NMR-SPEKTROSKOPIA
761359A Spektroskooppiset menetelmät NMR-SPEKTROSKOPIA Ville-Veikko Telkki, kevät 2015 1 Sisällysluettelo Sisällysluettelo .................................................................................... 2 Johdanto ............................................................................................. 4 1. Ytimen spin ja magneettinen momentti..................................... 8 2. Ytimen energiatilat ................................................................... 12 3. Makroskooppinen ydinmagnetoituma ..................................... 15 4. NMR-signaalin havaitseminen .................................................. 19 5. Ytimen vuorovaikutukset ympäristönsä kanssa ....................... 24 6. 5.1 Varjostusvuorovaikutus .................................................... 25 5.2 Suora dipolivuorovaikutus ................................................ 29 5.3 Epäsuora spin-spin-vuorovaikutus ................................... 30 5.4 Kvadrupolivuorovaikutus.................................................. 36 Relaksaatio................................................................................ 37 6.1 Spin-ympäristörelaksaatio ...................................................... 38 6.1.1 T1:n määrittäminen kääntämis-palautumismenetelmällä .................................................................................................. 38 6.1.2 Pitkittäisen magnetisaation palautuminen 90-pulssin jälkeen ...................................................................................... 41 2 6.2 Spin-spin-relaksaatio .............................................................. 43 6.2.1 T2-relaksaatioajan määrittäminen ................................... 43 6.3 Relaksaatiomekanismit........................................................... 46 7. Fourier-muunnos ...................................................................... 49 7.1 Rf-pulssin taajuusvaste ........................................................... 49 7.2 Spektri ..................................................................................... 52 8. Diffuusio ................................................................................... 56 9. 2D NMR..................................................................................... 62 10. Magneettikuvaus .................................................................. 65 11. NMR-spektrometri................................................................ 69 12. Lisätietoa NMR-spektroskopiasta ja magneettikuvauksesta 70 3 Aktivoi ennakkotietosi: Mitä lyhenne NMR tarkoittaa? Miten NMR-spektroskopia eroaa muista spektroskopioista? Tunnetko NMR-spektroskopian sovelluksia? Millä aloilla NMR-spektroskopiaa voidaan hyödyntää? Johdanto Ydinmagneettinen resonanssispektroskopia eli NMR-spektroskopia (NMR on lyhenne sanoista Nuclear Magnetic Resonance) perustuu magneettisten ydinten vuorovaikutukseen magneettikenttien kanssa. Se on eräs monipuolisimmista tutkimusmenetelmistä, koska se tarjoaa sekä kemiallista, dynaamista että paikkaan liittyvää tietoa. NMR-spektroskopiassa näyte absorboi ja emittoi radiotaajuista (luokkaa 100 MHz) säteilyä, joka ei ole ionisoivaa (toisin kuin esim. röntgensäteily). Lisäksi radioaallot pystyvät tunkeutumaan läpinäkymättömiin aineisiin, joten NMR-mittaus ei vaurioita tutkittavaa näytettä. 4 NMR-spektroskopiaa hyödynnetään hyvin erilaisiin tarkoituksiin: Kemistit käyttävät sitä laajasti kemialliseen analyysiin ja molekyylien (jopa suurien proteiinimolekyylien) rakenteen määrittämiseen. Ei ole liioiteltua väittää, että varteenotettavaa kemian tutkimusta ei ole nykyisin mahdollista tehdä ilman NMRspektroskopiaa. NMR on yksi harvoista menetelmistä molekyylien diffuusion tutkimiseen ilman merkkiaineita tai keinotekoisia konsentraatiogradientteja. Sillä saadaan tietoa myös molekyylien orientaatiosta, pyörimisliikkeestä ja virtauksista. NMR:n tunnetuin sovellus on sairaaloissa laajasti käytössä oleva magneettikuvausmenetelmä. Kun röntgenkuvissa näkyvät lähinnä kovat materiaalit, kuten luut, niin magneettikuvauksella nähdään pehmytkudos – sillä voidaan esimerkiksi ottaa poikkileikkauskuvia potilaan aivoista vahingoittamatta niitä mitenkään. NMR-spektroskopian monitieteisyyttä kuvaavaa useat eri alojen Nobel-palkinnot, joita menetelmän kehittämisestä on sen historian aikana myönnetty: Felix Blochin ja Edward M. Purcellin johtamat tutkimusryhmät havaitsivat (toisistaan riippumatta) ensimmäiset NMR-signaalit vuonna 1945 ja Bloch ja Purcell saivat tästä keksinnöstä yhteisesti fysiikan Nobel-palkinnon vuonna 1952. Richard R. Ernst sai puolestaan kemian Nobel-palkinnon vuonna 5 1991 uusien NMR-menetelmien (Fourier-muunnos-NMR ja kaksiulotteinen NMR) kehittämisestä. Vuonna 2002 Kurt Wüthrich sai jaetun kemian Nobel-palkinnon NMR-menetelmien kehittämisestä biologisten makromolekyylien kolmiulotteisen rakenteen määrittämiseen liuostilassa ja vuonna 2003 Paul C. Lauterbur ja Sir Peter Mansfield saivat lääketieteen Nobel-palkinnon magneettikuvauksen kehittämisestä. 6 Tässä Spektroskooppiset menetelmät –kurssin NMR-osiossa tavoitteena on tutustua NMR-spektroskopian perusteisiin ja ymmärtää, mihin kaikkeen sitä voi soveltaa. Perusteellisemmin ja syvällisemmin NMR:n maailmaan voit perehtyä seuraavilla Oulun yliopiston fysiikan laitoksella järjestettävillä syventävillä kursseilla: 761663S NMR-spektroskopia, 766661S NMR-kuvaus (magneettikuvaus), 761670S Kiinteän aineen NMR-spektroskopia, 766669S Ydinmagneettinen relaksaatio ja 761669S NMR-spektroskopian sovellukset. Kurssi 766106P Fysiikan laboratoriotyöt 2 sisältää NMRspektroskopiaan liittyvän harjoitustyön (saman harjoitustyön voi tehdä myös kurssilla 766308A Fysiikan laboratoriotyöt 3). Kemian laitos tarjoaa myös useita käytännönläheisiä NMR-kursseja, mm. NMR-workshop –kurssit. NMR-spektroskopiaan liittyvään tutkimukseen voit osallistua jo opintojesi aikana valitsemalla fysiikan tutkimusprojektin, kandin työn ja gradun aiheen joko kokeellisesta tai laskennallisteoreettisesta NMR:stä (edellisessä tapauksessa ota yhteyttä dosentti Ville-Veikko Telkkiin, jälkimmäisessä professori Juha Vaaraan). 