1. No category

Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Page
Udarbejdet i et samarbejde mellem: Lisbeth Thestrup, Lone Als Egebo, Rebekka Neergaard, Maj
Thorup Nielsen, Poul Gerhard Pedersen, Benthe Schou, Jakob Lund, Camilla Kær Mørkholt, Jørn M.
Clausen og Lars Haastrup Pedersen.
1
Ekstraktion og oprensning af proteiner fra
oksekød
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
1. Introduktion
Myoglobins struktur og funktion
Oprensning af proteiner er en basal og essentiel proces i den bioteknologiske forskning og industri. I dette
eksperiment skal vi oprense proteinet myoglobin fra oksekød.
Myoglobin er et iltbindende globulært protein på 153 aminosyrer med en molekylvægt på 17.053 Dalton
(units) eller 17,1 kDa (Figur 1)
Figur 1: Proteinstruktur af myoglobin: oxygen-transportør i muskelvæv, globulært protein, enkelt peptidkæde på 153 aminosyrer, bygget op af 8 α-helices, indeholder en hæm-gruppe (Fe(II)-bindende porphyrin) som prostetisk gruppe
Især dyrs muskelvæv er rig på myoglobin, da arbejdende muskler har et højt energikrav og dermed et højt
iltforbrug. Ilten føres rundt i blodet og ud til musklerne vha. hæmoglobin. Her overtager myoglobin ilten fra
hæmoglobin og transporterer det til muskelcellernes mitochondrier, hvor respirationen og energidannelsen
foregår.
Mængden af myoglobin i den humane muskulatur varierer alt efter hvor meget musklerne bruges. Trænede
muskler har eksempelvis en højere koncentration af myoglobin end utrænede. Hvis musklen er i hvile, fungerer myoglobin som et iltlager, dvs. jo mere myoglobin der findes i musklerne jo større iltlager.
Musklernes rødlige farve skyldes, at myoglobin indeholder en jernholdig gruppe den såkaldte hæm-gruppe.
Farveintensiteten afhænger derfor af myoglobin mængden. Eksempelvis er musklerne hos hvaler nærmest
brune pga. den høje koncentration af myoglobin, og det gør dem i stand til at være neddykkede i op til en
time.
Page
Forsøget foregår i tre trin:
1. Ekstraktion af proteiner fra oksekød. I denne øvelse tager vi udgangspunkt i oksekød, men andre
typer kød kan sagtens anvendes.
2
Oprensningen af myoglobin
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
2. Fraktionering af proteinekstraktet og oprensning af proteinerne ved hjælp af ionbytningskromatografi.
3. Analyse og proteinseparation ved hjælp af gel-elektroforese.
Ekstraktionen af protein foregår ved at findele kødet og tilsætte acetat buffer med pH 5.5, hvormed proteinerne kommer i opløsning
Proteinerne oprenses ved hjælp af FPLC (Fast Protein Liquid Chromatograhpy eller hurtig protein væskekromatografi). I FPLC processen adskiller man proteiner vha. en ionbytter søjle. Søjlen indeholder et bæremateriale med en negativt ladet overflade (produktnavn SP Sepharose) som kan binde positivt ladede proteiner, mens negativt ladede proteiner passere uhindret ved den anvendte pH 5,5 De positivt ladede proteiner vil bindes til kolonnen med forskellig styrke afhængig af deres opbygning (sammensætning af aminosyrer samt proteinets foldning). Derefter vaskes søjlen med en eluerings-væske, der indeholder natriumklorid
og saltkoncentrationen øges gradvist. På denne måde vil natrium-ionerne konkurrerer med proteinerne om
bindingen til kolonnen og den stigende saltkoncentration medfører at proteinerne mister bindingen til kolonnen og udvaskes således med elueringsvæsken. Elueringsvæsken opsamles i små fraktioner á 5 mL, som
på grund af søjlens evne til at tilbageholde de forskellige proteiner i kortere eller længere tid, vil have et
forskelligt proteinindhold. Der er således sket en fraktionering af proteinekstraktet og en delvis oprensning
af proteinerne. Proteinernes eluering i fraktioner visualiseres i et kromatogram. På kromatogrammet indikerer absorbansen målt ved 280 nm (A280) indholdet af proteiner i de individuelle fraktioner. Fraktionerne
er nummererede i kromatogrammet og på fraktionsopsamleren. En høj top i kromatogrammet indikerer en
høj protein koncentration.
Page
3
De fraktionerede proteiner separeres ved SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis). SDS-PAGE er en gel-elektroforese, som anvendes til at adskille proteiner efter deres størrelse.
