Linkki julkaisuun - UEF Electronic Publications - Itä

HYVIN PIENITAAJUISEN MAGNEETTIKENTÄN VAIKUTUS
ROTAN GLIOOMASOLUJEN
HAPPIRADIKAALITUOTANTOON JA DNA-VAURIOIHIN –
VAIKUTUSTEN ESTÄMINEN N-ASETYYLIKYSTEIINILLÄ
Joni Mustonen
Pro Gradu -tutkielma
Ympäristötiede
Itä-Suomen yliopisto, Ympäristötieteen laitos, Kuopio
Kesäkuu 2015
ITÄ-SUOMEN YLIOPISTO, Luonnontieteiden ja metsätieteiden tiedekunta
Ympäristötiede
Mustonen, Joni: Hyvin pienitaajuisen magneettikentän vaikutus rotan glioomasolujen
happiradikaalituotantoon ja DNA-vaurioihin – vaikutusten estäminen N-asetyylikysteiinillä
Pro Gradu -tutkielma 45 sivua, 1 liite (3 sivua)
Tutkielman ohjaajat:
Tutkijatohtori Jukka Luukkonen, FT
Yliopistonlehtori Jonne Naarala, FT, dosentti
Kesäkuu 2015
avainsanat: antioksidantti, DNA-vaurio, happiradikaali, hyvin pienitaajuinen magneettikenttä,
N-asetyylikysteiini, oksidatiivinen stressi
TIIVISTELMÄ
Sähkömagneettisten kenttien terveysvaikutuksia on tutkittu useita vuosikymmeniä ja
tutkimukset ovat osoittaneet pienitaajuisten magneettikenttien voivan aiheuttaa lisääntynyttä
happiradikaalituotantoa
solutasolla,
mutta
yksiselitteistä
vastausta
solutason
vaikutusmekanismista ei toistaiseksi ole löydetty.
Tässä tutkimuksessa selvitettiin hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia välittömiä
vaikutuksia rotan glioomasolujen happiradikaalituotantoon DCFH-DA-menetelmällä ja DNAvauriovasteeseen
yksisolugeelielektroforeesilla
eli
Comet
Assay-menetelmällä.
Tutkimuksessa selvitettiin myös, pystytäänkö mahdollisia vaikutuksia estämään
yleisantioksidantti N-asetyylikysteiinillä. Osaa soluista altistettiin myös menadionille. Lisäksi
määritettiin solujen elävyyttä propidiumjodidin ja digitoniinin avulla.
Magneettikenttäaltistus laski happiradikaalituotantoa yhteisaltistuksessa menadionin kanssa
lähes jokaisessa tapauksessa. Antioksidantti NAC laski happiradikaalituotantoa välittömästi
magneettikenttäaltistuksen
jälkeen
määritettynä,
mutta
tässäkin
tapauksessa
happiradikaalituotanto näytti olevan pienempi magneettikenttäaltistetuilla soluilla verrattuna
kontrolleihin. Menadionialtistus lisäsi happiradikaalituotantoa, mutta NAC:lla ei tätä
vaikutusta pystytty estämään vastoin odotuksia, vaan NAC jopa lisäsi happiradikaalituotantoa
verrattuna kontrolleihin. Useat tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että hyvin
pienitaajuinen magneettikenttä lisää happiradikaalituotantoa. Tässä tutkimuksessa
magneettikenttäaltistuksella happiradikaalituotanto oli kuitenkin pienempi lähes jokaisessa
tapauksessa verrattuna kontrolliin. Tämä voi aiheutua siitä, että käytetty menetelmä ei ole
tehokas määrittämään spesifejä happiradikaaleja, kuten superoksidianioneja tai
vetyperoksideja.
Magneettikentälle altistettujen solujen DNA-vauriovastetta kuvaava OTM-arvo oli suurempi
verrattuna kontrollisoluihin. Magneettikenttäaltistus lisäsi DNA-vauriovastetta, mutta laski
happiradikaalituotantoa. Magneettikentän vaikutusmekanismi solutason tapahtumiin voi siis
olla jokin muu kuin happiradikaalituotannon kautta, mutta lisätutkimuksia tarvitaan eri
solulinjoilla ja spesifisemmillä menetelmillä eri happiradikaalien määrittämiseksi. Lisäksi
tarvitaan tutkimuksia eri antioksidanttien eri pitoisuuksilla, jolloin mahdolliset suojaavat
vaikutukset saadaan paremmin esiin. Antioksidanttikäsittelyn keston tai ajankohdan
vaikutusta magneettikentän aiheuttaman happiradikaalituotannon kasvun estämiseen tulisi
myös tutkia lisää.
ESIPUHE
Tämä Pro Gradu -tutkielma on tehty Itä-Suomen yliopiston Ympäristötieteen laitoksen
Fysikaalisten ja kemiallisten riskien tutkimusryhmässä säteilybiologian laboratoriossa
Genomic instability induced by genotoxic and non-genotoxic exposures-projektissa (GITOX).
Tutkielmani laboratoriotyöt suoritin kesän ja syksyn 2014 aikana. Kirjallisen osuuden tein
syksyn 2014 ja kevään 2015 aikana.
Esitän mitä parhaimmat kiitokseni tutkijatohtori Jukka Luukkoselle ja yliopistonlehtori Jonne
Naaralalle mielenkiintoisen tutkimusaiheen tarjoamisesta ja erinomaisesta ohjauksesta aina
laboratoriotöistä kirjoitusvaiheeseen. Haluan kiittää erityisesti myös laboratoriomestari Hanne
Säppiä avusta laboratoriotyöskentelyssä. Kiitos myös nuorempi tutkija Mikko Herralalle
tutkielmani toisena tarkastajana toimimisesta.
Suuret kiitokset perheelleni, sukulaisilleni ja ystävilleni kaikesta saamastani tuesta ja
kannustuksesta Pro Gradu –tutkielman teon eri vaiheissa ja opiskelujen aikana.
Porissa, 9. kesäkuuta, 2015
Joni Mustonen
SISÄLLYSLUETTELO
1 JOHDANTO............................................................................................................................ 5
2 KIRJALLISUUSKATSAUS ................................................................................................... 6
2.1 IONISOIMATON SÄTEILY JA SÄHKÖMAGNEETTISET KENTÄT ....................... 6
2.1.1 Hyvin pienitaajuiset magneettikentät ......................................................................... 6
2.2 OKSIDATIIVINEN STRESSI JA ANTIOKSIDANTIT ................................................. 8
2.2.1 Happiradikaalit ja oksidantit ...................................................................................... 9
2.2.2 Antioksidantit oksidatiivisen stressin torjunnassa ................................................... 10
2.2.3 Oksidatiivinen stressi solutason häiriöiden ja karsinogeneesin taustalla ................. 11
2.3 HYVIN PIENITAAJUISTEN MAGNEETTIKENTTIEN AIHEUTTAMAT
SOLUTASON VAIKUTUKSET ......................................................................................... 14
2.3.1 Vaikutukset oksidatiivisiin prosesseihin, genomiin ja DNA-vaurioihin ................. 15
3 TYÖN TAVOITTEET .......................................................................................................... 18
4 AINEISTO JA MENETELMÄT .......................................................................................... 19
4.1 SOLULINJA JA SOLUVILJELY .................................................................................. 19
4.1.1 Solujen valmistelu altistuksia varten ....................................................................... 20
4.2 MÄÄRITYSMENETELMÄT ........................................................................................ 20
4.2.1 Happiradikaalituotanto ............................................................................................. 20
4.2.2 Solujen elävyys ........................................................................................................ 21
4.2.3 DNA-vauriot ............................................................................................................ 22
4.3 ESIKOKEET .................................................................................................................. 24
4.4 KOEASETELMA JA MAGNEETTIKENTTÄALTISTUSLAITTEISTO ................... 29
4.5 TILASTOLLISET ANALYYSIT .................................................................................. 30
5 TULOKSET .......................................................................................................................... 31
5.1 HAPPIRADIKAALITUOTANTO JA SOLUJEN ELÄVYYS ..................................... 31
5.2 DNA-VAURIOT ............................................................................................................ 35
6 TULOSTEN TARKASTELU ............................................................................................... 37
7 YHTEENVETO .................................................................................................................... 40
LÄHTEET ................................................................................................................................ 41
LIITE 1. KEMIKAALIT JA LIUOKSET ................................................................................ 46
5
1 JOHDANTO
Sähkömagneettisille kentille altistuminen on lisääntynyt merkittävästi viime vuosikymmeninä
tapahtuneen yhteiskunnan sähköistymisen ja kehittyneen elektroniikan vuoksi. Näille kentille
altistuminen on kasvanut niin asuinperäisesti kuin työperäisestikin. Näin ollen huoli
mahdollisista haitallisista terveysvaikutuksia on kasvanut, sillä kyseisille sähkömagneettisille
kentille altistuminen on lähes jatkuvaa ja niiltä kokonaan suojautuminen mahdotonta.
Sähkömagneettisten kenttien terveysvaikutuksia on tutkittu useita vuosikymmeniä. Useat
tutkimukset ovat osoittaneet pienitaajuisten magneettikenttien voivan aiheuttaa lisääntynyttä
happiradikaalituotantoa solutasolla, mutta yksiselitteistä vastausta solu- ja molekyylitason
vaikutusmekanismista ei toistaiseksi ole löydetty. Ympäristössä ei altistuta pelkästään yhdelle
altisteelle kerrallaan, joten on muistettava erilaisten yhdisteiden, niin kemiallisten kuin
fysikaalisten altisteiden aiheuttama mahdollinen kokarsinogeeninen vaikutus.
Pienitaajuisten
magneettikenttien
on
havaittu
aiheuttavan
radikaaliparien
uudelleenjärjestymistä, joten yksi mahdollinen ja todennäköisin vaikutusmekanismi on
radikaaliparimekanismi.
Happiradikaalit
horjuttavat
solun
tasapainotilaa
aiheuttaen
oksidatiivista stressiä. Oksidatiivisen stressin ja syövän kehittymisen välillä on havaittu
yhteys, sillä happiradikaalit kykenevät aiheuttamaan mutaatioita DNA:ssa. Happiradikaalien
ylimäärästä aiheutuvat DNA-vauriot ovat pääosin yksöis- ja kaksoisjuostevaurioita sekä
puriinien,
pyrimidiinien
ja
deoksiriboosien
rakenteiden
muutoksia.
Solut
lisäävät
antioksidanttituotantoa oksidatiivisen stressin torjunnassa. Antioksidanttien avulla solut
pelkistävät haitallisia yhdisteitä vähemmän haitallisempaan muotoon. Näin ollen kiinnostava
ajatus onkin, pystytäänkö antioksidanteilla vähentämään tai estämään kokonaan hyvin
pienitaajuisten magneettikenttien aiheuttamia solutason vaikutuksia.
Tässä tutkimuksessa selvitettiin hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia välittömiä
vaikutuksia rotan glioomasolujen happiradikaalituotantoon ja DNA-vauriovasteeseen.
Tutkimuksessa
selvitettiin
myös
pystytäänkö
mahdollisia
vaikutuksia
yleisantioksidantti N-asetyylikysteiinillä. Lisäksi määritettiin solujen elävyyttä.
estämään
6
2 KIRJALLISUUSKATSAUS
2.1 IONISOIMATON SÄTEILY JA SÄHKÖMAGNEETTISET KENTÄT
Ionisoimaton säteily on sähkö- ja magneettikentistä muodostuvaa säteilyä, joka koostuu
ultraviolettisäteilystä, näkyvästä valosta, infrapunasäteilystä, radioaalloista ja pientaajuisista
sähkömagneettisista kentistä. Joskus ionisoimattomaksi säteilyksi luokitellaan myös ultraääni.
Ionisoimattomaan säteilyyn luokitellaan myös staattiset kentät. Maapallon staattisen
magneettikentän voimakkuus on keskimäärin 0,05 mT. (Jokela 2006.)
Riittävän pienillä taajuuksilla fotonin energia pienenee. Fotonin energian jäädessä alle 12
elektronivoltin, ionisaatiota ei tapahdu merkittävissä määrin, jolloin kemiallisen sidoksen
ionisoitumista ei esiinny. Tällöin puhutaan ionisoimattomasta säteilystä. Ionisoimattoman
säteilyn aallonpituusrajana voidaan pitää yli 100 nm aallonpituusaluetta. Kentän
voimakkuuden pysyessä vakiona, kenttiä kutsutaan staattisiksi. Kentän muutosnopeuden
kasvaessa kentät etenevät sähkömagneettisena aaltoliikkeenä. (Jokela 2006.) Kuvassa 1 on
kaaviokuva sähkömagneettisen säteilyn spektristä taajuuksineen ja aallonpituuksineen.
Taajuus
30 Hz
Staattinen
kenttä
300 Hz
100 kHz
300 GHz 300 THz 750 THz
Hyvin
Välitaajuinen Radiotaajuus- Infrapunapienitaajuinen
kenttä
säteily
magneettikenttä
magneettikenttä
10 000 km
1000 km
3 km
1 mm
Näkyvä
valo
1 µm
30 PHz
RöntgenUltraviolettija gammasäteily
säteily
400 nm
100 nm
Aallonpituus
Kuva 1. Sähkömagneettisen säteilyn spektri.
2.1.1 Hyvin pienitaajuiset magneettikentät
Pienitaajuiset sähkö- ja magneettikentät jaotellaan välitaajuisiin ja hyvin pienitaajuisiin
magneettikenttiin. Hyvin pienitaajuisten magneettikenttien taajuus on alle 300 Hz. Tämän
7
taajuisten kenttien on havaittu olevan riittävän voimakkaita indusoimaan ihmiseen
sähkökenttiä. Ulkoisen magneettikentän aiheuttama induktiosähkökenttä kehoon synnyttää
kehossa induktiovirtoja eli kiertäviä sähkövirtoja. Kehon koko ja asento suhteessa
magneettikentän suuntaan vaikuttavat sähkömagneettisen induktion muodostumiseen. Hermoja lihassolujen sähköärsytystä voi aiheutua voimakkaista induktiosähkökentistä. (Jokela
2006). Aivotoiminnot ja monet muut elimistön biologiset toiminnot, kuten esimerkiksi
ruuansulatus
ovat
riippuvaisia
hermoston
välittämistä
impulsseista.
Pienitaajuiset
magneettikentät voivat vaikuttaa kaikkiin näihin sähköisiin hermotoimintoihin. (D’Angelo
ym. 2015.)
Pääasiallisia pienitaajuisten magneettikenttien lähteitä ovat sähköenergian tuotanto, jakelu ja
käyttö. Kotitalouksissa huomattavimman magneettikentän voi aiheuttaa kiinteistömuuntamo.