7 1. Ytimen spin ja magneettinen momentti Aktivoi ennakkotietosi: Mitä sana spin tarkoittaa? Mitä spin tarkoittaa kvanttimekaniikassa? Elektronin spin on ½. Miten elektronin spin muuttaa atomeista havaittua spektriä? Useilla atomien ytimillä on nollasta poikkeava sisäinen impulssimomentti eli spinimpulssimomentti J (vektori). Klassisesti voidaan kuvitella, että tällaiset ytimet ovat kuin pieniä hyrriä, joiden kuvitteellinen pyörimisakseli määrittää ytimen suunnan eli orientaation. Jos ytimellä on spinimpulssimomentti, niin sillä on myös magneettinen dipolimomentti , joka on J:n kanssa yhdensuuntainen (saman- tai vastakkaissuuntainen): μ J (1) Verrannollisuuskerroin on kullekin ytimelle ominainen luku, gyromagneettinen suhde. Kun tällainen magneettinen ydin laitetaan magneettikenttään B, kenttä kohdistaa ytimeen vääntömomentin B, joka klassisen 8 mekaniikan mukaan on ytimien spinimpulssimomentin aikaderivaatan (dJ/dt) suuruinen. Tämän seurauksena ydin alkaa prekessoida (prekessointi tarkoittaa pyörimisakselin kiertymistä, pyörimisakselin ja magneettikentän välinen kulma pysyy vakiona), aivan samalla tavalla kuin hyrrä prekessoi maan gravitaatiokentässä. Ytimen prekessiotaajuus eli ns. Larmorin prekessiotaajuus on B. 2 (2) Prekessiotaajuus riippuu siis vain ytimen kohdalla olevan magneettikentän suuruudesta ja ytimen gyromagneettisesta suhteesta. Todellisuudessa spinimpulssimomentti on kvanttimekaaninen ominaisuus, eikä se liity ytimen pyörimiseen (hyrräanalogia on kuitenkin oivallinen tapa hahmottaa asiaa). Kvanttimekaniikan mukaan spinimpulssimomenttivektorin pituus ja suunta eivät ole mielivaltaisia, vaan ne voivat saada vain diskreettejä arvoja. J:n pituus on J J I I 1 , (3) missä I on ytimen spinkvanttiluku, joka on joku luvuista 1 3 I 0, ,1, ... , 2 2 (4) ja ħ = h/2, missä h on Planckin vakio. J:n komponentti z-akselin suunnassa on joku luvuista 9 J z m I , I 1, I 2, ..., I , (5) joita on yhteensä 2I + 1 kappaletta (tarkasti ottaen J:n zkomponentin mittaustulos on joku em. luvuista, ennen mittausta ydin voi olla superpositiotilassa). Koska Jz on aina pienempi kuin J, spin ei ole koskaan orientoitunut täysin z-akselin suuntaisesti. Spinimpulssimomenttivektorin kvantittumisesta seuraa se, että myös magneettinen dipolimomentti on kvantittunut: yhtälöiden (1) ja (3) mukaan :n pituus on μ J I I 1 , (6) ja yhtälöiden (1) ja (5) mukaan sen komponentti z-akselin suunnassa on z J z m . (7) Taulukko 1. Eräiden NMR:ssä paljon käytettävien ydinten ominaisuuksia. 10 Esimerkki 1 Vety-ytimen (protonin) spinkvanttiluku on I = ½. Laske spinimpulssimomenttivektorin J pituus ja J:n zakselin suuntaisen komponentin mahdolliset arvot. Mikä on vektoreiden J ja B välinen kulma? 11 2. Ytimen energiatilat Klassisen fysiikan mukaan ytimen magneettisen dipolimomentin ja sen kohdalla olevan magneettikentän B välisen vuorovaikutuksen (Zeemanin vuorovaikutuksen) energia on E μ B . (8) Jos B on z-akselin suuntainen, niin yhtälön (5) avulla E:n lauseke yksinkertaistuu muotoon Em Bm . (9) Energian arvot ovat siis myös kvantittuneet. Kun ydin siirtyy energiatasolta viereiselle tasolle (ts. ytimen suunta muuttuu siten, että m:n muutos m on 1, ainoastaan tällaiset siirtymät ovat suoraan havaittavia), energian muutos on E B . Siirtymässä absorboituvan (resonanssitaajuus) on (10) tai emittoituvan E B B. h h 2 kvantin taajuus (11) Resonanssitaajuus on täsmälleen sama kuin yhtälössä (2) esitetty ytimen prekessiotaajuus. 12 Esimerkki 2 Oulun yliopiston NMR-laboratoriossa on kuusi NMR-spektrometria, joiden pienin magneettikenttä on 4.7 T ja suurin 14.1 T. Laske, mitkä ovat protonin resonanssitaajuudet näissä kentissä. 13 Esimerkki 3 Vuonna 1994 professori Paul Callaghanin johtama tutkimusryhmä matkusti Etelänapamantereelle tutkimaan jään rakennetta NMR-spektroskopian avulla. Maan magneettikentässä suoritetuissa NMR-kokeissa protonin resonanssitaajuus oli 2.76 kHz. Laske maan magneettikentän suuruus Etelänapamantereella. Kuriositeettina mainittakoon, että magneettikentän suunta on lähes pystysuora tuolla alueella. Reissun nettisivut: http://www.victoria.ac.nz/scps/research/research-groups/magneticresonance/antarctic-nmr 14 3. Makroskooppinen ydinmagnetoituma Kun ytimet laitetaan ulkoiseen magneettikenttään B0, ne pyrkivät orientoitumaan kentän suuntaisesti vähän samaan tyyliin kuin magneettinen kompassin neula pyrkii kääntymään maan magneettikentän suuntaan (edellisen luvun mukaan spin-1/2-ydinten spinylös-orientaation energia on matalampi kuin spin-alas-orientaatio, jos > 0). On kuitenkin muistettava, että kvanttimekaniikan mukaan ytimen mitattu orientaatio ei ole koskaan täsmälleen ulkoisen kentän suuntainen, esim. spin-½-ytimen ollessa spin-ylös-tilassa vektoreiden J ja B välinen kulma on 54.7. Toiseksi, lämpöliikkeestä johtuen kaikki ytimet eivät ole spin-ylös-tilassa. Itse asiassa terminen energia kT (k on Bolzmannin vakio ja T on lämpötila) huoneenlämpötilassa on paljon suurempi kuin ydinten energiatilojen välinen erotus E, jonka vuoksi tilojen välinen miehitysero on hyvin pieni. Tilojen miehitysluvut noudattavat Bolzmannin jakaumaa, joten identtisten spin-½-ydinten tapauksessa miehityslukujen suhde on N 1 / 2 E B0 . e E / kT 1 1 N 1 / 2 kT kT (12) Näin ollen tilojen suhteellinen miehitysero on N 1 / 2 N 1 / 2 E B0 . N 1 / 2 N 1 / 2 2kT 2kT (13) 15 Kun kaikkien näytteessä olevan N:n identtisen ytimen magneettiset momentit lasketaan yhteen, tilojen välisen miehityserojen näytteeseen muodostuu ulkoisen magneettikentän (z-akselin) suuntainen makroskooppinen ydinmagnetoituma, jonka suuruus termisessä tasapainotilassa on M0 N 2 2 I I 1 B0 . 3kT (14) Näytteestä havaittavan NMR-signaalin voimakkuus on suoraan verrannollinen M0:n suuruuteen. Magnetoituman suuruutta voidaan kasvattaa kasvattamalla ulkoisen magneettikentän voimakkuutta tai laskemalla lämpötilaa. Vedyn 1H isotoopilla on suurin kaikista stabiileista ytimistä. Lisäksi se on runsaslukuisin ydin biologisissa systeemeissä ja sen luonnollinen runsaus on lähes 100%. Näistä seikoista johtuen 1H on eniten käytetty ydin NMR:ssä. 16 Esimerkki 4 Laske protonien energiatilojen suhteellinen miehitysero 600 MHz:n kentässä (B = 14.1 T) huoneen lämpötilassa (22C). Jos näytteessä on miljoona protonia, niin kuinka moni niistä on spin-ylös-tilassa ja kuinka moni spin-alastilassa? Onko yhtälöitä (12) ja (13) johdettaessa käytetty approksimaatio kT >> E voimassa näissä olosuhteissa? 