Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer
Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Läs dessa anvisningar noga innan du använder dessa produkter. Spara denna bruksanvisning för framtida bruk. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 1 Denna sida har avsiktligt lämnats tom Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 2 Innehållsförteckning Innehållsförteckning Tillverkare: RAScan och ACE Kits .......................................................................... 7 Ansvarsfriskrivning för översättning ........................................................................ 7 Licenser, varumärken och upphovsrätt................................................................... 7 Kontaktuppgifter ..................................................................................................... 8 DEL I RAScan Kits ............................................................................................... 9 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD.............................................................................. 10 1.1 Avsedd användning.................................................................................................................. 10 1.2 Indikationer................................................................................................................................ 10 1.3 Beställningsinformation........................................................................................................... 10 1.4 Principer för RAScan Kits CE IVD ........................................................................................... 11 1.4.1 KRAS och NRAS ....................................................................................................................................... 11 1.5 Analysprocedur ........................................................................................................................ 12 1.5.1 Somatisk mutationsdetektion med RAScan Kits ‐ en översikt ............................................................... 12 1.5.2 SURVEYOR Nuclease .............................................................................................................................. 12 1.6 Att tänka på avseende arbetsflöde ......................................................................................... 14 1.6.1 Analys av patientprover med RAScan Kits ............................................................................................. 16 1.7 Härledning av kittets kontrollsubstanser ............................................................................... 17 1.8 Kontrollparametrar .................................................................................................................. 17 1.8.1 Kvalitetskontroll av RAScan Complete Kit CE IVD .................................................................................. 17 1.8.2 Användning av kontrollplasmid‐DNA ..................................................................................................... 18 1.9 komponenter ............................................................................................................................. 19 1.9.1 RAScan Kits ............................................................................................................................................. 19 1.9.2 Antal reaktioner per kit .......................................................................................................................... 20 1.10 Reagensberedning ................................................................................................................. 20 1.11 Förvaring och hållbarhet........................................................................................................ 20 1.12 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser ................................................................ 20 1.13 Varningar och försiktighetsåtgärder .................................................................................... 21 1.14 Primär provinsamling, hantering och förvaring .................................................................. 21 1.15 Prestationsegenskaper .......................................................................................................... 21 1.15.1 LOD för mutationer med SURVEYOR med RAScan Combination Kit .................................................... 21 1.15.2 Sekvensbekräftelse .............................................................................................................................. 22 1.15.3 Analysprocessens begränsningar ......................................................................................................... 22 Kapitel 2 Allmänna PCR-villkor för RAScan ......................................................... 23 2.1 Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll .................................................................... 23 2.2 Kvalitetskontroll av PCR-produkter ........................................................................................ 23 Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning för RAScan .... 24 3.1 SURVEYOR Nuclease-nedbrytning ......................................................................................... 24 3.2 Storleksfragmentering ............................................................................................................. 25 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 3 Innehållsförteckning Kapitel 4. Universella sekvenseringsreaktioner för RAScan Kits .......................... 25 Kapitel 5 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar med mikrofluidisk kapillärelektrofores ................................................................... 25 5.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip-instrument ............................................ 25 5.2 RAScan bestämningsmetod .................................................................................................... 26 5.3 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata ....................................................... 26 Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon 2 Kit ............................. 26 6.1 INLEDANDE inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem............ 26 6.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 26 6.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 26 Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS exoner 3 och 4 Kit................. 28 7.1 Inledande inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem .......... 28 7.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 28 7.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 28 Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS exoner 2, 3 och 4 Kit ............ 31 8.1 Inledande inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem .......... 31 8.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 31 8.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 31 Kapitel 9 Stegvisa instruktioner för RAScan Complete Kit .................................... 34 9.1 Inledande inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem .......... 34 9.2 Att tänka på avseende templat ................................................................................................ 34 9.3 Amplifieringsprotokoll ............................................................................................................. 34 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores............................................................................. 36 10.1 Analys av resultat ................................................................................................................... 36 10.2 Granskning av resultat ........................................................................................................... 36 10.3 Tolkning av resultat ................................................................................................................ 41 Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits ....................................................... 48 11.1 Platta, arrangemang 1 ............................................................................................................ 48 11.2 Platta, arrangemang 2 ............................................................................................................ 48 11.3 Kontroll-DNA-stämplar ........................................................................................................... 49 Kapitel 12 Referenser för RAScan Kits................................................................. 50 DEL II ACE™ Kits................................................................................................ 51 Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion ............................................................................................... 53 1.1 Avsedd användning av ACE Kits ............................................................................................ 53 1.2 Indikationer för ACE Kits ......................................................................................................... 53 1.3 Beställningsinformation........................................................................................................... 54 1.4 Härledning av kittets kontrollsubstanser ............................................................................... 54 1.5 ACE Kit-komponenter .............................................................................................................. 54 1.6 Antal prover som kan testas med ett ACE-kit........................................................................ 55 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 4 Innehållsförteckning 1.7 Övrig nödvändig utrustning och reagenser som krävs för ACE Kits ................................ 55 1.8 Reagensberedning för ACE Kits ............................................................................................. 55 1.9 Förvaring och hållbarhet efter första användningen av ACE Kits....................................... 55 1.10 Varningar och försiktighetsåtgärder för ACE Kits .............................................................. 55 1.11 Förberedande provtagning, hantering och förvaring av ACE Kits .................................... 56 1.12 Somatisk mutationsdetektion med ACE - en översikt ........................................................ 57 1.13 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar med mikrofluidisk kapillärelektrofores ................................................................................................. 57 1.13.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip‐instrument ............................................................. 57 1.13.2 Procedur för mutationsbestämning med ACE Kit ................................................................................ 57 1.14 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata ..................................................... 58 Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ............................................................ 58 2.1 Indikationer för användning av ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD .......................................... 58 2.2 Principer för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ......................................................................... 58 2.3 Den allelspecifika PCR Primer-analys som används i ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD .... 59 2.4 Stegvisa instruktioner för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD................................................... 60 2.4.1 Att tänka på avseende templat .............................................................................................................. 60 2.4.2 Allelspecifikt PCR‐protokoll för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ............................................................... 60 2.4.3 Termocyklerprogram för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ......................................................................... 62 2.5 Användning av BRAF kontrollplasmid-DNA för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD............... 62 2.6 Storleksfraktionering för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD .................................................... 62 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE ..................................................... 63 3.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD ........................... 63 3.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD .......................................................... 64 3.3 Amplikonstorleksanalysen som används i ACE Kit for EGFR Exon 19 .............................. 65 3.4 Den allelspecifika analysen som används i ACE Kit för EGFR Exon 21 ............................. 66 3.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD ...................................... 67 3.5.1 Att tänka på avseende templat .............................................................................................................. 67 3.5.2 Allelspecifikt och storleksbaserat PCR‐protokoll för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 ............................ 67 3.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR‐protokoll ............................................................................ 69 3.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA .......................................................................... 70 3.7 Storleksfragmentering ............................................................................................................. 70 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD .............................................. 70 4.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD ........................... 70 4.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD .......................................................... 71 4.3 G719 allelspecifik analys som används i ACE Kit för EGFR Exon 18 and 20 CE IVD ....... 72 4.4 T790M allelspecifik analys som används i ACE Kit EGFR Exon 18 and 20 CE IVD ........... 73 4.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD ...................................... 74 4.5.1 Att tänka på avseende templat .............................................................................................................. 74 4.5.2 Allelspecifikt och storleksbaserat PCR‐protokoll för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD ................. 74 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 5 Innehållsförteckning 4.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR‐protokoll ............................................................................ 76 4.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA .......................................................................... 76 4.7 Storleksfragmentering ............................................................................................................. 77 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument .............................................................................................. 77 5.1 Analys av resultat ..................................................................................................................... 77 5.2 Granskning av resultat ............................................................................................................. 77 5.3 Tolkning av elektroferogramresultat ...................................................................................... 79 Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser ................................................. 85 Kapitel 7 Referenser för ACE Kits ........................................................................ 86 Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analyser ............................................. 87 Bilaga B – Felsökningsguide ................................................................................ 88 Problem 1 — RAScan och ACE Kits Låg PCR-avkastning eller ingen PCR-produkt vid analys på agarosgel eller på mikrofluidiskt kapillärelektroforesinstrument ............................ 88 Problem 2 — RAScan Kits Flera PCR-produkter vid analys på agarosgel ............................... 89 Problem 3 — RAScan Kits: Inga klyvningsprodukter observeras vid analysen efter behandling av heteroduplex med SURVEYOR Nuclease ........................................................... 90 Problem 4 — RAScan Kits: Höga bakgrundsstörningar efter behandling med SURVEYOR Nuclease .......................................................................................................................................... 91 Problem 5 — ACE Kits: Extra toppar på elektroferogrammet på grund av allelspecifik primning........................................................................................................................................... 92 Problem 6 — RAScan Kits: SURVEYOR Nuclease-nedbrytningstoppar i negativa kontroller ......................................................................................................................................... 92 Problem 7 – RAScan Kits: Misslyckade SURVEYOR Nuclease-resultat ................................... 93 Problem 8 — ACE Kits: Misslyckade resultat .............................................................................. 93 Problem 9 — RAScan och ACE Kits: Oväntade toppar i elektroferogrammet ......................... 94 Problem 10 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller (mikrokapillär elektrofores) .................................................................................................................................... 95 Problem 11 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller (sekvensering) ..... 96 Problem 12 — RAScan och ACE Kits: Mikrofluidisk kapillärelektrofores, t.ex. Caliper LabChip............................................................................................................................................ 97 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 6 Tillverkare: RAScan och ACE Kits Tillverkare: RAScan och ACE Kits Tillverkare M Transgenomic, Inc. 12325 Emmet Street, Omaha, NE 68164, USA Tel +1-402-452-5400 EGrepresentant P Transgenomic Limited 40 Watt Road, Hillington Park, Glasgow G52 4RY, UK Tel +44-141-892-8800 Ansvarsfriskrivning för översättning Transgenomic, Inc. har vidtagit alla åtgärder för att säkerställa att denna översättning är korrekt. Om du undrar över någon information i denna översatta version av handboken bör du läsa i den engelska versionen: Instructions for Use of Transgenomic’s Kits For the Detection of Mutations Using Microfluidic Capillary Electrophoresis – 482504(EN) http://world.Transgenomic.com/files/literature/482504-EN.pdf och/eller kontakta Transgenomic på support @transgenomic.com. Licenser, varumärken och upphovsrätt SURVEYOR Nuclease: Denna produkt tillverkas enligt en exklusiv licens för amerikanska patent 6,699,980, 6,391,557, 5,869,245, deras motsvarigheter i andra länder samt andra sökta patent. Användning av SURVEYOR Nuclease kräver licens från Transgenomic. Akademiska, ideella och vinstdrivande organisationer har begränsad rätt att använda SURVEYOR Nuclease för forskning genom inköp av denna produkt. Återförsäljning eller andra tillämpningar är strängt förbjudna. Var vänlig kontakta Transgenomic för mer information. DNA Polymerase: Användning av denna produkt täcks av ett eller flera av följande amerikanska patent och motsvarande upphovsrätter utanför USA:, 5,789,224, 5,618,711, 6,127,155 samt patentanspråk utanför USA som motsvarar US Patent No. 4,889,818. Köp av denna produkt inkluderar en begränsad, icke-överlåtbar immunitet mot skadeståndsanspråk för intrång i ovanstående patent endast för användning av denna produkt för köparens egna interna forskning. Inga rättigheter enligt något annat patentanspråk (t.ex. den patenterade 5' Nuclease-processen i de amerikanska patenten 5,210,015 och 5,487,972), ingen rätt att utföra någon patenterad metod och ingen rätt att utföra kommersiella tjänster på något sätt, inklusive bland annat att rapportera resultaten av köparens aktiviteter mot avgift eller annan kommersiell ersättning, medges, vare sig uttryckligen eller underförstått eller på grund av förverkande. Denna produkt är endast avsedd för forskning. Diagnostisk användning under Roches patent kräver en separat licens från Roche. Ytterligare information om köp av licenser kan erhållas från Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA. Transgenomic och SURVEYOR är registrerade varumärken och spirallogotypen, Advancing Personalized Medicine, ACE samt Rascan är varumärken som tillhör Transgenomic, Inc. Alla övriga varumärken tillhör sina respektive innehavare. © 2013 Transgenomic, Inc. Med ensamrätt. Tryckt i USA. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 7 Kontaktuppgifter Kontaktuppgifter Huvudkontor Europa Transgenomic, Inc. Transgenomic Limited 12325 Emmet Street 40 Watt Road Omaha, Hillington Park, Hillington Nebraska 68164 Glasgow G52 4RY USA Storbritannien Tel: (888) 233-9283* eller +1 (402) 452-5400 Tel: +44 141 892 8800 Fax: +1 (402) 452-5401 Fax: +44 141 883 5967 E-post: [email protected] E-post: [email protected] *Endast i Nordamerika www.Transgenomic.com Dokumentnr. 482504(SV) rev-02 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 8 DEL I RAScan Kits DEL I RAScan Kits Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 9 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.1 Avsedd användning Endast för professionellt bruk. Transgenomics RAScan Kits CE IVD är en in vitro diagnostisk analys som upptäcker somatiska mutationer i exoner 2, 3 och 4 i KRAS- och NRAS-generna. Dessa potentiella mutationer påvisas av SURVEYOR® Nuclease-klyvningstoppar och inkluderar de mutationer som har känd klinisk signifikans. Dessa kit är utformade för användning i ett kliniskt diagnostiskt laboratorium av utbildad personal som testar DNA som utvunnits ur formalinfixerad paraffininbäddad vävnad. Dessa bruksanvisningar kan hämtas på http://world.transgenomic.com/files/literature/482504SV.pdf. 1.2 Indikationer Kliniker kan använda RAScan Kits CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem såsom Caliper LabChip® MultiDX för att underlätta fastställande av om patienters kolorektala cancertumörer kanske inte svarar på anti-EGFR-behandling såsom panitumumab. RAScan Kits CE IVD får inte användas för diagnos av kolorektal cancer eller någon annan form av cancer. RAScan Kits CE IVD är analyser som detekterar förekomsten av potentiella somatiska mutationer i exoner 2, 3 och 4 hos KRAS- och/eller NRAS-generna, men som inte bekräftar mutationens sekvensidentitet. För att bestämma exakt vilken mutation som detekteras krävs ytterligare analys, t.ex. DNA-sekvensering. Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med RAScan Kits CE IVD bör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med kolorektal cancer. Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelelektroforessystem för att identifiera prover som är positiva för en KRAS- eller NRAS-mutation med dessa kit endast bör utgöra en vägledning och att alla mutationer måste bekräftas genom ytterligare analys, t.ex. DNA-sekvensering. 