Pääosin
kotitalouksissa
esiintyvät
50
Hz
magneettikentät
ovat
alle
0,1
µT
kentänvoimakkuudella, mutta kiinteistömuuntamoiden läheisyydessä olevissa asuintiloissa
voi esiintyä jopa yli 100 µT:n magneettikenttiä. Metalliteollisuuden prosesseissa voi esiintyä
jopa 100 mT:n voimakkuudella olevia sähkömagneettisia kenttiä. Kauppaliikkeiden
varashälytinportit ja lentokenttien metallinpaljastuslaitteistot voivat aiheuttaa niistä kulkevalle
ihmiselle varsin suuren hetkellisen magneettikenttäaltistuksen. Kyseiset laitteet toimivat
taajuusalueella 100 Hz – 100 kHz. (Jokela 2006). Kansainvälinen syöväntutkimuskeskus on
luokitellut pienitaajuiset sähkömagneettiset kentät ryhmään 2B eli mahdollisesti ihmiselle
karsinogeeneiksi (IARC Monographs 2002). Kyseinen luokitus perustuu epidemiologisesti
osoitettuun lisääntyneen lasten leukemian ja asuinoloissa tapahtuvan hyvin pienitaajuisille
magneettikentille altistumisen väliseen yhteyteen. In vivo –tutkimuksilla ilman yhteisaltisteita
on
hyvin
pienitaajuisilla
magneettikentillä
havaittu
vain
hyvin
pieniä
viitteitä
karsinogeenisistä vaikutuksista. Hyvin pienitaajuisten magneettikenttien on havaittu lisäävän
joidenkin tunnettujen DNA-vaurioita aiheuttavien altisteiden vaikutuksia. Eräs mahdollinen
mekanismi selittämään hyvin pienitaajuisten magneettikenttien aiheuttamia vaikutuksia on
niin kutsuttu radikaaliparimekanismi. (Juutilainen ym. 2006). Radikaaliparit jaotellaan
kahteen
pääryhmään
spinien
tilan
mukaisesti.
Korreloimattomilla
radikaalipareilla
(uncorrelated radical pairs) elektronien spinit ovat järjestyneet sattumanvaraisesti. Spinkorreloivilla
radikaalipareilla
(spin-correlated
radical
pairs)
elektronien
spinien
pyörimismäärä on vakio ja elektronien spinit ovat järjestyneet säännönmukaisesti.
Radikaaliparimekanismin mukaisesti magneettikenttä aiheuttaa mahdollisesti muutoksia
8
happiradikaalien parittomien elektronien spineissä ja spinien suuntauksissa. (Henbest ym.
2003; Timmel & Henbest 2004).
2.2 OKSIDATIIVINEN STRESSI JA ANTIOKSIDANTIT
Oksidatiivisella stressillä tarkoitetaan tilaa, jossa radikaalituotanto ja antioksidanttien määrä
ovat epätasapainossa eli solun hapetus-pelkistystila ei ole tasapainossa. Tämä tasapainotila on
varsin herkkä ja altis muutoksille. Normaaleissa olosuhteissa vapaiden radikaalien tuotanto ja
antioksidanttipuolustus ovat tasapainossa, jolloin solu ei kärsi oksidatiivisesta stressistä.
Oksidatiivisessa stressissä solukalvojen kalvopumppujen toiminta voi häiriintyä. Esimerkiksi
Na+/K+-ATPaasi voi vaurioitua oksidatiivisen stressin seurauksena aiheuttaen kaliumkanavien
toiminnan muutoksia, jolloin solukalvon potentiaali menee epätasapainoon. Myös Ca2+ -ionin
aineenvaihdunta soluissa voi häiriintyä kasvattaen solunsisäistä Ca2+ -konsentraatiota.
Yleisesti ottaen solut reagoivat hyvinkin eri tavoin radikaaleille altistuessaan ja vaikutukset
ovat
varsin
spesifisiä
solutyypille.
Vetyperoksidi
(H2O2),
superoksidianionit
ja
hydroksyyliradikaalit ovat tunnettuja vapaita radikaalityyppejä ja oksidantteja, joiden on
havaittu olevan yhteydessä apoptoosiin. Oksidatiivisen stressin tiedetään olevan hyvin
keskeisessä osassa syövän kehityksessä, mutta toisaalta oksidatiivinen stressi ei aina ole
haitallista. Esimerkiksi tulehdustilassa oksidatiivisen stressitilan tuottamat vapaat radikaalit
muun muassa tuhoavat haitallisia patogeenejä. (Halliwell 2007; Negi ym. 2014; Wätjen &
Beyersmann 2004.)
Siqueira ym. (2005) havaitsivat tutkimuksessaan yhteyden antioksidanttipuolustuksen
heikkenemisen aiheuttaman oksidatiivisen stressin ja rottien aivojen ikääntymisprosessin
välillä. He havaitsivat erityisesti häiriöitä aivojen nestekierrossa. Heidän tutkimus osoitti
oksidatiivisen stressin olevan monien neurodegeneratiivisten häiriöiden taustalla. Siqueira
ym. (2005) havaitsivat muun muassa hippokampuksen alueella olevan heikentynyttä
antioksidanttipuolustusta.
Oksidatiiviselle stressille ei ole olemassa varsinaista virallista luokittelujärjestelmää, mutta se
voidaan
jaotella
karkeasti
oksidatiivisen
stressitason
mukaisesti
taustatasoiseen
oksidatiiviseen stressiin (basal oxidative stress), matalaintensiteettiseen oksidatiiviseen
stressiin (low intensity oxidative stress), keski-intensiteettiseen oksidatiiviseen stressiin
9
(intermediate intensity oxidative stress) ja korkeaintensiteettiseen oksidatiiviseen stressiin
(high intensity oxidative stress). Lisäksi voidaan puhua akuutista ja kroonisesta
oksidatiivisesta stressistä. Akuutissa oksidatiivisessa stressitilassa happiradikaalitasot
palautuvat vakaalle tasolle ajan funktiona varsin nopeasti, kun taas kroonisessa
oksidatiivisessa stressitilassa happiradikaalitaso on pidempään epävakaassa tasossa aiheuttaen
edelleen solun homeostaasin epätasapainoa. (Lushchak 2014.)
2.2.1 Happiradikaalit ja oksidantit
Happiradikaaliksi tai vapaaksi radikaaliksi kutsutaan yhdistettä, jolla on pariton määrä
elektroneja. Happiradikaaleilla on erittäin matalat aktivaatioenergiat, joten ne ovat erittäin
reaktiivisia ja pystyvät pienen kokonsa ansiosta läpäisemään tehokkaasti solukalvon. Valtaosa
happiradikaaleista on peräisin mitokondrioiden aineenvaihduntatapahtumista, sytokromi
P450:n aineenvaihduntatapahtumista, peroksisomeista ja solun tulehdustapahtumista. (Jensen
2003; Valko ym. 2006.)
Eräs keskeisimmistä happiradikaaleista on superoksidianioni (O2•-). Sitä tuotetaan
mitokondriaalisessa
prosessissa,
jossa
vesimolekyylistä
vapautuu
happimolekyylejä.
Vetyperoksidia (H2O2) syntyy reaktioissa, jossa aminohapoista poistetaan aminoryhmät
(deaminaatio)
sekä
superoksididismutaasientsyymin
avulla
superoksidianioneista.
Vetyperoksidilla ei ole paritonta määrää elektroneja, joten se ei varsinaisesti toimi radikaalina,
mutta reagoi radikaalien tavoin, tosin ei yhtä kiivaasti kuin radikaalit. Näin ollen
vetyperoksidi luokitellaan yleisemmin oksidantiksi. Vetyperoksidilla on keskeinen osa
karsinogeneesissa, koska se voi diffundoitua mitokondrioiden ja solukalvojen läpi aiheuttaen
haitallisia vaikutuksia solussa. Vetyperoksidi voi aiheuttaa apoptoosia jo pieninäkin
millimolaaritason pitoisuuksina. Vetyperoksidin yhtenä mahdollisena hajoamistuotteena
syntyvän hydroksyyliradikaalin (•HO) on arvioitu aiheuttavan yli 50 % happiradikaalien
aiheuttamista
vaurioista,
lipidiperoksidaatiota.
sillä
hydroksyyliradikaali
kykenee
aiheuttamaan
Hydroksyyliradikaalin aiheuttamassa DNA-vauriossa syntyy 8-
hydroksiguanosiiniä, jonka hydrolyysi tuottaa 8-hydroksideoksiguanosiinia (8-OHdG). 8OHdG on yleisesti käytetty markkeri happiradikaalin aiheuttamasta DNA-vauriosta.
Hypokloriitti (ClO-) on amiineja, aminohappoja, tioleja, tioeettereitä, nukleotidejä ja
10
hemoproteiineja vaurioittava tehokas oksidantti. (Jensen 2003; Maccarrone ym. 1997; Reuter
ym. 2010.)
2.2.2 Antioksidantit oksidatiivisen stressin torjunnassa
Erään määritelmän mukaan antioksidanttina pidetään ainetta, joka pystyy heikentämään
merkittävästi jonkin toisen aineen hapettavia ominaisuuksia. Antioksidantteja on olemassa
lukuisia, eikä yhtä kaikenkattavaa ja parasta antioksidanttia voida nimetä. (Halliwell 2007.)
Solunsisäisistä antioksidanteista tärkeimpiä ja keskeisimpiä ovat superoksididismutaasit,
katalaasit, glutationiperoksidaasit sekä glutationit. Superoksididismutaasi on kaikkein
tehokkain solunsisäinen antioksidantti ja se toimii katalyyttinä superoksidianionin
muuntumisreaktiossa happimolekyyliksi ja vetyperoksidiksi. Katalaasi toimii peroksisomissa
ja sen tehtävänä on muuntaa vetyperoksidi vedeksi ja molekulaariseksi hapeksi.
Glutationiperoksidaasi
torjunnassa
ja
se
tioliantioksidantteihin
sytosolissa,
tumassa
toimii
hajottaa
pääsääntöisesti
peroksidit
luokiteltava
ja
matalatasoisen
vesimolekyyleiksi.
solunsisäinen
mitokondrioissa.
antioksidantti,
Tumassa
oksidatiivisen
Glutationi
jota
glutationi
stressin
on
tärkeä
esiintyy
eniten
ylläpitää
DNA:n
korjausmekanismeille välttämättömän sulfuuriproteiinin hapetustilaa. Glutationi muuntaa
vetyperoksideja ja lipidiperoksideja vähemmän reaktiivisempaan muotoon yhteisessä
reaktiossa glutationiperoksidaasin kanssa. Lisäksi glutationi osallistuu aminohappojen
kuljettamiseen solukalvon läpi. (Valko ym. 2006.)
Flavonoidit ovat hyviä ja tehokkaita antioksidantteja, sillä niiden on havaittu vaikuttavan
edullisesti solunsisäiseen hapetustilaan (Williams ym. 2004). Ishige ym. (2000) havaitsivat
eräiden flavonoidien toimivan suojana oksidatiivisen glutamaatin toksisuutta vastaan hiiren
hippokampaalisen solulinjan (HT-22) soluilla. Kasperczyk ym. (2014) havaitsivat
beetakaroteenin
laskevan
glutationiperoksidaasin
aktiivisuutta
lyijylle
altistuneilla
työntekijöillä, mutta esimerkiksi superoksididismutaasin aktiivisuudessa ei havaittu
merkittävää muutosta. Vaikka flavonoidit ovatkin varsin hyödyllisiä ja edullisia solun
toiminnan kannalta, niin silti eräiden flavonoidien on havaittu olevan sytotoksisia matalina
(µM) pitoisuuksina. Seibert ym. (2011) havaitsivat muun muassa apigeniinin ja luteoliinin
olevan sytotoksisia rotan C6-soluille.
11
Antioksidatiivisia vaikutuksia on havaittu myös melatoniinilla. Sen on havaittu tuottavan
positiivisia vaikutuksia diabeteksesta kärsivillä retinopaattisilla rotilla. Yhtenä mahdollisena
vaikutustapana lienee melatoniinin kyky suojata haiman insuliinia erittäviä β-soluja
oksidatiiviselta vauriolta. (Lushchak 2014.)
Hyvänä yleisantioksidanttina tunnettu kysteiinin esiaste N-asetyylikysteiini (NAC) toimii
glutationisynteesissä avustavana komponenttina. Glutationia pidetään yhtenä keskeisimmistä
sisäsyntyisistä antioksidanteista ja sillä on tärkeä osa immuunipuolustusjärjestelmässä.
Ihmiselimistössä NAC on merkittävässä osassa antioksidanttipuolustusjärjestelmässä ja näin
ollen oksidatiivisen stressin torjunnassa. NAC:n keskimääräinen puoliintumisaika on 5,6
tuntia. In vivo -kokeissa NAC:n on havaittu olevan mahdollisesti tehokas hoitokeino
heroiiniriippuvuuden hoidossa. (Sansone & Sansone 2011.)
Han
ym.
(1997)
käyttivät
tutkimuksessaan
rotan
C6-solulinjaa
ja
tutkivat
tioliantioksidanteiksi luokiteltujen alinolihapon (LA) ja N-asetyylikysteiinin (NAC) suojaavia
vaikutuksia. Sekä LA että NAC lisäsivät solujen glutationitasoja ja näin ollen suojasivat
soluja glutamaatin sytotoksisuudelta. Higuchi & Matsukawa (1999) havaitsivat glutationin
loppuun kuluttamisen aiheuttavan happiradikaalien lisääntymistä ja tämän puolestaan
aiheuttavan apoptoosin kautta suuria DNA-fragmentteja rotan C6-soluilla. Tämän on havaittu
olevan yhteydessä lipidiperoksidaatioon. Güler ym. (2008) havaitsivat NAC:n lisäävän
glutationiperoksidaasin aktiivisuutta 50 Hz magneettikentälle altistettujen marsujen
maksakudoksessa, joten myös heidän tutkimus osoitti NAC:n antioksidatiivisia vaikutuksia eli
NAC:lla oli vaikutusta oksidatiivisen stressin torjunnassa.
2.2.3 Oksidatiivinen stressi solutason häiriöiden ja karsinogeneesin taustalla
Oksidatiivisen stressin on havaittu olevan merkittävä tekijä esimerkiksi Alzheimerin ja
Parkinsonin taudin synnyssä sekä myös muissa neurologisissa häiriötiloissa. Raskasmetalliioneilla on taipumusta lisätä vapaiden radikaalien tuotantoa aiheuttaen näin ollen
oksidatiivista vauriota. Esimerkiksi Fe2+-, Cu2+- ja Co2+-ionien on havaittu olevan kykeneviä
happiradikaalituotannon lisäämiseen. (Wätjen & Beyersmann 2004.) Wätjen & Beyersmann
(2004)
havaitsivat
tutkimuksissaan
vetyperoksidin
ja
kadmiumkloridin
yhteisaltistuksen lisäävän apoptoottista DNA:n pilkkoutumista rotan C6-soluilla.
