1. No category

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO, UNIVERZA V LJUBLJANI
Modifikacije proteinov z
lipidi in njihov pomen
Seminar pri predmetu biološke membrane
Antonija Kirac
Veronika Berdajs
Eva Cizel
Mentor: prof. dr. Igor Križaj
December, 2014
UVOD
Modifikacije proteinov z lipidi so razširjene in funkcionalno pomembne v evkariontskih
celicah. V večini primerov je lipidna enota bistvenega pomena za močno povezovanje z
membranami. Lipidna enota lahko tudi pomaga pri urejanju proteinov na membranske
domene, ki spodbujajo lateralne in flip-flop protein-protein interakcije, ki so ključne za
delovanje celice. Kovalentni lipidi v nekaterih primerih delujejo kot funkcionalno stikalo in se
izražajo v funkcionalnih membranah določenih proteinskih konformacij. Kovalentna
navezanost lipidov na proteine je bila najprej opisana v študiju mielinskega proteina leta
1951. Leta 1969 sta Braun in Rehn jasno opisala vezavo lipidov na proteine, ki so pomembni
za biosintezo proteinov in imajo pomembno funkcijo pri študiju zunanje peptidoglikanske
membrane lipoproteina v E. Coli. Tem zgodnjim odkritjem je v 1970-ih sledila identifikacija
maščobnih kislin vezanih na virusne glikoproteine in izoprenoide, ki so bili kovalentno vezani
na receptorje v glivah in na GTP-vezavne proteine. V letih 1980 so identificirali in
karakterizirali N-miristoilirane proteine in GPI zasidrane proteine. V 1990-ih pa so odkrili nov
razred proteinov modificiranih s holesterolom. (D. E. Vance in sod., S. Yalovsky in sod.)
Veliko zunanjih membranskih proteinov je usidranih v membrano preko mehanizmov, ki so
različni od običajno uporabljenih v transmembranskih proteinih. Modifikacije z lipidi olajšajo
pritrditev topnih proteinov na biološke membrane in hkrati omogočijo interakcije proteinprotein, v nekaterih primerih pa tudi prenos proteinov med plazemsko membrano in
citosolom ali drugimi membranskimi komponentami. Modifikacije, ki so jih našli v vseh
evkariontskih celicah, lahko razdelimo v tri večje razrede, glede na tip lipida in mesto
modifikacije na proteinu. Le-te vključujejo miristoilacijo, palmitoilacijo in prenilacijo. V
nasprotju s fosforilacijo so modifikacije z lipidi omejene na majhne podenote celičnih
proteinov, ki sodelujejo pri signaliziranju. Nekatere modifikacije z lipidi so reverzibilne, imajo
regulatorno funkcijo (prevajanje signalov) in tako zagotavljajo strukturno osnovo za skupino
signalno proteinskih kompleksov na membranah ali zaključujejo signalne kaskade s hidrolizo
lipida in disociacijo proteina od membrane.
Biokemija večine modifikacij z lipidi je dokazana, čeprav niso bili identificirani vsi encimi, ki
opravljajo reakcije prenosa. Vloge N-miristoilacije in palmitoilacije v živalskih celicah ter
prenilacije v živalskih, glivnih in rastlinskih celicah pa so v veliki meri že preučene. (S.
Yalovsky in sod.)
1. PALMITOILACIJA
Palmitoilacijo proteina dosežemo z esterifikacijo palmitata, ki ima cisteinsko tiolno skupino.
Gre za kovalentno modifikacijo cisteinskega ostanka na proteinu palmitoil transferaza.
Palmitoilacija je post-translacijska modifikacija. (Slika 1) V nasprotju z N-miristoilacijo in
prenilacijo ni bilo identificirane primarne sekvence oz. motiva na katerem lahko
palmitoilacijo predvidimo. Palmitoilacijo so našli v povezavi z miristatom ali prenilnimi
skupinami ali v bližini hidrofobnih sekvenc domnevnih transmembranskih domen.
Palmitoilna skupina je hidrofobna, kar pomeni, da palmitoilacija povečuje hidrofobnost in
prispeva k membranski asociaciji. V nasprotju z ostalimi modifikacijami z lipidi je
palmitoilacija dinamičen in reverzibilen proces zaradi estrske vezi. Posebno pozornost
posvečamo reverzibilnosti zato, ker tako zagotavlja potencialen regulatorni mehanizem za
prenos proteinov med citosolom in membrano ali med različnimi membranskimi domenami.
