Spontane og kunstige koagler fra serøse pleuravæsker
SPONTANE OG KUNSTIGE KOAGLER FRA SERØSE PLEURAVÆSKER - EN KVANTITATIV UNDERSØGELSE AF DEN DIAGNOSTISKE BETYDNING AF SPONTANE OG KUNSTIGE KOAGLER FRA SERØSE PLEURAVÆSKER I FORHOLD TIL DEN CANCERDIAGNOSTISKE UDREDNING AF CANCER I PLEURA ● Kristoffer Søndergaard Vinter (175804) ● Lektor Turi Neubauer Modul 14 – Bachelorprojekt Cand.scient. Ph.D. VIA University College VIA University College, Campus Aarhus N Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus 67.643 tegn ● Bioanalytikerunderviser Birthe Søltoft Lundsgaard 27. maj 2015 Patologisk Institut, Regionshospitalet Viborg Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Forord Dette bachelorprojekt er udarbejdet af Kristoffer Søndergaard Vinter i forbindelse med afslutningen af bioanalytikeruddannelsen på VIA University College. Den praktiske del af projektet foregik på Patologisk Institut ved Regionshospitalet Viborg sammen med bioanalytikerstuderende Anne Plejdrup, Charlotte Månsson Eriksen og Maria Bætz. Der skal lyde et tak til dem, der har hjulpet med tilblivelsen af dette bachelorprojekt. Tak til Patologisk Institut ved Regionshospitalet Viborg for at vi måtte udføre vores forsøg på deres afdeling, og tak for at de ville stille faciliteter og ressourcer til rådighed for os. Jeg vil især gerne takke afdelingsbioanalytiker Lis Petersen, fordi hun satte tid af til at hjælpe os med vores projekt ved at vurdere nogle af vores prøver. Jeg vil også gerne takke mine vejledere Turi Neubauer og Birthe Søltoft Lundsgaard for den vejledning, de har givet min projektgruppe og mig i løbet af projektforløbet. Til sidst vil jeg gerne takke min projektgruppe: Anne, Charlotte og Maria for det gode samarbejde. __26/5 2015__ Dato Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Resumé Baggrund: Projektet omhandler spontane koagler, der kan opstå i pleuravæsker. På Patologisk Institut anvendes pleuravæske til diagnosticering af cancer i pleura. Hvis pleuravæsken indeholder et spontant koagel, anvendes disse ofte, ellers fremstilles et kunstigt koagel. Formålet med dette projekt var at undersøge forskellen i celleindholdet af disse spontane og kunstige koagler i forhold til deres anvendelse til diagnostisk udredning. Metode: Dette blev undersøgt ved at fremstille kunstige koagler efter plasma-thrombin metoden på 25 serøse pleuravæsker, der indeholdte et spontant koagel. Celleindholdet i koaglerne blev vurderet i forhold til celleindholdet i cytologiske udstrygninger vha. vurderingsskemaer. Overensstemmelse mellem vurderingerne af de to koagler blev beregnet vha. vægtet Cohens kappa-koefficient og Wilcoxons rangsumstest. Resultat: Der blev foretaget 37 % (28/75) ønskede vurderinger af de spontane koagler i forhold til kun 17 % (13/75) på de kunstige koagler. Overensstemmelsen mellem vurderingerne af de to typer af koagler blev beregnet til 0,285 ved en vægtet Cohens Kappa-koefficient. Der blev dog ikke fundet signifikant forskel ved en Wilcoxons rangsumstest (p = 0,2263). Konklusion: Projektet fandt at celleindholdet af de spontane koagler vil være mere fordelagtige ved diagnosticering af cancer i pleura, men forskellen på de to koagler var dog svag. Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Indholdsfortegnelse 1. Introduktion ................................................................................................................... 1 1.1. Baggrund ................................................................................................................ 1 1.2. Bioanalytisk relevans ............................................................................................. 2 1.3. Erfaringsmæssig og forskningsbaseret forforståelse .............................................. 2 1.4. Formål .................................................................................................................... 3 1.5. Problemformulering ............................................................................................... 4 1.6. Målformulering ...................................................................................................... 4 2. Teori .............................................................................................................................. 5 2.1. Pleuraeffusion ........................................................................................................ 5 2.1.1. Pleura og pleuravæske..................................................................................... 5 2.1.2. Den eksudative pleuravæskes cytologi ........................................................... 6 2.1.3. Cellernes udseende .......................................................................................... 6 2.2. Plasma-thrombin celleblok..................................................................................... 7 2.3. Rutine farvemetoder af pleuravæsker .................................................................... 8 2.3.1. Hematoxylin-Eosin ......................................................................................... 8 2.3.2. Period-Acid-Schiff og Alcian Blue ................................................................. 8 2.3.3. May-Grünwald-Giemsa................................................................................... 9 2.3.4. Papanicolaous ................................................................................................ 10 3. Materialer og metode .................................................................................................. 11 3.1. Metode ................................................................................................................. 11 3.1.1. Design ........................................................................................................... 11 3.1.2. Prøveindsamling og -behandling .................................................................. 11 3.1.3. Dataindsamling ............................................................................................. 12 3.1.4. Databehandling ............................................................................................. 14 3.2. Etiske og juridiske overvejelser ........................................................................... 14 3.3. Litteratursøgning .................................................................................................. 15 4. Resultater..................................................................................................................... 16 4.1. Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. søjlediagrammer ........................... 16 4.2. Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. medianen og 95 %-percentiler...... 19 4.3. Overensstemmelse mellem vurderingerne af de spontane og de kunstige koagler ......................................................................................................................... 20 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 4.4. Overensstemmelse mellem vurderinger foretaget af den rutinerede cytobioanalytiker og projektgruppen .......................................................................... 21 5. Diskussion ................................................................................................................... 22 5.1. Diskussion af design ............................................................................................ 22 5.2. Diskussion af prøveindsamling og –behandling .................................................. 23 5.3. Diskussion af dataindsamling .............................................................................. 25 5.3.1. Diskussion af dataindsamlingsmetoden ........................................................ 25 5.3.2. Diskussion af vurderingsskemaerne .............................................................. 26 5.3.3. Diskussion af de praktiske omstændigheder ................................................. 26 5.3.4. Flertydige prøver ........................................................................................... 27 5.4. Diskussion af ”Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. søjlediagrammer” . 27 5.5. Diskussion af ”Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. medianen og 95 %percentiler” .................................................................................................................. 