‫השוואה בין זנים מפרים ל'האס' וקביעה של יכולת ההפריה העצמית ב'ג'ם' באמצעות‬
‫פיתוח שיטה לזיהוי גנטי של ההורות בצאצאים‬
‫דו"ח ‪3102-01‬‬
‫דורון שניידר– מו"פ צפון‬
‫יעל לב‪ ,‬רפי שטרן ומרטין גולדווי – מכללת תל‪-‬חי‬
‫עמיר שרמן‪ ,‬רון אופיר וורד יריחימוביץ – מחלקה למטעים מכון וולקני‬
‫הדר כהן – מו"פ גליל מערבי‬
‫תומר לוי – מטע געתון‬
‫תוכן עניינים‬
‫עמוד‬
‫הקדמה‪........................................................................................................................‬‬
‫חומרים ושיטות‪............................................................................................................‬‬
‫‪1‬‬
‫‪1‬‬
‫תוצאות ודיון‬
‫‪.1‬א‪ .‬אפיון ‪ SNP‬בזנים ההוריים ממטע 'האס' (‪......................................................)H‬‬
‫‪4‬‬
‫‪.1‬ב‪ .‬קביעת המפרה בצאצאי 'האס' (‪ )H‬ממטע געתון בעזרת ‪...............................SNP‬‬
‫‪6‬‬
‫‪.2‬א‪ .‬אפיון ‪ SNP‬בזנים ההוריים ממטע 'ג'ם' (‪....................................................)GE‬‬
‫‪7‬‬
‫‪.2‬ב‪ .‬קביעת סוג ההפריה בצאצאי ג'ם (‪ )GE‬בעזרת ‪.............................................SNP‬‬
‫‪9‬‬
‫סיכום ביניים של ההתקדמות בשני חלקי המחקר‪...........................................................‬‬
‫‪11‬‬
‫הקדמה‬
‫דו"ח זה מסכם את ההתקדמות שהושגה במהלך שנת ‪ 2114‬בפיתוח שיטה גנטית לזיהוי ההורות בצאצאי‬
‫אבוקדו‪ .‬השיטה הגנטית לזיהוי ההורות בצאצאים בה אנו משתמשים מבוססת על ‪SNP (Single-‬‬
‫)‪ nucleotide polymorphism‬ספציפיים לכל זן‪ ,‬וזיהויים באופן מהיר ופשוט במכשיר ‪ .DHPLC‬מטרות‬
‫המחקר הן‪ .1 :‬השוואה ביעילות של ארבעה זנים מפרים שונים ל'האס' (‪ )H‬ו‪ .2-‬לימוד התלות של הזן ג'ם‬
‫(‪ )GE‬בהפריה זרה‪.‬‬
‫הזן ‪ H‬הוא זן האבוקדו המרכזי במטעי ישראל ‪ .‬הפירות שלו מבוקשים בשווקי העולם‪ ,‬אך היבול עומד על‬
‫כ‪ 1.1-‬טון‪/‬דונם בממוצע עם סירוגיות גבוהה‪ .‬בישראל משמש האטינגר (‪( )ET‬טיפוס פריחה ‪ )B‬כזן מפרה‬
‫בלעדי ל‪( H-‬טיפוס פריחה ‪ ,)A‬ויש צורך במציאת זנים מפרים מצטיינים נוספים‪ .‬במסגרת המחקר תבחן‬
‫איכות הזנים‪ :‬זוטאנו (‪ ,)ZU‬אדרנול (‪ )ED‬ו‪( )BL ( BL667-‬טיפוסי פריחה ‪ )B‬כמפרים ל‪ ,H-‬בהשוואה ל‪-‬‬
‫‪ .ET‬יעילות הזן המפרה תקבע לפי שיעור צאצאי ‪ ,H‬שיתקבלו כתוצאה מהפריה עם גרגרי אבקה שלו‪.‬‬
‫הזן ‪ GE‬הינו זן פטנטי מקליפורניה בעל פירות "דמויי האס"‪ .‬לפירות ‪ GE‬דמיון לפירות ה‪ H-‬מבחינת צורת‬
‫הפרי וקליפה מחוספסת המשחירה בהבשלה‪ .‬יחד עם זאת‪ ,‬פירות ‪ GE‬גדולים בהשוואה ל‪ H-‬והם מבשילים‬
‫בינואר‪ ,‬בעוד שפירות ‪ H‬מבשילים כבר בנובמבר‪ .‬ל‪ GE-‬מספר יתרונות ע"פ ה‪ :H-‬א‪ .‬פוריות גבוהה יותר‬
‫(כ‪ 2-‬ט'‪/‬ד' ויותר במטע קונבנציונלי) וסירוגיות נמוכה יותר; ב‪ .‬צימוח מתון ומבנה עץ קומפקטי המאפשרים‬
‫נטיעה של העצים בצפיפות גדולה (‪ 3 x5‬מ‪ ,)2‬אשר בה ניתן להגיע ליבולים גבוהים מ‪ 2-‬ט'‪/‬ד'; ו‪-‬ג‪ .‬עמידות‬
‫גדולה יותר לתנאי קרה‪ .‬פרחי ‪ ,GE‬בדומה לפרחי ‪ ,H‬הם מטיפוס פריחה ‪ ,A‬אך אין בספרות מידע לגבי‬
