1. No category

BIOZYMER ØVELSE 3
BEKÆMP DIN β-LACTAMASE
- TEST DIN EGEN MEDICIN!
FAGLIG BAGGRUND
For at få det maksimale udbytte af denne øvelse er det en forudsætning, at teorien bag enzymer, enzymkinetik og resistensmekanismer er bekendt. Hertil kan bl.a. henvises til kapitlet om antibiotika og resistens i ’Bioteknologiske Horisonter’ samt indlægget om enzymkinetik skrevet af Hans Christian Jensen, Ulla Christensen og Jakob Schiødt (tilgængeligt på www.emu.dk).
FORMÅL OG BAGGRUND
Formålet med øvelsen er at bestemme, hvilke stoffer eller betingelser, der kan
hæmme enzymet β-lactamase, og dermed forhindre baterievækst, når der er
antibiotika til stede. Dette gøres ved at teste aktiviteten af β-lactamasen på
agarplader, der indeholder antibiotikaet ampicillin. Ampicillin er ofte brugt i
forskning til at holde uønsket bakterievækst nede. Se faktaboks 1. Når man
kloner gener ind i bakterier, kan man bruge resistens til at selektere bakterier.
Hvis tilsætning af β-lactamasen tillader bakterievækst, er enzymet aktivt og
uhæmmet.
FAKTABOKS 1
RESISTENS I FORSKNING
I forskning kan det til tider
være en fordel at gøre sine celler
resistente, når man kloner. På
denne måde kan man gro dem
op i et medie, der indeholder
antibiotikum og forhindre alle
andre mikroorganismer, der
ellers også ville gro under disse
omstændigheder, fra at
overleve.
FAKTABOKS 2
Figur 1: Grundstrukturen af penicilliner. R er den del af penicillinen, der
kan variere. β-lactam-ringen er fremævet med rød.
Β-LACTAMASE
β-lactam-ringe er firledede ringe,
der udgør kernen i størstedelen
af antibiotika, der bliver brugt i
dag, inklusiv penicilliner, figur
1. β-lactamase er et enzym der
ødelægger denne firledede ring.
Udtrykkelsen af dette enzym kan
være med til at gøre bakterier
resistente over for en bred vifte
af forskellige antibiotika.
Antibiotika bruges til at bekæmpe bakterielle infektioner. β-lactam antibiotika
virker ved at hæmme enzymer, der er ansvarlige for dannelse af bakteriens
cellevæg. Disse enzymer hedder transpeptidaser. Ved at hæmme disse enzymer
stoppes celledeling, og bakterien dør. Som et forsvar mod β-lactam antibiotika
har bakterier videreudviklet den klasse af enzymer, der hedder β-lactamaser. En
β-lactamase katalyserer hydrolysen af β-lactam-ringe ved et nukleofilt angreb på
carbonyl carbon (angivet med en stjerne i figur 1). Derved åbnes den firledede
ring, figur 2. Når β-lactam-ringen er åbnet, har antibiotikaene mistet deres
virkning og kan derfor ikke længere hæmme transpeptidaserne (se faktaboks 3
om hydrolse og hydrolaser).
2
FORMÅL OG BAGGRUND
R
Figur 2: Reaktionen katalyseret
af β-lactamase. β-lactamasen
katalyserer hydrolosen af
β-lactama-ringe.
R
NH
S
N
R
O
–
O
NH
Beta-lactamase
H2O
O
S
NH
O
R
OH
FAKTABOKS 3
–
O
O
Det er ikke alle bakterier med β-lactamaser, der udgør en sygdomstrussel og
derned er patogene. Derimod ved vi, at alle patogene bakterier har β-lactamaser.
For at bekæmpe patogene bakterier, benyttes kombinationer af stoffer og/eller
der udvikles ny antibiotika. De patogene bakterier er i stand til at forsvare sig
mod sådanne tiltag ved at tilpasse det gen, der koder for β-lactamase og dermed
det protein, der bliver udtrykt. Denne tilpasning sker enten ved hjælp af mutationer i den β-lactamase, bakterien allerede har, eller ved horisontal gen-overførsel
fra en bakterie, der har genet, til en bakterie der ikke har. De nye β-lactamaser
har aktivitet på andre substrater og tilpasser sig hurtigt nye miljøer. Bakteriernes
primære forsvar mod antibiotika er derfor dannelsen af nye β-lactamaser.
Evnen til hurtigt at danne nye β-lactamaser skyldes det evolutionære pres, der
påhviler bakterierne for at overleve – survival of the fittest bacterium! Det er
smart for bakterien, men ikke smart for behandlingen af bakterielle infektioner.
Ved at danne nye β-lactamaser bliver bakterierne resistente overfor antibiotika,
der før kunne afhjælpe en infektion. Hvis bakterien bliver resistent overfor et
bredt spektrum af antibiotika, siges den at være multiresistent. Multiresistente
bakterier er et stort problem på bl.a. hospitaler.
HYDROLYSE
OG HYDROLASER
Når et molekyle hydrolyseres,
spaltes dette molekyle i to vha. et
vandmolekyle (af latin,
hydro - vand og lysere - spalte).
