Bachelor_katrine
BACHELOROPPGAVE I BIOINGENIØRFAG Evaluering av DRI® ETG immunoassay på Cobas® 6000 Utprøving av en screeningsmetode for etylglukuronid (EtG) i urin på Cobas® 6000 av Katrine Kaino Kristian Tverelv Mai 2014 DET HELSEVITENSKAPELIGE FAKULTET Institutt for medisinsk biologi UiT – Norges Arktiske Universitet FORORD Dette er en avsluttende bachelor-oppgave i Bioingeniørfag ved Universitetet i Tromsø våren 2014. Laboratoriearbeidet ble utført ved fagområdet russcreening og medikamentanalyser, seksjon 3 ved Laboratoriemedisin Universitetssykehuset Nord-Norge (UNN) Tromsø. Arbeidet med oppgaven pågikk i perioden april til mai, og laboratoriearbeidet ble utført over totalt 7 dager. Arbeidet med oppgaven har vært spennende, lærerikt og utfordrende. Vi vil rette en stor takk til skriveveileder Thorsten Steiro Thoresen, for raske tilbakemeldinger og svært grundig og god veiledning. Vi vil også rette en stor takk til fagveileder Elisabet Tverelv Jakobsen, for god tålmodighet under opplæring på laboratoriet og i endeløse spørsmålsseanser. Takk til dere begge for godt samarbeid og for at dere har hatt god tro på oss gjennom hele perioden. En takk sendes også til Anita Seljelund og Ole-Martin Fuskevåg på MS-laboratoriet ved UNN Tromsø, for veiledning ved analysering av prøver på LC/MS-MS og hjelp med teorispørsmål og korrekturlesing. Tromsø 31. mai 2014 i SAMMENDRAG Bakgrunn Laboratoriemedisin ved UNN Tromsø ønsker å prøve ut en screeningsmetode for etylyglukuronid (EtG) i urin. Screeningsmetoden skal analyseres på Cobas® 6000 med et Diagnostic Reagents Inc (DRI®) ETG immunoassay, og resultatene skal vurderes mot etablert metode på væskekromatografi/tandem massespektrometri (LC/MS-MS). Målet med oppgaven er å finne ut om DRI® ETG assayet er en god nok screeningsmetode for EtG i urin for å unngå å analysere negative prøver på LC/MS-MS, samt om rekvirenter raskere kan få tilgang på negative prøvesvar. Metode Tilfeldige anonymiserte spoturinprøver (n=117) ble analysert i duplikat med DRI® ETG assayet på Cobas® 6000, og på LC/MS-MS. Mellom-seriepresisjon på Cobas® 6000 ble utført med kontrollprøver i to nivåer, og innen-seriepresisjon ble utført med tre av de tilfeldige prøvene i tre utvalgte nivåer. Resultat Resultatene viste at det er godt kvalitativt samsvar mellom DRI® ETG assayet og LC/MS-MS. Det bør tas høyde for en potensiell feilkilde med DRI® ETG assayet på Cobas® 6000 og urinprøver med svært høy optisk densitet. I tillegg bør det vurderes om analysen skal ha en gråsone rundt beslutningsgrensen (cut-off) tilsvarende metodens impresisjon. ii Liste over forkortelser Forkortelse Definisjon ADH Alkohol dehydrogenase ALAT Alanin aminotransferase ALDH Aldehyd dehydrogenase ASAT Aspartat aminotransferase CDT Carbohydate deficient transferrin CV Variasjonskoeffisient CYP2E1 Cytochrome P450 2E1 DRI® Diagnostic Reagents Inc ECLIA Electrochemiluminescence immunoassay EIA Enzym immuno-assay EMIT® Enzyme multiplied immunoassay technique ESI Elektrospray ionisering EtG Etylglukuronid EtS Etylsulfat FAEE Fettsyre etylestere G6P Glukose-6-fosfat G6PDH Glukose-6-fosfat-dehydrogenase GGT Gammaglutamyl transferase HEtG Etylglukuronid i hår ISE Ion selective electrode LC/MS Væskekromatografi/massespektrometri LC/MS-MS Væskekromatografi/tandem massespektrometri iii m/z-ratio Masse til ladning ratio MCV Mean corpuscular volume MEOS Microsomal ethanol oxidizing system NAD Nikotinamid adenin dinukleotid Peth Fosfatidyletanol SRM Selected reaction monitoring SULT Sulfotransferase UGT uridin-5`-difosfo-glukuronosyltransferase UNN Universitetssykehuset Nord-Norge UPLC® Ultra performance liquid chromatography iv INNHOLDSFORTEGNELSE 1 INNLEDNING .................................................................................................................. 1 1.1 ETANOLMETABOLISME .......................................................................................... 1 1.2 TRADISJONELLE MARKØRER FOR ALKOHOLINNTAK ................................... 2 1.2.1 CDT ........................................................................................................................ 2 1.2.2 GGT........................................................................................................................ 3 1.2.3 MCV ....................................................................................................................... 3 1.2.4 ASAT OG ALAT ................................................................................................... 3 1.2.5 ETANOL ................................................................................................................ 4 1.3 ETG ............................................................................................................................... 5 1.4 ETS ............................................................................................................................... 6 1.5 KLINISK NYTTEVERDI AV ETG OG ETS .............................................................. 6 1.6 KREATININ ................................................................................................................. 7 1.7 KREATININJUSTERING ........................................................................................... 7 1.8 RUSMIDDEL-SCREENING ....................................................................................... 8 1.10 COBAS® 6000 .......................................................................................................... 9 1.11 DRI® ETG ASSAY ................................................................................................. 10 1.12 LC/MS-MS .............................................................................................................. 11 1.13 PROBLEMSTILLING ............................................................................................... 13 2 MATERIALE OG METODE ........................................................................................ 14 2.1 KJEMIKALIER DRI® ETG ASSAY ........................................................................ 14 2.2 KJEMIKALIER LC/MS-MS ...................................................................................... 14 2.3 DRI® ETG ASSAY PÅ COBAS® 6000 ................................................................... 15 2.4 ETG OG ETS METODE PÅ LC/MS-MS .................................................................. 16 2.5 PRØVEMATERIALE ................................................................................................ 17 2.6 PROSEDYRE ............................................................................................................. 17 v 2.7 BEHANDLING AV RESULTATER ......................................................................... 19 3 RESULTATER ............................................................................................................... 20 4 DISKUSJON.................................................................................................................... 23 5 4.1 INNEN-SERIE- OG MELLOM-SERIEPRESISJON ................................................ 23 4.2 BETYDNING AV URINENS EGENFARGE ........................................................... 24 4.3 SAMMENLIGNING AV RESULTATER ................................................................. 24 4.4 DRI® ETG ASSSAYET SOM SCREENINGSMETODE ......................................... 26 4.5 FALSKE POSITIVE ................................................................................................... 26 4.6 FALSKE NEGATIVE ................................................................................................ 28 KONKLUSJON .............................................................................................................. 30 LITTERATURLISTE ............................................................................................................ 31 6 VEDLEGG ...................................................................................................................... 34 6.1 PRØVERESULTATER COBAS® 6000.................................................................... 34 6.2 INNEN-SERIEPRESISJON COBAS® 6000 ............................................................. 37 6.3 MELLOM-SERIEPRESISJON COBAS® 6000 ........................................................ 37 6.4 PRØVERESULTATER LC/MS-MS .......................................................................... 38 vi 1 INNLEDNING 1.1 ETANOLMETABOLISME Alkoholmisbruk er et av de største helseproblemene i verden i dag. Ved inntak av alkohol (etanol), absorberes 20 % i magesekken og 80 % i tynntarmen. Menneskekroppen har ulike mekanismer som bryter ned og skiller ut etanolen som inntas (fig. 1). Omlag 90 til 95 % av etanolen oksideres i leveren av bl.a. alkohol dehydrogenase (ADH). Et av oksidasjonsproduktene er acetaldehyd, som er assosiert med mange patologiske effekter av etanol. Acetaldehyd oksideres videre av aldehyd dehydrogenase (ALDH) til acetat. En alternativ nedbrytningsvei for etanol er via microsomal ethanol oxidizing system (MEOS). I utgangspunktet er det lite etanol som oksideres via MEOS, men ved kronisk høyt inntak vil MEOS (hovedsakelig enzymet CYP2E1) utvides, slik at kroppens evne til å bryte ned etanol øker. CYP2E1 oksiderer i likhet med ADH etanol til acetaldehyd, men har større affinitet for substratet. CYP2E1 er en del av Cytokrom P-450-familien av enzymer. Oksidasjonsproduktene skilles ut i urinen. (1) Av de resterende 5 til 10 % av etanolen vil i underkant av 5 % skilles ut direkte via urin, svette og respirasjon. Resten vil bli tatt hånd om av ikke-oksidative nedbrytningsveier i leveren (2). Mindre enn 0,05 % av etanol konjugeres med glukuronidsyre av uridin-5`-difosfo-glukuronosyltransferase (UGT) til etylglukuronid (EtG). En omtrent like stor andel vil konjugeres til etylsulfat (EtS) av sulfotransferase (SULT). Sistnevnte konjugering utføres med sulfat (3). En liten fraksjon av etanol vil bli påkoplet fettsyrer og fosfolipider. Dette gir produktene fettsyre etylestere (FAEE) og fosfatidyletanol (PEth). Figur 1 visualiserer de ulike nedbrytningsveiene for etanol. Flere av produktene fra etanolmetabolismen kan benyttes til å overvåke et etanolinntak. 