‫יכולת ההפריה העצמית שלהם והתלות בהפריה זרה לקבלת יבול גבוה‪ .‬במסגרת המחקר תבחן תכונה זו‬
‫של ה‪ GE-‬במטע בו נטועים עצים מהזן המפרה ‪( ET‬טיפוס פריחה ‪ )B‬ועצים מהזן לביא (‪( )LA‬טיפוס‬
‫פריחה ‪ .)A‬החפיפה בין פרחי ‪ GE‬במופע נקבי לבין פרחי ‪ LA‬במופע זכרי אמורה להיות קצרה בגלל ששני‬
‫הזנים מטיפוס פריחה ‪ ,A‬ולכן צפוי שהפריה בין שני זנים אלו לא תהיה שכיחה‪ .‬אף על פי כן‪ ,‬צאצאי ‪GE‬‬
‫שהופרו ע"י אבקת ‪ LA‬עשויים להתפתח‪ .‬לכן יש צורך לפתח שיטה שתזהה בנוסף לצאצאי ‪ GE‬עצמיים‬
‫וכאלו שהופרו ע"י ‪ ,ET‬גם אותם‪.‬‬
‫חומרים ושיטות‬
‫‪.1‬‬
‫נתוני המטעים‬
‫‪ .1.1‬מטע 'האס' (געתון) המטע נמצא בסמוך לקיבוץ געתון בגליל המערבי‪ ,‬הוא ניטע בקיץ ‪ ,2112‬מרווחי‬
‫נטיעה ‪ .4X1‬הזן העיקרי במטע הוא ‪ H‬ולסירוגין נטועים בו כל עץ שלישי בשורה שלישית המפרים‪:‬‬
‫‪ ED ,ZU ,ET‬ו‪( BL -‬תמונה ‪.)1‬‬
‫‪1‬‬
‫תמונה ‪ .1‬סכמת מטע ‪ H‬עם המפרים ‪ ED ,ZU ,ET‬ו‪ .BL -‬במטע שלושה בלוקים שבכל אחד מהם חזרה‬
‫של שורה אחת עם כל אחד מהזנים המפרים‪ .‬עצי ‪ H‬מתוארים על‪-‬ידי משבצות לבנות‪ ,‬עצי ‪ET‬במשבצות‬
‫צהובות‪ ,‬עצי ‪ ZU‬במשבצות כחולות‪ ,‬עצי ‪ ED‬במשבצות ירוקות ועצי ‪ BL‬במשבצות סגולות‪.‬‬
‫‪ .1.2‬מטע 'ג'ם' (‪ ,GE‬געתון)‪ :‬המטע נמצא בסמוך לקיבוץ געתון בגליל המערבי‪ .‬הזן העיקרי במטע הוא ‪LA‬‬
‫ונטועה בו שורת ‪ ET‬לסירוגין כל שלוש שורות ‪ .LA‬במרכז המטע נטועות שלוש שורות מהזן ‪GE‬‬
‫(תמונה ‪ .)2‬עצי ‪ GE‬הורכבו בהרכבת סנדוויץ על ‪ H‬ב‪ .2110-‬שתילי ‪ H‬המקוריים ניטעו ב‪ ,2112-‬מרווחי‬
‫הנטיעה בכל המטע הם ‪ 2.5 x 2.5‬מ‪ 161 ,2‬עצים‪/‬ד'‪.‬‬
‫תמונה ‪ .2‬סכמת מטע ‪ GE‬עם הזנים ‪ ET‬ו‪ .LA-‬במטע בלוק אחד של שלוש שורות ‪( GE‬משבצות בכתום)‬
‫שמשני צדדיו שורת ‪( ET‬משבצות צהובות)‪ .‬בשאר המטע ‪ 6‬בלוקים של ‪ 2‬שורות ‪( LA‬משבצות בירוק)‬
‫וביניהם שורת ‪.ET‬‬
‫‪ .2‬חומר צמחי‬
‫להפקת דנ"א שימשו עלים מהזנים ההוריים מעצים ממטעי געתון‪ ED ,ZU ,ET ,H :‬ו‪ BL-‬ממטע ‪ H‬ו‪-‬‬
‫‪ ET ,GE‬ו‪ LA-‬ממטע ‪ .GE‬כ‪ 211-‬פירות ‪ ,GE‬כ‪ 111 -‬מכל שורה‪ ,‬שנאספו באקראי משני צידי כל אחת‬
‫‪2‬‬
‫מהשורות במטע געתון בינואר ‪ 2114‬נשמרו ב‪ 4°C-‬עד מרץ‪ ,‬הזרעים הוצאו מהפירות‪ ,‬נשטפו במים‪ ,‬נשתלו‬
‫במשטחי הנבטה במצע טוף (חב' מרום גולן) והונבטו בחממה‪ .‬דנ"א הופק מעלים שהתפתחו מהצמחונים‪.‬‬
‫כל העלים מהזנים ההוריים ומהזרעים המונבטים נשמרו ב‪ -70°C -‬עד לשימוש‪.‬‬
‫‪ .2‬הפקת דנ"א‬
‫דנ"א גנומי הופק לפי ‪ 100-200mg .)1987( Doyle and Doyle‬עלים נכתשו במכתש ועלי בנוכחות חנקן‬
‫נוזלי‪ .‬האבקה הכתושה הורחפה ב‪ 700μl -‬בופר הפקה המכיל‪,100mM Tris pH 8 :‬‬
‫‪2%‬‬
‫]‪20mM Ethylenediaminetetra Acetic Acid ,Hexadecyltrimethylammonium Bromide [CTAB‬‬
‫‪ 1% Polyvinylpyrolidone [PVP] MW=40000 ,1.4M NaCl ,[EDTA] pH 8‬ו‪1% 2- -‬‬
‫‪ .Mercaptoethanol‬התערובת הודגרה ‪ 11‬דקות ב‪ ,65°C -‬תוך כדי ערבוב מפעם לפעם‪ .‬לאחר קירור‬
‫לטמפרטורת החדר‪ ,‬נערכו שני מיצויים עם )‪ .Chloroform:Octanol (24:1‬ה‪ DNA-‬הושקע בעזרת‬
‫‪ Ethanol‬והומס במים‪ .‬הדנ"א נשמר ב‪ -20°C-‬עד לשימוש‪.‬‬
