השוואה בין זנים מפרים ל`האס` וקביעה של יכולת ההפריה העצמית ב
השוואה בין זנים מפרים ל'האס' וקביעה של יכולת ההפריה העצמית ב'ג'ם' באמצעות פיתוח שיטה לזיהוי גנטי של ההורות בצאצאים דו"ח 3102-01 דורון שניידר– מו"פ צפון יעל לב ,רפי שטרן ומרטין גולדווי – מכללת תל-חי עמיר שרמן ,רון אופיר וורד יריחימוביץ – מחלקה למטעים מכון וולקני הדר כהן – מו"פ גליל מערבי תומר לוי – מטע געתון תוכן עניינים עמוד הקדמה........................................................................................................................ חומרים ושיטות............................................................................................................ 1 1 תוצאות ודיון .1א .אפיון SNPבזנים ההוריים ממטע 'האס' (......................................................)H 4 .1ב .קביעת המפרה בצאצאי 'האס' ( )Hממטע געתון בעזרת ...............................SNP 6 .2א .אפיון SNPבזנים ההוריים ממטע 'ג'ם' (....................................................)GE 7 .2ב .קביעת סוג ההפריה בצאצאי ג'ם ( )GEבעזרת .............................................SNP 9 סיכום ביניים של ההתקדמות בשני חלקי המחקר........................................................... 11 הקדמה דו"ח זה מסכם את ההתקדמות שהושגה במהלך שנת 2114בפיתוח שיטה גנטית לזיהוי ההורות בצאצאי אבוקדו .השיטה הגנטית לזיהוי ההורות בצאצאים בה אנו משתמשים מבוססת על SNP (Single- ) nucleotide polymorphismספציפיים לכל זן ,וזיהויים באופן מהיר ופשוט במכשיר .DHPLCמטרות המחקר הן .1 :השוואה ביעילות של ארבעה זנים מפרים שונים ל'האס' ( )Hו .2-לימוד התלות של הזן ג'ם ( )GEבהפריה זרה. הזן Hהוא זן האבוקדו המרכזי במטעי ישראל .הפירות שלו מבוקשים בשווקי העולם ,אך היבול עומד על כ 1.1-טון/דונם בממוצע עם סירוגיות גבוהה .בישראל משמש האטינגר (( )ETטיפוס פריחה )Bכזן מפרה בלעדי ל( H-טיפוס פריחה ,)Aויש צורך במציאת זנים מפרים מצטיינים נוספים .במסגרת המחקר תבחן איכות הזנים :זוטאנו ( ,)ZUאדרנול ( )EDו( )BL ( BL667-טיפוסי פריחה )Bכמפרים ל ,H-בהשוואה ל- .ETיעילות הזן המפרה תקבע לפי שיעור צאצאי ,Hשיתקבלו כתוצאה מהפריה עם גרגרי אבקה שלו. הזן GEהינו זן פטנטי מקליפורניה בעל פירות "דמויי האס" .לפירות GEדמיון לפירות ה H-מבחינת צורת הפרי וקליפה מחוספסת המשחירה בהבשלה .יחד עם זאת ,פירות GEגדולים בהשוואה ל H-והם מבשילים בינואר ,בעוד שפירות Hמבשילים כבר בנובמבר .ל GE-מספר יתרונות ע"פ ה :H-א .פוריות גבוהה יותר (כ 2-ט'/ד' ויותר במטע קונבנציונלי) וסירוגיות נמוכה יותר; ב .צימוח מתון ומבנה עץ קומפקטי המאפשרים נטיעה של העצים בצפיפות גדולה ( 3 x5מ ,)2אשר בה ניתן להגיע ליבולים גבוהים מ 2-ט'/ד'; ו-ג .עמידות גדולה יותר לתנאי קרה .פרחי ,GEבדומה לפרחי ,Hהם מטיפוס פריחה ,Aאך אין בספרות מידע לגבי יכולת ההפריה העצמית שלהם והתלות בהפריה זרה לקבלת יבול גבוה .במסגרת המחקר תבחן תכונה זו של ה GE-במטע בו נטועים עצים מהזן המפרה ( ETטיפוס פריחה )Bועצים מהזן לביא (( )LAטיפוס פריחה .)Aהחפיפה בין פרחי GEבמופע נקבי לבין פרחי LAבמופע זכרי אמורה להיות קצרה בגלל ששני הזנים מטיפוס פריחה ,Aולכן צפוי שהפריה בין שני זנים אלו לא תהיה שכיחה .אף על פי כן ,צאצאי GE שהופרו ע"י אבקת LAעשויים להתפתח .