(CdCl2)
12
Useilla in vitro –tutkimuksilla on osoitettu glutamaatin olevan sytotoksinen muun muassa
kystiinin kulkeutumismekanismin häiriön aiheuttaman oksidatiivisen stressin kautta. Tästä
häiriöstä aiheutuu happiradikaalituotannon kasvua. Kysteiini, jonka hapettumisesta kystiini
muodostuu, toimii substraattina glutationisynteesissä (GSH). Glutamaatin aiheuttama
oksidatiivinen stressi on osoitettu olevan ensisijainen sytotoksisuutta aiheuttava tekijä muun
muassa C6- ja PC-12-solulinjoilla. (Han ym. 1997). Glutamaatin on havaittu lisäävän myös
ihmisen neuroblastoomasolujen (SH-SY5Y) happiradikaalituotantoa sekä aiheuttavan yhdessä
lyijyn kanssa oksidatiivista stressiä ja edelleen soluvauriota (Naarala ym. 1995).
DNA vaurioituu jatkuvasti sisäisten ja ulkoisten tekijöiden kautta ja DNA:ta korjataan
jatkuvasti korjausentsyymien toimesta. Epätasapaino vaurioiden ja korjausentsyymien
toiminnassa aiheuttaa DNA-vaurioiden kertymistä ja tämä voi aiheuttaa muun muassa
solukuolemaa, ikääntymistä tai syövän kehittymistä. DNA:n juostevauriot ovat joko yksöistai kaksoisjuostevaurioita. Kaksoisjuostevaurio on solun kannalta erittäin kriittinen ja yleensä
kaksoisjuostevauriolla on letaali vaikutus. (Phillips ym. 2009.)
Vapaiden radikaalien aiheuttaman DNA-molekyylien ja muiden biologisten molekyylien,
kuten lipidien ja proteiinien hapettumisen on havaittu olevan yhteydessä lukuisiin solutason
häiriöihin ja sairauksiin. Erityisesti lipidit ovat varsin alttiita vapaille radikaaleille. Lipidien
hapettuminen eli lipidiperoksidaatio aiheuttaa solujen kalvorakenteiden toimintahäiriöitä.
Lipidiperoksidaation reaktiotuotteet ovat erittäin sytotoksisia aiheuttaen proteiinien ja DNA:n
rakenteiden muutoksia. Lipidiperoksidaation reaktiotuotteena tunnetun trans-4-hydroksi-2nonenaalin ja DNA:n reaktiossa syntyvien DNA-adduktien on havaittu olevan keskeisessä
osassa syövän synnyssä. Lipidiperoksidaatiota on pystytty estämään luonnollisilla
antioksidanteilla, kuten C- ja E-vitamiineilla, karotenoideilla ja flavonoideilla sekä
synteettisillä antioksidanteilla. (Bartsch & Nair 2004; Negi ym. 2014; Omata ym. 2010;
Sander ym. 2003.)
Syövän kehityksen ja oksidatiivisen stressin välillä on havaittu selvä yhteys, sillä
oksidatiivinen stressi lisää mutaatioita DNA:ssa. Happiradikaalien ylimäärästä aiheutuvan
oksidatiivisen
stressin
kaksoisjuostevaurioita
aikaansaamat
sekä
puriinien,
DNA-vauriot
pyrimidiinien
ovat
ja
pääosin
deoksiriboosien
yksöis-
ja
rakenteiden
muutoksia. Nämä DNA-vauriot voivat vaikuttaa haitallisesti solun transkriptioon eli
tapahtumaan, jossa RNA-polymeraasi kopioi DNA:n geneettistä koodia RNA:ksi. Lisäksi
13
kyseiset DNA-vauriot voivat aiheuttaa replikaation eli solun DNA:n kahdentumisen häiriöitä
sekä lisäksi genomin epävakaisuutta. Oksidatiivinen stressi voi häiritä myös solun
signaalitransduktiota ja solun signaalinvälitystä. Näillä edellä mainituilla DNA:n vaurioilla ja
häiriötiloilla on havaittu yhteyksiä karsinogeneesiin. (Reuter ym. 2010; Valko ym. 2006.)
Oksidatiivisesta stressistä aiheutuva tulehdusvasteen nousu voi käynnistää suoraan
happiradikaalivälitteisen syövän kehityksen tai epäsuorasti signaalivälityksen kautta.
Happiradikaalit voivat aiheuttaa DNA:n juostevaurioiden lisäksi pistemutaatioita sekä
mutaatioita esisyöpägeeneissä ja kasvurajoitegeeneissä, jolloin syövän kehittyminen
pahanlaatuisempaan suuntaan voi olla mahdollista. Happiradikaalit kykenevät laskemaan
DNA:n yhteensopimattomien nukleotidien korjaukseen (mismatch repair) liittyvien geenien
entsymaattista aktiivisuutta ja lisäämään genomin hypermetylaatiota aiheuttavien DNA:n
metyylitransferaasien tuotantoa. (Reuter ym. 2010.)
Ikääntymisprosessi lisää solunsisäistä oksidatiivista stressiä ja happiradikaalien ylimäärän on
havaittu lisäävän eturauhasen karsinogeneesiä, sillä DNA:n korjausmekanismit eivät toimi
oikein oksidatiivisen stressin takia. Mieshormoni androgeenin on havaittu alentavan
solunsisäisen
glutationin
määrää
ja
lisäävän
näin
ollen
oksidatiivista
stressiä
androgeenivasteisissa eturauhassyöpäsoluissa (LNCaP). Oksidatiivisesta stressistä aiheutuvat
vauriot lisääntyvät luonnollisesti ikääntymisen myötä ja tämä on yhtenä syynä esimerkiksi
eturauhassyövän lisääntyneessä insidenssissä ikääntyneillä miehillä. (Minelli ym. 2009.)
Yleisen karsinogeneesin lisäksi oksidatiivisen stressin on havaittu olevan yhteydessä
fotokarsinogeneesiin iholla. Ihon entsymaattiseen antioksidanttipuolustukseen osallistuvat
sytosolinen
kupari-sinkkisuperoksididismutaasi
(CuZnSOD),
mitokondrionaalinen
mangaanisuperoksididismutaasi (MnSOD) ja katalaasientsyymi. In vitro-kokeissa näiden
entsyymien on havaittu muuntuvan ultraviolettisäteilyn vaikutuksesta ihosoluissa ja
vastaavasti hiiren ihossa in vivo-kokeissa. Näin ollen ihosolut kärsivät oksidatiivisen stressin
aiheuttamasta
lisääntyneestä
antioksidanttientsyymien
määrä
ihon
ja
vanhenemisprosessista.
lipidiperoksidaation
Onkin
kiihtyminen
havaittu,
että
pahanlaatuisessa
melanoomakudoksessa on suurempi verrattuna kontrollikudokseen. (Sander ym. 2003.)
14
2.3 HYVIN PIENITAAJUISTEN
SOLUTASON VAIKUTUKSET
MAGNEETTIKENTTIEN
AIHEUTTAMAT
Sähkömagneettisten kenttien vaikutuksia soluorganelleihin, kudoksiin ja soluihin on tutkittu
useiden
kymmenien
vuosien
ajan.
Useilla
in
vitro
-tutkimuksilla
on
osoitettu
sähkömagneettisten kenttien vaikuttavan solun fysiologiseen tilaan. Eräät tutkimukset ovat
myös osoittaneet sähkömagneettisilla kentillä olevan vaikutusta solun kasvuun, mutta nämä
tulokset ovat olleet kiistanalaisia. Sähkömagneettisten kenttien aiheuttamat haitalliset
vaikutukset
kudoksessa
riippuvat
kentän
taajuudesta,
kentänvoimakkuudesta
ja
altistumisajasta sekä altistuvan kohdekudoksen tai soluorganellin herkkyydestä. (D’Angelo
ym. 2015; Zhang ym. 2013.) Teoreettiset tarkastelut sekä kokeelliset havainnot viittaavat
siihen, ettei hyvin pienitaajuinen magneettikenttä yksinään aiheuta suoraa DNA-vauriota
(Luukkonen ym. 2014).
Zhang ym. (2013) havaitsivat hyvin pienitaajuisen magneettikentän parantavan ihmisen
orvaskeden kantasolujen solumäärän kasvua 5 mT:n kentänvoimakkuudella. Heidän
tutkimuksessaan viikon kestävä 30 minuutin päiväaltistus 50 Hz pienitaajuisella
magneettikentällä tuotti parhaimman solutiheyden. Sul ym. (2006) havaitsivat 60 Hz
sinimuotoisen sähkömagneettisen kentän aiheuttavan muutoksia solun tukirangan rakenteissa
rotan C6-soluilla 2 mT:n kentänvoimakkuudella. He myös havaitsivat magneettikentän
lisäävän aluksi solujen lisääntymistä, mutta solumäärän lisääntyessä magneettikentän
havaittiin puolestaan rajoittavan kasvua. Solujen erilaistumisen ja magneettikenttäaltistumisen
välillä ei tässä tutkimuksessa havaittu yhteyttä.
Keskeisiä solutyyppejä immuunipuolustusjärjestelmässä ovat monosyytit ja makrofaagit,
jotka voivat tuottaa erilaisia solujen viestinvälittäjäaineina tunnettuja sytokiinejä, kuten
interleukiini-1-beeta (IL-1β) ja tuumorinekroositekijä alfa (TNF-α). Hyvin pienitaajuisen
magneettikentän on havaittu aiheuttavan molekulaarisia ja solutason muutoksia edellä
mainituissa
immuunipuolustussoluissa.
Näiden
muutosten
on
arvioitu
lisäävän
immuunipuolustusjärjestelmän aktiivisuutta in vivo –tutkimuksissa. Sekä in vivo- että in vitro
–tutkimukset antavat viitteitä, että hyvin pienitaajuiset magneettikentät vaikuttavat
mahdollisesti joidenkin tulehdusvasteellisten molekyylien ilmentymään. Joidenkin tutkijoiden
mukaan hyvin pienitaajuisille kentille altistuminen vaikuttaa proteiinien toimintaan niin
solunsisäisesti kuin solukalvollakin. (D’Angelo ym. 2015.)
15
2.3.1 Vaikutukset oksidatiivisiin prosesseihin, genomiin ja DNA-vaurioihin
Luukkonen ym. (2011) havaitsivat menadionin lisäävän ihmisen neuroblastoomasolujen (SHSY5Y) solutason vasteita, kun soluja oli altistettu ennen menadionia 100 µT 50 Hz
magneettikentälle 24 h. Magneettikentälle altistettujen solujen DNA-vauriot ja mikrotumien
määrä lisääntyivät menadionialtistuksen jälkeen. Sen sijaan pelkästään magneettikentälle
altistetuissa
soluissa
ei
havaittu
vaikutuksia.
Menadioni
aiheuttaa
lisääntynyttä
superoksidianionien muodostumista, mutta nämä lisääntyneet superoksidianionitasot eivät ole
riittäviä
aiheuttamaan
oksidatiivista
DNA-vauriota.
Menadioni
aiheuttaa
kuitenkin
kalsiumioneista riippuvien nukleaasien aktivaatiota, jolloin aiheutuu mahdollisesti DNAvauriota. Markkanen ym. (2008) havaitsivat myös 24 h 50 Hz magneettikenttäaltistuksen
lisäävän solutason vasteita yhteisaltistuksessa menadionin kanssa hiiren L929-soluilla. He
korostivat tutkimuksessaan, että 100 µT kentänvoimakkuudella magneettikenttä voi aiheuttaa
biologisia prosesseja, jotka voivat olla keskeisiä syövän synnyssä.
Luukkonen ym. (2014) tutkivat 50 Hz magneettikentän (100 µT kentänvoimakkuus)
välittömiä
sekä
viivästyneitä
vaikutuksia
genomin
epävakaisuuteen,
oksidatiivisiin
prosesseihin ja mitokondrionaaliseen aktiivisuuteen ihmisen neuroblastoomasoluilla (SHSY5Y). Soluja altistettiin 24 h magneettikentälle sekä lisäksi osaa soluista 3 h menadionille ja
havaittiin, että mikrotumien muodostuminen lisääntyi magneettikenttäaltistuksessa sekä
menadionin kanssa että ilman menadionia. Magneettikenttä aiheutti antioksidanttien ja
oksidanttien välisessä tasapainossa muutoksia välittömästi altistusten jälkeen määritettynä.
Mitokondrionaalisen
aktiivisuuden
lisääntymistä
havaittiin
8
päivän
kuluttua
magneettikenttäaltistuksesta ja lisääntynyttä happiradikaalituotantoa ja lipidiperoksidaatiota
havaittiin 15 päivän jälkeen magneettikenttäaltistuksesta, mutta mitokondrionaalista
aktiivisuutta ei enää tällöin havaittu. Solujen elävyyksissä ei havaittu muutoksia.
Frahm ym. (2006) havaitsivat 50 Hz magneettikentän (0,05 mT; 0,1 mT; 0,5 mT; 1,0 mT
kentänvoimakkuuksilla) lisäävän tilastollisesti merkitsevästi happiradikaalituotantoa hiiren
promonosyyteillä kaikilla tutkituilla kentänvoimakkuuksilla 45 minuutin altistuksella.
Mikrotumamäärityksiä varten he altistivat hiiren makrofaagisoluja 1,0 mT 50 Hz
magneettikentälle 12, 24 ja 48 tunnin ajan, mutta he eivät havainneet tilastollisesti merkitseviä
eroja mikrotumien määrässä verrattuna kontrolleihin eivätkä myöskään mitoottisten solujen
määrässä. Jin ym. (2012) eivät havainneet 60 Hz magneettikentän (0,1; 0,2; 0,5; 1,0 mT)
16
vaikuttavan mikrotumien muodostumiseen hiiren sikiökautisilla fibroblasteilla ja ihmisen
keuhkofibroblasteilla yhteisaltistuksessa ionisoivan säteilyn ja vetyperoksidin kanssa. Soluja
altistettiin magneettikentälle neljän tunnin ajan. Jatkotutkimuksissa Jin ym. (2014) eivät
havainneet 60 Hz (1 mT) magneettikentällä olevan tilastollisesti merkitsevää vaikutusta
primääriin DNA-vaurioon neljän ja kuudentoista tunnin yhteisaltistuksella ionisoivan säteilyn
tai vetyperoksidin kanssa. He käyttivät tutkimuksessaan hiiren fibroblasteja, ihmisen
keuhkofibroblasteja sekä ihmisen maitorauhassoluja.
Di Loreto ym. (2008) altistivat rotan kortikaalisia hermosoluja 50 Hz magneettikentälle (0,1
mT ja 1,0 mT kentänvoimakkuudella) seitsemän vuorokauden ajan. He eivät havainneet
tilastollisesti merkitsevää eroa entsymaattisten antioksidanttien aktiivisuudessa verrattuna
kontrolleihin. Happiradikaalituotannossa havaittiin pientä nousua kentänvoimakkuuden
kasvaessa verrattuna kontrolliin, mutta erot eivät olleet kuitenkaan tilastollisesti merkitseviä.