Separationen foregår i et elektrisk flet over en gel af polyacrylamid. Inden elektroforesen denatureres og
udfoldes proteinerne ved at reducere eventuelle disulfidbroer og ved at tilsætte et sæbelignende stof, natriumdodecylsulfat(som forkortes SDS fordi natrium = sodium på engelsk). Ved at tilsætte disse stoffer og
udsætte proteinerne for varme, vil de udfoldes, og det negativt ladede SDS bindes regelmæssigt langs med
det udfoldede protein og giver derfor alle proteiner samme ladning pr masseenhed, samt medvirker til atholde det lineært. Den negative ladning af SDS vil overstige proteinets egen samlede ladning og dermed
muliggøre at alle proteiner bliver adskilt efter størrelse og ikke deres oprindelige ladning. Oftest anvendes
DTT (Dithiothreitol) som reduktionsmiddel og dermed forhindres dannelsen af disulfid bindinger mellem
svovlholdige aminosyrer, cystein. Peptidkæderne kan derefter adskilles efter størrelse og sammenlignes
med en størrelsesmarkør (se figur 2)
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Figur 2: Princippet bag SDS-PAGE
2. Formål
Formålet med forsøget er at oprense proteinet myoglobin fra kød, at udføre laboratorieforsøg med anvendelse af to bioteknologiske metoder, nemlig FPLC og SDS-PAGE samt at stifte bekendtskab med proteiners
egneskaber og biologiske funktion.
3. Proteinekstraktion fra okse-kød
Materialer:
Page
4
Skært oksekød
Skalpel/køkkenkniv
Acetatbuffer pH 5.5 (buffer A)
Målebæger
50 mL Greinerrør
20 mL sprøjte
2-3 0,4 µml engangsfilter
Pipette og tips
eppendorfrør
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Fremgangsmåde
a) Afvej 10 g oksekød og findel kødet med en skalpel/almindelig køkkenkniv.
b) Overfør kødet til et rent 50 mL Greinerrør.
c) Tilsæt 30 mL buffer A, sæt låg på røret og vend det forsigtigt nogle gange.
N.B. Her skulle væsken gerne blive rød (i hvert fald hvis oksekød anvendes) – den røde farve skyldes hovedsageligt jern (Fe2+) bundet af proteinet myoglobin, der transporterer O2 og CO2 i muskelceller.
d) Lad opløsningen stå i 5-15 minutter. Den kan evt. vendes / omrøres fra tid til anden.
e) Sug ca. 20 mL af kød-buffer-opløsningen op i en 20 mL engangs-sprøjte. Undgå at suge for meget
kød med op.
f) Et gult 0,4 µmL engangs-filter placeres på sprøjtens spids (skrues fast) og væsken presses igennem
filteret og ned i et rent 50 mL Greiner rør.
g) Udtag 20 µL af proteinekstraktet med pipetten (husk at der skal være sat en ren pipettespids fast
for enden af pipetten, hver gang denne benyttes!) og overfør dette til et 1,5 mL eppendorfrør. Dette rør markeres med teksten ”rå-ekstrakt” og gemmes i køleskab til senere analyse.
h) Protein ekstraktionen er nu fuldendt og ekstraktet er klar til at blive fraktioneret vha FPLC. Sprøjte,
filter og 50 mL centrifugerør er engangsmaterialer og bortskaffes efter anvendelse.
i) Om nødvendigt kan der gøres ophold her. I så tilfælde opbevares den udtagne prøve (punkt g) på
frost ved -20 °C, indtil proteinoprensningen har fundet sted (afsnit B). Proteinekstraktionen (punkt
f) kan opbevares på køl (4 °C) eller på frost (-20 °C).
4. Protein oprensning ved FPLC (TID: ca. 45 min)
Page
Fremgangsmåde
a) 10 mL af det filtrerede kød-protein-ekstrakt suges op i ren 10 mL engangs-sprøjte.
b) Sprøjten tømmes for luft (på bedste læge manér) ved at vende spidsen opad og presse luften ud af
sprøjten. Skyd en lille smule væske med ud og hav en serviet klar til at tørre sprøjten.
c) Sprøjten med det filtrerede proteinekstrakt påsættes FPLCen i injektionsventilens port nummer 3,
og størstedelen af ekstraktet skydes langsomt ind i prøve-loopet. Efterlad 1 mL tilbage i sprøjten
(Derved undgås at injicereluft i prøve-loopet. Dette vil forstyrre proteinoprensningen) (se Figur 3).
N.B. Da prøve-loopet har et volumen på 5 mL, og prøven er større end 5 mL, vil noget af proteinekstraktet løbe hele vejen igennem loopet og ud i affaldsflasken. Dette er helt i orden, så længe
loppet er fyldt med prøve.
d) Oprensningen påbegyndes ved at navigere med FPLCens pile-taster og OK-tasten:
e) Vælg menuen ”Run stored method” og tryk OK.
f) Herefter vælges den rigtige metode ved at vælge ”From System ” og tryk OK.
g) Vælg nummer: program 1 og tryk OK.
h) Tryk på OK endnu en gang for at starte oprensningen.
i) Programmet stopper af sig selv. Vælg nej til at lave ”memory print-out”.