לכן יש צורך לפתח שיטה שתזהה בנוסף לצאצאי GEעצמיים וכאלו שהופרו ע"י ,ETגם אותם. חומרים ושיטות .1 נתוני המטעים .1.1מטע 'האס' (געתון) המטע נמצא בסמוך לקיבוץ געתון בגליל המערבי ,הוא ניטע בקיץ ,2112מרווחי נטיעה .4X1הזן העיקרי במטע הוא Hולסירוגין נטועים בו כל עץ שלישי בשורה שלישית המפרים: ED ,ZU ,ETו( BL -תמונה .)1 1 תמונה .1סכמת מטע Hעם המפרים ED ,ZU ,ETו .BL -במטע שלושה בלוקים שבכל אחד מהם חזרה של שורה אחת עם כל אחד מהזנים המפרים .עצי Hמתוארים על-ידי משבצות לבנות ,עצי ETבמשבצות צהובות ,עצי ZUבמשבצות כחולות ,עצי EDבמשבצות ירוקות ועצי BLבמשבצות סגולות. .1.2מטע 'ג'ם' ( ,GEגעתון) :המטע נמצא בסמוך לקיבוץ געתון בגליל המערבי .הזן העיקרי במטע הוא LA ונטועה בו שורת ETלסירוגין כל שלוש שורות .LAבמרכז המטע נטועות שלוש שורות מהזן GE (תמונה .)2עצי GEהורכבו בהרכבת סנדוויץ על Hב .2110-שתילי Hהמקוריים ניטעו ב ,2112-מרווחי הנטיעה בכל המטע הם 2.5 x 2.5מ 161 ,2עצים/ד'. תמונה .2סכמת מטע GEעם הזנים ETו .LA-במטע בלוק אחד של שלוש שורות ( GEמשבצות בכתום) שמשני צדדיו שורת ( ETמשבצות צהובות) .בשאר המטע 6בלוקים של 2שורות ( LAמשבצות בירוק) וביניהם שורת .ET .2חומר צמחי להפקת דנ"א שימשו עלים מהזנים ההוריים מעצים ממטעי געתון ED ,ZU ,ET ,H :ו BL-ממטע Hו- ET ,GEו LA-ממטע .GEכ 211-פירות ,GEכ 111 -מכל שורה ,שנאספו באקראי משני צידי כל אחת 2 מהשורות במטע געתון בינואר 2114נשמרו ב 4°C-עד מרץ ,הזרעים הוצאו מהפירות ,נשטפו במים ,נשתלו במשטחי הנבטה במצע טוף (חב' מרום גולן) והונבטו בחממה .דנ"א הופק מעלים שהתפתחו מהצמחונים. כל העלים מהזנים ההוריים ומהזרעים המונבטים נשמרו ב -70°C -עד לשימוש. .2הפקת דנ"א דנ"א גנומי הופק לפי 100-200mg .)1987( Doyle and Doyleעלים נכתשו במכתש ועלי בנוכחות חנקן נוזלי .האבקה הכתושה הורחפה ב 700μl -בופר הפקה המכיל,100mM Tris pH 8 : 2% ]20mM Ethylenediaminetetra Acetic Acid ,Hexadecyltrimethylammonium Bromide [CTAB 1% Polyvinylpyrolidone [PVP] MW=40000 ,1.4M NaCl ,[EDTA] pH 8ו1% 2- - .Mercaptoethanolהתערובת הודגרה 11דקות ב ,65°C -תוך כדי ערבוב מפעם לפעם .לאחר קירור לטמפרטורת החדר ,נערכו שני מיצויים עם ) .Chloroform:Octanol (24:1ה DNA-הושקע בעזרת Ethanolוהומס במים .הדנ"א נשמר ב -20°C-עד לשימוש. .4תגובת PCR תגובת PCRעם תחלים אוניברסלים ,המגבירים קטעים בהם עשויים להיות , SNPנערכה לשם הגברת קטעי דנ"א השונים במכשיר ) .Minicycler (MJ Research, Waltman, MA USAהתערובת לתגובת הPCR- הכילה בנפח 50μlאת המרכיבים הבאים 200μΜ ,FastStart Taq PCR buffer X1 ,20ng DNA (1μl) :מכל אחד מה 30pmol ,dNTP-מכל תחל ו1 unit FastStart Taq DNA Polymerase (Roche diagnostics, - ) .Almere, The Netherlandsרצף התחלים ותנאי תגובת PCRמפורטים בטבלאות 1ו.2- טבלה :1התחלים לתגובת PCR התחלים שם הSNP- Cell450 SNP1371, NP14471 Cell950 SNP971 STK400 SNP345 SNP314 SNP31A, SNP31B SNP094 SNP09 תחל )5'>3'( Forward תחל )3'>5'( Reverse 2 )Cell450-FD (1482-15022 ) Cell450-RB (1308-1327 GGCCAAGATGTCATACATGG TCTCTGTTATCTGGACCACCC )F (751-7712 )R (1022-10432 TGGGTCCACTTTGGGCATGGC AGAGAAGCCCACCTGTCAGTCG )F (307-3273 )R (458-4813 ACAAGGTTGCCAAGGGCAAGC