HIGH PRESSURE LIQUED CHROMATOGRAPHY (HPLC)
HIGH PRESSURE LIQUED CHROMATOGRAPHY (HPLC) Valeria Feinshtein מבוא • כרומטוגרפיה ( )Chromatographyהיא שיטה בכימיה אנליטית המאפשרת הפרדה של חומרים המצויים בתערובת ,זיהויים וקביעת כמּותם. • פרוש המילה – הפרדת חומרים צבעוניים (מהפרדת מצויים צמחיים). • השיטה מתבססת על יכולת ספיחה שונה של חומרים על פני חומרים מספחים :כל חומר בתערובת נספח בחוזק שונה לחומר המספח וכך נוצרת ההפרדה. שיטות • כרומטוגרפיה על נייר : משתמשים בנייר סינון רגיל .מטפטפים טיפה מן התערובת על הנייר ומכניסים אותו לנוזל ההפרדה, כך שהנוזל אינו מגיע עד לטיפה. הנוזל מתחיל לעלות למעלה בכוח הנימיות, ו"סוחף" איתו את חומרי התערובת .ככל שחומר מסתפח חזק יותר לנייר ,כך הוא יעלה פחות, ולהפך. משווים לקונטרול ידוע. TLC = Thin Layer Chromatography שיטה דומה מאוד לכרומטוגרפיה על נייר ,רק במקום הנייר משתמשים בחומר סופח כגון סיליקה או אלומינה על משטח קשה כגון זכוכית או אלומיניום. כרומטוגרפית עמודה • כרומטוגרפיה בעמודה .1זיקה :שימוש עיקרי בהפרדת חלבונים .דוגמא: מילוי עמודה (קולונה) בחומר מספח ,וזו תהיה הפאזה הנייחת .אליה ניתן לחבר רצפטור שיקשור את החלבון הרצוי .מזליפים את התערובת הנוזלית = הפאזה הניידת ובה התערובת על הפאזה הנייחת ,היא מחלחלת דרך העמודה ,כאשר החלבון הרצוי נקשר לרצפטור ונשאר בעמודה. ביצוע אילוציה עם חומר אשר יספח עליו חזק יותר את החלבון. .2שיטות נוספות דומות : • שחלוף יונים (הפרדה על פאזה נייחת "ממולאת" ביונים שמשתחלפים עם היונים שבתערובת הניידת). • הפרדה לפי גודל (לדוגמא :פאזה נייחת עם פורות/ כדורים בגדלים שונים ,כך רק חומר בגודל מסוים יוכל לעבור). • שיטות מתקדמות: .1כרומטוגרפיה גזית. .2כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה. • על מנת להבין היטב את השיטות המתקדמות, נלך כמה צעדים אחורה.... • Direct Phaseאו ??? Reverse Phase .1הפאזה הנייחת המקובלת : סיליקה SiO2או אלומינה .Al2O3סופחות חומרים פולאריים .ככל שהחומר פולארי יותר ,נספח חזק יותר. .2ספיחה לא ספציפית .שליטה על הספיחה ניתן לקבל ע"י הוספת סולבנטים שונים .לדוגמא: הקסן – לא פולארי ,אילוציה איתו תביא ליציאת החומרים הלא פולאריים. אלכוהול – פולארי ביותר ,אילוציה איתו תביא ליציאת החומרים הכי פולאריים. שילובים שונים בין סולבנטים שונים בעלי פולאריות שונה, יאפשרו הפרדה של תערובות( .דוגמא בסוף המצגת). החסרונות של הDirect phase chromatography - • בעיה :1המים ממיסים אותה והורסים אותה. • בעיה :2ככל שהחומר שומני יותר הוא יצא מהר יותר מהמערכת ,והחומרים הפולאריים נתקעים הקולונה לזמן ממושך .רוב התרופות – הן מולקולות פולאריות. • בעיה :3שמירה על סולבנטים בצורה אל מיימית קשה ויקרה למדי. • בשיטת ה :Reverse -הסיליקה עברה תהליך אלקילציה. • מוספות קב' פחממניות ( C4, C8, C18 :וריאביליות). • כך הפאזה הנייחת מוגנת מפני פרוק והופכת לליפופולית. • החומרים הפולאריים יוצאים ראשונים (הפוך למה שראינו קודם) .הבעיות שהוזכרו קודם לכן נפתרו. • • • • כיום כמעט ואין שימוש לקולונות העמודה ,ונהוג לעבוד בלחצים גבוהים בכרומטוגרפיה. סיליקה שעברה אלקילציה והוכנסה לקולונה – מייד תדחס בהפעלת לחץ גבוה. פתרון לבעיה זו :כדורי זכוכית עמידים ללחץ, מצופים בסיליקה שעברה אלקילציה .גודל הכדוריות וריאבילי. mm 3,5,10 : כיום הפאזה הנייחת הנפוצה ביותר – : C18 כדוריות זכוכית מצופות סיליקה ,אשר עברה אלקילציה עם שיירים פחממניים באורך .C18 precolumn הפאזה הניידת : סולבנטים שונים המוזרמים למערכת בלחץ שנקבע. • פאזה ניידת אשר מוזרמת בריכוז קבוע למערכת – איזוקראטית .