Palmitoiliziran protein se nahaja na intercelularni strani lipidnih raftov. Nestabilnost
palmitoilne modifikacije in težave pri doseganju učinkovitega metabolnega opredeljevanja
proteinov s palmitolno kislino ovirata raziskovanje mehanizma palmitoilacije. Razumevanje
natančne funkcije je še naprej oteženo, saj se proces depalmitoilacije lahko zgodi s pomočjo
ali brez encima, mehanizem, ki regulira katerokoli od teh reakcij, pa je neznan. (S. Yalovsky in
sod.) (Kajdič S.)
Slika 1: Mehanizem reverzibine palmitoilacije (http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/protlip/index.htm).
Najbolj raziskani primeri palmitoiliranih proteinov so α-podenote trimernega G-proteina
(Gα) v živalskih celicah. Nadaljnja vezava z efektorjem privede do depalmitoilacije Gα in
kasnejše premestitve v citosol. To je potrebno za olajšanje hidrolize GTP-ja v GDP, ki pripravi
protein za nov celični cikel. Palmitoilacija lahko v tem primeru regulira lokalizacijo in
interakcijo Gα z receptorjem in efektorskimi proteini. Čeprav so našli v rastlinskih celicah
proteine podobne Gα, je njihova funkcija in vloga palmitoilacije na njih neznana. Kloroplast
proteina D1 je edini rastlinski protein za katerega so demonstrirali palmitoilacijo. D1 je
integralni protein reakcijskega centra fotosistema II (PSII). Vloga začasne lipidne modifikacije
proteina D1 ni znana, vendar so z razumevanjem predlagali, da palmitoilacija lahko pomaga
pri naraščanju lokalne koncentracije, specifičnosti in učinkovitosti D1 v interakciji z drugimi
PSII komponentami v lipidnem okolju tilakoidne membrane. (S. Yalovsky in sod.)
Palmitoilacijo pogosto najdemo v povezavi z miristatom ali prenilnimi skupinami, vendar je
bila povezava med temi različnimi lipidnimi modifikacijami podrobno raziskana le za en del
družine proteina Gαi. V tem primeru sta obe, palmitoilacija in miristoilacija, potrebni za
lokalizacijo stabilne plazemske membrane, hitrost pretvorbe palmitata pa znatno narašča v
ne-miristoiliranih proteinih. Miristoilirani vendar ne-palmitoilirani mutanti proteina Gαi so
razširjeni med plazemsko membrano in notranjimi membranami, protein z mutiranim
mestom za miristoilacijo pa se ne uspe asociirati s plazemsko membrano in ni palmitoiliran.
Iz te zanimive ugotovitve sklepamo, da miristoilacija sama po sebi ni potrebna za
palmitoilacijo, ampak se palmitoilacija zgodi v primeru, ko so proteini v tesni bližini z
notranjo stranjo plazemske membrane. Palmitoilacija tako verjetno, neodvisno od
miristoilacije ali prenilacije, utrjuje reverzibilno membransko asociacijo proteinov pritrjenih
na plazemsko membrano. (S. Yalovsky in sod.)
2. MIRISTOILACIJA
Kovalentna vezava miristata (14 C), preko amidne vezi na N-konec glicina, je katalizirana z Nmiristoiltransferazo, ki se tvori kotranslacijsko (gre za ko-translacijsko modifikacijo) po
odstranitvi metionina, ki ima vlogo iniciatorja, z M-aminopeptidazo. Čeprav je modifikacija
stabilna, pa hidrofobnost samega miristoiliranega peptida ni zadostna za sidranje proteina v
plazemsko membrano. Ta specifičen mehanizem sodeluje z miristoilacijo zato, da olajša
vezavo modificiranega proteina s plazemsko membrano. Sklepamo, da miristoilacija zahteva
prisotnost oziroma sodelovanje z drugimi proteinskimi modifikacijami. (S. Yalovsky in sod.)
Najbolj preučevani primeri miristoiliranih proteinov so iz skupine sesalcev oziroma celice
sesalcev iz družine Src proteinov. To so nereceptorski proteini tirozin-kinaze (sodelujejo v
intracelularni transdukciji signalov in imajo pomembno vlogo pri razvoju raka) in MARCKS
proteini (substrati proteina kinaze C). Ti proteini imajo N-terminalne polibazične domene s
skupki, ki vsebujejo pozitivno nabite aminokisline, kar jim omogoča, da interagirajo z
glavnimi skupinami kislinskih fosfolipidov, ki posredujejo negativni naboj na citoplazemsko
površino plazemske membrane. Fosforilacija serinskih ostankov, ki se nahajajo blizu
polibazičnih domen proteina, omogoča nastanek negativnega naboja, ki nevtralizira pozitivni
naboj in tako oslabi elektrostatske interakcije. Posledično se miristoiliran protein lahko
odcepi od plazemske membrane. Drugačen mehanizem reakcije pa ima Recoverin,
miristoiliran fotoreceptor s Ca2+ v čepkih mrežnice (čepki so ena izmed dveh vrst čutilnih
celic v očesni mrežnici), ki z inhibicijo delovanja rodopsin kinaze kontrolira življensko dobo
fotoekscitiranega rodopsina. V odsotnosti Ca2+ je miristoilna skupina v proteinu ovita s
hidrofobno plastjo. Vezava Ca2+ pa povzroči konformacijske spremembe v Recoverinu: pride
do izpostavitve miristilne skupine in tako olajšane vezave proteina na membrano. (S.