29 5.5.1. Median .......................................................................................................... 29 5.5.2. 95 %-percentil ............................................................................................... 30 5.5.3. Beregning ...................................................................................................... 31 5.6. Diskussion af ”Overensstemmelse mellem vurderingerne af de spontane og de kunstige koagler” ........................................................................................................ 31 5.6.1. Beregning ...................................................................................................... 32 5.7. Diskussion af ”Overensstemmelse mellem vurderinger foretaget af den rutinerede cytobioanalytiker og projektgruppen”......................................................................... 32 6. Konklusion .................................................................................................................. 33 7. Perspektivering............................................................................................................ 34 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 1. Introduktion Sundhedsstyrelsen har opstillet en liste over 8 folkesygdomme, som er de sygdomme, der forekommer hyppigst i den danske befolkning (1). Cancer er en af disse og diagnosticeres bl.a. på Patologiske Institutter. Der findes forskellige typer af cancer, og derfor modtager de Patologiske Institutter forskellige vævsprøver til diagnosticering (2). En af disse er pleuravæske, der er udtaget fra en pleuraeffusion via pleurapunktur (3). 1.1. Baggrund Patologisk Institut på Regionshospitalet Viborg modtager og undersøger serøse væsker i form af pleuravæsker, der er udtaget fra patienter med pleuraeffusion. Formålet med undersøgelsen er at diagnosticere og identificere eventuelle cancerceller i pleuravæsken. Undersøgelsen er en essentiel del af tumordiagnostikken, da malignt mesotheliom og metastaser kan findes i disse prøver (4). På afdelingen foretages der rutinemæssigt cytologiske undersøgelser af pleuravæsker ved at fremstille 2 cytologiske udstrygninger og 1 celleblok. Prøvematerialet fra pleuravæsken kan indeholde et spontant koagel. Hvis prøven indeholder et sådan, bliver det udtaget til fremstillingen af den cytologiske celleblok. Hvis prøven ikke indeholder et spontant koagel, fremstilles et kunstigt koagel ved brug af plasma-thrombin metoden. (5). Hermed anvendes der enten et spontant eller kunstigt koagel fra pleuravæsken til diagnosticering. Anvendelsen af de 2 forskellige koagler til diagnosticeringer har fået personalet på Patologisk Institut i Viborg til at overveje, hvilken effekt de forskellige præparationsmetoder kan have for celleblokkens indhold af celler. Det vides ikke om kvaliteten af cellerepræsentationen fra pleuravæsken er forskellig alt efter om det spontane eller kunstige koagel anvendes, således prøvens celler repræsenteres bedre i det ene koagel frem for det andet. Dette undersøges derfor i dette projekt, da det er væsentligt at undersøge, hvilken type koagel der medfører den bedste kvalitet af de endelige diagnosticeringer. På nuværende tidspunkt findes ingen viden om, hvilken betydning anvendelsen af kunstige koagler fra pleuravæsker indeholdende spontane koagler vil have på fremtidige patienters diagnose. Side 1 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Det er fundamentalt med en god repræsentation af celler fra pleuravæsken, for at en diagnose kan stilles korrekt. Jo mere cellemateriale der er repræsenteret, desto flere celler er der at vurdere. Således er der en mindre risiko for at celler overses i vurderingen, og patologen kan dermed også være mere sikker i sin svarafgivelse. Det vil dermed være ideelt at anvende det koagel, som indeholder flest repræsentative celler fra pleuravæsken til diagnosticering. Viser det sig, at det kunstige koagel er bedre end det spontane koagel, bør bioanalytikerne eventuelt lave kunstige koagler på alle prøver, selvom de indeholder et spontant koagel. Ses det derimod, at det spontane koagel repræsenterer flere celler fra pleuravæsken, er der muligvis ingen grund til at fremstille det kunstige koagel, da dette er en unødig økonomisk udgift. 1.2. Bioanalytisk relevans En af bioanalytikernes kerneværdier er ansvarlighed. Dette betyder, at det er vigtigt for bioanalytikere, at deres arbejde udføres ansvarligt og med patientbevidsthed. (6, s. 16). Dette omhandler også at optimere de analyser, der udføres, så patienten får den hurtigste og bedste udredning. Det er derfor nødvendigt for det bioanalytiske arbejde at undersøge, hvilken procedure i forhold til pleuravæsker indeholdende et spontant koagel der giver den bedste kvalitet af cancer udredningen. 1.3. Erfaringsmæssig og forskningsbaseret forforståelse Erfaring fra personalet på Patologisk Institut ved Regionshospitalet Viborg tyder på, at der forekommer flere usædvanlige og specielle cellefund i de kunstige koagler end i de spontane. Ud fra dette kan det forventes, at dette projekt vil finde celleindholdet i de kunstige koagler bedre end i de spontane. I 3 forskningsbaserede projekter (7–9) blev det undersøgt, hvorvidt celleblokke kunne anvendes til at forbedre diagnosticeringen af bl.a. cancer i pleura. Köksal et al. har undersøgt 40 eksudative pleuravæsker i forbindelse med udredning af lungecancer. Af disse 40 prøver blev 20 diagnosticeret maligne på traditionelle cytologiske udstrygninger og 24 på celleblokke (7). Kulkarni et al. har undersøgt brugen af celleblokke ved finnålsaspirater og serøse effusioner sammenlignet med cytologiske udstrygninger. De producerede celleblokke på 38 serøse effusioner, hvoraf 20 var fra Side 2 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt pleura. Af de 38 effusioner blev 20 diagnosticeret maligne, og 2 blev diagnosticeret atypiske på cytologiske udstrygninger. Ved diagnosticering på celleblokkene blev 23 diagnosticeret maligne. (8). Bhanvadia et al. har også lavet en undersøgelse, hvor de har undersøgt den diagnostiske værdi af celleblokke under diagnosticering af effusioner. De undersøgte 150 effusioner, hvoraf 79 var fra pleura. Af de 150 effusioner blev 16 diagnosticeret suspekte for malignitet, og 18 blev diagnosticeret maligne på cytologiske udstrygninger. Ved diagnosticering på celleblokke blev 1 prøve diagnosticeret suspekt for malignitet, og 33 blev diagnosticeret maligne. (9). Disse artikler bidrager til en forståelse af, at der bliver diagnosticeret flere maligne prøver ved at anvende celleblokke sammen med de cytologiske udstrygninger. Resultaterne af disse 3 undersøgelser viste dermed, at det er en fordel at anvende celleblokke til diagnosticering af cancer i pleura, men da der ikke findes viden om, hvilken type koagel der er bedst ift. diagnosticering med celleblok, er dette relevant at undersøge. Jalal et al. har undersøgt den diagnostiske værdi af spontane koagler i serøse effusionsvæsker fra pleura, perikardiet og peritoneum i forhold til cancer diagnostik. De undersøgte disse koagler og sammenlignede resultaterne med cytologiske udstrygninger og kunstige koagler. Jalal et al. fandt, at der blev diagnosticeret 85 tilfælde af prøver indeholdende atypiske eller maligne celler ved at anvende spontane koagler til diagnosticering frem for kun 42 tilfælde, der blev opdaget ved brug af cytologisk udstrygninger og kunstigt koagel alene. Dette var en fordobling af antallet af atypiske eller maligne diagnoser. (10). Ud fra denne undersøgelse må man vurdere, at der er forskel på celleindholdet af spontane og kunstige koagler, og at de spontane koagler er bedst at avende til cancer diagnostik. Dette resultat står dog i modsætning til den erfaring personalet på Patologisk Institut havde, hvilket tyder på, at der er en uoverensstemmelse mellem den erfaringsmæssige og forskningsbaseret viden om emnet, og der dermed er brug for yderligere forskning på området for at forklare denne uoverensstemmelse. 