5
Materialer
Computerstyret FPLC apparatur inkl. fraktionsopsamler og en SP Sepharose kationbytter-kolonne
10 mL sprøjte
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
N.B. Det første minut løber væsken direkte i affaldsflasken. Herefter skal man holde øje med, at
væsken rammer rørene i fraktionsopsamleren. Undervejes bliver kolonnen farvet rød (hvis oksekød
eller andet rødt kød anvendes). Den røde farve forsvinder i takt med at salt-koncentrationen i kolonnen stiger (under elueringen hvor buffer A og B gradvist blandes).
j) Imens oprensningen finder sted, angives navnet på resultat-filen øverst i PrimeView programmet.
Noter navnet, da dette skal bruges til at evaluere resultatet senere!
k) Myoglobin forventes at eluere imellem fraktion 16-18, i kan visuelt se på jeres kromatogram om
det er tilfældet, samt kigge direkte ned i røret på fraktionsopsamleren og se om den er blevet farvet rød!
Figur 3: Påsætning af proteinprøve
5. Udvælgelse af prøver vha. kromatogrammet
Når proteinoprensningen er fuldendt kan kromatogrammet åbnes i software programmet ”PrimeView Evaluation” (der findes en genvej på PCens skrivebord).
Page
a) Vælg file
b) open (Filen ligger i mappen ”Results”). Kromatogrammerne er navngivet med år (Y), måned (M),
dag (D) og nummer (X): YYYYMMMDDnoXXX (Eksempel: 2011jan27no001 – kromatogram nummer
001 fra den 27. januar 2011).
c) Ved at højre-klikke på kromatogrammet og vælge ”properties” kan man vælge hvilke data, der skal
vises i kromatogrammet under ”Curve” fanebladet.
d) Udvælg relevante fraktioner ud fra kromatogrammet (max 16 stk. – i de medfølgende geler vil der
typisk være plads til at påsætte prøver af 10 forskellige fraktioner pr gel). Vælg gerne fraktioner på
begge sider af en top (A280-peak)). På Figur 4 ses et eksempel på et kromatogram hvor fraktion 4,
5, 6, 35 og 36 er udvalgt.
N.B. Det er ikke muligt direkte ud fra kromatogrammet at afgøre hvilken fraktion der indeholder
myoglobin, men ved at kigge på fraktionerne kan en svag rød farve indikere at myoglobin er tilstede.
e) Fra hver udvalgt fraktion udtages 20 µL med pipette (husk ren pipettespids på før hver enkelt pipettering), som overføres til hver sit rene 1,5 mL eppendorfrør.
N.B. Her kan forsøget stoppes, og alle prøver kan lægges på frost!
6
Kromatogrammet åbnes således:
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Figur 4: Kromatogram efter oprensning af proteiner ekstraheret fra oksekød vha. FPLC. Den blå linie repræsenterer absorbansen
ved UV 280, den røde linie repræsenterer conductiviteten (indholdet af salt), den grønne repræsenterer gradienten (forholdet
mellem buffer A og B). Resultatet af denne oprensning er en stor peak i starten af kromatogrammet, som er alle de ubundne
proteiner der løber igennem. Den næste peak ses idet gradienten (den grønne streg) begynder at stige, og indeholdet i denne
peak skulle hovedsageligt være myoglobin (se om fraktionerne har en rød farve). Der kommer efterfølgende 2 små peaks, som
selvfølgelig også skal testes for protein indhold ved SDS-PAGE.
6. Analyse af proteinoprensningen
I har nu det maksimale antal prøver samt jeres ”rå-ekstrakt” prøve (punkt A7). Alle disse køres nu på en
SDS-PAGE.
Materialer
Page
a) Tilsæt 20 µL Sample buffer (SB) til hver af prøverne (inkl. ”rå-ekstrakt prøven”) (brug pipetten –
husk ren pipettespids til hver pipettering).
b) Prik hul i hvert låg, således at lågene ikke ”popper” under opvarmning
c) Alle prøver samt protein-vægt-markør (Fermentas #SM0431, figur 3) opvarmes i 5-10 min ved 97100 °C (i vandbad eller varmeblok).
d) Herefter sættes prøverne på is i 5 minutter, hvorefter de centrifugeres kort i en bordcentrifuge på
max speed (ex. 14,500 rpm i 20 sekunder). Dette kan undlades hvis en bordcentrifuge ikke forefindes, det er udelukkende for at få den kondenserede prøve samlet.