Yalovsky in sod.) (Kajdič S.)
Podskupina poznanih miristoiliranih proteinov, ki vključuje nekatere predstavnike Src
skupine in α-podenote heterotrimernih G-proteinov, vsebuje cistein zraven ali pa kar
vezanega na miristoiliran glicin, ki je običajno predhodno palmitoiliziran. Ker je palmitoilacija
nestabilna, se miristoiliran protein sprosti iz plazemske membrane z depalmitoilacijo. V tem
primeru palmitoilacija vsekakor izboljša učinkovitost vezave na membrano, možno pa je, da
vpliva tudi na subcelično lokalizacijo ali na protein-protein interakcije miristoiliranih
proteinov. N-miristoilacija, v povezavi z drugimi funkcionalnimi skupinami ali modifikacijami,
omogoča reverzibilno vezavo proteinov s plazemsko membrano, kot odziv na različne celične
signale, ali prenos proteinov med različnimi deli membran. (S. Yalovsky in sod.)
V nadaljevanju so predstavljene tri skupine rastlinskih proteinov, ki so izboljšale vpogled v
potek in razumevanje modifikacij. PTO protein kinaza, ki se nahaja v paradižniku, sodeluje v
signalizaciji pri patogeni infekciji. Odporne rastline, ki vsebujejo Pto mesto (genski lokus) so
prav tako občutljive na organofosforni insekticid fention. Ta občutljivost je omiljena s FENom, ki je homolog PTO, katerega gen je tesno vezan na Pto. Oba proteina imata domnevne
N-miristoilirane akceptorske glicine in mutacija FEN-a povzroči izgubo v občutljivosti na
fention. Podobna mutacija v PTO pa nima vpliva na njegovo funkcijo, ko je protein ektopično
izražen v dovzetnih transgenih rastlinah, kar nakazuje, da miristoilacija ni potrebna za
bakterijsko odpornost povzročeno s PTO. (S. Yalovsky in sod.)
Miristoilacija je bila demonstrirana za eno rastlino, ki vsebuje proteinsko kinazo odvisno od
Ca2+ (CDPKs), katere funkcije so neznane. Poleg tega so cisteini na mestu 3 in/ali 5 prisotni
pri vseh predstavnikih te družine kinaz, kar nakazuje na dodatne modifikacije s palmitoilacijo
– podobno kot pri PTO protein kinazi. Ni pa še razjasnjeno ali je asociacija s plazemsko
membrano rastlinskih CDPKs regulirana podobno kot pri Recoverinu, kjer vezava Ca2+
izpostavi miristoilno skupino in olajša lokalizacijo membrane ter sidranje proteinov v njej. (S.
Yalovsky in sod.)
3. PRENILACIJA
Proteinska prenilacija se od N-miristilacije in palmitoilacije razlikuje v samem tipu lipidnih in
proteinskih domen, ki sodelujejo v tej vrsti modifikacije. Reakcija je katalizirana s tremi tipi
preniltransferaz, ki se pripenjajo na 15. ali 20. C-konec izoprenoidov farnezil in geranilgeranil.
Gre za modifikacijo z izoprenoidi. Ločimo dve glavni vrsti prenilacije: farnezilacijo ( na 15 C
atomu) in geranilgeranilacijo (na 20 C antomu). V obeh primerih gre za modifikacijo na Ckončnem cisteinskem ostanku proteina. (Kajdič S.)
Prenilacija proteina je bila raziskana v glivah, vendar je bila identificirana tudi kot
modifikacija
v
različnih
drugih
evkariontih.
Večina
proteinov
modificiranih
s
preniltransferazami ima regulatorno vlogo v celični signalizaciji in transportu z vezikli.
Vključujejo skoraj vse člane iz družine Ras (majhnih GTPaz), nekaj γ-podenot heterotrimernih
G-proteinov, jedrne lamine in tudi nekaj drugih proteinov. Nasprotovanje, da prenilacijska
inhibicija lahko obrne transformacijo celic sesalcev z aktiviranim Ras mutiranim proteinom,
je doprineslo k večji pozornosti usmerjeni na strukturo in funkcijo proteinskih preniltrasferaz.