1.4. Formål Heraf udledes det, at det er nødvendigt at undersøge forskellen på de spontane og kunstige koagler, da der mangler viden herom. Denne forskel kan have betydning for den endelige Side 3 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt diagnose, der stilles på pleuravæsken, hvilket har betydning for patienten. Da det er et mål, at give patienten det bedste udredningsforløb, sikres projektets relevans heraf (11). Formålet med dette projekt er at sammenligne kvaliteten af præparationsmetoderne tilhørende spontane og kunstige koagler fra pleuravæsker indeholdende et spontant koagel på Regionshospitalet Viborg. Dette gøres med henblik på at bidrage med viden, der kan anvendes til at vurdere, om en ændret præparationsmetode kan implementeres for at øge kvaliteten af pleuravæskeundersøgelser på Patologisk Institut. Projektet udføres ved at undersøge og vurdere, om der er forskel på repræsentationen af celler i spontane og kunstige koagler ved vurdering ud fra celleindholdet i de tilhørende cytologiske udstrygninger. 1.5. Problemformulering Hvilken påvirkning har præparationsmetoderne af spontane og kunstige koagler på celleindholdet i celleblokke fremstillet af pleuravæsker indeholdende et spontant koagel, og hvilken betydning har dette for patienten? Med en celleblok menes et cytologisk prøvemateriale, der er blevet præparater på en sådan måde, at det kan anvendes som histologisk prøvemateriale. Der findes forskellige celleblokke med forskellige præparationsmetoder f.eks. skelnes der mellem præparationsmetoderne af spontane og kunstige koagler. (12). Udover dette defineres spontane koagler som de koagler, der forekommer naturligt i nogle serøse pleuravæsker (13, s. 139), og med kunstige koagler menes der plasma-thrombin celleblokke produceret i laboratoriet. De serøse pleuravæsker stammer fra ophobet væske i pleurahulen under en pleuraeffusionen (14) og har et celleindhold bestående af en række af forskellige celler (13, s. 116). 1.6. Målformulering Problemformuleringen vil belyses ved at: Indsamle 25 pleuravæsker indeholdende et spontant koagel. Undersøge og vurdere cellefundet i de cytologiske udstrygninger og anvende disse som en gylden standard. Side 4 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Undersøge og vurdere cellefundet i de spontane og kunstige koagler ved at sammenligne dem med den gyldne standard. Sammenholde resultaterne med en cytobioanalytikers vurdering af et udvalg af prøverne. 2. Teori I det følgende afsnit præsenteres den teoretiske baggrundsviden, der ligger til grund for projektet. 2.1. Pleuraeffusion 2.1.1. Pleura og pleuravæske Pleuravæske er den væske, der findes i pleurahulen. Pleuravæskens funktion er at mindske friktionen mellem det viscerale pleurablad og det parietale pleurablad, der er fastgjort til henholdsvis lungerne og thorax. Dette medfører, at lungerne kan udvides uden at blive hæmmet af friktion mellem lungerne og thorax. Desuden har pleuravæske også den funktion, at minimere risikoen for at lungen kollapser under ventilation ved at nedsætte de 2 pleurablades mulighed for at blive trukket fra hinanden. (15, s. 361-362). En pleuraeffusion er en ophobning af pleuravæske i pleurahulen. Pleuraeffusion kan være et symptom på en række forskellige sygdomme og opdeles i 2 typer: transudativ og eksudativ pleuravæske (14). Transudater indgår ikke i dette projekt, hvorfor de ikke beskrives yderligere. Eksudat kan skyldes pneumoni, lungeemboli eller cancer. Disse sygdomme kan medføre inflammation og skade på pleura. Dette øger pleuras permeabilitet, hvorved proteiner og celler overføres til pleurahulen, hvilket medfører en ophobning af pleuravæske. Eksudat forekommer ofte lateralt, da kun den ene pleurahule er beskadiget eller inflammeret. (14). I eksudater der ikke er tilført antikoagulans, kan der forekomme spontant dannede koagler. Disse koagler kan opfange mange af cellerne i prøven, hvorved disse ikke ses i de udstrygningerne der fremstilles. (13, s. 139). Side 5 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 2.1.2. Den eksudative pleuravæskes cytologi Normalt vil man kun finde mesotelceller og makrofager i pleuravæsken. Mesotelceller er det yderste lag af celler i pleura og holdes på plads af et stroma bestående af fibrøst og adipøst væv. Dette stroma indeholder små blod- og lymfekar. (13, s. 115). Under mesotelcellernes normal proliferation afstødes nogle af cellerne fra pleura og ud i pleuravæsken. Ved en primær tumor i pleura vil proliferationen af mesotelcellerne øges, hvorved afstødningen af celler også øges, og der vil ses et øget antal af abnorme mesotelceller i pleuravæsken (13, s. 152). De fleste tumorer, der forekommer i pleura, vil dog være sekundære tumorer bestående af metastaser fra f.eks. lungerne eller mamma. (13, s. 129). Hvis effusionen skyldes cancer eller andre årsager, vil mesotelcellerne kunne udvikle reaktivitet (13, s. 121). Disse reaktive mesotelceller kan være svære at differentiere fra maligne mesotelceller (13, s. 151). Når pleura beskadiges, og der forekommer inflammation, vil der ses en ophobning af blodlegemer i pleuravæsken. Dette er både erythrocytter og leukocytter herunder hovedsageligt lymfocytter. Dette skyldes, at det bliver lettere for cellerne i de små blodog lymfekar i pleuras stroma at trange igennem pleurabladet. (13, s. 126). 2.1.3. Cellernes udseende I en pleuravæske ses mesotelceller som runde celler (se figur 2.1.A1), der ligger enkeltvis eller i små klaser med varierende størrelse mellem 15-30 µm i diameter. Mesotelceller har tydeligt cytoplasma bestående af 2 zoner: et ydre ektoplasma og et indre endoplasma (se figur 2.1.A1). Mesotelcellernes cellemembran kan indeholde mikrovilli (se figur 2.1.A3). Kernen er rund eller oval og kan ligge centralt eller excentrisk i cellen (se figur 2.1.A). (13, s. 116). Makrofager ses hyppigst som enkeltliggende celler. De har ca. samme størrelse som mesotelcellerne og ligner dem meget. Makrofagernes cellemembran er mindre tydelig, og cytoplasmaen er vakuliseret (se figur 2.1.C). Deres kerner er nyreformede og ligger excentrisk. (13, s. 126). Side 6 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Lymfocytter er små celler bestående af en rund kerne og meget lidt cytoplasma (se figur 2.1.D). Lymfocytter har en diameter mellem 6-8 µm. (16, s. 212). Cancerceller er meget varierende i deres udseende alt efter hvilken primærcancer, de stammer fra. For at diagnosticere cancerceller anvendes en række kriterier, der kan opstå når celler bliver maligne. Disse kriterier kaldes derfor malignitetskriterierne og opdeles i cytologiske og histologiske kriterier. De cytologiske malignitetskriterier består af: Forstørrede, hyperkromatiske og polymorfe kerner (se figur 2.1.B). Øget mitosetal og abnorme mitoser. Nedsat cellulær differentieringsevne. (17, s. 138-139). Figur 2.1: Cellernes udsende ved MGG farvning. A: Mesotelceller. B: Cancerceller. C: Makrofag. D: Erythrocytter og leukocytter. De histologiske malignitetskriterier præsenteres ikke, da der kun arbejdes med cytologisk prøvemateriale i dette projekt. 2.2. Plasma-thrombin celleblok Når man har en cytologisk prøve, kan man anvende prøvematerialet til at fremstille en celleblok. En celleblok kan anvendes som en histologisk prøve og kan behandles ligeledes. Celleblokke præpareres og indstøbes i en paraffinblok, hvorefter der skæres vævssnit af blokken, der kan farves med forskellige farvemetoder. (18). En metode der ofte anvendes til at fremstille celleblokke er plasma-thrombin metoden. Ved denne metode koncentreres prøven ved centrifugering, og der tilføres plasma og thrombin. Dette medfører, at der dannes et koagel, der opfanger prøvematerialet. (19). Side 7 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 2.3. Rutine farvemetoder af pleuravæsker 2.3.1. Hematoxylin-Eosin Hematoxylin-Eosin (HE) metoden er en hyppigt anvendt oversigtsfarvning til histologisk materiale. HE farvning indeholder 2 farvemolekyler: Aluminium-hæmatein (Alhæmatein) og Eosin Y. (20, s. 35). Al-hæmatein er et metalkompleksfarvestof, der binder til DNA og RNA i cellernes kerne. I DNA og RNA findes der phosphat-radikaler, og det er disse phosphat-radikaler, som Al-hæmatein kan binde til. Størstedelen af cellens DNA og RNA findes i kernen, og man vil derfor se en klar blå kernefarvning med Al-hæmatein. (20, s. 35-36). Eosin Y er et anionfarvestof og binder til positivt ladet grupper i vævet og giver vævet en lys pink Figur 2.2: Eksempel på et vævssnit fra et koagel, farve. Det er hovedsageligt proteiner, der besidder farvet med HE farvemetoden. disse positivt ladet grupper, hvortil Eosin Y kan binde. Dette betyder, at samtlige proteiner både intra- og ekstracellulært farves såsom bindevævets fibrin, cellens cytoskelet og cellens cytoplasma. Desuden er DNA viklet omkring proteiner, der kaldes histoner. Dette medfører, at cellenkernen også bliver farvet med Eosin Y, men dette påvirker kun kernefarvningen i svag grad. I cytoplasma kan der forekomme vesikler, der indeholder bestemte proteiner i høje koncentrationer. Hvis dette er proteiner, der besidder mange eller få positivt ladet grupper, vil man kunne se en ændret grad af farvningen i disse vesikler i forhold til resten af cytoplasmaet. (20, s. 36-37). 