1.3 Beställningsinformation Produktnum mer Produktnamn Storlek RAScan Kits 713120 RAScan™ Kit KRAS Exon 2 CE IVD 100 reaktioner 713130 RAScan™ Kit KRAS Exons 3 & 4 CE IVD 100 reaktioner 713140 RAScan™ Kit NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD 100 reaktioner 713110 RAScan™ Complete Kit CE IVD 230 reaktioner Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 10 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.4 Principer för RAScan Kits CE IVD 1.4.1 KRAS och NRAS KRAS och NRAS ingår i genfamiljen RAS, vilken kodar för proteiner som är involverade i att sända signaler inuti cellerna. När Ras-proteiner "slås på" av inkommande signaler, aktiveras andra celler som är involverade i tillväxt, differentiering och överlevnad av celler. Mutationer i KRAS, NRAS och andra relaterade gener kan leda till att Ras-proteiner blir permanent aktiverade, vilket leder till överaktiv signalering även vid avsaknad av inkommande signaler och detta kan leda till sådan okontrollerad cellförökning som är typisk för cancer. Mutationer som aktiverar Ras-proteiner permanent återfinns i ~25% av tumörer hos människor och i upp till 90% vid cancerformer. RAScan Kits är analyser för detektion av alla sekvensförändringar samt ändringar i form av tillägg/deletioner i exoner 2, 3 och/eller 4 hos KRAS- och NRAS-generna. Positiva kontroller tillhandahålls i detta kit för mutationer i kodon 12, 61, 117 och 146 i KRAS-genen och kodon 12, 61 och 146 i NRAS-genen. Dessa kit använder Transgenomics patentskyddade SURVEYOR Nuclease-teknik och tillhandahåller, i samverkan med mikrofluidisk kapillärelektrofores, en enkel och känslig detektion av potentiella mutationer. De kan detektera en blandning av 5-10% muterat DNA i en bakgrund av ej muterat DNA. Kontrollstudier har påvisat extremt hög överensstämmelse i väldefinierade prover med kolorektal cancer. På grund av att dessa analyser har en hög känslighet i förhållande till Sanger-sekvensering, rekommenderas att laboratoriets installation är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A– Laboratorieinstallation för PCR-analyser. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 11 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.5 Analysprocedur 1.5.1 Somatisk mutationsdetektion med RAScan Kits - en översikt Detektion och bekräftelse av mutationer med SURVEYOR Nuclease innefattar följande figur: Figur 1. RAScan förhandsscreening i tre enkla steg Steg 1: PCR‐amplifiera prov‐DNA Steg 2: SURVEYOR Nuclease‐klyvning Steg 3: Storleksbaserad analys med mikrofluidisk kapillärelektrofores Steg 1 - Förbered PCR-amplikoner från muterat (test) och normalt (referens) DNA, och fortsätt efter den sista PCR-amplifieringscykeln med att smälta alla dubbla strängar och därefter långsamt låta dem svalna för optimal uppkomst av hetero- och homoduplexer (heteroduplexer uppstår när en sträng i en Wild-Type-sekvens härdas med en sträng av en muterad sekvens). Steg 2 – Behandla en del av den härdade heteroduplex-/homoduplex-blandningen med SURVEYOR Nuclease. SURVEYOR Nuclease kommer att skära av båda strängarna med heteroduplex DNA och bilda DNA-fragment. Kontrollen Wild-Type DNA, som behandlats på samma sätt, fungerar som bakgrundskontroll. Steg 3 - Analysera DNA-fragmenten med ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. Formeringen av nya kluvna produkter, till följd av förekomsten av en eller flera avvikelser, påvisas genom förekomsten av ytterligare elektroferogramtoppar. Migrationstiden för de kluvna produkterna anger storleken på fragmenten och därmed avvikelsens eller avvikelsernas ungefärliga placering. 1.5.2 SURVEYOR Nuclease Transgenomics SURVEYOR Nuclease är en avvikelsespecifik (mismatch-specific) växtbaserad DNA-endonukleas som kan söka efter kända och okända mutationer och polymorfismer i heteroduplex DNA8. Enzymet klyver DNA med hög precision på ställen med avvikelser i basen och andra förändringar. Denna DNA-endonukleas klipper av båda strängarna på en DNA-heteroduplex på 3’-sidan av det avvikande stället. Tillägg/deletioner och bassubstituerande avvikelser identifieras men klyvningens effektivitet varierar beroende på sekvensen på avvikelsen. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 12 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD Figur 2: Verkningssätt för SURVEYOR Nuclease. Endonukleasen känner igen en avvikelse och klyver på 3’-sidan på varje bas i avvikelsen. Detta klyver den dubbla DNA-strängen och lämnar kvar ett 3’-överhäng av ett enda baspar. SURVEYOR Nuclease har använts i många olika sammanhang för att korrekt detektera en rad mutationer och polymorfismer i gener. Det bör noteras att SURVEYOR Nuclease har använts för att bekräfta förekomsten av kända mutationer i ett antal gener som associeras med njurcancer, lungcancer, cancer i huvud och nacke, leukemi, endometriecancer och för att förutsäga resultatet av strålbehandling9,10,11. RAScan Kits CE IVD har utformats för att klyva avvikelser i KRAS och NRAS exoner 2, 3 och/eller 4 för efterföljande analys med en mikrofluidisk kapillärelektrofores, t.ex. Caliper LabChip MultiDX. Observera följande: Om ett prov är 100% muterat DNA, kan inga heteroduplex bildas och provet kommer att visas som "Wild-Type". Biopsiprover från tumörer kommer dock att innehålla Wild-Type-celler på grund av tumörheterogenicitet och/eller kontamination av normala vävnader; notera att prover med 5% och 95% muterat DNA kommer att ha identiska elektroferogram. Endast den DNA-polymeras som tillhandahålls med detta kit får användas för denna analys. Följ de specifika anvisningarna i laboratoriets Bruksanvisning till mikrofluidisk kapillärelektrofores. För att framgångsrikt använda dessa kit rekommenderar vi att du läser igenom den här handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet Användning av kontroll-DNA-plasmider. Om du har ytterligare frågor eller behöver hjälp kan du kontakta (888) 233-9283 (endast Nordamerika), +1 (402) 452-5400 eller +44 (0) 141 892 8800 (Europa) och begära "KRAS- och NRAS-support". Alternativt kan du mejla oss på: [email protected]. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 13 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.6 Att tänka på avseende arbetsflöde I allmänhet bör bearbetning av alla prov utföras från början till slut enligt beskrivningen i den här bruksanvisningen. Om bearbetningen av ett prov stoppas innan alla steg är klara, ska DNA förvaras i -20 °C vid angivna punkter. Man bör dock undvika att utsätta ett fruset prov för upprepad upptining och förvaring (-18 till -25 °C) av PCR-amplifierad DNA eller SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter under längre perioder (>1 vecka). Analys av prover bör följa nedan illustrerade arbetsflöde: Skrapa vävnad 1 DNAisolering och PCR 2 Gelelektrofores 3 Ange Robust/Svag PCR 4 SURVEYOR Nuclease och kapillärelektrofores RAScan Misslyckades 5 RAScan Positiv RAScan Negativ 7 6 Ingen detekterad avvikelse Sekvensbekräftelse 8 Sekvenskvalitet misslyckades Sekvenskvalitet godkänd 9 Mutationer i KRAS eller NRAS kodon G12, G13, A59, Q61, K117 or A146 Ingen detekterad avvikelse Figur 3. Arbetsflöde för RAScan Kit-analys Anmärkningar till figur 3 1. Isolera DNA från FFPE med vedertagen laboratorieteknik. 2. Utför PCR och kontrollera DNA-kvaliteten genom gelelektrofores med användning av en s.k. DNA-ladder (medföljer ej). 3. Registrera om PCR-bandet är robust (cirka ≥40 ng/µl) eller svagt (cirka <20 ng/µl). Om det finns flera PCR-band ska färsk genomisk DNA beredas från FFPE och analysen upprepas enligt illustration i figur 3. 4. Gå vidare till SURVEYOR Nuclease-behandling följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för prover som angetts som antingen robust PCR eller svag PCR efter PCR-amplifiering. Observera ett det vid en svag PCR-bestämning kan finnas otillräcklig DNA för att få meningsfulla resultat på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem men det kan finnas tillräckligt med DNA för sekvensering. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 14 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 5. Se Bilaga B – Felsökningsguide för exempel på misslyckade RAScan-resultat. Alla prover med ett misslyckat RAScan-resultat bör köras om antingen genom att: a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomisk DNA kvar b. extrahera DNA på nytt från FFPE; detta bör vara andrahandsalternativet eftersom det som regel inte är önskvärt att skära ytterligare ett FFPE-block. c. Om en annan sektion eller block används bör hela analysen upprepas eftersom nedbrytningsskillnader kan bero på tumörheterogenicitet. 6. Om det inte finns några synliga klyvningstoppar ska ett negativt RAScan-resultat registreras, d.v.s. NVD = Ingen detekterad avvikelse. 7. Om ett prov visar SURVEYOR Nuclease-klyvningsprodukter (motsvarar inte relevant WildType-kontroll), måste det skickas för sekvensbekräftelse. 8. Om sekvensbekräftelseanalysen inte godkänns, ska man antingen: a. upprepa PCR om det finns tillräckligt med genomiskt DNA kvar b. extrahera DNA på nytt från FFPE; detta bör vara andrahandsalternativet eftersom det som regel inte är önskvärt att skära ytterligare snitt från ett FFPE-block. 9. Om sekvensbekräftelsen är godtagbar betyder resultatet antingen: a. Wild-Type-sekvens, d.v.s. ingen avvikelse detekterad (NVD); eller b. Avvikelse detekterad. Om sekvensbekräftelsen visar någon basförändring som leder till aminosyraförändring vid KRAS eller NRAS: i. kodon 12 ii. kodon 13 iii. kodon 59 iv. kodon 61 v. kodon 117; eller vi. kodon 146 bedöm som positiv för KRAS- eller NRAS-mutation. Observera följande: Det är möjligt att ha en positiv RAScan-bestämning som också ger resultatet "Ingen avvikelse detekterad" vid ett sekvensbekräftelsetest. Detektionsnivån (LOD) för SURVEYOR Nuclease på mikrofluidiska kapillärelektroforessystem kan vara så låg som 2% mutation i 98% Wild-Type-DNA för vissa mutationer, medan LOD för sekvensering är cirka 10-25% mutation i 90-75% Wild-Type-DNA. Om ett prov är 100% muterat DNA, kan inga heteroduplex bildas och provet kommer att visas som "Wild-Type". Tumörbiopsiprover kommer dock att innehålla Wild-Type-celler på grund av tumörheterogenicitet och/eller kontaminerande normalvävnad. Prover med 5% och 95% muterat DNA kommer att ha identiska elektroferogram. Positiva RAScan-resultat kan bero på andra basförändringar än de som har befunnits vara KRAS- eller NRAS-aktiverande. Dessa mutationer är sällsynta och måste bekräftas av en annan metod, t.ex. DNA-sekvensering, för att fastställa om ett positivt RAScanresultat är en KRAS-eller NRAS-aktiverande mutation eller ej. Den formalinfixationsprocess som används vid beredning av FFPE-tumörbiopsiprover kan orsaka deaminering av cytosin. Denna deaminering omvandlar cytosin till uracil. Polymerasen "läser" denna uracil som tymin och införlivar adenin i de kopierade strängarna. Detta kommer sedan att se ut som en mutation där den normala G nu har bytts ut mot A som orsakar en G:C- till A:T-mutation. Dessa är artefaktmutationer som uppstått på grund av fixationsprocessen och inte äkta somatiska mutationer. Detta förekommer sällan, men om de kopieras tidigt under PCR-cykeln kommer de att "se ut som" mutationer. De upprepas inte när PCR-analysen upprepas. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 15 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD Exempel på potentiella cytosindeamineringsmutationer i KRAS som skulle kunna beaktas vid beslut om patientvård är: - Kodon 12: GGT> AGT (G12S) eller GAT (G12D) - Kodon 13: GGC> AGC (G13S), GAC (G13D) eller GGT (G13G, en tyst mutation) - Kodon 146: GCA>ACA (A146T) Exempel på potentiella cytosindeamineringsmutationer i NRAS som skulle kunna beaktas vid beslut om patientvård är: - Kodon 12: GGT> AGT (G12S) eller GAT (G12D) - Kodon 13: GGT> AGT (G13S), GAT (G13D) eller GGC (G13G, en tyst mutation) - Kodon 146: GCC>ACC (A146T) Därför rekommenderas att sådana mutationer bekräftas med duplikatanalys av samma genomiska DNA eller att alla prover omfattas av duplikatanalys från analysens början. 1.6.1 Analys av patientprover med RAScan Kits RAScan Kits CE IVD bör endast användas i samband med det arbetsflöde som visas nedan. Arbetsflöde Patientprov Test KRAS Test KRAS Test NRAS Exon 2 Exoner 3 och 4 Exoner 2, 3 och 4 Test KRAS och NRAS Rapportera resultat Figur 4: Arbetsflöde med RAScan Kits för screening av KRAS och/eller NRAS För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS exoner 2-4, se Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 16 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.7 Härledning av kittets kontrollsubstanser De kontrollsubstanser som tillhandahålls i detta kit är plasmida kloner av KRAS och NRAS exoner 2-, 3- och 4-sekvenser. Alla kloner har sekvenserats för att verifiera sekvensens överensstämmelse genom jämförelse med NCBI-referenssekvenser: NG_007524.1 (KRAS) och NG_007572 (NRAS). Wild-Type-kontroller för KRAS och NRAS exoner 2, 3 och 4 finns i en enda plasmid som har linjäriserats för att ge upphov till DNA-fragment av cirka 200-300 bp amplifierbar Wild-Type-sekvens. Mutationskontrollerna KRAS och NRAS Mutants, Exons 2, 3 och 4 finns i en enstaka plasmid som också innehåller respektive Wild-Type-sekvens för den exon som är av intresse. Vidare linjäriseras denna plasmid, vilket ger samma 200-300 bp-fragment som kommer att amplifieras som en 50:50-blandning av muterat till Wild-Type. Alla kontroller har en genetisk "stämpel" och restriktionsenzympunkter. Se Kapitel 11.3 Kontrollernas DNA-stämplar; dessa är variationer av KRAS eller NRAS Wild-Type-sekvenser i en region som inte förväntas ha mutationer och som kan användas för att felsöka provkontamination av mutationskontroller. Tillsats av restriktionsenzympunkter resulterar i positiva och Wild-Type-kontroller bestående av huvudsakligen fragmenterad plasmid och inte dubbelsträngat plasmid-DNA. Se Bilaga B - Felsökningsguide, problem 5, för ett exempel på DNA-sekvenserande elektroferogram som visar kontaminering av sekvensen med den "stämpel" som finns i kitkontrollerna. "KRAS- och NRAS Wild-Type Control"-sekvenser konstruerades genom syntes och kloning till en vektor av exoner 2, 3 och 4 av KRAS och NRAS med användning av NCBI-referenssekvenser NG_007524.1 (KRAS) och NG_007572 (NRAS). Restriktionsenzympunkten vid 5' och 3' för varje kloningsregion. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen jämfört med referenssekvensen var de förändrade baserna vid den "stämplade" regionen (Kapitel 11.3 Kontroll-DNA- stämplar). "KRAS and NRAS Mutant Control"-sekvenser konstruerades genom syntes och kloning av exoner 2, 3 och 4 avKRAS och NRAS Wild-Type- och Mutant-sekvenser för varje amplikon till en vektor med användning av NCBI-referenssekvenser NG_007524.1 (KRAS) och NG_007572 (NRAS). Wild-Type kontrolldelarna av sekvenserna var desamma som de som användes i KRAS och NRAS Control Wild-Type-plasmiden. De muterade kontrollsekvenserna är desamma som Wild-Type-sekvenserna med undantag av en mutation vid relevant kodon. DNA-sekvensering bekräftade att den enda förändringen jämfört med referenssekvensen var de förändrade baserna vid den "stämplade" regionen beträffande muterade kontroller (Kapitel 11.3 Kontroll-DNAstämplar). 1.8 Kontrollparametrar 1.8.1 Kvalitetskontroll av RAScan Complete Kit CE IVD Kontroll-DNA-plasmider ingår i detta kit för att tillhandahålla kvalitetskontroller vid specifika steg i analysprocessen. För amplifieringsprotokollet, erbjuder dessa kontroller ett sätt att säkerställa att Master Mix-blandningarna är korrekt preparerade och att amplifieringen fungerar korrekt. Kontrollsubstanser utan templat (där vatten tillförs istället för DNA-templat) krävs också för att kontrollera förekomsten av eventuell kontamination av kitkomponenter från ett ovidkommande DNA-templat. I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från dessa kontrollplasmid-DNA en effektiv kontroll att förhållandena för klyvningsreaktion (beredning av SURVEYOR Nuclease Digest Master Mix-blandning och inkuberingsförhållanden) var tillfredsställande. Vid analysstadiet efter fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, av SURVEYOR Nuclease-nedbrutna Wild Type-kontroller erhålls vägledningen om hur ett prov utan mutation kommer att se ut i varje amplikon och de muterade kontrollerna ger vägledning om var klyvningsprodukternas toppar motsvarande dessa mutationer i KRAS och NRAS exoner 2, 3 och 4, kommer att elueras, även vid låga nivåer (se figur 5-16). Klyvningsprodukttoppar som motsvarar andra mutationer i KRAS eller NRAS exoner 2, 3 och 4 kan elueras i något avvikande positioner. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 17 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD Om PCR-amplikonerna inte motsvarar resultaten som beskrivs i 2.2 Kvalitetskontroll av PCRprodukter, se Bilaga B - Felsökningsguide eller kontakta teknisk support ([email protected]) innan du går vidare med ytterligare provanalyssteg. 1.8.2 Användning av kontrollplasmid-DNA Kitet levereras med två kontroll-DNA som anges i tabell 1.9 Komponenter. Dessa kontroll-DNA klyvs med ett restriktionsenzym för att fragmentera plasmid-DNA. Wild-Typekontrollen består av en plasmid som innehåller alla KRAS och NRAS Wild-Type-kontrollsekvenser. Muterad kontroll består av en plasmid som innehåller en blandning av alla KRAS och NRAS WildType-kontrollsekvenser, samt en muterad sekvens i var och en av KRAS exoner 2, 3 och 4 och även NRAS exoner 2, 3 och 4. Dessa muterade sekvenser skiljer sig från Wild-Type vid ett enstaka baspar inom varje exon. De nedbrutna kontrollerna tillhandahålls i separata flaskor, var och en med en koncentration på 105 kopior/µl. KRAS och NRAS exoner 2, 3 och 4 Forward och Reverse PCR-primrar som krävs för PCRamplifiering tillhandahålls separat i kittets lådor. Följ anvisningarna för varje kit för användning av dessa kontroller. VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR EXPERIMENTEN MED ENBART KONTROLLSUBSTANSERNA INNAN TESTNING GÖRS PÅ GENOMISKA PROVER Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 18 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.9 komponenter RAScan Kits levereras som en enda sats innehållande följande komponenter. 1.9.1 RAScan Kits Komponent hNummer Färg på rörets lock RAScan KRAS Exon 2 RAScan KRAS Exons 3 och 4 RAScan NRAS Exon 2, 3 och 4 RAScan Complete Lila Svart 2 1 2 1 2 1 5 3 Rosa 1 1 1 3 Amber Rött 1 1 1 1 1 1 1 2 Gult 1 1 1 1 Grönt 1 1 1 1 Låda med PCR-kontroller och SURVEYOR nedbrytningskomponenter 710160 710161 708049 710167 710164 710430 710431 ® SURVEYOR Nuclease W ® SURVEYOR Enhancer W2 ® SURVEYOR Enhancer Cofactor 0.15 M MgCl2 Solution ® SURVEYOR Stop Solution V CRC K- & NRAS Wild-Type a CRC K- & NRAS Mutants ab # Rör i kitet Låda med PCR-komponenter och kontroller 703310 DNA Polymerase Genomskinligt 1 1 1 3 703312 DNA Polymerase Genomskinligt - - 1 - 703315 DNA Polymerase 10x PCR Buffer Genomskinligt 1 1 1 2 703065 dNTPs (10 mM) Genomskinligt 1 1 1 - 705020 dNTPs (10 mM) Genomskinligt - - - 2 710155F KRAS Primer: Exon 2 Forward Blått 3 - - 1 710155R KRAS Primer: Exon 2 Reverse Blått 3 - - 1 710157F KRAS Primer: Exon 3 Forward 710157R 710154F 710154R 710156F 710156R 710452F 710452R 710453F 710453R 710454F 710454R 710153F 710153R KRAS Primer: Exon 3 Reverse KRAS Primer: Exon 4A Forward KRAS Primer: Exon 4A Reverse KRAS Primer: Exon 4B Forward KRAS Primer: Exon 4B Reverse NRAS Primer Exon 2 Forward NRAS Primer Exon 2 Reverse NRAS Primer Exon 3 Forward NRAS Primer Exon 3 Reverse NRAS Primer Exon 4 Forward NRAS Primer Exon 4 Reverse Universal Sequencing Primer 1 Universal Sequencing Primer 2 Blått - 1 - 1 Blått Blått Blått Blått Blått Blått Blått Blått Blått Blått Blått Orange Orange 2 2 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 19 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.9.2 Antal reaktioner per kit RAScan Kits är utformade för att medge testning av följande antal reaktioner: Antal reaktioner Antal kontroller/sats RAScan KRAS Exon 2 CE IVD 100 3 RAScan KRAS Exons 3 & 4 CE IVD 100 9 RAScan NRAS Exons 2, 3 & 4 CE IVD 100 9 RAScan Complete Kit CE IVD 230 21 Kit Det totala antalet prover som kan testas med ett kit beror på hur stora omgångar som testas. Detta beror på att en uppsättning kontrollreaktioner (Wild-Type-kontroll, positiv kontroll och kontroll utan templat) måste inkluderas för varje amplikon som inkluderas på en provplatta. OBS! Om flera plattor körs, måste en uppsättning med de kontroller som anges ovan köras på varje platta. Med en större provsatsstorlek ökar antalet prover som kan testas med ett kit, vilket minskar den genomsnittliga reagenskostnaden per prov. 1.10 Reagensberedning Alla reagenser som ingår i detta kit är användningsklara. En del komponenter behöver tinas upp, och/eller blandas i en vortexblandare eller mikrocentrifug före användning. Reagenser måste kombineras för att skapa Master Mix-blandningar och reaktionsblandningar. Se mer information under ifrågavarande Analysprocedur-kapitel för det RAScan Kit som används. 1.11 Förvaring och hållbarhet Kitterna ska förvaras i temperaturer mellan -18 ºC och -25 °C i en frys med konstant temperatur tills de ska användas. Notera utgångsdatumet för varje kit som tas emot. Använd inte kittet efter passerat utgångsdatum. SURVEYOR nukleasblandning som tillreds i avsnittet 3.1 Nedbrytning med SURVEYOR Nuclease ska användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W avaktiveras med tiden när det förekommer tillsammans med de andra komponenterna i SURVEYOR Nuclease reaktionsblandning. 1.12 Ytterligare nödvändig utrustning och reagenser Ytterligare komponenter och utrustning som krävs för att använda RAScan Kits CE IVD för ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem inkluderar följande: Mikrofluidiskt kapillärelektroforesinstrument, t.ex. Caliper LabChip MultiDX Mikrofluidiska kapillärelektroforesbuffrar och -lösningar Lämpligt DNA-chip för mikrofluidisk kapillärelektrofores (t.ex. DNA1000 för Caliper LabChip MultiDX-instrument) Vatten för molekylärbiologi 0,2 ml-PCR rör, remsor eller platta med 96 brunnar Mikropipetter Pipettspetsar Isbad Vortexblandare Mikrocentrifug Termocykler Agarosgeler och utrustning för agarosgelelektrofores 10% blekmedel eller liknande rengöringsmedel Laboratoriets material, utrustning och rutiner för rengöring av PCR-produkten och för cykling av sekvenseringsreaktioner bör användas. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 20 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.13 Varningar och försiktighetsåtgärder Ingen av reagenserna i dessa kit utgör en hälsorisk i de kvantiteter som förekommer. Transgenomics materialsäkerhetsblad för varje kit - kan hämtas efter behov från http://world.transgenomic.com/files/literature/713000-SV.pdf Det finns inga ämnen i dessa kit med animaliskt eller humant ursprung som innebär en infektionsrisk. Dessa kit får endast användas av personer som har utbildats i korrekta laboratorietekniker. Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och ögonskydd vid arbete med komponenterna i dessa kit. Efter användningen ska komponenterna i varje kit kasseras som sjukvårdsavfall och enligt lokala lagar och föreskrifter. Alikvoter av reagenser som pipetterats från rören i dessa kit är endast avsedda för engångsbruk. Komponenterna i dessa kit har validerats som fortfarande stabila efter 25 upptiningscykler. Använd inte dessa kit om antalet upptiningscykler har överskridits. 