GCACTCAATCCAAAGTCTGTAACC SNP31 F SNP31 R TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTA CGGGAGCACATACACAAATTGTATTC SNP09 F SNP09 R GCGAAAGAATCATCGTATGCCC CCCCTTCCGCCTATAGGTAGTTTTA 1המספר מתאר את מיקום ה SNP-ברצף הבסיסים בגן מהזן H 2מיקום התחל ברצף הבסיסים בגן ל Cellulase-מהזן )Acc. No. EU335600( H 2 מיקום התחל ברצף הבסיסים בגן ל STKמהזן )Acc. No. EU335745( H 4 פריימרים שהתקבלו ממרכז הגנומי במכון וולקני המגבירים רצף ובו ( SNPעמיר שרמן ורון אופיר ,תוצאות לא מפורסמות) 3 PCR- תגובת ה:2 טבלה ) זמן (דקות) מספר סיבובים°C( 'טמפ 1 1 91 1 1.1 91 1.1 10 1.1 72 21 1.1 91 1.1 11 1.1 72 1 1 72 DHPLC ע"י ריצוף ובמכשירSNP איפיון.1 לזיהוי הבדלים בדגמי הכרומטוגרמותDHPLC מדנ"א של הזנים ההוריים הורצו במכשיר הPCR תוצרי .GE נערך בצאצאיSNP - איפיון ראשוני של חלק מה.SNP כדי לזהות בהם,ולאחר מכן הם נשלחו לריצוף תוצאות ודיון )H( ' בזנים ההוריים ממטע 'האסSNP אפיון.א.0 ) ובוCell( Cellulase-) רוצף קטע מהגן לBL - וED ,ZU ,ET ,H( בגעתוןH בזנים ההוריים ממטע ובוCellulase- רוצפו בינתיים קטע נוסף מהגן לET- וH רק בזנים.)2 (תמונהSNP1447- וSNP1371 תחלים.) (תוצאות לא מובאותSNP345 ) ובוSTK( Serine Threonine Kinase - וקטע מהגן לSNP971 SNP09 ,SNP31 : התקבלו מהמרכז הגנומי בבית דגןSNP מאבוקדו המגבירים קטעי דנ"א בהם מצויים עם התחלים הללו נערכה על דנ"א מהזניםPCR תגובת.) תוצאות לא מפורסמות,(עמיר שרמן ורון אופיר בזנים ההוריים השונים בכלSNP - תכולת ה.)4 והקטעים המוגברים רוצפו (תמונה,ההוריים שהוזכרו צירופי.2 מופיעים בטבלה,DHPLC- כמו גם הכרומטוגרמה שהתקבלה עבורם ב,קטעי הדנ"א שנבדקו .4 ממטע געתון מופיעים בטבלהH האללים האפשריים בצאצאי HASS ETTINGER ZUTANO EDRANOL BL667 HASS ETTINGER ZUTANO EDRANOL BL667 HASS ETTINGER ZUTANO EDRANOL BL667 HASS ETTINGER ZUTANO EDRANOL BL667 GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG ************************************************************ SNP1371 AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT AGGYTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT AGGYTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT *** ******************************************************** SNP1447 TCAGTACCTGTATTCTAGCCCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG TCAGTACCTGTATTCTAGCTCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG TCAGTACCTGTATTCTAGCTCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG TCAGTACCTGTATTCTAGCYCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG TCAGTACCTGTATTCTAGCCCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG ******************* **************************************** TCCAGATAACAGAGA TCCAGATAACAGAGA TCCAGATAACAGAGA TCCAGATAACAGAGA TCCAGATAACAGAGA *************** 195 195 195 195 195 4 60 60 60 60 60 120 120 120 120 120 180 180 180 180 180 המכילBL- וED ,ZU ,ET ,H מהזנים ההורייםCellulase השוואת הרצף של קטע הגן ל:3 תמונה C/T=Y : מקרא האותיות.) (מסומנים ברקע צהובSNP1447 ,SNP1371 את SNP09: HASS ETTINGER ZUTANO EDRANOL BL667 HASS ETTINGER ZUTANO EDRANOL BL667 GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG ************************************************************ SNP09A GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 GTATCCACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 GTATCCACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 ***** ******************************************** 60 60 60 60 60 TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA ************************************************************ SNP31A SNP31B TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 TTAATTGCGTATCATACAATAAACGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 TTAATTGCGTATCATACAATAAACGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 ************* ********* ************************** 60 60 60 60 60 SNP31: HASS ETTINGER ZUTANO EDRADOL BL667 HASS ETTINGER ZUTANO EDRANOL BL667 ) (למטהSNP31- (למעלה) וSNP09 עם התחליםPCR קטעי דנ"א שהוגברו בתגובת.4 תמונה (מסומניםSNP31B- וSNP31A ,SNP09A המכילים אתBL- וED ,ZU ,ET ,H מהזנים ההוריים .)ברקע צהוב בכל קטעי,BL- וED ,ZU ,ET עם הזניםH בזנים ההוריים השונים במטעSNP - תכולת ה:3 טבלה .DHPLC-הדנ"א שנבדקו והכרומטוגרמות שהתקבלו עבורם ב 5 SNP31 זן שני האללים 1 כרומטוגרמה SNP09 זן שני האללים כרומטוגרמה cell450 זן שני האללים כרומטוגרמה stk400 זן שני האללים כרומטוגרמה cell950 זן שני האללים כרומטוגרמה H GT GT H T T H CC CC H T T H TT TT ET AC AC ET C C ET CT TT ET C T ET TT TC ZU AC AC ZU C C ZU CT TT ZU C T ZU TT TC ED GT GT ED T T ED CC CT ED T T ED TT TC BL GT GT BL T T BL CC CC BL C T BL TT TT 1האותיות מסמלות את הבסיסים באתרי ה SNP-ברצף שהוגבר בתגובת PCRעם התחלים המתאימים .מיקום ה SNP-ברצף הדנ"א מפורט בטבלה 1 ברקע צהוב ה SNP -הצפויים לפי דמיון לכרומטוגרמות משאר הזנים SNP .אלו טרם רוצפו. .0ב .קביעת המפרה בצאצאי 'האס' ( )Hממטע געתון בעזרת SNP בכל הצאצאים של הזן Hנמצא תמיד אלל אחד של ( Hאימהי) שמקורו בביצית ,כאשר המקור של האלל השני יהיה מגרגר האבקה של הזן המפרה .בטבלה 4ניתן לראות את האפשרויות של שילובי האללים בצאצאי Hעצמיים ובכאלו שיתקבלו לאחר הפריה זרה בנוכחות הזנים המפרים ED ,ZU , ET :ו.BL- מהטבלה עולה ש SNP31 -ו SNP09-הם SNPאינפורמטיביים ,כיוון שניתן באמצעותם לזהות בוודאות את כל צאצאי ה H -שהתקבלו מהפריה עם גרגרי אבקה מהזנים ETו( ZU -צאצאים מסוג .)2באמצעות SNP1371ו SNP1447-מהגן ל Cellulase-ניתן יהיה לדעת מהי הכמות של מחצית מצאצאי Hשיופרו ע"י ( EDהחסרת מספר צאצאים מסוג 2במספר הצאצאים מסוג .)2כדי לאפיין את מקור האבקה שהפרתה את כל הסוגים של צאצאי Hממטע געתון יש צורך למצוא SNPנוספים שיבדילו בין צאצאי Hעצמיים לצאצאי Hשהופרו ע"י EDו ,BL-ו SNP -שיבדילו בין צאצאי Hשהופרו ע"י ETו .ZU-העצים במטע זה ניטעו בקיץ .2112רק במהלך 2116תערך אנליזה גנטית של פירות Hראשונים ממטע זה ,שיבשילו בסתיו .2111 6 טבלה :4תכולת SNPבצאצאי Hהאפשריים ממטע בו נטועים הזנים המפרים .BL ED ,ZU ,ET סוג הצאצא :SNP31 צאצא 1 צאצא 2 מקור האלל אמא ()H אבא אמא ()H אבא :SNP09 אמא ()H צאצא 1 אבא אמא ()H צאצא 2 אבא :Cellulase אמא ()H צאצא 1 אבא אמא ()H צאצא 2 אבא אמא ()H צאצא 2 אבא האבא בצאצאי H שם הSNP- H SNP31A SNP31B G T G T G T A C SNP09A T T T C SNP1371 SNP1447 C C C C C C C T C C T T ET ZU √ H √ √ ET ZU √ H √ √ ET ZU √ √ √ √ √ ED BL √ √ ED BL √ √ ED BL √ √ √ .3א .