2.3.2. Period-Acid-Schiff og Alcian Blue Period-Acid-Schiff er en farvemetode, der anvendes til at påvise tilstedeværelsen af carbohydrater i vævet. Dette kan være polysakkarider, der udelukkende består af carbohydrater, eller mucosubstanser bestående af andre makromolekyler, hvortil carbohydraterne er bundet såsom glykoproteiner og proteoglykaner. (20, s. 54-56). Side 8 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Farvningen forekommer ved at carbohydraterne oxideres ved hjælp af periodsyre, hvorved nogle af carbohydraternes frie alkoholgrupper omdannes til aldehydgrupper. Herefter tilsættes Schiff’s reagens, der indeholder farvestoffet pararosanilin og rosanilin1. Disse farvestoffer binder kovalent til aldehydgrupperne i vævet, hvoraf størstedelen vil findes i form af de oxiderede carbohydrater og giver dem en rødlig lilla farve. (20, s. 5456). Mayers sure hæmalum indeholder Al-hæmatein og anvendes som kontrastfarve. Dette medfører, at cellekernerne farves blå ligesom ved en HE farvning. (20, s. 35-36). En PAS farvning kombineres tit med en Alcian Blue farvning. Denne farvemetode anvendes ligesom PAS til at farve carbohydrater. Forskellen er, at alcian blue farvestoffet kun kan binde til carbohydrater, der indeholder en caboxylsyre-gruppe. Ved at farve med begge farvestoffer kan man hurtigt identificere molekyler indeholdende sure carbohydrater, da disse vil få en kraftig blå farve. Alcian blue kan anvendes til at identificere mucopolysakkarider fra metastaserende tumorer, der har oprindelse i kirtelepitel. (21). 2.3.3. May-Grünwald-Giemsa May-Grünwald-Giemsa (MGG) metoden er en oversigtsfarvning, der anvendes til cytologiske prøver. MGG metoden består af en række farvestoffer. Disse farvestoffer kan inddeles i 2 kategorier: de positivt ladet kationfarvestoffer og det negativt ladet anionsfarvestof. (20, s. 43). Kationfarvestofferne er Azur A, Azur B og methylenblåt. Disse 3 molekyler er i familie med hinanden, da Azur A og B er oxidationsprodukter af methylenblåt, og de farver alle med den samme farve, blå. Kationfarvestofferne binder til negativt ladet grupper i vævet herunder hovedsageligt proteiner og carbohydrater men også DNA. (20, s. 47-48). I en MGG farvning har Eosin Y de samme egenskaber som i en HE farvning. (20, s. 40). 1 Forekomsten af rosanilin i Schiff’s reagens afhænger af producenten. Side 9 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Ved en MGG farvning opstår et fænomen, man kalder Romanovsky-effekten. Dette betyder, at cellernes kerne farves purpur. Dette skyldes, at 2 Azur B molekyler bindes og danner 1 dimer. Det ene molekyle vil binde til den negativt ladet gruppe i DNA, og den anden vil være ledig. Denne ledige positive gruppe vil binde til det negativt ladet Eosin Y, hvorved Eosin Y’s pinke farve blandes med Azur B’s blå farve. (20, s. 48-49). Fordelen ved en MGG farvning er, at kationfarvestofferne og anionfarvestoffet farver de samme typer af molekyler. Man kan derfor differentiere forskellige celletyper ud fra farvning af forskellige cellestrukturer herunder Figur 2.3: Eksempel på en cytologisk udstrygning farvet med MGG farvemetoden. hovedsageligt vesikler og granula. Det er også derfor, at denne farvemetode anvendes specifikt til differentiering af forskellige leukocytter, da de alle farves i et karakteristisk mønster. (20, s. 43-44). 2.3.4. Papanicolaous Papanicolaous (PAP) farvemetoden er en metode, der blev opfundet af George Papanikolaou. PAP farvningen er en multichromatisk metode, der indeholder en række forskellige farvestoffer. Den klassiske PAP farvning indeholder farvestofferne: Hematoxylin, Orange G, Eosin Y, Light Green SF yellowish og Bismarck brown Y. (22). Hæmatoxylin et er kompleksfarvestof og farver cellekernerne. Eosin Y er et anionfarvestof og farver positive proteiner og cytoplasma i metabolisk inaktive celler ligesom ved en HE farvning. Orange G farver keratin i keratiniserede epitelceller. Light Green SF yellowish er et farvestof, der farver cytoplasma og proteiner ligesom Eosin Y, men farver kun de metabolisk aktive celler. (22). Side 10 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 3. Materialer og metode I dette afsnit beskrives projektets metode herunder prøveindsamling, prøvebehandling, dataindsamling og databehandling. Derudover vil der være et afsnit omkring etiske og juridiske overvejelser i forhold til projektet samt et afsnit omhandlende litteratursøgning. I bilag 1 findes en liste over de materialer, der er blevet anvendt herunder reagenser, utensilier og apparatur (se bilag 1). 3.1. Metode 3.1.1. Design Til dette projekt blev der anvendt en beskrivende kvantitativ metode, hvor der blev undersøgt 25 pleuravæsker indeholdende et spontant koagel. Heraf blev der fremstillet et kunstigt koagel og celleindholdet af begge typer af koagler blev undersøgt ved, at de blev sammenlignede med cytologiske udstrygninger fra den samme prøve. Figur 3.1: Diagram over projektets metode fra prøvemodtagelse til databehandling. 3.1.2. Prøveindsamling og -behandling Projektets prøver blev udtaget via pleurapunktur fra patienter med pleuraeffusion (14). Pleuravæskerne blev modtaget fra forskellige afdelinger på Regionshospital Viborg og Regionshospitalet Silkeborg. I dette projekt blev der kun inkluderet serøse pleuravæsker. Desuden blev prøver, der var mere end 3 dage gamle ekskluderet. De fleste prøver ville dog ikke overskride denne grænse, da prøverne undersøges så hurtigt som muligt. I dette projekt blev prøvebehandlingen udført vha. den forskrift, der anvendes i forhold til exudater på Patologisk Institut ved Regionshospitalet Viborg dog med få ændringer. Dette var forskriften ”17.3.1. Exudater, pleura- og acitesvæsker” (se bilag 2), der beskriver arbejdsgange for exudative pleura- og acitesvæsker både med og uden spontane Side 11 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt koagel. Forskriften blev ændret således, at der blev anvendt Mayers sure hæmatoxylin i stedet for methylenblåt, samt at der blev fremstillet kunstige koagler af de prøver, der indeholdte et spontant koagel. I dette projekt blev der anvendt en systematisk prøveudvælgelse (23, s. 138), hvor alle pleuravæsker, der indeholdte et spontant koagel, blev medtaget i projektet, indtil det ønskede antal prøver var nået. 3.1.3. Dataindsamling Nedenfor følger fremgangsmåden for projektets dataindsamling. 3.1.3.1. Operationalisering Operationaliseringen i dette projekt bestod af udformningen af et vurderingsskema, hvor cellemængden af de forskellige celletyper i prøven blev kategoriseret i 3 niveauer (se bilag 3), og et vurderingsskema hvor celleindholdet i det spontane og kunstige koagel blev holdt op imod celleindholdet i den cytologiske udstrygning (se bilag 4). Vurderingsskemaerne ville producere semikvantitativt data, der kunne bruges til at vurdere celleindholdet i de 2 typer af koagler i forhold til udstrygningerne. Projektgruppen vurderede alle prøverne samlet ved et mikroskop med flere okularsæt, så flere personer kunne kigge i det samme mikroskop samtidig. 