7
TGX SDS geler
Sample buffer
Running Buffer
Gel elektroforesesystem: Bio-Rad Mini protean tetra kar med 2 holdere, låg ledninger, plastik buffer dam
og strømforsyning
CBS stain
Rystebord
Pippette og tips
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
N.B. Imens prøverne varmes og nedkøles gøres SDS-PAGE klar
e) Tag et par handsker på og pak TGX gelen ud (måske hedder gelen noget andet alt efter hvad der er
på lager ved afsendelsestidspunktet fra universitetet).
N.B.Det er vigtigt at fjerne det grønne stykke tape i bunden og den grønne plastikkam i
toppen af gelen!!!!!!
f)
Gelen isættes gelelektroforesekarret som vist på Figur 5, den korte side af gelen vender ind mod
midten af indsatsen og sikre at gelerne sidder stramt mod bunden mens sidderne klikkes op:
N.B. Følg evt. linket http://www.youtube.com/watch?v=IAfUEe4Db2U&feature=related hvor det
demonstreres hvordan karret sættes rigtigt i (dette kar er muligvis ikke helt identisk med dette i får
udleveret).
A
C
B
D
Figur 5: A – indsæt gelerne ved at placere den korte side af gelen mod midten af beholderen. B – Når gelerne er på plads skubbes
de grønne klemmer på plads. C – Gelbeholderen placeres i karret ved at beholderen med elektroderne står udenfor plastikforhøjningerne på karret. D – Fermentas markør der anvendes som værktøj til at vurdere ukendte proteiners størrelse.
Page
8
g) Karret med gelerne fyldes først helt op med SDS-PAGE running-buffer. Tjek om der løber running
buffer ud af beholderen før der fyldes SDS-PAGE running-buffer i resten af karet. Holder midten af
karret ikke tæt, skal hele indsatsen skilles ad, sættes ordentlig sammen og karret tørres af inden
man forsøger igen!
h) 7 µL af protein-vægt-markøren (Fermentas #SM0431) loades (påsættes) i den første brønd med pipetten og 25 µL af hver af prøverne tilføres hver af de resterende brønde ved at pippettere langsomt og forsigtigt (husk ren pipettespids ved hver enkelt pipettering).
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
N.B. Husk at notere rækkefølgen af de enkelte prøver. Anvend vedlagte skema (Tabel 1) til at holde
styr på rækkefølgen Låget sættes på karret (dette kan kun vende på én måde) og strømstikkene
isættes strømforsyningen (rødt stik til rød indgang – sort stik til sort indgang).
Tabel 1: Skema til notering af fraktioner loaded på gelen. Husk at skrive numre efter Fraktion. Eksempelvis: Fraktion 5
Gel 1
Brønd
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Prøve
Markør
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Rå ekstrakt
Mix
Er blandet
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
Load
7 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
Gel 2
Brønd
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Prøve
Fraktion
Markør
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Fraktion
Rå ekstrakt
Mix
20 µL prøve+20 µL SB
Er blandet
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
20 µL prøve+20 µL SB
Load
25 µL
7 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
25 µL
9
Strømforsyningen tændes (stik på højre side) hvorved der sættes en strøm over gelen med konstant spændingsforskel på 70 V i 5 minutter og herefter 200 V i ca. 22 minutter (indtil den blå linie
har arbejdet sig ned til bunden af gelen - kør ikke farven helt ud af gelen!). (Strømforsyningen kan
ses på Figur 6).
N.B. For at adskille proteinerne med en konstant spændingsforskel skal prikken lyse udfor V (Voltage) og ikke A eller T. Når strømmen er startet skal det gerne begynde at boble med ilt inde i karret
(hvis dette ikke er tilfældet, sidder gelen enten ikke rigtigt, eller også er der for lidt buffer i karret).
Page
i)
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Figur 6: til venstre ses strømforsyningen til elektroforesekarret og til venstre ses displayet.
j)
Når den blå linje er i bunden af gelen (efter ca. 20-23 minutter) skilles elektroforesecellen ad og gelen udtages. Gelen sidder imellem to stykker plastik. Disse skilles ad som vist på Figur 7. Der er fire
sorte pile på gelen hvor værktøjet indsættes og vrikkes til det siger klik. Pas på ikke at ødelægge gelen i denne proces.