17 Esimerkki 5 Oletetaan, että näytteessä on yhtä monta 1H-, 13C- ja 14N-ydintä. Kuinka suuri 13C:n ja 14N:n ydinmagnetoituma on verrattuna 1H:n ydinmagnetoitumaan? 18 4. NMR-signaalin havaitseminen Polkupyörän dynamossa pyörivä magneetti indusoi ympärillä olevaan kelaan virran, jonka vaikutuksesta lamppuun syttyy valo. NMRsignaalin havaitseminen perustuu täsmälleen samaan ilmiöön: muuttuva magneettikenttä indusoi näytteen ympärillä olevaan kelaan virran. Tasapainotilanteessa magnetoitumavektori M0 pysyy muuttumattomana z-akselin suuntaisena, eikä kelaan indusoidu virtaa. Stationaarisen, laboratoriokoordinaatiston xakselin suuntainen herätekentän B1 (B1 << B0) aiheuttama vääntömomentti M B1 pyrkii kiertämään magnetisaatiovektoria M kellon suuntaan (jos > 0) yz-tasolla. Samaan aikaan ulkoisen kentän aiheuttaman vääntömomentin M B0 vaikutuksesta magnetisaatiovektori prekessoi paljon suuremmalla nopeudella zakselin ympäri. Puolen prekessiokierroksen ajan (kun My > 0) B1-kenttä kiertää M-vektoria kauemmaksi z-akselista ja puolen (kun My < 0) z-akselia kohti. Loppujen lopuksi M pysyy lähes z-akselin suunnassa, ja sen arvo on lähes muuttumaton (M0), eikä NMR-signaalia havaita. 19 Jos stationaarisen herätekentän sijaan näytteeseen kohdistetaan z-akselin suhteen kohtisuora herätekenttä B1, joka pyörii ytimen resonanssitaajuudella zakselin ympäri, tällöin B1-vektorin ja Mvektorin xy-tason projektion välinen kulma pysyy vakiona, ja M alkaa prekessoida vektorin B1 ympäri (z-akselin suhteen tapahtuvan prekession lisäksi). Koordinaatistossa, joka pyörii resonanssitaajuudella laboratoriokoordinaatiston z-akselin ympäri, B1-vektori pysyy x’-akselilla, ja Mvektori kiertyy kulman B1t p (15) y’z-tasossa ajassa tp. Herätekenttä (virityspulssi) saadaan aikaiseksi kytkemällä resonanssitaajuinen vaihtovirta näytteen vieressä tai ympärillä olevaan kelaan, jolloin virran aiheuttama B1-kenttä värähtelee myös resonanssi taajuudella x-akselin suuntaisesti (sen maksimiarvo on B1 ja minimiarvo –B1). B1-vektorin voidaan ajatella olevan kahden vastakkaiseen suuntaan xy-tasolla pyörivän vektorin (joiden pituus on B1/2) summa. Kellon suuntaan pyörivä komponentti B1c pyörii synkroonissa M-vektorin kanssa (jos > 0), joten se aiheuttaa M-vektorin kallistumisen kohti poikittaista tasoa. Kellon suuntaan vastaa pyörivä komponentti B1a ei vaikuta mitenkään M-vektoriin, koska sen pyörimistaajuus poikkeaa - (-) 20 = 2:n verran M:n pyörimistaajuudesta. Huomaa, että tässä tapauksessa pulssi kulmaa laskettaessa B1 täytyy korvata B1/2:lla yhtälössä (15). On olemassa myös keloja, jotka tuottavat oikeasti pyörivän B1-kentän (esim. bird cage –kela). Virityspulssin pituus voidaan valita siten, että pulssin loputtua M on poikittaisella (xy-) tasolla. Pulssin loputtua vektori jatkaa prekessiotaan z-akselin ympäri xy-tasolla, jolloin näytteen ympärillä tai vieressä olevassa kela kokee muuttuvan magneettikentän, joka indusoi kelaan vaihtojännitteen (kuten polkupyörän dynamossa). Indusoitunut jännite on suoraan verrannollinen magnetoitumavektorin M x-komponentin muuttumisnopeuteen, ts. Mx:n aikaderivaattaan. Näin ollen vastaanottimeen tuleva radiotaajuinen (rf) signaali on muotoa srf (t ) f dM x . dt (16) T2-relaksaation ja magneettikentän epähomogeenisuuden vuoksi magnetisaatiovektori poikittainen komponentti alkaa vähitellen pienentyä, ja T1-relaksaation vaikutuksesta pitkittäinen komponentti kasvaa (ks. luku 6). Koska kelaan indusoituvan signaalin voimakkuus on verrannollinen poikittaisen komponentin suuruuteen, havaittava 21 signaali vaimenee vähitellen. Tämän vuoksi NMR-signaalia kutsutaan vapaan vaimenemisen signaaliksi eli FID-signaaliksi (FID = Free Induction Decay). Magnetisaatiovektorin käyttäytymiseen NMR-kokeissa voit tutustua myös Bloch-simulaattorin avulla: http://www.drcmr.dk/bloch Simulaatio perustuu magnetisaatiovektorin käyttäytymistä kuvaaviin Blochin yhtälöihin (ks. http://en.wikipedia.org/wiki/Bloch_equations), jotka johdetaan kurssilla 761663S NMR-spektroskopia. 22 Esimerkki 6 Laske N:n identtisen ytimen NMR-kokeessa näytteestä vastaanottimeen tuleva rf-signaali. Oletetaan, että kokeen alussa magnetisaatiovektori M0 on kaadettu y-akselin suuntaan 90-asteen pulssilla. Relaksaatiota ei tarvitse huomioida tässä. 23 5. Ytimen vuorovaikutukset ympäristönsä kanssa Pohdintatehtävä: Miten ytimen resonanssitaajuus voisi sisältää tietoa ytimen ympäristöstä? Nyt ymmärrämme jo, miten NMR-signaali tuotetaan. Seuraavaksi esitetään tärkeä kysymys: mitä tietoa NMR-signaali tarjoaa näytteestä? Koska yhtälöiden (2) ja (11) mukaan resonanssitaajuus riippuu vain ytimen kohdalla olevan magneettikentän suuruudesta ja ytimen gyromagneettisesta suhteesta, joku voisi erehtyä luulemaan, että NMR soveltuu ainoastaan gyromagneettisen suhteen ja sitä kautta ytimen magneettisen momentin määrittämiseen. Itse asiassa juuri tätä tarkoitusta varten Bloch ja Purcell tutkimusryhmineen NMR:n alun perin vuonna 1945 kehittivätkin. NMR-spektroskopian sovellusten kannalta merkittävämpää on kuitenkin se, että ytimen kemiallinen ympäristö, elektroniverho ja naapuriytimet muuttavat hiukan ytimen kohdalla olevaa magneettikenttää. Vaikka muutos on hyvin pieni (luokkaa miljoonasosa ulkoisen magneettikentän voimakkuudesta), se on kuitenkin helposti ja tarkasti havaittavissa. Tämän vuoksi NMR tarjoaa monipuolista ja yksityiskohtaista tietoa ytimen kemiallisesta ja fysikaalisesta ympäristöstä. Seuraavaksi perehdymme ytimen kokemiin vuorovaikutuksiin ympäristönsä kanssa (Zeemanin vuorovaikutus käytiin läpi jo luvussa 2). 24 5.1 Varjostusvuorovaikutus Kun molekyyli laitetaan ulkoiseen magneettikenttään, kenttä pakottaa elektronit kiertoliikkeeseen B0:n suunnan ympäri. Tästä johtuva sähkövirta aiheuttaa oman magneettikenttänsä, joka pienentää (varjostaa) ytimen kohdalla olevaa magneettikenttää. Ytimen kokema magneettikenttä on (1-)B0, missä on ytimen varjostusvakio. Ytimen resonanssitaajuus on siten yhtälön (11) perusteella v 1 B0 . 