אפיון SNPבזנים ההוריים ממטע 'ג'ם' ()GE בזנים ההוריים ממטע GEבגעתון ( ET ,GEו )LA-רוצף קטע מהגן ל Cellulase-ובו SNP1371ו- ( SNP1447תמונה .)1רק ב ET-רוצפו קטע נוסף מהגן ל Cellulase-ובו SNP971וקטע מהגן לSerine - )STK( Threonine Kinaseובו ( SNP345תוצאות לא מובאות) .תחלים מאבוקדו המגבירים קטעי דנ"א בהם מצויים SNPהתקבלו מהמרכז הגנומי בבית דגן( SNP09 ,SNP31 :עמיר שרמן ורון אופיר ,תוצאות לא מפורסמות) .תגובת PCRעם התחלים הללו נערכה על דנ"א מהזנים ההוריים שהוזכרו ,והקטעים המוגברים רוצפו (תמונה .)6תכולת ה SNP-בזנים ההוריים השונים בכל קטעי הדנ"א שנבדקו ,כמו גם הכרומטוגרמה שהתקבלה עבורם ב ,DHPLC-מופיעים בטבלה .1צירופי האללים האפשריים בצאצאי GE ממטע געתון מופיעים בטבלה .6 7 GEM ETTINGER LAVI GEM ETTINGER LAVI GEM ETTINGER LAVI GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG ************************************************************ SNP1371 AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT AGGYTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT *** ******************************************************** SNP1447 TCAGTACCTGTATTCTAGCYCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG TCAGTACCTGTATTCTAGCTCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG TCAGTACCTGTATTCTAGCYCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG 60 60 60 120 120 120 180 180 180 ******************* **************************************** GEM ETTINGER LAVI TCCAGATAACAGAGA 195 TCCAGATAACAGAGA 195 TCCAGATAACAGAGA 195 *************** המכיל אתLA- ו,ET ,H מהזנים ההורייםCellulase השוואת הרצף של קטע הגן ל:5 תמונה C/T=Y : מקרא האותיות.) (מסומנים ברקע צהובSNP1447 ,SNP1371 SNP09: GEM ETTINGER LAVI GEM ETTINGER LAVI GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG 60 GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG 60 GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG 60 ************************************************************ SNP09A GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 GTATCCACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110 ***** ******************************************** SNP31: GEM ETTINGER LAVI GEM ETTINGER LAVI TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA 60 TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA 60 TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA 60 ************************************************************ SNP31A SNP31B TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 TTAATTGCGTATCATACAATAAACGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110 ************* ********* ************************** ) (למטהSNP31- (למעלה) וSNP09 עם התחליםPCR קטעי דנ"א שהוגברו בתגובת.6 תמונה .) (מסומנים ברקע צהובSNP31B- וSNP31A ,SNP09A המכילים