Page
k) Gelen overføres til en bakke hvori der tilsættes blå SDS-PAGE farve (Coomassie Brilliant Blue (CBB)
stain) til gelen er dækket. Låget sættes på bakken (må gerne stå lidt åbent i et hjørne).
l) Blandingen varmes i mikrobølgeovn i 30-50 sekunder og derefter køles gelen i 10 minutter ved
stuetemperatur (gerne på et rystebord, hvis et sådant er tilgængeligt).
m) Den blåt farvede væske hældes fra gelen (i vasken) og postevand tilsættes så det dækker gelen.
n) Blandingen opvarmes igen i 30-50 sekunder i mikrobølgeovnen.
o) Et par foldede papirservietter lægges ned i bakken til gelen for at suge farven (der skal stadig være
væske i beholderen).
p) Lad gelen affarve (destaine) i 10 min, hvorefter papirservietterne skiftes. Allerede her burde det
være muligt at se nogle blåt farvede protein bånd på gelen (disse bånd ses lettere ved at løfte bakken op fra bordet).
N. B. Kan man ikke se nogle bånd kan gelen evt. opvarmes en ekstra gang i mikrobølgeovn med
vand.
10
Figur 7: TGX gelen har 4 sorte pile, her på billedet ses 2. Værktøjet indsættes mellem de to plastikplader ved hver pil og vrikkes
op og ned indtil det siger klik, sørg for den er ordentlig skilt ved alle fire punkter før gelen overføres til farvning.
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
q) Lad gelen affarve fuldstændigt (skift papir ca. hver tiende minut og tilsæt evt. mere vand) og derefter kan proteinoprensningen visualiseres.
r) Gelen kan med fordel overføres til en plastiklomme og scannes med en almindelig scanner.
7. Evaluering af oprensningen
Kromatogrammet åbnes i software programmet ”PrimeView Evaluation” (der findes en genvej på
PC’ens skrivebord).
a) Kromatogrammet åbnes ved at vælge file -> open.
b) Kromatogrammerne er navngivet med år (Y), måned (M), dag (D) og nummer (X):
YYYYMMMDDnoXXX (Eksempel: 2011jan27no001 – kromatogram nummer 001 fra den 27. januar
2011).
c) Ved at højre-klikke på kromatogrammet og vælge ”properties” kan man vælge hvilke data, der skal
vises i kromatogrammet under ”Curve” fanebladet.
d) Under fanebladet ”X-axis” kan indstillingerne for x-aksen foretages: Skal kromatogrammet vises
som funktion af antal minutter oprensningen har kørt, eller af antallet af mL der har passeret kolonnen.
e) Under fanebladet ”Y-axis” kan indstillingerne for y-aksen foretages: Hvordan skal de enkelte data
(valgt under ”Curves”) vises.
f) Kromatogrammet kan gemmes som billede-fil (.emf) ved at højreklikke på kromatogrammet og
vælge ”Save as meta-file”
g) Data kan også eksporteres til en tekst-fil som kan overføres til fx Excel (Figur 8):
a. Vælg ”file”
b. Vælg ”Export”
c. Vælg ”Curves” (her kan også vælges ”Peak table”)
d. Vælg de ønskede data
e. Tryk på ”Select”
f. Tryk på ”Export”
g. Tryk på ”OK”
Page
h) De eksporterede data kan importeres i Excel:
a. Vælg ”Data”
b. Vælg ”Fra tekst”
11
Figur 8: Skærmbillede til hjælp af eksport af data
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
12
Figur 9: Skærmbillede til hjælp af integrering af areal under grafer
Page
i)
c. Vælg vis: ”Alle filer”
d. Vælg de eksporterede data
e. Vælg ”Importer”
f. Vælg ”Udfør”
g. Tryk på ”OK”
PrimeView Evaluation kan integrere arealet under graferne (Figur 9):
a. Vælg menuen ”Integrate”
b. Vælg ”Peak Integration”
c. Vælg den graf der skal integreres (UV280). Grafen hedder det samme som data filen +
”:10_UV”. (Eksempel: 2011jan27no001:10_UV)
d. Basislinien (baseline) defineres. Vælg enten ”calculated baseline” eller ”Zeroed baseline”
e. Man behøver ikke at tage stilling til ”Target peak list”
f. I undermenuen ”Peak window” kan man vælge de dele af kromatogrammet som skal integreres. Ændres dette ikke integreres hele kromatogrammet.
g. Toppene (peaks) noteres efter deres placering på x-aksen (i minutter eller i mL).
h. Vælg ”OK”
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
1. Lærervejledning
ÄKTAprime Plus er et FPLC apparatur til oprensning af proteiner. Systemet styres let ved brug af tasterne på
apparatets forside.
Figur 10: Billede af frontpanelet på FPLC'en







Piletasterne anvendes til at navigere imellem de forskellige menuer.
OK-knappen bruges til at gå ind i den valgte menu (enter), samt til at godkende valgte indstillinger.
Esc-knappen bruges til at gå tilbage til den forrige undermenu.
End-knappen bruges til at afslutte en kørsel (run). Hvad enten dette er en manuel eller automatisk
metode.