Et enzym, der katalyserer en
hydrolyse, hedder en hydrolase.
Den tilfældige (spontane)
hydrolyse af β-lactamer er meget
langsom. For at have bedre
chancer for at overleve
antibiotika har visse
bakterieceller altså udviklet
enzymer, der kan øge tempoet
hvormed β-lactam-stofferne
hydrolyseres. Disse
enzymer hedder β-lactamaser.
β-lactamaser er altså en
underklasse af hydrolaserne.
I denne øvelse skal I afprøve aktiviteten af β-lactamasen, når den udsættes for
forskellige behandlinger. Det betyder praktisk, at I skal undersøge om β-lactamasen er i stand til at katalysere åbningen af β-lactam-ringen under
forskellige betingelser. Dette kan visualiseres ved at undersøge E. colis evne til at
overleve på en agarplade, hvor der er tilsat en β-lactam antibiotika i vækstmediet. I skal først udsætte β-lactamasen for forskellige betingelser, der
kan ødelægge dens tredimensionelle struktur, tilstoppe dets aktive site, eller på
anden vis stresse proteinet kemisk. Efter I har udsat den for bl.a. opvarmning, reduktionsmiddel, denaturant eller proteaser, skal I påsætte små ringe af β-lactamasen (spotte) på pladen i forskellige koncentrationer.
Bagefter skal I, ovenpå β-lactamase-spotten, sætte levende
E. coli-celler. Hvis der, på trods af at der er væksthæmmer i form af
antibiotika i agarmediet, alligevel vokser E. coli kolonier op, der hvor I har spottet β-lactamase, så er β-lactamasen aktiv og kan beskytte E. coli mod
ampicillinen, se figur 3 på næste side.
3
FORMÅL OG BAGGRUND
Figur 3: Pladeassay.
Pladeassayet virker som
angivet på figuren ovenfor; en
LB-agarplade med antibiotika
spottes med den β-lactamase,
I vil afprøve aktiviteten af.
Hvis β- lactamasen er katalytisk aktiv, vil E. coli cellerne,
der spottes ovenpå, overleve
(øverst). Hvis β-lactamasen
er inaktiv, vil I ikke se nogen
bakterievækst (nederst).
Et typisk resultat af pladeassayet kan se ud som på Figur 4. Her er der i de øvrige
forsøg anvendt andre proteiner, der ikke er enzymer og derfor ikke kan angribe
ampicillinen.
Figur 4: Pladeassay med ikkeβ-lactamaser.
Følgende proteiners evne
til at katalysere åbningen af
β-lactam-ringen blev undersøgt i de angivne koncentrationer (2 μg, 0,2 μg, 0,02 μg
og 0,002 μg): β-lactamase
(positiv kontrol); ovalbumin;
lysozym; og β-lactoglobulin.
Det ses af dette pladeassay, at
kun β-lactamasen er i stand
til at katalysere åbningen af
β-lactam-ringen, symboliseret
ved de hvide bakteriekolonier.
4
FORMÅL OG BAGGRUND
Som det kan ses af figur 4, vokser bakterierne gerne, når der tilsættes β-lactamasen
(de hvide spots), hvorimod der ikke er nogen bakterier, der kan gro ved de tre
andre proteinspots. I kan også bemærke, at der er lavet en serie af forsøg, hvor
β-lactamasen er tilsat i forskellig koncentrationer. Hertil skal I bruge en fortyndingsrække. Denne fremstilles som vist i figur 5.
Figur 5: Fremstilling af
fortyndinger.
5
FREMGANGSMÅDE
FREMSTILLING AF AGARPLADER
·· Agaren opvarmes til ca. 60° C enten vha. mikroovn eller vandbad. Hvis
mikroovn benyttes, skal I være forsigtige med at bruge for høj effekt over
for lang tid, da agaren så vil stødkoge. Vi anbefaler, at I prøver jer frem ved
en meget lav frekvens i korte tidsrum.
··
Sæt en streg på jeres petriskåle, der markerer ca. 1 cm fra bunden.
··
Når agaren er varmet op, hælder I det forsigtigt ned i en petriskål, til det når
den markerede streg. Petriskålen vil have et låg. Det er den med den største
omkreds. Sørg derfor for at hælde agar i bunden.
For at undgå at der kommer alt for mange luftbobler i agaren, skal I hælde
med en konstant hastighed. Agarpladen stilles til tørring med låget halvt på.
Tørringen tager ca. 30 minutter.
AKTIVITETSASSAY
·· Mens agarpladerne tørrer, kan I gøre jeres β-lactamase opløsninger klar.
Hvert hold undersøger en forudbestemt betingelse samt en bestemmelse
efter eget ønske (jeres egen ”medicin”).
··
Start med at opmærke 10 Eppendorfrør: fem til den forudbestemte betingelse og fem til jeres eget forslag. Fra en udleveret stamopløsning af
β- lactamase laves en fortyndingsserie som vist overfor i de fem opmærkede
Eppendorfrør. På den måde får I et indtryk af, hvor meget enzym der skal til
for, at bakterien vil overleve tilstedeværelsen af antibiotika.
