HIGH PRESSURE LIQUED
CHROMATOGRAPHY
(HPLC)
Valeria Feinshtein
‫מבוא‬
‫• כרומטוגרפיה (‪ )Chromatography‬היא שיטה‬
‫בכימיה אנליטית המאפשרת הפרדה של חומרים‬
‫המצויים בתערובת‪ ,‬זיהויים וקביעת כמּותם‪.‬‬
‫• פרוש המילה – הפרדת חומרים צבעוניים‬
‫(מהפרדת מצויים צמחיים)‪.‬‬
‫• השיטה מתבססת על יכולת ספיחה שונה של‬
‫חומרים על פני חומרים מספחים‪ :‬כל חומר‬
‫בתערובת נספח בחוזק שונה לחומר המספח וכך‬
‫נוצרת ההפרדה‪.‬‬
‫שיטות‬
‫• כרומטוגרפיה על נייר ‪:‬‬
‫משתמשים בנייר סינון רגיל‪ .‬מטפטפים טיפה מן‬
‫התערובת על הנייר ומכניסים אותו לנוזל ההפרדה‪,‬‬
‫כך שהנוזל אינו מגיע עד לטיפה‪.‬‬
‫הנוזל מתחיל לעלות למעלה בכוח הנימיות‪,‬‬
‫ו"סוחף" איתו את חומרי התערובת‪ .‬ככל שחומר‬
‫מסתפח חזק יותר לנייר‪ ,‬כך הוא יעלה פחות‪,‬‬
‫ולהפך‪.‬‬
‫משווים לקונטרול ידוע‪.‬‬
‫‪TLC = Thin Layer‬‬
‫‪Chromatography‬‬
‫שיטה דומה מאוד לכרומטוגרפיה על נייר‪ ,‬רק במקום‬
‫הנייר משתמשים בחומר סופח כגון סיליקה או‬
‫אלומינה על משטח קשה כגון זכוכית או אלומיניום‪.‬‬
‫כרומטוגרפית עמודה‬
‫• כרומטוגרפיה בעמודה‬
‫‪ .1‬זיקה ‪ :‬שימוש עיקרי בהפרדת חלבונים‪ .‬דוגמא‪:‬‬
‫מילוי עמודה (קולונה) בחומר מספח‪ ,‬וזו תהיה‬
‫הפאזה הנייחת‪ .‬אליה ניתן לחבר רצפטור שיקשור‬
‫את החלבון הרצוי‪ .‬מזליפים את התערובת הנוזלית‬
‫= הפאזה הניידת ובה התערובת על הפאזה‬
‫הנייחת‪ ,‬היא מחלחלת דרך העמודה‪ ,‬כאשר החלבון‬
‫הרצוי נקשר לרצפטור ונשאר בעמודה‪.‬‬
‫ביצוע אילוציה עם חומר אשר יספח עליו חזק יותר‬
‫את החלבון‪.‬‬
‫‪ .2‬שיטות נוספות דומות ‪:‬‬
‫• שחלוף יונים (הפרדה על פאזה נייחת "ממולאת"‬
‫ביונים שמשתחלפים עם היונים שבתערובת‬
‫הניידת)‪.‬‬
‫• הפרדה לפי גודל (לדוגמא‪ :‬פאזה נייחת עם פורות‪/‬‬
‫כדורים בגדלים שונים‪ ,‬כך רק חומר בגודל מסוים‬
‫יוכל לעבור)‪.‬‬
‫• שיטות מתקדמות‪:‬‬
‫‪ .1‬כרומטוגרפיה גזית‪.‬‬
‫‪ .2‬כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה‪.‬‬
‫• על מנת להבין היטב את השיטות המתקדמות‪,‬‬
‫נלך כמה צעדים אחורה‪....‬‬
‫•‬
‫‪ Direct Phase‬או ‪??? Reverse Phase‬‬
‫‪ .1‬הפאזה הנייחת המקובלת ‪:‬‬
‫סיליקה ‪ SiO2‬או אלומינה ‪ .Al2O3‬סופחות חומרים‬
‫פולאריים‪ .‬ככל שהחומר פולארי יותר‪ ,‬נספח חזק יותר‪.‬‬
‫‪ .2‬ספיחה לא ספציפית‪ .‬שליטה על הספיחה ניתן לקבל ע"י‬
‫הוספת סולבנטים שונים‪ .‬לדוגמא‪:‬‬
‫הקסן – לא פולארי‪ ,‬אילוציה איתו תביא ליציאת החומרים‬
‫הלא פולאריים‪.‬‬
‫אלכוהול – פולארי ביותר‪ ,‬אילוציה איתו תביא ליציאת‬
‫החומרים הכי פולאריים‪.‬‬
‫שילובים שונים בין סולבנטים שונים בעלי פולאריות שונה‪,‬‬
‫יאפשרו הפרדה של תערובות‪( .‬דוגמא בסוף המצגת)‪.‬‬