Pause/cont -knappen bruges til at introducere en pause i den valgte metode, samt til at genoptage
kørslen.
Feed-tube og Hold/cont funktionerne anvendes ikke her.
N.B. Der opereres her med to vaskeprocedurer: Systemets automatiske som vasker pumperne og
vaskeprogram 4 (en forprogrammeret metode), der vasker søjlen.
2. Klargøring af ÄKTAprime FPLC (ca. 2 timer)
Klargøring kan gøres dagen før. I så fald skal punkt 8 (automatisk vask) gentages lige inden brug.
Page
13
1. Fraktionsopsamleren (på toppen af FPLCen) fyldes med ca. 45 rør og fraktionsarmen placeres over
rør 1. Mærket på indersiden af det hvide stykke plastik på armen skal stå udfor midten af rør nummer 1. Fraktionsopsamleren drejes ved at trække det lille ”tandhjul” bagerst til højre ud (markeret
med rød cirkel på figur 13), hvorefter fraktionsopsamleren frit kan drejes.
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Page
2. Forbind den bærbare PC med ÄKTAprime plus via USB stikket. Anvend kun den markerede USB port
i PCen.
3. Tænd ÄKTAprime plus på kontakten på bagsiden. FPLCen foretager en automatisk opstarts kontrol
og kalibrering – dette kan tage et par minutter. Når FPLCen er klar ses teksten ”Templates” på displayet.
4. Tænd PC (User: AAU, Password: biotech).
5. Start PrimeView software på PCen (der findes en genvej på computerens skrivebord).
6. Placér affalds-slangerne (de tre tynde brune slanger i en tom beholder markeret ”affald”).
7. Buffer-slangerne markeret ”A1” og ”B” overføres til henholdsvis buffer A og buffer B.
N.B. Husk at banke bufferslangerne forsigtigt hver gang de overføres til en ny buffer for at undgå
luftbobler
a. Buffer A (vaskebuffer): 20 mM Eddikebuffer, 20 mM NaCl, pH 5.5
b. Buffer B (elueringsbuffer): 20 mM Eddikebuffer, 1000 mM NaCl, pH 5.5
c. De 20 mM eddikesyre er fordelt således: 3,52 mM eddikesyre (l) og 16,48 mM natrium acetat. Dette giver en pH tæt ved de ønskede 5.5. pH justeres med 2M NaOH til 5.5.
8. Vask buffer-slanger og pumpe med FPLCs automatiske vaskeprogram således: (se punkt 20 hvis du
på noget tidspunkt får en pressure limit allert)
a. Automatisk vaskeprogram findes ved at bruge FPLCens piletaster og OK-tast:
b. Vælg menuen ”Templates” og tryk OK.
c. Vælg undermenuen ”Application Template” og tryk OK.
d. Vælg undermenuen ”System wash method” og tryk OK.
e. Brug piletasterne til at flytte markøren (den lille vandrette streg under teksten på displayet)
hen under OK (sådan: OK) og tryk på OK-tasten.
f. Tryk på OK-tasten for at starte det automatiske vaskeprogram.
g. Vasken tager ca. 5 minutter og maskinen bipper, når den er færdig. Tryk NO til at gemme
udskrift.
9. Herefter startes et langsomt flow af buffer A igennem buffer slange A1:
a. Brug FPLCens piletaster til at finde menuen ”Manual Run” og tryk på OK-tasten.
14
Figur 11: Indstilling af fraktionsopsamler
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
b. Brug piletasterne og OK-tasten til at indstille system parametrene (se nedenstående tabel).
Her anvendes OK-tasten til at ændre og acceptere de indstillede parametre.
c. Når alle parametre er indstillet som angivet i ovenstående tabel (tjek evt. disse indstillinger
endnu en gang), vælges ”Start Run” og tryk på OK-tasten.
d. Tryk på OK-tasten endnu en gang for at starte vasken.
Tabel 2: Skema til at indstille parametrene i en manual run
Parameter
Værdi
Sådan skal displayet se ud:
Set Method Base
Ml
Set Method Base
(ml)
Set Concentration %B
0 %B
Set Concentration %B
(0 %B)
Set Gradient
Off
Set Gradient
(Off)
Set Flow Rate
1 ml/min
Set Flow Rate
(1 ml/min)
Set fraction Base
mL
Set Fraction Base
(ml)
Set Fraction Size
0.0 ml
Set Fraction Size
(0.0 ml)
Set Pressure Limit
0.4 MPa
Set Pressure Limit
(0.4 MPa)
Set Buffer Valve Pos
Pos 1
Set Buffer Valve Pos.