3.1.3.2. Vurdering af cellemængden i prøverne Prøvernes cellemængde blev bestemt ud fra prøvernes MGG udstrygninger. Celletyperne i prøverne blev kategoriseret i 4 cellegrupper: Mesotelceller og makrofager Erythrocytter Leukocytter og lymfocytter Cancerceller De forskellige cellegrupper i prøverne blev kategoriseret i 3 niveauer bestående af henholdsvis lav, medium og høj cellemængde, der blev symboliseret ved cirkler frem for tal. Lav cellemængde blev symboliseret ved 1 cirkel, medium cellemængde ved 2 cirkler og høj cellemængde ved 3 cirkler. Side 12 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 3.1.3.3. Vurdering af celleindholdet i koaglerne De 2 koagler fra hver prøve blev blindet, så det ikke var muligt at vide hvilken type af koagel, der blev vurderet på et givent tidspunkt (24, s. 33). Blindingen foregik ved, at der blev sat et klistermærke hen over glasnumrene på objektglassene, så det kun var muligt at se prøvenummeret. På denne måde var det uvist, om det var det spontane eller det kunstige koagel, der blev vurderet, men ikke hvilken prøve de tilhørte. Koaglerne blev vurderet på en ordinalskala, ved at celleindholdet i de forskellige cellegrupper blev scoret i 5 kategorier med indbyrdes rangorden (25). De blev scoret ud fra indholdet af celler i koaglerne i forhold til de cytologiske udstrygninger fra prøvematerialet. Hver cellegruppe blev scoret separat. De 5 scores, der blev brugt til at bedømme celleindholdet i koaglerne, var: Ø, hvis der ingen celler var i koaglet i den pågældende cellegruppe, men der var celler i udstrygningen. -, hvis der var færre celler i koaglet end i udstrygningen. /, hvis der var et tilsvarende celleindhold i koaglet, som der var i udstrygningen. +, hvis der var flere celler i koaglet end i udstrygningen. ++, hvis der var mange flere celler i koaglet end i udstrygningen. Vævsnittene fra koaglerne og de cytologiske udstrygninger blev farvet med de rutinemæssige farvemetoder. På koaglerne blev der rutinemæssigt udført HE farvning og PAS-AB farvning, og på de cytologiske udstrygning blev der rutinemæssigt udført MGG farvning og PAP farvning (5). Vævssnittene og udstrygningerne blev undersøgt i et lysmikroskop ved 10 gange forstørrelse. De prøver, som projektgruppen havde svært ved at vurdere, blev også vurderet af en rutineret cytobioanalytiker med erfaring i at undersøge cytologiske prøver. Dette var hovedsageligt de prøver, der var diagnosticeret maligne, og de prøver hvor projektgruppen havde haft problemer med at identificere mesotelceller og makrofager. Side 13 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 3.1.4. Databehandling Den indsamlede data blev behandlet vha. grafisk fremstilling, beregning af den centrale tendens og fordelingsbredden samt statistiske tests. Med henblik på at behandle og visualisere data blev der produceret grafiske fremstillinger over fordelingen af de forskellige vurderinger bestående af søjlediagrammer (26, s. 47). Desuden blev den centrale tendens og fordelingsbredden udregnet for vurderingerne i de forskellige cellegrupper for at beskrive disse som en helhed i stedet for de individuelle vurderinger. Den centrale tendens opgives i form af dataets median, og fordelingsbredden opgives som 95 %-percentilet. (26, s. 34-41). Både medianerne og 95 %-percentilerne blev beregnet i Excel 2013, men da Excel kun kan opererer med tal, var det nødvendigt at konvertere de forskellige vurderinger til tal frem for symboler. Konverteringen foregik ved, at Ø vurderingerne blev 1, - vurderingerne blev 2, osv. i forhold til den indbyrdes rangorden, således at hver vurderinger blev konverteret til et tal mellem 1 og 5. Der blev beregnet vægtede Cohens kappa-koefficienter for at undersøge, om der var overensstemmelse mellem vurderingerne af de spontane og kunstige koagler samt mellem vurderingerne foretaget af projektgruppen og en rutineret cytobioanalytiker. Den vægtet Cohens kappa-koefficient fortæller hvor ofte, de 2 koagler vurderes ens. (26, s. 103-109). De vægtede Cohens kappa-koefficienter blev beregnet vha. hjemmesiden graphpad.com (27). Den beregnede vægtede Cohens kappa-koefficient angives som et tal mellem -1 og 1. De vægtede Cohens kappa-koefficient blevet vurderet ud fra inddelingen fastsat af Landis og Koch i 1977 (26, s. 106). Desuden blev det også undersøgt, om der var signifikant forskel mellem medianerne af disse grupper vha. Wilcoxons rangsumstest. Ved Wilcoxons rangsumstest beregnes en p-værdi, der angiver sandsynligheden for at udtage de undersøgte stikprøver, når man antager at nul-hypotesen er sand. (26, s. 86-87). Wilcoxons rangsums testene blev beregnet vha. hjemmesiden vassarstats.net (28). 3.2. Etiske og juridiske overvejelser De etiske og juridiske overvejelser i forbindelse med projektets metode præsenteres i følgende afsnit. Side 14 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Projektet blev udført med prøver, der var udtaget til rutinediagnosticering, og det havde derfor ingen fysisk betydning for patienterne, at de indgik i projektet. Alt materiale, der blev fremstillet, indgik i den rutinemæssige diagnosticering, og det var derfor ikke nødvendigt at indhente fornyet samtykke til projektet. For at opretholde patienternes anonymitet i henhold til Helsinki deklarationen (29) blev al indsamlet data anonymiseret, så det ikke kunne føre tilbage til de enkelte patienter. 3.3. Litteratursøgning Med henblik på at finde empirisk viden om emnet i form af forskningsbaseret artikler blev der udført en systematisk litteratursøgning. Før der kan udføres en systematisk emneordssøgning er det nødvendigt at kende de emneord, der skal anvendes. Der blev derfor udført en bevidst tilfældig søgning på google og PubMed, for at finde emneord og MeSH-termer til anvendelse i søgestrategien (se bilag 5). (30, s. 36). De fundne søgeord og MeSH-termer blev inddelt i en søgestrategi, der kunne anvendes på forskellige databaser for forskningsbaseret litteratur. Population "Pleural Effusion" [Mesh] Fænomen Cell block OR OR OR Cell-block OR Clot* OR Pleural Fluid Clot section* "Pleural Effusion, Malignant" [Mesh] Kontekst ”Specimen Handling" [Mesh] AND OR AND "Cytological Techniques" [Mesh] OR "Cytodiagnosis" [Mesh] Tabel 3.1: Søgestrategi der blev anvendt til systematisk litteratursøgning. Denne søgestrategi blev anvendt på PubMed (31), SveMed+ (32), CINAHL Complete (33) og Cochrane Library (34). På PubMed blev der kun inkluderet artikler, der var publiceret inden for de sidste 10 år, der omhandlede mennesker og som var på engelsk for at reduceret antallet af artikler. Dette var ikke nødvendigt ved søgningen i de 3 andre databaser. Denne søgestrategi medførte, at der blev fundet 43 poster på PubMed (se bilag 6), 0 poster på SveMed+ (se bilag 7), 3 poster på CINAHL Complete (se bilag 8) og 2 post på Cochrane Library (se bilag 9). Ud af disse poster blev 8 artikler fra PubMed fundet Side 15 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt relevante og kunne inddrages i dette projekt (se bilag 10). Disse 8 artikler var baseret på undersøgelser omhandlende den diagnostiske anvendelsesmulighed af celleblokke. Den ene af disse 8 artikler kunne dog ikke hentes hjem i tide, til at den kunne inddrages i dette projekt. 4. Resultater I det følgende afsnit fremgår de resultater, der er blevet fundet under analysen af data. Der blev indsamlet data omkring cellemængden i prøverne (se bilag 11) og omkring vurderingen af celleindholdet i koaglerne i forhold til de cytologiske udstrygninger (se bilag 12). Vurderingerne af celleindholdet i koagler blev også opdelt efter cellemængden i prøverne (se bilag 13). 4.1. Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. søjlediagrammer Der blev fremstillet en række søjlediagrammer for at kunne visualisere forholdet mellem de forskellige vurderingskategorier for de spontane og kunstige koagler. Disse søjlediagrammer viser fordelingen af de forskellige vurderinger, der er blevet foretaget af de spontane og kunstige koagler delt op i de forskellige celletyper. Der blev også produceret søjlediagrammer, hvor vurderingerne også er opdelt efter de forskellige niveauer af cellemængderne i prøverne (se bilag 14). Side 16 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Vurdering af mesotelceller og makrofager ++ + / - Modul 14 Bachelorprojekt Vurdering af erythrocytter Ø ++ + / - Ø 15 12 11 9 3 4 5 4 2 6 5 4 2 2 0 Spontant koagel Kunstigt koagel 5 4 2 3 0 Spontant koagel Kunstigt koagel Figur 4.2: Søjlediagram over frekvensen af de Figur 4.3: Søjlediagram over frekvensen af de forskellige vurderinger af mesotelcelle- og forskellige vurderinger af erythrocytindholdet i makrofagindholdet i de spontane og kunstige de spontane og kunstige koagler sammenlignet koagler sammenlignet med den tilsvarende med den tilsvarende cytologiske udstrygning. Se cytologiske udstrygning. ++ betyder mange flere figur 4.1 for tegnforklaring. celler i koaglet end udstrygningen, + betyder flere celler, / betyder en tilsvarende mængde celler, - betyder færre celler og Ø betyder ingen celler. Tallet over hver søjle er frekvensen. Side 17 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Vurdering af leukocytter ++ + / - Modul 14 Bachelorprojekt Vurdering af cancerceller Ø ++ + / - Ø 15 9 6 7 4 3 4 2 0 0 Spontant koagel Kunstigt koagel 1 0 0 0 0 Spontant koagel 0 1 0 0 0 Kunstigt koagel Figur 4.4: Søjlediagram over frekvensen af de Figur 4.5: Søjlediagram over frekvensen af de forskellige vurderinger af leukocytindholdet i de forskellige vurderinger af cancercelleindholdet i spontane og kunstige koagler sammenlignet med de spontane og kunstige koagler sammenlignet den tilsvarende cytologiske udstrygning. Se figur med den tilsvarende cytologiske udstrygning. Se 4.1 for tegnforklaring. figur 4.1 for tegnforklaring. Side 18 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Følgende er et skema over andelene af de forskellige vurderinger, hvor der er blevet fundet et større, lavere eller tilsvarende indhold af celler i koaglerne sammenlignet med udstrygningerne. Cellegruppe Mesotelceller og makrofager Erythrocytter Leukocytter Cancerceller Celleindhold Flere celler Tilsvarende Færre celler Flere celler Tilsvarende Færre celler Flere celler Tilsvarende Færre celler Flere celler Tilsvarende Færre celler Spontane koagler 7/24 11/24 6/24 6/25 6/25 13/25 9/25 9/25 7/25 1/1 0/1 0/1 Kunstige koagler 5/25 12/24 7/24 7/25 15/25 3/25 6/25 15/25 4/25 1/1 0/1 0/1 Tabel 4.2: Tabel over andelene af de forskellige vurderinger, opdelt ud fra indholdet af celler i koaglerne i 3 niveauer i forhold til udstrygning og opdelt efter cellegruppe. 