1.14 Primär provinsamling, hantering och förvaring RAScan Kits CE IVD har validerats för användning med DNA som utvunnits från formalinfixerade paraffininbäddade (FFPE) kolorektala cancertumörprover. För optimal DNA-extraktion ska vävnaden fixeras i formalin i 14-24 timmar innan den bäddas in i paraffin. Tumörbiopsier är en heterogen blandning av tumörceller och icke-tumörceller. Vidare är själva tumörcellen en heterogen blandning av tumörceller med mutationer och tumörceller utan mutationer. Eftersom dessa somatiska mutationer kanske inte är jämnt fördelade i tumören, kan analysresultaten från olika sektioner i samma tumör skilja sig åt. För att öka möjligheten att upptäcka en mutation, bör DNA från vävnadens tumörregion isoleras genom att endast tumörområdet skrapas från objektglaset med en ny, steril skalpell för varje nytt objektsglas. För framgångsrik användning av dessa kit bör extraherat DNA uppfylla kriterierna i Att tänka på avseende templat. OBS! Extraherade DNA-prover som inte används för omedelbar analys med dessa kit ska förvaras vid -20 ºC till -80 ºC 1.15 Prestationsegenskaper 1.15.1 LOD för mutationer med SURVEYOR med RAScan Combination Kit Validering av RAScan Kits för mikrofluidiska kapillärelektroforessystem med användning av plasmidkloner av alla indicerade mutationer har visat att SURVEYOR Nuclease-toppar kan detekteras i en blandning av 5-10% mutation i en Wild-Type-bakgrund. Observera att topparnas profil för specifika mutationer kan variera beroende på antalet prover som har körts på ett enskilt chip. Automatisk sekvensering av både framåtriktade och bakåtriktade strängar misslyckas ofta med att detektera mutationer vid nivåer under 10% i blandningar med Wild-Type-DNA. Tillsammans med resultaten från SURVEYOR Nuclease är det möjligt att med högre säkerhet tolka 5-10% elektroferogram för mutant sekvensering. Om en provanalys visar ett positivt RAScan-resultat utan någon detekterbar KRAS- eller NRAS-mutation med DNA-sekvensering, rekommenderar vi att resultatet "No Variant Detected" (ingen avvikelse detekterad) registreras. Ytterligare detaljer finns i avsnittet Att tänka på avseende arbetsflödet. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 21 Kapitel 1 RAScan Kits CE IVD 1.15.2 Sekvensbekräftelse Fortsätt med sekvensbekräftelse för alla positiva RAScan-resultat sekvensidentiteten för KRAS eller NRAS exoner 2, 3 eller 4-mutationer. för att fastställa Fortsätt inte med sekvensbekräftelse om RAScan-resultatet var negativt. Provet kan rapporteras som Wild-Type eller NVD (ingen avvikelse detekterad). Universal Sequencing-primrar som inkluderas i detta kit är avsedda för sekvensbekräftelse. Framåtriktad primer är PN 710153F (Universal Sequencing Primer 1) och bakåtriktad primer är PN 710153R (Universal Sequencing Primer 2). 1.15.3 Analysprocessens begränsningar Kontaminerande ämnen som överförs genom extraktion av formalinfixerade paraffininbäddade prover kan inverka negativt på PCR-amplifieringen och nedbrytningsprocessen med SURVEYOR Nuclease. Rutinerna för kvalitetskontroll som beskrivs under Kvalitetskontroll av PCR-produkter säkerställer att extraherat DNA är lämpligt för användning i detta kit. Detta kit har validerats för analys av formalinfixerade paraffininbäddade kolorektala cancertumörprover. Det har inte validerats för diagnostisk användning med vare sig andra typer av cancer eller med färska eller frusna biopsiprover. Läs i Bilaga B - Felsökningsguide för felsökning av onormala resultat och information om faktorer som kan påverka analysen. Försiktighet måste iakttas för att undvika överföring och korskontamination med detta kit. På grund av analysmetodens extrema känslighet, måste försiktighetsåtgärder vidtas vid följande punkter: Se till att alla prover hanteras på ett sådant sätt att korskontamination mellan prover inte kan förekomma Arbeta i en PCR-arbetsstation eller annat lämpligt utrymme där arbetsområdet kan exponeras för UV-ljus innan PCR-amplifieringsreaktionerna förbereds. Använd separat PCR-arbetsstation eller -rum för att öppna proverna efter PCRamplifiering för kvalitetskontroll med gelelektrofores. Förberedelse för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning bör göras i ett separat rum eller en annan PCR-arbetsstation än den där inledande PCR gjordes. Se till att kittets plasmidkontroller hanteras separat från testproverna under alla analysstadier. o Kontrollera att alla lösningar, kontroll utan templat, samt prov-DNA-brunnar är förslutna innan rören med kontrollplasmid-DNA öppnas. o KONTROLLER SKA HANTERAS SIST. Tillsätt kontrollplasmid-DNA till lämpliga rör endast EFTER DET ATT ALLA kontroller utan templat och provbrunnar har förslutits. o När rören med kontroll-DNA har förslutits ska ALLA rör och lock torkas av med DNA-destruerande medel (t.ex. 10% blekmedel) innan de överförs till ett annat område. Obs! Om 10% blekmedel används måste en ny sats blandas varje vecka. Se till att pipettering av prover i plattor med 96 brunnar inte möjliggör provkontamination av intilliggande brunnar på grund av stänk vid blandningen eller på grund av att pipettspetsarna inte bytts ut. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 22 Kapitel 2 Allmänna PCR-villkor för RAScan Kapitel 2 Allmänna PCR-villkor för RAScan 2.1 Termocykelprogram för amplifieringsprotokoll 1. Använd följande termocykelprotokoll för PCR-amplifiering och heteroduplexformering: Inledande denaturering 95 C 5 minuter Touchdown-amplifiering 15 cykler 95 C 30 sekunder 62 C, -0,5 ºC/cykel 30 sekunder 72 C 25 sekunder Amplifiering 30 cykler 95 C 30 sekunder 55 C 30 sekunder 72 C 25 sekunder Sista förlängning 1 cykel 72 C 2 minuter Heteroduplexformering 95 ºC 2 minuter ≤12 C Vänta 2.2 Kvalitetskontroll av PCR-produkter 1. Amplikonernas kvalitet och kvantitet bör kontrolleras med gelelektrofores (eller motsvarande) innan du fortsätter med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning eftersom robust nedbrytning sker vid ≥40 ng/µl. 2. Analysera en alikvot av PCR-produkt tillsammans med flera olika mängder av en 100-bp DNA-ladder. 3. Använd denna ladder till att beräkna koncentrationen av amplifierad DNA. 4. Bara ett enda band >40 ng/µl som motsvarar huvud-PCR-produkten ska synas. 5. Kontrollera att tillsatt DNA-templat höll tillräckligt hög kvalitet om det finns flera band (se Bilaga B – Felsökningsguide). 6. Kontrollera att tillsatt DNA-templat höll tillräckligt hög kvalitet om ingen produkt kan iakttas (se Bilaga B – Felsökningsguide). Om kvaliteten motsvarar specifikationerna, ska du öka volymen på templatet till 4,0 µl per 50 µl reaktion (minska vattenmängden per reaktion till 31,0 µl). 7. Inga PCR-produkter ska synas i kontrollprovet utan templat. Om DNA-produkter kan iakttas med denna kontroll har kontamination antagligen skett. Se Bilaga B – Felsökningsguide. 8. Ange PCR som robust eller svag PCR. a. Robust PCR ska ha ett enda band med minst 40 ng/µl. b. Svag PCR ska ha ett enda band med mindre än 20 ng/µl. c. Fortsätt med SURVEYOR Nuclease-nedbrytning med både robusta och svaga PCRbestämningar. TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till en vecka. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 23 Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning för RAScan Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nucleasenedbrytning för RAScan 3.1 SURVEYOR Nuclease-nedbrytning 1. När prov-PCR har bedömts vara av tillräckligt hög kvalitet och kvantitet, ska nedbrytning med SURVEYOR Nuclease utföras enligt beskrivningen nedan. En provkoncentration om minst 40 ng/ul krävs för optimal nedbrytning med SURVEYOR Nuclease 2. Tina rören med 0,15 M MgCl2 Solution och SURVEYOR Enhancer Cofactor på is. 3. Tillsätt 10,0 µl av varje PCR-amplifierat prov till ett nytt 0,2 ml PCR-rör eller brunn på en platta med 96 brunnar. 4. Om du gör flera prover, bered en ny blandning av 0,15 M MgCl2-lösning, SURVEYOR Enhancer Cofactor, SURVEYOR Enhancer W2 och SURVEYOR Nuclease W (SURVEYOR Nuclease-blandning). Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för Surveyor Nucleasenedbrytning för analys av flera prover. Exemplet nedan har tillräckliga mängder för en Master Mix med 10 prover. Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. Antal SURVEYOR Nuclease-nedbrytningsreaktioner: Volymberäkning: 0,15 M MgCl2-lösning SURVEYOR Enhancer Cofactor (µl) SURVEYOR Enhancer W2 (µl) SURVEYOR Nuclease W (µl) Total volym Master Mix: Tillsätt 5 µl SURVEYOR Nuclease Master Mix till varje PCR-amplifierat prov (µl) Total volym SURVEYOR Nucleasenedbrytningsreaktion: 10 10,0 10,0 10,0 20,0 50,0 10,0 15,0 a. Centrifugera varje reagens före användning. b. Vortexblanda varje reagens försiktigt före pipettering; centrifugera under en kort stund i ~10 sekunder efter varje vortexmoment. c. Tillför följande komponenter för, varje nedbrytning, till ett 0,2 ml PCR (eller större) mikrocentrifugeringsrör. 1,0 µl 0,15 M MgCl2-lösning (PN 710167) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer Cofactor (PN 708049) 1,0 µl SURVEYOR Enhancer W2 (PN 710161) 2,0 µl SURVEYOR Nuclease W (PN 710160) eller tillsätt 5 µl Master Mix som beretts enligt tabellen ovan. 5. Vortexblanda försiktigt Master Mix för SURVEYOR Nuclease i 10 sekunder på låg hastighet. 6. Centrifugera Master Mix för SURVEYOR Nuclease i 10 sekunder på låg hastighet. 7. Placera Master Mix för SURVEYOR Nuclease på is tills den är redo att användas. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 24 Kapitel 3 Allmänna villkor för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning för RAScan Obs! Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning som beretts i steg 7 ska användas omedelbart eftersom SURVEYOR Nuclease W blir inaktivt över tid vid förekomst av de övriga komponenterna i Master Mix för SURVEYOR Nucleasenedbrytning. 8. Pipettera en alikvot om 5,0 µl av Master Mix för SURVEYOR Nuclease-nedbrytning i varje rör eller brunn som innehåller en alikvot om 10,0 µl amplifierad PCR-produkt (se steg 3 ovan). 9. Efter pipetteringen, förslut och centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattan med 96 brunnar i 10 sekunder. 10. Vortex-blanda försiktigt 0,2 ml PCR-rör eller platta med 96 brunnar i 10 sekunder. 11. Centrifugera i 10 sekunder på låg hastighet (detta moment är extra viktigt om nedbrytningen görs i ett instrument utan uppvärmt lock). 12. Inkubera i 42 °C i 30 minuter. 13. Tillsätt 10 µl SURVEYOR Stop Solution (PN 710164) i varje rör eller brunn, förslut och vortexblanda försiktigt (total SURVEYOR Nuclease reaktionsvolym är 25,0 µl). TIPS: SURVEYOR nedbrytningsprodukter kan lagras vid ≤ -20 ºC i upp till en vecka. 3.2 Storleksfragmentering 1. Ladda provnedbrytningsprodukterna i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för fragmentstorleksanalys. 2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och virtuella gelerna för att avgöra vilka prover och amplikoner som har potentiella mutationer och som behöver analyseras med Sanger DNA-sekvensering. Kapitel 4. Universella sekvenseringsreaktioner för RAScan Kits Universal Sequencing Primers (PN 710153F och 710153R) tillhandahålls för användning vid DNAsekvensering av alla prover som amplifierats med tillhandahållna PCR-primrar. De PCRamplikoner som skapades före SURVEYOR Nuclease-nedbrytning ska användas för sekvensering. Det är viktigt att två oberoende granskare analyserar sekvenseringselektroferogrammen. Kapitel 5 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar med mikrofluidisk kapillärelektrofores 5.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip-instrument Caliper LabChip-systemet ställs in, körs och analyseras enligt bruksanvisningen. Tillhörande Caliper LabChip Software används för granskning av data, bearbetning av elektroferogram och för att generera rapporter. Notera att ett positivt RAScan-resultat INTE bekräftar mutationens identitet. Sådana omständigheter som provkvalitet, ovanliga förhållanden vid körningen samt chipets skick kan alla påverka resultatets precision. Vidare kommer mycket sällsynta mutationer i andra kodoner än 12, 13, 61, 117 och 146, t.ex. kodoner 11 och 14 att ge klyvningsprodukter med användning av RAScan. Sekvensbekräftelse krävs för alla KRAS och NRAS exoner 2, 3 eller 4 RAScan-nedbrytningsresultat som visar att en mutation kan förekomma i provet. DNAsekvensering eller en jämförbar metod kan användas för att fastställa identiteten hos en KRAS- eller NRAS-mutation och om mutationen är KRAS- eller NRAS-aktiverande eller ej. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 25 Kapitel 5 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar med mikrofluidisk 5.2 RAScan bestämningsmetod 1. Förbered laboratoriets mikrofluidiska kapillärelektroforessystem enligt anvisningar i tillverkarens bruksanvisning till instrumentet. (Läs även i HT DNA-anvisningarna till 1Kanalysen för Caliper LabChip MultiDX-instrumentet). a. Säkerställ att SURVEYOR nedbrytningsprodukter är i en platta som är godkänd för användning på instrumentet. b. Öppna instrumentets programvara och välj lämpliga kommandon för att starta analysen när chip, reagenser och prover har laddats korrekt i instrumentet. c. Börja körningen när plattan och instrumentet har ställts in och alla parametrar är klara. Utför rengöring och förvaring av materialen enligt beskrivning i tillverkarens anvisningar när körningen är klar. 5.3 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata Se exempel på specifika KRAS- och NRAS-resultat i Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores. Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon 2 Kit 6.1 INLEDANDE inställning/kalibrering av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem Läs i bruksanvisningen till ditt system när SURVEYOR Nuclease-plattan ställs i ordning för analys på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, beträffande korrekt användning och underhåll av instrumentet. Se exempel för specifika KRAS och de nationella regleringsmyndigheterna Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores. 6.2 Att tänka på avseende templat 1. För FFPE-isolerat DNA-templat, använd normala laboratorierutiner för att bedöma kvalitet och kvantitet på extraherat DNA för att se till att det finns tillräckligt templat för PCR. 2. 260/280 absorptionsförhållandet ska vara över 1,80. 3. För att underlätta PCR-inställningen bör den effektiva koncentrationen av templat vara 12,5 ng/µl. Späd vid behov ut DNA-förlagorna med graderat molekylärbiologiskt vatten. 6.3 Amplifieringsprotokoll 1. Ta ut 10 µM-primrar, 10 mM dNTPs och DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) ur frysen och tina på is. 2. Vortexblanda alla komponenter efter upptining (~10 sekunder) så att de blandas noga, centrifugera en kort stund (~10 sekunder) för att tillförsäkra att ingen vätska finns kvar på rörens lock och lägg på is. 3. Förbered Master Mix-blandningarna på is. Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för KRAS Exon 2-reaktioner: Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 26 Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon 2 Kit Master Mix-guide för 2 µl DNA-prover (DNA@12,5 ng/µl) Antal reaktioner (7 prover + 3 kontroller): 10 Volymberäkning: Vattenvolym (µl) DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) dNTPs (µl) Forward Primer (µl) Reverse Primer (µl) DNA Polymerase (µl) Total volym Master Mix 330** 50 40 25 25 10 480,0 **OBS! Användaren bör sträva efter att ha minst 25 ng DNA per 50 µl PCR-reaktion. När de extraheras är DNA-koncentrationerna mindre än 12,5 ng/µl. Öka volymen extraherat DNA proportionerligt för att tillförsäkra 25 ng per reaktion. Minska vidare volymen vatten i Master Mix-blandningarna med samma mängd (upp till 5 µl) för att få 50 µl per reaktion. Alla prover som prepareras med dessa Master Mix-blandningar kommer att behöva extraherat DNA som har spätts ut till ungefär samma lägsta koncentrationsgrad. Vi rekommenderar inte att koncentrationer av extraherat DNA på <5 ng/µl används. 4. I samtliga fall kommer KRAS och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och KRAS och NRAS Mutant Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en av de enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje KRAS-exon 2. (a) För Master Mix (MM-K2), KRAS Exon 2, kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: KRAS Wild-Type Control, KRAS Mutant Control Exon 2 och KRAS Exon 2 kontroll utan templat 1. Obs! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 5. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med vederbörlig provinformation. 6. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning. 7. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till 2,0 ml centrifugeringsrören som är märkta "Master Mix". 8. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-röret. 9. Tillsätt nödvändig mängd 10 mM dNTPs till Master Mix-rören. 10. Tillsätt nödvändig mängd KRAS Exon 2 Forward Primer till Master Mix-röret. 11. Tillsätt nödvändig mängd KRASExon 2 Reverse Primer till respektive Master Mix-rör. 12. Centrifugera DNA Polymerase i ~10 sekunder. 13. Vortexblanda DNA Polymerase i ~10 sekunder. 14. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase och AmpErase till Master Mix-rören. 15. Förslut Master Mix-röret. 16. Vortexblanda Master Mix-röret i ~30 sekunder och centrifugera det därefter i ~10 sekunder före användning. 17. Förvara på is tills det används. 18. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar och byt pipettspets om du använder en pipett med en kanal. Var noga med att undvika spill och stänk mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 27 Kapitel 6 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS Exon 2 Kit 19. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA eller vatten (templat utan kontroll - NTC) till lämpliga brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med med prov-DNA och NTC med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 20. ENDAST EFTER DET ATT STEG 19 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS KONTROLLTEMPLAT-DNA (PN 710430 och 710431) öppnas. Pipettera 2.0 µl av KRAS och NRAS Wild-Type-kontroll (PN 710430) i respektive brunn eller rör för Wild-Typekontroll innan KRAS och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas. När WildType-kontrollerna har förslutits ska KRAS och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och en av brunnarna eller rören för muterade kontroller. Förslut därefter varje brunn eller rör. Genom att tillsätta kitkontrollerna som de sista proverna som läggs till minskar risken för att något prov-DNA kontamineras. Förslut varje brunn med remsor med 8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat i brunnar som inte ligger intill muterade kontroller eller prover. OBS! För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS exoner 2-4, se Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits. 21. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 22. Centrifugera i 1-2 minuter för att tillförsäkra att alla lösningar har samlats i brunnarnas eller rörens botten. Kontrollera att lösningarna är på botten av brunnen eller röret. Upprepa centrifugeringen i annat fall. Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS exoner 3 och 4 Kit 7.1 Inledande inställning/kalibrering kapillärelektroforessystem av mikrofluidiskt Läs i bruksanvisningen till ditt system när SURVEYOR Nuclease-plattan ställs i ordning för analys på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, beträffande korrekt användning och underhåll av instrumentet. Se exempel för specifika KRAS och de nationella regleringsmyndigheterna Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores. 7.2 Att tänka på avseende templat 1. För FFPE-isolerat DNA-templat, använd normala laboratorierutiner för att bedöma kvalitet och kvantitet på extraherat DNA för att se till att det finns tillräckligt templat för PCR. 2. 260/280 absorptionsförhållandet ska vara över 1,80. 3. För att underlätta PCR-inställningen bör den effektiva koncentrationen av templat vara 12,5 ng/µl. Späd ut DNA-förlagorna med graderat molekylärbiologiskt vatten om så behövs. 7.3 Amplifieringsprotokoll 1. Ta ut 10 µM-primrar, 10 mM dNTPs och DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) ur frysen och tina på is. 2. Vortexblanda alla komponenter efter upptining (~10 sekunder) så att de blandas noga, centrifugera en kort stund (~10 sekunder) för att tillförsäkra att ingen vätska finns kvar på rörens lock och lägg på is. 3. Förbered Master Mix-blandningarna på is. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 28 Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS exoner 3 och 4 Kit Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för var och en av KRAS exon 3-, KRAS exon 4A- och KRAS exon 4b-reaktionerna: Master Mix-guide för 2 µl DNA-prover (DNA@12,5 ng/µl) Antal reaktioner (7 prover + 3 kontroller): 10 Volymberäkning: Vattenvolym (µl) DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) dNTPs (µl) Forward Primer (µl) Reverse Primer (µl) DNA Polymerase (µl) Total volym Master Mix 330** 50 40 25 25 10 480 **OBS! Användaren bör sträva efter att ha minst 25 ng DNA per 50 µl PCR-reaktion. När de extraheras är DNA-koncentrationerna mindre än 12,5 ng/µl. Öka volymen extraherat DNA proportionerligt för att tillförsäkra 25 ng per reaktion. Minska vidare volymen vatten i Master Mix-blandningarna med samma mängd (upp till 5 µl) för att få 50 µl per reaktion. Alla prover som prepareras med dessa Master Mix-blandningar kommer att behöva extraherat DNA som har spätts ut till ungefär samma lägsta koncentrationsgrad. Vi rekommenderar inte att koncentrationer av extraherat DNA på <5 ng/µl används. 4. I samtliga fall kommer KRAS och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och KRAS och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en av de enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje KRAS-exon. a. För Master Mix (MM-K3), KRAS exon 3, kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K- och NRAS Mutants Control Exon 3 och KRAS Exon 3 No Template Control 2. b. För Master Mix (MM-K4A), KRAS Exon 4A kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K-& NRAS Mutants Positive Control Exon 4A och KRAS Exon 4A No Template Control 3. c. För Master Mix (MM-K4B), KRAS Exon 4B kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K-& NRAS Mutants Positive Control Exon 4B och KRAS Exon 4B No Template Control 4. OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 5. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med vederbörlig provinformation. 6. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning. 7. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till 2,0 ml centrifugeringsrören som är märkta "Master Mix". 8. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-rören. 9. Tillsätt nödvändig mängd 10 mM dNTPs till Master Mix-rören. 10. Tillsätt nödvändig mängd KRAS Forward Primer till respektive Master Mix-rör. 11. Tillsätt nödvändig mängd KRAS Reverse Primer till respektive Master Mix-rör. 12. Centrifugera DNA Polymerase i ~10 sekunder. 13. Vortexblanda DNA Polymerase i ~10 sekunder. 14. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase och AmpErase till Master Mix-rören. 15. Förslut Master Mix-rören. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 29 Kapitel 7 Stegvisa instruktioner för RAScan KRAS exoner 3 och 4 Kit 16. Vortexblanda Master Mix-rören i ~30 sekunder och centrifugera därefter i ~10 sekunder före användning. 17. Förvara på is tills det används. 18. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar och byt pipettspets om du använder en pipett med en kanal. Var noga med att undvika spill och stänk mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. 19. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA eller vatten (templat utan kontroll - NTC) till lämpliga brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med prov-DNA och NTC med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml PCRrören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 20. ENDAST EFTER DET ATT STEG 19 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS KONTROLLTEMPLAT-DNA (PN 710430 och 710431) öppnas. Pipettera 2,0 µl av K- och NRAS Wild-Type-kontroll (PN 710430) i respektive brunn eller rör för Wild-Type-kontroll för varje kontroll och förslut varje brunn eller rör innan K- och NRAS Mutant Positive Control (PN 710431) öppnas. När Wild-Type-kontrollerna för alla exoner har förslutits ska K- och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och en av brunnarna eller rören för muterade kontroller för varje exon. Förslut därefter varje brunn eller rör. Genom att tillsätta kitkontrollerna som de sista proverna som läggs till minskar risken för att något prov-DNA kontamineras. Förslut varje brunn med remsor med 8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat i brunnar som inte ligger intill muterade kontroller eller prover. OBS! För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS exoner 2-4, se Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits. 21. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 22. Centrifugera i 1-2 minuter för att tillförsäkra att alla lösningar har samlats i brunnarnas eller rörens botten. Kontrollera att lösningarna är på botten av brunnen eller röret. Upprepa centrifugeringen i annat fall. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 30 Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS exoner 2, 3 och 4 Kit Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS exoner 2, 3 och 4 Kit 8.1 Inledande inställning/kalibrering kapillärelektroforessystem av mikrofluidiskt Läs i bruksanvisningen till ditt system när SURVEYOR Nuclease-plattan ställs i ordning för analys på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, beträffande korrekt användning och underhåll av instrumentet. Se exempel för specifika KRAS och de nationella regleringsmyndigheterna Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores. 8.2 Att tänka på avseende templat 1. För FFPE-isolerat DNA-templat, använd normala laboratorierutiner för att bedöma kvalitet och kvantitet på extraherat DNA för att se till att det finns tillräckligt templat för PCR. 2. 260/280 absorptionsförhållandet ska vara över 1,80. 3. För att underlätta PCR-inställningen bör den effektiva koncentrationen av templat vara 12,5 ng/µl. Späd ut DNA-förlagorna med graderat molekylärbiologiskt vatten om så behövs. 8.3 Amplifieringsprotokoll 1. Ta ut 10 µM-primrar, 10 mM dNTPs och DNA Polymerase 10X PCR Buffer (PN 703315) ur frysen och tina på is. 2. Vortexblanda alla komponenter efter upptining (~10 sekunder) så att de blandas noga, centrifugera en kort stund (~10 sekunder) för att tillförsäkra att ingen vätska finns kvar på rörens lock och lägg på is. 3. Förbered Master Mix-blandningarna på is. Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för var och en av NRAS exon 2-, NRAS exon 3- och NRAS exon 4-reaktionerna: Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 31 Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS exoner 2, 3 och 4 Kit Master Mix-guide för 2 µl DNA-prover (DNA@12,5 ng/µl) Antal reaktioner (7 prover + 3 kontroller): 10 Volymberäkning: Vattenvolym (µl) DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) dNTPs (µl) Forward Primer (µl) Reverse Primer (µl) DNA Polymerase (µl) Total volym Master Mix 330** 50 40 25 25 10 480 **OBS! Användaren bör sträva efter att ha minst 25 ng DNA per 50 µl PCR-reaktion. När de extraheras är DNA-koncentrationerna mindre än 12,5 ng/µl. Öka volymen extraherat DNA proportionerligt för att tillförsäkra 25 ng per reaktion. Minska vidare volymen vatten i Master Mix-blandningarna med samma mängd (upp till 5 µl) för att få 50 µl per reaktion. Alla prover som prepareras med dessa Master Mix-blandningar kommer att behöva extraherat DNA som har spätts ut till ungefär samma lägsta koncentrationsgrad. Vi rekommenderar inte att koncentrationer av extraherat DNA på <5 ng/µl används. 4. I samtliga fall kommer K- och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och K- och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en av de enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje NRAS-exon. a. För Master Mix (MM-N2), NRAS Exon 2 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS Mutants Positive Control Exon 2 och NRAS Exon 2 No Template Control 5. b. För Master Mix (MM-N3), NRAS Exon 3 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS Mutants Positive Control Exon 3 och NRAS Exon 3 No Template Control 6. c. För Master Mix (MM-N3), NRAS Exon 4 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS Mutants Positive Control Exon 4 och NRAS Exon 4 No Template Control 7. OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 5. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med vederbörlig provinformation. 6. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning. 7. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till 2,0 ml centrifugeringsrör som är märkta "Master Mix". 8. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-rören. 9. Tillsätt nödvändig mängd 10 mM dNTPs till Master Mix-rören. 10. Tillsätt nödvändig mängd NRAS Forward Primer till respektive Master Mix-rör. 11. Tillsätt nödvändig mängd NRAS Reverse Primer till respektive Master Mix-rör. 12. Centrifugera DNA Polymerase i ~10 sekunder. 13. Vortexblanda DNA Polymerase i ~10 sekunder. 14. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase och AmpErase till Master Mix-rören. 15. Förslut Master Mix-rören. 16. Vortexblanda Master Mix-rören i ~30 sekunder och centrifugera därefter i ~10 sekunder före användning. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 32 Kapitel 8 Stegvisa instruktioner för RAScan NRAS exoner 2, 3 och 4 Kit 17. Förvara på is tills det används. 18. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar och byt pipettspets om du använder en pipett med en kanal. Var noga med att undvika spill och stänk mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. 19. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA eller vatten (templat utan kontroll - NTC) till lämpliga brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med med prov-DNA och NTC med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 20. ENDAST EFTER DET ATT STEG 19 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS KONTROLLTEMPLAT-DNA (PN 710430 och 710431) öppnas. Pipettera 2,0 µl av K- och NRAS Wild-Type-kontroll (PN 710430) i respektive brunn eller rör för Wild-Type-kontroll för varje kontroll och förslut varje brunn eller rör innan K- och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas. När Wild-Type-kontrollerna för alla exoner har förslutits ska K- och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och en av brunnarna eller rören för muterade kontroller för varje exon. Förslut därefter varje brunn eller rör. Genom att tillsätta kitkontrollerna som de sista proverna som läggs till minskar risken för att något prov-DNA kontamineras. Förslut varje brunn med remsor med 8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat i brunnar som inte ligger intill muterade kontroller eller prover. OBS! För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS exoner 2-4, se Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits. 21. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 22. Centrifugera i 1-2 minuter för att tillförsäkra att alla lösningar har samlats i brunnarnas eller rörens botten. Kontrollera att lösningarna är på botten av brunnen eller röret. Upprepa centrifugeringen i annat fall. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 33 Kapitel 9 Stegvisa instruktioner för RAScan Complete Kit Kapitel 9 Stegvisa instruktioner för RAScan Complete Kit 9.1 Inledande inställning/kalibrering kapillärelektroforessystem av mikrofluidiskt Läs i bruksanvisningen till ditt system när SURVEYOR Nuclease-plattan ställs i ordning för analys på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, beträffande korrekt användning och underhåll av instrumentet. Se exempel för specifika KRAS och de nationella regleringsmyndigheterna Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores. 9.2 Att tänka på avseende templat 1. För FFPE-isolerat DNA-templat, använd normala laboratorierutiner för att bedöma kvalitet och kvantitet på extraherat DNA för att se till att det finns tillräckligt templat för PCR. 2. 260/280 absorptionsförhållandet ska vara över 1,80. 3. För att underlätta PCR-inställningen bör den effektiva koncentrationen av templat vara 12,5 ng/µl. Späd ut DNA-förlagorna med graderat molekylärbiologiskt vatten om så behövs. 9.3 Amplifieringsprotokoll 1. Ta ut 10 µM-primrar, 10 mM dNTPs och DNA Polymerase 10X PCR Buffer ur frysen och tina på is. 2. Vortexblanda alla komponenter efter upptining (~10 sekunder) så att de blandas noga, centrifugera en kort stund (~10 sekunder) för att tillförsäkra att ingen vätska finns kvar på rörens lock och lägg på is. 3. Förbered Master Mix-blandningarna på is. Använd nedanstående tabell som en vägledning för beredning av en Master Mix för var och en av KRAS Exon 2-, KRAS Exon 3-, KRAS Exon 4A-, KRAS Exon 4B-, NRAS Exon 2-, NRAS Exon 3- och NRAS Exon 4-reaktionerna: Master Mix-guide för 2 µl DNA-prover (DNA@12,5 ng/µl) Antal reaktioner (7 prover + 3 kontroller): 10 Volymberäkning: Vattenvolym (µl) DNA Polymerase 10X PCR Buffer (µl) dNTPs (µl) Forward Primer (µl) Reverse Primer (µl) DNA Polymerase (µl) Total volym Master Mix 330** 50 40 25 25 10 480 **OBS! Användaren bör sträva efter att ha minst 25 ng DNA per 50 µl PCR-reaktion. När de extraheras är DNA-koncentrationerna mindre än 12,5 ng/µl. Öka volymen extraherat DNA proportionerligt för att tillförsäkra 25 ng per reaktion. Minska vidare volymen vatten i Master Mix-blandningarna med samma mängd (upp till 5 µl) för att få 50 µl per reaktion. Alla prover som prepareras med dessa Master Mix-blandningar kommer att behöva extraherat DNA som har spätts ut till ungefär samma lägsta koncentrationsgrad. Vi rekommenderar inte att koncentrationer av extraherat DNA på <5 ng/µl används. 4. I samtliga fall kommer K- och NRAS Wild-Type Control (PN 710430) och K- och NRAS Mutants Positive Control (PN 710431) att användas för förberedelse av var och en av de Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 34 Kapitel 9 Stegvisa instruktioner för RAScan Complete Kit enskilda Wild-Type- och Mutant-kontrollreaktionerna för varje KRAS- och NRAS-exon som testas. De exonspecifika primrarna i de olika Master Mix-blandningarna avgör de specifika regioner som kommer att amplifieras. a. För Master Mix (MM-K2), KRAS exon 2, kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K- och NRAS Positive Mutants Control och KRAS Exon 2 No Template Control 1. b. För Master Mix (MM-K3), KRAS Exon 3, kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K- och NRAS Positive Mutants Control och KRAS Exon 3 No Template Control 2. c. För Master Mix (MM-K4A), KRAS Exon 4A kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K- och NRAS Positive Mutants Control och KRAS Exon 2 No Template Control 3. d. För Master Mix (MM-K4B), KRAS Exon 4B kommer ytterligare tre reaktioner att krävas per provplatta: K- och NRAS Wild-Type Control, K- och NRAS Positive Mutants Control och KRAS Exon 2 No Template Control 4. e. För Master Mix (MM-N2), NRAS Exon 2 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS Positive Mutant Control Exon 2 och NRAS Exon 2 No Template Control 5. f. För Master Mix (MM-N3), NRAS Exon 3 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS Positive Mutant Control och NRAS Exon 3 No Template Control 6. g. För Master Mix (MM-N4), NRAS Exon 4 kommer ytterligare tre reaktioner att behövas per provplatta för K- och NRAS Wild-Type Control , K- och NRAS Positive Mutant Control och NRAS Exon 4 No Template Control 7. OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 5. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med vederbörlig provinformation. 6. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning. 7. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till 2,0 ml centrifugeringsrören som är märkta "Master Mix". 8. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase 10X PCR Buffer till Master Mix-rören. 9. Tillsätt nödvändig mängd 10 mM dNTPs till Master Mix-rören. 10. Tillsätt nödvändig mängd KRAS eller NRAS Forward Primer till respektive Master Mix-rör. 11. Tillsätt nödvändig mängd KRAS eller NRAS Reverse Primer till respektive Master Mix-rör. 12. Centrifugera DNA Polymerase i ~10 sekunder. 13. Vortexblanda DNA Polymerase i ~10 sekunder. 14. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase och AmpErase till Master Mix-rören. 15. Förslut Master Mix-rören. 16. Vortexblanda Master Mix-rören i ~30 sekunder och centrifugera därefter i ~10 sekunder före användning. 17. Förvara på is tills det används. 18. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar och byt pipettspetsar om du använder en pipett med en kanal. Var noga med att undvika spill och stänk mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. 19. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA eller vatten (No Template Control) till lämpliga brunnar. Använd separata pipettspetsar för varje prov och undvik korskontaminering av proverna genom stänk. Förslut alla brunnar med prov-DNA och templat utan kontroll med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 35 Kapitel 9 Stegvisa instruktioner för RAScan Complete Kit 20. ENDAST EFTER DET ATT STEG 19 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS KONTROLLTEMPLAT-DNA (PN 710430 och 710431) öppnas. Pipettera 2,0 µl av K- och NRAS Wild-Type-kontroll (PN 710430) i respektive brunn eller rör för Wild-Type-kontroll för varje kontroll och förslut varje brunn eller rör innan K- och NRAS Postitive Mutants Control (PN 710431) öppnas. När Wild-Type-kontrollerna för alla exoner har förslutits ska K- och NRAS Positive Mutants Control (PN 710431) öppnas och 2,0 µl pipetteras i var och en av brunnarna eller rören för muterade kontroller för varje exon. Förslut därefter varje brunn eller rör. Genom att tillsätta kitkontrollerna som de sista proverna som läggs till minskar risken för att något prov-DNA kontamineras. Förslut varje brunn med remsor med 8 proppar (om en platta med 96 brunnar används) eller förslut 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. OBS! Det är god laboratoriepraxis att placera kontroller utan templat i brunnar som inte ligger intill muterade kontroller eller prover. OBS! För förslag på hur plattor med 96 brunnar kan arrangeras för analys av alla KRAS och NRAS exoner 2-4, se Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits. 21. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 22. Centrifugera i 1-2 minuter för att tillförsäkra att alla lösningar har samlats i brunnarnas eller rörens botten. Kontrollera att lösningarna är på botten av brunnen eller röret. Upprepa centrifugeringen i annat fall. Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores 10.1 Analys av resultat Granskaren ska visuellt undersöka gelbilder och elektroferogram för alla prover för att fastställa förekomst/frånvaro av en mutation. När en visuell inspektion av gelbilder och elektroferogram utförs bör banorna för No Template Control, Wild-Type Control och Positive Control undersökas först för att fastställa att: det inte förekommer kontaminering i No Template Control endast obeskurna homoduplextoppar förekommer i Wild-Type-kontrollen positiv kontroll har de specifika toppar (elektroferogram) eller band (gel) som genereras av SURVEYOR Nuclease-nedbrytning Den positiva kontroll (PN 710431) som används för att bekräfta att SURVEYOR Nuclease är aktiv och för att identifiera den region i gelen där bandmönstren som ses i proverna kan indicera förekomst av en potentiell mutation. Wild-Type-kontrollen (PN 710430) är komparator för provets bandmönster; förekomst av distinkta band i ett prov som inte finns i Wild-Type-kontrollen indicerar att provet bör skickas för DNAsekvensanalys. 10.2 Granskning av resultat För jämförelse och kontroll ska man ALLTID utföra SURVEYOR Nuclease-nedbrytning på var och en av kontrollerna (Wild-Type- och positiva kontroller), en kontroll utan templat (NTC), samt provDNA, vilka ska köras med samma provplatta på mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. I nedbrytningsstadiet av SURVEYOR Nuclease, tillhandahåller amplikonerna från dessa kontrollplasmid-DNA en effektiv kontroll att förhållandena för klyvningsreaktion (beredning av SURVEYOR Nuclease-blandning och inkuberingsförhållanden) var tillfredsställande. I analysstadiet och i följande exempel användes ett Caliper LabChip-system och kurvorna av dessa SURVEYOR Nuclease-nedbrutna kontrollamplikoner ger en vägledning om var DNA-fragmenten efter klyvningen vid dessa specifika mutationers avvikelseställe kommer att elueras, även vid låga nivåer (se figurer 5-16). Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 36 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Om antingen PCR-amplikonerna eller SURVEYOR Nuclease-klyvningsfragment som härletts av kontroll-DNA inte motsvarar beskrivna resultat, se Bilaga B -Felsökningsguide eller kontakta Transgenomics tekniska support innan nästa steg i provanalysen tas. SURVEYOR Nuclease klyver vid alla avvikelser som uppstår till följd av heteroduplex formering mellan Wild-Type och muterat DNA, inte bara mutationer i exoner 2, 3 eller 4. SURVEYOR Nuclease bekräftar avvikelsen. Mutationens specifika basförändringsidentitet krävs för bestämning av KRAS- och NRAS-aktiverande status och den måste bekräftas med en annan metod, t.ex. sekvensering. Obs! Det är viktigt att kontrollera att ingen "stämpel"-sekvens förekommer i varje sekvenseringselektroferogram för att bekräfta att mutationen inte beror på att provet kontaminerats av en av kittets kontroller. Obs! Om provet är Wild-Type vid relevanta kodon av intresse och den "stämplade" sekvensen förekommer, är provet kontaminerat och analysen måste göras om. Förekomst av "stämpeln" anger att provet kan vara kontaminerat med en av kittets Wild-Type-kontroller. Denna kontamination kan maskera eventuell lågnivåmutation i provet. Se A.2 Kontrollernas DNAstämplar för information om kontrollernas stämpelsekvenser. Nedanstående exempel ges endast i illustrerande syfte och ska INTE användas för att avgöra identiteten hos någon specifik mutation. Bekräftelse av identiteten hos en mutation krävs för att oåterkalleligt fastställa förekomsten av en specifik basförändring i exoner 2, 3 eller 4 i KRASoch/eller NRAS-genen. I alla exempel följdes tillvägagångssättet som beskrivs i avsnittet Stegvisa anvisningar till fullo. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 37 bp Prov 4 Prov 3 Prov 2 Prov 1 KRAS Wild-Type Control KRAS Positive Control Exon 2 Kontroll utan templat KRAS HT DNA 1K Ladder bp Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores ←Ej beskuren homoduplex ←Toppar i SURVEYOR ←Nedbrytningsregion Figur 5: En Caliper LabChip gelbild av SURVEYOR Nuclease nedbrytningsfragment efter PCR-amplifiering av KRAS exon 2. I ovanstående exempel innehåller kontrollen utan templat inga band och det förekommer därför ingen kontamination av proverna. Den positiva kontrollen visar de 2 distinkta band som genereras av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningen av G12D mutationskontroll, vilket indicerar att enzymet är aktivt. Wild-Type-kontrollen har endast en tydlig ej beskuren homoduplextopp, vilket visar att det inte förekommer någon kontamination av muterat DNA. Proverna 1, 3 och 4 visar distinkta band i brunnarna som är i korrekt region; dess prover innehåller sannolikt mutationer. Utan DNA-sekvensering är det emellertid omöjligt att avgöra vilka mutation(er) som förekommer eller om mutationerna är i kodoner 12 eller 13. I vissa prover kanske mutationerna inte finns vid kodon 12 eller 13, och därför skulle provet anses vara KRAS Exon 2 Wild-Type beträffande kodon 12 eller 13. Prov 2 visar det obeskurna homoduplexbandet och det finns därför inga tecken på någon mutation i provet. Detta prov behöver inte bekräftas med DNAsekvensering och kan klassificeras som KRAS exon 2 Wild-Type beträffande kodon 12 och 13. Förutom visuell inspektion av gelbilderna kan det vara bra att jämföra provernas elektroferogram med de positiva kontroller och Wild-Type-kontroller som medföljer i kittet. Det är bäst att använda funktionen "Överlappningsförskjutning" för elektroferogrammen som återfinns längst ned på fliken "Egenskaper". Det finns även andra alternativ. Figur 6 nedan visar elektroferogrammen för samma prover som visades i gelbildsläget ovan. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 38 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 6: Elektroferogrammen för samma uppsättning som visades på gelbilden i figur 5. Toppmönstren i proverna 1, 3 och 4 (rosa, blågröna och lila linjer) var inte exakt likadana och befinner sig i den region där mutationer i kodon 12 eller 13 återfinns. Bekräftelse med DNAsekvensering krävs för att identifiera den specifika basförändringen. Visuell granskning av elektroferogrammen för prov 2 (ljusbrun linje) visar ett baslinjemönster som liknar Wild-Typekontrollen och DNA-sekvensering behövs inte. Prov 1 Prov 3 Prov 4 Framåtriktad avläsning Bakåtriktad avläsning Figur 7: Sekvensanalys av prover 1, 3 och 4 från figur 10. Prover 1, 3 och 4 från figur 6 analyserades ytterligare med DNA-sekvensering. Prov 1 har en G13D-mutation; Prov 3 har en G13C-mutation och Prov 4 har en G12C-mutation. Dessa prover illustrerar (a) förmågan hos SURVEYOR Nuclease att detektera potentiella mutationer och (b) SURVEYOR Nuclease oförmåga att fastställa exakt placering eller specifik basförändring hos mutation(erna) i provet. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 39 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 8: Caliper LabChip elektroferogram av SURVEYOR Nuclease nedbrytningsfragment efter PCR-amplifiering av NRAS exon 2. I exemplet ovan visar den positiva kontrollen de 2 distinkta band som genereras av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningen av G12D mutationskontroll, vilket indicerar att enzymet är aktivt. Wild-Type-kontrollen har endast en tydlig ej beskuren homoduplextopp, vilket visar att det inte förekommer någon kontamination av muterat DNA. Proverna 1 och 3 (bruna och gröna linjer) var distinkta band i korrekt region. Prov 1 har två band och prov 3 verkar ha fyra band. Prov 3 har sannolikt en dubbel mutation men utan DNAsekvensering är det omöjligt att avgöra vilka mutationer som förekommer eller om mutationerna är i kodoner 12 eller 13 för vare sig prov 1 eller prov 3. I vissa prover kanske mutationerna inte finns vid kodon 12 eller 13, och därför skulle provet anses vara NRAS Exon 2 Wild-Type beträffande kodon 12 eller 13. Prov 2 (rosa linje) visar det obeskurna homoduplexbandet och det finns därför inga tecken på någon mutation i provet. Detta prov behöver inte bekräftas med DNA-sekvensering och kan klassificeras som NRAS exon 2 Wild-Type beträffande kodon 12 och 13. Prov 1 G12D Prov 3 G12D och A18T Figur 9: Sekvensanalys av prov 1 och 3 från figur 8. Prover 1 och 3 från figur 8 analyserades ytterligare med DNA-sekvensering. Prov 1 har en G12D-mutation (svart pil) och prov 3 har två mutationer: en G12D (svart pil) och en A18T (den lila rutan i figuren visar förekomst av A18Tmutationen i prov 3 samt frånvaron i samma region i prov 2). Dessa prover illustrerar (a) förmågan hos SURVEYOR Nuclease att detektera potentiella mutationer och (b) SURVEYOR Nuclease oförmåga att fastställa exakt placering eller specifik basförändring hos mutation(erna) i provet. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 40 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores 10.3 Tolkning av resultat Figur 10: KRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram och virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av KRAS Positive Control Exon 2, KRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPE-sektioner. KRAS Positive Control Exon 2 är en blandning av Wild-Type och muterade G12D-plasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 74 and 116 bp (röd linje). Vid jämförelse mellan oc för prover 1-4 med Wild-Type-elektroferogram (grön linje), är det tydligt att proverna 1, 3 och 4 (rosa, blågröna och lila linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för prov 2 (ljusbrun linje) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste proverna 1, 3 och 4 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon för KRAS exon 2, medan prov 2 inte behöver sekvenseras. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 41 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 11: KRAS Exon 3 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (virtuella gelbilder och elektroferogram) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av KRAS Positive Control Exon 3, KRAS Control Wild-Type och CRC DNA som isolerats från FFPEsektioner. KRAS Positive Control Exon 3 är en blandning av Wild-Type och muterade Q61Hplasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 67 and 133 bp (röd linje). Vid jämförelse av nedbrytningsmönstren för proverna 1-4 med Wild-Type-elektroferogram (grön linje), är det tydligt att proverna 2 och 4 (ljusbruna och lila linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för prov 1 och 3 (rosa och ljusbruna linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste proverna 2 och 4 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon förKRAS exon 3, medan proverna 1 och 3 inte behöver sekvenseras. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 42 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 12: KRAS Exon 4A SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (virtuella gelbilder och elektroferogram) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av KRAS Positive Control Exon 4A, KRAS Control Wild-Type och CRC DNA som isolerats från FFPEsektioner. KRAS Positive Control Exon 4A är en blandning av Wild-Type och muterade K117Nplasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 80 and 88 bp (rosa linje). Vid jämförelse av nedbrytningsmönster för prover 1-4 med Wild-Type (grön linje) elektroferogram är det uppenbart att prov 3 (blågrön linje) har en möjlig mutation. Nedbrytningsmönstret för proverna 1, 2 och 4 (rosa, ljusbruna och lila linjer) liknar mönstret hos Wild-Type-kontrollen. Därför bör prov 3 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon för KRAS exon 4A, medan proverna 1, 2 och 4 inte behöver sekvenseras. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 43 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 13: KRAS Exon 4B SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram och virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av KRAS Positive Control Exon 4B, KRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPEsektioner. KRAS Positive Control Exon 4B är en blandning av Wild-Type och muterade A146Tplasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 78 and 116 bp (röd linje). Vid jämförelse av nedbrytningsmönstren för proverna 1-4 med Wild-Type-elektroferogram (grön linje), är det tydligt att proverna 2 och 4 (ljusbruna och lila linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för prov 1 och 3 (rosa och ljusbruna linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste proverna 2 och 4 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon förKRAS exon 4B, medan proverna 1 och 3 inte behöver sekvenseras. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 44 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 14: NRAS Exon 2 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram och virtuella gelbilder). Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av NRAS Positive Control Exon 2, NRAS Control Wild-Type och DNA som isolerats från FFPE-sektioner. NRAS Positive Control Exon 2 är en blandning av Wild-Type och muterade G12D-plasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 75 and 161 bp (röd linje). Vid jämförelse av nedbrytningsmönstren för proverna 1-4 med Wild-Type-elektroferogram (grön linje), är det tydligt att proverna 1 och 2 (rosa och ljusbruna linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för prov 3 och 4 (ljusbruna och lila linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste proverna 1 och 2 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon förNRAS exon 2, medan proverna 3 och 4 inte behöver sekvenseras. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 45 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 15: NRAS Exon 3 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram och virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av NRAS Positive Control Exon 3, NRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPE-sektioner. NRAS Positive Control Exon 3 är en blandning av Wild-Type och muterade Q61K-plasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 77 and 126 bp (röd linje). Vid jämförelse av nedbrytningsmönstren för proverna 1-4 med Wild-Type-elektroferogram (grön linje), är det tydligt att proverna 1-3 (rosa, ljusbruna och blågröna linjer) har potentiella mutationer. Nedbrytningsmönstret för prov 4 (lila) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför måste proverna 1 - 3 sekvenseras för att bekräfta förekomst eller frånvaro av mutation vid relevant kodon för NRAS exon 3, medan prov 4 inte behöver sekvenseras. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 46 Kapitel 10 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Microfluidic kapillärelektrofores Figur 16: NRAS Exon 4 SURVEYOR Nuclease nedbrytningsprodukter (elektroferogram och virtuella gelbilder) Caliper LabChip-analys av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar av NRAS Positive Control Exon 4, NRAS Control Wild-Type and DNA som isolerats från FFPE-sektioner. NRAS Positive Control Exon 4 är en blandning av Wild-Type och muterade A146T-plasmider som uppstår i nedbrytningstoppar om 68 and 165 bp (röd linje). Nedbrytningsmönstret för prov 1 - 4 (rosa, ljusbruna, blågröna och lila linjer) liknar Wild-Type-kontrollens mönster. Därför behöver proverna 1 - 4 inte sekvenseras. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 47 Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits 11.1 Platta, arrangemang 1 Det arrangemang av plattan som föreslås nedan är för RAScan-analys av alla sju KRAS- och NRAS-exonerna samtidigt i 10 prover. 1 2 A: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 2 2 WT 2 Mut 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 Prov 10 Tom Tom Tom NTC KRAS Ex 2 NTC KRAS Ex 3 NTC KRAS Ex 4A NTC KRAS Ex 4B NTC NRAS Ex 2 NTC NRAS Ex 3 NTC NRAS Ex 4 B: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 3 3 WT 3 Mut C: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 4A 4A WT 4A Mut D: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 4B 4B WT 4B Mut E: NRAS NRAS Ex NRAS Ex Ex 2 2 WT 2 Mut F: NRAS NRAS Ex NRAS Ex Ex 3 3 WT 3 Mut G: NRAS NRAS Ex NRAS Ex Ex 4 4 WT 4 Mut H: Tom Tom Förklaring: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = No Template Control (kontroll utan templat) 11.2 Platta, arrangemang 2 Det arrangemang av plattan som föreslås nedan är för RAScan-analys av alla sju KRAS- och NRAS-exonerna samtidigt i 9 prover. 1 2 A: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 2 2 WT 2 Mut 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov 6 Prov 7 Prov 8 Prov 9 NTC KRAS Ex 2 B: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 3 3 WT 3 Mut NTC KRAS Ex 3 C: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 4A 4A WT 4A Mut NTC KRAS Ex 4A D: KRAS KRAS Ex KRAS Ex Ex 4B 4B WT 4B Mut NTC KRAS Ex 4B E: NRAS NRAS Ex NRAS Ex Ex 2 2 WT 2 Mut NTC NRAS Ex 2 F: NRAS NRAS Ex NRAS Ex Ex 3 3 WT 3 Mut NTC NRAS Ex 3 G: NRAS NRAS Ex NRAS Ex Ex 4 4 WT 4 Mut NTC NRAS Ex 4 H: Tom Tom Tom Tom Tom Tom Tom Tom Tom Tom Tom Tom Förklaring: Ex = Exon; WT = Wild-Type; Mut = Mutation; NTC = No Template Control (kontroll utan templat) Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 48 Kapitel 11 Översikt av platta för RAScan Kits 11.3 Kontroll-DNA-stämplar Sekvenser med en "stämpel" anges nedan. Förklaring: De vanligaste mutationsområdena markeras med lila. Sekvenser med VERSALER är kodande baser; ej kodande baser anges med gemener. Kontrollernas genetiska "stämpel" är markerad i gult; denna avvikelse från KRAS eller NRAS Wild-Type-sekvensen, i en region som inte förväntas ha mutationer, kan användas för att felsöka provkontamination av muterade kontroller. Se Bilaga B - Felsökningsguide, problem 5, för ett exempel på en RAScan-kurva av sådan kontamination. KRAS Exon 2-"stämpel" Amplikonstorlek: 190 bp. För att skapa KRAS Exon 2-kontrollplasmidens genetiska stämpel har TAT ändrats till ATA. Kodon 12 och 13 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är samma förutom att kodon 12 har muterats till G12D (GGT>GAT). GCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAAATAGAT KRAS Exon 3-"stämpel" Amplikonstorlek: 200 bp. För att skapa KRAS Exon 3-kontrollplasmidens genetiska stämpel har Wild-Type, TAT, ändrats till ATA. Kodon 59 och 61 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är samma förutom att kodon 61 har muterats till Q61H (CAA>CAC). GAATGGTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG KRAS Exon 4A-"stämpel" Amplikonstorlek: 168 bp. För att skapa KRAS Exon 4A-kontrollplasmidens genetiska stämpel har Wild-Type, AGA, ändrats till TCT. Kodon 117 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är samma förutom att kodon 117 har muterats till K117N (AAA>AAT). AATAAATGTGATTTGCCTTCTAGAACAGTTCTCAC KRAS Exon 4B-"stämpel" Amplikonstorlek: 194 bp. För att skapa KRAS Exon 4B-kontrollplasmidens genetiska stämpel har Wild-Type, AGT, ändrats till TCA. Kodon 146 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är samma förutom att kodon 146 har muterats till A146T (GCA>ACA). TCAGCAAAGACAAGACAGgtatcaaac NRAS Exon 2-"stämpel" Amplikonstorlek: 236 bp. För att skapa NRAS Exon 2-kontrollplasmidens genetiska stämpel har Wild-Type, ACA, ändrats till TGT. Kodon 12 och 13 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är samma förutom att kodon 12 har muterats till G12D (GGT>GAT). ccatgtggttcttgctggtgtgaaATGACTGAGTACAAACTGGTGGTGGTTGGAGCAGGTGGTGTT NRAS Exon 3-"stämpel" Amplikonstorlek: 203 bp. För att skapa NRAS Exon 3-kontrollplasmidens genetiska stämpel har Wild-Type, GAC, ändrats till CTG. Kodon 59 och 61 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är samma förutom att kodon 61 har muterats till Q61K (CAA>AAA). ACAGCTGGACAAGAAGAGTACAGTGCCATGAGACTGCAA NRAS Exon 4-"stämpel" Amplikonstorlek: 233 bp. För att skapa NRAS Exon 4-kontrollplasmidens genetiska stämpel har Wild-Type, CAA, ändrats till GTT. Kodon 117 och 146 har också markerats nedan. Den muterade kontrollen är samma förutom att kodon 146 har muterats till A146T (GCA>ACA). AACAAGTGTGATTTGCCAACAAGGACAGTTGATACAAAAGTTGCCCACGAACTGGCCAAGAGTTACGGGATT CCATTCATTGAAACCTCAGCCAAG Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 49 Kapitel 12 Referenser för RAScan Kits Kapitel 12 Referenser för RAScan Kits 1. Amgen News Release (2013) New analyses identify predictive biomarkers for Vectibix® (panitumumab) in patients with metastatic colorectal cancer. http://wwwext.amgen.com/media/media_pr_detail.jsp?-year=2013&releaseID=1820728 2. Peeters M et al (2013) Massively parallel tumor multigene sequencing to evaluate response to panitumumab in a randomized phase III study of metastatic colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 1902-12. 3. De Roock W et al (2010) Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA 304 1812-20. 4. Peeters M et al (2013) Mutant KRAS codon 12 and 13 alleles in patients with metastatic colorectal cancer: assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab. J Clin Oncol. 31 759-65. 5. Andre T et al (2013) Panitumumab combined with irinotecan for patients with KRAS wild-type metastatic colorectal cancer refractory to standard chemotherapy: a GERCOR efficacy, tolerance, and translational molecular study. Ann Oncol. 24 412-9. 6. Loupakis F et al (2009) KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer. Br J Cancer 101 715-21. 7. De Roock W et al (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis. Lancet Oncol. 11 753-62. 8. Qiu P et al (2004) Mutation detection using Surveyor™ nuclease. Biotechniques 36 702-707. 9. Kuang Y et al (2009) Noninvasive detection of EGFR T790M in gefitinib or erlotinib resistant non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 15 2630-6. 10. Mitani N et al (2007) Surveyor nuclease-based detection of p53 gene mutations in haematological malignancy. Ann. Clin. Biochem. 44 557-9 11. Engelman JA et al (2006) Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer. J. Clin. Invest. 116 2695-2706. Se även http://world.transgenomic.com/files/literature/482146.pdf för referenser om SURVEYOR Nuclease och dess tillämpningar. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 50 DEL II ACE™ Kits DEL II ACE™ Kits Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 51 DEL II ACE™ Kits Denna sida har avsiktligt lämnats tom Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 52 Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion 1.1 Avsedd användning av ACE Kits Endast för yrkesmässig användning. Transgenomics ACE (Allele Specific PCR Enrichment) Kits CE IVD är diagnostiska analyser in vitro som detekterar specifika somatiska mutationer vid specifika kodoner i BRAF- och EGFR-generna, plus alla deletioner och komplexa mutationer i relevant region av EGFR Exon 19. Specifika punktmutationer fastställs för BRAF exon 15, EGFR exoner 18, 20 och 21 men de EGFR exon 19-deletioner som detekteras kan inte sekvensbestämmas av dessa analyser. Specifikt fastställande av exakt exon 19-deletion eller komplex mutation behöver fastställas med DNA-sekvensering. Alla mutationer och deletioner påvisas av distinkta fragmentlängder när de sparareras med mikrofluidisk kapillärelektrofores. Dessa kit är utformade för användning i ett kliniskt diagnostiskt laboratorium av utbildad personal som testar DNA som utvunnits ur formalinfixerad paraffininbäddad vävnad. Dessa bruksanvisningar kan hämtas på http://world.transgenomic.com/files/literature/482504-SV.pdf 1.2 Indikationer för ACE Kits Kliniker kan använda ACE Kits CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att underlätta fastställande av om en patients tumör kommer att svara på behandling eller ej. Var god läs i det specifika kapitlet för varje analys. ACE Kits CE IVD får inte användas för diagnos av lungcancer, kolorektal cancer, bröstcancer eller någon annan form av cancer. ACE Kits CE IVD är analyser som detekterar och bekräftar förekomst av specifika somatiska mutationer i BRAF- och EGFR- generna. Deletioner i EGFR exon 19 detekteras av denna analys men bekräftas inte. För att bestämma exakt deletion i EGFR exon 19 krävs ytterligare analys, t.ex. DNA-sekvensering. Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kits CE IVD bör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med lungcancer, kolorektal cancer eller bröstcancer. Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att identifiera mutationer med dessa kit endast är specifikt för de mutationer som kan upptäckas. Andra mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med dessa kit. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 53 Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion Denna allelspecifika analys ger en hög känslighet för mutationsdetektion och därför bör dessa bruksanvisningar, instruktioner för hantering av lösningar samt analysprotokoll följas för att minimera risken för kontamination. Kitet bör endast hanteras i ett område som anses fritt från DNAkontaminanter. 1.3 Beställningsinformation Produktnum mer Produktnamn Storlek ACE Kits 714150 ACE™ KIT EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 100 reaktioner 714160 ACE™ KIT EGFR Exons 19 and 21 CE IVD 100 reaktioner 714120 ACE™ KIT BRAF Exon 15 CE IVD 100 reaktioner 1.4 Härledning av kittets kontrollsubstanser De kontroller som medföljer dessa kit är plasmidkloner av relevanta gensekvenser för BRAF eller EGFR. Alla kloner har sekvenserats för att verifiera sekvensens överensstämmelse genom jämförelse med NCBI-referenssekvenser: NG_007873.2, NG_007726.3 och NG_012113.2. Alla kontroller i detta kit måste hanteras isolerade från genomisk provberedning för att förhindra korskontamination. Om du har ytterligare frågor eller behöver hjälp kan du kontakta (888) 2339283 (endast Nordamerika), +1 (402) 4525400 eller +44 (0) 141 892 8800 (Europa) och begära "support". Du kan även skicka epost till [email protected]. Skriv "ACE Kit Support" i ämnesraden. Ytterligare detaljer om kontrollernas DNA-sekvenser finns i avsnitten Användning kontrollplasmid-DNA i respektive kapitel för den ACE Kit som testas i laboratoriet. 1.5 ACE Kit-komponenter Antal rör i kitet Katalog Nummer 703310 Komponent ACE Kit BRAF Exon 15 ACE Kit EGFR Exons 19 & 21 ACE Kit EGFR Exons 18 & 20 Genomskinligt 1 1 1 Vitt 1 1 1 Genomskinligt Blått Grönt Blått Blått Blått Grönt 1 1 1 - 1 1 1 1 1 1 - Färg på rörets lock 703065 707251 707244 707551 707552 707553 707545 DNA Polymerase 250 U DNA Polymerase 10X PCR Buffer dNTPs (10 mM) ACE BRAF Primer Mix BRAF ab Mix Primer Mix 1(EGFR Ex 19 Del) Primer Mix 2 (EGFR L858R) Primer Mix 3 (EGFR L861Q) EGFR Ex 19 ab 707543 EGFR Ex 21 ab L858R Grönt - 1 - 707544 EGFR Ex 21 ab L861Q ACE EGFR (Exon 18) Primer Mix EGFR Ex 18 ab G719 ACE EGFR Exon 20 Primer Mix EGFR Ex 20 ab T790M Grönt - 1 - Blått - - 1 Grönt - - 1 Blått - - 1 Grönt - - 1 703315 707652 707642 707651 707641 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 54 av Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion 1.6 Antal prover som kan testas med ett ACE-kit Alla ACE-kit är utformade för att genomföra sammanlagt 100 reaktioner. Det totala antalet reaktioner och det antal prover som kan testas beror på antalet exoner som testas och på den genomsnittliga satsstorleken hos de prover som testas vid varje tillfälle. Detta beror på att en uppsättning kontroller måste testas i varje provomgång. 1.7 Övrig nödvändig utrustning och reagenser som krävs för ACE Kits Ytterligare komponenter och utrustning som behövs för att använda ACE Kits innefattar följande: Mikrofluidiskt kapillärelektroforesinstrument, t.ex. Caliper LabChip MultiDX Mikrofluidiska kapillärelektroforesbuffrar och -lösningar Lämpligt DNA-chip för mikrofluidisk kapillärelektrofores (t.ex. DNA1000 för Caliper LabChip Multi Dx-instrument) Vatten för molekylärbiologi 0,2 ml-PCR rör, remsor eller platta med 96 brunnar Mikropipetter Pipettspetsar Isbad Vortexblandare Mikrocentrifug Termocykler 10% blekmedel eller liknande rengöringsmedel 1.8 Reagensberedning för ACE Kits Alla reagenser som ingår i dessa kit är användningsklara. En del komponenter behöver tinas upp, vortexblandas eller centrifugeras i en mikrocentrifug före användning. Ytterligare information finns i avsnittet Analysprocedur, nedan. Reagenser behöver kombineras för att producera Master Mixblandningar och reaktionsblandningar. En fullständig beskrivning ges under Analysprocedur nedan. 1.9 Förvaring och hållbarhet efter första användningen av ACE Kits Kittet ska förvaras vid -18 ºC till -25 °C i en frys med konstant temperatur (d.v.s. utan avfrostningscykel) tills de ska användas. Notera utgångsdatumet för varje kit som tas emot. Använd inte kittet efter passerat utgångsdatum. 1.10 Varningar och försiktighetsåtgärder för ACE Kits Ingen av reagenserna i dessa kit utgör en hälsorisk i de kvantiteter som förekommer. Transgenomics materialsäkerhetsblad för vart och ett av dessa kit kan laddas ner från följande webbplats http://world.transgenomic.com/files/literature/714000-SV.pdf. Det finns inga ämnen i dessa kit med animaliskt eller humant ursprung som innebär en infektionsrisk. Dessa kit får endast användas av personer som har utbildats i korrekta laboratorietekniker. Använd alltid lämplig laboratorierock, engångshandskar och ögonskydd vid arbete med komponenterna i detta kit. Vidare måste dessa kit användas i en lokal som är fri från potentiell DNA-kontamination. Efter användningen ska kittets komponenter kasseras som sjukvårdsavfall och enligt lokala lagar och föreskrifter. Alikvoter av reagenser som pipetterats från rören i dessa kit är endast avsedda för engångsbruk. Komponenterna i dessa kit har validerats som fortfarande stabila efter 20 upptiningscykler. Använd inte dessa kit om antalet upptiningscykler har överskridits. Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion 1.11 Förberedande provtagning, hantering och förvaring av ACE Kits Alla ACE Kits har validerats för användning med DNA som extraherats från formalinfixerade paraffininbäddade tumörprover som är lämpliga enligt avsnittet "Indikationer för användning" för varje enskilt kit. För optimal DNA-extraktion ska vävnaden fixeras i formalin i 14-24 timmar innan den bäddas in i paraffin. Tumörbiopsier är en heterogen blandning av tumörceller och icke-tumörceller. Vidare är själva tumörcellen en heterogen blandning av tumörceller med mutationer och tumörceller utan mutationer. Eftersom dessa somatiska mutationer kanske inte är jämnt fördelade i tumören, kan analysresultaten från olika sektioner i samma tumör skilja sig åt. För att öka möjligheten att upptäcka en mutation, bör DNA från vävnadens tumörregion isoleras genom att endast tumörområdet skrapas från objektglaset med en ny, steril skalpell för varje nytt objektsglas. För att uppfylla viktiga värden avseende kvalitetskontroll för att framgångsrikt använda dessa kit, ska extraherat DNA uppfylla följande standarder: 1. UV-spektrofotometri (t.ex. uppmätt med NanoDrop®-instrument eller en UV-spektrofotometer med mikrokyvetter) kan användas för att avgöra DNA-koncentrationen. Eftersom DNA som isolerats från FFPE-vävnader kan vara ytterst fragmenterad bör denna koncentration användas som en vägledning och kommer inte nödvändigtvis att korrekt fastställa mängden "amplifierbar" DNA i ett prov. o 260/280 nm absorptionsförhållandet ska vara >1,80 o Varje provs templatkoncentration ska vara utspädd till 12,5 ng/µl. Sammanlagt används 25 ng per PCR. 2. En alternativ metod för att fastställa amplifierbart DNA är att använda en qPCR-analys. Denna qPCR-analys bör ge amplikoner i storleksområdet 100–130 bp. Extraherade DNA-prover som inte används för omedelbar analys med dessa kit ska förvaras vid 20 ºC till -80 ºC Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 56 Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion 1.12 Somatisk mutationsdetektion med ACE - en översikt Figur 1: Mutationsdetektion med ACE Kit omfattar tre steg: Steg 1: Isolera genomisk DNA Steg 2: PCR‐amplifiera prov‐DNA Steg 3: Storleksbaserad mutationsbekräftelse med mikrofluidisk kapillärelektrofores Steg 1 – Isolera tillräcklig genomisk DNA av hög kvalitet från lämpliga FFPE-vävnadssnitt. Steg 2 – Amplifiera proverna tillsammans med kittets positiva kontroll med användning av medföljande ACE primermix för de genetiska regioner som undersöks. Steg 3 - Analysera DNA-fragmenten med ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. Uppkomsten av specifika toppar efter PCR-amplifiering kommer att indicera exakt mutation i provet för BRAF och EGFR exoner 18, 20 och 21. Beträffande de deletioner som detekteras i EGFR exon 19, kan själva deletionen upptäckas men inte den exakta DNA-sekvensen. 1.13 Fragmentstorleksbestämning av SURVEYOR Nuclease-nedbrytningar med mikrofluidisk kapillärelektrofores 1.13.1 Exempel med användning av ett Caliper LabChip-instrument Caliper LabChip-systemet ställs in, körs och analyseras enligt bruksanvisningen. Tillhörande Caliper LabChip Software används för granskning av data, bearbetning av elektroferogram och för att generera rapporter. Obs! Endast de specifika mutationerna i varje kit kan detekteras med dessa analyser. Mutationer i andra kodoner detekteras inte av ACE-analyserna. Vidare upptäcker ACE Kit EGFR Exon 19 deletioner i EGFR exon 19, men kittet kan inte särskilja den exakta sekvensnivån. 