(Pos 1)
Set Injection Valve Pos
Load
Set Injection Valve Pos
Page
10. Kolonnen skal nu påsættes systemet. Når kolonnen er koblet til med slangerne skal det se ud som
vist på figur 16.
a. Find kolonnen frem. Den er markeret SP Sepharose. Behandl denne forsigtigt.
15
(Load)
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Page
16
b. Påsætning af kolonne skal ske ved et konstant lavt flow af buffer (jf. punkt 9 og ovenstående tabel).
c. INFO (læs hele punkt c, før du foretager dig noget): Lukkepropperne for enden af slangerne
på kolonnen er markeret med rød tape. Den grønne og hvide slange der skal sættes sammen er markeret med gul tape og slangen i bunden af kolonnen er markeret med hvid, ligesåvel er adaptoren (der findes i den medfølgende kasse med adaptorer, se figur 12) og
detektoren.
d. Fjern lukkeproppen fra den hvide slange (markeret med gul tape), og løsn lukkeproppen, i
enden af den hvide slange fra bunden af kolonnen (begge markeret med rød tape). På den
måde kan væsken løbe lidt igennem kolonnen. (propperne kan ses på Figur 12).
e. Afmontér FPLCens grønne slange fra detektoren(markeret med gul tape), og sæt denne
sammen med den anden ende af den hvide slange der går fra toppen af kolonnen (markeret med gul tape) (Figur 12, begge propper der skal forbindes er markeret med gul tape).
Nu er toppen af kolonnen forbundet til FPLCen, og man burde kunne se noget væske pible
op forbi den løsnede lukkeprop for enden af den hvide slange i bunden af kolonnen.
f. Fjern den sorte lukke-prop (markeret med rød tape) helt fra den nederste slange på kolonnen (markeret med hvid) hvorefter væsken løber frit ud (Figur 12). Påsæt/montér adaptoren med hvid tape omkring (fra den medfølgende æske med løsdele) i enden af slangen og
forbind nu dette til indgangen af detektoren (markeret med hvid).
g. Sørg for at systemet holder tæt, ved at undersøge om der kommer overskydende væske op
omkring detektoren
N.B. Pas godt på disse sorte stopskruer (markeret med rød tape), da disse skal anvendes
igen, når kolonnen afmonteres fra FPLCen efter endt eksperiment.
h. Når man kan se væsken løbe igennem de brune slanger i affaldsflasken, stoppes det manuelle program ved at trykke på end-knappen på forsiden af FPLCen.
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Figur 12: Her ses FPLC’en som i modtager den. Stoppropperne for enden af kolonnens hvide slanger er markeret med rød tape
(se gule pile). Stopproppen til slangen i bunden af kolonnen er afrundet, hvor stopproppen for enden af slangen i toppen af
kolonnen ligner et han stik. Der er en hvid slange fra toppen af kolonnen som skal forbindes med den grønne slange fra injektionsporten (begge markeret med gul tape). Den hvide slange fra bunden af kolonnen skal forbindes med den adaptor med hvid
tape der ses på billedet (gul cirkel, er at finde i den medfølgende kasse med løsdele, se billede til højre), dette forbindes nu med
detektorens indgang markeret med hvid tape.
11. Jævnfør punkt 10 skulle kolonnen nu være tilsluttet FPLC-systemet og kan nu vaskes igennem med
buffer A1 (ca 10 min)
a. Vælg menuen ”Run stored method” og tryk OK.
b. Der spørges nu efter, hvor metoden ligger gemt: Her vælges ”Systemet” og tryk OK.
c. Vælg nummer program 4 og tryk OK.
d. Tryk på OK endnu en gang for at starte oprensningen.
e. Programmet stopper af sig selv – vælg nej til at lave ”memory print-out”.
N.B. Vasken i punkt 11 kan følges på computerens display. Når vaskeprogrammet er slut,
bør absorptions- og konduktivitetsmålingerne (ca. 3 mS/cm) være stabiliseret – er dette ikke tilfældet gentages punkt 11.
12. Når pumperne er vasket (punkt 8), kolonnen påsat (punkt 10) og vasket (punkt 11), er apparatet
klar til anvendelse. Afsnit 3, 4 og 5 fra elev-vejledningen udføres som beskrevet.
13. Rengøring med 100 % buffer B:
Page
Dette bør gøres samme dag eller senest dagen efter proteinoprensningen har fundet sted. Det er
yderst vigtigt at absorbansen bliver stabil/lineær, da det ellers betyder at kolonnen er kontamineret.
17
3. Rengøring og adskillelse af FPLC system (ca. 2 timer):
15.
16.
17.
18.
19.