‫‪ .4‬תגובת ‪PCR‬‬
‫תגובת ‪ PCR‬עם תחלים אוניברסלים‪ ,‬המגבירים קטעים בהם עשויים להיות ‪ , SNP‬נערכה לשם הגברת‬
‫קטעי דנ"א השונים במכשיר )‪ .Minicycler (MJ Research, Waltman, MA USA‬התערובת לתגובת ה‪PCR-‬‬
‫הכילה בנפח ‪ 50μl‬את המרכיבים הבאים‪ 200μΜ ,FastStart Taq PCR buffer X1 ,20ng DNA (1μl) :‬מכל‬
‫אחד מה‪ 30pmol ,dNTP-‬מכל תחל ו‪1 unit FastStart Taq DNA Polymerase (Roche diagnostics, -‬‬
‫)‪ .Almere, The Netherlands‬רצף התחלים ותנאי תגובת ‪ PCR‬מפורטים בטבלאות ‪ 1‬ו‪.2-‬‬
‫טבלה ‪ :1‬התחלים לתגובת ‪PCR‬‬
‫התחלים‬
‫שם ה‪SNP-‬‬
‫‪Cell450‬‬
‫‪SNP1371, NP14471‬‬
‫‪Cell950‬‬
‫‪SNP971‬‬
‫‪STK400‬‬
‫‪SNP345‬‬
‫‪SNP314‬‬
‫‪SNP31A, SNP31B‬‬
‫‪SNP094‬‬
‫‪SNP09‬‬
‫תחל ‪)5'>3'( Forward‬‬
‫תחל ‪)3'>5'( Reverse‬‬
‫‪2‬‬
‫)‪Cell450-FD (1482-15022‬‬
‫) ‪Cell450-RB (1308-1327‬‬
‫‪GGCCAAGATGTCATACATGG‬‬
‫‪TCTCTGTTATCTGGACCACCC‬‬
‫)‪F (751-7712‬‬
‫)‪R (1022-10432‬‬
‫‪TGGGTCCACTTTGGGCATGGC‬‬
‫‪AGAGAAGCCCACCTGTCAGTCG‬‬
‫)‪F (307-3273‬‬
‫)‪R (458-4813‬‬
‫‪ACAAGGTTGCCAAGGGCAAGC‬‬
‫‪GCACTCAATCCAAAGTCTGTAACC‬‬
‫‪SNP31 F‬‬
‫‪SNP31 R‬‬
‫‪TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTA‬‬
‫‪CGGGAGCACATACACAAATTGTATTC‬‬
‫‪SNP09 F‬‬
‫‪SNP09 R‬‬
‫‪GCGAAAGAATCATCGTATGCCC‬‬
‫‪CCCCTTCCGCCTATAGGTAGTTTTA‬‬
‫‪ 1‬המספר מתאר את מיקום ה‪ SNP-‬ברצף הבסיסים בגן מהזן ‪H‬‬
‫‪ 2‬מיקום התחל ברצף הבסיסים בגן ל‪ Cellulase-‬מהזן ‪)Acc. No. EU335600( H‬‬
‫‪2‬‬
‫מיקום התחל ברצף הבסיסים בגן ל‪ STK‬מהזן ‪)Acc. No. EU335745( H‬‬
‫‪4‬‬
‫פריימרים שהתקבלו ממרכז הגנומי במכון וולקני המגבירים רצף ובו ‪( SNP‬עמיר שרמן ורון אופיר‪ ,‬תוצאות לא מפורסמות)‬
‫‪3‬‬
PCR-‫ תגובת ה‬:2 ‫טבלה‬
‫) זמן (דקות) מספר סיבובים‬°C( '‫טמפ‬
1
1
91
1
1.1
91
1.1
10
1.1
72
21
1.1
91
1.1
11
1.1
72
1
1
72
DHPLC ‫ ע"י ריצוף ובמכשיר‬SNP ‫ איפיון‬.1
‫ לזיהוי הבדלים בדגמי הכרומטוגרמות‬DHPLC‫ מדנ"א של הזנים ההוריים הורצו במכשיר ה‬PCR ‫תוצרי‬
.GE ‫ נערך בצאצאי‬SNP -‫ איפיון ראשוני של חלק מה‬.SNP ‫ כדי לזהות בהם‬,‫ולאחר מכן הם נשלחו לריצוף‬
‫תוצאות ודיון‬
)H( '‫ בזנים ההוריים ממטע 'האס‬SNP ‫ אפיון‬.‫א‬.0
‫) ובו‬Cell( Cellulase-‫) רוצף קטע מהגן ל‬BL -‫ ו‬ED ,ZU ,ET ,H( ‫ בגעתון‬H ‫בזנים ההוריים ממטע‬
‫ ובו‬Cellulase-‫ רוצפו בינתיים קטע נוסף מהגן ל‬ET-‫ ו‬H ‫ רק בזנים‬.)2 ‫ (תמונה‬SNP1447-‫ ו‬SNP1371
‫ תחלים‬.)‫ (תוצאות לא מובאות‬SNP345 ‫) ובו‬STK( Serine Threonine Kinase -‫ וקטע מהגן ל‬SNP971
SNP09 ,SNP31 :‫ התקבלו מהמרכז הגנומי בבית דגן‬SNP ‫מאבוקדו המגבירים קטעי דנ"א בהם מצויים‬
‫ עם התחלים הללו נערכה על דנ"א מהזנים‬PCR ‫ תגובת‬.)‫ תוצאות לא מפורסמות‬,‫(עמיר שרמן ורון אופיר‬
‫ בזנים ההוריים השונים בכל‬SNP -‫ תכולת ה‬.)4 ‫ והקטעים המוגברים רוצפו (תמונה‬,‫ההוריים שהוזכרו‬
‫ צירופי‬.2 ‫ מופיעים בטבלה‬,DHPLC-‫ כמו גם הכרומטוגרמה שהתקבלה עבורם ב‬,‫קטעי הדנ"א שנבדקו‬
.4 ‫ ממטע געתון מופיעים בטבלה‬H ‫האללים האפשריים בצאצאי‬
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRANOL
BL667
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRANOL
BL667
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRANOL
BL667
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRANOL
BL667
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
************************************************************
SNP1371
AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
AGGYTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
AGGYTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
*** ********************************************************
SNP1447
TCAGTACCTGTATTCTAGCCCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
TCAGTACCTGTATTCTAGCTCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
TCAGTACCTGTATTCTAGCTCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
TCAGTACCTGTATTCTAGCYCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
TCAGTACCTGTATTCTAGCCCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
******************* ****************************************
TCCAGATAACAGAGA
TCCAGATAACAGAGA
TCCAGATAACAGAGA
TCCAGATAACAGAGA
TCCAGATAACAGAGA
***************
195
195
195
195
195
4
60
60
60
60
60
120
120
120
120
120
180
180
180
180
180
‫ המכיל‬BL-‫ ו‬ED ,ZU ,ET ,H ‫ מהזנים ההוריים‬Cellulase‫ השוואת הרצף של קטע הגן ל‬:3 ‫תמונה‬
C/T=Y :‫ מקרא האותיות‬.)‫ (מסומנים ברקע צהוב‬SNP1447 ,SNP1371 ‫את‬
SNP09:
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRANOL
BL667
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRANOL
BL667
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG
************************************************************
SNP09A
GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
GTATCCACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
GTATCCACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
***** ********************************************
60
60
60
60
60
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA
************************************************************
SNP31A
SNP31B
TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
TTAATTGCGTATCATACAATAAACGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
TTAATTGCGTATCATACAATAAACGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
************* ********* **************************
60
60
60
60
60
SNP31:
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRADOL
BL667
HASS
ETTINGER
ZUTANO
EDRANOL
BL667
)‫ (למטה‬SNP31-‫ (למעלה) ו‬SNP09 ‫ עם התחלים‬PCR ‫ קטעי דנ"א שהוגברו בתגובת‬.4 ‫תמונה‬
‫ (מסומנים‬SNP31B-‫ ו‬SNP31A ,SNP09A ‫ המכילים את‬BL-‫ ו‬ED ,ZU ,ET ,H ‫מהזנים ההוריים‬
.)‫ברקע צהוב‬
‫ בכל קטעי‬,BL-‫ ו‬ED ,ZU ,ET ‫ עם הזנים‬H ‫ בזנים ההוריים השונים במטע‬SNP -‫ תכולת ה‬:3 ‫טבלה‬
.DHPLC-‫הדנ"א שנבדקו והכרומטוגרמות שהתקבלו עבורם ב‬
5
‫‪SNP31‬‬
‫זן‬
‫שני האללים‬