1 ALAT, ASAT Plasmamarkører for vevs- eller organskade CDT MCV Assosiert med mange patologiske effekter av etanol GGT NAD+ NADH Oksidativ: CH3CH2OH (Etanol) ADH NAD+ NADH CH3CHO (Acetaldehyd) FAEE Syntase Ikke-oksidativ: Fosfolipase UDP-Glukuronosyltransferase (UGT) Sulfotransferase (SULT) ALDH CH3COOH (Acetat) Fettsyre etylestere (FAEE) Fosfatidyletanol (PEth) Etylglukoronid (EtG) Etylsulfat (EtS) Figur 1 Oksidativ og ikke-oksidativ metabolismeveier for alkohol (etanol). Alanin aminotransferase (ALAT), aspartat aminotransferase (ASAT), carbohydrate deficient transferrin (CDT), mean corpuscular volume (MCV), gammaglutamyl transferase (GGT), alkohol dehydrogenase (ADH), aldehyd dehydrogenase (ALDH), nikotinamid adenin dinukleotid (NAD) (egen figur modifisert fra (2)). 1.2 TRADISJONELLE MARKØRER FOR ALKOHOLINNTAK Tradisjonelt har det ikke vært vanlig å analysere direkte metabolitter fra nedbrytning av etanol. Det har vært mer vanlig å analysere plasmamarkører som oppstår som en skadevirkning av alkoholmisbruk. Figur 1 gir en oversikt av de forskjellige markørene som kan brukes ved stort alkoholinntak over lengere tid. 1.2.1 CDT Et av produktene av skadevirkningen, er carbohydrate deficient transferrin (CDT). Transferrin er et transportprotein som transporterer jern i plasma. Det er flere ulike karbohydratgrupper festet til transferrin. CDT vil mangle disse karbohydratgruppene, helt eller delvis. Et stort inntak av alkohol over lengere tid, det vil si rundt en uke med 50 g alkohol eller mer per dag, vil gi en økning av CDT. Kun økt konsentrasjon av CDT har klinisk interesse. Det er ikke sett noen sammenheng mellom lav CDT i plasma og patologiske tilstander. CDT kan øke også uten inntak av alkohol, blant annet ved leversykdommer. Det er også observert økte 2 verdier hos kvinner i siste trimester av graviditeten. Oppfølging av misbrukspasienter og diagnostikk av misbruk bør derfor ikke baseres kun på CDT-verdier. Som regel blir bl.a. gammaglutamyl transferase (GGT) og mean corposcular volume (MCV) vurdert sammen med CDT. (4) 1.2.2 GGT GGT er et membranbundet enzym som det finnes mest av i leveren, men er også lokalisert i andre organer som f.eks. prostata, nyrene og pankreas. Enzymets funksjon er å flytte glutamylgrupper til peptider og proteiner, i tillegg til at det har en hydrolytisk funksjon på enkelte peptider. I og med at enzymet er lokalisert i flere ulike organer, er det mange tilstander i kroppen som kan gi patologiske plasmaverdier. Leversykdom på grunn av alkoholmisbruk er kun en av disse tilstandene. Andre typer leversykdom kan også gi økte plasmaverdier. Ved vurdering av GGT er det i hovedsak kun økte verdier om har klinisk interesse. GGT har en halveringstid i plasma på 1 – 2 uker. Dette gir GGT potensiell nytteverdi som kontroll ved avrusning og generelt av alkoholikere som avslutter alkoholinntaket. (2) (4) 1.2.3 MCV En annen markør for skadevirkning av langvarig alkoholmisbruk, er økt MCV. MCV er en analyse av gjennomsnittlig volum av røde blodceller. Ved langvarig alkoholmisbruk vil MCV kunne øke, fordi dette fører til at utviklingen av erytroblastene i beinmargen forstyrres. Økt MCV kan også sees ved mange andre patologiske tilstander og er derfor en meget lite spesifikk indikasjon på alkoholmisbruk. Ved stopp i alkoholinntak etter langvarig misbruk, vil man se en meget langsom nedgang av MCV. (4) 1.2.4 ASAT OG ALAT ALAT er et enzym som hovedsakelig finnes i leveren. ALAT overfører en aminogruppe fra alanin til α-ketoglutarat, som resulterer i pyruvat og glutamat. Både pyruvat og glutamat kan gå inn i ureasyklusen. ALAT finnes hovedsakelig i leveren, og høye plasmakonsentrasjoner gir relativt god spesifisitet for leversykdom. En patologisk høy plasmaverdi sier allikevel ingenting om hvilken leversykdom pasienter lider av. (4) 3 ASAT er et enzym som finnes i mange ulike celler og vev, men har høyest konsentrasjon i lever, hjerte og skjelettmuskulatur. Enzymet overfører en aminogruppe fra aspartat til α-ketoglutarat. Det gir produktene oksaloacetat og glutamat. Oksaloacetat er i likhet med pyruvat og glutamat, en komponent som kan gå inn i ureasyklusen. (4) De to enzymene ASAT og ALAT kan brukes som markører på skadevirkning av alkoholmisbruk. Da ASAT ikke er et spesifikt leverenzym, vil det alene ikke være en god markør for leverskade. De to enzymene sammen kan derimot brukes til å vurdere omfang av leverskade. Forholdet mellom ASAT og ALAT er interessant på grunn av at ASAT har to ulike isoenzymer, der et er lokalisert i cytoplasma og et er lokalisert i mitokondriene. Ved cellenekrose vil både ASAT fra mitokondriene og cytoplasma lekke ut i plasma, mens ved celleskade vil kun ASAT fra cytoplasma lekke ut. Hvis forholdet mellom ASAT og ALAT blir høyt, vil det derfor være mistanke om alvorlig leverskade. ASAT og ALAT kan allikevel ikke brukes til å diagnostisere at en leverskade skyldes alkoholmisbruk, da alle patologiske forhold som gir uttalt leverskade vil gi høye verdier. (2) (4) 1.2.5 ETANOL De ulike plasmamarkørene for skadevirkning av alkoholmisbruk kan være til hjelp ved overvåking av pasienter over tid. For derimot å påvise et nylig inntak av alkohol, er den mest objektive måten å måle etanol direkte i serum eller urin. Analysen kan f.eks. utføres ved mistanke om kjøring i alkoholpåvirket tilstand. Ved analyse av etanol i serum, vil prøvesvaret gi et korrekt bilde på hva som er tilfellet der og da. En positiv serumprøve betyr at pasienten har inntatt alkohol i løpet av de siste timene og fortsatt er påvirket. Ved analyse av etanol i urin, vil det være mulig å konkludere med at det har vært et inntak i løpet av det siste døgnet. Omtrent 12 timer etter inntak vil ikke lenger etanol kunne påvises i serum. (4) Ved overvåking av alkoholikere, vil analyse av etanol i serum kun gi et bilde av hva pasienten har inntatt de siste timene før prøven blir tatt. Prøveresultatet vil ikke si noe om hva som har hendt de siste dagene. I tillegg kan analyse av etanol i urin gi et falskt positivt resultat. Ulike mikroorganismer benytter sukker i en fermenteringsprosess der etanol er produktet. Det muliggjør bl.a. etanoldannelse in vitro i urin som stammer fra pasienter med diabetes. 4 Da etanol raskt elimineres fra kroppen og har et smalt deteksjonsvindu, er andre metabolitter foretrukket for å påvise nylige eller langvarig alkoholinntak. EtG er en god kandidat, på grunn av at den har et lengere deteksjonsvindu i urin enn etanol. 1.3 ETG Den kjemiske formelen til EtG er H8C12O7 (fig. 2). EtG er en ikke-flyktig, vannløselig komponent med lang holdbarhet ved -20 °C (6). Det er en direkte metabolitt av etanol, som dannes av enzymet UGT i leveren. Flere isoformer av enzymet kan danne EtG (7). EtG elimineres via nyrene. Da EtG har lengere halveringstid enn etanol, er det mulig å oppdage et alkoholkonsum også etter at etanol er totalt eliminert fra kroppen. Schmitt et al Figur 2 Molekylstruktur (2S,3S,4S,5R,6S)6-ethoxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2carboxylic acid (EtG) (5). rapporterte en halveringstid for EtG på 2 til 3 timer i serum (8). Ifølge Dahl et al er det imidlertid mulig å detektere EtG i urin i opptil 80 timer etter alkoholinntak (9). Nøyaktig hvor lenge EtG kan detekteres i urin, varierer allikevel ut fra mengden konsumert alkohol. EtG er en direkte metabolitt av etanol, og kan derfor benyttes som biomarkør på alkoholinntak. Dette bekreftes av Wurst og Metzger, som konkluderer med at EtG er en god kandidat som biomarkør for alkoholinntak (10). EtG er meget spesifikk, i og med at det kun dannes fra etanol. Verken alder, kjønn eller etnisitet har vist å ha innvirkning på mengden utskillelse av EtG i urin ved alkoholinntak. I tillegg til å bli detektert i urin, kan EtG også detekteres i både hår og negler. Morini et al konkluderte med at analyse av EtG i hår (HEtG) gir en meget god indikasjon på kronisk alkoholmisbruk over lengere tid (11). Kharbouche et al bekrefter at HEtG er en god og pålitelig markør for alvorlig og langvarig alkoholmisbruk. Resultatene viste også at HEtG var mer pålitelig enn de tradisjonelle markørene GGT, CDT, ASAT og ALAT. Vurdering av HEtG alene gav samme konklusjon som når HEtG ble vurdert sammen med disse. Hver for seg viste dessuten de tradisjonelle 5 markørene å ha dårlig pålitelighet. Forfatterne konkluderte med at HEtG er bedre enn de tradisjonelle markørene for overvåkning og påvisning av langvarig alkoholmisbruk. (12) Wurst et al fant at i tillegg til å benytte EtG som markør for alkoholinntak, kan også EtS benyttes. (13) 1.4 ETS Den kjemiske formelen til EtS er C2H6O4S (fig. 3). EtS er som nevnt en direkte metabolitt av etanol, som dannes av enzymet SULT i leveren. EtS er meget sensitiv og spesifikk for alkoholinntak, og har alle fordelene EtG har. I og med at EtG og EtS dannes fra etanol i to ulike metabolismeveier, vil det øke sensitiviteten å bruke begge parameterne (13). Ved Figur 3 Molekylstruktur ethyl hydrogen sulfate (EtS) (14). Laboratoriemedisin UNN Tromsø, vurderes alltid EtG og EtS sammen. 