Solujen elävyyteen magneettikentän havaittiin vaikuttavan positiivisesti tilastollisesti
merkitsevästi. Simkó ym. (2001) havaitsivat 50 Hz magneettikentän (1 mT) lisäävän
superoksidianionituotantoa hiiren makrofaageilla ja Rollwitz ym. (2004) vastaavasti hiiren
promonosyyteillä.
Lai & Singh (1997) tutkivat 60 Hz magneettikentän vaikutusta DNA-vaurioihin rotilla
(Sprague-Dawley). Rottia altistettiin magneettikentälle 0,1 mT; 0,25 mT ja 0,5 mT
voimakkuudella kahden tunnin ajan ja tämän jälkeen niistä eristettiin aivosoluja. He
havaitsivat
tilastollisesti
merkitseviä
DNA:n
yksöisjuostevaurioita
kaikilla
kentänvoimakkuuksilla aiheutettuna ja kaksoisjuostevaurioita 0,25 mT:n ja 0,5 mT:n
kentänvoimakkuuksilla aiheutettuna. Singh & Lai (1998) tutkivat edelleen 60 Hz
magneettikentän vaikutusta 0,5 mT:n kentänvoimakkuudella rotilla (Sprague-Dawley) ja
havaitsivat, että magneettikenttä vaikuttaa DNA-proteiinien ja DNA-DNA-ristisidosten
(crosslinks) muodostumiseen aivosoluissa. Kyseisillä asioilla on havaittu olevan yhteys muun
muassa solukuolemaan. Wolf ym. (2005) käyttivät tutkimuksissaan ihmisen leukemiasoluja
(HL-60), rotan fibroblasteja ja ihmisen diploidisia fibroblasteja (WI-38) ja altistivat niitä 24,
48 ja 72 tunnin ajan 50 Hz magneettikentälle (0,5 mT; 0,75 mT ja 1,0 mT). Magneettikenttä
aiheutti DNA:n juostevauriota kaikilla tutkituilla solulinjoilla.. Lisäksi he käyttivät
tutkimuksissaan antioksidantti α-tokoferolia, joka esti magneettikentän aiheuttaman DNAvaurion syntymistä. Myös happiradikaalituotanto kasvoi magneettikenttäaltistuksessa
verrattuna kontrolleihin. Falone ym. (2007) havaitsivat 50 Hz (1 mT) magneettikentän
17
lisäävän
happiradikaalituotantoa
yhteisaltistuksessa
vetyperoksidin
kanssa
ihmisen
neuroblastoomasoluilla (SH-SY5Y) 96 tunnin altistuksella. Antioksidantti NAC (10 mM)
laski happiradikaalituotantoa samalle tasolle kontrollisolujen kanssa. Magneettikenttä lisäsi
glutationiperoksidaasin aktiivisuutta ja myös solujen elävyyttä. Magneettikenttä yksinään ei
vaikuttanut
DNA-vauriovasteeseen,
mutta
yhteisaltistuksessa
vetyperoksidin
kanssa
magneettikenttä aiheutti lisääntynyttä DNA-vauriovastetta. Solujen elävyyden kasvua ihmisen
neuroblastoomasoluilla (SH-SY5Y) havaitsivat myös Sulpizio ym. (2011) 50 Hz (1 mT)
magneettikenttäaltistuksella viiden, kymmenen ja viidentoista päivän altistuksilla. Moret ym.
(2005) tutkivat 50 Hz (1,0 mT) magneettikentän ja bentseenijohdannaisten yhteisvaikutusta
ihmisen lymfoblastoidisolujen (Jürkat-solut) DNA-vauriovasteeseen ja havaitsivat, että
magneettikenttä ja hydrokinoni aiheuttivat yhdessä DNA-vauriota, kun yksittäin näillä
kahdella altisteella ei havaittu vaikutusta.
Miyakoshi ym. (2012) havaitsivat 50 Hz (10 mT) magneettikenttäaltistuksen aiheuttavan
mikrotumien muodostumista altistettujen rottien (vastasyntyneet Sprague-Dawley-rotat)
astrosyyteillä 72 tunnin altistuksella. He havaitsivat myös, että antioksidantti TEMPO (4hydroksi-2,2,6,6-tetrametyyli-piperidiini-1-oksyyli)
esti
mikrotumien
muodostumista
magneettikenttäaltistuksessa. Heidän tutkimuksessaan käytettiin yhteisaltisteena bleomysiiniä,
jota käytetään yleisesti syövän hoidossa. Jelenković ym. (2006) altistivat rottia (Wistar)
seitsemän vuorokauden ajan 50 Hz (0,5 mT) magneettikentälle ja havaitsivat magneettikentän
aiheuttavan
superoksidianionituotannon
lisääntymistä
aivosoluissa,
kuten
myös
lipidiperoksidaation ja superoksididismutaasin aktiivisuutta. Myös Falone ym. (2008)
havaitsivat 50 Hz magneettikenttäaltistuksen (0,1 mT) aiheuttavan ikääntyneiden rottien
(Sprague-Dawley)
aivosolujen
solunsisäisten
antioksidanttipitoisuuksien
lisääntymistä
kymmenen päivän altistuksella. Vastaavanlaisia tuloksia ovat saaneet myös Lee ym. (2004)
hiirien
60
Hz
magneettikenttäaltistuksella,
jossa
superoksididismutaasientsyymin aktiivisuutta aivosoluissa.
magneettikenttä
lisäsi
18
3 TYÖN TAVOITTEET
Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia
välittömiä solutason vaikutuksia rotan C6-glioomasolulinjalla ja tarkastella, mikä vaikutus
yleisantioksidanttina
tunnetulla
N-asetyylikysteiinillä
(NAC)
on
solujen
happiradikaalituotantoon ja DNA-vaurioihin. Lisäksi haluttiin selvittää, pystytäänkö NAC:lla
estämään hyvin pienitaajuisen magneettikentän aiheuttamia mahdollisia vaikutuksia.
Tutkimuksessa selvitettiin happiradikaalituotantoa DCF-menetelmällä ja DNA-vauriovastetta
yksisolugeelielektroforeesilla eli niin kutsutulla Comet Assay-menetelmällä.
19
4 AINEISTO JA MENETELMÄT
4.1 SOLULINJA JA SOLUVILJELY
Tässä tutkimuksessa solulinjana käytettiin rotan glioomasolulinjaa (C6). Kyseinen solulinja
on äärimmäisen kiivas jakautumaan. Alun perin kyseinen solulinja on saatu aikaiseksi
altistamalla Wistar-Furth-rottia N-nitroso-N-metyyliurealle (NMU), jolloin rotan gliasoluista
on kehittynyt glioomia (Grobben ym. 2002).
Solujen kasvatusliuoksena käytettiin Dulbecco’s Modified Eagle Mediumia (Gibco,
Invitrogen Corporation, Yhdysvallat), joka sisälsi 1,0 g/l D-glukoosia, 584 mg/l L-glutamiinia
ja 110 mg/l pyruvaattia. Mikrobikontaminaatioriskin pienentämiseksi mediumiin lisättiin
5000 U/ml penisilliiniä ja 5000 µg/ml streptomysiiniä. Mediumiin lisättiin myös FBS:aa (fetal
bovine serum) solujen kasvun tehostamiseksi. Soluja kasvatettiin soluviljelyinkubaattorissa
(Heraeus HeraCell, Saksa) +37 °C:n lämpötilassa ja 5 % suhteellisessa CO2-pitoisuudessa.
Soluja kasvatettiin soluviljelypulloissa (75 cm2, Nunc, Tanska). Soluja tarkkailtiin päivittäin
mikroskopoimalla (Olympus CK40, Japani).
Solujen siirrostaminen suoritettiin steriilisti laminaarivirtauskaapissa (Kojair Tech Oy, KR125 B, Suomi), jonka puhdistukseen käytettiin 1,5 % erifenolia ja 70 % etyylialkoholia.
Puhdistumisen tehostamiseksi käytettiin UV-valoa, jota pidettiin päällä ennen työskentelyä.
Soluviljelyliuokset lämmitettiin vesihauteessa (Grant Instruments Y22, Iso-Britannia) +37
°C:een. Solujen siirrostamisessa medium poistettiin pasteur-pipetillä imun avulla. Solujen
irrottamiseen käytettiin 0,1 % trypsiini-liuosta (in 0,02 % EDTA in PBS w/o Ca2+, Mg2+), jota
pipetoitiin kasvatuspulloon 4 ml ja annettiin vaikuttaa noin viiden minuutin ajan. Irrottamisen
jälkeen kasvatuspulloon pipetoitiin 8 ml mediumia huuhdellen pulloa huolellisesti ja
pipetoitiin solususpensio 15 ml:n falcon-putkeen. Falcon-putkea sentrifugoitiin (Heraeus
Instruments
Biofuge
Primo,
Kendro
Laboratory
Products,
Saksa)
solupelletin
muodostamiseksi kahdeksan minuutin ajan 363 × g. Sentrifugoinnin jälkeen poistettiin
supernatantti ja suspensoitiin solupelletti 1 ml:aan mediumia.
Solulaskentaa varten solususpensiota laimennettiin 1:100 (10 µl solususpensiota pipetoitiin
990 µl:aan PBS-liuosta) ja vorteksoitiin huolellisesti (VMR Lab Dancer). Solulaskenta
suoritettiin Moxi Z -solulaskurilla (Orflo Technologies, Yhdysvallat) pipetoimalla 75 µl
20
soluliuoslaimennosta mittaliuskalle. Laskuri antoi solumäärän, solun keskimääräisen
halkaisijan ja solujen elävyysprosentin. Saadun solumäärän perusteella valmistettiin
jatkoviljelyä ja altistuksia varten solususpensiot. Jatkoviljelyä varten solususpensio pipetoitiin
20 ml:aan mediumia. Soluja viljeltiin jatkoon tarpeen mukainen määrä, yleensä 0,25 × 106 tai
0,5 × 106 solua/20 ml medium. Soluja siirrostettiin keskimäärin kaksi kertaa viikossa.
4.1.1 Solujen valmistelu altistuksia varten
Altistuksia ja määrityksiä varten soluja siirrostettiin joko 48-kuoppalevyille (Sigma Cell
Culture Plate, Yhdysvallat) tai maljoille riippuen määrityksestä. Soluja esikasvatettiin
määrityksestä riippuen joko kuoppalevyillä tai maljoilla 20 tuntia ennen altistuksien
aloittamista solujen kiinnittymisen varmistamiseksi. Siirrostamiset tehtiin steriileissä
olosuhteissa. DCF-määrityksiä varten soluja pipetoitiin 15 000 solua/500 µl kuoppaa kohden.
Comet Assay–määritystä varten soluja pipetoitiin maljoille 25 000 solua/5 ml maljaa kohden.
Esikokeissa vastaavat määrät olivat 30 000 solua/500 µl kuoppaa kohden ja 0,5 x 106 solua/5
ml maljaa kohden.
4.2 MÄÄRITYSMENETELMÄT
Happiradikaalituotantoa määritettiin 48-kuoppalevyllä DCF-menetelmällä. Solujen elävyyttä
määritettiin propidiumjodidin ja digitoniinin avulla fluorometrillä (Tecan Infinite F200 Pro,
Tecan Group Ltd, Sveitsi). DNA-vauriota määritettiin yksisolugeelielektroforeesilla eli niin
kutsutulla Comet Assay-menetelmällä. Altistukset Comet Assayta varten suoritettiin
maljoilla. Määritykset tehtiin välittömästi magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Koeasetelma
kuvataan tarkemmin kappaleessa 4.4.
4.2.1 Happiradikaalituotanto
Happiradikaalituotannon
määritys
DCF-menetelmällä
perustuu
2´,7´-
diklorodihydrofluoreskiinidiasetaatin (DCFH-DA) tunkeutumiseen solukalvon läpi ja
reagoimiseen solun esteraasientsyymien kanssa, jolloin DCFH-DA deasyloituu ja muuntuu
21
fluoresoimattomaksi
2´,7´-diklorodihydrofluoreskiiniksi
(DCFH).
DCFH
hapettuu
happiradikaalin kohdatessaan voimakkaasti fluoresoivaksi 2´,7´-diklorofluoreskiiniksi (DCF)
aiheuttaen mitattavissa olevaa fluoresenssia. (Hoet ym. 2013.)
Määritys suoritettiin välittömästi altistuksen jälkeen poistamalla kuopista altisteet ja
pesemällä solut kerran 0,5 ml:lla HBSS-puskuria. Tämän jälkeen solut ladattiin 40 µM
DCFH-DA:lla pipetoimalla 0,5 ml kuhunkin kuoppaan. Latauksen jälkeen kuoppalevyjä
inkuboitiin soluviljelyinkubaattorissa (Heraeus HeraCell, Yhdysvallat) 30 minuutin ajan.
Inkuboinnin jälkeen mitattiin fluoresenssi Tecan Infinite F200 Pro –fluorometrillä (Tecan
Group Ltd, Sveitsi) (eksitaatioaallonpituus 485 nm, emissioaallonpituus 535 nm). Tulokset on
esitetty suhteellisina fluoresenssiyksikköinä (RFU).
4.2.2 Solujen elävyys
Solujen elävyyttä määritettiin propidiumjodidin ja digitoniinin avulla. Propidiumjodidilla on
taipumus sitoutua DNA:han aiheuttaen fluoresenssia. Propidiumjodidi sitoutuu kromatiiniin
nekroottisissa soluissa eli solukalvovauriosta kärsivissä soluissa (Luukkonen ym. 2014).
Digitoniini hajottaa solukalvon, jolloin propidiumjodidi pääsee kaikkiin soluihin aiheuttaen
fluoresenssia. Elävyysmääritys suoritettiin pipetoimalla 20 µl 1,25 mM propidiumjodidia
kuoppaa kohden, jolloin loppukonsentraatio kuopassa oli 50 µM. Tämän jälkeen
kuoppalevyjä sekoitettiin lyhyesti kuoppalevyravistelijassa (Labsystems Wellmix, Saksa) ja
inkuboitiin 20 minuuttia huoneenlämmössä valolta suojattuna. Inkubaation jälkeen mitattiin
fluoresenssi Tecan Infinite F200 Pro –fluorometrillä (Tecan Group Ltd, Sveitsi)
(eksitaatioaallonpituus 540 nm, emissioaallonpituus 612 nm).