‫‪1‬‬
‫כרומטוגרמה‬
‫‪SNP09‬‬
‫זן‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫‪cell450‬‬
‫זן‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫‪stk400‬‬
‫זן‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫‪cell950‬‬
‫זן‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫‪H‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪H‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪H‬‬
‫‪CC‬‬
‫‪CC‬‬
‫‪H‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪H‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪AC‬‬
‫‪AC‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪CT‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TC‬‬
‫‪ZU‬‬
‫‪AC‬‬
‫‪AC‬‬
‫‪ZU‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪ZU‬‬
‫‪CT‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪ZU‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪ZU‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TC‬‬
‫‪ED‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪ED‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪ED‬‬
‫‪CC‬‬
‫‪CT‬‬
‫‪ED‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪ED‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TC‬‬
‫‪BL‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪BL‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪BL‬‬
‫‪CC‬‬
‫‪CC‬‬
‫‪BL‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪BL‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪1‬האותיות מסמלות את הבסיסים באתרי ה‪ SNP-‬ברצף שהוגבר בתגובת‬
‫‪ PCR‬עם התחלים‬
‫המתאימים‪ .‬מיקום ה‪ SNP-‬ברצף הדנ"א מפורט בטבלה ‪1‬‬
‫ברקע צהוב ה‪ SNP -‬הצפויים לפי דמיון לכרומטוגרמות משאר הזנים‪ SNP .‬אלו טרם רוצפו‪.‬‬
‫‪.0‬ב‪ .‬קביעת המפרה בצאצאי 'האס' (‪ )H‬ממטע געתון בעזרת ‪SNP‬‬
‫בכל הצאצאים של הזן ‪ H‬נמצא תמיד אלל אחד של ‪( H‬אימהי) שמקורו בביצית‪ ,‬כאשר המקור של האלל‬
‫השני יהיה מגרגר האבקה של הזן המפרה‪ .‬בטבלה ‪ 4‬ניתן לראות את האפשרויות של שילובי האללים‬
‫בצאצאי ‪ H‬עצמיים ובכאלו שיתקבלו לאחר הפריה זרה בנוכחות הזנים המפרים ‪ ED ,ZU , ET :‬ו‪.BL-‬‬
‫מהטבלה עולה ש‪ SNP31 -‬ו‪ SNP09-‬הם ‪ SNP‬אינפורמטיביים‪ ,‬כיוון שניתן באמצעותם לזהות בוודאות‬
‫את כל צאצאי ה‪ H -‬שהתקבלו מהפריה עם גרגרי אבקה מהזנים ‪ ET‬ו‪( ZU -‬צאצאים מסוג ‪ .)2‬באמצעות‬
‫‪ SNP1371‬ו‪ SNP1447-‬מהגן ל‪ Cellulase-‬ניתן יהיה לדעת מהי הכמות של מחצית מצאצאי ‪ H‬שיופרו ע"י‬
‫‪( ED‬החסרת מספר צאצאים מסוג ‪ 2‬במספר הצאצאים מסוג ‪ .)2‬כדי לאפיין את מקור האבקה שהפרתה‬
‫את כל הסוגים של צאצאי ‪ H‬ממטע געתון יש צורך למצוא ‪ SNP‬נוספים שיבדילו בין צאצאי ‪ H‬עצמיים‬
‫לצאצאי ‪ H‬שהופרו ע"י ‪ ED‬ו‪ ,BL-‬ו‪ SNP -‬שיבדילו בין צאצאי ‪ H‬שהופרו ע"י ‪ ET‬ו‪ .ZU-‬העצים במטע זה‬
‫ניטעו בקיץ ‪ .2112‬רק במהלך ‪ 2116‬תערך אנליזה גנטית של פירות ‪ H‬ראשונים ממטע זה‪ ,‬שיבשילו בסתיו‬
‫‪.2111‬‬
‫‪6‬‬