2 (17) Varjostusvakio on eri suuruinen eri molekyylien osissa oleville ytimille, koska ydinten elektroniset (kemialliset) ympäristöt ovat erilaiset. Eri ympäristöissä olevien ytimien resonanssitaajuuksien ero on niiden välinen kemiallinen siirtymä. Käytännössä resonanssitaajuus i mitataan jonkun referenssiaineen resonanssitaajuuden ref suhteen, ja kemiallinen siirtymä i ilmoitetaan miljoonasosina (parts per million, ppm): v ref ref 106 v ref 0 106 . (18) Jälkimmäisessä muodossa nimittäjässä on käytetty referenssiaineen taajuuden sijaan spektrometrin operointitaajuutta 0, koska nämä 25 kaksi taajuutta poikkeavat toisistaan vain hyvin vähän. Yleensä 1H- ja 13 C-NMR-spektroskopiassa referenssiaineena käytetään tetrametyylisilaania, TMS [Si(CH3)4]. -asteikon etuna on se, että siirtymän arvot ovat magneettikentästä riippumattomia, koska sekä osoittajan että nimittäjän arvot ovat suoraan verrannollisia magneettikentän voimakkuuteen. Tyypillisiä kemiallisen siirtymän arvoja (a) 1H- ja (b) 13C-ytimille: 26 Kemiallisen siirtymän ja varjostuksen välinen yhteys saadaan ratkaistua sijoittamalla yhtälö (17) yhtälöön (18): 1 B0 1 0 B0 106 0 106 1 0 B0 10 6 0 10 (19) Kun varjostus pienenee, niin kemiallinen siirtymä kasvaa. Historiallisista syistä johtuen NMR-spektrit esitetään siten, että kasvaa oikealta vasemmalle. Kemiallinen siirtymä selittää alla olevan etanolin (CH3CH2OH) 1HNMR-spektrin pääpiirteet. CH3-ryhmän protonien on noin 1 ppm. Kaksi CH2-ryhmän protonia ovat molekyylin eri osassa, joten ne kokevat hiukan erilaisen paikallinen magneettikentän, ja niiden on noin 3 ppm. Hydroksyyliryhmän (OH-ryhmän) protonin vieressä on happiatomi, jonka elektronegatiivisuus on suuri. Happi vetää voimakkaasti puoleensa sidoselektroneja, pienentäen hydroksyyliprotonin elektronitiheyttä. Tästä johtuen hydroksyyliprotonin varjostus pienenee, ja sen on suurin (noin 4 ppm) kaikista etanolin protoneista. 27 Esimerkki 7 Asetaldehydin (CH3CHO) metyyliryhmän (CH3-ryhmän) protonien kemiallinen siirtymä 2.20 ppm ja karbonyyliryhmän (CHO-ryhmän) 9.80 ppm. Mikä on paikallisen magneettikentän suuruuden erotus näillä kahdella alueella, kun ulkoinen magneettikenttä on (a) 1.5 T ja (b) 15 T? 28 5.2 Suora dipolivuorovaikutus Ytimen j magneettinen momentti j luo ympärilleen magneettikentän, jonka vuon tiheys on B j r 0 3r j r j 3 , 4 r 5 r (20) missä r on vektori ytimestä tarkasteltavaan pisteeseen ja 0 on tyhjiön permeabiliteetti. Ytimen j luoma magneettikenttä Bj muuttaa hiukan naapuriytimen i kokemaa magneettikenttää. Oletetaan, että ytimet pysyvät paikoillaan. Jos spin-½-ydin j on spin-ylös-tilassa, niin sen luoma kenttä ytimen i kohdalla on samansuuruinen ja suuntainen, mutta vastakkaismerkkinen verrattuna tilanteeseen, jossa j on spinalas-tilaan. Tämän vuoksi ytimen i resonanssi jakautuu dipolikytkennän vuoksi kahdeksi spektriviivaksi. Viivojen välimatka riippuu ydinten i ja j välisestä etäisyydestä sekä niiden välisen vektorin orientaatiosta suhteessa ulkoiseen magneettikenttään. Täten dipolikytkentä tarjoaa tietoa molekyylien sidospituuksista ja – kulmista. 29 Dipolikytkentä keskiarvoistuu nollaksi molekyylien isotrooppisen pyörimisen seurauksena, joten kytkentää ei havaita nesteistä tai kaasuista (kahden kytkeytyneen spin-½-ytimen spektrissä nähdään kahden spektriviivan sijaan vain yksi viiva). Kytkentä voidaan kuitenkin havaita kiinteistä aineista ja nestekiteistä. Viime vuosina nestekiteillä tms. heikosti orientoitujen proteiinien rakenteesta on saatu uutta tietoa hyödyntämällä ns. jäännösdipolikytkentää (residual dipolar coupling, RCD). Viereisessä kuvassa siniset nuolet esittävät tiettyjen peptidien N-H sidosten kulmaa. Määrittämällä riittävän monen sidoksen kulma suhteessa ulkoiseen magneettikenttään proteiinin kolmiulotteinen rakenne saadaan ratkaistua. 5.3 Epäsuora spin-spin-vuorovaikutus Ydin j muuttaa hiukan naapuriytimen i kokemaa magneettikenttää myös epäsuorasti elektroniverhon kautta, sillä ytimen j magneettikenttä polarisoi elektronien spineistä johtuvia magneettisia momentteja, jonka seurauksena ydin i kokee pienen lisäkentän Bj. Tämän epäsuoran spin-spin-vuorovaikutuksen seurauksena ytimen i resonanssi jakautuu kahdeksi spektriviivaksi, joista toinen vastaa naapuriytimen j (spin-½-ydin) spin-ylös-tilaa ja toinen spin-alas-tilaa. 30 Toisin kuin dipolikytkentä, spin-spin-kytkentä ei keskiarvoistu nollaksi isotrooppisen pyörimisen seurauksena, vaan kytkentä havaitaan myös nesteissä ja kaasuissa. Spektriviivojen taajuuseroa J kutsutaan spin-spin-kytkentävakioksi. J ilmoitetaan herzeinä (Hz), ja sen arvo on ulkoisen magneettikentän voimakkuudesta riippumaton. Jos ydin X aiheuttaa ytimen A spektriviivan jakautumisen kahtia, niin A aiheuttaa myös ytimen X:n spektriviivan jakautumisen siten, että viivojen taajuusero on molemmissa tapauksissa yhtä suuri. Täten monen ytimen spinsysteemissä samansuuruisista spin-spin-kytkennän arvoista voidaan päätellä, että kyseiset ytimet ovat kytkeytyneitä toisiinsa (ellei J ole sattumalta samansuuruinen) ja että ne ovat suhteellisen lähellä toisiaan. Jos ydin A on kytkeytynyt kahteen magneettisesti ekvivalenttiin ytimeen X (ns. AX2-spinsysteemi), niin A ytimen resonanssi jakautuu kahdeksi spektriviivaksi (dupletiksi, taajuusero J) toisen kytkennän vuoksi ja dupletin kumpikin viiva jakautuu edelleen dupleteiksi (sama taajuusero) toisen kytkennän vuoksi. Jakautumisen tuloksena on siis kolme viivaa (tripletti), joiden intensiteettisuhteet ovat 1:2:1 (koska keskimmäinen viiva koostuu kahden eri dupletin viivoista). Kaksi magneettisesti ekvivalenttia X-ydintä resonoivat puolestaan kuin 31 yksi ydin, tuottaen dupletin (taajuusero J). X-ydinten spektriviivojen yhteen laskettu intensiteetti on kaksinkertainen verrattuna Aytimen viivojen kokonaisintensiteettiin, koska X-ytimiä on kaksinkertainen määrä. AX3-spinsysteemin kolme ekvivalenttia Xydintä jakaa A-ytimen resonanssin neljäksi spektriviivaksi (kvartetti), joiden intensiteettien suhde on 1:3:3:1 ja joiden viivojen välinen taajuusero on J. X-resonanssi on edelleen dupletti (taajuusero J). Yleisesti ottaen n ekvivalenttia spin-½-ydintä jakaa näihin kytkeytyneen spinin tai ekvivalenteista spineistä koostuvan ryhmän resonanssin (n+1):ksi viivaksi, joiden intensiteettisuhteet noudattavat alla olevaa Pascalin kolmiota. Merkintä 1JCH tarkoittaa sellaisen 1Hja 13C-ydinten välistä kytkentää, joiden välissä on yksi sidos. Esimerkiksi 1JCH = 100 – 250 Hz ja 2JCH = 0 – 10 Hz. 32 33 34 Esimerkki 8 Minkälaisen hienorakenteen spin-spin-kytkentä aiheuttaa etanolin protonispektriin? 