Razumevanje regulacije teh encimov in njihovih potencialnih funkcij v koordinaciji sinteze
izoprenoidov s kontrolo celične rasti tako ostaja nepopolno, saj principa še ne poznamo
dovolj dobro. (S. Yalovsky in sod.)
Farneziltransferaza (FTaza) in tip I geranilgeranil-transferaza (GGTaza-I) sta heterodimerna
encima, ki si delita skupno α-podenoto in imata različni β-podenoti, ki določata specifičnost
substrata. Oba encima zaznata C-terminalni aminokislinski sekvenčni motiv poznan kot CaaX
box, kjer »C« zaznamuje cistein, »a« predstavlja alifatsko aminokislino in »X« je cistein, serin,
metionin, alanin, glutamin ali levcin. Če je »X« levcin, je protein geranilgeranil-iran z GGTazaI. Prisotnost polibazične domene, ki je bogata z argininom in lizinom, blizu CaaX box zvišuje
afiniteto substrata GGTaza-I in učinkovitost prenilacije. Podobno kot pri pritrjevanju prenilne
skupine na cisteinski akceptor, so končne aaX amino kisline pritrjene s posebnimi
proteazami. Izpostavljena karboksilna skupina prenil-cisteina je nato metilirana. (Slika 2)
Podobno encimska aktivnost so identificirali v kulturi tobačnih celic v suspenziji, kjer so
uporabljali umetni metilni akceptor, kar kaže na to, da je postprenilacijska modifikacija
prisotna tudi v rastlinah. Pokazali so tudi, da se pri Ras proteinih aaX protoliza in
karboksimetilacija odvijata v endoplazemskem retikulumu. Popolnoma modificirani proteini
nato potujejo do plazemske membrane preko Golgijevega aparata ali mogoče kar skozi
citoplazmo. Nahaja se na intercelularni strani. (S. Yalovsky in sod.) (Kajdič S.)
Slika 2: Proteinska prenilacija (Yalovsky S., 1999).
Rab-GTPaza je tretja preniltransferaza in samo ta je tista, ki modificira, ko gre za regulacijo
sekretornega transporta preko veziklov. Rab-GTPaza si ne deli podenot z FTazo in GGTazo-I
in se razlikuje od ostalih dveh preniltransferaz tudi zaradi prisotnosti tretje komponente (Rab
Escort Protein), ki je potrebna za encimsko aktivnost Rab-GTPase. (S. Yalovsky in sod.)
Proteinsko prenilacijo lahko uravnavamo s fluksom poti pri biosintezi izoprenoida v
citoplazmi. Odkritje je pomembno, ker FPP (C 15 farnezil difosfat) in GGPP (C 20
geranilgeranil difosfat) intermediata tvorita veliko cepitvenih točk v rastlinah. Situacija je
postala zahtevnejša glede na odkritja alternativnih sintez izoprenoida v plastidih. Zato ni
nujno, da vse spremembe koncentracije FPP in GGPP v celici odsevajo lokalne spremembe v
citosolu, ki so posledica sprememb v (S. Yalovsky in sod.):
-metabolnem statusu celice
-aktivnosti HMGR-ja
-fluksu med citoplazmo in plazmidom
-aktivnosti drugih encimov v citoplazmi pri biosintezi izoprenoida.
Nedavni dokazi pri živalih prav tako nakazujejo regulatorno vlogo prenilacije. Rezultat
aktivacije biosinteze izoprena v kokošjih srčnih celicah je farnezilacija Ras-a, aktivacija
signalizacije Ras in izražanju muskarinskega receptorja in heterotrimernega G-proteina.
Fosforilacija FTazine α-podenote, ki je pospešena z induciranjem inzulina, prav tako
pospešuje farnezilacijo Ras-a. Te spremembe ravni glukoze v celici ali razmerja AMP:ATP
lahko regulirajo proteinsko prenilacijo preko fosforilacije in aktivnosti FTaze ter verjetno tudi
GGTaze-I. Zavedati pa se moramo, da ni znano, ali je v rastlinah skupna α-podenota FTaze in
GGTaze-I tudi fosforilirana ali ne. (S. Yalovsky in sod.)
Ne glede na sklepe, ne smemo izločiti še neraziskanih mehanizmov, ki bi prav tako lahko
regulirali proteinsko prenilacijo v rastlinah, kot tudi kontrolirali izražanje genov FTaze in
GGTaze v rastlinah. Raven substrata v celici za tarčni protein prenilacije je lahko tudi
pomemben faktor, saj bi koncentracija pod Kw (porazdelitvenim koeficientom) verjetno
vodila do neučinkovitih modifikacij. V nasprotju z palmitoil transferazo in N-miristoil
transferazo se afiniteta prenil transferaze znatno spreminja glede na različne proteinske
substrate v odvisnosti od aminokislinskega odseka v CaaX boxu, v nekaterih proteinih je
odvisna tudi od polibazične domene poleg Caax box. (S. Yalovsky in sod.)