‫טבלה ‪ :4‬תכולת ‪ SNP‬בצאצאי‪ H‬האפשריים ממטע בו נטועים הזנים המפרים ‪.BL ED ,ZU ,ET‬‬
‫סוג‬
‫הצאצא‬
‫‪:SNP31‬‬
‫צאצא ‪1‬‬
‫צאצא ‪2‬‬
‫מקור‬
‫האלל‬
‫אמא (‪)H‬‬
‫אבא‬
‫אמא (‪)H‬‬
‫אבא‬
‫‪:SNP09‬‬
‫אמא (‪)H‬‬
‫צאצא ‪1‬‬
‫אבא‬
‫אמא (‪)H‬‬
‫צאצא ‪2‬‬
‫אבא‬
‫‪:Cellulase‬‬
‫אמא (‪)H‬‬
‫צאצא ‪1‬‬
‫אבא‬
‫אמא (‪)H‬‬
‫צאצא ‪2‬‬
‫אבא‬
‫אמא (‪)H‬‬
‫צאצא ‪2‬‬
‫אבא‬
‫האבא בצאצאי ‪H‬‬
‫שם ה‪SNP-‬‬
‫‪H‬‬
‫‪SNP31A SNP31B‬‬
‫‪G‬‬
‫‪T‬‬
‫‪G‬‬
‫‪T‬‬
‫‪G‬‬
‫‪T‬‬
‫‪A‬‬
‫‪C‬‬
‫‪SNP09A‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪C‬‬
‫‪SNP1371 SNP1447‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪ZU‬‬
‫√‬
‫‪H‬‬
‫√‬
‫√‬
‫‪ET‬‬
‫‪ZU‬‬
‫√‬
‫‪H‬‬
‫√‬
‫√‬
‫‪ET‬‬
‫‪ZU‬‬
‫√‬
‫√‬
‫√‬
‫√‬
‫√‬
‫‪ED‬‬
‫‪BL‬‬
‫√‬
‫√‬
‫‪ED‬‬
‫‪BL‬‬
‫√‬
‫√‬
‫‪ED‬‬
‫‪BL‬‬
‫√‬
‫√‬
‫√‬
‫‪.3‬א‪ .‬אפיון ‪ SNP‬בזנים ההוריים ממטע 'ג'ם' (‪)GE‬‬
‫בזנים ההוריים ממטע ‪ GE‬בגעתון (‪ ET ,GE‬ו‪ )LA-‬רוצף קטע מהגן ל‪ Cellulase-‬ובו ‪ SNP1371‬ו‪-‬‬
‫‪( SNP1447‬תמונה ‪ .)1‬רק ב‪ ET-‬רוצפו קטע נוסף מהגן ל‪ Cellulase-‬ובו ‪ SNP971‬וקטע מהגן ל‪Serine -‬‬
‫‪ )STK( Threonine Kinase‬ובו ‪( SNP345‬תוצאות לא מובאות)‪ .‬תחלים מאבוקדו המגבירים קטעי דנ"א‬
‫בהם מצויים ‪ SNP‬התקבלו מהמרכז הגנומי בבית דגן‪( SNP09 ,SNP31 :‬עמיר שרמן ורון אופיר‪ ,‬תוצאות‬
‫לא מפורסמות)‪ .‬תגובת ‪ PCR‬עם התחלים הללו נערכה על דנ"א מהזנים ההוריים שהוזכרו‪ ,‬והקטעים‬
‫המוגברים רוצפו (תמונה ‪ .)6‬תכולת ה‪ SNP-‬בזנים ההוריים השונים בכל קטעי הדנ"א שנבדקו‪ ,‬כמו גם‬
‫הכרומטוגרמה שהתקבלה עבורם ב‪ ,DHPLC-‬מופיעים בטבלה ‪ .1‬צירופי האללים האפשריים בצאצאי ‪GE‬‬
‫ממטע געתון מופיעים בטבלה ‪.6‬‬
‫‪7‬‬
GEM
ETTINGER
LAVI
GEM
ETTINGER
LAVI
GEM
ETTINGER
LAVI
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
GGCCAAGATGTCATACATGGTAGGATTCGGAGAGAGGTATCCACAGCATGTCCATCACAG
************************************************************
SNP1371
AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
AGGYTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
AGGCTCCTCACTTCCATCTGTACAGGTGCACCCTAATTCCATACCCTGCAATGCTGGATT
*** ********************************************************
SNP1447
TCAGTACCTGTATTCTAGCYCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
TCAGTACCTGTATTCTAGCTCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
TCAGTACCTGTATTCTAGCYCACCCAACCCAAATATCCTAGTGGGTGCCATATTGGGTGG
60
60
60
120
120
120
180
180
180
******************* ****************************************
GEM
ETTINGER
LAVI
TCCAGATAACAGAGA 195
TCCAGATAACAGAGA 195
TCCAGATAACAGAGA 195
***************
‫ המכיל את‬LA-‫ ו‬,ET ,H ‫ מהזנים ההוריים‬Cellulase‫ השוואת הרצף של קטע הגן ל‬:5 ‫תמונה‬
C/T=Y :‫ מקרא האותיות‬.)‫ (מסומנים ברקע צהוב‬SNP1447 ,SNP1371
SNP09:
GEM
ETTINGER
LAVI
GEM
ETTINGER
LAVI
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG 60
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG 60
GCGAAAGAATCATCGTATGCCCCGGAAGATAGATTATTACGAGCCATACTTGGCATTCAG 60