4.2. Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. medianen og 95 %-percentiler Medianen og 95 %-percentiler blev beregnet for de forskellige cellegrupper. Medianer og 95 %-percentiler opdelt efter prøvernes cellemængde blev også beregnet (se bilag 15). Spontane koagler Celletype Kunstige koagler Median 95 %percentil Median 95 %percentil Mesotelceller og makrofager / Ø til ++ / Ø til + Erythrocytter Leukocytter Cancerceller / ++ Ø til ++ - til ++ / / + - til ++ - til ++ Tabel 4.3: Tabel over medianen og 95 %-percentiler af de forskellige vurderinger der er blevet foretaget af indholdet i de forskellige celletyper opdelt i spontane og kunstige koagler. Side 19 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 4.3. Overensstemmelse mellem vurderingerne af de spontane og de kunstige koagler Der blev beregnet vægtede Cohens kappa-koefficienter mellem vurderingerne af de 2 koageltyper i forhold til de forskellige celletyper for at undersøge, om der er overensstemmelse mellem vurderingerne af de spontane og kunstige koagler. Der blev også beregnet vægtede Cohens kappa-koefficienter ved forskellige niveauer af cellemængder i prøverne (se bilag 16). Mesotelceller og makrofager Erythrocytter Leukocytter Alle celletyper 0,287 0,238 0,374 0,285 Observeret kappa-koefficient Tabel 4.4: Oversigt over beregnede vægtede Cohens kappa-koefficienter mellem vurderingerne af de spontane og de kunstige koagler opdelt ved de forskellige celletyper. Wilcoxons rangsumstest med et signifikansniveau på 95 % blev anvendt for at vurdere, om der er signifikant forskel på medianerne beregnet på de 2 forskellige koagler. Derudover blev Wilcoxons rangsumstest også beregnet ved de forskellige cellemængder (se bilag 17). Først opstilles hypotesen: 𝐻0 : 𝑥̃1 = 𝑥̃2 , dvs. at der ikke er signifikant forskel på medianen af de 2 typer af koagel. 𝐻1 : 𝑥̃1 ≠ 𝑥̃2 , dvs. at der er signifikant forskel på medianen af de 2 typer af koagel. Ved 95 % signifikansniveau accepteres H0, hvis p > 0,0500. p-værdi Konklusion Mesotelceller og makrofager 0,3371 H0 accepteres, dvs. at der ikke er signifikant forskel Erythrocytter Leukocytter Alle cellergrupper 0,0209 0,8181 0,3953 H0 forkastes, dvs. at der er signifikant forskel H0 accepteres, dvs. at der ikke er signifikant forskel H0 accepteres, dvs. at der ikke er signifikant forskel Tabel 4.5: Oversigt over beregnede p-værdier ved Wilcoxons rangsumstest mellem de spontane og de kunstige koagler ved forskellige cellegrupper. Side 20 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 4.4. Overensstemmelse mellem vurderinger foretaget af den rutinerede cytobioanalytiker og projektgruppen Forskel i vurderinger foretaget af cytobioanalytiker og projektgruppe PG ++ PG + PG / PG - PG Ø 14 9 6 4 3 3 2 2 1 0 CB ++ 2 2 1 0 1 1 0 CB + 0 0 CB / 1 1 1 0 0 CB - 0 CB Ø Figur 4.6: Søjlediagram over sammenholdet mellem vurderingerne foretaget af den rutinerede cytobioanalytiker (CB) og projektgruppen (PG). Hver søjle repræsenter de vurderinger, projektgruppen har foretaget i forhold til den vurdering, cytobioanalytikeren har udført. Tallene over hver søjle angiver hvor ofte denne specifikke sammenhæng forekom mellem projektgruppens og cytobioanalytikerens vurderinger. En vægtet Cohens kappa-koefficient blev beregnet på vurderingen af 9 udvalgte prøver (se bilag 18) foretaget af projektgruppen samt den rutinerede cytobioanalytiker fra afdelingen. 9 udvalgte prøver Alle celletyper og koagler Observeret kappa-koefficient 0,550 Tabel 4.6: Oversigt over den vægtet Cohens kappa-koefficient beregnet mellem projektgruppen og den rutinerede cytobioanalytikers vurderinger af 9 udvalgte prøver. En Wilcoxons rangsumstest blev også beregnet for at undersøge, om der er signifikant forskel mellem medianerne af vurderingerne foretaget af projektgruppen og Side 21 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt cytobioanalytikeren. Denne Wilcoxons rangsumstest blev beregnet ved et signifikans niveau på 95 % (se bilag 18) med hypotesen: 𝐻0 : 𝑥̃1 = 𝑥̃2 , dvs. at der ikke er signifikant forskel på medianen af de 2 typer af koagel. 𝐻1 : 𝑥̃1 ≠ 𝑥̃2 , dvs. at der er signifikant forskel på medianen af de 2 typer af koagel. p-værdi Konklusion Alle celletyper og koagler 0,2263 H0 accepteres, dvs. at der ikke er signifikant forskel. Tabel 4.7: Oversigt over beregnet p-værdi ved Wilcoxons rangsumstest mellem vurderinger foretaget af projektgruppen og vurderinger foretaget af cytobioanalytiker ved alle celletyper og begge koageltyper. 5. Diskussion I dette afsnit vil der blive præsenteret en diskussion af projektets metode og resultater mhp. at synliggøre projektets interne og eksterne validitet samt reliabilitet (23, s. 141). Til at vurdere metoden og resultaterne i dette projekt anvendes begreberne intern og ekstern validitet samt reliabilitet. Den interne validitet er et udtryk for hvorvidt projektets metode kan anvendes til at fremstille resultater, der giver svar på den ønskede problemstilling. Den eksterne validitet bruges til at vurdere hvorvidt projektets resultat er generaliserbart. Reliabilitet er et udtryk for projektets pålidelighed, og hvorvidt metoden vil kunne gentages med samme resultat. (23, s. 141). 5.1. Diskussion af design Den beskrivende kvantitative metode styrker projektets interne validitet og reliabilitet. Denne metode blev valgt for at undersøge forskellen mellem de 2 typer af koagler, og så resultaterne kunne overføres til alle fremtidige pleuravæsker indeholdende et spontant koagel. En beskrivende kvantitativ metode er god, hvis man ønsker et resultat, der er bredt, generaliserbart og er repræsentativt over for den problemstilling, man ønsker at undersøge (23, s. 98-101). Et generelt resultat fra en kvantitativ metode er nemmere at finde igen ved en gentagelse af projektet end et specifikt og subjektivt resultat fra en kvalitativ metode. Hvis man vil sikre generaliserbarhed af en beskrivende metode, er det dog vigtigt, at man har udtaget en repræsentativ stikprøve fra totalpopulationen. Dette Side 22 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt skyldes, at en repræsentativ stikprøve skal indeholde alle de variable, der havde betydning for problemstillingen før man kan sige noget generaliserbart omkring denne. (23, s. 8688). Prøverne blev udtaget ved systematisk udvælgelse for at sikre repræsentativiteten af stikprøven og derved styrke den interne validitet og reliabiliteten af projektet. Denne metode var mere praktisk at udføre end tilfældig udvælgelse, da det ikke er nødvendigt med en anden part til udvælgelsen af prøverne. Den systematiske udvælgelse medførte dog stadig en god repræsentativitet af totalpopulationen i stikprøven (23, s. 138). 