Page
14.
a. Kolonnen vaskes igennem med at køre et manual run som angivet i Tabel 2, med den afvigelse at der under ”set concentration % B” vælges 100%
b. Lad den stå og køre indtil absorbansen bliver stabil (kan godt tage en times tid)
Rengøring med 2 M NaCl
a. Når absorbansen er stabil sættes systemet på pause på FPLCens frontpanel (se Figur 10)
b. Herefter flyttes begge slanger over i den medfølgende 2 M NaCl, slangerne bankes lige for
at undgå luft.
c. Indstil koncentrationen af B ved at bruge piltasterne på frontpanelet indtil ”set concentration” er nået, tryk da ok, og indstil til 50 % med piltasterne. Tryk da ok, og anvend piltasterne til at komme tilbage til start og tryk da run igen.
d. Systemet må igen gerne stå en times tid eller indtil absorbansen er stabil.
e. Når absorbansen er stabil, sættes systemet igen trykkes der på end.
Vask bufferslanger og pumpe med FPLCs automatiske vaskeprogram: (se punkt 20 hvis du får en
pressure limit allert)
a. Overfør begge bufferslanger til den medfølgende flaske med MilliQ vand, bank slanger for
at fjerne luft.
b. Automatisk vaskeprogram findes ved at bruge FPLCens piletaster og OK-tast:
c. Vælg menuen ”Templetes” og tryk OK.
d. Vælg undermenuen ”Application Template” og tryk OK.
e. Vælg undermenuen ”System wash method” og tryk OK.
f. Brug piletasterne til at flytte markøren (den lille vandrette streg under teksten på displayet)
hen under OK (sådan: OK) og tryk på OK-tasten.
g. Tryk på OK-tasten for at starte det automatiske vaskeprogram.
h. Vasken tager ca. 5 minutter og maskinen bipper når den er færdig. Tryk NO til at gemme
udskrift.
Herefter vaskes kolonnen med program 4 (se punkt 20 hvis du får en pressure limit allert)
a. Vælg menuen ”Run stored method” og tryk OK.
b. Der spørges nu efter hvor metoden ligger gemt: Her vælges ”Systemet” og tryk OK.
c. Vælg nummer program 4 og tryk OK.
d. Tryk på OK endnu en gang for at starte oprensningen.
e. Programmet stopper af sig selv – vælg nej til at lave ”memory print-out”
Begge bufferslanger (både A1 og B) flyttes fra deres respektive bufferopløsninger og placeres i den
leverede flaske med 20 % Ethanol og punkt 15 og 16 gentages indtil absorptionen er stabil (konduktiviteten skulle gerne her stabiliseres omkring 0 da dette ikke indeholder salt)
Er dette ikke tilfældet gentages punkt 16. Er dette tilfældet fortsæt da med punkt 19.
Kolonnen er nu klar til at blive afmonteret fra FPLC systemet:
a. Start en manuel kørsel (run) med et langsomt flow igennem buffer slange A1 (se punkt 9):
b. Denne gang indstilles flow til 0.5 mL/min og kolonnen kan nu afmonteres fra systemet:
c. Bunden af kolonnen, som er monteret til FPLCens absorptionsmåler (markeret med hvid
tape), løsnes, adaptoren srkues af og den ene sorte lukke-prop (markeret med rød tape)
skrues løst på bunden af kolonnen.
N.B. Skru kun proppen løst på, så væsken stadig kan komme ud.
18
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Protokol for ekstraktion og oprensning af proteiner fra oksekød
Page
Figur 13: Proteiners 3-dimensionelle struktur
19
d. Toppen af kolonnens slange (markeret med gul), som er monteret til den grønne slange,
løsnes og den anden sorte stop-prop (markeret med rød tape) skrues ind i hun-stikket
(denne skrues helt på - kun ved håndkraft, anvend ikke værktøj).
e. Herefter strammes bundproppen og kolonnen er nu afkoblet.
f. Den grønne slange (markeret med gul tape) monteres på FPLCens absorptionsmåler.
g. Når man kan se væsken løbe igennem slangerne i affaldsflasken, stoppes det manuelle program ved at trykke på end-knappen på forsiden af FPLCen.
h. Sug ca. 10-20 mL 20 % ethanol ind i en ren engangssprøjte, og sprøjt dette ind i port nummer 3 i FPLCens injektionsventil (samme ventil som prøven i sin tid blev doseret (loaded)
ind i). Herved vaskes injektionsventil og prøve-loopet igennem med ethanol.
i. FPLCens slukkes på bagsiden af apparatet i venstre side.
j. Computeren afmonteres.
20. Hvis du får en alarm med at trykket er for højt trykker du på pause. Brug da piltasterne til at manøvrere igennem programmet med, indtil du når indstilling flow (mL/Min), tryk da ok og indstil den
til 1 mL mindre, tryk continue. Hvis problemet fortsætter indstil da til et mindre flow indtil du får et
acceptabelt tryk.