1.5 KLINISK NYTTEVERDI AV ETG OG ETS Som tidligere nevnt, har etanol kortere halveringstid i serum enn EtG. Dermed kan analyse av EtG gi et bilde av pasientens inntak av alkohol de siste dagene. Konsentrasjonen av EtG i urin vil avhenge av hvor stort inntak pasienten har hatt og hvor lenge siden det ble inntatt. Analyse av EtG benyttes ofte på pasienter som inngår i et avrusningsprogram. Junghanns et al fant at analyse av EtG og EtS i urin var til stor hjelp for å verifisere avhold hos pasienter på avrusning (15). Det er ikke uvanlig at alkoholikere har så alvorlig leversvikt, at de behøver en levertransplantasjon. Erim et al har vist at pasienter som er levertransplantasjons-kandidater ikke rapporterer korrekt om sitt alkoholkonsum. Studien gikk ut på at pasientene skulle føre et skjema over alkoholkonsum selv, i tillegg til at de frivillig skulle avgi urinprøve. Pustemålinger av alkohol ble også gjennomført. Ingen av pasientene i studien rapporterte om alkoholkonsum, men det ble detektert EtG i urinprøvene til halvparten av pasientene. Det var også flere pasienter som ikke avga urinprøve ved flere anledninger. Dette kan indikere at flere av pasientene enn de som ble identifisert av analysen, hadde konsumert alkohol. Studien 6 indikerer at det er behov for oppfølging med urinprøver hos pasienter med leversvikt, som står i kø til levertransplantasjon. (16) Wurst et al fant at EtG er en markør som kan ha stor nytte i mange forskjellige situasjoner utover overvåking og behandling av alkoholmisbruk. Dette kan være bl.a. i yrker der alkoholbruk medfører risiko, som f.eks. sjåfører, piloter eller leger. Det er også en markør som er svært nyttig innen rettsmedisin. Hvis det stilles et kvalitativt spørsmål ang. nylig alkoholinntak, er EtG den foretrukne analysen. (17) Noe som reduserer klinisk nytteverdi av EtG og EtS i urin, er at urinkonsentrasjonen varierer individuelt og med væskeinntak. Urinprøver som skal til analyse kan også bli manipulert, enten før eller etter prøvetaking. I denne forbindelse øker klinisk nytteverdi ved å vurdere kreatininkonsentrasjon i urinprøven. 1.6 KREATININ Kreatinin er et avfallsstoff i kroppen, som dannes ved at kreatin-fosfat spaltes til fosfat, vann og kreatinin. Reaksjonen skjer spontant uten enzymatisk hjelp og er irreversibel. Kreatinfosfat utgjør størsteparten av skjelettmuskulaturens energilager. Hastigheten til spaltingen av kreatin-fosfat er til en viss grad proporsjonal med skjelettmuskelmasse. Kreatinin vil fordele seg i kroppens væske. Det er ikke rapportert at kreatinin er toksisk for kroppen. En person med høy skjelettmuskelmasse vil ha mer kreatinin i blodet, enn en person med lav skjelettmuskelmasse. Konsentrasjonen av kreatinin vil også variere med inntak av mat. F.eks. vil et stort inntak av rødt kjøtt eller fisk føre til høyere konsentrasjon av kreatinin i blod. (4) Kreatinin skilles ut gjennom nyrene. Kreatininkonsentrasjonen i urin tilsvarer i hovedsak hvor mye kreatinin som filtreres i glumeruli, fordi det ikke blir reabsorbert eller aktivt sekrert i nyretubuli. Noe kreatinin kan allikevel reabsorberes hos personer med lav diurese. Et menneske med normale nyrer, som har konstant funksjon og et fast kreatinininntak, vil ha en døgnurin-kreatinin som er tilnærmet stabil. (4) 1.7 KREATININJUSTERING Ved rusmiddelanalyser i urin vil konsentrasjonen av rusmiddelet variere med urinkonsentrasjonen. Kreatininkonsentrasjonen kan brukes som et mål på hvor konsentrert urinen er. En normal, nyrefrisk person har meget sjeldent verdier under 2 mmol/L. Lavere verdi tyder på at urinprøven er fortynnet. Den vanligste manipulasjonsmetoden er å fortynne 7 prøven enten ved å drikke veldig mye vann like før prøvetaking, eller å tilsette vann direkte i prøveglasset. Vurdering av kreatininkonsentrasjonen vil derfor gi informasjon om prøvens representativitet, og avdekke evt. manipulasjon av prøvematerialet. Helander et al anbefaler en nedre grense på 2 mmol/L for å påvise en fortynnet urinprøve. Forfatterne understreker allikevel at en kreatininkonsentrasjon under denne grensen, ikke automatisk bør tolkes som juks og dermed positiv prøve. Det er fordi en slik lav kreatininkonsentrasjon i visse tilfeller kan skyldes andre årsaker enn tilsiktet manipulasjon. (18) Fysiologisk urin varierer i konsentrasjon utfra væskeinntak og hydreringsstatus. Da rusmiddelkonsentrasjonen varierer med urinkonsentrasjonen, blir det ikke sammenliknbart å vurdere rusmiddelkonsentrasjonen i en fysiologisk fortynnet urinprøve mot en konsentrert urinprøve. Ved å kreatininjustere resultatene tas det høyde for slike konsentrasjonsforskjeller. Når det gjelder EtG og EtS kan altså kreatininjusterte resultater brukes til å vurdere mulige nye inntak av alkohol, da slike resultater kan sammenlignes over tid. Ved Laboratoriemedisin UNN Tromsø kreatininjusteres analyse av EtG og EtS, samt cannabinoider (hasj) før de gis ut til rekvirent. 1.8 RUSMIDDEL-SCREENING Kvantitering og spesifikk påvisning av lege- og rusmidler krever en sensitiv og spesifikk metode. Slike analyser utføres derfor som regel på f.eks. et væskekromatografi/massespektrometri (LC/MS) system. Analysemetodene på slike systemer er ofte kompliserte og tidkrevende. I tillegg kreves spesialisert personell til å drifte instrumentene. Dette medfører et kostnadsnivå i form av instrumenter, reagenser og ekstra personell ikke alle laboratorier kan forsvare. Som et alternativ er det vanlig å benytte immunologiske screeningsmetoder. En screeningsmetode er kvalitativ, og brukes til å skille mellom positive og negative prøver. Slike metoder er ofte enklere å ta i bruk, og kan utføres på instrumenter laboratoriet allerede har uten ekstra personellbehov. Immunologiske metoder er i tillegg raskere, og kan ta unna mange prøver på kort tid. De fleste rusmiddelprøvene som analyseres, blir analysert i forbindelse med behandling eller diagnostikk av pasienter. Disse prøvene blir kalt IS-13 prøver. Det finnes i tillegg IS-14 8 prøver, som analyseres i forbindelse med rettslige forhold. Positive prøvesvar på IS-14 prøver kan således gi grunnlag for alvorlige rettslige og personlige konsekvenser. Dette kan være f.eks. å miste samvær med egne barn, miste skoleplass, miste arbeidsplass og lignende. Immunologiske screeningsmetoder er ikke like spesifikke som LC/MS. Ofte har de spesifisitet for flere beslektede molekyler, f.eks. flere typer benzodiazepiner eller cannabinoider. Ifølge helsedirektoratet er allikevel immunologiske screeningsmetoder gode nok til å påvise positive IS-13 prøver. IS-14 prøver med positivt screening-resultat må derimot bekreftes på en spesifikk ikke-immunologisk metode. Bekreftelsesmetoden må ivareta rettstoksikologiske krav. Ifølge helsedirektoratet ivaretar f.eks. væskekromatografi/tandem massespektrometri (LC/MS-MS) disse kravene, og metoden kan derfor brukes til bekreftelse av positive prøver. Negative prøver behøver ingen bekreftelse, verken for IS-13 eller IS-14 prøver. Dette gjelder dersom det ikke er noen mistanke om manipulasjon av prøvematerialet. Screeningsmetoder er derfor også aktuelt for laboratorier som analyserer IS-14 prøver, da tidsbesparelsen ved å luke ut negative prøver før analyse på LC/MS-MS kan være betydelig. (19) (20) 1.10 COBAS® 6000 Cobas® 6000 (Roche) er en helautomatisk modulær analytisk plattform. Systemet kan tilknyttes moduler for klinisk kjemi og immunkjemi, og er tilpasset både kvantitative og kvalitative in vitro bestemmelser av mange ulike analytter. Systemet kan utføre ion selective electrode- Illustrasjon av Cobas® 6000 med c501 og e601 (21). (ISE) og spektrofotometriske metoder på c501 moduler, samt electrochemiluminescence immuno assay (ECLIA) metoder på e601 moduler. DRI® ETG assayet er en spektrofotometrisk metode som utføres på c501. c501 består av tre hovedkomponenter i tillegg til ISE; prøve-, reagens- og reaksjonssystem. Prøve- og reagenspipetter har egne rensestasjoner, hvor pipettespissene renses inn- og utvendig mellom hver pipettering. Reagenssystemet benytter reagenskassetter, og behandling av nye og brukte kassetter er helautomatisk; nye kassetter tas inn, åpnes og lagres, gamle kassetter kasseres. Reagensrommet holder en optimal temperatur på 4 °C. Reaksjonssystemet består av en roterende disk med reaksjonsceller, en fotometrisk måleenhet og et 9 cellerensesystem. Disken er omgitt av et inkubasjonsbad som holder 37 ± 0,1 °C. Blanding av reaksjonsløsninger gjøres med ultralydmikser. (22) c501 tilfredsstiller kravene til DRI® ETG assayet, ved at det er i stand til å opprettholde en konstant reaksjonstemperatur, pipettere prøver, blande reagenser, måle enzymatiske hastigheter ved 340nm og tidsberegne reaksjonen nøyaktig (23). Informasjon om utførelsen av assayet er lagret i en analyseapplikasjon. Alle analyser som utføres på Cobas® 6000 har en tilhørende applikasjon installert i kontrollenheten. Applikasjonene inneholder instrukser for hvordan de respektive analysene skal utføres. Applikasjonen for DRI® ETG assayet er utarbeidet av Thermo Fisher, og er tilpasset Cobas® 6000 c501. 