
500
550
600
bil promotor aktiven. Tako so
valovna
dolžina
[nm]
uspešno pokazali, da se lahko
GFP uporablja kot označevalSpektralne lastnosti GFP iz meduze Aequorea victoria; spekter
ni gen ter obenem tudi kot privzbujevalne svetlobe je prikazan z vijoličasto, spekter oddane
svetlobe pa z zeleno barvo. Iz spektra lahko vidimo, da obsevanje
pomoček za spremljanje loka(vzbujevanje) GFP z UV- ali modro svetlobo povzroči, da GFP
cije in interakcije proteinov
oddaja (fluorescira) zeleno svetlobo. (Vir: K. Siemering)
znotraj živih celic. Pozneje so
različne skupine ugotovile, da
se lahko GFP izraža še v kvasovkah, sesalčjih stih 65–67 (serin-tirozin-glicin) v zaporedju
celicah in vinski mušici. Kljub vsemu pa je GFP tvorijo fluorescentni kromofor. Protein
mehanizem tvorbe funkcionalnega kromofo- je sodčkaste oblike in s kromoforom na srera v GFP ostajal nepojasnjen.
dini te strukture. Maksimum vzbujevalnega
spektra je pri 400 nm valovne dolžine svetlobe, z drugim vrhom pri 470 nm. Oster vrh odSTRUKTURA IN RAZVOJ GFP
dane svetlobe je pri 505 nm valovne dolžine
svetlobe (zelena fluorescenca).
Kristalna zgradba GFP je bila določena
Ko je Roger Y. Tsien poskušal GFP izraleta 1996. GFP je sestavljen iz 238 aminoki- ziti v bakteriji E. coli še v anaerobnih pogoslinskih ostankov, pri čemer ostanki na me- jih, je ugotovil, da GFP, tvorjen v razmerah
brez kisika, ne fluorescira. Po
dodatku kisika pa se je fluorescenca počasi spet pojavila.
Na osnovi tega so raziskovalci
sklepali, da se funkcionalni
kromofor tvori, ko je protein
že pravilno zvit, za njegovo
tvorbo pa je kot edini dejavnik
potreben kisik.
Tsien in sodelavci so šli še
korak naprej in v genu za GFP
na določenih mestih z mutacijami spremenil aminokislinModel sodčkaste strukture GFP; na levi je pogled od zgoraj
sko zaporedje. S tem jim je
in s kromoforom na sredini, na desni pa pogled od strani.
uspelo spremeniti spektralne
(Vir: wikimedia commons in scholarpedia)
lastnosti proteina, kar pome
januar 2010 • Življenje in tehnika
15
Nobelova nagrada
za kemijo leta 2008
Roger Y. Tsien, Martin Chalfie in Osamu
Šimomura so za svoje delo z GFP leta 2008
prejeli Nobelovo nagrado za kemijo. Od odkritja naprej je ta protein postajal eno izmed
najpomembnejših orodij sodobne bioznanosti.
S pomočjo GFP so raziskovalci razvili metode
za spremljanje procesov, ki so bili prej nevidni,
kot npr. za razvoj živčnih celic ali za opazovanje premikanja molekul znotraj celice. Spremljanje proteinov v njihovem naravnem okolju
omogoča nov vpogled v kemijske procese v živih organizmih, kar je še posebno pomembno
pri raziskovanju nastanka in razvoja bolezni.
UPORABA
FLUORESCENTNIH PROTEINOV
Spekter uporabe fluorescentnih proteinov
je izredno širok. Omogočajo namreč časovno
in prostorsko spremljanje številnih procesov v
živih celicah in organizmih, kot so izražanje
genov, dinamika in lokalizacija proteinov, interakcije proteinov, podvojevanje in organizacija kromosomov, znotrajcelične transportne
poti ter drugi podobni procesi. Poleg tega so
iz fluorescentnih proteinov razvili senzorje, ki pokažejo pH-vrednosti, koncentracijo
kalcijevih ionov in številne druge pomembne
lastnosti notranjosti celic. Vse to pa ne bi bilo
mogoče, če ne bi bile razvite metode transformacije oz. genskega spreminjanja živih
organizmov, saj lahko fluorescentne proteine
vnesemo v celice le na ta način.
Kot praktičen primer njihove uporabe si
oglejmo spremljanje lokalizacije proteinov.
V živih celicah so proteini načeloma nevidni,
vidni pa lahko postanejo, če jih na nek način označimo. Če želimo biti res prepričani,
da smo označili le želeni protein, je najbolje
pripraviti genski konstrukt z genom izbranega
Nobelovi nagrajenci leta 2008 za kemijo
(od leve proti desni): Roger Y. Tsien, Osamu
Šimomura in Martin Chalfie (Foto: Reuters)
ni, da so se vzbujevalni spektri in spektri oddane svetlobe premaknili. Tako so pridobili
več različic GFP, ki niso več oddajale samo
zelene fluorescence, ampak tudi rumeno,
rdečo ali oranžno; prav tako se je izboljšala
intenziteta fluorescence in zvijanje proteina
ob njegovem nastajanju.