Prenilacija specifičnih signalnih proteinov bi lahko signifikantno vplivala na njihovo pot
delovanja. Regulacija prenilacije pa je lahko še bolj zapletena z rednim in hitrim
menjavanjem FTaze in GGTaze-I. Oba encima neučinkovito prenilirata substrate, ki bi bili
običajno specifični za FTaze (CaaX) ali GGTaze (CaaL) in GTaze-I, lahko pa FPP tudi izkoriščata.
To izpostavi zanimiva vprašanja, ker eksperimenti z RhoB v celicah sesalcev pa nakazujejo na
funkcionalno ustreznost alternativne prenilacije. RhoB GTPaza sodeluje pri regulaciji aktina v
citoskeletu in igra pomembno vlogo pri transformaciji povzročeni z Ras. Metabolno
označevanje celic s H-mevalonatom prikazuje, da je večina RhoB geranilgeranil-iranih
dosledno s CaaL motivom, majhna frakcija pa je farnezilirana. FTazni inhibitorji (ki ne zavirajo
GGTaze-I) zavirajo celično transformacijo z onkogenom RhoB in eliminirajo število
farneziliranih RhoB iz celic. Ti rezultati kažejo, da s pomočjo rastlinskih proteinov
modificiranih s prenil transferazo mogoče lahko razložimo zakaj era1-2 lahko obstoji, čeprav
ji primanjkuje aktivnosti FTaze. Z današnjimi orodji in tehnologijo bomo tudi ta vprašanja
lahko enkrat razjasnili. (S. Yalovsky in sod.)
3. 1. FARMEZILACIJA
Farmezilacija poteka na 15 C atomu ob prisotnosti encima farneziltransferaze.
V sinhroniziranih tobačnih tkivnih kulturah je povišanje FTazne aktivnosti povezano z
iniciacijo/začetkom celične delitve. Specifični inhibitor FTaze je manumicin, ki zavira celično
delitev. Ti zgodnji dogodki v rastlinskih celicah oz. v njihovem ciklu verjetno zahtevajo
farnezilacijo trenutno še nepoznanih proteinov. Med pregledom rastlin s hiperobčutljivim
odzivom na ABA (gen za β-podenoto FTaze je v tem mutantu izbrisan) so odkrili Arabidopsis
mutant. Ko so ga preučili so prišli do sklepa, da farnezilacija ni ključna proteinska
modifikacija za regulacijo celičnega cikla v rastlinah. Vseeno pa je to sklepanje lahko prehitro,
saj o tem še ne vemo dovolj. Očitna vloga rastlinske FTaze je v negativni regulaciji ABAsignalizacije in razkriva samo del kompleksnega delovanja proteinske prenilacije v funkcijah
celice, kar kaže na to, da še niso odkriti vsi proteini. (S. Yalovsky in sod.)
S pomočjo nekaterih računskih programov oz. modelov za identifikacijo rastlinskih
prenilacijskih substratov in zaznavo
CaaX box proteinov, so prišli do nekaj primernih
kandidatov (proteinov). Prenilacija večine proteinov je potrjena, ampak tobačni protein ANJ1
je prvi protein za katerega je bila farnezilacija demonstrirana in vivo. ANJ1 je rastlinski
homolog bakterijskega šaperona DnaJ. Funkcija ANJ1 še ni znana, farnezilacija proteina pa je
potrebna za membransko vezavo. V celicah je farnezilacija YDJ1 (kvasni homolog proteina
ANJ1) nujna za rast pri 37° C. Rezultati prikazujejo, da je samo farneziliran ANJ1 aktiven pri
povišanih temperaturah v kvasnih celicah, ne razkriva pa funkcije ANJ1 v rastlinah. (S.
Yalovsky in sod.)
Farneziltransferaze so tarča zdravil, saj inhibitorje farneziltransferaz najpogosteje uporablja
za kemoterapijo. Pri kemoterapiji tumorjev, je ključna specifična inhibicija funkcije proteinov
Ras, saj lahko mutirani protein Ras povzroči transformacijo evkariontske celice. (Kajdič S.)
3. 2. GERANILGERANILACIJA
Geranilgeranilacija poteka na 20 C atomu ob prisotnosti encima geranilgeraniltransferaze.
(Kajdič S.)