************************************************************
SNP09A
GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
GTATCCACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
GTATCTACCGCAAAGGAAACTTGTCTAAAACTACCTATAGGCGGAAGGGG 110
***** ********************************************
SNP31:
GEM
ETTINGER
LAVI
GEM
ETTINGER
LAVI
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA 60
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA 60
TGTCGGGGTAACTAGTAACTATACTATATTAATTAATTAATTAAAACTATATTAATTAAA 60
************************************************************
SNP31A
SNP31B
TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
TTAATTGCGTATCATACAATAAACGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
TTAATTGCGTATCGTACAATAAATGAATACAATTTGTGTATGTGCTCCCG 110
************* ********* **************************
)‫ (למטה‬SNP31-‫ (למעלה) ו‬SNP09 ‫ עם התחלים‬PCR ‫ קטעי דנ"א שהוגברו בתגובת‬.6 ‫תמונה‬
.)‫ (מסומנים ברקע צהוב‬SNP31B-‫ ו‬SNP31A ,SNP09A ‫ המכילים את‬LA-‫ ו‬ET ,H ‫מהזנים ההוריים‬
8
‫טבלה ‪ :5‬תכולת ה‪ SNP -‬בזנים ההוריים השונים במטע ‪ GE‬עם הזנים ‪ ET‬ו‪ LA-‬בכל קטעי הדנ"א‬
‫השונים שנבדקו והכרומטוגרמות שהתקבלו עבורם ב‪.DHPLC-‬‬
‫‪SNP31‬‬
‫‪1‬‬
‫זן‬
‫שני האללים‬
‫כרומטוגרמה‬
‫זן‬
‫‪SNP09‬‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫זן‬
‫‪cell450‬‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫זן‬
‫‪stk400‬‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫זן‬
‫‪cell950‬‬
‫שני האללים כרומטוגרמה‬
‫‪GE‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪GE‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪GE‬‬
‫‪CC‬‬
‫‪CT‬‬
‫‪GE‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪GE‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TC‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪AC‬‬
‫‪AC‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪CT‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TC‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪GT‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪CC‬‬
‫‪CT‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪TT‬‬
‫‪TC‬‬
‫‪.3‬ב‪ .‬קביעת סוג ההפריה בצאצאי ‪ GE‬בעזרת ‪SNP‬‬
‫בכל הצאצאים של הזן ‪ GE‬נמצא תמיד אלל אחד של ‪( GE‬אימהי) שמקורו בביצית‪ ,‬כאשר המקור של‬
‫האלל השני יהיה מגרגר האבקה של הזן המפרה‪ .‬בטבלה ‪ 6‬ניתן לראות את אפשרויות שילובי האללים‬
‫בצאצאי ‪ GE‬עצמיים ובכאלו שיתקבלו לאחר הפריה זרה עם אבקת ‪ ET‬או ‪ .LA‬מהטבלה עולה ש‪-‬‬
‫‪ SNP31‬ו‪ SNP09-‬הם ‪ SNP‬אינפורמטיביים‪ ,‬כיוון שניתן באמצעותם לזהות בוודאות את כל צאצאי ה‪-‬‬
‫‪ GE‬שהופרו ע"י ‪( ET‬צאצאים מסוג ‪ .)2‬באמצעות ‪ SNP1371‬ו‪ SNP1447-‬מהגן ל‪ Cellulase-‬ניתן יהיה‬
‫לאפיין רבע מצאצאי ‪ GE‬העצמיים (צאצא מסוג ‪ .)1‬כדי להגדיל את דרגת הוודאות של ההורות בצאצאי‬