5.2. Diskussion af prøveindsamling og –behandling Antallet af prøver der kunne medtages i projektet blev begrænset af, at Patologisk Institut på Regionshospitalet Viborg modtog få pleuravæsker indeholdende et spontant koagel inden for projektets givne tidsperiode. Det er ikke muligt at vurdere hvilken indflydelse, dette har haft på den interne validitet, da det ikke er muligt at beregne en teststyrke. Dette er ikke muligt, da projektet arbejder med semikvantitativ frem for kvantitative data. Det var nødvendigt, at afdelingen igangsætte prøveindsamlingen inden projektets start, for at der kunne indsamles et ønskværdigt antal prøver. Der blev derfor produceret en modificeret forskrift for prøvebehandlingen, inden det var fastlagt, hvordan projektgruppen ville arbejde med problemstillingen. Der blev opstillet inklusions- og eksklusionskriterier i forhold til de anvendte prøver for at styrke projektets interne validitet. Det var et inklusionskriterie, at der skulle være dannet et spontant koagel i den serøse pleuravæske og et eksklusionskriterie, at prøverne ikke måtte være for gamle. Inklusionskriteriet begrundes med at dette projekt beskæftiger sig med forskellen mellem disse spontane koagler og kunstigt fremstillede koagler. Prøverne måtte ikke være ældre end et par dage inden udstrygningerne, og det kunstige koagel blev produceret, da dette var tilsvarende, hvis prøverne var blevet modtaget fredag, men først blev behandlet mandag. Der var dog ingen prøver, der blev ekskluderet for at have overskredet denne tidsgrænse. Der blev ikke valgt nogle eksklusionskriterier i forhold til patienternes alder, køn, etnicitet, etc. for at øge projektets generaliserbarhed, og derved styrke den eksterne validitet. Side 23 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Den forskrift, der blev anvendt til prøvebehandlingen, blev valgt, da prøverne skulle indgå i den normale rutine på afdelingen, og det derfor var bedst at anvende afdelingens egen forskrift. Dette svækkede metodens interne validitet, da det ikke vides, om der findes en bedre forskrift baseret på nyere empirisk evidens. Det var nødvendigt at lave få ændringer i forskriften, for at den kunne anvendes til projektet. En af ændringerne var, at der skulle anvendes Mayers sure hæmatoxylin i stedet for methylenblåt til at synliggøre koaglerne inden indstøbningen i paraffin. Denne ændring havde dog ingen betydning for det endelige projekt. Ændringen i forskriften var blevet besluttet, inden det var fastlagt, hvordan projektgruppen ville arbejde med problemstillingen og havde kun betydning, hvis man havde valgt at vurdere kvaliteten af farvningen af de forskellige koagler. Den anden ændring bestod af, at der skulle fremstilles kunstige koagler på prøver indeholdende et spontant koagel, da dette var essentielt for projektet, og derved styrkede den interne validitet. De 4 farvemetoder der anvendes i projektet blev valgt, fordi der var vævssnit, der allerede var blevet farvet med disse farvemetoder, da prøverne havde indgået i den normale rutinemæssige diagnosticering, inden prøverne blev anvendt til projektet. Dette svækkede metodens interne validitet, da der muligvis havde været mere empirisk evidens for at anvende andre farvemetoder, der var mere egnet til projektet. De farvemetoder, der blev anvendt til metoden, bestod af de 2 mest hyppige oversigtsfarvninger til henholdsvis histologisk og cytologisk materiale. Da koaglerne blev vurderet ved, at der blev dannet et overblik over celleindholdet, blev den interne validitet kun svækket lidt af at disse farvemetoder blev anvendt frem for farvemetoder, der var mere egnet. Ud af de 2 cytologiske farvemetoder blev det vurderet, at MGG farvemetoden gav den mest repræsentative udstrygning, da disse var tørfikseret, og der derfor ikke var mulighed for, at cellerne blev skyllet af objektglasset under præpareringen. Dette var en mulighed ved en PAP farvning, da denne var alkoholfikseret. Snit farvet med PAS-AB var kun relevant ved maligne pleuravæsker, da det normale celleindhold i en pleuravæske ikke producerer sure muciner, hvorimod metastaser med oprindelse i kirtelepitel producerer disse. (15, s. 394). Side 24 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 5.3. Diskussion af dataindsamling 5.3.1. Diskussion af dataindsamlingsmetoden Den anvendte dataindsamlingsmetode var simpel og beskæftigede sig kun med celleindholdet i koaglerne i forhold til udstrygningerne. Den kunne på den måde bruges til at undersøge, om der var en forskel i celleindholdet af de 2 koagler, hvilket var problemstillingen projektet beskæftigede sig med. Den interne validitet blev svækket af, at dette var en metode projektgruppen selv opbyggede, og dermed ikke en valideret metode. Det var ikke muligt at finde en sådan valideret metode, der kunne anvendes inden for de rammer projektet skulle opbygges under. Projektets reliabilitet blev styrket af, at der var blevet indsamlet semikvantitativt data, men det var dog ikke muligt at indsamle kvantitativt data, hvilket formindskede projektets styrkede reliabilitet. Det var ikke muligt at indsamle kvantitativ data, fordi der var mange celler, der skulle kvantificeres, og fordi koaglerne skæres i snit, hvorved man kun vurderer et udsnit af koaglet. Det blev besluttet, at der skulle fremstilles vurderingsskemaer, da disse kunne bruges til at indsamle semikvantitativt data, hvilket styrker reliabiliteten. Disse vurderingsskemaer blev producerede gennem diskussion i projektgruppen. Denne diskussion omhandlede hvilke opdelinger, der skulle foretages i forhold til celleindholdet, samt hvordan scoringen skulle foregå. Der var bl.a. tale om at vurdere alle cellerne samlet samt at lave en samlet score for hvert koagel ud fra de del-scores hver cellegruppe fik. Disse ideer blev dog ikke medtaget i de endelige vurderingsskemaer, da de blot ville komplicere vurderingsprocessen uden at styrke projektets reliabilitet eller interne validitet. Hvis der havde været mere tid og flere ressourcer til rådighed, kunne man have styrket projektets interne validitet ved at anvende en metode tilsvarende Jalal et al.’s. De valgte, at en patolog skulle diagnosticere prøven henholdsvis på det spontane koagel og det kunstige koagel uafhængigt. Først bagefter blev det undersøgt, om der var sammenhæng mellem de diagnoser, der var blevet stillet på de 2 forskellige typer af koagler. Denne metode var god, fordi den ikke fokuserede på mængden af celler i koaglerne men på antallet af maligne diagnoser, der blev stillet på det ene type koagel frem for det andet. (10). Side 25 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 5.3.2. Diskussion af vurderingsskemaerne Cellemængden skulle gradueres i 3 niveauer for at prøverne kunne inddeles i grupper, uden at grupperne blev for små. Dette øgede projektets reliabilitet, da flere kategorier ville betyde, at der er mindre variation mellem kategorierne, hvorved det bliver svære med sikkerhed at placere en vurdering i 1 kategori. Hver score blev symboliseret for at gøre visualiseringen af resultaterne lettere, da det er lettere at differentiere mellem symboler frem for tal. Oprindeligt var der blevet gradueret i 4 niveauer, men kun 1 prøve blev vurderet i det laveste niveau, så det blev besluttet at de 2 laveste niveauer blev forenet til et. Udover at cellemængden blev gradueret i 3 niveauer, så blev cellerne i prøverne også kategoriseret i 4 cellegrupper, da det kan være svært at adskille de forskellige typer af celler inden for den samme cellegruppe. Da forholdet mellem de forskellige cellegrupper kan variere i prøverne, blev projektets reliabilitet styrket ved, at cellerne blev vurderet i de individuelle cellegrupper. Celleindholdet i koaglerne blev holdt op imod celleindholdet i de tilsvarende udstrygninger, da dette ville give den mest valide data omkring celleindholdet i koaglerne i forhold til prøverne. Celleindholdet i koaglerne skulle scores i 5 niveauer. Dette gjorde, at det spontane og det kunstige koagel kunne vurderes i 2 forskellige niveauer, selvom at de begge f.eks. havde et større celleindhold end deres tilsvarende udstrygning. Dette svækkede metodens reliabilitet, da der var mindre variation mellem de forskellige vurderingskategorier. I praksis havde projektgruppen f.eks. besvær med at vurdere om et koagel indeholdte flere eller mange flere celler end udstrygningen. 5.3.3. Diskussion af de praktiske omstændigheder Alle mikroskoperinger af koaglerne og udstrygningerne blev fortaget samlet i projektgruppen. Dette medførte, at de individuelle vurderinger kunne diskuteres, og der kunne vurderes en fælles score til hvert koagel, hvorved projektets reliabilitet blev styrket, da koaglerne fik en mere ensformig vurdering. Alle mikroskoperinger blev foretaget ved 10 gange forstørrelse, da der ved denne forstørrelse kunne dannes et overblik over præparatet, og det derfor var nemmere at vurdere det generelle antal og forhold af celler i de forskellige cellegrupper. Koaglerne blev blindet for at øge projektets interne validitet, da dette var med til at nedsætte projektets bias. På denne måde blev vurderingerne af koaglerne ikke påvirket af Side 26 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt forforståelsen om at finde det ene koagel bedre end det andet, da det ikke var muligt at vide hvilken type koagel, der blev vurderet på et givent tidspunkt (24, s. 33). 