1.11 DRI® ETG ASSAY DRI® ETG (Thermo Fisher) er et flytende, homogent kompetitivt enzym immuno-assay (EIA). Assayet benytter musmonoklonale anti-EtG-antistoffer, som ikke viser signifikant kryssreaksjon med andre glukoronidforbindelser. (23) Assayet har samme prinsipp som enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT®) teknologi. EMIT® er mye brukt ved kvalitativ, kvantitativ og semi-kvantitativ bestemmelse av lege- og rusmidler i serum eller urin. Prinsippet går ut på at det er konkurranse for en bestemt mengde spesifikke antistoff-bindingssteder mellom fritt EtG fra urinprøven og EtG merket med enzymet glukose-6-fosfat dehydrogenase (G6PDH). Antistoffer som ikke binder til EtG fra urinprøven, binder enzymmerket EtG. Enzymet er designet slik at når antistoff binder enzymmerket EtG blir det deaktivert. Ved lav konsentrasjon av fritt EtG fra urinprøven, vil en større del av mengden antistoff binde enzymmerket EtG og dermed reduseres enzymaktiviteten. Ved høy konsentrasjon av fritt EtG fra urinprøven, vil en større del av mengden antistoff binde fritt EtG og en mindre del antistoff binde enzymmerket EtG. Dermed vil enzymaktiviteten være større. Dette fenomenet skaper et direkte forhold mellom fritt EtG i urinprøven og enzymaktiviteten. (23) (24) (25) Enzymet G6PDH omdanner NAD+ til NADH ved følgende reaksjon: D-glukose-6-fosfat + NAD+ ⎯⎯⎯⎯⎯⎯ 6-fosfoglukonolakton + NADH + H+ (26) 10 Enzymmerket EtG Kofaktor NAD Substrat G6P Aktivert Enzym Produkt NADH Figur 4 Illustrasjon av den enzymatiske reaksjonen i DRI® ETG assayet. G6PDH med kofaktor og substrat danner NADH, som absorberer lys ved 340nm. (egen figur) NADH absorberer lys ved 340nm. Raten på absorbansendringen vil tilsvare enzymaktiviteten til G6PDH, og kan avleses spektrofotometrisk. Assayet kan brukes kvantitativt og semi-kvantitativt med cut-off grense på 500 eller 1000 ng/ml for å skille negative og positive prøver. Produsenten understreker at DRI® ETG assayet kun gir et foreløpig ubekreftet resultat, og anbefaler at positivt resultat bekreftes av en mer spesifikk alternativ metode (23). For rusmiddeltesting på IS-14 prøver der positivt prøvesvar kan få rettslige konsekvenser for pasienten, er det som nevnt et krav at positiv screening skal bekreftes med en metode som ivaretar rettstoksikologiske krav, f.eks. LC/MS-MS. 1.12 LC/MS-MS Væskekromatografi/tandem massespektrometri er en analysemetode som måler masse til ladning (m/z) ratio for ladde partikler. På grunn av høy spesifisitet og sensitivitet, er LC/MS-MS mye brukt til påvisning og kvantitering av lege- og rusmidler. Ved MS-laboratoriet UNN Tromsø benyttes elektrospray ionisering (ESI) LC/MS-MS i selected reaction monitoring (SRM) modus til analyse av mange ulike legemidler og rusmidler, bl.a. Illustrasjon av et Xevo TQ-S tandem massespektrometer (27). EtG og EtS i urin. 11 Systemet er bygget opp slik at forbindelsene i prøveløsningen overføres fra væskefase ved atmosfærisk trykk til gassfase i vakuum. Opparbeidet prøveløsning innføres via ultra performance liquid chromatography (UPLC®), som separerer forbindelsene i prøven basert på deres affinitet til stasjonær fase i kromatografikolonnen. Analyttene i mobilfasen går deretter videre inn i ESI-proben, hvor løsemiddelet samt analytter går over til gassfase ved bruk av varme, høy spenning og en tørkegass (nitrogen). Dette skjer ved at prøveløsningen sendes gjennom et tynt kapillærrør, hvor kapillærspissen har påsatt elektrisk spenning. Det elektriske feltet fører til at prøveløsningen ved utgangen av kapillærspissen danner en aerosol av ladde dråper. Nitrogengassen som strømmer langs kapillærrøret forsterker dannelsen av aerosol, samtidig som dråpene føres mot inngangen til massespektrometeret. De ladde dråpene minker i størrelse ved at løsemiddelet fordamper, noe som framskyndes ved å bruke en strøm av varm gass foran ioniseringskilden. Ladde ioner vil «løsne» fra dråpene og dermed overføres til gassfase. Ionene føres videre inn i massespektrometeret som holdes under vakuum. (28) Et tandem massespektrometer er bygget opp av en detektor og to masseanalysatorer i serie adskilt av en kollisjonscelle. Masseanalysatorene sorterer ioner basert på deres m/z-ratio ved hjelp av et justerbart elektrisk felt. Analyttioner kan manipuleres ved bruk av elektromagnetiske frekvensfelt slik at disse får en stabil reisebane igjennom instrumentet helt til detektoren. (28) I kollisjonscellen kolliderer ioner selektert av den første masseanalysatoren med en inert gass, slik at kovalente bindinger brytes, noe som resulterer i fragmentdannelser. Når molekyler brytes ned i fragmenter, vil ulike forbindelser gi et fragmentmønster som er ulikt andre molekylers mønster (kjemisk fingeravtrykk). Det opprinnelige ionet kalles mor-ionet, og fragmentene kalles datter-ioner. Den andre masseanalysatoren sorterer datter-ionene med samme prinsipp som den første. (28) Ønskede ioner som har passert gjennom masseanalysatorene treffer detektoren. Detektoren danner en elektrisk strøm proporsjonal med mengden ioner (intensitet) som treffer den per tidsenhet. Informasjonen behandles i et dataprogram, som lager et massespekter over molekylmasse og intensitet. (28) 12 Ved å analysere i SRM-modus får systemet svært høy spesifisitet og sensitivitet da den kjemiske støyen reduseres betraktelig. SRM går ut på at begge masseanalysatorene selekterer på spesifikke masser. Den første analysatoren låses på mor-ionets m/z-ratio, den andre låses på m/z-ratio til et eller flere datter-ioner. Da datter-ionene er et direkte produkt av mor-ionet, vil denne teknikken danne et unikt «fingeravtrykk» for analytten. Ved å bruke et eller flere datter-ioner til kvantiteringen, fås en svært spesifikk kvantiteringsmetode. Det er usannsynlig at flere forbindelser i organisk prøvemateriale har samme m/z-ratio for mor-ionet, med de samme spesifikke datter-ioner. Unntaksvis kan dette gjelde beslektede isomerer. (29) Bruk av internstandard under opparbeidelse av prøver før analysering øker presisjon og riktighet. En kjent mengde internstandard tilsettes prøvematerialet, standarder og kontroller før disse opparbeides. Dette vil korrigere for evt. tilfeldige feil under prosessen med å klargjøre prøvene for analyse, og variasjoner ved innføring av prøve via UPLC® eller i ioniseringsprosessen. Hvis noe prøvemateriale går tapt, vil tilsvarende mengde internstandard gå tapt. Ved analysering med ESI LC/MS-MS gir bruk av isotopmerkede internstandarder det beste resultatet, da disse korrigerer best for ioneundertrykkelse/ioneforsterkning som kommer fra prøvematrisen. Ved kvantitering brukes forholdet mellom internstandard og analytt (respons) mot standardkurve. (28) 1.13 PROBLEMSTILLING Det overordnede formålet med oppgaven var å finne ut om DRI® ETG assayet er en god nok screeningsmetode for EtG i urin. Laboratoriet har allerede en etablert metode for analyse av EtG og EtS på LC/MS-MS, som ble brukt som referansemetode. Da alkohol finnes i mange andre produkter enn drikkevarer, kan EtG påvises i urinprøver uten at vedkommende har drukket alkohol. Derfor har referansemetoden en etablert cut-off grense (2,5 µmol/L) for å redusere antallet falske positive prøver til et minimum. Cut-off grensen er satt på bakgrunn av kliniske vurderinger. DRI® ETG assayet benytter cut-off grense anbefalt av produsenten (500 ng/ml). Målet var å vurdere metodens innen-serie- og mellom-seriepresisjon i området rundt beslutningsgrensen (cut-off), og vurdere samsvaret mellom resultatene fra DRI® ETG assayet og LC/MS-MS. 13 2 MATERIALE OG METODE 2.1 KJEMIKALIER DRI® ETG ASSAY Alle kjemikalier ble oppbevart ved 4 °C. Tabell 1 Kjemikalier brukt i DRI® ETG assayet Type Navn Produktnr LOT Holdbarhet Reagens A Antistoff/substrat Reagens E Enzymkonjugat 10011723 60178626 2014-08 Kalibrator DRI® EtG negativ kalibrator 10011207 59883091 2015-01 Kalibrator DRI® EtG kalibrator 100 ng/ml 10011208 60050313 2014-07 Kalibrator DRI® EtG kalibrator 500 ng/ml 10011210 59807121 2014-07 Kalibrator DRI® EtG kalibrator 1000 ng/ml 10011212 60050312 2014-11 Kalibrator DRI® EtG kalibrator 2000 ng/ml 10011213 60186722 2014-07 Kontroll DRI® EtG 375 ng/ml kontroll 10012135 60420589 2015-06 Kontroll DRI® EtG 625 ng/ml kontroll 10012136 59883094 2014-07 2.2 KJEMIKALIER LC/MS-MS MS-laboratoriet ved UNN Tromsø lager de fleste reagenser selv. Kalibratorer og kontroller lages ved å tilsette EtG/EtS arbeidsløsning (750 µmol/L) til blank urin fra frivillig alkoholavholdende donor. EtG/EtS arbeidsløsning lages fra stamløsning. Internstandard lages ved å tilsette 460 µl penta-deuteriummerket d5-EtG stamløsning og 270 µl d5-EtS stamløsning til 100 ml Milli-Q-vann. Alle stamløsninger lages ved å tilsette 3ml metanol til 1mg/ml respektiv ampulle EtG/ EtS/ d5-EtG/ d5-EtS fra Cerilliant. Stamløsninger og negativ donorurin oppbevares ved -20 °C. Ferdig opparbeidede kalibratorer og kontroller oppbevares ved -70 °C. Internstandard oppbevares i kjøleskap ved 4 °C. (30) 14 Tabell 2 Kjemikalier brukt ved analyse av EtG/EtS på LC/MS-MS Type Navn Kontroll Kontrollprøve EtG/EtS 40 µmol/L Kontroll Kontrollprøve EtG/EtS 4 µmol/L Internstandard d5-EtG/d5-EtS i Milli-Q-vann Blank Urin fra etanolavholdende donor Kalibrator Standard EtG/EtS 100 µmol/L Kalibrator Standard EtG/EtS 50 µmol/L Kalibrator Standard EtG/EtS 10 µmol/L Kalibrator Standard EtG/EtS 5 µmol/L Kalibrator Standard EtG/EtS 1 µmol/L Mobil fase A 0,1 % maursyre Mobil fase B 100 % metanol 2.3 DRI® ETG ASSAY PÅ COBAS® 6000 DRI® ETG assayet ble utført på Cobas® 6000 som en fotometrisk metode på c501 med kinetisk avlesning. Assayet ble brukt semikvantitativt. En cut-off grense på 500 ng/ml ble brukt for å skille positive og negative prøver. Reagenser overføres til en tom reagenskassett av type Cobas® CDC-302. Reagens A og reagens E overføres til hhv. posisjon B og C. EtG-applikasjonen definerer CDC-302 som DRI® ETG reagenser, og reagens A og E som hhv. reagens R1 og R3: - R1: Antistoff-/substratreagens inneholder musmonoklonalt anti-EtG-antistoff, glukose-6-fosfat (G6P) og NAD i Tris-buffer med natriumazid som konserveringsmiddel - R3: Enzymkonjugat-reagens inneholder EtG-derivat merket med G6PDH i Tris-buffer med natriumazid som konserveringsmiddel c501 tidsberegner i sykluser. En hel rotasjon av reaksjonsdisken er definert som 1 syklus, og tar ca. 8,5s (8,57s = 1 syklus). En bikromatisk fotometrisk avlesning utføres ved spesifiserte bølgelengder en gang per syklus. 