Maksimifluoresenssin määrittämiseksi kuoppalevyille pipetoitiin 20 µl 4 mM digitoniinia
kuoppaa kohden, jolloin loppukonsentraatio kuopassa oli 160 µM. Tämän jälkeen
kuoppalevyjä sekoitettiin voimakkaasti kuoppalevyravistelijassa (Labsystems Wellmix,
Saksa) 20 minuutin ajan valolta suojattuna. Fluoresenssi mitattiin Tecan Infinite F200 Pro –
fluorometrillä
(Tecan
Group
Ltd,
Sveitsi)
(eksitaatioaallonpituus
540
emissioaallonpituus 612 nm). Solujen elävyysprosentti laskettiin seuraavalla kaavalla:
nm,
22
ä
(%) = 100 − (
− ) × 100
− , jossa
F=
fluoresenssiarvo propidiumjodidilisäyksen jälkeen
Fmax =
maksimifluoresenssiarvo digitoniinilisäyksen jälkeen
blank1 =
taustafluoresenssi propidiumjodidilisäyksen jälkeen soluttomista kuopista
blank2 =
taustafluoresenssi digitoniinilisäyksen jälkeen soluttomista kuopista
4.2.3 DNA-vauriot
DNA-vauriovastetta
määritettiin
yksisolugeelielektroforeesilla
(Single-Cell
Gel
Electrophoresis) eli niin kutsutulla Comet Assay-menetelmällä. Tämä menetelmä perustuu
DNA-fragmenttien ajamiseen ulos solujen tumista sähkövirran avulla ja nämä fragmentit
havaitaan mikroskopiassa komeetan kaltaisena rakenteena pää- ja häntäosineen. Menetelmällä
voidaan havaita sekä DNA:n yksöis- että kaksoisjuostevaurioita. Menetelmä on erittäin
käyttökelpoinen havaitsemaan yksittäisen solun kärsimän DNA-vaurion ja lisäksi tällä
menetelmällä voidaan myös arvioida DNA:n korjausmekanismeja. (Da Silva ym. 2000.)
Menetelmää varten objektilasit (Thermo Scientific Menzel-Gläser, Saksa) päällystettiin
kastamalla laseja agaroosigeeliin. Agaroosigeeli valmistettiin liuottamalla 0,5 grammaa
agaroosia
(Normal
Melting
Point-agarose,
BioWhittaker
Molecular
Applications,
Yhdysvallat) 50 ml:aan PBS-liuosta. Liukenemisen tehostamiseksi liuosta lämmitettiin
mikroaaltouunissa. Objektilasi kastettiin geelissä kolme kertaa, jonka jälkeen objektilaseja
säilytettiin pakastimessa yleensä noin viikon ajan ennen käyttöä. Objektilasien pakastamisen
havaittiin tehostavan agaroosigeelin kiinnipysymistä objektilaseilla analyyseissä verrattuna
huoneenlämmössä säilytettyihin.
Comet
Assay:ta varten
valmistettiin
varsinaisesta
valmistettiin
hajotuspuskuri
hajotuspuskuriliuoksesta,
ja ajopuskuri.
milliQ-vedestä
ja
Hajotuspuskuri
Triton-X-100-
kemikaalista (Sigma-Aldrich, Saksa). Ajopuskuri valmistettiin milliQ-vedestä, 10 M
natriumhydroksidista ja 200 mM EDTA:sta. Liuokset valmistettiin määrityspäivänä vähintään
tuntia ennen käyttöä ja säilytettiin jääkaapissa. Liuosten valmistus on esitettynä liitteessä 1.
23
Altistusten jälkeen altisteet poistettiin ja lisättiin solujen irrotusta varten 1 ml 0,1 % trypsiiniliuosta (in 0,02% EDTA in PBS w/o Ca2+, Mg2+) solumaljaa kohden. Trypsiinin annettiin
vaikuttaa 5 minuuttia, jonka jälkeen lisättiin 2 ml mediumia neutralointia varten ja pipetoitiin
saadut suspensiot 15 ml:n falcon-putkiin jäähauteessa. Putkia sentrifugoitiin 8 minuuttia 363
× g 4 °C:een lämpötilassa (Heraeus Instruments Biofuge Stratos, Kendro Laboratory
Products, Saksa). Sentrifugoinnin jälkeen poistettiin supernatantti ja suspensoitiin solupelletti
500 µl:aan PBS-puskuria, jolloin laskennallinen solumäärä oli 30 000 solua/15 µl.
Käytännössä kuitenkin arvioitu todellinen solumäärä objektilaseilla oli lopulta noin 15 000,
sillä solujen irrotusvaiheessa ja sentrifugoinnissa osa soluista jää maljoille ja falcon-putkiin.
Tämä solumäärä oli riittävä analysointeja varten.
Solunäytteet
pipetoitiin
15
µl
eppendorf-putkiin,
johon
oli
pipetoitu
75
µl
matalasulamispisteistä agaroosia (Agarose 0,5 Low Melting Point in PBS, Sigma,
Yhdysvallat) ja vorteksoitiin (Scientific Industries Vortex Genie-2, Yhdysvallat) huolellisesti.
Saatua liuosta pipetoitiin 80 µl objektilasille ja annettiin olla peitinlasin alla jäillä vähintään 5
minuuttia. Tämän jälkeen poistettiin peitinlasit varoen sivukautta ja asetettiin objektilasit
muovilaatikkoon, johon kaadettiin hajotuspuskuri. Hajotuspuskurin annettiin vaikuttaa tunnin
ajan jääkaapissa. 15 minuuttia ennen hajotusajan päättymistä lisättiin ajopuskuriliuos
elektroforeesilaitteeseen. Hajotusajan jälkeen asetettiin objektilasit elektroforeesilaitteeseen
(Horizon 20-25, Gibco BRL, Yhdysvallat) ja annettiin objektilasien olla 20 minuutin ajan
laitteessa ilman sähkövirtaa valolta suojattuna (unwinding) ja tämän jälkeen 25 minuutin
elektroforeesiajo valolta suojattuna (Life Technologies Model 250EX Gibco BRL
Electrophoresis Power Supply, Yhdysvallat; 24 V, 380 mA). Elektroforeesiajon jälkeen
suoritettiin viiden minuutin neutralointipuskurointi muovilaatikossa kolme kertaa valolta
suojattuna. Lopuksi objektilasit fiksattiin 96 % -etanolilla minuutin ajan (96 ml Etax AA + 4
ml milli-Q-vesi) ja vietiin objektilasit kuivumaan huoneenlämmössä valolta suojattuna.
Näytteiden analysointi suoritettiin aikaisintaan seuraavana päivänä.
Näytteiden analysointia varten objektilasit värjättiin etidiumbromidilla (EtBr). EtBr-värjäys
suoritettiin laimentamalla 0,2 mg/ml EtBr-kantaliuosta milliQ-veteen 1:10. Tätä laimennosta
pipetoitiin 75 µl objektilasia kohden ja annettiin vaikuttaa peitinlasin alla 30 minuutin ajan.
Mikroskooppina käytettiin Axio Scope.A1–mikroskooppia (Carl Zeiss Microscopy GmbH,
Saksa), joka oli yhdistetty tietokoneeseen. Analysointisovelluksena käytettiin Comet Assay
IV-sovellusta (Perceptive Instruments, Iso-Britannia). Kyseisellä ohjelmistolla pystytään
24
laskemaan solut yksitellen, jolloin ohjelmisto analysoi solun DNA-vauriovastetta kuvaavia
parametrejä. Varsinaiset analysoinnit tehtiin sokkoistettuna eli analysointivaiheessa analysoija
ei tiennyt mistä näytteestä oli kyse. Näin ollen virhelähdettä saatiin pienennettyä, kun
näytteiden analysoija ei tiennyt analysoitavan näytteen altistetta eikä mahdolliset olettamat
kunkin altisteen aiheuttamasta vaikutuksesta häirinnyt tulosten analysointia. Varsinaisten
tutkimusten ja näytteiden analysointien jälkeen sokkoistukset purettiin ja tulokset käsiteltiin.
4.3 ESIKOKEET
Esikokeiden tarkoituksena oli selvittää sopivat menadioni –ja antioksidanttipitoisuudet
altistuksia varten. Lisäksi esikokeilla selvitettiin sopivat pitoisuudet positiivikontrolleihin,
joilla varmistettiin käytettyjen menetelmien toimivuus kullakin määritystoistokerralla.
Positiivikontrolleina käytettiin DCF-määrityksessä (ks. kpl 4.2.1) dietyylimaleaattia (DEM) ja
DNA-vauriomäärityksessä (ks. kpl 4.2.3) metyylimetaanisulfonaattia (MMS) menetelmien
toimivuuden
varmistamiseksi.
DEM:n
tiedetään
aiheuttavan
lisääntynyttä
happiradikaalituotantoa ja MMS:n DNA-vaurioita. Esikokeissa suoritetut altistukset
pipetoitiin steriileissä olosuhteissa ja altistusinkubaatiot suoritettiin soluviljelyinkubaattorissa
vastaavissa olosuhteissa kuin solujen kasvatuskin.
Menadionin havaittiin laskevan happiradikaalituotantoa, mutta varsinainen annosvastesuhde
ei tullut esiin kovin selvästi kahdella toistokerralla (kuva 2). Soluja altistettiin menadionin eri
pitoisuuksille kolmen tunnin ajan. Altistuksen jälkeen suoritettiin välittömästi DCF-määritys.
Eniten happiradikaalituotantoa laski 30 µM ja vähiten 5 µM menadionipitoisuus.
25
2000
RFU
1500
1000
500
0
0
1
5
10
15
20
25
30
40
50
Menadioni (µM)
Kuva 2. Happiradikaalituotanto välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen. Kuvassa on esitetty
happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU),
n = 2.
Kuvassa 3 on esitetty solujen elävyysprosentti välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen
mitattuna. Solujen elävyys oli kaikilla menadionipitoisuuksilla yli 80 %. Elävyysprosentti oli
alhaisin 50 µM menadionille altistetuilla soluilla.
100
Elävyys (%)
80
60
40
20
0
0
1
5
10 15 20 25 30 40 50
Menadioni (µM)
Kuva 3. Solujen elävyys (%) mitattuna välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen. Kuvassa esitetty
elävyysprosentit keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 2.
26
N-asetyylikysteiinin (NAC) havaittiin laskevan annosvastesuhteisesti happiradikaalituotantoa
verrattuna kontrolliin. Soluja käsiteltiin NAC:lla 1 h ajan ja osaa soluista altistettiin 3 h ajan
20 µM menadionille. Menadionille altistetuilla soluilla happiradikaalituotanto sen sijaan nousi
2 mM NAC-pitoisuudella verrattuna kontrolliin, mutta oli kuitenkin matalampi 5 mM NACpitoisuudella kuin 2 mM. NAC:lla saatiin siis estettyä menadionin vaikutusta. (Kuva 4)
2500
- 20 µM menadioni
+ 20 µM menadioni
RFU
2000
1500
1000
500
0
0
2
5
0
2
5
NAC (mM)
Kuva 4. Happiradikaalituotanto välittömästi menadionialtistuksen (3 h) jälkeen. Ennen menadionialtistusta
soluja altistettiin 1 h ajan N-asetyylikysteiinin (NAC) eri pitoisuuksille. Kuvassa on esitetty
happiradikaalituotanto suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 1.
Kuvassa 5 on esitetty solujen elävyysprosentti altistusten jälkeen. Soluja oli altistettu 1 h ajan
0, 2 ja 5 mM NAC-pitoisuuksille ja tämän jälkeen 3 h ajan 20 µM menadionille. Elävyydet
olivat kaikissa tapauksissa yli 90 %.
- 20 µM menadioni
+ 20 µM menadioni
100
Elävyys (%)
80
60
40
20
0
0
2
5
0
2
5
NAC (mM)
Kuva 5. Solujen elävyys (%) mitattuna välittömästi altistusten (1 h NAC + 3 h menadioni) jälkeen. Kuvassa on
esitetty happiradikaalituotanto suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 1.
27
Dietyylimaleaatin (DEM) havaittiin lisäävän happiradikaalituotantoa pitoisuuden (%)
kasvaessa. Soluja altistettiin eri pitoisuuksille 1, 2 ja 3 h ajan ja tämän jälkeen suoritettiin
välittömästi DCF-määritys. (Kuva 6)
5000
1 h altistus
2 h altistus
4000
RFU
3 h altistus
3000
2000
1000
0,
04
0,
03
5
0,
03
0,
02
5
0,
02
0,
00
5
0,
01
0,
01
5
0
0,
00
25
0
DEM (%)
Kuva 6. Happiradikaalituotanto välittömästi dietyylimaleaattialtistuksen (DEM) jälkeen. Soluja altistettiin 1, 2 ja
3 h ajan DEM:n eri pitoisuuksille. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon
keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 2.
Kuvassa 7 on esitettynä solujen elävyysprosentti (%) välittömästi DEM-altistuksen jälkeen.
Soluja altistettiin 1 h, 2 h ja 3 h DEM:n eri pitoisuuksille. Elävyys laski eniten 3 h 0,04 DEMaltistetuilla soluilla.
28
1h
100
Elävyys (%)
2h
80
3h
60
40
20
0,
04
0,
03
5
0,
03
0,
02
5
0,
02
0,
01
5
0,
01
0
0,
00
25
0,
00
5
0
DEM (%)
Kuva 7. Solujen elävyys mitattuna välittömästi DEM-altistusten jälkeen. Kuvassa on esitetty elävyysprosentit
keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3.
Kuvassa 8 on esitetty Comet Assay –menetelmällä saadut OTM-arvot (olive tail moment) 3 h
menadionialtistuksen jälkeen kahdella eri irrotustavalla. Tulokset antoivat viitteitä, että
trypsinoinnilla tehtävä solujen irrotus nostaa vähemmän OTM-arvoja kuin skreippaus, joten
solut päätettiin tämän perusteella irrottaa trypsinoimalla varsinaisissa määrityksissä. Kaikilla
käytetyillä menadionipitoisuuksilla ei saatu esikokeissa määritettyä OTM-arvoa menetelmän
herkkyyden ja yhden toistokerran takia.
15
Skreippaus
Trypsiini
OTM
10
5
0
0
10
20
40
Menadioni (µM)
Kuva 8. Comet Assay –menetelmällä määritetyt OTM-arvot 3 h menadionialtistuksen jälkeen kahdella eri
irrotustavalla. n = 1.
29
Esikokeiden perusteella positiivikontrolliksi happiradikaalimäärityksiin valittiin 0,02 %
DEM-altistus (3 h), sillä kyseisellä pitoisuudella saatiin hyvää soluvastetta aikaiseksi
verrattuna
kontrolliin
ja
solujen
elävyysprosentti
pysyi
keskimäärin
90
%.
Menadionikonsentraatioksi valittiin 1 µM ja 20 µM sekä NAC-konsentraatioksi 2 mM. DNAvauriomäärityksiin menadionikonsentraatioksi valittiin 20 µM ja irrotustavaksi trypsinointi
sekä positiivikontrolliksi aikaisempien tutkimusten perusteella 3 h metyylimetaanisulfonaattialtistus (MMS) 50 µg/ml.
