1. No category

BIOZYMER ØVELSE 2
OPRENSNING AF PROTEINER
FAGLIG BAGGRUND
Det forudsættes, at den grundlæggende teori bag rekombinant protein ekspression og proteinopresning er bekendt. For
dette henvises til undervisningsmateriale forfattet af Hans Chr. Jensen, Karen Helmig og Jakob Schiødt om aminosyrer
og proteiner, der er tilgængeligt på emu (www.emu.dk/gym/fag/bt/inspiration/mat erialer-download/index.html). Endvidere henvises til Biotech Academys undervisningsmateriale for gymnasierne omhandlende genteknologi
(www.biotechacademy.dk/Testprojekter/testprojekter/genteknologi/teori/2biotekrute.aspx)
FORMÅL OG BAGGRUND
Formålet med øvelsen er at oprense enzymet β-lactamase. Jeres udgangspunkt
for denne oprensning er det cellebundfald, der er fremkommet, efter man har
overudtrykt enzymet β-lactamase i Escherichia coli (E. coli) celler. Jeres opgave
bliver at isolere β-lactamasen fra andre proteiner, som E. coli udtrykker.
FRA BAKTERIE TIL PROTEIN.
Alle celler udtrykker proteiner. Hvilke proteiner, der udtrykkes, varierer fra celle
til celle alt afhængigt af, hvad cellens funktion er. Mængderne, de udtrykkes i. vil
også ændre sig alt efter, hvor meget der er behov for.
For eksempel udtrykker røde blodlegemer primært hæmoglobin, mens nogle
celler i maven primært udtrykker enzymer, der kan nedbryde forskellige komponenter i den mad, vi spiser.
I industrielle og forskningsrelaterede sammenhænge kan det være nødvendigt
at producere store mængder af et protein Faktaboks 1. Proteinerne kan enten
oprenses fra naturlige kilder, såsom celler eller væsker, eller de kan oprenses fra
celler, der er fremstillet til at kunne udtrykke store mængder af et protein. I disse
tilfælde har man introduceret nye gener til organismen. Når man introducerer
nye gener kaldes det at genmanipulere organismen, og selve det at udtrykke
proteinerne kaldes rekombinant protein ekspression. Proteiner, der produceres på
denne måde, kaldes også rekombinante proteiner.
Bakterien E. coli bliver ofte brugt til produktion af rekombinante proteiner, da
det er nemt at efterligne de vækstbetingelser som E. Coli foretrækker. Derudover
er det er let at introducere nye gener i E. Coli ved hjælp af plasmider.
FAKTABOKS 1
DIABETES OG INSULIN
Sygdommen diabetes skyldes, at kroppen ikke kan producere peptidhormonet insulin eller er blevet resistent overfor det.
Insulin er med til at regulere blodsukkeret. Har man insulinresistens eller -mangel kan det medføre for højt blodsukker.
Diabetes kan holdes i skak ved at tilføre kroppen insulin og derved holde et stabilt blodsukker.
Da insulin første gang kom på markedet som lægemiddel blev det udvundet fra okse-bugspytkirtler. Uheldigvis var der
mange urenheder (andre proteiner og småmolekyler) i okse-insulin, der resulterede i, at patienterne udviklede allergi over
for produktet. Derfor begyndte man i midten af 70’erne at isolere det fra svin, da dette gav et renere præparat og færre
allergiske reaktioner.
I slut-80’erne kom det første humane (menneske) insulin på markedet. Dette insulin var ikke isoleret fra humane bugspytkirtler, men derimod fra gærceller. Gærens DNA var blevet ændret til at kode for humant insulin. At udtrykke insulinen rekombinant i gærceller gjorde det muligt at isolere insulinen bedre fra andre proteiner og småmolekyler. Dermed fik
man et renere og mere koncentreret produkt og patienterne fik færre allergiske reaktioner.
I denne øvelse skal I oprense enzymet β-lactamase. Jeres udgangspunkt for oprensningen er et E. coli proteinbundfald. Hvorledes dette bundfald har fundet vej
fra levende celle til jer kan ses på gelektroforesen i figur 1.
2
FORMÅL OG BAGGRUND
PROTEINOPRENSNING
Efter proteinet er blevet overudtrykt i bakteriecellen, skal det adskilles fra resten
af bakteriens proteiner, membraner og organeller, dvs. proteinet skal isoleres. Når
man taler om at isolere et protein, taler man som regel om at oprense det.