‫החסרונות של ה‪Direct phase chromatography -‬‬
‫• בעיה ‪ :1‬המים ממיסים אותה והורסים אותה‪.‬‬
‫• בעיה ‪ :2‬ככל שהחומר שומני יותר הוא יצא מהר יותר‬
‫מהמערכת‪ ,‬והחומרים הפולאריים נתקעים הקולונה‬
‫לזמן ממושך‪ .‬רוב התרופות – הן מולקולות פולאריות‪.‬‬
‫• בעיה ‪ :3‬שמירה על סולבנטים בצורה אל מיימית קשה‬
‫ויקרה למדי‪.‬‬
‫• בשיטת ה‪ :Reverse -‬הסיליקה עברה תהליך אלקילציה‪.‬‬
‫• מוספות קב' פחממניות ‪( C4, C8, C18 :‬וריאביליות)‪.‬‬
‫• כך הפאזה הנייחת מוגנת מפני פרוק והופכת לליפופולית‪.‬‬
‫• החומרים הפולאריים יוצאים ראשונים (הפוך למה שראינו‬
‫קודם)‪ .‬הבעיות שהוזכרו קודם לכן נפתרו‪.‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫כיום כמעט ואין שימוש לקולונות העמודה‪ ,‬ונהוג‬
‫לעבוד בלחצים גבוהים בכרומטוגרפיה‪.‬‬
‫סיליקה שעברה אלקילציה והוכנסה לקולונה –‬
‫מייד תדחס בהפעלת לחץ גבוה‪.‬‬
‫פתרון לבעיה זו‪ :‬כדורי זכוכית עמידים ללחץ‪,‬‬
‫מצופים בסיליקה שעברה אלקילציה‪ .‬גודל‬
‫הכדוריות וריאבילי‪. mm 3,5,10 :‬‬
‫כיום הפאזה הנייחת הנפוצה ביותר – ‪: C18‬‬
‫כדוריות זכוכית מצופות סיליקה‪ ,‬אשר עברה‬
‫אלקילציה עם שיירים פחממניים באורך ‪.C18‬‬
precolumn
‫הפאזה הניידת ‪:‬‬
‫סולבנטים שונים המוזרמים למערכת בלחץ שנקבע‪.‬‬
‫• פאזה ניידת אשר מוזרמת בריכוז קבוע למערכת –‬
‫איזוקראטית‪ .‬טובה להפרדת חומרים לפי הודרופוביות‪/‬‬
‫הידרופיליות ( ‪ FQ‬לדוגמא)‪.‬‬
‫• פאזה ניידת אשר מוזרמת בריכוז משתנה – גראדיאנט‪.‬‬
‫טובה להפרדת תערובת חומרים אשר זהים בבסיסם‪,‬‬
‫אך טעונים שונה‪( .‬לדוגמא‪.)cAMP,cADP,cATP :‬‬
‫הזרקת הפאזה הניידת למערכת‪:‬‬
‫• ישנם כמה אמצעים בעזרתם ניתן להזריק את הפאזה‬
‫הניידת למערכת ‪:‬‬
‫‪ :Reciprocating Piston Pumps .1‬פיסטונים אשר‬
‫מתמלאים ומזריקים את הנוזל במהירות גבוהה‪ .‬המילוי‬
‫לוקח ‪( msec‬אין זרימה בזמן זה)‪ .‬נותן "רעש רקע"‬
‫במערכת‪.‬‬
‫‪ :Syringe Type Pumps .2‬מזרק עם נפח קבוע‪ ,‬אשר‬
‫ממולא בתחילת האנליזה‪ ,‬עם נפח המתאים לאותה‬
‫אנליזה בלבד‪ .‬טוב עבור אנליזות רגישות במיחד‪.‬‬
‫קולונות‬
HPLC
METHOD
COLUMN/MOBILE
PHASE
USES
REVERSE PHASE
C-18, C-8
AQUES /ORGANIC
NEUTRAL OR
NONIONIZED
COMPOUNDS
ANION OR CATION
EXCHANGE,
AQUES MOBILE PLUS
BUFFER
MIXURES OF
INORGANIC IONS,
Nucleic acid
ION-EXCHANGE
HPLC
SIZE-EXCLUSION
HPLC
Polystyrene or silica
Aqueous or organic
High-molecular-weight
such proteins and
synthetic polymers
‫ ניתנת‬.‫ אשר נועדה להגן על ניקיון הקולונה‬,‫ תוספת לפני הקולונה‬: Precolumn
.‫ זולה יחסית‬,‫להחלפה‬
‫גלאים‬