4.4 KOEASETELMA JA MAGNEETTIKENTTÄALTISTUSLAITTEISTO
Tutkimuksessa altistettiin rotan glioomasoluja (C6) 48-kuoppalevyillä tai maljoilla 50 Hz
magneettikentälle (kentänvoimakkuus 100 µT) 24 h ajan. Ennen magneettikenttäaltistusta
soluja
altistettiin
tunnin
ajan
antioksidantti
N-asetyylikysteiinille
(NAC)
soluviljelyinkubaattorissa. NAC-konsentraationa käytettiin 2 mM. Magneettikenttäaltistuksen
jälkeen soluja altistettiin menadionille kolmen tunnin ajan. Menadionikonsentraatioina
käytettiin 1 µM ja 20 µM. Lisäksi positiivikontrolleina käytettiin DCF-määrityksessä
dietyylimaleaattia (DEM) ja DNA-vauriomäärityksessä metyylimetaanisulfonaattia (MMS)
menetelmien toimivuuden varmistamiseksi. Kuvassa 9 on esitettynä aikajanamuodossa
koeasetelma altistusaikoineen.
Altiste
NAC
NAC + Magneettikenttä
Menadioni
1h
24 h
3h
Aik a
Happiradikaali -ja
elävyysmääritykset sekä
Comet Assay
Kuva 9. Koeasetelma altistusaikoineen. Janan yläpuolella on altiste ja alapuolella altistusaika sekä
määritysmenetelmien ajankohta.
Magneettikenttäaltistuksessa käytettiin soluviljelyinkubaattoriin (Heraeus HeraCell, Saksa)
kytkettyä magneettikenttälaitteistoa (kuva 10), joka koostui signaaligeneraattorista (BK-
30
precision 3010 Function Generator, Yhdysvallat) ja virtavahvistimesta (Peavey Electronics
Corporation, M-3000 Power Amplifier, Yhdysvallat) sekä inkubaattorin sisään asetetuista
kahdesta kuparikelasta, jotka olivat kooltaan 340 × 460 mm ja olivat asetettu Helmholztyyppisesti
220
mm
etäisyydelle
toisistaan.
Näin
ollen
kuparikelat
muodostivat
mahdollisimman tasaisen magneettikentän. Inkubaattorissa vallitsi +37 °C:n lämpötila ja noin
5
%
suhteellinen
CO2-pitoisuus.
Magneettikentän
voimakkuutta
mitattiin
magneettikenttämittarilla (Hirst Gaussmeter CM 08, Axial Fluxgate Probe AFG100, Hirst
Magnetic Instruments Ltd, Iso-Britannia). Samanaikaisesti magneettikenttäaltistuksen kanssa
kontrollisoluja inkuboitiin vastaavanlaisissa olosuhteissa, mutta ilman magneettikenttää.
Altistuslaitteisto kytkettiin päälle edeltävänä päivänä ennen altistusten aloittamista
magneettikentän voimakkuuden tasaamisen vuoksi.
Kuva 10. Magneettikenttäaltistuslaitteisto
Tässä tutkimuksessa käytetyt kemikaalit ja liuokset on esitetty liitteessä (liite 1).
4.5 TILASTOLLISET ANALYYSIT
Tilastolliset analyysit suoritettiin GraphPad Prism 6-sovelluksella ja analyyseinä käytettiin
yksisuuntaista
varianssianalyysiä
(one-way
ANOVA)
ja
Tukey’n
post-hoc-testiä.
Tilastollisesti merkitsevinä tuloksina pidettiin tuloksia, joiden p-arvo oli alle 0,05 (p < 0,05).
31
5 TULOKSET
5.1 HAPPIRADIKAALITUOTANTO JA SOLUJEN ELÄVYYS
Kuvassa
11
on
esitettynä
happiradikaalituotanto
mitattuna
välittömästi
24
h
magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Ennen magneettikenttäaltistusta soluja käsiteltiin tunnin
ajan 2 mM NAC:lla. Kontrolli-inkubaatio suoritettiin vastaavanlaisissa olosuhteissa kuin
magneettikenttäaltistuskin,
happiradikaalituotantoa,
mutta
kuten
ilman
myös
2
magneettikenttää.
mM
NAC.
Magneettikenttä
Magneettikentän
laski
aiheuttama
happiradikaalituotannon lasku ei ollut kuitenkaan tilastollisesti merkitsevää, kuten ei myös
NAC:n vaikutus (p > 0,05).
2500
Sham
MF
RFU
2000
1500
1000
500
0
0
2
NAC (mM)
Kuva 11. Happiradikaalituotanto välittömästi magneettikenttäaltistuksen (24 h) jälkeen. Ennen
magneettikenttäaltistusta soluja altistettiin 1 h ajan 2 mM N-asetyylikysteiinille (NAC). Kuvassa on esitetty
happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU),
n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
32
Kuvassa
12
on
esitettynä
solujen
elävyysprosentti
(%)
välittömästi
24
h
magneettikenttäaltistuksen jälkeen.
100
Sham
MF
Elävyys (%)
80
60
40
20
0
0
2
NAC (mM)
Kuva 12. Solujen elävyysprosentti välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen määritettynä. Kuvassa
esitettyinä elävyysprosenttien keskiarvot keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää,
MF = magneettikenttä.
Kuvassa 13 on esitettynä positiivikontrollina käytetyn dietyylimaleaatin (DEM) aiheuttama
happiradikaalituotanto mitattuna välittömästi altistuksen jälkeen. Soluja altistettiin 24 h
magneettikenttäaltistuksen jälkeen 3 h ajan 0,02 % DEM:lle.
3000
Sham
MF
RFU
2000
1000
0
0
0,02
DEM (%)
Kuva 13. Happiradikaalituotanto välittömästi magneettikenttäaltistuksen ja dietyylimaleaattialtistuksen (DEM)
jälkeen. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina
fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
33
Kuvassa
14
on
esitetty
solujen
elävyysprosentti
(%)
välittömästi
24
h
magneettikenttäaltistuksen ja 3 h DEM-altistuksen jälkeen.
100
Sham
MF
Elävyys (%)
80
60
40
20
0
0
0,02
DEM (%)
Kuva 14. Solujen elävyysprosentti välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen ja 3 h DEM-altistuksen jälkeen
määritettynä. Kuvassa esitettyinä elävyysprosenttien keskiarvot keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham
= ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
Kuvassa
15
on
esitetty
NAC-antioksidantin
vaikutus
menadionin
aiheuttamaan
happiradikaalituotantoon. Ennen magneettikenttäaltistusta osaa soluista altistettiin 1 h ajan 2
mM N-asetyylikysteiinille (NAC) ja 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen 3 h ajan 0, 1 ja
20 µM menadionille. Magneettikenttä laski happiradikaalituotantoa verrattuna kontrolliin
kaikissa tapauksissa, paitsi 1 µM menadionialtistuksessa ilman 2 mM NAC:a. 2 mM NAC
lisäsi happiradikaalituotantoa. Magneettikentän aiheuttama vaikutus ei ollut tilastollisesti
merkitsevää
(p
>
0,05).
NAC
lisäsi
tilastollisesti
merkitsevästi
(p
<
0,05)
happiradikaalituotantoa 1 µM menadionille altistetuissa soluissa verrattuna soluihin, joita oli
altistettu
1
µM
menadionille,
mutta
ei
NAC:lle.
Menadionin
aiheuttama
happiradikaalituotannon vaihtelu ei ollut tilastollisesti merkitsevää (p > 0,05), paitsi 1 µM
menadionille ja 2 mM NAC:lle altistettujen solujen tapauksessa oli tilastollisesti merkitsevä
ero (p < 0,05).
34
2500
RFU
2000
+ 2 mM NAC
- 2 mM NAC
Sham
MF
1500
1000
500
0
0
1
20
0
1
20
Menadioni (µM)
Kuva 15. Happiradikaalituotanto välittömästi altistusten jälkeen. Kuvassa on esitetty happiradikaalituotannon
keskiarvot ja keskiarvon keskivirhe (SEM) suhteellisina fluoresenssiyksikkönä (RFU), n = 3. Sham = ei
magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
Kuvassa
16
on
esitetty
solujen
elävyysprosentti
(%)
välittömästi
24
h
magneettikenttäaltistuksen ja 3 h menadionialtistuksen jälkeen määritettynä.
- 2 mM NAC
+ 2 mM NAC
100
Sham
MF
Elävyys (%)
80
60
40
20
0
0
1
20
0
1
20
Menadioni (µM)
Kuva 16. Solujen elävyysprosentti välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen ja 3 h menadionialtistuksen
jälkeen määritettynä. Kuvassa esitettyinä elävyysprosenttien keskiarvot keskiarvon keskivirheineen (SEM). n =
3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
35
5.2 DNA-VAURIOT
Kuvassa 17 on esitetty CometAssay –menetelmällä saadut OTM-tulokset välittömästi 24 h
magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Soluja altistettiin ennen magneettikenttäaltistusta 2 mM
NAC:lle 1 h ajan. Magneettikenttä nosti OTM-arvoa verrattuna kontrolliin. 2 mM NAC nosti
OTM-arvoa verrattuna kontrolliin. Magneettikentän eikä NAC:n vaikutus ei ollut kuitenkaan
tilastollisesti merkitsevä (p > 0,05).
6
Sham
MF
OTM
4
2
0
0
2
NAC (mM)
Kuva 17. OTM-arvot välittömästi 24 h magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Kuvassa on esitetty tulokset
keskiarvoineen ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
Kuvassa 18 on esitetty on esitetty Comet Assay –menetelmällä saadut OTM-arvot
välittömästi
menadionialtistuksen
jälkeen.
Osaa
soluista
altistettiin
ennen
24
h
magneettikenttäaltistusta 2 mM NAC:lle 1 h ajan. Magneettikenttäaltistuksen jälkeen osaa
soluista altistettiin 20 µM menadionille 3 h ajan. Magneettikenttä nosti OTM-arvoa kaikissa
tapauksissa, mutta kontrollissa (ilman 2 mM NAC ja 0 µM menadioni) OTM-arvo oli selvästi
suurempi verrattuna muihin tapauksiin. Sekä 2 mM NAC että 20 µM menadioni nostivat
OTM-arvoa verrattuna kontrolleihin. Menadionin, magneettikentän ja NAC:n vaikutukset
eivät olleet tilastollisesti merkitseviä (p > 0,05). Tilastollisesti merkitsevä ero havaittiin (p <
0,05) kontrollisolujen ja magneettikentälle altistettujen solujen välillä ilman NAC-käsittelyä.
36
8
- 2 mM NAC
+ 2 mM NAC
OTM
6
Sham
MF
4
2
0
0
20
0
20
Menadioni (µM)
Kuva 18. OTM-arvot välittömästi 3 h menadionialtistuksen jälkeen. Kuvassa on esitetty tulokset keskiarvoineen
ja keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
Kuvassa 19 on esitetty Comet Assay –menetelmällä saadut OTM-arvot välittömästi 3 h 50
µg/ml MMS-altistuksen jälkeen määritettynä. MMS-altistus nosti OTM-arvoa kontrolliin
verrattuna.
20
Sham
MF
OTM
15
10
5
0
0
50
MMS (µg/ml)
Kuva 19. OTM-arvot välittömästi 3 h MMS-altistuksen jälkeen. Kuvassa on esitetty tulokset keskiarvoineen ja
keskiarvon keskivirheineen (SEM). n = 3. Sham = ei magneettikenttää, MF = magneettikenttä.
37
6 TULOSTEN TARKASTELU
Magneettikenttäaltistus
laski
happiradikaalituotantoa
verrattuna
kontrollisoluihin
yhteisaltistuksessa menadionin kanssa kaikissa tapauksissa, paitsi 1 µM menadionin kanssa
magneettikentän aiheuttama happiradikaalituotanto oli suurempi kuin kontrollisolujen.
Antioksidantti
NAC
laski
magneettikenttäaltistuksen
happiradikaalituotantoa
jälkeen
määritettynä,
mutta
välittömästi
tässäkin
24
h
tapauksessa
happiradikaalituotanto näytti olevan pienempi magneettikenttäaltistetuilla soluilla verrattuna
kontrolleihin. NAC:n vaikutus ei ollut tilastollisesti merkitsevää välittömästi 24 h
magneettikenttäaltistuksen jälkeen. Menadionialtistus lisäsi happiradikaalituotantoa, mutta
NAC:lla ei tätä vaikutusta pystytty estämään vastoin odotuksia, vaan NAC jopa lisäsi
happiradikaalituotantoa verrattuna kontrolleihin. NAC:n vaikutus oli tilastollisesti merkitsevä
(p < 0,05) soluilla, joita oli altistettu 1 µM menadionille ja 2 mM NAC:lle, tosin vaikutus oli
happiradikaalituotantoa lisäävä. Useat tutkimukset eri solulinjoilla ovat kuitenkin osoittaneet
NAC:n kykenevän estämään happiradikaalituotantoa ja näin ollen oksidatiivista stressiä.
Falone ym. (2007) tutkimuksessa NAC esti 50 Hz magneettikentän aiheuttamaa
happiradikaalituotantoa ihmisen neuroblastoomasoluilla, tosin suuremmalla pitoisuudella ja
Han ym. (1997) havaitsivat tutkimuksissaan NAC:n lisäävän solun glutationitasoja. NACpitoisuus ei siis välttämättä ollut riittävän suuri tässä tutkimuksessa estämään menadionin
aiheuttamaa happiradikaalituotannon nousua C6-soluilla. Lisätutkimuksia tarvitaan eri
solulinjoilla käyttämällä NAC:n eri pitoisuuksia, jotta nähdään
NAC:n vaikutus
happiradikaalituotantoon magneettikenttäaltistetuilla soluilla.
Useissa tutkimuksissa hyvin pienitaajuisen magneettikentän on havaittu aiheuttavan
lisääntynyttä happiradikaalituotantoa eri solulinjoilla ja erilaisilla kentänvoimakkuuksilla sekä
altistusajoilla (Di Loreto ym. 2008; Frahm ym. 2006; Luukkonen ym. 2011; Luukkonen ym.
2014). Tässä tutkimuksessa magneettikenttäaltistuksella happiradikaalituotanto oli kuitenkin
pienempi lähes jokaisessa tapauksessa verrattuna kontrolliin. Erot eivät olleet tilastollisesti
merkitseviä. Tämä voi aiheutua siitä, että DCF-menetelmä ei ole tehokas määrittämään
spesifejä happiradikaaleja, kuten esimerkiksi superoksidianioneja tai vetyperoksideja, vaan
menetelmällä pystytään määrittämään solunsisäistä happiradikaalituotantoa yleisellä tasolla
(Luukkonen ym. 2008). Luukkonen ym. (2014) havaitsivat menadionin aiheuttavan
annosvasteisesti
laskevaa
happiradikaalituotanto
voi
happiradikaalituotantoa
olla
suurempi
DCF-menetelmällä.
magneettikenttäaltistetuilla
Näin
ollen
soluilla
kuin
38
kontrollisoluilla.
Lisätutkimuksia
tarvitaan
selvittämään
spesifisempää
happiradikaalituotantoa eri menetelmillä.