Glede na število identificiranih geranilgeranil-iranih proteinov v rastlinah je vloga GGTaze-I v
različnih celičnih procesih precej kompleksna. Najbolj poznani predstavniki Rac-povezanih
Rop družin (majhnih GTPaz) v rastlinah imajo prav tako C-terminalni CaaL box motiv in
polibazične sekvenčne domene, ki so blizu prenilnih akceptorskih cisteinov. Demonstrirali so
direktno geranilgeranilacijo le za enega predstavnika družine, ampak je zelo verjetno, da je
substrat za GGTazo-I večina Rop družin. Rac GTPaze so povezane v reorganizacijo aktinskega
citoskeleta preko aktivacije fosfatidilinozitol 4 - fosfat - 5 - kinaze. Verjetno imajo Rop
proteini povezano vlogo v regulaciji polarizirane rasti v rastlinskih celicah zaradi močno
izraženega Arabidopsis Rop proteina, ki pospešuje izotropno rast pri celični delitvi kvasnih
celic. Določeni Rop proteini se v rastlinah lokalizirajo na rob samega cvetnega pestiča in
konsistentno igrajo vlogo pri polarizirani celični rasti. Učinek geranilgeranil-acije na
membransko lokalizacijo GGTaze tarčnega proteina v rastlinah, je zaenkrat najbolje
razumljen za CaM53, ki pa je novejši tip proteina modificiranega s kalcijem (CaM), katerega
ni moč najti v kvasnih in sesalskih celicah. CaM53 ima tipično kalmodulinsko domeno s
podaljšanim C-koncem s 34-imi aminokislinami, ki so bogate z lizinom in argininom in
tipičnim GGTaza-I CaaL motivom. Preniliran CaM53 verjetno prikazuje pomemben pogled na
funkcijo CaM53 in fiziološke spremembe v celici. (S. Yalovsky in sod.)
Obstaja poznan encimski mehanizem za vezavo prenilne skupine in proteina s tio-estersko
vezjo in verjetno je, da lokalizacijo jedra v CaM53 vsebuje novo sintetizirani protein, ki ne
postane preniliran. CaM53 ima za regulacijo proteinske aktivnosti v plazemski membrani ali v
jedru potencial, saj bi bila prenilacija proteina lahko kontrolirana s pomočjo mnogih
fizioloških mehanizmov. (S. Yalovsky in sod.)
3. 3. VLOGA PRENILACIJE
Prenilacija ima vlogo pri celični rasti in diferenciaciji, signalizaciji, citokinezi, transportu in
razmeščanju proteinov med membranami. Raziskave temeljijo na izražanju in analizi
mutiranih proteinov, ki ne morejo biti prenilirani (zamenjava cisteina s Serinom, uporaba
kompaktina in mevinolina na celicah, ki izražajo onkogeni Ras protein). (Kajdič S.)
4. MODIFIKACIJE PROTEINOV S HOLESTEROLOM
Poleg njegovih številnih vlog v sami strukturi membrane, so holesterol raziskali tudi za
modifikacije s posttranslacijskimi proteini v družini signalnih proteinov povezanih s hedgehog
(Hh) proteini. To modifikacijo so identificirali pri študijah na procesiranju Drosophila Hh
proteina. Med biosintezo se je Hh protein avtokatalitsko razcepil, domena s karboksi koncem
se je umaknila in holesterol se je kovalentno vezal na domeno z amino koncem preko aktivne
signalne molekule. Hh proteini, ki jih najdemo v insektih, vretenčarjih in drugih večceličnih
organizmih, predstavljajo del sekretornih signalnih molekul vključenih v strukturiranje
različnih tkiv med razvojem. Modifikacija Hh signalnih proteinov s holesterolom je ključna za
njihovo lastno vezavo na specifična tkiva med razvojem. (D. E. Vance in sod.)
4. 1. DODAJANJE HOLESTEROLA NA HEDGEHOG PROTEINE:
Novo sintetizirani Hedgehog (Hh) prokurzorski proteini (približno 45 kDa) vsebujejo signalno
sekvenco na N-koncu, ki veže proteine na ER (endoplazmatskem retikulumu) in se razcepi
(pribl. 19 kDa) skupaj z ohranjenim tripeptidnim motivom Gly-Cys-Phe. C-konec procesne
domene pa se tako umakne aktivni signalni molekuli. Dodajanje holesterola na Hh proteine
se nadaljuje z avtoproteolitsko reakcijo na Gly-Cys-Phe tripeptidni sekvenci. Cepitev je
sprožena z nukleofilnim napadom tiolne strani Cys verige na N-konec domene z Gly in GlyCys peptidna vez se zamenja s tioestersko vezjo. Drugi nukleofilni napad hidroksilne skupine
holesterola pa ima za posledico umik C-konca procesne domene in produkcijo aktivne Hh
signalne molekule z vključenim C-koncem holesterolne modifikacije. Čeprav je bilo
prikazano, da lahko tudi drugi steroli substituirajo s holesterolom v in vitro Hh procesnih
poskusih, je prosta 3β-hidroksilna skupina ključnega pomena za obdelavo. (D. E. Vance in
sod.)