1.13.2 Procedur för mutationsbestämning med ACE Kit Förbered laboratoriets mikrofluidiska kapillärelektroforessystem enligt anvisningar i tillverkarens bruksanvisning till instrumentet. (Läs även i HT DNA-anvisningarna till 1K-analysen för Caliper LabChip MultiDX-instrumentet). 1. Säkerställ att ACE Kit PCR nedbrytningsprodukter är i en platta som är godkänd för användning på instrumentet. 2. Öppna instrumentets programvara och välj lämpliga kommandon för att starta analysen när chip, reagenser och prover har laddats korrekt i instrumentet. 3. Börja körningen när plattan och instrumentet har ställts in och alla parametrar är klara. 4. Utför rengöring och förvaring av materialen enligt beskrivning i tillverkarens anvisningar när körningen är klar. Kapitel 1 Allelspecifika PCR-och storleksbestämningsanalyser för mutationsdetektion 1.14 Granskning av mikrofluidiska kapillärelektroforesdata Inspektera den virtuella gelbilden och elektroferogrammen som är specifika för varje kit för att avgöra förekomst av en specifik mutation eller deletion. Läs i ifrågavarande kapitel beträffande exempel på analyser med Caliper LabChip mikrofluidisk kapillärelektroforesplattform. För exempel på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en Caliper LabChip-plattform, läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip instrument. Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 2.1 Indikationer för användning av ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD Endast för yrkesmässig användning. Kliniker kan använda Transgenomics ACE (Allele Specific PCR Enrichment) Kit BRAF Exon 15 CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att avgöra om en patients tumör kommer att svara på Vemurafenib (Zelboraf®) som är godkänt för behandling av melanom som är positiva förBRAF V600-mutation. ACE Kit Exon 15 CE IVD får inte användas för diagnos av hudcancer eller någon annan form av cancer. ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD är en analys som detekterar och bekräftar förekomst av V600E (Val600Glu), V600E2 (Val600Glu) och V600K (Val600Lys) somatiska mutationer i BRAF-genen. Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kit BRAF Kit Exon 15 CE IVD bör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med metastaserande melanom. Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att identifiera mutationer med dessa kit endast är specifikt för de mutationer som kan upptäckas. Andra mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med dessa kit. Denna allelspecifika analys ger en hög känslighet för mutationsdetektion och därför bör dessa bruksanvisningar, procedurer och analysprotokoll följas för att minimera risken för kontamination. Detta kit bör endast hanteras i ett område som anses fritt från DNA-kontaminanter. 2.2 Principer för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD BRAF-genen kodar en medlem i Raf kinas-familjen och ingår i RAS-RAF signalbanan och är en aktivator av MEK och ERK. Valinen vid position 600 i exon 15 i BRAF-proteinet är det aktiverande segmentet i kinasdomänen. Mutationer som orsakar aminosyrabyte i denna valin orsakar ökningar i BRAF kinasaktivitet och i transformationen av celler in vivo. BRAF V600-mutationer återfinns i 8% av cancerpatienterna och anses, i likhet med KRASmutationer, vara självaktiverande vilket leder till en bristande respons på tyrosinkinashämmare såsom cetuximab (Erbitux®) och panitumumab (Vectibix®)1. BRAF V600-mutationer återfinns i 40 60% av alla melanom. Den vanligaste mutationen är V600E (Val600Glu), ett aminosyrabyte från valin till glutaminsyra. Tillsammans med V600E2(Val600Glu)- och V600K-mutationen (Val600Lys), är V600E ett mål för läkemedlet vemurafenib (Zelboraf®) som har godkänts för behandling av melanom2,3. V600E and V600E2 är de beteckningar som Transgenomic använder för att skilja de två olika mutationerna som leder till samma aminosyrabyte. På grund av att dessa analyser har en hög sensitivitet, rekommenderas att laboratoriets installation är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A–Laboratorieinst-llation för PCRanalyser. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 58 Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 2.3 Den allelspecifika PCR Primer-analys som används i ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD Denna multiplexa allelspecifika PCR kommer att amplifiera BRAF Wild-Type, V600E (c.1799T>A), V600E2 (c.1799_1800TG>AA) samt V600K (c.1798_1799GT>AA) vilket ger amplikonstorlekar om 132 bp, 112 bp, 122 bp respektive 103 bp. Denna allelspecifika längdskillnad i PCR-produkter kan användas för att analysera prover i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. BRAF Primer Mix har fyra primrar: en enkel framåtriktad primer och fyra bakåtriktade primrar. Var och en av de fyra bakåtriktade primrarna är specifika för en allel – Wild-Type, V600E, V600E2 och V600K. Figur 1 Översikt av BRAF allelspecifik PCR-analys V600 WT BRAF Positive Control V600K V600E BRAF Primer Mix bestående av: Blandning av WildType och BRAF V600K V600E2 Blandning av WildType och BRAF V600E allelspecifika primrar plus "svansar" för storleksavskiljning + När det allelspecifika termocyklerprogrammet är klart analyseras produkterna på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, t.ex. Caliper LabChip MultiDX. Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD ! Obs! För att framgångsrikt använda detta kit rekommenderar vi att du läser igenom den här handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet 2.5 Användning av BRAF kontrollplasmid-DNA för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD. Vidare krävs att användarna arbetar i DNA-arbetsstationer eller andra områden som kan rengöras ytterst noga för att minimera DNA-kontamination av reaktionerna. Läs i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser. 2.4 Stegvisa instruktioner för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 2.4.1 Att tänka på avseende templat Obs! Användning av en PCR-arbetsstation med UV-lampa och HEPA-filter rekommenderas starkt. Alla ytor eller utrustningar som kommer att användas vid denna ACE-analys bör rengöras med en lösning som kommer att förstöra DNA som kan förekomma på sådana ytor. Det finns många lösningar som dekontaminerar DNA från laboratorieytor; dock fungerar de flesta av dessa inte för att förstöra DNA-fragment under 500 bp5. Om laboratoriet arbetar med DNA som isolerats från FFPE-sektioner bör ytor och utrustning dekontamineras med en 10% blekmedelslösning som bereds varje vecka. Obs! Kontrollera att korrekt personlig skyddsutrustning används vid hantering av blekmedelslösningar. Läs i lokala säkerhetsrutiner för laboratoriet. Kvaliteten på extraherat templat-DNA som ska testas bör ha följande egenskaper: 1. Koncentrationen ska vara ≥ 12,5 ng/µl. 2. A260/280-förhållandet ska vara ≥ 1,8. 2.4.2 Allelspecifikt PCR-protokoll för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 1. dNTPs-lösningen tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mM total deoxinukleotid (2,5 mM av var och en av de fyra deoxinukleotiderna). 2. BRAF-primrarna är en enstaka, förblandad lösning som innehåller en universell framåtriktad primer och 4 allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik amplifiering av Wild-Type, V600E2, V600E och V600K-mutationer. 3. Ta upp BRAF Primer Mix, dNTPs, 10X PCR Buffer, DNA Polymerase samt BRAF Positive Control ur frysen och tina på is. Vortexblanda var och en efter upptining i 5 10 sekunder och centrifugera därefter rören under en kort stund för att säkerställa att ingen reagens finns kvar på rörens lock eller på sidorna. 4. Placera återigen alla rören på is. 5. Förbered Master Mix-blandningen på is. 6. Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för 10 (tio) reaktioner: Antal reaktioner: (8 prover + 2 kontroller) 10 Volymberäkning Vattenvolym (µl) 10X PCR Buffer (µl) dNTPs (µl) BRAF Primer Mix (µl) DNA Polymerase (µl) Total volym Master Mix 335,0 50,0 40,0 50,0 5 480,0 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 60 ! Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 7. Beräkna nödvändiga volymer för alla angivna Master Mix-blandningar med användning av ovanstående tabell. OBS! a. Ytterligare två reaktioner kommer att behövas för BRAF Positive Control samt för BRAF kontroll utan templat. Obs! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 8. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med lämplig provinformation. 9. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning. 10. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till Master Mix-röret. 11. Tillsätt nödvändig mängd 10X PCR Buffer till Master Mix-röret. 12. Tillsätt nödvändig mängd dNTPs-lösning till Master Mix-röret. 13. Tillsätt nödvändig mängd BRAF Primer Mix till Master Mix-röret. 14. Centrifugera DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder. 15. Knacka försiktigt på DNA Polymerase-röret för att blanda innehållet. 16. Centrifugera återigen DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder. 17. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. För inte ner pipettspetsen hela vägen ner i polymerasröret; den ska föras ner till strax under enzymlösningens yta. Detta förhindrar förlust av enzym som annars skulle fastna på pipettrörets plastyta. 18. Förslut Master Mix-röret. 19. Vortex-blanda Master Mix-röret i cirka10 sekunder före användning. 20. Förvara på IS tills det används. 21. Centrifugrea ner Master Mix-röret före alikvotering för att avlägsna eventuell lösning från rörets sidor eller lock. 22. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar eller rör och byt pipettspets om du använder en pipett med en kanal. Se till att det inte spiller/stänker mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. 23. ENDAST EFTER DET ATT STEG 22 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS POSITIVA KONTROLL-DNA ÖPPNAS. Tillsätt 2,0 µl vatten (kontroll utan templat) till passande brunn eller rör. När pipettering av kontroll utan templat är klar, ska brunnen förslutas med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt lock på 0,2 ml PCR-röret. Se till att proppen sluter till ordentligt. 24. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA som ska vara tinad (om DNA har förvarats frusen), vortexblandad och centrifugerad, till lämpliga brunnar. När provpipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 25. Tillsätt 2,0 µl BRAF Positive Control till passande brunn eller rör. När kontrollpipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 26. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 27. Centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattorna. Inspektera plattorna eller 0,2 ml PCR-rören. Kontrollera att vätskan är på botten av brunnen. Centrifugera återigen i annat fall. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 61 Kapitel 2 ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 2.4.3 Termocyklerprogram för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 1. Använd följande termocyklerprotokoll för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD allelspecifik PCR: Inledande denaturering 95 C 5 minuter Amplifiering 38 cykler 95 C 30 sekunder 61 C 45 sekunder 72 C 25 sekunder Sista förlängning 72 C 1 cykel 2 minuter Förvaring ≤12 C Vänta 2. Säkerställ att den totala programtiden är 2 timmar och 10 minuter, detta motsvarar rampningstiden 1,5 ºC/sekund. TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till en vecka. 3. Analysera lämplig mängd på det mikrofluidiska kapillärelektroforesinstrumentet. 4. För analys med ett Caliper LabChip MultiDX-instrument: överför 10 µl av varje PCR till en platta med 96 brunnar, tillsätt 15 µl vatten, blanda på instrumentet. 2.5 Användning av BRAF kontrollplasmid-DNA för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD Detta kit tillhandahålls med en BRAF positiv kontroll för BRAF. Denna består av plasmider med insatser. Den positiva kontrollen innehåller: en blandning av Wild-Type-klon och tre mutationskloner (V600E, V600E2 samt V600K). Följ anvisningarna i det allelspecifika PCR-protokollet för att använda denna kontroll. VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR EXPERIMENTEN MED ENBART KONTROLLSUBSTANSEN INNAN TESTNING GÖRS PÅ GENOMISKA PROVER 2.6 Storleksfraktionering för ACE Kit BRAF Exon 15 CE IVD 1. Ladda provnedbrytningsprodukterna i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för fragmentstorleksanalys. 2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och virtuella gelbilderna för att avgöra vilka prover som har mutationer. 3. För exempel på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en Caliper LabChip-plattform, läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip instrument. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 62 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE 3.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD Endast för yrkesmässig användning. Kliniker kan använda Transgenomics ACE (Allele Specific PCR Enrichment) Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att underlätta fastställande av om patient med icke småcellig lungcancer kommer att svara EGFR tyrosinkinashämmare (TKI) såsom erlotinib (Tarceva) och gefitinib (Iressa). ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD får inte användas för diagnos av lungcancer eller någon annan form av cancer. ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD är en analys som detekterar och bekräftar förekomst av somatiska mutationer i exon 21 L858R och L861Q samt deletioner i exon 19 i EGFR-genen. Alla deletioner som är större än 9 bp samt komplexa mutationer i EGFR exon 19 detekteras men kan inte sekvensbestämmas av dessa analyser. Specifikt fastställande av exakt exon 19-deletion behöver fastställas med DNA-sekvensering. Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kit EGFR Kit Exons 19 and 21 CE IVD bör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med icke småcellig lungcancer (NSCLC). Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att identifiera mutationer eller deletioner med detta kit endast är specifikt för de mutationer eller deletioner som kan upptäckas. Andra mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med dessa kit. Denna allelspecifika analys ger en hög känslighet för mutationsdetektion och därför bör dessa bruksanvisningar, procedurer och analysprotokoll följas för att minimera risken för kontamination. Detta kit bör endast hanteras i ett område som anses fritt från DNA-kontaminanter. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 63 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD 3.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD EGFR-genen kodar ett transmembrant glykoprotein, epidermal tillväxtfaktorreceptor, och som är en av cellens proteinkinaser. Den extracellulära domänen hosEGFR binder epidermal tillväxtfaktor (EGF); bindning av EGF till EGFR leder till dimerisering av EGFR, vilket stimulerar dess tyrosinfosforyleringsaktivitet vilket orsakar en signalkaskad i MAPK- och AKT-banorna och leder till cellförökning. Mutationer i EGFR återfinns i många typer av cancer. Många av dessa mutationer orsakar aktivering av EGFR utan EGF-bindning. Tyrosinkinashämmare (TKI:er) hämmar mutationsaktiverad EGFR genom att blockera anknutna signalbanor för cellförökning. Det finns två huvudklasser av TKI:er: (1) monoklonala antikroppshämmare cetuximab (Erbitux®) och panitumumab (Vectibix®.) som binds vid den extracellulära domänen och (2) små molekylhämmare, såsom gefitinib (Iressa®) och erlotinib (Tarceva®) som binds vid den interna kinasdomänen.1-4 Deletioner i EGFR exon 19 och punktmutationer i exon 21 kodoner 858 och 861 är de vanligaste aktiverande mutationerna vid kolon- och lungcancer1. Förekomst av mutationer i G719X (G719A, G719C eller G719S) i EGFR exon 18 ger känslighet för TKI:er.2,3 T790M-mutationen i EGFR exon 20 är den vanligaste mutationen som skapar resistens mot TKI:er.2,4 Analyserna ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD kan alla utföras under samma PCR-termocykelförhållanden. Läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip instrument. På grund av att dessa analyser har en hög känslighet, rekommenderas att laboratoriets installation är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 64 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD 3.3 Amplikonstorleksanalysen som används i ACE Kit for EGFR Exon 19 EGFR Exon 19-analysen amplifierar sekvensen där de flesta deletioner har observerats, nämligen kodoner 744-761. I prover som saknar deletion kommer en enstaka topp motsvarande WildType , 102 bp, att ses på elektroferogrammet i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem såsom Caliper LabChip MultiDX. Om en deletion förekommer syns två toppar: Wild-Type 102-bp-toppen (från normala celler i biopsiprovet) och en mindre topp som motsvarar deletionen. EGFR Exon 19 Positive Control är den övre änden av deletionsregionen 24 bp varvid den positiva kontrollen innehåller toppar om 78 bp för 24 bp-deletionen och 102 bp för den deletionsfria (Wild-Typekontrollen). Specifika deletionskontroller medföljer visserligen detta kit men de bör endast användas som storleksreferenser. De kan inte användas för att avgöra deletionens exakta natur, eftersom den specifika storleken hos en detekterad deletion inte beaktar om provets sekvens innehåller en deletion plus ett tillägg, t.ex. p.L747_A750>P, c.2239_2248TTAAGAGAAG>C. Provet måste sekvenseras för att fastställa den specifika deletion som detekterats. På grund av begränsningar i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, såsom Caliper LabChip MultiDX-systemets uppklarningsförmåga, kommer deletioner som är mindre än 9 bp inte att detekteras; dock är ~99,8% av beskrivna exon 19-deletioner och komplexa mutationer ≥9 bp, enligt COSMIC.1 Figur 3 Översikt av EGFR Exon 19 storleksbaserad PCR-analys Exon 19 Wild-Type Kodoner 744-761 102-bp PCR Product Exon 19 15-bp Deletion p.E746_A750del 78-bp PCR Product Analys med mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem 15-bp del 78-bp WT 102-bp EGFR Exon 19 Primer Mix bestående av: 5’ PCR Primer + 3’ PCR Primer Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 65 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD 3.4 Den allelspecifika analysen som används i ACE Kit för EGFR Exon 21 De två allelspecifika PCR-primrarna i detta kit kommer att amplifiera (1) EGFR Wild-Type och L858R (c.2573T>G) vilket ger amplikonstorlekar om 101 bp respektive 116 bp; och (2) EGFR Wild-Type och L861Q (c.2582T>A) vilket ger amplikonstorlekar om 138 bp respektive 153 bp. Dessa allelspecifika längdskillnader i PCR-produkter kan användas för att analysera prover i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. EGFR Exon 21 Primer-blandningar har två primrar: (1) för EGFR L858R är det en blandning av två framåtriktade primrar, en för Wild-Type och en för L858R samt en bakåtriktad primer; och (2) för EGFR L861Q är det en blandning av en framåtriktad primer och två bakåtriktade primrar, en för WildType och en för L861Q. Figur 3 Översikt av EGFR Exon 21 L858R och L861Q allelspecifika PCR-analyser L858R L858R Wild-Type CTG GAC Wild-Type L858R CGG GCC Wild-Type + L858R Analys med mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem Wild-Type 101 bp L858R 116 bp L861Q L861Q Wild-Type CTG GAC Wild-Type L861Q CAG GTC + EGFR L858 Primer Mix eller EGFR L861 Primer Mix bestående av: Analys med mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem Wild-Type 138 bp L861Q 153 bp Allelspecifika primrar plus "svansar" för storlekssärskiljning; + 5’ för L861 eller 3’ för L858 PCR-primrar Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD ! Obs! För att framgångsrikt använda detta kit rekommenderar vi att du läser igenom den här handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet 3.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA. Vidare krävs att användarna arbetar i DNA-arbetsstationer eller andra områden som kan rengöras ytterst noga för att minimera DNA-kontamination av reaktionerna. Läs i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser. 3.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD 3.5.1 Att tänka på avseende templat Analyserna ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD kan alla utföras under samma PCR-termocykelförhållanden. Se Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser. Obs! Användning av en PCR-arbetsstation med UV-lampa och HEPA-filter rekommenderas starkt. Alla ytor eller utrustningar som kommer att användas vid denna ACE-analys bör rengöras med en lösning som kommer att förstöra DNA som kan förekomma på sådana ytor. Det finns många lösningar som dekontaminerar DNA från laboratorieytor; dock fungerar de flesta av dessa inte för att förstöra DNA-fragment under 500 bp. Om laboratoriet arbetar med DNA som isolerats från FFPE-sektioner bör ytor och utrustning dekontamineras med en 10% blekmedelslösning som bereds varje vecka. Obs! Kontrollera att korrekt personlig skyddsutrustning används blekmedelslösningar. Läs i lokala säkerhetsrutiner för laboratoriet. vid hantering av Kvaliteten på extraherat templat-DNA som ska testas bör ha följande egenskaper: 1. Koncentrationen ska vara ≥ 12,5 ng/µl. 2. A260/280-förhållandet ska vara ≥ 1,8. 3.5.2 Allelspecifikt och Exons 19 and 21 storleksbaserat PCR-protokoll för ACE Kit EGFR 1. dNTPs-lösningen tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mM total deoxinukleotid (2,5 mM av var och en av de fyra deoxinukleotiderna). 2. EGFR-primrarna är förblandade singellösningar som innehåller: a. en universell framåtriktad primer och en universell bakåtriktad primer för specifik amplifiering av alla deletioner och komplexa mutationer i EGFR exon 19. b. en universell bakåtriktad primer och allelspecifika framåtriktade primrar för specifik amplifiering av EGFR exon 21 Wild-Type samt L858R-mutationen. c. 3. en universell framåtriktad primer och allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik amplifiering av EGFR exon 21 Wild-Type samt L861Q-mutationen. Ta upp lämplig Primer Mix, dNTPs, 10X PCR Buffer, DNA Polymerase samt lämpliga positiva kontroller ur frysen och tina på is. Vortexblanda var och en efter upptining i 5 - 10 sekunder och centrifugera därefter rören under en kort stund för att säkerställa att ingen reagens finns kvar på rörens lock eller på sidorna. a. Det finns tre Master Mix-blandningar när ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVDanalyserna genomförs: 4. i. EGFR exon 19-deletioner ii. EGFR exon 21 L858R iii. EGFR exon 21 L861Q Placera alla rören på is. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 67 ! Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD 5. Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för 10 (tio) reaktioner för varje analys: Antal reaktioner: (8 prover + 2 kit-kontroller) 10 Volymberäkning Vattenvolym (µl) 10X PCR Buffer (µl) dNTPs (µl) Lämplig EGFR Exon Primer Mix (µl) DNA Polymerase (µl) Total volym Master Mix 6. 335,0 50,0 40,0 50,0 5 480,0 Beräkna nödvändiga volymer för alla angivna Master Mix-blandningar med användning av ovanstående tabell. OBS! a. För ovanstående Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3, kommer ytterligare två reaktioner att behövas: i. En positiv kontroll för varje specifik reaktion. ii. En kontroll utan templat för varje specifik reaktion. OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 7. Bered lämpliga Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3 och lägg alla rör på is. 8. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med lämplig provinformation. 9. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning. 10. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till Master Mix-röret. 11. Tillsätt nödvändig mängd 10X PCR Buffer till Master Mix-röret. 12. Tillsätt nödvändig mängd dNTPs-lösning till Master Mix-röret. 13. Tillsätt nödvändig mängd av lämplig Primer Mix till Master Mix-röret. 14. Centrifugera DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder. 15. Knacka försiktigt på DNA Polymerase-röret för att blanda innehållet. 16. Centrifugera återigen DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder. 17. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. För inte ner pipettspetsen hela vägen ner i polymerasröret; den ska föras ner till strax under enzymlösningens yta. Detta förhindrar förlust av enzym som annars skulle fastna på pipettrörets plastyta. 18. Förslut Master Mix-röret. 19. Vortex-blanda Master Mix-röret i cirka10 sekunder före användning. 20. Förvara på IS tills det används. 21. Centrifugrea ner Master Mix-röret före alikvotering för att avlägsna eventuell lösning från rörets sidor eller lock. 22. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar eller rör och byt pipettspets om du använder en pipett med en kanal. Se till att det inte spiller/stänker mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. 23. ENDAST EFTER DET ATT STEG 22 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS POSITIVA KONTROLL-DNA ÖPPNAS. Tillsätt 2,0 µl vatten (kontroll utan templat) till passande brunn eller rör. När pipettering av kontroll utan templat är klar, ska brunnen förslutas Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 68 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt lock på 0,2 ml PCR-röret. Se till att proppen sluter till ordentligt. 24. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA som ska vara tinad (om DNA har förvarats frusen), vortexblandad och centrifugerad, till lämpliga brunnar. När provpipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 25. Tillsätt 2,0 µl lämplig positiv kontroll till lämplig brunn. När kontrollpipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 26. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 27. Centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattorna. 28. Inspektera plattorna eller 0,2 ml PCR-rören. Kontrollera att vätskan är på botten av brunnen. Centrifugera återigen i annat fall. 3.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR-protokoll 1. Använd följande termocyklerprotokoll för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD PCR. 2. Säkerställ att den totala programtiden är 2 timmar och 10 minuter, detta motsvarar rampningstiden 1,5 ºC/sekund. Inledande denaturering 95 C 5 minuter Amplifiering 38 cykler 95 C 30 sekunder 61 C 30 sekunder 72 C 25 sekunder Sista förlängning 1 cykel 72 C 2 minuter Förvaring ≤12 C Vänta TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till en vecka. 3. Analysera lämplig mängd på det mikrofluidiska kapillärelektroforesinstrumentet. a. För analys med ett Caliper LabChip MultiDX-instrument: överför 10 µl av varje PCR till en platta med 96 brunnar, tillsätt 15 µl vatten, blanda noga och ladda på instrumentet. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 69 Kapitel 3 ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD 3.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD tillhandahålls med lämpliga positiva kontroller för analys av EGFR exon 19-deletioner, EGFR Exon 21 L858R- eller L861Q-mutationer. Dessa består av plasmider med tillägg. De positiva kontrollerna innehåller blandningar av Wild-Type- och muterade sekvenser eller regioner som interrogeras av varje analys. Följ anvisningarna i det allelspecifika PCR-protokollet för att använda denna kontroll. VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR EXPERIMENTEN MED ENBART KONTROLLSUBSTANSEN INNAN TESTNING GÖRS PÅ GENOMISKA PROVER 3.7 Storleksfragmentering 1. Ladda provnedbrytningsprodukterna i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för fragmentstorleksanalys. 2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och de virtuella gelbilderna för att avgöra vilka prover som har mutationer. 3. För exempel på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en Caliper LabChip-plattform, läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip instrument. Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 4.1 Indikationer för användning av ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD Endast för yrkesmässig användning. Kliniker kan använda Transgenomics ACE (Allele Specific PCR Enrichment) Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD följt av fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att underlätta fastställande av om patient med icke småcellig lungcancer kommer att svara EGFR tyrosinkinashämmare (TKI) såsom erlotinib (Tarceva®) och gefitinib (Iressa®). ACE EGFR Exons 18 and 20 CE IVD får inte användas för diagnos av lungcancer eller någon annan form av cancer. ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD är analyser som detekterar och bekräftar förekomst av somatiska mutationer i exon 18 G719X och exon 20 T790M i EGFR-genen. Analysresultaten med detta kit kommer visserligen att visa patientens mutationsstatus, men andra kliniska faktorer bör beaktas. Resultat som erhålls med ACE Kit EGFR Kit Exons 18 and 20 bör inte vara den enda metod som används för att besluta om behandling av patienter med icke småcellig lungcancer (NSCLC). Det är viktigt att notera att användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för att identifiera mutationer eller deletioner med detta kit endast är specifikt för de mutationer eller deletioner som kan upptäckas. Andra mutationer i omgivande kodoner upptäcks inte med dessa kit. Denna allelspecifika analys ger en hög känslighet för mutationsdetektion och därför bör dessa bruksanvisningar, procedurer och analysprotokoll följas för att minimera risken för kontamination. Detta kit bör endast hanteras i ett område som anses fritt från DNA-kontaminanter. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 70 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 4.2 Principer för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD EGFR-genen kodar ett transmembrant glykoprotein, epidermal tillväxtfaktorreceptor, och som är en av cellens proteinkinaser. Den extracellulära domänen hosEGFR binder epidermal tillväxtfaktor (EGF); bindning av EGF till EGFR leder till dimerisering av EGFR, vilket stimulerar dess tyrosinfosforyleringsaktivitet vilket orsakar en signalkaskad i MAPK- och AKT-banorna och leder till cellförökning. Mutationer i EGFR återfinns i många typer av cancer. Många av dessa mutationer orsakar aktivering av EGFR utan EGF-bindning. Tyrosinkinashämmare (TKI:er) hämmar mutationsaktiverad EGFR genom att blockera anknutna signalbanor för cellförökning. Det finns två huvudklasser av TKI:er: (1) monoklonala antikroppshämmare cetuximab (Erbitux®) och panitumumab (Vectibix®.) som binds vid den extracellulära domänen och (2) små molekylhämmare, såsom gefitinib (Iressa®) och erlotinib (Tarceva®) som binds vid den interna kinasdomänen.1-4 Deletioner i EGFR exon 19 och punktmutationer i exon 21 kodoner 858 och 861 är de vanligaste aktiverande mutationerna i kolon- och lungcancer.1 Förekomst av mutationer i G719X (G719A, G719C eller G719S) i EGFR exon 18 ger känslighet för TKI:er.2,3 T790M-mutationen i EGFR exon 20 är den vanligaste mutationen som skapar resistens mot TKI:er.2,4 På grund av att dessa analyser har en hög sensitivitet, rekommenderas att laboratoriets installation är optimerad för att undvika korskontamination av prover eller kontroller. Ett exempel på ett idealiskt laboratoriearrangemang finns i Bilaga A–Laboratorieinstallation för PCR-analyser. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 71 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 4.3 G719 allelspecifik analys som används i ACE Kit för EGFR Exon 18 and 20 CE IVD Denna multiplexa allelspecifika PCR kommer att amplifiera EGFR Wild-Type-, G719A (c.2156G>C)-, G719C (c.2155G>T)- samt G719S (c.2155G>A)-sekvenser vilket ger amplikonstorlekar om 93 bp, 103 bp, 112 bp respektive 121 bp. Denna allelspecifika längdskillnad i PCR-produkter kan användas för att analysera prover i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. EGFR Exon 18 Primer Mix har fem primrar: en framåtriktad primer och fyra bakåtriktade primrar. Var och en av de fyra bakåtriktade primrarna är specifika för en allel – Wild-Type, G719A, G719C samt G719S. Figur 5 Översikt av EGFR Exon 18 G719 allelspecifik PCR-analys EGFR Positive Control G719A G719C Blandning av Wild-Type och EGFR G719A G719S WT Blandning av Wild-Type och EGFR G719C EGFR G719 Primer Mix bestående av: allelspecifika primrar plus "svansar" för storleksavskiljning + 5’ PCR-primer Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 72 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 4.4 T790M allelspecifik analys som används i ACE Kit EGFR Exon 18 and 20 CE IVD Denna multiplexa allelspecifika PCR kommer att amplifiera EGFR Exon 20 Wild-Type och T790M (c.2369C>T) vilket ger amplikonstorlekar om 108 bp respektive 124 bp. Denna allelspecifika längdskillnad i PCR-produkter kan användas för att analysera prover i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. EGFR Exon 18 Primer Mix har fem primrar: en framåtriktad primer och fyra bakåtriktade primrar. Var och en av de fyra bakåtriktade primrarna är specifika för en allel – Wild-Type and T790M. Figur 6 Översikt av EGFR Exon 20 T790M allelspecifik PCR-analys Analys med mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem EGFR T790 Primer Mix bestående av: allelspecifika primrar plus "svansar" för storleksavskiljning + 5’ PCR-primer När det allelspecifika termocyklerprogrammet är klart analyseras produkterna på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem, t.ex. Caliper LabChip MultiDX. ! Obs! För att framgångsrikt använda detta kit rekommenderar vi att du läser igenom den här handboken och noggrant följer alla instruktioner och riktlinjer. Nya användare bör utföra de kontrollexperiment som beskrivs i avsnittet 4.6 Användning av lämplig EGFR kontroll-DNA-plasmid. Vidare krävs att användarna arbetar i DNA-arbetsstationer eller andra områden som kan rengöras ytterst noga för att minimera DNA-kontamination av reaktionerna. Läs i Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analys beträffande förslag till laboratoriearrangemang. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 73 ! Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 4.5 Stegvisa anvisningar för ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 4.5.1 Att tänka på avseende templat Analyserna ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD kan alla utföras under samma PCR-termocykelförhållanden. Se Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser. Obs! Användning av en PCR-arbetsstation med UV-lampa och HEPA-filter rekommenderas starkt. Alla ytor eller utrustningar som kommer att användas vid denna ACE-analys bör rengöras med en lösning som kommer att förstöra DNA som kan förekomma på sådana ytor. Det finns många lösningar som dekontaminerar DNA från laboratorieytor; dock fungerar de flesta av dessa inte för att förstöra DNA-fragment under 500 bp5. Om laboratoriet arbetar med DNA som isolerats från FFPE-sektioner bör ytor och utrustning dekontamineras med en 10% blekmedelslösning som bereds varje vecka. Obs! Kontrollera att korrekt personlig skyddsutrustning används blekmedelslösningar. Läs i lokala säkerhetsrutiner för laboratoriet. vid hantering av Kvaliteten på extraherat templat-DNA som ska testas bör ha följande egenskaper: 1. Koncentrationen ska vara ≥ 12,5 ng/µl. 2. A260/280-förhållandet ska vara ≥ 1,8. 4.5.2 Allelspecifikt och storleksbaserat Exons 18 and 20 CE IVD 1. PCR-protokoll för ACE Kit EGFR dNTPs-lösningen tillhandahålls med en koncentrationsgrad av 10 mM total deoxinukleotid (2,5 mM av var och en av de fyra deoxinukleotiderna). 2. EGFR-primrarna är förblandade singellösningar som innehåller: a. en universell framåtriktad primer och 4 allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik amplifiering av EGFR exon 18 Wild-Type samt G719X-mutationer (G719A, G719C samt G719S). b. en universell framåtriktad primer och allelspecifika bakåtriktade primrar för specifik amplifiering av EGFR exon 20 Wild-Type samt T790M-mutationen. 3. Ta upp lämplig Primer Mix, dNTPs, 10X PCR Buffer, DNA Polymerase samt lämpliga positiva kontroller ur frysen och tina på is. Vortexblanda var och en efter upptining i 5 - 10 sekunder och centrifugera därefter rören under en kort stund för att säkerställa att ingen reagens finns kvar på rörens lock eller på sidorna. a. Det finns två Master Mix-blandningar när ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVDanalyserna genomförs: 4. i. EGFR Exon 18 G719X ii. EGFR Exon 20 T790M Placera alla rören på is. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 74 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 5. Använd följande tabell som en guide för beredning av Master Mix för 10 (tio) reaktioner för varje analys: Antal reaktioner: (8 prover + 2 kit-kontroller) 10 Volymberäkning Vattenvolym (µl) 10X PCR Buffer (µl) dNTPs (µl) Lämplig EGFR Exon Primer Mix (µl) DNA Polymerase (µl) Total volym Master Mix 6. 335,0 50,0 40,0 50,0 5 480,0 Beräkna nödvändiga volymer för alla angivna Master Mix-blandningar med användning av ovanstående tabell. OBS! b. För ovanstående Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3, kommer ytterligare två reaktioner att behövas: i. En positiv kontroll för varje specifik reaktion. ii. En kontroll utan templat för varje specifik reaktion. OBS! Beakta att en Master Mix-volym som är något större är denna beräkning krävs för att ge utrymme för visst svinn vid pipettering. 7. Bered lämpliga Master Mix-blandningar som beskrivs i steg 3 och lägg alla rör på is. 8. Märk 0,2 ml PCR-rör eller brunnar i en 96-hålsplatta med lämplig provinformation. 9. Märk 2,0 ml centrifugeringsrör för beredning av Master Mix-blandning. 10. Tillför nödvändig mängd molekylärbiologiskt vatten till Master Mix-röret. 11. Tillsätt nödvändig mängd 10X PCR Buffer till Master Mix-röret. 12. Tillsätt nödvändig mängd dNTPs-lösning till Master Mix-röret. 13. Tillsätt nödvändig mängd av lämplig Primer Mix till Master Mix-röret. 14. Centrifugera DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder. 15. Knacka försiktigt på DNA Polymerase-röret för att blanda innehållet. 16. Centrifugera återigen DNA Polymerase-röret i cirka 10 sekunder. 17. Tillsätt nödvändig mängd DNA Polymerase till Master Mix-rören. För inte ner pipettspetsen hela vägen ner i polymerasröret; den ska föras ner till strax under enzymlösningens yta. Detta förhindrar förlust av enzym som annars skulle fastna på pipettrörets plastyta. 18. Förslut Master Mix-röret. 19. Vortex-blanda Master Mix-röret i cirka10 sekunder före användning. 20. Förvara på IS tills det används. 21. Centrifugrea ner Master Mix-röret före alikvotering för att avlägsna eventuell lösning från rörets sidor eller lock. 22. Pipettera 48,0 µl Master Mix i lämpliga brunnar eller rör och byt pipettspets om du använder en pipett med en kanal. Se till att det inte spiller/stänker mellan hålen om en repeterpipett används. Förvara plattan på is. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 75 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD 23. ENDAST EFTER DET ATT STEG 22 HAR FULLBORDATS FÅR KITTETS POSITIVA KONTROLL-DNA ÖPPNAS. Tillsätt 2,0 µl vatten (kontroll utan templat) till passande brunn eller rör. När pipettering av kontroll utan templat är klar, ska brunnen förslutas med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt lock på 0,2 ml PCRröret. Se till att proppen sluter till ordentligt. 24. Tillsätt 2,0 µl av varje provtemplat-DNA som ska vara tinad (om DNA har förvarats frusen), vortexblandad och centrifugerad, till lämpliga brunnar. När provpipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 25. Tillsätt 2,0 µl lämplig positiv kontroll till lämplig brunn. När kontrollpipetteringen är klar, slut till alla brunnar med remsor med 8 proppar (om du använder en 96-hålsplatta) eller sätt på proppar på 0,2 ml PCR-rören. Se till att propparna sluter till ordentligt. 26. Vortexblanda (~1/2 hastighet) i 10 sekunder. 27. Centrifugera 0,2 ml PCR-rören eller plattorna. 28. Inspektera plattorna eller 0,2 ml PCR-rören. Kontrollera att vätskan är på botten av brunnen. Centrifugera återigen i annat fall. 4.5.3 Termocyklerprogram för allelspecifikt PCR-protokoll 3. Använd följande termocyklerprotokoll för ACE Kit EGFR Exons 19 and 21 CE IVD eller ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD PCR. 3.13 Säkerställ att den totala programtiden är 2 timmar och 10 minuter, detta motsvarar rampningstiden 1,5 ºC/sekund. Inledande denaturering 95 C 5 minuter Amplifiering 38 cykler 95 C 30 sekunder 61 C 30 sekunder 72 C 25 sekunder Sista förlängning 1 cykel 72 C 2 minuter Förvaring ≤12 C Vänta TIPS: I det här stadiet kan PCR-produkter förvaras vid -20 ºC eller kallare i upp till en vecka. 4. Analysera lämplig mängd på det mikrofluidiska kapillärelektroforesinstrumentet. a. För analys med ett Caliper LabChip MultiDX-instrument: överför 10 µl av varje PCR till en platta med 96 brunnar, tillsätt 15 µl vatten, blanda noga och ladda på instrumentet. 4.6 Användning av EGFR kontrollplasmid-DNA ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD tillhandahålls med lämpliga positiva kontroller för analys av EGFR exon 18 G719X- samt EGFR Exon 20 T790M-mutationer. Dessa består av plasmider med tillägg. De positiva kontrollerna innehåller blandningar av Wild-Type- och muterade sekvenser eller regioner som interrogeras av varje analys. Följ anvisningarna i det allelspecifika PCR-protokollet för att använda denna kontroll. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 76 Kapitel 4 ACE Kit EGFR Exons 18 and 20 CE IVD VI REKOMMENDERAR STARKT ATT NYA ANVÄNDARE FÖRST UTFÖR EXPERIMENTEN MED ENBART KONTROLLSUBSTANSEN INNAN TESTNING GÖRS PÅ GENOMISKA PROVER 4.7 Storleksfragmentering 1. Ladda provnedbrytningsprodukterna i ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem för fragmentstorleksanalys. 2. Analysera de resulterande elektroferogrammen och de virtuella gelbilderna för att avgöra vilka prover som har mutationer. För exempel på resultat av mikrofluidisk kapillärelektrofores med användning av en Caliper LabChip-plattform, läs i Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip instrument. Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument 5.1 Analys av resultat Granskaren ska visuellt undersöka gelbilder och elektroferogram för alla prover för att fastställa förekomst/frånvaro av en mutation i den angivna regionen som motsvarar den positiva kontrollen i specifik ACE Kit. När en visuell inspektion av gelbilder och elektroferogram utförs bör banorna för No Template Control och Positive Control undersökas först för att fastställa att: det inte förekommer kontaminering i kontrollen utan templat. den positiva kontrollen har de specifika toppar (elektroferogram) eller band (gel) som genereras av den specifika ACE Kit som används. alla prover utan bevis för en Wild-Type-topp flaggas för uppföljning eftersom DNA som isolerats från FFPE-sektioner av tumörer som regel inte är 100% muterad. De positiva kontrollerna används för att identifiera regionen i elektroferogrammet där specifika mutationer kan fastställas med hjälp av inriktning med motsvarande toppar i den positiva kontrollen för det specifika kittet. 5.2 Granskning av resultat För jämförelse och kontroll ska positiva kontroller och kontroller utan templat ALLTID beredas för varje ACE Kit och köras i samma provplatta i det mikrofluidiska kapillärelektroforessystemet. I analysstadiet och i följande exempel användes ett Caliper LabChip-system. Elektroferogramkurvorna för positiv kontroll visar placeringen av de specifika topparna för de angivna mutationerna eller det generella området för deletionerna för EGFR exon 19. Kontrollen utan templat kan ha några toppar på grund av artefakter från PCR-primern, men inga provtoppar får finnas. Detta undersöker om det finns kontaminerande DNA i provet eller i området. Om kontrollen utan templat är positiv, är hela analysen ogiltig och måste upprepas. Om antingen elektroferogrammen eller de virtuella gelbilderna som erhållits från positiva kontrollDNA inte motsvarar beskrivna resultaten, se Bilaga B-Felsökningsguide eller kontakta Transgenomics tekniska support innan ytterligare åtgärder i provanalysen vidtas. Nedanstående exempel ges endast i illustrerande syfte och ska INTE användas för att avgöra identiteten hos någon specifik mutation i ett prov. Bekräftelse av en mutations identitet genom jämförelse av den positiva kontrollens toppmönster med provets i samma analysfönster är nödvändigt för att otvetydigt fastställa de specifika basförändringarna för punktmutationerna och för förekomst av en deletion i EGFR Exon 19 ACE-analysen. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 77 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument Prov 4 Prov 3 Prov 2 Prov 1 ACE Kit BRAF Positive Control No Template Control HT DNA 1K Ladder I alla exempel följdes tillvägagångssättet som beskrivs i avsnittet Stegvisa anvisningar för det ACE Kit som användes till fullo. Övre markör BRAF V600WT BRAF V600E2 BRAF V600E BRAF V600K Nedre markör Figur 7: En Caliper LabChip gelbild av analys av BRAF Exon 15 för V600WT(132 bp), V600E2 (122 bp), V600E (112 bp) och V600K (103 bp). I ovanstående exempel innehåller kontrollen utan templat inga band och det förekommer därför ingen kontamination av proverna. Den positiva kontrollen visar de 4 distinkta band som genererats av BRAF ACE Kit-analysen där banden visar WT och de tre mutationerna som detekterats vid V600. Det finns synliga band ovanför den nedre markören och dessa är primerartefakter. Banden med högre molekylvikt är artefakter av allelspecifik PCR-primning oberoende av om den förekommer en mutation. Prov 1 och 3 har band som är i linje med V600E-mutationen medan prov 2 har ett band som är i linje med V600K-mutationen. Alla prover harV600WT-bandet eftersom de alla kommer från DNA som isolerats från FFPE-tumörvävnad. Mutationsresultaten blir följande: Prov 1 – V600E Prov 2 – V600K Prov 3 – V600E Prov 4 – Wild-Type vid V600 Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 78 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument 5.3 Tolkning av elektroferogramresultat Den visuella granskningen av gelbilderna underlättar vid fastställande av förekomst eller frånvaro av mutationstoppar i elektroferogrambilderna. Det kan vara bäst att förskjuta elektroferogrammen så att inriktning av provtopparna med topparna i den positiva kontrollen kan användas för att bestämma eventuella mutationer i ett provelektroferogram. Figur 8 nedan visar elektroferogrammen för samma prover som visades i gelbildsläget ovan. Nedre markör Övre markör Prov 4 Prov 3 Prov 2 112 bp 122 bp Prov 1 132 bp 103 bp ACE Kit BRAF Inriktad tid Positive Control NTC Inriktad tid Figur 8: Elektroferogrammen för samma provuppsättning som visades på gelbilden i figur 7. Toppmönstren i proverna 1 och 3 (bruna och rosa linjer) är i linje med V600WT- och V600Etopparna för BRAF Positive Control (röd linje). Därför innehåller dessa prover V600E-mutationen. Toppmönstret för prov 2 (grön linje) är i linje med V600 Wild-Type- och V600K-topparna i den positiva kontrollen (röd linje) och därför innehåller detta prov en V600K-mutation. Prov 4 (mörkbrun linje) är endast i linje med V600WT-toppen och därför finns det inte någon V600 punktmutation i detta prov. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen som markerats med en röd ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 79 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument Nedre markör Övre markör Prov 4 Prov 3 Prov 2 78 bp Prov 1 ACE Kit EGFR Exon 19 Positive Control 102 bp Inriktad tid Figur 9: Elektroferogram av DNA från FFPE-tumör som analyserats med ACE Kit EGFR Exon 19-analysen. Toppmönstren i proverna 1 och 2 (bruna och gröna linjer) är i linje med EGFR Exon 19 Wild-Type (utan deletion) och i regionen mellan EGFR Exon 19 Wild-Type och 24 bp deletionstopparna i EGFR Exon 19 Positive Control (röd linje). Därför innehåller dessa prov EGFR Exon 19-deletioner eller komplexa mutationer. Toppmönstret för prov 3 och 4 (rosa och blå/bruna linjer) är i linje med Wild-Type (utan deletion) Positive Control (röd linje) och därför finns det inga deletioner eller komplexa mutationer i dessa prov. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen som markerats med en röd ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 80 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument Region för primerartefakt Nedre markör Övre markör Prov 4 Prov 3 Prov 2 101 bp 116 bp Prov 1 ACE Kit EGFR Exon 21 L858 Positive Control Inriktad tid NTC Figur 10: Elektroferogram av DNA från FFPE-tumör som analyserats med ACE Kit EGFR Exon 21-analys för L858R. Toppmönstren i prov 2, 3 och 4 (gröna, rosa och mörkbruna linjer) är i linje med EGFR Exon 21 L858 Wild-Type- och L858R-topparna för EGFR Exon 21 L858 Positive Control (röd linje). Därför innehåller dessa prov EGFR exon 21 L858R-mutationer. Prov 1 (mörkbrun linje) är endast i linje med L858WT-toppen och därför finns det inte någon L858R punktmutation i detta prov. Proverna 2 och 4 har låga och mycket låga toppar för L858Rmutationen; dock är förekomst av mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för prov 1 med elektroferogrammen för prov 2 och 4. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen som markerats med ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 81 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument Region för primerartefakt Nedre markör Övre markör Prov 4 Prov 3 Prov 2 Prov 1 ACE Kit EGFR Exon 21 L861 Positive Control Inriktad tid 153 bp 138 bp NTC Inriktad tid Figur 11: Elektroferogram av DNA från FFPE-tumör som analyserats med ACE Kit EGFR Exon 21-analys för L861Q. Toppmönstren i prov 2 och 4 (gröna och mörkbruna linjer) är i linje med EGFR Exon 21 L861 Wild-Type- och L861Q-topparna för EGFR Exon 21 L861 Positive Control (röd linje). Därför innehåller dessa prov EGFR exon 21 L861R-mutationer. Prov 1 och 3 (bruna och rosa linjer) är endast i linje med L861WT-toppen och därför finns det inte någon L861Q punktmutation i detta prov. Prov 2 har låga toppar för L861Q-mutationen; dock är förekomst av mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för prov 1 med elektroferogrammen för prov 2. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen som markerats med en röd ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 82 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument Nedre markör Övre markör Prov 4 Prov 3 Prov 2 Prov 1 ACE Kit EGFR Exon 18 Positive Control Inriktad tid NTC 93 bp G719X G719A, G719C, G719S Figur 12: Elektroferogram av DNA från FFPE-tumör som analyserats med ACE Kit EGFR Exon 18-analys för G719X. Toppmönstren i prov 2, 3 och 4 (gröna, rosa och mörkbruna linjer) är i linje med EGFR Exon 18 G719 Wild-Type- och G719X-topparna för EGFR Exon 18 G719 Positive Control (röd linje). Således innehåller dessa prov EGFR Exon 18 G719X-mutationer (det finns viss korshybridisering med G719C och antingen G719S eller G719S och därför kan man inte alltid enkelt avgöra exakt vilken G719-mutation som förekommer. I det här fallet är prov 2 och 4 G719S och prov 3 är G719A). Prov 1 (brun linje) är endast i linje med G719WT-toppen och därför finns det inte någon G719X punktmutation i detta prov. Prov 4 har en låg topp för G719Xmutationen; dock är förekomst av mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för prov 1 med elektroferogrammen för prov 4. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen som markerats med ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 83 Kapitel 5 Analys och tolkning av Fragment Dimensionering Använda Caliper LabChip Instrument Region för primerartefakt Prov 4 Nedre markör Övre markör Prov 3 Inriktad tid Prov 2 Inriktad tid Prov 1 ACE Kit EGFR Exon 20 Positive Control NTC 108 bp 124 bp Figur 13: Elektroferogram av DNA från FFPE-tumör som analyserats med ACE Kit EGFR Exon 20-analys för T790M. Toppmönstren i prov 1 och 2 (bruna och gröna linjer) är i linje med EGFR Exon 20 T790 Wild-Type- och T790M-topparna för EGFR Exon 20 T790 Positive Control (röd linje). Därför innehåller dessa prov EGFR exon 20 T790M-mutationer. Prov 3 och 4 (rosa och mörkbruna linjer) är endast i linje med T790WT-toppen och därför finns det inte någon T790M punktmutation i dessa prov. Proverna 1 och 2 har låga toppar för T790M-mutationen; dock är förekomst av mutation tydlig vid jämförelse mellan elektroferogrammen för prov 4 med elektroferogrammen för prov 1 och 2. Det elektroferogram som visas till höger är en förstoring av regionen som markerats med en ruta i huvudelektroferogrammet. De övre och nedre markörerna som visas är artefakttoppar på grund av PCR-primrarna och artefakttoppar med högre molekylvikt på grund av de allelspecifika PCR-primningsreaktionerna. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 84 Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser Kapitel 6 Analys av alla ACE Kit EGFR-analyser Eftersom alla termocykelförhållanden är desamma för alla ACE Kit EGFR-analyserna kan alla analyserna göras samtidigt på en platta. 1 A: POS CTRL EGFR Ex 18 G719 2 Prov 3 POS CTRL EGFR Ex 20 T790 4 Prov 5 POS CTRL EGFR Ex 19 DEL 6 Prov 7 POS CTRL EGFR Ex 21 L858 8 Prov 9 POS CTRL EGFR Ex 21 L861 10 11 Tom Prov 12 NTC EGFR Ex 18 G719 Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Tom NTC EGFR Ex 20 T790 Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Tom NTC EGFR Ex 19 DEL Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Tom NTC EGFR Ex 21 L858 Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Tom NTC EGFR Ex 21 L861 F: Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Tom Tom G: Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Tom Tom H: Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov Prov B: C: B: E: Tom Tom För felsökning av analyserna, se Bilaga B – Felsökning eftersom många av felsökningsmomenten handlar om behov av DNA av hög kvalitet eller felsökning av det specifika mikrofluidiska kapillärelektroforesinstrumentet. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 85 Kapitel 7 Referenser för ACE Kits Kapitel 7 Referenser för ACE Kits 1. Dhomen N et al (2012) Therapeutic targeting of the epidermal growth factor receptor in human cancer. Crit. Rev. Oncog. 17(1):31-50. 2. COSMIC Catalogue of Somatic Mutations in http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/gene/analysis?ln=EGFR#histo. Cancer – EGFR 3. Wu J et al (2011) Effectiveness of tyrosine kinase inhibitors on "uncommon" epidermal growth factor receptor mutations of unknown clinical significance in non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 17(11):3812-21. 4. Pao W et al (2005) Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain. PLoS Med. 2(3) e73. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 86 Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analyser Bilaga A – Laboratorieinstallation för PCR-analyser För att erhålla tillförlitliga och kontaminationsfria PCR-resultat bör god laboratoriesed iakttas vid planering av PCR-laboratoriet. När laboratoriet planeras ska man beakta behovet av separationsutrymme mellan beredning av PCR-amplifiering och aktiviteter efter amplifiering. Det är viktigt att separera (i) DNA-isolering: (ii) PCR-amplifiering; och (iii) aktiviteter efter PCR, t.ex. att öppna rör med amplifierade prover vid förberedelse för att köra geler och förbereda andra analyser, t.ex. SURVEYOR Nucleasenedbrytning och DNA-sekvensering. Det är också viktigt att laboratorieutrustning och material tilldelas varje område och att de endast används i det specifika området. Avtorkning av alla ytor med 10% (v/v) blekmedel, som bereds ny varje vecka, kommer att underlätta eliminering av DNA-fragment, ≤ 500 bp, som templat för PCR. Det kan vidare vara gynnsamt att behandla plastmaterial och lösningar med UV-ljus med kort våglängd i 7-10 minuter med användning av en UV Crosslinker. Obs! Enzymer och DNA som ska amplifieras får inte behandlas med UV-ljus. Användning av skyddskläder, frekventa byten av handskar samt att torka av handskarna med 10% (v/v) blekmedelslösningen kommer att vara till stor hjälp för att reducera kontamination. Det bör minst finnas ett arrangemang som liknar det tvårumsarrangemang som visas i nedanstående diagram som är specifikt utformat för PCR och analys med SURVEYOR Nuclease. Organisation av PCR-laboratorium Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 87 Bilaga B – Felsökningsguide Bilaga B – Felsökningsguide Effektiv användning av alla RAScan Kits följt av fragmentstorleksbestämning eller ACE Kits med användning av ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem är beroende av framgångsrikt genomförande av ett antal moment. Ett av de mest avgörande stegen är PCR-amplifiering som måste resultera i produktion av specifika, jämnstora DNA i tillräcklig kvantitet för att kunna detekteras efter hybridisering och klyvning. Detta beror i sin tur på kvaliteten på det ursprungliga provet. Att utföra analysen med DNA som inte motsvarar kriterierna för kvalitet och kvantitet rekommenderas inte. Obs! Om det är första gången du använder RAScan eller ACE Kits, bör du utföra experimenten i avsnitten Användning av kontrollplasmid-DNA när du har läst igenom och förstått avsnittet Stegvisa anvisningar som motsvarar de RAScan eller ACE Kits som används. Se till att du har resultaten från kontroll-DNA innan du kontaktar Transgenomics tekniska support. Denna Felsökningsguide omfattar en rad problem som du kan komma att stöta på medan du använder RAScan eller ACE Kits för fragmentstorleksbestämning på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem samt förslag på hur du kan lösa dem. De exempel som visas kommer från både KRAS- och NRAS-exoner. Beträffande den modell av mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem som har använts, läs i tillverkarens Bruksanvisning för detaljerad information beträffande användning och underhåll av instrumentet. Handboken innehåller specifika processer för att kontrollera och underhålla mikrochipprestanda och inkluderar felsökningsinformation. Problem 1 — RAScan och ACE Kits Låg PCR-avkastning eller ingen PCRprodukt vid analys på agarosgel eller på mikrofluidiskt kapillärelektroforesinstrument Robust och svag PCR-AVKASTNING God Dålig PCRPCRavkastning avkastning MÖJLIG ORSAK LÖSNING Dålig kvalitet på DNA templat Gör om reningen av DNA; gå igenom den använda reningsmetoden Om FFPE-extraherat DNA är alltför fragmenterat kan alternativa FFPEblock krävas. För mycket RNA i provet som orsakar för högt beräknad DNAkoncentration. Upprepa RNase-behandling av DNA-provet och rena DNA:t på nytt. Termocyklern är inte kalibrerad. Kalibrera termocyklern. Otillräckligt templat. Öka mängden templat. med RNAband Obs! Högkvalitativ DNA från FFPE ska användas. DNA bör ha en koncentration på 12,5 ng/µl enligt bestämning genom absorption av 260 nm, ha en absorptionsgrad vid 260/280 nm som överstiger 1,8 samt vara högre än 90% DNA (d.v.s. fritt från den mesta tRNA- och rRNAkontaminationen enligt visuell bedömning på agarosgel). Förvara DNA-prover vid -20 °C till -80 °C. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 88 Bilaga B – Felsökningsguide Analys av DNA-templat som extraherats från paraffininbäddad vävnad kräver flera försiktighetsåtgärder. Extraherat DNA kan behandlas med uracil DNA-glykosylas (UNG) för att förebygga amplifiering av DNA-fragment som innehåller deaminerade C-rester. En hög procentandel av det A260-absorberande material som extraheras från paraffininbäddad vävnad kommer ofta inte att amplifieras väl under PCR. Genom att använda en större mängd DNA till starten kan man ofta producera en tillräcklig mängd med amplifieringsprodukt. FFPE-tumörsektioner med en hög andel tumörceller bör väljas i största möjliga mån. Mikrodissektion kan också användas men detta är tidsödande och rekommenderas inte vid allmän laboratorietestning. Problem 2 — RAScan Kits Flera PCR-produkter vid analys på agarosgel FLERA PCR-PRODUKTER God PCR med PCRflera avkastning band MÖJLIG ORSAK LÖSNING För låg härdningstemperatur Kontrollera termocyklern kalibrering. Obs! PCR ska producera en tillräckligt stor avkastning (>40 ng/µl) av EN ENSTAKA amplifierad typ av korrekt storlek. DNA-polymeras och DNA- polymeras 10X PCR-buffert som tillhandahålls i detta kit måste användas för PCR. Amplikoner från kontrollerna bör brytas ned med SURVEYOR Nuclease och köras parallellt för att exkludera missvisande bakgrundsstörningar genom visuell jämförelse av kurvornas profiler. Granska varje amplifierad DNA-produkt före nedbrytning med gelelektrofores eller mikrofluidisk kapillärelektrofores för att säkerställa att det är en enstaka typ av förväntad storlek. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 89 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 3 — RAScan Kits: Inga klyvningsprodukter observeras vid analysen efter behandling av heteroduplex med SURVEYOR Nuclease INGA KLYVNINGSPRODUKTER Position för saknade heteroduplex Nedre markör Ej beskuren homoduplextopp MÖJLIG ORSAK LÖSNING Andelen avvikande mål är för liten. Kontrollera analysen med hjälp av kontrollsubstanserna. Ineffektiv formering av heteroduplex Följ korrekt PCR- och hybridiseringsprocess . Använd nyss hybridiserad DNA vid SURVEYOR Nucleasenedbrytning. Övre markör Utför ny PCRamplifiering med genom att (1) använda samma kvantitet DNAtemplat; (2) öka mängden start-DNA; eller (3) isolera färsk DNA från samma eller en annan FFPEsektion. Overksam SURVEYOR Nuclease Utför kontrollreaktionen för att kontrollera enzymfunktionen. Använd endast färsk SURVEYOR Nuclease Master Mix. Obs! SURVEYOR Nuclease klyver huvudsakligen avvikelser i heteroduplex. Andelen heteroduplex i förhållande till homoduplex i det hybridiserade provet avgör storleken på SURVEYOR Nuclease-nedbrytningssignal. Om KRAS- eller NRAS-mutationen förekommer i väldigt låga koncentrationer i det genomiska DNA-provet, kan signalen vara för svag för att ge ett positivt resultat. Det är viktigt att se till att hybridiseringssteget ingår i termocykelprogrammet (se Amplifieringsprotokoll-avsnittet för ifrågavarande kit) för att maximera effektiviteten i heteroduplexformationen. Heteroduplex är mycket ineffektivt formade under vanliga PCRreaktioner. Varning! Kommersiellt tillgänglig PCR-buffert varierar dramatiskt med avseende på innehåll och formlerna är ofta inte definierade av leverantörerna. Ett flertal buffertar är INTE kompatibla med SURVEYOR Nuclease på grund av pH-värdet eller förekomsten av tillsatser, ytaktiva ämnen eller andra varumärkesskyddade ingredienser. ANVÄND INTE någon annan polymeras eller 10X polymerasbuffert än de som tillhandahålls i detta kit. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 90 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 4 — RAScan Kits: Höga bakgrundsstörningar efter behandling med SURVEYOR Nuclease HÖGA BAKGRUNDSSTÖRNINGAR Hög MÖJLIG ORSAK LÖSNING Suboptimalt hybridiseringssteg Gör så här: bakgrundsstörning Se till att DNAkoncentrationen är i nivån ≥25 ng/µl för PCR-reaktionen. Upprepa steget för bildning av heteroduplex och var noga med att följa rekommenderad metod, se 12.7.1. Nedre Övre markör markör Obeskuren homoduplex- Mängden DNA är för låg. Kontrollera avkastning och kvalitet på DNA-templat Obestämda PCRprodukter. Kontrollera avkastning och kvalitet på DNA-templat. SURVEYOR Enhancer W2 och/eller SURVEYOR Enhancer Cofactor har förlorat verkan. Kontrollera kittets utgångsdatum Obs! Det kan hända att SURVEYOR Nuclease rispar dubbelsträngad DNA vid slumpvist matchade ställen. Detta orsakar bakgrundsstörningar efter nedbrytning. Denna aktivitet dämpas av SURVEYOR Enhancer W2 och dess Cofactor utan att ha andra negativa effekter på klyvningen av avvikelser. SURVEYOR Enhancer W2 och SURVEYOR Enhancer Cofactor inkluderas i detta kit och ska alltid användas. Då denna typ av rispning fortfarande förekommer, genereras mindre toppar på ett mikrofluidiskt kapillärelektroforessystem. Nedbrytningen av Wild Type-kontrollen kommer att visa dessa mindre toppar. Denna jämförelse används för att söka efter skillnader i elektroferogrammönstren mellan Wild-Type-kontrollen och provet och används vid jämförelse av provets mönster med WildType-kontrollen. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 91 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 5 — ACE Kits: Extra toppar på elektroferogrammet på grund av allelspecifik primning Extra toppar MÖJLIG ORSAK Primer- Artefakt- dimers toppar Extra toppar är vanliga på grund av primning av de allelspecifika reaktioner. Dessa är i distinkta regioner utanför de storlekar i den positiva kontrollen som används för mutationsbestämni ng Flera toppar i mutationsbestämni ngsregionen indicerar möjlig kontamination av kittets positiva kontroll Inriktad tid (sek.) LÖSNING Dessa regioner ignoreras och stör inte de specifika bestämningarna av mutationer eller deletioner Dekontaminera området och upprepa ACE-reaktionerna Obs! På grund av multiplexreaktionerna finns det potentiella PCR-biprodukter som kan vara mindre eller större än de toppar som används för att bestämma mutationen. Dessa toppar ignoreras eftersom de är artefakter av PCR-reaktionen. Problem 6 — RAScan Kits: SURVEYOR Nuclease-nedbrytningstoppar i negativa kontroller NEDBRYTNINGSTOPPAR KONTROLLER I NEGATIVA Nedbrytnings toppar Nedre markör Ej beskuren homoduplextopp MÖJLIG ORSAK LÖSNING Kittets innehåll har kontaminerats med KRAS- eller NRASamplikoner eller plasmidkontroller Kassera alla kitkomponenter och använd ett nytt kit. Kontakta Transgenomic tekniska support för att diskutera eventuella orsaker och källor till kontaminationen Övre markör Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 92 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 7 – RAScan Kits: Misslyckade SURVEYOR Nuclease-resultat SURVEYOR NUCLEASENEDBRYTNINGEN AV POSITIVA KONTROLLER HAR MISSLYCKATS Positiv kontroll Wild-Type-kontroll MÖJLIG ORSAK LÖSNING SURVEYOR Nuclease tillsattes inte Bryt ned ett nytt prov SURVEYOR Nucleasenedbrytning skedde vid fel temperatur Bryt ned ett nytt prov Problem 8 — ACE Kits: Misslyckade resultat ACE PCR-ANALYS MISSLYCKADES Positiv kontroll Prov 1 Prov 2 (misslyckad analys) Kontroll utan templat MÖJLIG ORSAK LÖSNING Prov-DNA tillsattes inte Analysera provet på nytt Prov-DNA av av otillräcklig kvalitet eller kvantitet Kontrollera DNAkvaliteten och -kvantiteten och isolera vid behov DNA på nytt från en annan FFPE-sektion och analysera om. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 93 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 9 — RAScan och ACE Kits: Oväntade toppar i elektroferogrammet YTTERLIGARE TOPPAR ELLER ARTEFAKTTOPPAR RAScan Kits Oväntade nedbrytnings - Ej beskuren homoduplextopp MÖJLIG ORSAK LÖSNING Mutation på ovanlig plats. Sekvensera provet för att bekräfta mutation. Toppar som är mycket smala och som är slumpvis placerade på grund av damm i provet/skatter i detektorn. Kontrollera att rör, lösningar o.s.v. är fria från damm och analysera proverna igen. Positiv kontrolltoppar Wild-Type-kontroll Nedre markör RAScan och ACE Kits Övre markör Specifika toppar av fördefinierad storlek, t.ex. överföring av ladder-DNA. Rengör mikrochip, munstycken och luftcylinder. Ring för att begära service om detta fortsätter. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 94 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 10 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller (mikrokapillär elektrofores) NEDBRYTNINGSMÖNSTER SOM ÖVERENSSTÄMMER MED FÖREKOMST AV BLANDADE POSITIVA KONTROLLERS STÄMPLADE REGION OCH WILD-TYPE HETERODUPLEX MÖJLIG ORSAK LÖSNING Exempel på SURVEYOR Nuclease-nedbrytning med stämplad plasmid i ett prov. Dålig pipetteringsteknik Var försiktig vid pipettering för att undvika korskontamination. Nedre markör Flera toppar som pekar på kontamination Ej beskuren homoduplextopp Prov med flera mutationer eller kontamination Muterat prov Wild-Type-prov Normala giltiga provtoppar Den övre kurvan (grön linje) är ett exempel som kan vara (1) ett prov med mer än en mutation eller (2) potentiell kontamination. Om samma mönster observeras i prover i intilliggande brunnar eller i alla proverna har kontamination skett. Kontrollera kontrollstämplarna s sekvensregioner för kontamination av positiv kontroll. Skicka prover för sekvensering och kontrollera stämpelregionens sekvens. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 95 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 11 — RAScan Kits: Kontamination av prover med kitkontroller (sekvensering) ANALYS AV "STÄMPLAD" REGION AV SEKVENSERINGSELEKTROFERO GRAM VISAR SE EXEMPEL NEDAN: MÖJLIG ORSAK LÖSNING Dålig pipetteringsteknik Var försiktig vid pipettering för att undvika korskontamination. Arbetet sker inte i en UV-arbetsstation Kontrollera att arbetsmiljö och arbetsområdet är lämpliga Laboratoriet saknar lämpligt luftflöde Kontrollera kontrollstämplarnas sekvensregioner för kontamination av muterad kontroll. Det saknas separat laboratorieområde för PCR-förberedelse och arbete efter PCR Kontakta Transgenomic teknisk support: [email protected] EXEMPEL: Sekvensering visar att NRAS Exon 2 stämpelregioner kontaminerar ett prov. Kodon 12 och 13-region av NRAS exon 2 Plasmidkontrollens "Stämpel"-region av NRAS exon 2 Giltigt prov: Provet är Wild-Type (GGT GGT) och ingen "stämpel" (ACA) Kontaminerat: Provet är Wild-Type (GGT GGT) "Stämpeln" (A/TC/GA/T) förekommer Giltigt prov: Provet är muterat (GGT GG/AT) och ingen "stämpel" (ACA) Kontaminerat: Provet är muterat (GG/AT GGT). "Stämpeln" (A/TC/GA/T) förekommer Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 96 Bilaga B – Felsökningsguide Problem 12 — RAScan och ACE Kits: Mikrofluidisk kapillärelektrofores, t.ex. Caliper LabChip Problem Avvikande elektroferogram eller storleksbestämnings-ladders; Varierande retentionstid som inte korrigeras av den automatiska inriktningskomponenten i instrumentets programvara; Problem rörande baslinje MÖJLIG ORSAK LÖSNING Alla problem Kontakta teknisk hjälp för ditt kapillärelektroforesinstrument. Chip Chip är ömtåliga och därför måste de hanteras med försiktighet. Lösningen på ett dåligt chip är att byta ut det mot ett nytt (ha ett extra chip till hands) Gel Buppeltoppar och damm Baslinjen sjunker för den övre markören och ibland för de största fragmenten Programvaran flaggar som regel dessa med ett rött eller gult "!" på gelen, plattans layout och kurvans namn. I detta elektroferogram visar den nedre markören en liten artefakt, med huvudprodukt och övre markör följda av en sjunkande kurva. Varierande retentionstid som inte korrigeras av den automatiska inriktningskompone nten i instrumentets programvara Gelen kan ta slut snabbt eftersom det inte finns någon möjlighet att anpassa till körningar med olika antal prover. Dessa är sällsynta men kan uppstå och därför ska man vara försiktig när man laddar prover och beakta den omgivning där instrumentet är placerat. Indikation på felfunktion i chipet. Ett nytt chip måste beställas. Bruksanvisning till Transgenomic Kits för detektion av mutationer med användning av mikrofluidisk kapillärelektrofores Sid 97
© Copyright 2024