35 5.4 Kvadrupolivuorovaikutus Jos ytimen spin on suurempi kuin puoli (ts. I 1), sen varausjakauma ei ole pallosymmetrinen, ja sitä kutsutaan kvadrupolariseksi ytimeksi. Magneettikentän lisäksi myös sähkökenttä voi aiheuttaa kvadrupolariseen ytimeen vaikuttavan vääntömomentin, joka pyrkii muuttamaan sen orientaatiota. Kvadrupolivuorovaikutuksessa kvadrupolaariset ytimet vuorovaikuttavat ytimen kohdalla olevan sähkökentän gradientin kanssa. Tämän seurauksena anisotrooppisesta ympäristöstä havaitut resonanssit jakautuvat multipleteiksi. Molekyylien isotrooppisen pyörimisen seurauksena vuorovaikutus kuitenkin keskiarvoistuu nollaksi, eikä resonanssien jakautumista havaita neste- tai kaasunäytteistä. 36 6. Relaksaatio Kuten kappaleessa 4 opimme, NMR-kokeessa termisessä tasapainossa olevaa ydinspinsysteemiä häiritään säteilyttämällä sitä resonanssitaajuisella B1-kentällä. Tämän seurauksena 1. energiatilojen populaatiot muuttuvat ja 2. magnetoituman poikittaiset komponentit Mx ja My saavat nollasta eriävät arvot. Häiriön jälkeen systeemi palaa vähitellen termiseen tasapainotilaan relaksaation vaikutuksesta. Relaksaatio tarkoittaa siis prosesseja, joiden seurauksena termisestä tasapainosta poikkeutettu magnetisaatiovektori palaa tasapainotilaan. Eristettyjen spin-½-ydinten tapauksessa voidaan kuvata kahdella aikavakiolla: relaksaatioprosesseja 1. spin-ympäristö- eli pitkittäistä relaksaatiota ulkoisen magneettikentän suunnassa kuvaa relaksaatioaika T1 ja 2. spin-spineli poikittaista relaksaatiota ulkoista magneettikenttää vastaan kohtisuorassa suunnassa kuvaa relaksaatioaika T2. Relaksaatioaikojen perusteella voidaan saada tärkeää tietoa molekyylien liikkeestä. Lisäksi relaksaatio voi paljastaa ”piilotetut” spinien väliset vuorovaikutukset; Esimerkiksi suora dipolivuorovaikutus ei vaikuta mitenkään isotrooppisista nesteistä havaittuun NMR-spektriin, mutta se muuttaa relaksaatioaikoja, 37 mahdollistaen mm. biomolekyylien määrittämisen ns. NOESY tai ROESY –kokeilla. molekyylirakenteen 6.1 Spin-ympäristörelaksaatio Spin-ympäristörelaksaatioon liittyy aina spinsysteemin energian muutos; Energia, jonka spinsysteemi on absorboinut B1-pulssista, luovutetaan ympäristöön, jonka energia siten kasvaa. Blochin yhtälöiden mukaan tasapainotilastaan poikkeutetun magnetisaation z-komponentin Mz käyttäytymistä häiriön jälkeen kuvaa yhtälö d M z M 0 M M0 . z dt T1 (21) Tässä M0 on magnetoituma tasapainotilanteessa. Protonin spin-ympäristörelaksaatioaika T1 on yleensä sekuntien 13 luokkaa. C:n T1 vaihtelee suurten molekyylien millisekuntisuuruusluokasta pienten molekyylien satojen sekuntien suuruusluokkaan. 6.1.1 T1:n määrittäminen kääntämis-palautumismenetelmällä Jos magnetisaatiovektori käännetään –z-akselin suuntaan 180pulssilla, pulssin jälkeen magnetoituma palaa vähitellen takaisin tasapainotilaa spin-ympäristö-relaksaation vaikutuksesta. Yhtälön (21) perusteella, käyttämällä alkuehtoa Mz(0) = -M0, magnetisaation z-komponentiksi ajan kuluttua pulssin jälkeen saadaan M z M 0 1 2e / T1 . (22) 38 Jos Mz = 0 hetkellä 0, niin T1 0 ln 2 . (23) Kääntämis-palautumiskokeessa (inversion recovery experiment) magnetoitumavektori M0 käännetään ensiksi –z-akselin suuntaan 180-pulssilla, ja sitten magnetoituman annetaan palautua kohti tasapainotilaa hetken aikaa. Ajan kuluttua magnetisaatiovektorin pituus (sen suhteellinen arvo) luetaan 90-pulssilla. Lukemiseen tarvitaan 90pulssia, koska ainoastaan poikittainen magnetisaatio voidaan havaita NMR-kokeessa. Koe toistetaan monella eri viiveellä. Lyhyillä :n arvoilla Mz on negatiivinen juuri ennen 90-pulssia, jolloin havaitaan negatiivinen signaali. Pitkän :n jälkeen Mz on puolestaan positiivinen, jolloin havaitaan positiivinen signaali. Jos = 0, havaitun signaalin amplitudi on nolla. T1 saadaan määritetyksi sovittamalla yhtälö (22) ajan funktiona mitattuihin Mz:n arvoihin. Vaihtoehtoisesti kokeessa voidaan määrittää nolla-amplitudia vastaava arvo 0, ja sen jälkeen T1 voidaan laskea yhtälöllä (23). 39 Esimerkki 9 (a) Johda yhtälö (22). (b) Johda yhtälö (23). (c) Veden protoneille 300 MHz:n kentässä suoritetussa kääntämispalautumiskokeessa signaalin amplitudi oli nolla, kun viive oli 2.11 s. Laske veden protonien T1-relaksaatioaika. 40 6.1.2 Pitkittäisen magnetisaation palautuminen 90-pulssin jälkeen Usein NMR-koe toistetaan monta kertaa, ja peräkkäisten kokeiden signaalit summataan, jotta spektrin signaali-kohina-suhdetta saadaan kasvatettua. Ennen kokeen toistamista Mz:n arvon pitäisi ehtiä palautua riittävän suureksi, jotta seuraavassakin kokeessa havaittaisiin riittävän voimakas signaali. Jos magnetisaatiovektori on kokeen alussa käännetty poikittaiselle tasolle 90-pulssilla, niin yhtälön (21) perusteella, käyttämällä alkuehtoa Mz(0) = 0, magnetisaation z-komponentiksi ajan t kuluttua pulssin jälkeen saadaan M z t M 0 1 e t / T1 . (24) Ajan t = T1 kuluttua Mz:n arvo on noin 63% M0:n arvosta. Yleensä riittävän pitkänä NMR-kokeen toistoaikana pidetään arvoa 3-5T1. 41 Esimerkki 10 (a) Laske Mz:n arvo juuri ennen toisen kokeen 90-asteen pulssia, jos kokeen toistoaika on 3T1. (b) Laske vastaava arvo, jos toistoaika on 5T1. 42 6.2 Spin-spin-relaksaatio Spin-spin-relaksaatioaika T2 kuvaa magnetisaation poikittaisen komponentin pituuden Mxy vaimenemisnopeutta sen tasapainoarvoon nolla. Jos NMR-kokeen alussa M0 kaadetaan poikittaiselle tasolle 90-pulssilla, niin ajan t kuluttua pulssin jälkeen Mxy:n arvo on M xy t M 0et / T2 . (25) Spin-spin-relaksaatio ei muuta spinsysteemin energiaa, koska sen seurauksena energiatasojen miehitykset eivät muutu. 6.2.1 T2-relaksaatioajan määrittäminen Jos ulkoinen magneettikenttä olisi täydellisen homogeeninen koko näytteen alueella, niin FID-signaali vaimenisi pelkästään T2-relaksaation vaikutuksesta, ja T2-relaksaatioaika saataisiin määritettyä sovittamalla yhtälö (25) FID-signaalin verhokäyrään. Magneettikentän epähomogeenisuuden vaikutuksesta näytteen eri osien magnetisaatiovektorit prekessoivat kuitenkin hieman eri taajuudella. Tällöin 90-pulssin jälkeen magnetisaatiovektorit ”viuhkaantuvat”, ja poikittainen magnetoituma häviää nopeammin kuin mitä T2-relaksaatio edellyttää. Signaalin (suunnilleen) eksponentiaalista vaimenemista kuvaa aikavakio T2*, joka sisältää sekä T2-relaksaation että magneettikentän epähomogeenisuuden vaikutuksen. 