BETINGELSER
Når I har fremstillet jeres 10 rør, er I klar til at undersøge om β-lactamase kan
give vækstbetingelse til bakterierne. I skal derfor undersøge under hvilke
betingelser β-lactamasen er katalytisk aktiv, det vil sige kan hydrolysere en
β-lactam-ring. Som nævnt tidligere skal dette undersøges ved at teste E. colis
overlevelsesevne på β-lactamase spots.
Når I har udsat β-lactamasen for den ønskede behandling (se forslagsliste
nedenfor), skal I forsigtigt afsætte 5 μl β-lactamase på en agarplade fra hver
fortynding, helst så det danner en cirkel. Lad spotten tørre i 5-10 minutter, enten
på bordet eller ved at sætte det ind ved 37° C. Efter tørring påsættes 5 μl levende
E. coli-celler ovenpå β-lactamase-spotten. Lad igen spotten tørre. Stil (inkuber)
pladen ved 37° C natten over eller 48 timer ved stuetemperatur.
Efter inkubationen vil det være tydeligt at se, om der er vækst eller ej, og dermed
om β-lactamase har bevaret sin katalytiske aktivitet. Der, hvor β-lactamasen ikke
er slået ud, men fortsat er aktiv, vil der gro bakterier, så der dannes et tæppe af
cellekolonier. Der, hvor β-lactamase er katalytisk inaktiv, vil bakterierne ikke
kunne gro.
Når man laver forsøg som dette, er det vigtigt at have en positiv og en negativ
kontrol. Dette er henholdsvis et forsøg, hvor man er sikker på, at dét stof man
bruger virker og sikker på, at det stof man bruger ikke virker.
Udtænk, hvordan disse forsøg skal sættes op?
DET SKAL I BRUGE:
BUFFERE
OG OPLØSNINGER
·· 2 mg/ml β-lactamase opløst i
50 mM fosfatbuffer pH 7 (kan
enten købes som frysetørret
pulver eller oprenses)
·· 50 mM Tris-HCl pH 7
·· 1 l LB-agar med 100 µg/ml
ampicillin tilsat (nok til ca. 20
agarplader)
·· 8 M urea
·· Gentamycin
·· Ampicillin opløst i milli-q
vand til 100 mg/ml
·· 1 M β-mercaptoethanol
·· 1 M dithioreitol
·· 0.25 M EDTA
·· Din egen ubekendte faktor/
medicin – kun fantasien
sætter grænser (kaffe, cola,
vaskepulver, sulfo etc)
MATERIALE
OG APPARATUR
·· Petriskåle – afhænger af
antallet af grupper og antallet af betingelser man ønsker
undersøgt
·· 10 µl pipetter, 1 mL pipetter
per hold og pipettespidser
·· Eppendorfrør til blandinger
·· E. coli stamme uden B-lactamase aktivitet (f.eks. DH5a )
·· 37° C varmeskab
·· Evt. varmeblok
·· Mikrobølgeovn
·· Handsker, kitler og sikkerhedsbriller
6
FREMGANGSMÅDE
MULIGE BEHANDLINGER AF β-LACTAMASEN
TIL AKTIVITETSASSAYET:
Hvert hold får én af betingelserne 1-9 samt en valgfri mulighed:
1. Native forhold – det vil sige, at β-lactamasen er korrekt foldet og ved pH 7
2. Efter inkubation i 6 M urea i 5 minutter
3. Efter opvarmning til 95° C i fem minutter
4. Efter opvarmning til 95° C i fem minutter tilsat 5 mM β-mercaptoethanol eller DTT (dithiotreitol)
5. β-lactam antibiotika som ampicillin, carbenicillin, spectomycin, gentamycin,
kanamycin, etc.
6. Tilsæt en protease, eksempelvis trypsin
7. Tilsæt spyt
8. Din egen ”medicin” (cola, kaffe, opløst vaskepulver, gødning, etc)
NEDENSTÅENDE SKEMA UDFYLDES EFTER FORSØGET:
BETINGELSE
FORTYNDING 1
FORTYNDING 2
FORTYNDING 3
FORTYNDING 4
FORTYNDING 5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
7
SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN
SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN
1.
Spørgsmål
Var
der nogen
1 betingelser der tillod bakterievækst? Hvilke?
2.
Spørgsmål
Var
der nogen
2 betingelser der ikke tillod bakterievækst? Hvilke?
3.
Spørgsmål
Hvad
var begrundelsen
3
for jeres valg af betingelse?
4.
Spørgsmål
Hvilket
forsøg
4 ville du lave for at sikre, at dit forsøg virker? (den postive og den negative kontrol)
5.
Spørgsmål
Hvad
er en 5protease, og hvordan virker den?
6.
Spørgsmål
Hvorfor
tilsætter
6
man ampicillin til agaren?
7.
Spørgsmålvil
Hvorledes
7 I formode, at ampicillin og gentamycin adskiller sig fra hinanden?
8.
Spørgsmål
Hvorfor
er kun
8 nogle bakterier patogene og andre ikke?
9.
Hvordan virker gentamycin?
8
NOTER
9