אתLA- וET ,H מהזנים ההוריים 8 טבלה :5תכולת ה SNP -בזנים ההוריים השונים במטע GEעם הזנים ETו LA-בכל קטעי הדנ"א השונים שנבדקו והכרומטוגרמות שהתקבלו עבורם ב.DHPLC- SNP31 1 זן שני האללים כרומטוגרמה זן SNP09 שני האללים כרומטוגרמה זן cell450 שני האללים כרומטוגרמה זן stk400 שני האללים כרומטוגרמה זן cell950 שני האללים כרומטוגרמה GE GT GT GE T T GE CC CT GE C T GE TT TC ET AC AC ET C C ET CT TT ET C T ET TT TC LA GT GT LA T T LA CC CT LA C T LA TT TC .3ב .קביעת סוג ההפריה בצאצאי GEבעזרת SNP בכל הצאצאים של הזן GEנמצא תמיד אלל אחד של ( GEאימהי) שמקורו בביצית ,כאשר המקור של האלל השני יהיה מגרגר האבקה של הזן המפרה .בטבלה 6ניתן לראות את אפשרויות שילובי האללים בצאצאי GEעצמיים ובכאלו שיתקבלו לאחר הפריה זרה עם אבקת ETאו .LAמהטבלה עולה ש- SNP31ו SNP09-הם SNPאינפורמטיביים ,כיוון שניתן באמצעותם לזהות בוודאות את כל צאצאי ה- GEשהופרו ע"י ( ETצאצאים מסוג .)2באמצעות SNP1371ו SNP1447-מהגן ל Cellulase-ניתן יהיה לאפיין רבע מצאצאי GEהעצמיים (צאצא מסוג .)1כדי להגדיל את דרגת הוודאות של ההורות בצאצאי GEיש צורך למצוא SNPנוספים שיבדילו בין צאצאי GEעצמיים לצאצאי GEשהופרו ע"י .LA בשנה האחרונה (עונת )2112-14הופק דנ"א מעלים של כ 211-זרעי GEממטע געתון .במהלך השנה הקרובה בכוונתנו לקבוע את ההורות בצאצאים האלו ,כדי לקבוע האם ה GE -זקוק להפריה זרה ,וכן לאסוף צאצאים נוספים מעונת .2114-11בשלב זה נבדקה תכולת SNP09ב 11-מתוך 211צאצאי GEהנ"ל וכולם נמצאו הומוזיגוטים לאלל ( Tסוג צאצא 1בטבלה .)6מתוצאות ראשוניות אלה עולה שצאצאי GEלא התקבלו מהפריה זרה באמצעות גרגרי אבקה מהזן ETושלזן GEיכולת הפריה עצמית .כדי לבסס מסקנות אלה יש לבדוק את תכולת האלל במדגם רחב יותר של צאצאי GEוכן לשלול את האפשרות שצאצאי ה GE -התקבלו מהפריה זרה של גרגרי אבקה מפרחי הזן .LA 9 טבלה :6תכולת SNPבצאצאי GEהאפשריים ממטע בו נטועים הזנים ETו.LA- סוג הצאצא :SNP31 מקור האלל האבא בצאצאי GE שם האלל GE ET LA SNP31A SNP31B G T אמא ()GE צאצא 1 √ √ אבא G T G T צאצא 2אמא ()GE √ אבא A C LA ET GE SNP09A :SNP09 T אמא ()GE צאצא 1 √ √ אבא T T אמא ()GE צאצא 2 √ אבא C LA ET GE SNP1371 SNP1447 :Cellulase C C אמא ()GE צאצא 1 √ √ אבא C C C T צאצא 2אמא ()GE √ אבא T T C C אמא ()GE צאצא 2 √ אבא T T C T אמא ()GE צאצא 4 √ √ √ אבא C T C C צאצא 11אמא ()GE √ √ √ אבא C T 1שיעור הצאצאים מסוג זה צפוי להיות כפול בהשוואה לשאר הצאצאים. סיכום ביניים של ההתקדמות בשני חלקי המחקר .1בחלק הראשון של המחקר נערכת השוואה בין הזנים זוטאנו ,אדרנול BL667 ,ואטינגר כמפרים ל'האס' .יעילות הזן המפרה תקבע לפי אחוז צאצאי ה'האס' שיתקבל במטע כתוצאה מהפריה עם גרגרי אבקה שלו (אחוז גבוה מעיד על יעילות גבוהה של הזן המפרה) .זיהוי הזן המפרה בצאצאים יעשה באמצעות שיטה גנטית ,שהתחלנו לפתח במהלך 2114ונמשיך בכך גם ב.2111- .2בחלק השני של המחקר נקבעת יכולת ההפריה העצמית בזן 'ג'ם' .לצורך כך מפותחת שיטה גנטית לזיהוי ההורות בצאצאים .תוצאות ראשוניות מ 2114-מצביעות על יכולת הפריה עצמית בזן זה .ב- 2111נבסס תוצאות אלה מאנליזה של ההורות במספר רב של צאצאי 'ג'ם' ומניסויי שדה ,בהם עצי 'ג'ם' יכוסו במהלך הפריחה ברשת בנוכחות דבורי דבש וללא זן מפרה. 11
© Copyright 2024