14 µl prøvemateriale inkuberes med 80 µl R1 i 300s. Deretter tilsettes 80 µl R3, og reaksjonsløsningen inkuberes i ytterligere 45s. Deretter måles enzymaktiviteten bikromatisk 15 ved primær/sekundær bølgelengde på 340/415nm i 51s. Prøvens EtG konsentrasjon beregnes ut fra målt ∆abs i henhold til standardkurve og faktorer. Resultater rapporteres i ng/ml. En 5-punkts polynomisk standardkurve lages ved å analysere kalibratorer i duplikat. DRI® ETG assayet har et oppgitt måleområde fra 100 – 2000 ng/ml. (23) 23985 Absorbanskurve prøve #93 DRI® ETG assay på Cobas 6000 Abs 20105 16225 3 4 40 45 12345 1 2 8465 4585 0 5 10 15 20 25 30 35 50 55 60 65 Syklus 70 Figur 5 Absorbanskurve på DRI® ETG assayet for en tilfeldig valgt prøve. 1. Prøvemateriale og R1 inkuberes sammen i ca. 300s. Anti-EtG-antistoffer vil binde evt. fritt EtG fra prøven. 2. Deretter tilsettes R2, og absorbansen faller noe pga. fortynningseffekt. Evt. resterende anti-EtG-antistoffer vil nå binde enzymmerket EtG. 3. Etter en inkubering på ca. 45s starter målingen av reaksjonshastigheten, som vil være proporsjonal med mengden fritt EtG fra prøven. 4. Målingen skjer over ca. 51s. ∆abs for prøven beregnes, og EtG konsentrasjonen bestemmes ved hjelp av standardkurven. 2.4 ETG OG ETS METODE PÅ LC/MS-MS Kvantitering av EtG og EtS er en del av rutinen på MS-laboratoriet ved UNN Tromsø. Til opparbeiding av prøvemateriale benyttes en Freedom Evo® (Tecan) pipetteringsrobot. Roboten overfører 50 µl prøvemateriale og 950 µl internstandard til en prøveblokk, og blander løsningen. LC/MS-MS systemet består av et Acquity UPLC® I-Class System (Waters) tilkoplet et Xevo TQ-S (Waters) tandem massespektrometer. Analysen benytter en Acquity HSS T3 2.1x100 mm kolonne. Injeksjonsvolum er 1 µl, flow rate ~0,5 ml/min og total analysetid ~2 min. ESI brukes i negativ ion modus. 16 EtG/EtS konsentrasjoner beregnes ut fra forholdet mellom arealet av EtG/EtS datter-ion og d5-EtG/d5-EtS datter-ion i massespektret, i henhold til standardkurven. Analysen utføres i MRM modus, med massene 221→75.1 og 221→85.1 for EtG, og 125→97.1 for EtS. Kriterier for et positivt svar er at alle datter-ioner til forbindelsen må være tilstede, og konsentrasjonen for hvert datter-ion må ligge i samme nivå. For EtG benyttes datter-ion med høyest intensitet til kvantitering. Kvantitering utføres i MassLynx MS Software (Waters, USA). Resultater rapporteres i µmol/L. For å skille positive og negative prøver benyttes cut-off grense på 2,5 µmol/L. En lineær standardkurve lages ved å analysere kalibratorer i duplikat. Prøvesekvens er standardrekke, kontroller og blank, ukjente prøver, kontroller. 2.5 PRØVEMATERIALE Overflødig materiale fra anonymiserte spoturinprøver (n=117) fra laboratoriets rutinedrift ble brukt til evalueringen av DRI® ETG assayet. Positive prøver (n=31) ble samlet fra rutinedriften (LC/MS-MS) over en periode på tre måneder før evalueringen startet. Utover dette ble tilfeldige utvalgte prøver fra rus-screening (n=68) og urinlab (n=18) brukt. Alle prøver ble alikvotert i tre eksemplarer, og lagret ved -20 °C inntil analyse. Ferdig analyserte prøver ble lagret videre ved -20 °C. EtG har vist seg stabil ved en slik lagringstemperatur (6). 2.6 PROSEDYRE To av alikvotene ble brukt til å analysere alle prøver i paralleller på Cobas® 6000. Den tredje alikvoten ble analysert på LC/MS-MS. Da LC/MS-MS er en sensitiv metode, bør ikke prøver ha vært i et annet instrument først pga. fare for kontaminering. Da vi startet alikvoteringen av tilfeldige utvalgte prøver, ble prøvemateriale overført i sarstedtrør ved helling. Vi oppdaget raskt at ved å helle prøvematerialet kom det mye bunnfall over i det siste av de tre alikvotene. Vi bestemte oss for å bruke pasteurpippetter til alikvoteringen av resterende prøver, da det var lettere å unngå overføring av uønsket utfelling. Samtidig med alikvoteringen ble alle prøver merket med barkode og labnummer fra 0 til 116. Før analysering på Cobas® 6000, ble prøvene tint, blandet opp og stående en tid på benk for å sedimentere. Noen av de tilfeldige utvalgte prøvene ble ikke frosset før analyse på Cobas® 17 6000, men analysert direkte og frosset etterpå. Alle prøvene som skulle til analyse på MSlaboratoriet ved UNN Tromsø ble oppbevart ved -20 °C inntil analyse. Analyseringen på Cobas® 6000 ble utført over fem dager, med opphold i helg og helligdager. To av dagene var påfølgende. Det ble opprettet en egen profil på analyseinstrumentet for våre prøver. Dette innebærer at instrumentet automatisk rekvirerte kreatinin og EtG på urinprøver som ikke tilhørte rutinen. I tillegg til prøvene ble det analysert kontroller. Kontrollene ble analysert i Hitachi-kopper. Kontroller ble analysert daglig over en periode på en måned, men opphold i helger og helligdager. På dagene vi analyserte prøver, ble kontrollene analysert flere ganger. Enkelte dager ble de analysert opp til seks ganger. I tillegg ble analysen rekalibrert ved reagensskifte, og kontroller analysert etter kalibreringen. Tre prøver ble identifisert som kandidater til å sjekke analysens innen-seriepresisjon på instrumentet. Prøvene var hhv. Omtrent 400, 500 og 600 ng/ml. De tre prøvene ble analysert i serie (n=21). Prøvene ble alikvotert i både hitachi-kopper og mikro-kopper, alt ettersom hvor mye materiale som var tilgjengelig. Der vi ikke hadde nok til 21 alikvoter, ble prøvene analysert på nytt til vi hadde 21 resultat. I denne sammenheng ble re-run for analysen avslått, slik at prøvene kom ut av instrumentet straks etter pipettering. Det ble beregnet middelverdi, standardavvik og variasjonskoeffisient (CV) på innen-seriepresisjon. Ca. en uke etter at de siste prøvene ble analysert på Cobas® 6000, ble prøvene analysert på LC/MS-MS. Alikvotene som var beregnet til dette ble tint, blandet opp og montert i egne rack til pipetteringsroboten. Prøvene, kalibratorene, kontrollene og internstandardløsning ble plassert i roboten. Opparbeidingen av prøveløsning i blokk ble så utført automatisk. På to av prøvene feilet roboten og prøvematerialet ble ikke pipettert. Disse to prøvene ble derfor pipettert manuelt. En blokk har plass til 88 prøver i tillegg til kalibratorer og kontroller. Det ble derfor brukt to blokker. Prøveblokkene ble forseglet med silikonmatte, og lagret kjølig for analyse senere på dagen. Prøvenes barkodene ble scannet inn i MassLynx for å få korrekt prøveidentifikasjon på resultatene. 18 2.7 BEHANDLING AV RESULTATER Excel 2010 (Microsoft, USA) ble brukt til behandling og formatering av resultater, utregninger, statistiske beregninger og grafisk framstilling. Resultater fra Cobas® 6000 ble ført inn i Excel manuelt. Resultater fra LC/MS-MS ble overført til Excel direkte fra MassLynx. 19 3 RESULTATER Kontrollskjema DRI® EtG 375 ng/ml (n=40) 2SD Target -2SD Kontrollmålinger over tid Figur 6 Kontrollskjema for DRI® EtG 375 ng/ml på Cobas® 6000. Striplet linje er kusum (kumulert avvik). Punktene viser kontrollmålingenes avvik fra målverdi i antall standardavvik. Kontrollgrensene er beregnet ut fra en CV på 10 %, som er bestemt på bakgrunn av kliniske vurderinger. Kontrollskjema DRI® EtG 625 ng/ml (n=40) 2SD Target -2SD Kontrollmålinger over tid Figur 7 Kontrollskjema for DRI® EtG 625 ng/ml på Cobas® 6000. Striplet linje er kusum (kumulert avvik). Punktene viser kontrollmålingenes avvik fra målverdi i antall standardavvik. Kontrollgrensene er beregnet ut fra en CV på 10 %, som er bestemt på bakgrunn av kliniske vurderinger. 20 Tabell 3 Mellom-seriepresisjon DRI® ETG på Cobas® 6000 (n=40) Middel ng/ml Median ng/ml Range ng/ml SD ng/ml CV % DRI® EtG 375 388 388 96 19,8 5,1 DRI® EtG 625 637 635 69 17,2 2,7 Kontroll Tabell 4 Innen-seriepresisjon DRI® EtG på Cobas® 6000 (n=21) Middel ng/ml Median ng/ml Range ng/ml SD ng/ml CV % Prøve #113 413 414 56 15,7 3,8 Prøve #47 528 531 78 20,0 3,8 Prøve #95 591 591 59 16,9 2,9 Prøve Tabell 5 Sammenligning mellom ufortynnet og fortynnet prøveresultat for prøve #74. Prøven hadde svært høy optisk densitet, og ufortynnet fikk parallell 2 en feilmelding. Parallell 1 Parallell 2 Prøve #74 Kreatinin mmol/L EtG ng/ml Kreatinin mmol/L EtG ng/ml Ufortynnet 19,9 99 20,7 > Abs Fortynnet 1:5* 21,3 245 23,5 230 * Resultatene er korrigert for fortynning Ved vurdering av resultatene fra DRI® ETG assayet mot LC/MS-MS, ble parallell 1 benyttet. Med en cut-off verdi på 500 ng/ml, ble 58 prøver detektert som positive og 59 prøver detektert som negative på DRI® ETG assayet. På LC/MS-MS ble 59 prøver detektert som positive og 58 prøver detektert som negative. Av totalt 117 prøver fikk 116 prøver samme resultat på DRI® ETG assayet og LC/MS-MS (99,1 %). Det var en uoverensstemmende prøve. Resultatene oppsummeres i tabell 6. 21 Tabell 6 Sammenligning av kvalitative resultater mellom DRI® ETG assayet og LC/MS-MS for alle prøver (n=117). Ved å bruke resultater fra LC/MS-MS som referanse, var sensitiviteten til DRI® ETG assayet 98,3 % og spesifisiteten 100 %. LC/MS-MS + Cobas® 6000 + 58 0 - 1* 58 * Prøve #47 hadde negativt resultat på parallell 1, og positivt resultat på parallell 2 på DRI® ETG assayet. For alle andre prøver gav begge paralleller samme kvalitative resultat. Kji-kvadrat ble benyttet til å sjekke om det var sannsynlig at resultatene mellom DRI® ETG assayet og LC/MS-MS var signifikant forskjellige. Testen indikerte at det ikke var signifikant forskjell (p = 0,89). Korrelasjonen mellom semi-kvantitative resultater fra DRI® ETG assayet (n=16) og kvantitative resultater fra LC/MS-MS ble vurdert ved å beregne korrelasjonskoeffisient (r = 0,97). Prøver med EtG konsentrasjoner over eller under måleområdet til DRI® ETG assayet (n=101) ble ikke tatt med i beregningen. 