Den oprensningsmetode, der virker bedst på det enkelte protein, afhænger af
hvilket protein man arbejder med – nogle proteiner kan oprenses på få dage,
mens andre tager flere uger. Det protein, I skal arbejde med, er en β-lactamase,
og det kan oprenses i løbet af kort tid.
Nedenfor vil de oprensningstrin, I skal bruge, blive gennemgået.
SONIKERING OG CENTRIFUGERING
Når I modtager proteinet, befinder det sig i et bundfald. Foregående er cellerne
groet op, og proteinet er blevet overudtrykt inde i cellerne. Herefter er cellerne
blevet sonikeret tre gange og centrifugeret (se hhv. Faktaboks 1 og 2).
Den β-lactamase, I skal arbejde med, er ikke i opløsning, når cellerne ødelægges
ved sonikering. Derimod folder de forkert og samler sig i en aggregeret form, der
er så stor, at den er synlig i mikroskop. Disse aggregater kaldes inclusion bodies
eller på dansk ’inklusionslegemer’. Når cellerne efterfølgende centrifugeres, vil
β-lactamasen derfor være i bundfaldet. I bundfaldet vil der også findes membranfragmenter, cellekerner og store organeller, såsom mitokondrier, lysosomer og
peroxisomer. For at få β-lactamasen i opløsning kan man tilføje en høj koncentration af urea til sin opløsning, da det udfolder proteinet.
FAKTABOKS 2
SONIKERING OG
CENTRIFUGERING
Når man har udtrykt sit protein
i en organisme, bliver det på et
tidspunkt nødvendigt at slå cellerne i stykker for at få proteinet
ud, så man kan arbejde med det.
Her kan man eksempelvis
benytte sig af ultralyd, der er
så kraftig, at det ryster cellens
membran fra hinanden. Denne
metode kaldes sonikering.
Efter sonikeringen skiller man
de større og faste fragmenter fra
væsken ved at centrifugere
sonikatet. Der er nu enten
mulighed for, at proteinet er i
opløsning, eller at det er
aggregeret til inclusion bodies.
Figur 1: Gelektroforese,
der viser oprensningen af
β-lactamase. De blå bånd på
gelen repræsenterer proteiner.
LMW er en standard blanding
af proteiner med kendt molekylestørrelse. Ud fra denne kan
man omtrent bestemme størrelsen af proteinerne i de andre
baner. I banerne ”Før induktion” og ”Efter induktion” ses
det, at et blåt bånd dukker op
ved proteinets molekylevægt.
I banerne ”Pellet 1-3” ses et
klart, tykt blåt bånd, der svarer
til β-lactamasens molekylvægt.
Dette indikerer, at β-lactamasen
er tilstede i disse fraktioner. De
andre blå bånd repræsenterer
de proteiner, I skal have fjernet
fra opløsningen.
3
FORMÅL OG BAGGRUND
DIALYSE
For at opnå korrekt foldet β-lactamase efter man har bragt det i opløsning, er det
nødvendigt at sænke koncentrationen af urea langsomt. Her benyttes en membran
med porestørrelser (huller), der er nøje afstemt efter størrelsen på det protein, man
arbejder med. Dette tillader ureaen at diffundere ud i den omgivne buffer, uden at
koncentrationen af protein i opløsningen indeni membranen falder. Denne metode
kaldes dialyse.
Under dialysen indstiller der sig en ligevægt for urea mellem den væske, der er
udenfor og indeni dialyseposen, således at koncentrationen er lige så stor inden
i dialyseslangen som uden for dialyseslangen. Derfor er det vigtigt, at voluminet udenfor slangerne er meget større end voluminet inden i poserne, hvor proteinet befinder sig. På den måde bliver koncentrationen af urea meget mindre.
Koncentrationen af protein indeni slangen falder ikke, da porerne ikke er store
nok til, at β- lactamasen kan komme ud af dialyseposen. Alle mindre molekyler, såsom små proteiner og urea- og vandmolekylerne, vil kunne diffundere frit,
mens β-lactamasen bliver tilbageholdt i dialyseslangen.
Figur 2: Dialyse.
En dialyse er baseret på passiv
diffusion. En proteinblanding
kommes i en semi-permeabel
membranpose. I denne membranpose kan kun de molekyler,
der er små nok til at passere
ud gennem hullerne (porerne)
i posen diffundere ud i den omkringværende opløsning. Dette
vil medføre, at kun de molekyler, der er for store til at passere
gennem porerne, vil forblive
i posen. Figuren er taget fra
http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/
enzpur/amso4.htm
Når ureaen langsomt diffunderer ud, og koncentrationen falder, vil proteinet folde
tilbage i sin oprindelige form, eller det der kaldes proteinets native konformation.
figur 3. Derfor kaldes dialyse også refoldning, hvis formålet med dialysen er at få
proteinet til at folde korrekt.