Poleg modifikacije s holesterolom se Hh proteini lahko tudi palmitoilirajo na N-terminalnem
koncu Cys ostanka (del CGPGR motiva) potem, ko je holesterol dodan. Aciltransferaza,
imenovana tudi Skinny Hh, je bila odkrita v Drisophila –i. Mutanti Skinny Hh celic ekspresirajo
Hh proteine, ki vsebujejo modifikacijo s holesterolom, manjka jim le amino-konec palmitata.
Ostanek palmitata je amidno vezan na N-konec proteina in ne s tioestersko vezjo na
cisteinsko stran verige. (D. E. Vance in sod.)
4. 2. BIOLOŠKI POMEN MODIFIKACIJE S HOLESTEROLOM:
S holesterolom modificirane Hh molekule morajo pripotovati do drugih celic, da iz njih
izvabijo odziv, čeprav hidrofobne holesterolne molekule delujejo kot membransko sidro. Hh
proteini, ki se cepijo na tem določenem cepitvenem mestu, niso modificirani s pomočjo
holesterola, pa kljub temu proizvajajo aktivne signalne molekule: študije na Drisophila –i so
pokazale, da tovrstni proteini niso ustrezno vezani in povzročajo nepravilnosti in celo smrt
zarodkov. (D. E. Vance in sod.)
Topna oblika Hh, ki se nahaja v celicah sesalcev (tudi sonic Hh) in je modificirana s
holesterolom, multimerna in biološko učinkovita, je bila izolirana iz okončine razvijajočega se
piščančjega mladiča. Potrebna je sprostitev tega topnega kompleksa in predlagan model
pravi, da se Hh protein, ki je modificiran s holesterolom, prestavi na ekstracelularno stran
lipidnih raftov, kjer se zgodi multimerizacija in topen kompleks lahko potuje do tarčne celice
in izzove njen efekt. (D. E. Vance in sod.)
Holesterolne modifikacije Hedgehog proteinov promovirajo proliferacijo, preprečujejo
apoptozo in določujejo, kako se bo celica diferencirala. Ti protein so pomembni tudi pri
odraslih osebah, saj lahko spremembe povzročijo različne bolezni, kot je na primer rak.
(Kajdič S.)
5. GPI SIDRANJE PROTEINOV
GLIKOZIL FOSFATIDIL INOZITOL - i (GPI - i) so obstoječa družina evkariontskih glikolipidov.
GPI-ji so bili prvotno odkriti pri kovalentni vezavi na celični površini glikoproteinov in so bili
prepoznani kot pomemben alternativni mehanizem za sidranje proteinov na celično
površino. Po sintezi GPI sidra in pritrditvi na protein v endoplazemskem retikulumu se GPI
sidrani proteini transportirajo do celične površine. GPI sidra se nahajajo na različnih
funkcionalnih delih proteinov in glikokonjugatih, vključujoč celične receptorje na površini,
celične skupke molekul, hidrolaze na celični površini, regulatorne proteine in površinske
molekule praživali. (D. E. Vance in sod.)
GPI - sidra služijo ne samo za pritrditev proteinov na celico, ampak imajo tudi vlogo
označevalcev in so sestavni del lipidnih raftov, ki so odporni na detergente in sodelujejo s
sfingolipidi in sterolno bogatimi domenami v membranah, ki imajo pomembno vlogo pri
aktivaciji signalnih kaskad. (D. E. Vance in sod.)
5. 1. SUBCELULARNA LOKACIJA IN MEMBRANSKA TOPOLOGIJA BIOSINTEZE GPI
Biosinteza GPI poteka v ER, ker pa je ER zelo heterogen organel, biosinteza GPI oz. njene
aktivnosti niso enakomerno razporejene po prostornini ER - a. Sposobnost za sintetiziranje
GlcNAc-PI je enakomerno razporejena po ER celicah sesalcev, medtem ko so nadaljnji koraki
biosinteze, ki vodijo do nastanka (EtN-P)Man-GlcN-PI, zelo pogosti v ER predelu, ki je
povezan z mitohondrijem. Razlog za segregacijo nekaterih reakcij biosinteze v mitohondrijski
predel ni znan. (D. E. Vance in sod.)
5. 2. PRITRDITEV GPI NA PROTEINE
Novo sintetizirani proteini se pritrdijo na predhodno obstoječe GPI-je na lumenski strani ER.
