27. 2. 11 2. vaja – Homogenizacija tkiva in frakcionirno
obarjanje z amonijevim sulfatorm
-  Same metode homogenizacije smo spoznali pri prejšnji vaji,
tokrat se bomo osredotočili na izolacijske postopke
proteinov iz neke snovi
-  Za razumevanje procesov je potrebno razumeti zgradbo in
lastnosti proteinov
Proteini imajo lahko štiri nivoje zgradbe proteina:
I.  PRIMARNA
•  zaporedje aminokislin
v polipeptidni verigi
1 27. 2. 11 Proteini imajo lahko štiri nivoje zgradbe proteina:
I.  PRIMARNA
•  zaporedje aminokislin
v polipeptidni verigi
•  ! določa strukturo in
posledično funkcijo
proteina !
Proteini imajo lahko štiri nivoje zgradbe proteina:
II.  SEKUNDARNA
•  zvijanje predvsem zaradi H-vezi, ki
nastanejo med karboksilnimi in
aminskimi skupinami
nesosednjih aminokislin
•  α- vijačnica, β-ploskev
2 27. 2. 11 Proteini imajo lahko štiri nivoje zgradbe proteina:
II.  SEKUNDARNA
•  zvijanje predvsem zaradi H-vezi, ki
nastanejo med karboksilnimi in
aminskimi skupinami
nesosednjih aminokislin
•  α- vijačnica, β-ploskev
Proteini imajo lahko štiri nivoje zgradbe proteina:
II.  SEKUNDARNA
•  zvijanje predvsem zaradi H-vezi, ki
nastanejo med karboksilnimi in
aminskimi skupinami
nesosednjih aminokislin
•  α- vijačnica, β-ploskev
Proteini imajo lahko štiri nivoje zgradbe proteina:
III.  TERCIARNA
•  stabilizacija
preko vezi, ki
se tvorijo med
stranskimi
skupinami
3 27. 2. 11 Proteini imajo lahko štiri nivoje zgradbe proteina:
IV.  KVARTARNA
•  povezovanje več polipeptidnih verig
IZBIRA IZHODNEGA MATERIALA
centrifugiranje
EKSTRAKCIJA
! stabilnost proteinov
homogenizacija
! proteaze, nukleaze
! membranski proteini
ultracentrifugiranj
e
ČIŠČENJE
gelska
ionska
kromatografija
afinitetna
obarjanje
ultrafiltracija
KONCENTRIRANJE
liofilizacija
EKSTRAKCIJA
centrifugiranje: glej ppt prejšnje vaje!
homogenizacija: pozorni moramo biti na pogoje homogenizacije,
da želen protein ohrani strukturo in posledično
funkcijo.
! stabilnost proteinov (T, pH, ionska moč)
nadomestni substrat
! proteaze, nukleaze
inhibitorji
uporaba EDTA, citrata
! membranski proteini (detergenti)
4 27. 2. 11 ČIŠČENJE
ultracentrifugiranje
Stryer, 5th eddition
ČIŠČENJE
kromatografija
Kromatografija(iz grške besede χρῶµα chroma „barva" in
γράφειν graphein „pisati") je skupen termin za več
laboratorijskih tehnik, ki se uporabljajo za ločevanje določenih
snovi v zmesi.
Vključuje potovanje mobilne faze, kjer se nahaja vzorec, preko
stacionarne faze, kjer pride do ločitve želene snovi na podlagi
lastnosti, ki se razlikujejo od ostalih snovi v zmesi.
V biokemiji najpogosteje uporabljamo 3 vrste kromatigrafij:
•  gelska kromatografija
•  ionska kromatografija
•  afinitetna kromatografija
ČIŠČENJE
kromatografija
ionska kromatografija
kromatografija
gelska kromatografija
afinitetna
http://www.f1000scientist.com/article/display/15284/; 23.2.2011
5 27. 2. 11 ČIŠČENJE
obarjanje
Obarjanje je proces, s katerim z uporabo kemikalij ali spremembe
stanja sistema povzročimo, da se določene snovi izločijo iz
zmesi v obliki trdnih ali tekočih delcev.