Figur 3: Urea denaturering
og refoldning til den native
konformation. Til venstre ses en
repræsentation af et urea-udfoldet protein. Under dialysen
vil urea- molekylerne diffundere
ud af dialyseposen og blive
erstattet af buffer uden denaturant. Det vil medføre en langsom
refoldning til den native konformation, repræsenteret til højre.
4
FORMÅL OG BAGGRUND
ANION AFFINITETSKROMATOGRAFI
Efter dialysen formodes I at have korrekt foldet β-lactamase. Desværre består
opløsningen ikke kun af β-lactamase på dette tidspunkt. Der vil også være mange
andre proteiner til stede, som bliver udtrykt af E. Coli.
Endnu et oprensningstrin er derfor påkrævet for at oprense proteinet.
Da β-lactamasen netto har en negativ ladning benyttes et trin, der adskiller
molekyler afhængigt af deres ladning. Dette oprensningstrin består i at filtrere
proteinopløsningen gennem et materiale (en resin), der selektivt binder negativt
ladede molekyler (anioner). Jo mere negativt ladet molekylet er, jo stærkere binder det til resinen, se figur 4. Denne type filtrering kaldes også en anion bytning
eller anion-affinitets-kromatografi, da den holder fast i anioner.
Efter man har ført sin prøve gennem resinen, vil ens eget protein være bundet fast
til resinen. Man er nu interesseret i at få det ud igen. Man vasker derfor proteinet
af resinen igen (eluerer) ved at tilsætte en saltholdig buffer. Denne buffer vil indeholde mange små negativt ladede molekyler, der udkonkurrerer proteinets binding til resinet. Jo større negativ ladning proteinet bærer, jo stærkere vil det også
binde til resinet. Dermed vil det også kræve tilsvarende store mængder af salt for
at eluere. Omvendt, jo mindre negativ ladning proteinet har, jo mindre salt skal
der til. Positivt ladede proteinet vil naturligvis ikke binde til søjlematerialet. Efter
dette trin vil størstedelen af de andre proteiner og celledele være sorteret fra og
β-lactamasen kan anses som oprenset.
Figur 4: Anionbytter.
En anionbytter består af et
resin, der selektivt binder til
anioner, repræsenteret som kugler med ”fangearme”. I denne
figur har de lilla molekyler en
meget negativ ladning; de blå
har en medium negativ ladning;
og de røde molekyler har en
mindre negativ ladning. På en
anionbytter vil en blanding af
de lilla, blå og røde molekyler
blive udvasket efter forskellige
mængder af udvaskningsbuffer.
Først vil de røde molekyler
udvaskes, så vil de blå og så de
lilla. På den måde kan man let
isolere molekyler med forskellige ladninger fra hinanden på
en anionbytter. Figuren er fra
http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/
enzpur/ionX.htm
5
FREMGANGSMÅDE
REFOLDNINGSDIALYSE
β-lactamasen er i inklusionslegemerne, når I får det udleveret som et bundfald.
Defor opløses bundfaldet i en bufret urea-opløsning.
··
Tilsæt 20 ml af en opløsning, der indeholder 8 M urea 20 mM Tris-HCl og
har en pH på 7, til bundfaldet og pipettér forsigtigt op og ned med en
pasteurpipette. Når bundfaldet er gået i opløsning, bestemmes
koncentrationen af protein i opløsningen som beskrevet neden for.
··
Mål absorbansen ved 280 nm. Dette gøres ved først at nulstille
spektrofotometret på en ”blank” prøve. En ”blank” prøve indeholder ikke
protein, men kun buffer. I dette tilfælde er bufferen 8 M urea 20 mM
Tris-HCl pH 7. Der skal typisk bruges 1 ml til at fylde en kuvette, men det
kan variere med kuvetten. Når spektrofotometret er nulstillet måles
absorbansen på proteinprøven. For at opnå det mest præcise resultat bør
denne måling foretages minimum tre gange, hvor man har hældt
opløsningen tilbage og udtaget en ny prøve. Det er ikke nødvendigt at
nulstille igen, når man måler anden og tredje gang.
··
Beregn proteinkoncentrationen ved at omarrangere Lambert-Beers lov;
A = ɛlc, hvor A er absorbansen ved 280 nm; ε er ekstinktionskoefficienten
som er proteinafhængig og i dette tilfælde 0,891 mg/ml; og c, der er
proteinkoncentrationen i M. Bestemmelse af proteinkoncentrationen skal
bruges til at udtage 10 mg protein.