Magneettikentälle altistettujen solujen DNA-vauriovastetta kuvaava OTM-arvo oli suurempi
verrattuna kontrollisoluihin. Tilastollisesti merkitseviä eroavaisuuksia ei kuitenkaan havaittu.
Hajonta OTM-arvoissa oli varsin suurta, mutta tämä on tyypillistä tälle menetelmälle
menetelmän herkkyydestä aiheutuen. Vastoin odotuksia, NAC lisäsi OTM-arvoa verrattuna
kontrolleihin, mutta ei tilastollisesti merkitsevästi. Luukkonen ym. (2011) kirjoittaa, että
menadioni aiheuttaa kalsiumioneista riippuvien nukleaasien aktivaatiota, jolloin aiheutuu
mahdollisesti DNA-vauriota ja tässä tutkimuksessa menadionialtistus kasvatti OTM-arvoa
verrattuna soluihin, joita ei ollut altistettu menadionille eli menadioni aiheutti DNA-vauriota.
OTM-arvo oli suurempi magneettikenttäaltistetuilla soluilla kaikissa tapauksissa, paitsi
kontrollisoluilla, joita ei ollut altistettu menadionille eikä käsitelty NAC:lla. Tämä ero oli
tilastollisesti merkitsevä (p < 0,05). Tässä on todennäköisesti tapahtunut jonkinlainen
tekninen virhe mahdollisesti solujen irrotusvaiheessa trypsiinillä, sillä trypsiini alkaa hajottaa
soluja, mikäli soluja trypsinoidaan liian kauan. Aikaisemmissa tutkimuksissa hyvin
pienitaajuisen magneettikentän yhteydestä DNA-vaurioon on saatu erilaisia tuloksia. Jin ym.
(2014) eivät havainneet magneettikentän aiheuttavan DNA-vauriota yksinään eivätkä
myöskään vetyperoksidin kanssa, kun taas Falone ym. (2007) havaitsivat magneettikentän ja
vetyperoksidin lisäävän DNA-vauriovastetta.
Positiivikontrollina happiradikaalimäärityksessä käytetty dietyylimaleaatti (DEM) aiheutti
odotetusti selkeää happiradikaalituotannon nousua samankaltaisesti kuin Luukkosen ym.
(2014) tutkimuksessa neuroblastoomasoluilla. Tässä tutkimuksessa käytettiin esikokeiden
perusteella valittua 0,02 % DEM-pitoisuutta kolmen tunnin altistuksella, kun taas Luukkonen
ym.
(2014)
käyttivät
0,015
%
DEM-pitoisuutta
tunnin
altistuksella.
DNA-
vauriomäärityksessä positiivikontrollina käytetty metyylimetaanisulfonaatti (MMS) aiheutti
selkeää DNA-vauriovastetta kuvaavan OTM-arvon nousua 50 µg/ml pitoisuudella. Sekä
DCF-menetelmällä että Comet Assay–menetelmällä saatiin siis vastetta aikaiseksi
positiivikontrolleilla, joten ainakin niiltä osin menetelmät toimivat C6-soluilla.
Magneettikenttäaltistus lisäsi DNA-vauriovastetta, mutta laski happiradikaalituotantoa rotan
glioomasoluilla. Magneettikentän vaikutusmekanismi solutason tapahtumiin voi siis olla jokin
39
muu kuin happiradikaalituotannon kautta, mutta lisätutkimuksia tarvitaan eri solulinjoilla ja
spesifisemmillä menetelmillä eri happiradikaalien määrittämiseksi. Lisäksi tarvitaan
tutkimuksia eri antioksidanttien eri pitoisuuksilla, jolloin mahdolliset suojaavat vaikutukset
saadaan paremmin esiin. Antioksidanttikäsittelyn keston tai ajankohdan vaikutusta
magneettikentän aiheuttaman happiradikaalituotannon kasvun estämiseen tulisi myös tutkia
lisää.
Tilastollisten analyysien perusteella havaittiin, että tilastollisesti merkitseviä eroja oli soluilla,
joita oli altistettu 1 µM menadionille ja 2 mM NAC:lle sekä DNA-vauriovastemäärityksessä
kontrollisolujen ja magneettikentälle altistettujen solujen välillä ilman NAC-käsittelyä (p <
0,05). Tässä on kuitenkin todennäköisesti käynyt kokeen suorittamisvaiheessa jokin virhe,
kuten jo aiemmin on mainittu. Tuloksissa oli havaittavissa biologisia eroavaisuuksia, joten
magneettikentällä ja menadionilla sekä antioksidantti NAC:lla oli vaikutusta solutasolla tässä
tutkimuksessa, vaikka tilastollisia merkitsevyyksiä ei läheskään jokaisen eroavaisuuden
välillä havaittu.
6.1 VIRHELÄHTEET
DNA-vauriomäärityksessä käytetyllä Comet Assay-menetelmällä saaduissa tuloksissa
kontrollisolujen
OTM-arvo
nousi
varsin
korkealle
tasolle
verrattuna
magneettikenttäaltistettuihin soluihin. Tässä on todennäköisesti käynyt jokin tekninen virhe,
joka vaatii lisäselvittelyjä. Yksi mahdollinen virhetekijä on solujen irrotusvaiheessa tehtävä
solujen trypsinointi. Solut ovat mahdollisesti olleet tässä tapauksessa liian kauan trypsiinin
vaikutuksen alaisena, jolloin solut ovat mahdollisesti alkaneet hajoamaan nostaen näin ollen
OTM-arvoa.
Soluviljelyssä
ja
määritysmenetelmissä
sekä
liuosten
ja
altisteiden
valmistuksessa käytetyt tilavuudet ovat pieniä, joten pipetoinnissa tapahtuva pienikin
poikkeama voi aiheuttaa muutoksia tuloksissa. Solutason tutkimustyö vaatii äärimmäistä
tarkkuutta. Työskentely laboratoriossa sujui pääosin hyvin, olosuhteet toistojen välillä olivat
samankaltaiset ja solujen elävyys pysyi hyvänä toistojen välillä, joten tuloksia voidaan pitää
luotettavina. Toistojen määrää lisäämällä tulosten luotettavuutta saadaan parannettua.
40
7 YHTEENVETO
Magneettikenttäaltistus vähensi happiradikaalituotantoa lähes jokaisessa tapauksessa sekä
ilman
menadionia
että
menadionin
kanssa.
Käytetty
DCF-menetelmä
määrittää
happiradikaalituotantoa yleisellä tasolla, joten spesifisemmät happiradikaalit eivät välttämättä
määrity
käytetyllä
menetelmällä.
NAC:lla
saatiin
laskettua
happiradikaalituotantoa
välittömästi magneettikenttäaltistuksen jälkeen määritettynä, mutta menadionialtistuksen
jälkeen estävää vaikutusta ei enää ollut havaittavissa. Magneettikenttä nosti DNAvauriovastetta kuvaavaa OTM-arvoa lähes jokaisessa tapauksessa. NAC:lla tätä vaikutusta ei
pystytty estämään. Tarvitaan lisätutkimuksia eri solulinjoilla ja spesifisemmillä menetelmillä
eri happiradikaalien määrittämiseksi. Lisäksi tarvitaan tutkimuksia eri antioksidanttien eri
pitoisuuksilla,
jolloin
mahdolliset
suojaavat
vaikutukset
saadaan
paremmin
esiin.
Antioksidanttikäsittelyn keston tai ajankohdan vaikutusta magneettikentän aiheuttaman
happiradikaalituotannon nousun estämiseen tulisi myös tutkia lisää.
41
LÄHTEET
Bartsch H. ja Nair J. (2004). Oxidative stress and lipid peroxidation-derived DNA-lesions in
inflammation driven carcinogenesis. Cancer Detection and Prevention 28: 385-391.
Da Silva J., de Freitas T.R.O., Marinho J.R., Speit G. ja Erdtmann B. (2000). An alkaline
single-cell gel electrophoresis (comet) assay for environmental biomonitoring with native
rodents. Genetics and Molecular Biology 23: 241-245.
D’Angelo C., Costantini E., Kamal M.A. ja Reale M. (2015). Experimental model of ELFEMF exposure: Concern of human health. Saudi Journal of Biological Sciences 22: 75-84.
Di Loreto S., Falone S., Caracciolo V., Sebastiani P., DʼAlessandro A., Mirabilio A.,
Zimmitti V. ja Amicarelli F. (2008). Fifty hertz extremely low-frequency magnetic field
exposure elicits redox and trophic response in rat-cortical neurons. Journal of Cellular
Physiology 219: 334-343.
Falone S., Grossi M.R., Cinque B., DʼAngelo B., Tettamanti E., Cimini A., Di Ilio C. ja
Amicarelli F. (2007). Fifty herz extremely low-frequency magnetic field causes changes in
redox and differentiative status in neuroblastoma cells. The International Journal of
Biochemistry & Cell Biology 39: 2093-2106.
Falone S., Mirabilio A., Carbone M.C., Zimmitti V., Di Loreto S., Mariggiò M.A., Mancinelli
R., Di Ilio C. ja Amicarelli F. (2008). Chronic exposure to 50 Hz magnetic fields causes a
significant weakening of antioxidant defence systems in aged rat brain. The International
Jounral of Biochemistry & Cell Biology 40: 2762-2770.
Frahm J., Lantow M., Lupke M., Weiss D.G. ja Simkó M. (2006). Alteration in cellular
functions in mouse macrophages after exposure to 50 Hz magnetic fields. Journal of Cellular
Biochemistry 99: 168-177.
Grobben B., De Deyn P.P. ja Slegers H. (2002). Rat C6 glioma as experimental model system
for the study of glioblastoma growth and invasion. Cell Tissue Research 310: 257-270.
Güler G., Turkozer Z., Tomruk A. ja Seyhan N. (2008). The protective effect of N-acetyl-Lcysteine and epigallocatehcin-3-gallate on electric field-induced hepatic oxidative stress.
International Journal of Radiation Biology 84 (8): 669-680.
Halliwell B. (2007). Biochemistry of oxidative stress. Biochemical Society Transactions 35
(5): 1147-1150.
Han D., Sen C.K., Roy S., Kobayashi M.S., Tritschler H.J. ja Packer L. (1997). Protection
against glutamate-induced cytotoxicity in C6 glial cells by thiol antioxidants. The American
Physiological Society 273: R1771-R1778.
Henbest K.B., Kukura P., Rodgers C.T., Hore P.J. ja Timmel C.R. (2003). Radio frequency
magnetic field effects on a radical recombination reaction: a diagnostic test for the radical pair
mechanism. Journal of American Chemical Society 126: 8102-8103.
42
Higuchi Y. ja Matsukawa S. (1999). Glutathione depletion induces giant DNA and highmolecular-weight DNA fragmentation associated with apoptosis through lipid peroxidation
and protein kinase C activation in C6 glioma cells. Archives of Biochemistry and Biophysics
363 (1): 33-42.
Hoet P., Nemery B. ja Napierska D. (2013). Intracellular oxidative stress caused by
nanoparticles: What do we measure with the dichlorofluorescein assay?. Nano Today 8: 223227.
IARC Monographs 80. (2002). Non-ionizing radiation, part 1: Static and extremely lowfrequency (ELF) electric and magnetic fields.
Ishige K., Schubert D. ja Sagara Y. (2000). Flavonoids protect neuronal cells from oxidative
stress by three distinct mechanism. Free Radical Biology & Medicine 30 (4): 433-446.
Jelenković A., Janać B., Pešić V., Jovanović D.M., Vasiljević I. ja Prolić Z. (2006). Effects of
extremely low-frequency magnetic field in the brain of rats. Brain Research Bulletin 68: 355360.
Jensen S.J.K. (2003). Oxidative stress and free radicals. Journal of Molecular Structure
(Theochem) 666-667: 387-392.
Jin Y.B., Kang G.-Y., Lee J.S., Choi J.-II., Lee J.-W., Hong S.-C., Myung S.H. ja Lee Y.-L.
(2012). Effects of micronuclei formation of 60-Hz electromagnetic field exposure with
ionizing radiation, hydrogen peroxide or c-Myc overexpression. International Journal of
Radiation Biology 88 (4): 374-380.
Jin Y.B., Choi S.-H., Lee J.S., Kim J.-K., Lee J.-W., Hong S.-C., Myung S.H. ja Lee Y.--L.
(2014). Absence of DNA damage after 60-Hz electromagnetic field exposure combined with
ionizing radiation, hydrogen peroxide, or c-Myc overexpression. Radiation and
Environmental Biophysics 53: 93-101.
Jokela K. (2006). Säteily- ja ydinturvallisuus, osa 6: Ionisoimaton säteily – Sähkömagneettiset
kentät: 1. luku: s. 16, 18, 20–22. Karisto Oy:n kirjapaino, Hämeenlinna.
Juutilainen J., Kumlin T. ja Naarala J. (2006). Do extremely low frequency magnetic fields
enhance the effects of environmental carcinogens? A meta-analysis of experimental studies.
International Journal of Radiation Biology 82 (1): 1-12.
Kasperczyk S., Dobrakowski M., Kasperchyk J., Ostalowska A., Zalejska-Fiolka J. ja Birkner
E. (2014). Beta-carotene reduces oxidative stress, improves glutathione metabolism and
modifies antioxidant defense systems in lead-exposed workers. Toxicology and Applied
Pharmacology 280: 36-41.
Lai H. ja Singh N.P. (1997). Acute exposure to a 60 Hz magnetic field increases DNA strand
breaks in rat brain cells. Bioelectromagnetics 18: 156-165.
43
Lee B.-C., Johng H.-M., Lim J.-K., Jeong J.H., Baik K.Y., Nam T.J., Lee J.H., Kim J., Sohn
U.D., Yoon G., Shin S. ja Soh K.-S. (2004). Effects of extremely low frequency magnetic
field on the antioxidant defense system in mouse brain: a chemiluminescence study. Journal
of Photochemistry and Photobiology 73: 43-48.
Lushchak V.I. (2014). Free radicals, reactive oxygen species, oxidative stress and its
classification. Chemico-Biological Interactions 224: 164-175.
Luukkonen J., Juutilainen J. ja Naarala J. (2008). Combined effects of 872 MHz
radiofrequency radiation and ferrous chloride on reactive oxygen species production and
DNA damage in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. Bioelectromagnetics 31: 417-424.
Luukkonen J., Liimatainen A., Höytö A., Juutilainen J. ja Naarala J. (2011). Pre-exposure to
50 Hz magnetic fields modifies menadione-induced genotoxic effects in human SH-SY5Y
neuroblastoma cells.PLoS ONE 6 (3): 1-6.
Luukkonen J., Liimatainen A., Juutilainen J. ja Naarala J. (2014). Induction of genomic
instability, oxidative processes, and mitochondrial activity by 50 Hz magnetic fileds in human
SH-SY5Y neuroblastoma cells. Mutation Research 760: 33-41.
Maccarrone M., Catani M.V., Iraci S., Melino G. ja Agrò A.F. (1997). A survey of reactive
oxygen species and their role in dermatology. Journal of the European Academy of
Dermatology and Venereology 8: 185-202.