22 4 DISKUSJON 4.1 INNEN-SERIE- OG MELLOM-SERIEPRESISJON Tabell 4 viser resultater for innen-seriepresisjon på Cobas® 6000. Resultatene viser at metodens CV er høyere under og ved cut-off grensen (500 ng/ml) enn over. Selv om CV er høyere i lavt enn høyt område, ser vi at range er bedre på det laveste nivået. Det er vanskelig å få en lav CV ved lavere konsentrasjoner enn høye, fordi samme konsentrasjonsendring gir større prosentvis utslag. Hvis vi sammenligner CV for innen-seriepresisjon med prøve #95 (tabell 4) med CV for mellom-seriepresisjon for kontrollen ETG 625 (tabell 3), er innenseriepresisjonen dårligere ved omtrent samme konsentrasjonsnivå. Dette kan skyldes at innenseriepresisjon ble utført med pasientprøver, mens mellom-seriepresisjon ble utført med rene kontrollprøver. Kontrollprøvene består av renset humant urin tilsatt rent EtG, og det kan tenkes at pasientprøver med matriksforskjeller kan gi større svingninger i resultatene. Da laboratoriet etablerte rus-screening på analyseinstrumentet Cobas® 6000, ble det på bakgrunn av kliniske vurderinger bestemt at kontrollgrenser beregnet fra en CV på 10 % var godt nok. Vi brukte samme kontrollgrenser ved evalueringen av DRI® ETG assayet. Tabell 3 viser resultatene for mellom-seriepresisjon på Cobas® 6000. Middelverdi er nær målverdi for begge kontroller. Median er lik middelverdi for begge kontroller. CV er en del høyere ved lavt enn ved høyt kontrollnivå. Range viser også at det er større svingninger i resultatene til lav kontroll. Dette visualiseres i figur 6, der kontrollmålingene er veldig spredt. Kusum (kummulert avvik) viser først en oppadgående trend, men går ned mot slutten av målingene. På det antallet målinger vi har, viser kusum at de fleste målingene er over målverdi. Figur 7 visualiserer målingene for høy kontroll. Det er tydelig at metoden har mindre svingninger i resultatene her. Kusum holder seg jevnt over og under målverdi, og viser ingen spesiell tendens. Målingene er jevnt spredt rundt målverdi. Immunologiske metoder har som regel høyere CV enn tradisjonelle klinisk kjemi metoder. Våre resultater viser at begge kontroller er langt bedre enn fastsatt kontrollgrense. Mellomseriepresisjon for DRI® ETG assayet er også bedre enn mange av laboratoriets øvrige russcreeningmetoder. 23 4.2 BETYDNING AV URINENS EGENFARGE Ved analysering av EtG i prøve #74 rapporterte c501 feilkode «< abs» på parallell 1 (P1). Parallell 2 (P2) ble analysert uten feilkode. Det ble kjørt automatisk re-run på P1, med samme feilkode. Brukermanualen til Cobas® 6000 forklarer feilkoden med at prøvens optiske densitet er så høy at de fotometriske målingene blir usikre. Begge alikvotene ble fortynnet1:5 med saline, og analysert på nytt. Tabell 5 viser resultatene før og etter fortynning. Etter fortynning var EtG konsentrasjonen for P1 omtrent 3 ganger høyere enn før fortynning. P2 har ikke resultat før fortynning. Resultatene for P1 og P2 etter fortynning er gode paralleller. Den aktuelle prøven var svært mørk gul, den mørkeste av alle prøvene. Da kun en av alikvotene fikk feilkode, kan det tyde på at prøvens optiske densitet ved 340nm var i grenseland for hva instrumentet takler. Pga. at resultatet for EtG etter fortynning var høyere enn før fortynning, kan det se ut som at analysen har en øvre grense for hvor høy optisk densitet prøvematerialet kan ha før resultatet blir usikkert. Det kan virke som at denne grensen er lavere enn grensen for feilmelding. Den aktuelle prøven hadde negativt resultat både på Cobas® 6000 og LC/MS-MS. I dette tilfellet hadde derfor ikke fenomenet noe å si for den kvalitative bestemmelsen. Dette fenomenet ble kun observert i en av prøvene våre. I tillegg hadde denne prøven en EtG konsentrasjon nær metodens nedre målegrense, som kan gi målingene ekstra usikkerhet. Vi forsøkte å finne flere prøver med tilsvarende eller mørkere egenfarge uten å lykkes. Ved en evt. etablering av DRI® ETG assayet i rutinen, bør en derfor vurdere om prøver med en optisk densitet over en viss grense automatisk fortynnes før analyse. 4.3 SAMMENLIGNING AV RESULTATER Resultatene for EtG på Cobas® 6000 har gode paralleller i metodens måleområde. For konsentrasjoner over måleområdet, blir parallellene gradvis dårligere jo høyere konsentrasjonen blir. Da metoden brukes semi-kvantitativt, har ikke presisjonen over måleområdet betydning for å skille positive og negative prøver. 24 På prøver med EtG konsentrasjoner over måleområdet til DRI® ETG assayet, var det dårlig samsvar mellom semi-kvantitative resultater fra Cobas® 6000 og kvantitative resultater fra LC/MS-MS. Flere prøver fikk rapportert omtrent samme svært høye EtG konsentrasjon på LC/MS-MS. Ved å sammenligne resultatene for disse prøvene med resultatene fra Cobas® 6000, var det ingen sammenheng og resultatene varierte svært mye i begge retninger. Dette er allikevel svært positive prøver, og resultatene var langt over måleområdet til DRI® ETG assayet. Dette fenomenet har derfor ingen betydning for det kvalitative screenings-resultatet. Prøver målt med DRI® ETG assayet som fikk rapportert EtG konsentrasjoner i metodens måleområde, hadde godt samsvar med tilsvarende resultater på LC/MS-MS (r = 0,97). Korrelasjonskoeffisienten forteller oss at det er en viss linearitet mellom resultatene for de to metodene. Dette er vesentlig, da immunoassayets riktighet og presisjon i og rundt beslutningsgrensen er det som er viktig for en screeningsmetode. Tabell 6 viser en sammenligning av kvalitative resultater mellom Cobas® 6000 og LC/MS-MS. Ved å bruke LC/MS-MS som referanse, er sensitiviteten 98,3 % og spesifisiteten 100 %. P1 av prøve #47 ble negativ på DRI® ETG assayet, mens P2 av samme prøve ble positiv på DRI® ETG assayet. EtG konsentrasjonen i denne prøven lå omtrent på cut-off verdi (500 ng/ml). Prøven ble brukt ved undersøkelse av innen-seriepresisjon på cut-off. Tabell 4 viser at prøvens middelverdi ble målt til 528 ng/ml. Målt middelverdi er et sikrere anslag av prøvens sanne verdi, og viser at prøven fikk et negativt resultat på DRI® ETG assayet pga. tilfeldige feil. Dette støttes av den teoretiske testen, som indikerer at forskjellen i resultater mellom Cobas® 6000 og LC/MS-MS skyldes tilfeldigheter (p = 0,89). Dette skyldes kun stort øvrig samsvar i resultatene, da den teoretiske testen ikke tar hensyn til om en prøve er i en gråsone eller ikke. Sensitiviteten i dette tilfellet sier noe om testens evne til å identifisere alkoholmisbruk i gruppen med resultat over cut-off grensen. Spesifisiteten sier noe om testens evne til å identifisere alkoholavhold i gruppen med resultat under cut-off grensen. Både sensitiviteten og spesifisiteten for DRI® ETG assayet er meget høyt. Dette kan skyldes at de fleste av prøvene var klart positive eller klart negative. Kun noen få av prøvene (n=6) 25 hadde EtG konsentrasjoner rundt cut-off verdi (500 ± ~150 ng/ml), og én prøve hadde EtG konsentrasjon omtrent på cut-off verdi. Det er i dette området spesifisiteten og sensitiviteten må være god. 4.4 DRI® ETG ASSSAYET SOM SCREENINGSMETODE Tiltenkt bruk for DRI® ETG assayet er screening av både IS-13 og IS-14 prøver. For IS-13 prøver kan det være hensiktsmessig med god spesifisitet, slik at man unngår falske positive prøver. Dette skyldes at rekvirenten ikke alltid ber om at et positivt resultat bekreftes/kvantiteres på LC/MS-MS. Dette kan føre til at falske positive får negative konsekvenser for vedkommende. For IS-14 prøver hvor positivt resultat kan ha rettslige og personlige konsekvenser, kan det være hensiktsmessig med god sensitivitet. Dette kommer av at IS-14 prøver med positiv screeningsresultat, uansett sendes videre til LC/MS-MS for bekreftelse. En potensiell løsning er å etablere en gråsone på cut-off verdi tilsvarende DRI® ETG assayets impresisjon. IS-13 prøver i gråsonen kan svares ut med inkonklusivt svar og IS-14 prøver i gråsonen sendes til LC/MS-MS for bekreftelse. På denne måten kunne en unngå falske positive IS-13 prøver. I tillegg vil rettslige prosesser avhengig av IS-14 prøvesvar ikke avgjøres av falske negative svar pga. DRI® ETG assayets impresisjon. Alle prøveresultater både fra rus-screening og LC/MS-MS blir sett over og evt. kommentert av medisinsk ansvarlig lege før de gis ut til rekvirent. 4.5 FALSKE POSITIVE Falske positive prøver kan skyldes metodens impresisjon, dårlig spesifisitet, uskyldig eksponering for alkohol eller at EtG dannes i prøvematerialet in vitro. EtG er en robust analytt mtp. oppbevaring av prøvematerialet. Stephanson et al viste at urinprøver oppbevart ved 4 °C og ved romtemperatur i 14 dager, ikke viste signifikant endring i EtG konsentrasjon. Urinprøver oppbevart ved -20 °C viste lang holdbarhet (6). Helander et al har i etterkant vist at EtG både kan dannes og brytes ned in vitro gitt visse betingelser. Dette var tilfellet dersom urinprøven inneholdt både E. coli bakterier og etanol. Etanolen trenger ikke stamme fra nylig alkoholinntak. Som tidligere nevnt, er det mulig at etanol dannes in vitro bakterielt ved fermentering av sukker. Forfatterne fant at i 35 % av 26 prøvene som inneholdt E. coli og etanol, ble det detektert EtG som ikke hadde vært i prøven fra før. Prøvematerialet ble oppbevart ved romtemperatur. (31) Dette kan være problematisk da analyse av EtG i urin ikke bare brukes som dokumentasjon på avhold hos alkoholikere, men også i andre situasjoner som i skoler og på arbeidsplasser. I tillegg brukes analyse av EtG post mortem som en markør for antemortem alkoholinntak. (31) Uskyldig eksponering for etanol kan gi tilstrekkelig mengde ekskresjon av EtG til positivt screenings-resultat. Dette er ikke falske positive i analytisk forstand, men de skyldes annen eksponering enn etanolkonsum i form av drikkevarer. Reisfield et al fant at regelmessig bruk av etanolbasert hånddesinfeksjon kan føre til ekskresjon av EtG i urin opptil fire ganger høyere enn vanlig akseptert cut-off verdi (500 ng/ml) (32). Et slikt resultat ville blitt bekreftet på LC/MS-MS, da det er en reell EtG konsentrasjon i prøven. Det er viktig at rekvirenter og pasienter et tilstrekkelig informert om at utilsiktet eksponering for etanol kan gi positivt