··
Fortynd 10 mg protein til 1 mg/ml i 50 mM Tris-HCl pH 7, 1mM EDTA og
overfør opløsningen til en dialysepose som beskrevet neden for.
Forinden har dialyseslangen ligget i ionbyttet vand i minimum 10 minutter for
at fjerne urenheder og gøre posen blød og medgørlig. Skyl gerne slangen indeni
også ved hjælp af en pipette. Husk altid at have handsker på, når dialyseslangen
håndteres, så der ikke overføres proteiner og snavs fra jeres hænder til selve
posen.Arbejd gerne hurtigt, så dialyseposen ikke tørrer ud og krakelerer.
Sæt en dialyseklemme i den ene ende af slangen og overfør proteinopløsningen
til posen gennem en tragt. Det er smartest at overføre proteinopløsningen over
et kar eller et bægerglas, så man ikke mister noget, hvis man skulle komme til at
spilde. Efter man har overført proteinopløsningen til slangen, sættes den anden
dialyseklemme fast. Der må gerne være en luftboble øverst i slangen. Hvis I ikke
har dialyseklemmer, kan I binde knuder i begge ender, men husk så at tage det
med i jeres beregninger, når I skal bestemme, hvor meget dialyseslange I skal
bruge. Når proteinopløsningen er overført til dialyseslangen og begge klemmer
er forsvarligt lukket, kommes den ned i dialysebufferen (5 l med 50mM TrisHCl pH 7) i et 5 l bægerglas. En magnet kommes i, og dialysen stilles ved 4° C
og natten over under omrøring.
··
DET SKAL I BRUGE:
TIL DIALYSE:
BUFRE OG
OPLØSNINGER
·· 20 ml 8 M urea 20 mM TrisHCl pH 7
·· 5 l 50 mM Tris-HCl pH 7
MATERIALE
OG APPARATUR
·· Pasteurpipetter (plastic, 5 ml)
·· Spektrofotometer, der kan
måle absorbans ved 280 nm
·· Kuvette til absorbansmåling
·· Dialyseslange med MWCO
på 3000-6000 (Spectro/Por)
·· Dialyseklemmer
·· Tragt til at overføre proteinopløsningen til dialyseslange
·· Magnet
·· Magnetomrører
·· pH-meter, samt syre og base
til pH-indstilling af bufre
·· 5 l bægerglas
·· 15 ml nunc-rør med låg til
opbevaring af proteinet
Dagen efter overføres dialysatet til et 15 ml nunc-rør ved brug af en tragt
over en skål eller et bægerglas Proteinopløsningen skal opbevares ved 4° C,
når den ikke er i brug.
6
FREMGANGSMÅDE
ANION AFFINITETSKROMATOGRAFI
For at isolere β-lactamasen fra de andre proteiner i dialysatet udføres et anion
affinitetskromatografi-trin.
··
··
··
··
5 ml anion affinitetes resin opslemmet i 20 % ethanol overføres til en tragt
med indlagt filter stillet i en konisk kolbe. Inden proteinopløsning påføres
resinet, vaskes dette med 50 ml B-buffer. Dette gøres ved at hælde B-buffer
på resinet og vente til, det er dryppet igennem.
Når al B-bufferen er dryppet igennem, gentages proceduren med A-buffer.
Når A-bufferen er dryppet igennem, sættes en konisk kolbe ind under tragten. Proteinopløsningen (dialysatet) overføres nu forsigtigt til tragten med
resinet. I skal nu vente til dialysatet er dryppet ned i kolben.
Når det ikke længere drypper fra tragten, tager I gennemløbet i den koniske
kolbe, og hælder det forsigtigt på resinet igen. Dette skal gentages yderligere
to gange for at sikre, at så meget protein som muligt er bundet til resinet.
Alle de proteiner, der var i proteinopløsningen, er nu i resinet. For at fjerne
de proteiner, der ikke binder, skylles resinet med 50 ml A-buffer ved
forsigtigt at hælde A-buffer over, og vente til det ikke længere drypper fra
tragten. For derefter at fjerne de proteiner, der kun binder svagt til resinet,
skylles med en vaskebuffer, der indeholder 50 mM Tris-HCl pH 7, 1 mM
EDTA, 50 mM NaCl. Dette gøres igen ved forsigtigt at hælde vaskebufferen
på resinet, og vente til det ikke længere drypper fra tragten.