3 vrste obarjanja proteinov:
•  obarjanje s soljo
•  obarjanje z organskimi topili
•  izoelektrično obarjanje
OD ČESA JE ODVISNA TOPNOST PROTEINA?
ČIŠČENJE
topnost
obarjanje s soljo
VSOLJEVANJE
koncentracija soli
IZSOLJEVANJE
6 +
-
-
+
+
-
27. 2. 11 +
-
+
-
+
-
VSOLJEVANJE
NAJVEČJA TOPNOST IZSOLJEVANJE
Ob dodajanju majhne
koncentracije soli v
raztopino proteina pride
do senčenja nabitih
aminokislin na površini
proteina. To zmanjšuje
ekektrostatski potencial
med nasprotno nabitimi
amnokislinami proteina
in povečuje topnost.
Ob primerni koncentraciji
soli (ki je odvisna od
naboja posameznega
proteina na površini) je
doseženo otimalno
stanje med nabojem
proteina, soli in vode in
posledično maksimalna
topnost.
Ponovno obarjanje pri
dodajanju še večjih
količin soli je posledica
zmanjšane solvatacije
proteinskih molekul. Ioni
soli namreč odtegnejo
molekule vode, kar
povzroči, da postanejo
interakcije med proteina
močnejše kot tiste med
proteinom in topilom.
ČIŠČENJE
obarjanje z organskimi topili
Dodatek nepolarnih topil (MeOH, EtOH, aceton) zniža dielektrično
konstanto topila, kar povzroči, da pride do večjih elektrostatskih
interakcij med nabitimi deli proteina.
Zaradi izpostavljanja hidrofobnih površin topilu lahko pride do
obarjanja proteinov!
Ali z organskimi topili lahko na enak način oborimo npr.
membranske proteine? Zakaj?
ČIŠČENJE
izoelektrično obarjanje
topnost
Izoelektrična točka je pH raztopine,
pri katerem je neto naboj proteina enak nič.
pH
7 27. 2. 11 IZBIRA IZHODNEGA MATERIALA
centrifugiranje
EKSTRAKCIJA
! stabilnost proteinov
homogenizacija
! proteaze, nukleaze
! membranski proteini
ultracentrifugiranj
e
ČIŠČENJE
gelska
ionska
kromatografija
afinitetna
obarjanje
PUFRI?
ultrafiltracija
KONCENTRIRANJE
liofilizacija
Pogosto je potrebno med različnimi postopki zamenjati
raztopine v katerih se trenutno nahaja vzorec. Tako moramo
pred npr. ionsko kromatografijo vzorec razsoliti, včasih pa
želimo le zamenjati določen pufer z nekim drugim.
Med načini dializiranja bomo omenili naslednje:
• 
• 
• 
• 
dializa
ultrafiltracija
gelska filtracija (naslednjič)
obarjanja (glej predhodne razlage)
MENJAVA PUFROV
dializa
8 27. 2. 11 MENJAVA PUFROV
ultrafiltracija
Ultrafiltracija se primarno
uporablja v namene
koncentriranja vzorcev.
Ko pa je vzorec
skoncentriran ga pa lahko
raztopimo tudi v drugi
raztopini in na ta način
zamenjamo pufer.
http://www.siumed.edu/~bbartholomew/course ; 26.2.2011
KONCENTRIRANJE
liofilizacija
Poleg prej omenjene ultrafiltracije se za koncentriranje raztopin
lahko uporablja tudi liofilizacija (angl. „freeze-drying“).
Gre za zamrzovanje snovi in odparevanje topila (ki je ponavadi
voda) v vaakumu, kar povzroči sublimacijo topila.
http://www.food-manufacturer.com/; 26.2.2011
2. VAJA
•  homogenizacija goveje vranice
•  prva stopnja čiščenja želenega proteina s
frakcionirnim obarjanjem z amonijevim sulfatom
9