טובה להפרדת חומרים לפי הודרופוביות/ הידרופיליות ( FQלדוגמא). • פאזה ניידת אשר מוזרמת בריכוז משתנה – גראדיאנט. טובה להפרדת תערובת חומרים אשר זהים בבסיסם, אך טעונים שונה( .לדוגמא.)cAMP,cADP,cATP : הזרקת הפאזה הניידת למערכת: • ישנם כמה אמצעים בעזרתם ניתן להזריק את הפאזה הניידת למערכת : :Reciprocating Piston Pumps .1פיסטונים אשר מתמלאים ומזריקים את הנוזל במהירות גבוהה .המילוי לוקח ( msecאין זרימה בזמן זה) .נותן "רעש רקע" במערכת. :Syringe Type Pumps .2מזרק עם נפח קבוע ,אשר ממולא בתחילת האנליזה ,עם נפח המתאים לאותה אנליזה בלבד .טוב עבור אנליזות רגישות במיחד. קולונות HPLC METHOD COLUMN/MOBILE PHASE USES REVERSE PHASE C-18, C-8 AQUES /ORGANIC NEUTRAL OR NONIONIZED COMPOUNDS ANION OR CATION EXCHANGE, AQUES MOBILE PLUS BUFFER MIXURES OF INORGANIC IONS, Nucleic acid ION-EXCHANGE HPLC SIZE-EXCLUSION HPLC Polystyrene or silica Aqueous or organic High-molecular-weight such proteins and synthetic polymers ניתנת. אשר נועדה להגן על ניקיון הקולונה, תוספת לפני הקולונה: Precolumn . זולה יחסית,להחלפה גלאים Ultra-Violet (UV) Fluorescent Radiochemical Electrochemical Near-Infra Red (Near-IR) Mass Spectroscopy (MS) Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Light Scattering (LS) • • • • • • • • • הגלאים מותאמים לתכונות החומרים המופרדים. • למשל : עבור חומר עם בליעה פלואורוסנטית כמו – FQנשתמש בגלאי.... עבור חומר עם בליעה בתחום ,UVכמו ,Nitrofurantoin נשתמש בגלאי... עבור חומר המסומן באיזוטופ ראדיואקטיבי ,נשתמש בגלאי... = Recorderרשם • מחשב אשר מכמת את הסיגנל המגיע מהגלאי ,ומוציא פלט בצורת פיקים .גודל הפיק פרופורציונלי לריכוז/כמות החומר. • הפרמטרים החשובים: • – RTזמן יציאת החומר מהמערכת .ישאר קבוע בתנאים קבועים, וכל יכול לאפיין חומר. • סימטריית הפיק .1± • רצולוזיה -מחושבת לפי המשוואה הבאה : )Rs=(T2-T1)/[0.5(W1+W2 Rs≥ 1.5; complete separation חישוב גודל פיק • איך מחשבים גודל פיק אם הרשם הפסיק לעבוד? • גובה * רוחב הבסיס בחצי הגובה! • חשוב להתאים את הרכב הפאזה הניידת להפרדה הטובה ביותר .לדוגמא : בסך הכל ישנן כמה פרמטרים רצויים בעבודה עם : HPLC • .1 .2 .3 .4 .5 לסיכום: פרמטרים משתנים: גודל השיירים הפחממניים. גודל הכדוריות. עבודה בלחצים שונים. גלאים שונים. סולבנטים שונים. פאזה נייחת כל אלה נותנים וריאביליות גדולה מאוד ויכולת הפרדה טובה ויעילה של חומרים שונים. שימושים של HPLC • • • • ברוקחות :משתמשים בשיטה להפרדה וכימות חומרים. כמו כן לבדיקת ניקיון חומרים שונים .דוגמא : מפעל Xמייצר עבור מפעל Yאת החומר הפעיל בתרופה .ASPIRINמפעל Xמעוניין לבדוק את ניקיון החומר המסופק לו ,לפני שיתחיל את ייצור התרופה. שימוש רפואי :בדיקה של רמות תרופה Zבדמו של חולה. ( לדגמא :ניטור חולה שאושפז עקב זיהום חמור בדרכי השתן והכליות ,אשר מקבל .)I.V. Levofloxacin כרומטוגרפיה בגז • • • • • המערכת דומה ל ,HPLC -אבל : הפאזה ניידת – גזית .משתמשים בגז אינרטי כגון .N2, He, Ar התערובת המוזרקת הופכת לגז. כאשר החומרים יוצאים מהקולונה הם נשרפים, ולפי כמות הפחמן הדו-חמצני המתקבל משרפת החומר מתבצע הכימות( .כמות הפחמן הדו-חמצני פרופורציונלית לכמות החומר הנבדק). השיטה טובה עבור חומרים אורגניים. תודה על ההקשבה!
© Copyright 2024