Proteinet skal nu elueres, det vil sige vaskes ud af resinet, på en kontrolleret
måde. Dette gøres ved forsigtigt at hælde B-buffer på resinet og opsamle
gennemløbet i fraktioner af 1 ml. Det vil sige, gennemløbet skal deles op
og altså ikke elueres ned i den koniske kolbe. Opsamling af 1 ml fraktioner
gøres lettest ved at holde fraktionsrøret ind under tragtens munding og lade
eluatet dryppe ned i fraktionsrøret. Enzymet bør nu være i de 5 første
fraktioner (se figur 5 næste side).
DET SKAL I BRUGE:
TIL ANION AFFINITETSKROMATOGRAFI:
BUFRE OG
OPLØSNINGER
·· Buffer A: 50 mM Tris-HCl
pH 7, 1 mM EDTA (500 ml)
·· Buffer B: 50 mM Tris-HCl
pH 7, 1 mM EDTA, 1 M
NaCl (500 ml)
·· Buffer til at skylle resinet
med: 200 ml 50 mM Tris-HCl
pH 7, 1 mM EDTA, 50 mM
NaCl
·· SDS-PAGE prøvebuffer
MATERIALE
·· 5 mL Q-FF anion affinitets resin opslemmet i 20 % ethanol
Tragt (almindelig glas- eller
kaffe-)
·· 100 ml konisk kolbe til at
opfange gennemløbet
·· Filterpapir (Whatman no. 1
eller kaffefilter)
·· Pasteurpipetter (plastic, 5 ml)
·· Fraktionsrør til fraktioner af
1 ml (evt. eppendorfrør) pHmeter, samt syre og base til
pH-indstilling af bufre
·· Magnet
·· Magnetomrører
·· pH-meter, samt syre og base
til pH-indstilling af bufre
·· 5 l bægerglas
·· 15 ml nunc-rør med låg til
opbevaring af proteinet
7
FREMGANGSMÅDE
Figur 5: Gelektroforese af anionbytter fraktioner. På gelen ses fra venstre mod højre: LMW; det der blev påsat anionbytteren; det der løb igennem søjlen; det der løb gennem søjlen efter vask med A buffer; det der løb gennem søjlen efter
vask med A buffer tilsat 50 mM NaCl; fraktionerne 1-5. β-lactamasen giver anledning til de blå proteinbånd, der er
markeret med pil. Det ses, at β-lactamasen eluerer i fraktionerne 1-5.
Hvis I skal fortsætte med β-lactamasen og lave enzymkinetikøvelsen, skal I nu
skifte bufferen på de fraktioner, der indeholder β-lactamase til en 50 mM fosfatbuffer pH 7. Dette gøres ved dialyse, som da I skulle refolde β-lactamasen.
Hvis I skal arbejde videre med β-lactamasen i enzymkinetikøvelsen, kan I se,
hvad I skal bruge i boksen til højre.
BUFRE OG
OPLØSNINGER
·· 5 l 50 mM fosfatbuffer pH 7
MATERIALE
·· Dialyseslange med MWCO
på 3000-6000 (Spectro/Por)
·· Dialyseklemmer
·· Tragt til at overføre proteinopløsningen til dialyseslangen
·· Magnet
·· Magnetomrører
·· pH-meter, samt syre og base
til pH-indstilling af bufre
·· 5 l bægerglas
·· 15 ml nunc-rør med låg til
opbevaring af proteinet
8
SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN
SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN
1.
Hvad består bundfaldet af, når I får det?
2.
Hvad betyder det, at et protein denaturerer? Hvorfor tror I, at inklusionslegemerne er opløselige i urea?
3.
Hvorfor kan man bestemme proteinkoncentrationen af en opløsning ved at måle absorbansen ved 280 nm?
4.
Er det bedst at vælge en membran med porer, der er større eller mindre end det protein, man arbejder med, når man skal dialysere?
5.
Hvilken størrelse har de andre proteiner i dialyseposen efter dialyse i forhold til β-lactamasen?
6.
Hvilken ladning har molekylerne i resinet, som man benytter til anion affninitetskromatografi-trinnet?
7.
Hvorfor tror I, det er muligt at eluere proteinet med en saltholdig buffer?
8.
Hvor rent er jeres β-lactamase efter anionbytningen sammenlignet med før dette trin?
Vurder ud fra gelen i Figur 6.
9.
Vil I vurdere dette trin som ideelt?
10.
Foreslå en anden oprensningsmetode, der vil være passende at bruge til videre oprensning?
11.
Hvorfor er der en stor del af proteinet, der ikke binder til søjlen, men som suser lige igennem i gennemløbet?
9
NOTER
10