43 Magneettikentän epähomogeenisuuden vaikutus voidaan eliminoida spin-kaikupulssisarjalla. Kokeen aluksi magnetisaatiovektorit kaadetaan pyörivän koordinaatiston y-akselin suuntaan 90x-pulssilla (merkintä tarkoittaa sitä, että B1-kenttä on pyörivän koordinaatiston x-akselin suuntainen). Pulssin jälkeen keskimääräistä korkeammassa kentässä olevien spinien magnetisaatiovektorit pyörivät kellon suuntaan (jos > 0) xy-tasolla, kun taas keskimääräistä matalammassa kentässä olevien spinien magnetisaatiovektorit pyörivät kellon suunnan vastaisesti. Molemmat vektorit siis loittonevat y-akselista. Viuhkaantumisen seurauksena poikittainen kokonaismagnetoituma Mxy pienenee nopeasti. Ajan kuluttua magnetisaatiovektorit käännetään yakselin ympäri 180y-pulssilla. Korkeammassa kentässä olevien spinien magnetisaatiovektorit jatkavat edelleen pyörimistä kellon 44 suuntaan, mutta koska ne on käännetty y-akselin toiselle puolelle, niin ne nyt lähestyvät y-akselia. Samoin matalassa kentässä olevat spinit lähestyvät y-akselia, ja ajan kuluttua kaikki vektorit ovat jälleen y-akselin suuntaisia. Tämän refokusoinnin seurauksena havaitaan kaiku – magneettikentän epähomogeenisuuden vuoksi ehkä jopa kokonaan kadonnut signaali ilmestyy uudelleen näkyviin. Poikittainen kokonaismagnetoituma kaiun hetkellä on M xy 2 M 0e 2 / T2 , (26) ts., ainoastaan T2-relaksaatio vaimentaa sen suuruutta. T2relaksaatioaika voidaan määrittää mittaamalla kaiun amplitudi useilla eri -viiveillä ja sovittamalla yhtälö (26) mittauspisteisiin. 45 T2-mittaus voidaan tehdä myös nopeammin Carr-Purcell-MeiboomGill-pulssisarjalla (CPMG-pulssisarjalla), jossa yhden kaiun sijaan mitataan suuri määrä kaikuja samassa kokeessa. CPMG-kokeessa 90x-pulssin jälkeen magneettikentän epähomogeenisuudesta aiheutuva viuhkaantuminen refokusoidaan yhä uudelleen 180ypulsseilla. 6.3 Relaksaatiomekanismit Molekyylien lämpöliikkeen vuoksi ytimet kokevat satunnaisesti vaihtelevan (fluktuoivan) magneettikentän, ja samalla tavalla, kuin viritykseen käytettävä resonanssitaajuudella pyörivä B1-kenttä, nämä fluktuoivat kentät voivat aiheuttaa energiatilojen välisiä siirtymiä, jos niiden taajuus on sopiva. Fluktuoivat magneettikentät aiheuttavat spin-½-ydinten relaksaation. Kvadrupolaaristen ydinten (I > ½) tapauksessa myös sähkökentän gradientit vaikuttavat relaksaatioon. Merkittävimmät nesteissä spin-½-ydinten tapauksessa vaikuttavat relaksaatiomekanismit ovat suora dipolivuorovaikutus, kemiallisen siirtymän anisotropia ja spin-rotaatio vuorovaikutus. 46 Suora dipolivuorovaikutus. Magneettisen ytimen j luoman kentän voimakkuus samassa molekyylissä olevan ytimen i kohdalla riippuu molekyylin orientaatiosta, koska spinin suunta ei muutu molekyylin pyörimisliikkeen mukana. Näin ydin i kokee ytimen j vaikutuksesta fluktuoivan magneettikentän, jonka fluktuointitaajuus on verrannollinen molekyylin rotaatioliikeen taajuuteen. Kemiallisen siirtymän anisotropia. Kuten kappaleessa 5.1 opimme, ulkoinen magneettikenttä B0 pakottaa molekyylin elektronit kiertoliikkeeseen B0:n suunnan ympäri, ja tästä johtuva virta aiheuttaa oman magneettikenttänsä, joka pienentää (varjostaa) ulkoista kenttää. Kentän suuruus ja suunta riippuu molekyylin orientaatiosta suhteessa B0:aan, ja tämän vuoksi molekyylien pyöriessä nesteessä tai kaasussa spinit kokevat fluktuoivan kentän. Spin-rotaatiovuorovaikutus. Molekyylit koostuvat positiivisista (ytimet) ja negatiivisista (elektronit) sähkövarauksista. Kun molekyylit pyörivät, varausten pyörimisliike vastaa sähkövirtaa. Siten molekyylien rotaatio aiheuttaa paikallisia magneettikenttiä, jotka vuorovaikuttavat ydinten magneettisten momenttien kanssa. 47 Tätä kutsutaan spin-rotaatiovuorovaikutukseksi. Pyörimistaajuuden muuttuessa esim. molekyylien törmäysten vuoksi ydinten spinrotaatiovuorovaikutuksen vuoksi kokema kenttä muuttuu, ja tällä tavalla fluktuoiva magneettikenttä aiheuttaa relaksaation. 48 7. Fourier-muunnos 7.1 Rf-pulssin taajuusvaste Kuten kappaleessa 4 opimme, NMR-kokeessa magnetisaatio poikkeutetaan tasapainotilastaan resonanssitaajuisella rf-pulssilla, jotta NMR-signaali voitaisiin havaita. Koska pulssi on lyhyt (yleensä mikrosekuntien luokkaa), Fourier-sarja-analyysin perusteella se sisältää suuren jakauman erilaisia taajuuksia. Taajuuksien jakauma eli pulssin taajuusvaste F() on pulssin P(t) Fourier-muunnos: F F B1 t Pt e i 2 t dt . (27) Taajuusvaste on kahden sinc-funktion summa, joista toinen vastaa positiivisia ja toinen negatiivisia taajuuksia. Sincfunktion ensimmäisten nollakohtien välimatka on 2 , tp (28) missä tp on pulssin pituus. Jos tp on 10 s, niin = 200 kHz (330 ppm protoneille 600 MHz:n kentässä). Lyhyt pulssi siis ei ainoastaan viritä juuri pulssin kantotaajuudella 0 resonoivia ytimiä, vaan se 49 virittää samalla kertaa kaikki ytimet, joiden resonanssitaajuus on välillä 0 /2. Tämän vuoksi pulssiherätteinen menetelmä on paljon nopeampi kuin aikaisemmin käytössä ollut jatkuvaherätteinen menetelmä, jossa resonanssit viritettiin yksitellen joko muuttamalla hitaasti jatkuvasti päällä olevan heikon rf-kentän taajuutta tai ulkoisen magneettikentän vuon tiheyttä. 50 Esimerkki 11 Laske rf-pulssin Fourier-muunnos, yhtälö (27), ja osoita, että yhtälö (28) on tosi. Laskujen helpottamiseksi oleta, että pulssin kantotaajuus on nolla, jolloin pulssista tulee laatikkofunktio: B , kun t p 2 t t p 2 Pt 1 0 muulloin 51 7.2 Spektri Jos spinien i magnetisaatiovektori kaadetaan kokeen alussa 90pulssilla y-akselin suuntaiseksi, havaitun rf-signaalin x- ja ykomponentit ovat sxi Ae t / T2 cos2 i t , (29) s iy Ae t / T2 sin2 i t , (30) ja missä A = 2fMi00 (ks. Esim. 6). Eksponenttitermi ottaa huomioon T2-relaksaation aiheuttaman poikittaisen magnetoituman vaimenemisen. Signaali voidaan esittää kompleksimuodossa: si s xi is iy Ae t / T2 cos2 i t i sin 2 i t Ae t / T2 ei 2 it (31) 52 Signaalin si taajuusjakauma (NMR-spektri) saadaan ratkaistua laskemalla si:n Fourier-muunnos: F si si e i 2 t dt A 0 1 T2 i 2 i 1 T2 2 4 2 i 2 (32) NMR-spektrinä esitetään Fsi:n reaaliosa, S(): S ReF si AT2 2 2 1 4 T2 i 2 (33) Funktio (33) on Lorentzin viivanmuotofunktio, jonka maksimikorkeus on AT2 (kun = i) ja leveys puolikorkeudelta 1/T2. 