Markkanen A., Juutilainen J. ja Naarala J. (2008). Pre-exposure to 50 Hz magnetic fields
modifies menadione-induced DNA damage response in murine L929 cells. International
Journal of Radiation Biology 84 (9): 742-751.
Minelli A., Bellezza I., Conte C. ja Culig Z. (2009). Oxidative stress-related aging: A role for
prostate cancer?. Biochimica et Biophysica Acta 1795: 83-91.
Monetti M., Villarini M., Simonucci S., Fatigoni C., Scassellati-Sforzolini G., Monarca S.,
Pasquini R., Angelucci M. ja Strappini M. (2005). Effects of co-exposure to extremely low
frequency (ELF) magnetic fields and benzene or benzene metabolites determined in vitro by
the alkaline comet assay. Toxicology Letters 157: 119-128.
Miyakoshi Y., Kajihara C., Shimizu H. ja Yanagisawa H. (2012). Tempol suppresses
micronuclei formation in astrocytes of newborn rats exposed to 50-Hz 10-mT electromagnetic
fields under bleomycin administration. Mutation Research 747: 138-141.
Naarala J.T., Loikkanen J.J., Ruotsalainen M.H. ja Savolainen K.M. (1995). Lead amplifies
glutamate-induced oxidative stress. Free Radical Biology & Medicine 19 (5): 689-693.
Negi R., Pande D., Karki K., Kumar A., Khanna R.S. ja Khanna H.D. (2014). Association of
oxidative DNA damage, protein oxidation and antioxidant function with oxidative stress
induced cellular injury in pre-eclamptic/eclamptic mothers during fetal circulation. ChemicoBiological Interactions 208: 77-83.
44
Omata Y., Saito Y., Yoshida Y., Jeong B-S., Serwa R., Nam T-g., Porter N.A. ja Niki E.
(2010). Action of 6-amino-3-pyridinols as novel antioxidants against free radicals and
oxidative stress in solution, plasma, and cultured cells. Free Radical Biology & Medicine 48:
1358-1365.
Phillips J.L., Singh N.P. ja Lai H. (2009). Electromagnetic fields and DNA damage.
Pathophysiology 16: 79-88.
Reuter S., Gupta S.C., Chaturvedi M.M. ja Aggarwal B.B. (2010). Oxidative stress,
inflammation, and cancer: How are they linked?. Free Radical Biology & Medicine 49: 16031616.
Rollwitz J., Lupke M. ja Simkó M. (2004). Fifty-hertz fields induce free radical formation in
mouse bone marrow-derived promonocytes and macrophages. Biochimica et Biophysica Acta
1674: 231-238.
Sander C.S., Hamm F., Elsner P. ja Thiele J.J. (2003). Oxidative stress in malignant
melanoma and non-melanoma skin cancer. British Journal of Dermatology 148: 913-922.
Sansone R.A. jaSansone L.A. (2011). Getting a knack for NAC. Innovations in Clinical
Neuroscience 8 (1): 10-14.
Seibert H., Maser E., Schweda K., Seibert S. ja Gülden M. (2011). Cytoprotective activity
against peroxide-induced oxidative damage and cytotoxicity of flavonoids in C6 rat glioma
cells. Food and Chemical Toxicity 49: 2398-2407.
Simkó M., Droste S., Kriehuber R. ja Weiss D.G. (2001). Stimulation of phagocytosis and
free radical production in murine macrophages by 50 Hz electromagnetic fields. European
Jounral of Cell Biology 80: 562-566.
Singh N. ja Lai H. (1998). 60 Hz magnetic field exposure induces DNA crosslinks in rat brain
cells. Mutation Research 400: 313-320.
Siqueira I.R., Fochesatto C., de Andrade A., Santos M., Hagen M., Bello-Klein A. ja Netto
C.A. (2005). Total antioxidant capacity is impaired in different structures from aged rat brain.
International Journal of Developmental Neuroscience 23: 663-671.
Sul A-R., Park S-N.ja Suh H. (2006). Effects of electromagnetic fields on structure and
function of rat glioma cell line. Research Journal of Microbiology 1 (2): 124-135.
Sulpizio M., Falone S., Amicarelli F., Marchisio M., Di Giuseppe F., Eleuterio E., Di Ilio C.
ja Angelucci S. (2011). Molecular basis underlying the biological effects elicited by
extremely low-frequency magnetic field (ELF-MF) on neuroblastoma cells. Journal of
Cellular Biochemistry 112: 3797-3806.
Timmel C.R. ja Henbest K.B. (2004). A study of spin chemistry in weak magnetic fields.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series A, 362: 2573-2589.
Valko M., Rhodes C.J., Moncol J., Izakovic M. ja Mazur M. (2006). Free radicals, metals and
antioxidants in oxidative stress-induced cancer. Chemico-Biological Interactions 160: 1-40.
45
Williams R.J., Spencer J.P.E. ja Rice-Evans C. (2004). Flavonoids: antioxidants or signalling
molecules? Free Radical Biology & Medicine 36 (7): 838-849.
Wolf F.I., Torsello A., Tedesco B., Fasanella S., Boninsegna A., DʼAscenzo M., Grassi C.,
Azzena G.B. ja Cittadini A. (2005). 50-Hz extremely low frequency electromagnetic fields
enhance cell proliferation and DNA damage: possible involvement of a redox mechanism.
Biochimica & Biophysica Acta 1743: 120-129.
Wätjen W. ja Beyersmann D. (2004). Cadmium-induced apoptosis in C6 glioma cells:
Influence of oxidative stress. Biometals 17: 65-78.
Zhang M., Li X., Bai L., Uchida K., Bai W., Wu B., Xu W., Zhu H. ja Huang H. (2013).
Effects of low frequency electromagnetic field of proliferation of human epidermal stem cells:
an in vitro study. Bioelectromagnetics 34: 74-80.
LIITE 1
LIITE 1. KEMIKAALIT JA LIUOKSET
Kemikaalit
Agaroosi (matala sulamispisteinen) = Low Melting Point-Agarose (Sigma, Yhdysvallat)
Agaroosi (normaali sulamispisteinen) = Normal Melting Point-Agarose (BioWhittaker
Molecular Applications, Yhdysvallat)
DCF = Dikloorihydrofluoreskiinidiasetaatti (Invitrogen Corporation / Molecular Probes,
Yhdysvallat)
DEM = Maleic Acid Diethyl Ester (Sigma Chemical Corporation, Yhdysvallat)
Dulbecco’s Modified Eagle Mediumi (Life Technologies, Yhdysvallat)
Digitoniini (Sigma-Aldrich Yhdysvallat / Saksa)
DMEM = Dulbecco´s Modified Eagle Medium (Gibco, Invitrogen Corporation, Yhdysvallat)
EDTA = Etyleenidiamiinitetraetikkahappo (Merck KGaA, Saksa)
Eriphenol Erisan Erifenol Combi (Orion yhtymä oyj NOIRO, Suomi)
ETAX Aa = Absoloitu etanoli (99,5 paino-%) (Altia Oyj, Suomi)
EtOH = Etyylialkoholi (Altia Corporation, Suomi)
FBS = Fetal Bovine Serum = Fetaali vasikan seerumi (Gibco, Invitrogen Corporation, IsoBritannia)
Menadioni (Sigma Chemical, Yhdysvallat / Sigma-Aldrich, Belgia)
MMS = metyylimetaanisulfonaatti (Sigma-Aldrich, Yhdysvallat/ Saksa)
Na2HPO4 = Natriumvetyfosfaatti (Merck KGaA, Saksa)
NAC = N-Asetyyli-L-kysteiini (Sigma-Aldrich, Yhdysvallat)
NaCl = Natriumkloridi (Fisher Chemical, Iso-Britannia)
NaOH = Natriumhydroksidi (Fisher Chemical, UK)
Natriumlauryylisarkosinaatti (Sigma, UK)
Penisilliini-streptomysiini-liuos = 5000 U/ml penisilliiniä ja 5000 µg/ml streptomysiiniä
(Gibco, Invitrogen Corporation, Kanada)
PI = Propidiumjodidi (Molecular Probes, Yhdysvallat / Molecular Probes Europe,
Alankomaat)
Tris Base (Sigma, USA)
Triton-X-100 (Sigma-Aldrich, Saksa)
Trypsiini 2,5 %
Liuokset
Agaroosiliuos objektilaseille: Punnitse 0,5 g NMP-agaroosia ja liuota se 50 ml PBSpuskuriin. Kiehauta varoen mikroaaltouunissa, siten että liuos on kirkasta. Tarkasta nestepinta
ja täydennä tarvittaessa PBS-puskurilla. Poista pinnalta ylimääräinen geelikerros.
Käytettävissä heti.
DCF-HBSS: 240 µl 5 mM DCF-kantaliuos + 35 ml HBSS
DCF-kantaliuos (5 mM) DMSO:ssa: Liuotetaan 14,6 mg DCF:aa 14,6 ml:aan DMSO:ta.
Jaetaan 120 µl:n eriin eppendorf-putkiin ja lisätään suojakaasu N2. Kääritään parafilmi
ympärille ja laitetaan folioon ja silikageelillä varustettuun purkkiin. Säilytys -20⁰C.
LIITE 1
Digitoniini-kantaliuos (4 mM) MilliQ-vedessä: Tehdään ensin 40 mM kantaliuos. Digitoniinia
liuotetaan 49,17 mg/ml +95⁰C MilliQ-veteen 15 minuutin ajan lämpöblokissa. 40 mM kantaliuos laimennetaan eppendorf-putkiin suhteessa 1:10 MilliQ-vedellä. Säilytys +4⁰C.
Elektroforeesipuskuri (ajopuskuriliuos): 1930 ml MilliQ-vesi + 60 ml NaOH (10 M) + 10 ml
EDTA (200 mM). Peitä parafilmillä ja säilytä jääkaapissa ennen käyttöä. Valmistettava
samana päivänä vähintään tuntia ennen käyttöä.
Hajotuspuskuriliuos: 146,1 g/l NaCl + 37,2 g/l EDTA + 1,2 g/l + 10 g/l
natriumlauryylisarkosinaatti. Aineet sekoitetaan MilliQ-veteen magneettisekoittajalla
mielellään vetokaapissa. Liuos on tässä vaiheessa sameaa ja vaahtoaa helposti. Liuoksen
pH:ta säädetään NaOH-rakeilla, kunnes pH on 10. Samalla liuos kirkastuu. Kaadetaan litran
mittapulloon ja säädetään lopputilavuuteen MilliQ-vedellä. Suodatetaan liuos 0,45 µm
suodattimen läpi säilöpulloon. Säilytetään huoneenlämmössä.
Hajotuspuskuri: 267 ml hajotuspuskuriliuosta + 30 ml milliQ-vesi + 3 ml Triton-X-100. Peitä
parafilmillä ja säilytä valolta suojattuna jääkaapissa ennen käyttöä. Valmistettava samana
päivänä vähintään tuntia ennen käyttöä.
HBSS: Hank´s Balanced Salt Solution (5 mM KCl, 0,5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 3,8 mM
NaH2PO4, 2,9 mM NaHCO3) pH 7,0-7,4: 900 ml:aan MilliQ-vettä liuotetaan 0,4 g KCL, 0,06
g KH2PO4, 8,0 g NaCl, 0,35 g NaHCO3, 0,048 g NaH2PO4 ja 1,0 g D-Glukoosi. Liuoksen pH
tarkistetaan ja lisätään MilliQ-vettä lopputilavuuteen 1000 ml asti. Valmis liuos
streriilisuodatetaan membraanisuodattimella (Millipore 0,22 µm) steriiliin säiliöpulloon.
Irrotusliuos: (0,1 % trypsiini in 0,02 % EDTA in PBS w/o Ca2+, Mg2+). Tehdään PBSpuskuriin, johon lisätään ennen autoklavointia 0,04 g EDTA/200 ml. Liuos steriloidaan
autoklaavissa, jonka jälkeen lisätään 8 ml 2,5 % trypsiiniä, jolloin irrotusliuoksen
trypsiinivahvuus on 0,1 %.
Kasvatusliuos: 500 ml DMEM (glukoosia 1,0 g/l) + 50 ml 10 % inaktivoitu FBS + 5 ml
penisilliini-streptomysiini-liuosta. Inaktivoitu FBS ja penisilliini-streptomysiini-liuos
(molempien säilytys -20⁰C) lisätään juuri ennen käyttöä valmiiksi jaotelluissa erissä.
Menadioni-kantaliuos 100 mM MilliQ-vedessä: Liuotetaan 0,1381 g menadionia 5 ml:aan
MilliQ-vettä. Jaetaan eppendorf-putkiin ja laitetaan parafilmi putkien ympärille. Säilytettävä 20⁰C.
NAC-kantaliuos (0,5 M) MilliQ-vedessä: 407,98 mg NAC + 5 ml MilliQ-vettä. NAC
liuotetaan lämpimässä vesihauteessa MilliQ-veteen ja täytetään lopputilavuuteen. Liuos
steriilisuodatetaan membraanisuodattimella (Millipore 0,22 µM). Jaetaan eriin. Säilytys 20⁰C.
Natriumhydroksidi (10 M NaOH): 200 g/500 ml NaOH. Liuotetaan punnittu aine pienissä
erissä MilliQ-veteen magneettisekoittajalla vetokaapissa. Liuos lämpenee voimakkaasti.
Annetaan liuoksen jäähtyä esim. jääastiassa huoneenlämpöiseksi, kaadetaan mittapulloon ja
täytetään lopputilavuuteen MilliQ-vedellä. Kaadetaan valmis liuos säilöpulloon, säilytys
huoneenlämmössä.
LIITE 1
Neutralointipuskuri (0,4 M Tris): 48,5 g/l Tris Base. Sekoitetaan punnittu aine MilliQ-veteen
magneettisekoittajalla mielellään vetokaapissa. Säädetään liuoksen pH:ksi 7,5 väkevällä
suolahapolla (J.T.Baker, Holland). Kaadetaan litran mittapulloon ja säädetään
lopputilavuuteen MilliQ-vedellä. Suodatetaan liuos 0,45 µm suodattimen läpi säilöpulloon.
Säilytetään huoneenlämmössä.
PBS + FBS (2 %) –puskuri: 1 ml FBS + 49 ml PBS
PBS = Phosphate-Buffered Saline w/o Ca2+, Mg2+ 1000 ml, pH 7,4: KCl 0,20 g/l (2,7 mM),
KH2PO4 0,20 g/l (1,5 mM), NaCl 8,00 g/l (137 mM), Na2HPO4 1,15 g/l (8,1 mM)
PBS-FBS: 1 ml FBS + 49 ml PBS
Propidiumjodidi (PI)-kantaliuos (1,25 mM) MilliQ-vedessä: punnitaan 6,68 mg PI + 8 ml
MilliQ-vettä. Jaetaan 200 µl eriin. Säilytys +4⁰C.