Ultra-Violet (UV)
Fluorescent
Radiochemical
Electrochemical
Near-Infra Red (Near-IR)
Mass Spectroscopy (MS)
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)
Light Scattering (LS)
•
•
•
•
•
•
•
•
‫• הגלאים מותאמים לתכונות החומרים המופרדים‪.‬‬
‫• למשל ‪:‬‬
‫עבור חומר עם בליעה פלואורוסנטית כמו ‪ – FQ‬נשתמש‬
‫בגלאי‪....‬‬
‫עבור חומר עם בליעה בתחום ‪ ,UV‬כמו ‪,Nitrofurantoin‬‬
‫נשתמש בגלאי‪...‬‬
‫עבור חומר המסומן באיזוטופ ראדיואקטיבי‪ ,‬נשתמש‬
‫בגלאי‪...‬‬
‫‪ = Recorder‬רשם‬
‫• מחשב אשר מכמת את הסיגנל המגיע מהגלאי‪ ,‬ומוציא פלט‬
‫בצורת פיקים‪ .‬גודל הפיק פרופורציונלי לריכוז‪/‬כמות החומר‪.‬‬
‫• הפרמטרים החשובים‪:‬‬
‫• ‪ – RT‬זמן יציאת החומר‬
‫מהמערכת‪ .‬ישאר קבוע‬
‫בתנאים קבועים‪,‬‬
‫וכל יכול לאפיין חומר‪.‬‬
‫• סימטריית הפיק ‪.1±‬‬
‫• רצולוזיה ‪ -‬מחושבת לפי המשוואה הבאה ‪:‬‬
‫)‪Rs=(T2-T1)/[0.5(W1+W2‬‬
‫‪Rs≥ 1.5; complete separation‬‬
‫חישוב גודל פיק‬
‫• איך מחשבים גודל פיק אם הרשם הפסיק לעבוד?‬
‫• גובה * רוחב הבסיס בחצי הגובה!‬
‫• חשוב להתאים את הרכב הפאזה הניידת להפרדה‬
‫הטובה ביותר‪ .‬לדוגמא ‪:‬‬
‫בסך הכל ישנן כמה פרמטרים רצויים בעבודה עם ‪: HPLC‬‬
‫•‬
‫‪.1‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.3‬‬
‫‪.4‬‬
‫‪.5‬‬
‫לסיכום‪:‬‬
‫פרמטרים משתנים‪:‬‬
‫גודל השיירים הפחממניים‪.‬‬
‫גודל הכדוריות‪.‬‬
‫עבודה בלחצים שונים‪.‬‬
‫גלאים שונים‪.‬‬
‫סולבנטים שונים‪.‬‬
‫פאזה נייחת‬
‫כל אלה נותנים וריאביליות גדולה מאוד ויכולת‬
‫הפרדה טובה ויעילה של חומרים שונים‪.‬‬
‫שימושים של ‪HPLC‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫ברוקחות ‪ :‬משתמשים בשיטה להפרדה וכימות חומרים‪.‬‬
‫כמו כן לבדיקת ניקיון חומרים שונים‪ .‬דוגמא ‪:‬‬
‫מפעל ‪ X‬מייצר עבור מפעל ‪ Y‬את החומר הפעיל בתרופה‬
‫‪ .ASPIRIN‬מפעל ‪ X‬מעוניין לבדוק את ניקיון החומר‬
‫המסופק לו‪ ,‬לפני שיתחיל את ייצור התרופה‪.‬‬
‫שימוש רפואי‪ :‬בדיקה של רמות תרופה ‪ Z‬בדמו של חולה‪.‬‬
‫( לדגמא‪ :‬ניטור חולה שאושפז עקב זיהום חמור בדרכי‬
‫השתן והכליות‪ ,‬אשר מקבל ‪.)I.V. Levofloxacin‬‬
‫כרומטוגרפיה בגז‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫המערכת דומה ל ‪ ,HPLC -‬אבל ‪:‬‬
‫הפאזה ניידת – גזית‪ .‬משתמשים בגז אינרטי כגון‬
‫‪.N2, He, Ar‬‬
‫התערובת המוזרקת הופכת לגז‪.‬‬
‫כאשר החומרים יוצאים מהקולונה הם נשרפים‪,‬‬
‫ולפי כמות הפחמן הדו‪-‬חמצני המתקבל משרפת‬
‫החומר מתבצע הכימות‪( .‬כמות הפחמן הדו‪-‬חמצני‬
‫פרופורציונלית לכמות החומר הנבדק)‪.‬‬
‫השיטה טובה עבור חומרים אורגניים‪.‬‬
‫תודה על ההקשבה!‬