53 Yleensä näyte koostuu useista eri taajuuksilla resonoivien spinien joukoista. Tällöin jokaisen joukon i signaalin käyttäytymistä 90pulssin jälkeen kuvaa yhtälöt (29) ja (30), ja havaittava FID-signaali on kaikkien näiden signaalien summa. FID-signaali voi näyttää hyvin monimutkaiselta, ja, toisin kuin yhden ainoan resonanssitaajuuden tapauksessa, FID-signaalin muodosta on hyvin vaikea päätellä, millaisia taajuuksia se sisältää. Taajuusjakauma saadaan kuitenkin ratkaistua Fourier-muuntamalla FID-signaali, ja tuloksena saatava spektri sisältää jokaista joukkoa i vastaavan Lorentz-viivan (33). Alla oleva proteiinin signaaleita. 1 H-NMR-spektri sisältää valtavan määrän 54 Esimerkki 12 (a) Osoita, että signaalin (31) Fourier-muunnos on funktio (32) (b) Osoita, että Lorentz-viivan (33) leveys puolikorkeudelta on 1/T2. 55 8. Diffuusio Diffuusio on molekyylien satunnaisliikkeestä johtuvaa aineen siirtymistä suuremmasta konsentraatiosta pienempään. Diffuusioyhtälö (Fickin toinen diffuusiolaki) c 2c D 2 t z (34) kuvaa konsentraation muuttumista ajan funktiona diffuusion vaikutuksesta. Yhtälö (34) esittää yksiulotteista, z-akselin suuntaista diffuusiota, c on konsentraatio ja D on diffuusiokerroin. 56 Propagaattori P(z0z,t) on ehdollinen todennäköisyys sille, että aluksi kohdassa z0 ollut molekyyli löydetään kohdasta z ajan t kuluttua. Molekyylien diffuusiota voidaan kuvata propagaattorin avulla. Propagaattorin avulla lausuttuna diffuusioyhtälö saa muodon P 2P D 2 t z (35) Vapaan diffuusion tapauksessa yhtälön (35) ratkaisu on P( z0 z , t ) 2 1 e ( z z0 ) / 4 Dt . 4Dt (36) 57 Diffuusiokokeissa hyödynnetään ns. gradienttipulsseja, joiden vaikutuksesta ulkoisen magneettikentän voimakkuus näytteen alueella ei olekaan enää vakio, vaan se muuttuu lineaarisesti paikan funktiona: B B0 gz . (37) Tässä g = B/z on magneettikentän gradientti ja Bg(z) = gz on gradienttipulssin aiheuttama ylimääräinen, paikasta riippuva magneettikenttä. Magneettikentän gradientin vuoksi spinien prekessiotaajuus tulee paikasta riippuvaiseksi, = (z). Jos gradienttipulssin kesto on , niin sen aiheuttama magnetisaatiovektorin vaihe on z 2 g z 2 Bg z gz . (38) 2 Magnetisaatiovektoreiden invertoitua y-pulssilla, vaiheet joka saadaan kiertää 58 magnetisaatiovektoreita 180 y-akselin ympäri. Tällöin (z) -> - (z). Diffuusiota voidaan tutkia NMR-spektroskopialla ns. PGSEpulssisarjalla (PGSE: Pulsed-field-Gradient Spin-Echo). Pulssisarjan aluksi magnetisaatiovektorit kaadetaan y-akselin suuntaan 90xpulssilla. Ensimmäisen gradienttipulssin vaikutuksesta magnetisaatiovektoreiden vaihe tulee paikasta riippuvaiseksi, se 59 on suurin näytteen yläosassa (suurin z:n arvo) ja pienin (suurin negatiivinen arvo) näytteen alaosassa. Syntyy yllä olevan kuvan mukainen magnetisaatiovektoriheliks. Ensimmäisen gradienttipulssin aiheuttama vaihe kohdassa z0 on z0 gz0 . (39) 180y-pulssi invertoi vaiheen: (z0) -> - (z0). Viiveen aikana molekyylit liikkuvat paikasta z0 paikkaan z diffuusion vaikutuksesta. Toisen gradienttipulssin aiheuttama vaihe kohdassa z on z gz . (40) Gradienttipulssien aiheuttamien vaiheiden summa on tot g z z0 . (41) Havaitun kaiun amplitudi PGSE-kokeessa saadaan laskemalla yhteen magnetisaatiovektorit, ottaen huomioon kaikki mahdolliset molekyylien alkupisteet z0 sekä siirtymät pisteestä z0 pisteeseen z. Kun vaihevektori esitetään kompleksilukuna exp[i2q(z - z0)], missä q = g/2, niin kaiun amplitudi on integraali E ( z0 ) P( z0 z, ) exp i 2q( z z0 )dzdz0 . (42) Tässä (z0) on spintiheys. PGSE-kokeessa havaitaan siis maksimaalinen kaiku, jos molekyylit eivät liiku ollenkaan. Kaiku on 60 sitä pienempi, mitä pidemmän matkan molekyylit liikkuvat diffuusion vaikutuksesta viiveen aikana. Vapaan diffuusion tapauksessa kaiun sijoittamalla yhtälö (36) yhtälöön (42) E exp(4 2 q 2 D) . amplitudiksi saadaan (43) Nesteen tai kaasun diffuusiokerroin saadaan määritettyä mittaamalla kaiun amplitudi q:n funktiona ja sovittamalla yhtälö (43) mittauspisteisiin. Rajoitettu diffuusio: Jos neste tai kaasu on tilassa, jonka seinämät rajoittavat molekyylien vapaata diffuusiota, PGSE-kokeen kaiun amplitudi poikkeaa yhtälön (43) käyttäytymisestä. Jos tilan geometria tunnetaan, niin kaiun amplitudin lauseke voidaan johtaa yhtälön (42) avulla. Tällöin sovittamalla teoreettinen kaiun amplitudin lauseke mittauspisteisiin tilan koko saadaan määritettyä. Menetelmä soveltuu esimerkiksi kasvien solukokojen jakauman määrittämiseen. 61 9. 2D NMR Joskus, erityisesti suuria proteiinimolekyylejä tutkittaessa, tavanomainen yksiulotteinen (1D) spektri voi olla niin täynnä signaaleita, ettei kaikkia signaaleita voi erotta toisistaan, ja spektrin tulkinta käy mahdottomaksi. Spektrin resoluutiota voidaan parantaa käyttämällä useampidimensionaalisia NMRmenetelmiä. Menetelmät tarjoavat myös monipuolista uutta tietoa näytteestä. 2D-NMR-kokeen periaate voidaan kuvata seuraavalla kaaviolla: Yksinkertaistettu kuvaus jaksoista: Valmistelujakso (preparation): Spinejä manipuloidaan. Yksinkertaisimmillaan koostuu relaksaatioviiveestä ja 90pulssista. 62 Evoluutiojakso (evolution): Annetaan spinien prekessoida vapaasti ajan t1. Jakson t1 pituutta kasvatetaan vähitellen kokeesta toiseen. Sekoitusjakso (mixing time): Spinejä manipuloidaan uudelleen. Havaitseminen (detection): Havaitaan FID-signaali ajan t2funtiona. Evoluutiojakson aikana magnetisaatioon on koodattu ensimmäisen ytimen resonanssitaajuus. Sekoitusjakson aikana magnetisaatio siirretään toiselle ytimelle joko spin-spin-kytkennän tai dipolikytkennän (ns. NOE-ilmiö) avulla. Havaitsemisjakson aikana magnetisaatio prekessoi toisen ytimen taajuudella. 2D-NMR-kokeessa mitataan siis joukko eri t1-viiveitä vastaavia FIDsignaaleja. FID-signaalien Fourier-muunnoksen (t2:n suunnassa) tuloksella on signaali ensimmäisen ytimen taajuudella. Signaalin amplitudi muuttuu t1:n funktiona. Toisen, t1-suuntaisen Fouriermuunnoksen tuloksena saadaan kaksiulotteinen spektri, jossa spektripiikin taajuus F1-akselin suhteen kertoo ensimmäisen ytimen resonanssitaajuuden ja taajuus F2-akselin suhteen antaa toisen ytimen resonanssitaajuuden. 