Ob koncu prejšnjega stoletja je bil iz koral
vrste Discosoma izoliran fluorescentni protein
DsRed, ki v vzbujenem stanju oddaja rdečo
svetlobo. Skupina Rogerja Tsiena je tudi ta
protein okarakterizirala in ga z vpeljavo različnih mutacij izboljšala ter podobno kot pri
GFP pripravila različice z različnimi spektralnimi lastnostmi. Različne fluorescentne
proteine so izolirali tudi iz drugih nebioluminiscentnih vrst koral (Anemonia sp., Zoanthus sp.). Vsi ti proteini so po spektralnih
lastnostih zelo podobni prej omenjenim različnim oblikam GFP.
16
Življenje in tehnika•januar2010
V zgornjem delu slike so suspenzije različnih
fluorescentnih proteinov v epruvetkah, spodnja
slika pa je narisana z bakterijami, ki izražajo
različne fluorescentne proteine. (Foto: R. Tsien)
Zelo izpopolnjena oblika takega mikroskopa je konfokalni mikroskop. Z njim lahko
izberemo valovno dolžino
svetlobe, s katero vzbudimo
fluorescenco fluorescentnega
proteina, prav tako pa izberemo območje spektra, v katerem bomo spremljali oddano
fluorescenco. To je zelo pomembno, kadar v celici poleg
vnesenega fluorescentnega
proteina naravno fluorescira
še kaj drugega. Prav tako lahko hkrati spremljano dogajanje pri več valovnih dolžinah
in slike pozneje združimo.
Konfokalni mikroskop omoShematska predstavitev vizualizacije nativnega proteina β-aktin
goča opazovanje tudi v tretji
v sesalčji celici s pomočjo fluorescentnega proteina
ravnini, kar pozneje omogoča
Gen za fluorescentni protein, združen z genom za β-aktin, se vstavi
3-dimenzionalne rekonstrukv jedro celice (a). Gen se prepiše v mRNK (b) in prevede v protein (c).
cije opazovanega objekta.
Nativni protein se prestavi na njegovo običajno mesto v celici,
Tako lahko povsem neinvana kar fluorescentni protein ne vpliva (d). V primeru β-aktina
zivno spremljamo fluorescense le-ta sestavi v filamente znotraj celice (e). V spodnjem desnem
kotu je prikazan praktičen primer fluorescentno označenega
tno označene nativne proteine
β-aktina. (Vir: scholarpedia.org)
znotraj živih celic. Dobljene
slike nam pokažejo točno loproteina, ki ga povežemo z genom za fluore- kacijo označenega proteina. Z opisano metoscentni protein. Ta konstrukt nato prenesemo do lahko v teoriji spremljamo lokacijo katerev celico s transformacijo. Ob uspešnem izra- ga koli proteina, če je le poznano zaporedje
žanju vnesenega konstrukta dobimo znotraj gena, ki ga kodira.
celice izbran protein, na katerega je pripet še fluorescentni protein, kar nam omogoča
spremljanje lokacije in delovanja vnesenega konstrukta.
Še ena izjemna lastnost fluorescentnih proteinov je, da ne
motijo delovanja nativnega
proteina znotraj celice in tudi
ne spreminjajo njegove lokacije znotraj celice – označeni
protein tako v celici neovirano
opravlja svojo običajno vlogo.
Za spremljanje fluorescentnih proteinov potrebujemo
fluorescentni mikroskop, da
izberemo točno valovno dol- S konfokalnim mikroskopom narejena slika kaže korenino gensko
žino svetlobe, s katero želimo spremenjenega navadnega repnjakovca, pri katerem je fluorescentni
vzbuditi fluorescenco prote- protein združen s proteini, ki so v jedru celice. Celične stene so bile
ina, ki ga želimo spremljati. kemijsko obarvane, da fluorescirajo rdeče. (Foto: John Runions)
januar 2010 • Življenje in tehnika
17
določenih procesov, v katere so vpleteni posamezni proteini. Spremljanje teh procesov
s pomočjo fluorescentnih proteinov na modelnih organizmih (npr. miših) nam lahko
ponudi nov vpogled v celoten sistem ne le
razvoja bolezni, temveč delovanja organizma
na splošno.
Tudi na Nacionalnem inštitutu za biologijo
v Ljubljani uporabljamo fluorescentne proteine
za sledenje vnosa genov v rastlinske celice.
(Foto: David Dobnik)
Področje raziskav fluorescentnih proteinov je potekalo od lovljenja velikanskega števila meduz do gensko spremenjenih živali, ki
se svetijo pod ultravijolično ali modro lučjo.
Naj se sliši še tako nesmiselno, ampak prav
takšne živali pomenijo začetek raziskav nastanka in razvoja bolezni. Vzroki za nastanek
bolezni so velikokrat napake ali nedelovanje
18
Življenje in tehnika•januar2010
Literatura
1. The Royal Swedish Academy of Sciences, Scientific
Background on the Nobel Prize in Chemistry 2008,
The green fluorescent protein: discovery, expression
and development. 2008.
2. Shaner s sod., Improved monomeric red, orange and
yellow fluorescent proteins derived from Discosoma
sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology,
2004.
http://...
learn.hamamatsu.com/galleries/digitalvideo/index.html
(videoposnetki fluorescentnih proteinov znotraj živih celic)
en.wikipedia.org/wiki/Green_fluorescent_protein
(o zelenem fluorescentnem proteinu)
nobelprize.org (Nobelova fundacija)
www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/imaging/Index_imaging.htm
(optična mikroskopija in fluorescenca)