‫‪ GE‬יש צורך למצוא ‪ SNP‬נוספים שיבדילו בין צאצאי ‪ GE‬עצמיים לצאצאי ‪ GE‬שהופרו ע"י ‪.LA‬‬
‫בשנה האחרונה (עונת ‪ )2112-14‬הופק דנ"א מעלים של כ‪ 211-‬זרעי ‪ GE‬ממטע געתון‪ .‬במהלך השנה הקרובה‬
‫בכוונתנו לקבוע את ההורות בצאצאים האלו‪ ,‬כדי לקבוע האם ה‪ GE -‬זקוק להפריה זרה‪ ,‬וכן לאסוף‬
‫צאצאים נוספים מעונת ‪ .2114-11‬בשלב זה נבדקה תכולת ‪ SNP09‬ב‪ 11-‬מתוך ‪ 211‬צאצאי ‪ GE‬הנ"ל וכולם‬
‫נמצאו הומוזיגוטים לאלל ‪( T‬סוג צאצא ‪ 1‬בטבלה ‪ .)6‬מתוצאות ראשוניות אלה עולה שצאצאי ‪ GE‬לא‬
‫התקבלו מהפריה זרה באמצעות גרגרי אבקה מהזן ‪ ET‬ושלזן ‪ GE‬יכולת הפריה עצמית‪ .‬כדי לבסס‬
‫מסקנות אלה יש לבדוק את תכולת האלל במדגם רחב יותר של צאצאי ‪ GE‬וכן לשלול את האפשרות‬
‫שצאצאי ה‪ GE -‬התקבלו מהפריה זרה של גרגרי אבקה מפרחי הזן ‪.LA‬‬
‫‪9‬‬
‫טבלה ‪ :6‬תכולת ‪ SNP‬בצאצאי ‪ GE‬האפשריים ממטע בו נטועים הזנים ‪ ET‬ו‪.LA-‬‬
‫סוג‬
‫הצאצא‬
‫‪:SNP31‬‬
‫מקור‬
‫האלל‬
‫האבא בצאצאי ‪GE‬‬
‫שם האלל‬
‫‪GE‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪SNP31A‬‬
‫‪SNP31B‬‬
‫‪G‬‬
‫‪T‬‬
‫אמא (‪)GE‬‬
‫צאצא ‪1‬‬
‫√‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪G‬‬
‫‪T‬‬
‫‪G‬‬
‫‪T‬‬
‫צאצא ‪ 2‬אמא (‪)GE‬‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪A‬‬
‫‪C‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪GE‬‬
‫‪SNP09A‬‬
‫‪:SNP09‬‬
‫‪T‬‬
‫אמא (‪)GE‬‬
‫צאצא ‪1‬‬
‫√‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫אמא (‪)GE‬‬
‫צאצא ‪2‬‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪C‬‬
‫‪LA‬‬
‫‪ET‬‬
‫‪GE SNP1371 SNP1447‬‬
‫‪:Cellulase‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫אמא (‪)GE‬‬
‫צאצא ‪1‬‬
‫√‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫צאצא ‪ 2‬אמא (‪)GE‬‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫אמא (‪)GE‬‬
‫צאצא ‪2‬‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪T‬‬
‫‪T‬‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫אמא (‪)GE‬‬
‫צאצא ‪4‬‬
‫√‬
‫√‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪C‬‬
‫‪C‬‬
‫צאצא ‪ 11‬אמא (‪)GE‬‬
‫√‬
‫√‬
‫√‬
‫אבא‬
‫‪C‬‬
‫‪T‬‬
‫‪1‬שיעור הצאצאים מסוג זה צפוי להיות כפול בהשוואה לשאר הצאצאים‪.‬‬
‫סיכום ביניים של ההתקדמות בשני חלקי המחקר‬
‫‪ .1‬בחלק הראשון של המחקר נערכת השוואה בין הזנים זוטאנו‪ ,‬אדרנול‪ BL667 ,‬ואטינגר כמפרים‬
‫ל'האס'‪ .‬יעילות הזן המפרה תקבע לפי אחוז צאצאי ה'האס' שיתקבל במטע כתוצאה מהפריה עם‬
‫גרגרי אבקה שלו (אחוז גבוה מעיד על יעילות גבוהה של הזן המפרה)‪ .‬זיהוי הזן המפרה בצאצאים‬
‫יעשה באמצעות שיטה גנטית‪ ,‬שהתחלנו לפתח במהלך ‪ 2114‬ונמשיך בכך גם ב‪.2111-‬‬
‫‪ .2‬בחלק השני של המחקר נקבעת יכולת ההפריה העצמית בזן 'ג'ם'‪ .‬לצורך כך מפותחת שיטה גנטית‬
‫לזיהוי ההורות בצאצאים‪ .‬תוצאות ראשוניות מ‪ 2114-‬מצביעות על יכולת הפריה עצמית בזן זה‪ .‬ב‪-‬‬
‫‪ 2111‬נבסס תוצאות אלה מאנליזה של ההורות במספר רב של צאצאי 'ג'ם' ומניסויי שדה‪ ,‬בהם עצי‬
‫'ג'ם' יכוסו במהלך הפריחה ברשת בנוכחות דבורי דבש וללא זן מפרה‪.‬‬
‫‪11‬‬