63 Koko 2D-spektri koostuu homonukleaarisessa tapauksessa (samaa isotooppia tarkasteltu sekä evoluutio että havaitsemisjaksolla) diagonaalipiikeistä (A ja B), joiden taajuus on sama molemmissa dimensioissa, sekä ristipiikeistä (X). Magnetisaatio, joka ei ole siirtynyt sekoitusjakson aikana, tuottaa diagonaalipiikit, kun taas siirtynyt magnetisaatio tuottaa ristipiikit. Ristipiikit ovat siis merkki ko. ydinten vuorovaikutuksesta, ja sen vuoksi ne tarjoavat erittäin tärkeää informaatiota. Homonukleaarisessa 2D COSY –kokeessa (COSY: COrrelated SpectroscopY) magnetisaatio siirtyy spin-spin-kytkennän vaikutuksesta. Protonit, joiden välillä on yli kolme sidosta, eivät tuota ristipiikkiä spektriin, koska niiden välinen J-kytkentä on lähes nolla. Tämän vuoksi 2D COSY –spektrin ristipiikit paljastavat, mitkä protonit ovat kahden tai kolmen sidoksen päässä toisistaan, ja tätä tietoa voidaan hyödyntää molekyylin rakenteen määrittämisessä. 64 10. Magneettikuvaus Ihminen koostuu noin 70-prosenttisesti vedestä, ja jokaisessa vesimolekyylissä on kaksi vetyatomia. Tämän vuoksi ihmisestä voidaan havaita voimakas 1HNMR-signaali. Jos ihminen laitetaan homogeeniseen magneettikenttään, niin kaikki veden protonit resonoivat suunnilleen samalla taajuudella, ja NMR-spektri sisältää yhden kapeahkon signaalin (tarkalleen ottaen spektrissä on kyllä erilliset signaalit esim. vedestä ja rasvasta, mutta tässä yhteydessä sillä ei ole merkitystä). Jos gradienttipulssin avulla magneettikenttä tehdäänkin lineaarisesti paikasta riippuvaksi kuvan mukaisesti, potilaan pää on matalammassa magneettikentässä kuin jalat. Tällöin yhtälön (11) perusteella päässä olevat protonit resonoivat matalammalla taajuudella kuin jalkojen protonit. Signaalin voimakkuus on suoraan verrannollinen protonien määrään kussakin kohdassa. Täten havaittu spektri on ihmisen spintiheyden yksiulotteinen projektio, ts. yksiulotteinen magneettikuva. Taajuusakselin voi muuttaa zakseliksi, kun magneettikentän voimakkuus paikan funktiona tunnetaan. Magneettikuvaus perustuu siis siihen, että eri kohdissa olevat ytimet laitetaan resonoimaan eri taajuuksilla käyttäen tarkasti kontrolloituja lineaarisia kenttägradientteja. 65 Kaksiulotteisen magneettikuvauksen periaate on hiukan monimutkaisempi kuin yksiulotteisen, koska resonanssitaajuuden täytyy olla paikasta riippuvainen kahdessa eri suunnassa. 2D-magneettikuvaus muistuttaa hyvin paljon 2D NMRspektroskopiaa: Evoluutiojakson aikana tehdään resonanssitaajuudet gradienttien avulla paikasta riippuvaksi yhdessä suunnassa (esim. x-suunnassa) ja havaitsemisjakson aikana toisessa suunnassa (esim. z-suunnassa). Fourier-muunnosten tuloksena saadaan kaksiulotteinen spintiheyskartta, jonka taajuusakselit voidaan muuttaa paikka-akseleiksi samalla tavalla kuin 1D-kokeessa. Viipaleen valinta on myös oleellinen osa 2D magneettikuvausta: Virityspulssin profiili ja pituus voidaan valita siten, että pulssi sisältää vain rajoitetun määrän taajuuksia välillä [0 - /2, 0 + /2]. Kun pulssin aikana magneettikentän voimakkuus tehdään lineaarisesti paikasta riippuvaksi viipaleenvalintagradientin avulla, niin pulssi virittää vain kapealla alueella [z0 - z/2, z0 - z/2] olevat spinit, joiden resonanssitaajuus sattuu virityspulssin taajuusalueelle. Kokeessa tuloksena on siis 2D viipalekuva kohdasta z0 ja viipaleen 66 paksuus on z. Tällä tavalla esim. potilaan päästä voidaan mitata mistä kohdasta tahansa halutun paksuinen viipalekuva. Erilaisilla magneettikuvauskokeilla voidaan saada hyvin erilaista, monipuolista tietoa potilaasta tai näytteestä. Virtauspainotteinen magneettikuvaus korostaa virtauksen mukana liikkuvien ydinten signaalia. Kuvissa voi näkyä kirkkaana esimerkiksi verisuonissa virtaava veri. Diffuusiopainotteisessa magneettikuvauksessa voidaan havaita mm. alueet, joissa diffuusio on anistrooppista. Hermosolujen (neuronien) putkimaisen viejähaarakkeen (aksonin) sisällä nesteen diffuusio on anisotrooppista – diffuusio on nopeampaa putken akselin suunnassa kuin kohtisuorassa suunnassa seinämän asettaman rajoitteen vuoksi. Jos aivoissa tapahtuvaa nesteiden diffuusiota mitattaessa havaitaan, että jossakin kohtaa kuvaa diffuusio on anisotrooppista, niin voidaan päätellä, että siinä kohtaan on neuronien aksoneita. Diffuusiotensorikuvista voidaan mm. päätellä, mitkä osat aivoista on kytkeytyneet toisiinsa. 67 Funktionaalisessa magneettikuvauksessa (fMRI) nähdään, mitkä osat aivoista aktivoituu jonkun toiminnon tai ajattelutyön seurauksena. Menetelmä perustuu siihen, että veren happipitoisuus muuttuu aktivoinnin seurauksena, jolloin T2* relaksaatioaika muuttuu. fMRI-kokeessa mitataan T2*painotteinen sekä aktivaation tapahtuessa että ilman aktivaatiota, ja näiden kuvien erotus osoittaa paikat, joissa aktivaatio on tapahtunut. Jyväskyläläisten tutkijoiden video siitä, miten musiikki aktivoi aivojen eri osia: http://www.youtube.com/watch?v=D9EcsYTEcg8 BBC:n uutisjuttu siitä, miten tutkijat kommunikoivat vegetatiivisessa tilassa olevan potilaan kanssa: http://www.bbc.co.uk/news/health-20268044 YLEn juttu aiheesta: http://yle.fi/uutiset/tutkijat_kommunikoivat_vegetatiivisess a_tilassa_olevan_kanssa/6374200 68 11. NMR-spektrometri Nykyaikaisten spektrometrien korkea magneettikenttä tuotetaan suprajohdemagneeteilla. Magneetissa oleva kela on upotettuna nesteheliumiin, jonka lämpötila on 4.2 K, jotta kela olisi suprajohtavassa tilassa. Kelaan on aluksi ladattu suuri virta, eikä virrassa tapahdu häviöitä niin pitkään, kun kela pysyy nesteheliumin lämpötilassa. Virran indusoima magneettivuon tiheys on moderneissa spektrometreissä 6 – 23,5 T. Nesteheliumin ympärillä on nestetyppeä (77,4 K), jotta kalliin heliumin kiehumista saadaan vähennettyä. Kiehumista pyritään vähentämään myös termospullorakenteella (tyhjiö ja säteilysuoja). Kelan luoma magneettikenttä ei ole riittävän homogeeninen NMRkokeisiin. Magneetin sisällä on myös shimmikelat, joilla parannetaan magnettikentän homogeenisuutta. Lisäksi magneettiin laitetaan probe, joka sisältää signaalin virittämiseen ja havaitsemiseen käytettävän kelan. Spektrometrin konsoli sisältää virityspulssin ja gradienttien tuottamiseen sekä signaalin havaitsemiseen tarvittavaa elektroniikkaa. Spektrometria ohjataan tietokoneella. 69 12. Lisätietoa NMR-spektroskopiasta ja magneettikuvauksesta Nettikirja ”The basics of NMR” (kirjoittaja J. Hornak): http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/ Nettikirja ”The basics of MRI” (kirjoittaja J. Hornak): http://www.cis.rit.edu/htbooks/mri/ Professori Paul Callaghanin videoita NMR:n ja magneettikuvauksen perusteista: http://www.magritek.com/support-videos 70
© Copyright 2024