Proteini, ki se morajo GPI usidrati, vsebujejo N-terminalno signalno sekvenco za ciljanje na
ER in C-terminalno signalno sekvenco, ki usmeri GPI sidro. N-terminalna signalna sekvenca je
pritrjena s signalno peptidazo med ali po translokaciji nastajajočega polipeptida v lumen ER.
C-terminalna signalna sekvenca je nato pritrjena in premešana z GPI sidrom s pomočjo
delovanja GPI transmidaze (Slika 3). (D. E. Vance in sod.)
Slika 3: GPI sidranje proteinov (D. E. Vance in sod., 2002).
Motiv zaporedja za GPI sidranje vsebuje 4 elemente: (1) nestrukturirano vezavo na odseku
11-ih ostankov (ω-11 do ω-1); (2) 4, če je možno, majhne aminokisline (ω-1 do ω+2) in tudi
razcepljen del; (3) zmerno polaren vmesni predel (ω+3 do ω+9); in (4) hidrofobni rep od ω+9
ali ω+10 do C-končnega. Kompleks GPI transmidaze, odgovoren za pritrditev proteina na GPI
sidro, je sestavljen iz vsaj petih podenot: Gpi8p, Gaa1p, PIG-S, PIG-T in PIG-U. Encim
prepozna pro-protein, ki nosi signal za GPI sidranje, se pritrdi na signalno področje in pritrdi
nov karboksi konec na začetni EtNP. (D. E. Vance in sod.)
Gpi8p je membranski protein z veliko lumensko domeno (domena, ki sega v področje lumna)
in ima podobno sestavo kot družina cisteinskih proteaz, ki imajo mehanizacijo
endopeptidaze in aktivnost transmidaze. Cisteinski in histidinski ostanki, ki se nahajajo med
cisteinsko preoteazo in Gpi8p, so nujni za aktivnost GPI transmidaze, zato se predpostavlja,
da je na Gpi8p pritrjena sekvenca za signal in deluje v reakciji transmidacije. Naloge ostalih
podenot so še neznane. (D. E. Vance in sod.)
ZAKLJUČEK
To delo razlaga post-translacijske lipidne modifikacije proteinov, ki predstavljajo
funkcionalno kritične dodelave proteinske strukture. Te modifikacije, z možno izjemo
tioacilacije, so lahko pričakovane na stopnji primarnih proteinov ali na delih oblike
primarnega proteina in omogočajo predpostavke o lokalizaciji in obnašanja modificiranih
proteinov znotraj celice.
Modifikacije proteinov z lipidi so veljale za stabilna membranska sidra samo za topne
proteine, sedaj pa imajo več pozornosti pri uveljavljanju vloge v različnih signalnih poteh in
regulatornih mehanizmih. Večina večceličnih organizmov ima uveljavljene specifične tipe
lipidov in unikatnih encimov za kataliziranje številnih izbranih modifikacij proteinov – večina
jih je evolucijsko zavarovanih v rastlinah, živalih in glivah. Izmed modifikacij z lipidi lahko
prenilacija proteina služi tudi kot posrednik med citoplazemsko biosintezo izoprena in
regulatornimi potmi, ki kontrolirajo celični cikel in rast.
Skozi vsa raziskovanja postaja jasno, da modifikacije z lipidi niso samo 'maščobe na proteinih'
ampak del visoko zapletene in ohranjene mreže z vlogo usklajevanja delovanja zapletenih
celičnih funkcij. Analize biofizikalnih lastnosti membranskih povezav z lipidno modificiranimi
proteini, vloga v rafte združenih proteinov v celični signalizaciji in regulacija delovanja
proteinov z lipidno modifikacijo verjetno še naprej ostajajo zelo plodna področja
raziskovanja. (S. Yalovsky in sod.) (D. E. Vance in sod.)
VIRI IN LITERATURA
-
Modifikacije proteinov z lipidi, Kajdič Saša,
http://bio.ijs.si/~krizaj/group/Predavanja%202011/Seminar-SasaKajdic.pdf, 14. 12.
2014.
-
Palmitoilacija, The AOCS Lipid Library,
http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/protlip/index.htm, 14. 12. 2014.
-
Vance D. E., Vance J. E.: Biochemistry of Lipids, Lipoproteins and Membranes, Elsevier,
2002, 37 – 54.
-
Yalovsky S.; Rodriguez-Concepcion M.; Gruissem W. Lipid modifications of proteins –
slipping in and out of membranes. Trends in Plant Science. 1999, 4, 11, 439 – 445.
-
Slovenski medicinski slovar - Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta
(http://www.termania.net/slovarji/slovenski-medicinski-slovar/5534564/prenilacija ),
14. 12. 2014
-
Protein Prenylation: Molecular Mechanisms and Functional Consequences
of
Biochemistry
(http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.bi.65.070196.001325?jour
nalCode=biochem) 14.12.2014