resultat. Personer som er med i et avholdsprogram, må derfor få beskjed om å holde seg unna all form for alkohol. Informasjon om at det er alkohol også i andre kilder enn drikkevarer må gis. Munnskyllevann, konfekter, hånddesinfeksjon og etterbarberingsvann kan inneholde etanol. Inntak eller bruk av slike produkter, kan gi tilstrekkelige EtG konsentrasjoner i urin til et positivt resultat. Prøvematerialet som kommer inn til rusmiddel-screening ved Laboratoriemedisin UNN Tromsø, har svært varierende utseende. Omtrent halvparten av prøvene brukt til denne evalueringen ble plukket fra disse. Prøvene har svært varierende mengde utfelling, farge, turbiditet og viskositet. Prøvene stammer fra klientell som potensielt utsetter kroppen sin for «hard behandling». Det kan tenkes at det er større sjanser for at slike prøver oppfyller betingelsene for in vitro endring av EtG konsentrasjonen. Derfor blir det viktig med korrekt oppbevaring før analyse. I tillegg kan den store variasjonen i disse prøvenes matriks, ha innvirkning på metodens presisjon. Produsenten av DRI® ETG assayet har gjort spesifisitetsforsøk mot glukoronidforbindelser som vanligvis finnes i urin, uten å finne noen signifikant kryssreaksjon. (23) 27 Arndt et al fant en mulig kryssreaksjon med trikloroetylglukuronid. Kryssreaksjonen kunne ikke bekreftes pga. at trikloroetylglukuronid ikke var tilgjengelig i ren form (33). Trikloroetylglukoronid er en metabolitt av kloralhydrat, som benyttes bl.a. som et beroligende legemiddel og til kortidsbehandling ved alkoholabstinenser (34). Arndt et al fant i en annen studie at DRI® ETG assayet kryssreagerer med n-propylglukuronid. Jevnlig bruk av propanolbasert hånddesinfeksjonsmiddel gir samtidig passiv inhalering av damp fra denne. Dette kan føre til tilstrekkelig inntak av propylalkoholer og påfølgende ekskresjon av propylglukoronider. I studiet ble det brukt hånddesinfeksjon hvert 15 min i 8 timer, som skulle simulere en vanlig arbeidsdag. Dette førte til ekskresjon av tilstrekkelig propylglukuronider til et positivt resultat på DRI® ETG assayet. (35) Dette er to eksempler på falske positive prøver pga. dårlig spesifisitet på DRI® ETG assayet. I begge disse tilfellene ble det ikke påvist EtG med LC/MS-MS. Det er viktig at rekvirent har tilstrekkelig informasjon om at immunologiske metoder har dårligere spesifisitet enn LC/MS-MS, slik at de ikke stoler blindt på en positiv screening. Hvis pasienten nekter for alkoholinntak, er det hensiktsmessig at prøven analyseres på LC/MS-MS i tillegg. Slike falske positive vil ikke ha betydning for rettslige konsekvenser av IS-14 prøver, da disse uansett må bekreftes på LC/MS-MS. 4.6 FALSKE NEGATIVE Falske negative prøver kan skyldes metodens impresisjon, dårlig sensitivitet, manipulasjon av prøvematerialet eller nedbrytning av EtG in vitro. Helander et al fant i tillegg til at EtG kan dannes in vitro, at EtG kan bli nedbrutt in vitro. Årsaken er at flere E. coli bakterier har enzymet β-glucuronidase som spalter EtG. Forfatterne viste også at EtS konsentrasjonen ikke ble påvirket av verken E. coli eller etanol i prøvematerialet. Avslutningsvis anbefalte forfatterne å måle både EtG og EtS, og vurdere dem sammen for å fastslå alkoholkonsum. (31) En svakhet med immunologiske metoder er muligheten til å manipulere prøvematerialet for å få et negativt screenings-resultat. Helander et al drøfter problemstillingen med manipulasjon av prøvematerialet ved fortynning, og bruk av kreatininmåling til å oppdage dette (18). Forfatterne nevner eksempler på metoder for manipulering, f.eks. tilsetting av kjemikalier som klorin, salt, syre, base eller detergent, som forstyrrer eller umuliggjør bruk av 28 immunologiske metoder. Det vanligste er derimot å vanne ut urinen, enten etter prøvetaking eller in vivo ved å innta store mengder drikke. Ved å måle kreatinin i prøvematerialet, vil en kunne vurdere om det er en ufortynnet fysiologisk prøve. Fortynnede prøver kan få så lav rusmiddelkonsentrasjon at de faller under påvisningsgrensen for analyseinstrumentet og gir et falskt negativt svar. Prøvene som ble brukt i evalueringen av DRI® ETG assayet, var av svært varierende egenfarge. Det ble ikke observert noen sammenheng mellom kreatininverdi og egenfarge, dvs. at mørke prøver kunne ha lavere kreatininverdi enn lyse prøver og motsatt. Visuell vurdering av prøvematerialet for å oppdage utvanning er derfor ikke mulig. F.eks. hadde vi en prøve som lignet vann i farge, men hadde allikevel svært høy kreatininverdi. Noen av prøvene i evalueringen hadde kreatininverdi < 2 mmol/L (n=4). Alle disse prøvene var positive for EtG på begge metodene. DRI® ETG assayet er ifølge produsenten egnet til analyse av urinprøver med pH i området 4,5 – 11 (23). For å unngå et usikkert resultat hvis prøvematerialet er tilsatt syre eller base, kan c501 måle pH i prøven for å sjekke at prøvematerialet er egnet til analyse med DRI® ETG assayet. LC/MS-MS er en sensitiv og spesifikk metode, og det er vanskelig å manipulere prøvematerialet slik at det forstyrrer metoden. Så lenge analytten er til stede i prøvematerialet, vil det kunne påvises og kvantiteres. Unntaket vil være dersom prøvematerialet er tilsatt noe som binder til analytten, slik at det feller ut som bunnfall. Dette kalles flokkulering. 29 5 KONKLUSJON DRI® ETG assayets innen-serie- og mellom-seriepresisjon tilfredsstiller kravene satt på bakgrunn av kliniske vurderinger. De kvalitative resultatene viste et meget godt samsvar mellom DRI® ETG assayet og LC/MS-MS (99,1 %). Ved å bruke LC/MS-MS som referanse fikk DRI® ETG assayet en beregnet spesifisitet og sensitivitet på hhv. 100 % og 98,3 %. Kun en prøve hadde uoverensstemmende resultater. Den aktuelle prøven hadde en EtG konsentrasjon like ved cut-off verdi, og resultatet kunne svinge begge veier pga. impresisjon. For å unngå feilaktige screeningsresultater på prøver med en EtG konsentrasjon i området rundt cut-off grense, bør det vurderes å etablere en gråsone tilsvarende DRI® ETG assayet impresisjon. Underveis i evalueringen ble det oppdaget en potensiell feilkilde med DRI® ETG assayet på Cobas® 6000 og urinprøver med høy optisk intensitet. Før metoden evt. tas i bruk bør dette undersøkes, evt. bør det etableres en øvre grense for prøvens egenabsorbans ved 340 nm med en automatisk fortynning av prøvematerialet. Utfra våre resultater kan vi konkludere med at DRI® ETG assayet er en god nok screeningsmetode for EtG i urin. 30 LITTERATURLISTE 1. Lieber CS. Microsomal Ethanol-Oxidizing System (MEOS): The First 30 Years (1968-1998)– A Review. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 1999; vol 23, nr. 6: 991-1007. 2. Abudu N. Ethyl Glucuronide: A Sensitive Marker for Alcohol Consumption. Warde Report. 2008; vol 19, nr. 3. http://tinyurl.com/q7jpkbm (8.5.2014) 3. Böttcher M, et al. Evaluation of a New Immunoassay For Urinary Ethyl Glucoronide Testing. Alcohol & Alcoholism. 2008; vol 43, nr. 1: 46-48. 4. Urdal P, et al. Brukerhåndbok Medisinsk Biokjemi. 4. utgave. Stavanger: Akademisk Fagforlag AS; 2009. 5. ChemSpider. Search and Share Chemistry. Ethyl Glucoronide. http://tinyurl.com/o4c8ago (19.5.2014) 6. Stephanson N, et al. Direct Quantification of Ethyl Glucuronide in Clinical Urine Samples by Liquid Chromatography–Mass Spectrometry. Therapeutic Drug Monitoring. 2002; vol 24, nr. 5: 645-651. 7. Foti RS, Michael B Fisher.Assessment of UDP-glucuronosyltransferase catalyzed formation of ethyl glucuronide in human liver microsomes and recombinant UGTs. Forensic Science International. 2005: vol 153: 109-116. 8. Schmitt G, et al. Ethyl glucuronide concentration in serum of human volunteers, teetotalers, and suspected drinking drivers. Journal of Forensic Sciences. 1997; nr. 42: 1099-1102. 9. Dahl H, et al. Comparison of Urinary Excretion Characteristics of Ethanol and Ethyl Glucuronide. Journal of Analytical Toxicology. 2002; vol 26: 201-204. http://tinyurl.com/qbshdpa (8.5.2014) 10. Wurst FM, Metzger J. The Ethanol Conjugate Ethyl Glucuronide Is a Useful Marker of Recent Alcohol Consumption. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 2002; vol 26, nr. 7: 1114-1119. 11. Morini L, et al. Ethyl glucuronide in hair. A sensitive and specific marker of chronic heavy drinking. Addiction. 2009; vol 104, nr. 6: 915-920. 31 12. Kharbouche H, et al. Diagnostic performance of ethyl glucuronide in hair for the investigation of alcohol drinking behavior: a comparison with traditional biomarkers. International Journal of Legal Medicine. 2012; vol 126, nr. 2: 243-250. http://tinyurl.com/k8c9wuj (8.5.2014) 13. Wurst FM, et al. Ethyl sulphate: a direct ethanol metabolite reflecting recent alcohol consumption. Addiction. 2006; vol 101, nr. 2: 204-211. 14. ChemSpider. Search and Share Chemistry. Ethyl hydrogen sulfate. http://tinyurl.com/n7ynfsy (19.5.2014) 15. Junghanns K, et al. Urinary ethyl glucuronide (EtG) and ethyl sulphate (EtS) assessment: valuable tools to improve verification of abstention in alcohol-dependent patients during inpatient treatment and at follow-ups. Addiction. 2009; vol 104, nr. 6: 921-926. 16. Erim Y, et al. Urinary ethyl glucuronide testing detects alcohol consumption in alcoholic liver disease patients awaiting liver transplantation. Liver Transplantation. 2007; vol 13, nr. 5: 757-761. http://tinyurl.com/kejp938 (8.5.2014) 17. Wurst FM, et al. Ethyl glucuronide--the direct ethanol metabolite on the threshold from science to routine use. Addiction. 2003; vol 98, nr. 2: 51-61. 18. Helander A, et al. Kreatininkoncentrationen i urin bör mätas vid drogtestning. Läkartidningen 2011. vol 108; nr. 24-25: 1311-1314. 19. Sosial- og Helsedirektoratet. Rundskriv IS-14/2002. http://tinyurl.com/kss7u89 (9.5.2014) 20. Sosial- og Helsedirektoratet. Rundskriv IS-13/2002. http://tinyurl.com/kj7xcv9 (14.5.2014) 21. Roche. Cobas® 6000 analyzer series. http://tinyurl.com/o9als7v (22.5.2014) 22. Cobas® 6000 analyzer series. Operator's manual. Manual version 5.0. 23. Pakningsvedlegg Microgenics DRI® etylglukoronid-assay. 24. Wikipedia. Enzyme multiplied immunoassay technique. http://tinyurl.com/lavl8pe (8.5.2014) 25. Thermo Fisher Scientific Inc. Drug Monitoring and Quality Control Products and 32 Instrumentation. http://tinyurl.com/mjaazh2 (8.5.2014) 26. MetaCyc. SRI International. Enzyme: glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase. http://tinyurl.com/ppshrgo (8.5.2014) 27. BGI Americas. Waters Xevo TQ-S. http://tinyurl.com/p35jfkb (22.5.2014) 28. Hoffmann E, Stroobant V. Mass Spectrometry Principles and Applications. 4. utgave. Chichester: John Wiley & Sons Ltd; 2007. 29. The University of Leeds. An Introduction to Mass Spectrometry. http://tinyurl.com/cf62go (10.5.2014) 30. Kvantifisering av etylglukuronid og etylsulfat i urin (LC -MS-MS). Laboratoriemedisin UNN Tromsø. Dok.nr. PR09216 v1. Gyldig fra 15.11.2012. 31. Helander A, et al. Postcollection Synthesis of Ethyl Glucuronide by Bacteria in Urine May Cause False Identification of Alcohol Consumption. Clinical Chemistry. 2007; vol 53, nr. 10: 1855-1857. http://tinyurl.com/nv2k6ks (8.5.2014) 32. Reisfield GM, et al. Ethyl Glucuronide, Ethyl Sulfate, and Ethanol in Urine after Sustained Exposure to an Ethanol-Based Hand Sanitizer. Journal of Analytical Toxicology. 2011; vol 35: 85-91. 33. Arndt T, et al. False-positive ethyl glucuronide immunoassay screening associated with chloral hydrate medication as confirmed by LC–MS/MS and self-medication. Forensic Science International. 2009; nr. 184: e27-e29. 34. MedlinePlus. National Institute of Health. Chloral Hydrate. http://tinyurl.com/8x9ypkf (15.5.2014) 35. Arndt T, et al. False-positive ethyl glucuronide immunoassay screening caused by a propyl alcohol-based hand sanitizer. Forensic Science International. 2012; nr. 223: 359-363. 33 6 VEDLEGG 6.1 PRØVERESULTATER COBAS® 6000 Prøvenr 10130000 10130001 10130002 10130003 10130004 10130005 10130006 10130007 10130008 10130009 10130010 10130011 10130012 10130013 10130014 10130015 10130016 10130017 10130018 10130019 10130020 10130021 10130022 10130023 10130024 10130025 10130026 10130027 10130028 10130029 10130030 10130031 10130032 10130033 10130034 10130035 10130036 Kreatinin mmol/L Parallell 1 Parallell 2 10,587 10,502 3,567 3,522 10,169 9,859 2,619 2,557 1,326 1,321 8,070 7,822 5,327 5,367 3,036 3,059 12,579 12,409 12,703 12,725 11,698 11,789 2,128 2,133 8,730 8,634 11,428 11,349 11,049 10,801 8,657 8,595 13,933 13,871 9,498 9,582 15,694 15,637 8,290 8,188 12,601 12,494 12,630 12,669 11,004 10,959 15,530 15,795 8,171 8,087 26,461 26,162 6,321 6,292 9,311 9,345 10,649 10,536 9,306 8,950 17,861 18,132 16,862 16,444 20,490 20,327 25,456 24,875 1,005 1,010 10,897 10,976 11,320 11,343 EtG ng/ml Parallell 1 Parallell 2 10213 10169 3905 3859 19784 19234 5284 4950 1538 1451 10586 10293 7721 7768 2868 2921 15167 14595 17477 17318 1303 1333 5219 5232 3632 3710 13852 13797 11181 10948 18779 18667 14345 13907 668 670 2621 2681 19235 18714 996 1019 5669 5724 16968 17202 12922 13127 879 875 4105 4164 5493 5480 21966 21899 8336 8389 21177 21098 2344 2412 40 31 76 94 0 0 8694 8602 30 35 0 0 Kommentar 34 10130037 10130038 10130039 10130040 10130041 10130042 10130043 10130044 10130045 10130046 10130047 10130048 10130049 10130050 10130051 10130052 10130053 10130054 10130055 10130056 10130057 10130058 10130059 10130060 10130061 10130062 10130063 10130064 10130065 10130066 10130067 10130068 10130069 10130070 10130071 10130072 10130073 10130074 101300741:5 10130075 10130076 10130077 10130078 10130079 6,879 18,306 1,744 12,443 12,376 31,585 16,788 22,612 14,384 5,293 6,603 11,365 15,084 22,482 11,484 12,821 9,847 11,411 16,975 8,634 12,590 16,010 4,949 6,242 1,400 28,464 9,526 7,218 21,529 2,833 11,123 28,526 12,855 2,094 24,429 5,847 12,731 19,945 6,749 18,064 1,688 12,844 12,285 31,855 16,636 22,877 14,266 5,169 6,659 11,168 15,231 22,432 11,665 12,906 9,757 11,490 16,755 8,854 12,782 16,202 5,023 6,230 1,405 28,329 9,605 7,218 20,959 2,794 11,078 28,447 12,816 2,083 24,881 5,835 12,793 20,749 41 20 3165 0 59 541 33 48 1734 97 488 6130 32 84 13 55 264 38 74 7030 11 26 108 43 7176 50 1438 29 2698 21 89 64 0 53 292 137 0 99 45 15 3251 0 48 597 15 40 1682 96 516 6125 43 63 35 59 274 21 76 7062 31 29 101 56 7304 68 1422 40 2599 31 99 81 0 40 291 138 0 - 21,330 12,161 9,667 7,274 7,127 9,599 23,535 12,127 9,763 7,607 7,178 9,667 245 38 21 72 0 15 230 11 23 87 0 9 Gråsone > Abs Resultat justert for fortynning < Test Samp.C (Crea -0,034) - RERUN 35 10130080 10130081 10130082 10130083 10130084 10130085 10130086 10130087 10130088 10130089 10130090 10130091 10130092 10130093 10130094 10130095 10130096 10130097 10130098 10130099 10130100 10130101 10130102 10130103 10130104 10130105 10130106 10130107 10130108 10130109 10130110 10130111 10130112 10130113 10130114 10130115 10130116 11,862 33,419 19,424 9,938 20,366 25,293 19,300 20,394 8,194 9,644 24,683 18,871 11,642 19,853 16,467 11,236 21,043 11,033 20,265 28,261 6,874 2,715 12,308 14,994 17,082 5,271 6,586 11,134 21,088 26,348 5,028 9,582 3,132 15,998 6,907 3,443 2,867 11,732 34,079 19,424 9,994 20,643 25,140 19,672 20,519 8,228 9,577 24,017 18,882 11,631 19,582 16,360 11,162 21,325 10,993 20,462 28,058 6,953 2,737 12,534 14,943 17,313 5,35 6,507 11,106 20,97 26,325 5,034 9,515 3,036 15,524 7,009 3,443 2,873 7 142 14684 42 9 35 73 32 8 7 658 148 75 117 133 621 9710 96 4545 93 9611 6850 14877 9355 1192 1649 6480 5034 2544 2055 9690 7942 10408 394 105 4 17 0 156 14782 52 42 32 56 11 12 7 627 138 99 125 148 606 9860 62 4557 70 9701 6865 15577 9362 1175 1711 6459 4968 2507 2074 9741 8002 10556 367 107 19 17 36 6.2 INNEN-SERIEPRESISJON COBAS® 6000 Parallell 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ca. 400 ng/ml Ca. 500 ng/ml Ca. 600 ng/ml Prøve #113 Prøve #47 Prøve #95 414 500 587 424 493 610 407 533 606 421 546 616 418 526 597 450 519 566 395 521 586 419 519 575 426 505 584 395 506 567 408 533 606 397 531 591 394 542 606 423 517 613 394 543 602 398 545 585 400 534 578 401 546 574 424 555 557 436 571 605 426 504 595 6.3 MELLOM-SERIEPRESISJON COBAS® 6000 DRI® ETG 375 ng/ml Dato 8.4 9.4 10.4 10.4 10.4 10.4 10.4 10.4 11.4 13.4 14.4 14.4 Lot 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 Resultat ng/ml 388 436 395 400 391 376 419 414 414 368 413 363 DRI® ETG 625 ng/ml Dato 8.4 9.4 10.4 10.4 10.4 10.4 10.4 10.4 11.4 13.4 14.4 14.4 Lot 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 Resultat ng/ml 644 653 653 657 664 653 654 629 636 625 617 638 37 14.4 14.4 14.4 14.4 15.4 15.4 15.4 15.4 17.4 18.4 19.4 20.4 20.4 21.4 22.4 22.4 22.4 22.4 22.4 23.4 25.4 25.4 29.4 30.4 5.5 6.5 7.5 8.5 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 60420589 389 371 401 421 377 413 340 380 385 363 385 403 401 395 362 388 379 379 401 389 388 356 362 393 376 387 382 380 14.4 14.4 14.4 14.4 15.4 15.4 15.4 15.4 17.4 18.4 19.4 20.4 20.4 21.4 22.4 22.4 22.4 22.4 22.4 23.4 25.4 25.4 29.4 30.4 5.5 6.5 7.5 8.5 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 59883094 645 630 634 642 617 624 607 626 645 618 612 651 649 622 634 658 608 630 666 668 676 623 637 645 626 626 628 627 6.4 PRØVERESULTATER LC/MS-MS Resultater i kolonne merket med * er beregnet ut fra molekylvekt for EtG (222,193 g/mol). Det er definert en arealgrense i MassLynx slik at resultater for prøver med konsentrasjoner under ca. 0,8 µM ikke beregnes automatisk. EtS Prøvenr. 10130000 10130001 10130002 10130003 µmol/L 69,3 19,5 159,8 34,2 EtG µmol/L 109,5 21,4 296,1 44,0 ng/ml* 24330 4759 65794 9783 Kommentar Pipettert manuelt i blokk 38 10130004 10130005 10130006 10130007 10130008 10130009 10130010 10130011 10130012 10130013 10130014 10130015 10130016 10130017 10130018 10130019 10130020 10130021 10130022 10130023 10130024 10130025 10130026 10130027 10130028 10130029 10130030 10130031 10130032 10130033 10130034 10130035 10130036 10130037 10130038 10130039 10130040 10130041 10130042 10130043 10130044 10130045 10130046 10130047 9,7 34,5 33,3 10,5 249,8 237,4 2,5 6,8 4,4 114,5 33,4 62,9 233,5 7,5 10,0 393,6 3,9 8,9 510,5 263,1 3,4 13,4 21,8 154,1 20,9 154,2 11,6 17,5 1,3 8,6 4,5 7,8 1,8 10,4 49,1 45,3 13,2 428,6 836,2 6,9 23,2 19,3 209,2 67,9 151,6 360,0 4,3 17,6 1075,0 6,3 35,9 1368,6 412,1 3,8 23,6 33,6 535,0 62,5 541,2 13,6 44,8 15,4 2,9 9,7 2,8 2306 10919 10059 2931 95227 185798 1526 5159 4293 46492 15076 33693 79987 964 3911 238860 1398 7970 304098 91555 835 5235 7468 118873 13885 120246 3020 9945 3415 640 2151 613 39 10130048 10130049 10130050 10130051 10130052 10130053 10130054 10130055 10130056 10130057 10130058 10130059 10130060 10130061 10130062 10130063 10130064 10130065 10130066 10130067 10130068 10130069 10130070 10130071 10130072 10130073 10130074 10130075 10130076 10130077 10130078 10130079 10130080 10130081 10130082 10130083 10130084 10130085 10130086 10130087 10130088 10130089 10130090 10130091 32,1 0,7 0,1 0,1 17,9 28,6 3,0 11,8 2,5 480,6 1,2 - 41,0 1,9 40,7 36,4 7,3 16,0 1,7 1475,6 3,2 - 9112 427 9034 8097 1618 3562 371 327866 715 - Pipettert manuelt i blokk 40 10130092 10130093 10130094 10130095 10130096 10130097 10130098 10130099 10130100 10130101 10130102 10130103 10130104 10130105 10130106 10130107 10130108 10130109 10130110 10130111 10130112 10130113 10130114 10130115 10130116 0,8 1,6 33,3 14,3 39,9 13,9 264,8 449,7 6,6 4,3 25,8 32,1 12,4 17,4 66,5 47,3 102,6 1,5 - 2,8 93,6 28,4 54,6 33,9 437,3 1594,6 6,6 8,3 51,8 42,8 15,7 14,6 178,8 92,7 259,7 2,1 - 624 20786 6315 12123 7521 97165 354309 1469 1849 11516 9517 3480 3251 39733 20591 57712 460 - Prøve var gråsone på Cobas® 6000 41
© Copyright 2024