5.3.4. Flertydige prøver De prøver, projektgruppen havde svært ved at vurdere, blev også vurderet af en rutineret cytobioanalytiker. Dette medførte, at det kunne undersøges, om der var forskel mellem de vurderinger den urutineret projektgruppe foretog i forhold til vurderingerne fortaget af det rutinerede personale på afdelingen. En overensstemmelse mellem disse vurderinger ville styrke metodens reliabilitet. Den rutineret cytobioanalytiker skulle vurdere prøverne ud over vedkommendes normale arbejdsopgaver, hvorfor det blev besluttet, at vedkommende kun skulle vurdere nogle udvalgte prøver frem for alle prøverne, der indgik i projektet. Dette formindsker graden, som metodens reliabilitet blev styrket ved. Ved 2 koagler havde cytobioanalytikeren givet 2 forskellige vurderinger. Her blev det valgt, at medtage den vurdering, hvor der var mindst forskel mellem koaglerne og udstrygningerne, for at resultatet ikke blev påvirket af bias der skyldtes forforståelsen. 5.4. Diskussion af ”Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. søjlediagrammer” Et søjlediagram er en klassisk grafisk afbildning, der har til formål at overskueliggøre frekvensen af forskellige målinger eller vurderingen, hvorved de kan holdes op imod hinanden og sammenlignes. Dette styrker metodens interne validitet, da de 2 typer af koagler kunne sammenlignes, hvorved man kunne se om der var forskel mellem dem. Fordelingen af de forskellige celler i prøven kan have stor betydningen for diagnosticering af prøven, da man gerne vil have en prøve med mange mesotelceller og cancerceller. Det er disse celler, der er interessante i forhold til diagnosticering af cancer. Leukocytter kan til dels også være interessante i forhold til cancer diagnosticering, da en prøve med mange leukocytter tyder på inflammation. Inflammationen kan dog skyldes en række andre sygdomme ud over cancer. Tilstedeværelsen af erythrocytter har heller ikke stor betydning for diagnosticering af cancer, da dette blot tyder på, at der har forekommet skade på pleura, hvorved der er fri adgang fra et blodkar og ind i pleurahulen. Det vil derfor være optimalt med et koagel, der indeholder mange mesotelceller og cancerceller Side 27 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt og få leukocytter og erythrocytter, da disse blot er forstyrrende, når man skal anvende koaglet til cancerdiagnosticering. Det er vigtigt med en hurtig og korrekt diagnostik, da dette ofte har betydning for patientens prognose, dog er prognosen generelt ikke god ved cancer i pleura (35). Vurderingerne kunne kategoriseres i 3 grupper, alt efter hvor ønskværdig vurderingerne var for at fremme de diagnostiske anvendelsesmuligheder af koaglerne: Ønskede vurderinger o Flere mesotelceller og makrofager o Færre erythrocytter o Færre leukocytter o Flere cancerceller Uønskede vurderinger o Færre mesotelceller og makrofager o Flere erythrocytter o Flere leukocytter o Færre cancerceller Ikke diagnostisk forskel o Tilsvarende mængde celler Denne kategorisering betyder, at der for de spontane og de kunstige koagler blev fortaget: De spontane koagler o 37 % (28/75) ønskede vurderinger o 28 % (21/75) uønskede vurderinger o 35 % (26/75) tilsvarende vurderinger De kunstige koagler o 17 % (13/75) ønskede vurderinger o 27 % (20/75) uønskede vurderinger o 56 % (42/75) tilsvarende vurderinger Der blevet foretaget stort set lige mange uønskede vurderinger for begge typer af koagler. Der blev dog foretaget betydeligt flere ønskede vurderinger af de spontane koagler end af Side 28 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt de kunstige koagler. Der blev dog foretaget betydelige flere ens vurderinger af de kunstige koagler end af de spontane koagler. Dette understøttes af Jalal et al.’s undersøgelse, hvilket styrker projektets eksterne validitet. Jalal et al.’s undersøgelse viste, at der forekom en fordobling af antallet af diagnosticerede atypiske eller maligne prøver, når der blev undersøgt et spontant koagel sammen med den cytologiske udstrygning og det kunstige koagel. Dette betød, at de spontane koagler med fordel kunne anvendes til cancer diagnostik i pleura, hvilket var det samme resultat som resultatet af dette projekt. Sammenligneligheden mellem dette projekt og Jalal et al.’s undersøgelse påvirkes dog af, at deres undersøgelse beskæftigede sig med spontane og kunstige koagler, der var blevet dannet ved andre metoder, end dem der er blevet anvendt i dette projekt. (10). En række undersøgelser fortaget af Köksal et al., Kulkarni et al. og Bhanvadia et al. Viste, at man med fordel kan anvende kunstigt fremstillet celleblokke under cancerdiagnostikken af pleuravæsker (7–9). Dette står i modsætning til resultatet af dette projekt, da dette viste, at der blev foretaget flere uønskede vurderinger af de kunstige koagler, end der var blevet foretaget ønskede. Sammenligneligheden mellem disse undersøgelser og dette projekt er imidlertid ikke god, da disse undersøgelser var baseret på andre metoder, forskellige typer af kunstige koagler og andre vurderingskriterier. 5.5. Diskussion af ”Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. medianen og 95 %-percentiler” Udover grafisk fremstilling blev fordelingen af de forskellige vurderingen også visualiseres ved den centrale tendens og fordelingsbredden. Dette styrker den interne validitet, da en overensstemmelse mellem resultaterne fra begge databehandlingsmetoder vil understøtte deres resultater. 5.5.1. Median Man kan ud fra medianerne se, at der var tendens til, at der forekom færre erythrocytter og flere cancerceller i de spontane koagler end i de kunstige, men at der ikke var forskelle mellem koaglerne i de andre cellegrupper. Der blev dog kun undersøgt 1 prøve indeholdende cancerceller, hvilket betød at usikkerheden på de beregnede medianer i Side 29 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt denne cellegruppe var stor, hvorved validiteten af dette resultat var lav. Dette resultat står i kontrast til, de resultater der blev præsenteret i afsnittet ” Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. søjlediagrammer”, der viste, at der var forskel på de 2 koagler ved alle celletyper. Undersøgelsen foretaget af Jalal et al. (10) understøtter dog dette resultat, da færre erythrocytter og flere cancerceller i de spontane koagler vil have betydning for, at der blev stillet flere maligne diagnoser på disse koagler frem for de kunstige. Den centrale tendens blev opgivet som medianen frem for modus, da modus blot angiver den kategori, hvoraf forekomsten er størst og ikke tager højde for at data er rangordnet (26, s. 35). Hvis der er en høj forekomst af vurderinger i den største kategori, men meget få i den anden største ville dette betyde, at modus vil blive bestemt til at være den største kategori. Også selvom at der gennemsnitligt er lige mange vurderinger i de 2 største og de 2 laveste kategorier. Medianen ville derimod blive bestemt til at være den midterste kategori i denne situation. Det var derfor bedre at anvende medianen til at bestemme den centrale tendens, da dette bedre repræsenterede den gennemsnitlige vurdering, hvilket styrker projektets interne validitet ved at sikre generaliserbarhed af resultatet. Der kan være uoverensstemmelse mellem dette resultat og resultatet fra afsnittet ”Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. søjlediagrammer”. Dette kan skyldes, at den midterste kategori er meget bred relativt til de andre kategorier, hvorved medianen vil befinde sig i denne kategori, selvom at der er flere forekomster af vurderingen i de 2 øverste kategorier frem for de 2 nederste. Man kunne undgå dette problem ved at øge antallet af vurderingskategorier. Dette ville medføre, at frekvensen af hver kategori ville falde. Dette ville dog svække metodens reliabilitet, da det ville være sværere at skelne mellem de forskellige kategorier, og det ville være mere tilfældigt, hvilken vurdering cellegruppen vil få. 5.5.2. 95 %-percentil Fordelingsbredden er et udtryk for variationen mellem målinger eller vurderinger på en ordinalskala. Den mest simple måde at angive fordelingsbredden på er ved at angive minimum og maksimum vurderingen. Problemet med fordelingsbredden er, at 1 enkelt ekstrem værdi har stor påvirkning på denne, da 1 enkelt måling i 1 af de yderste kategorier medfører, at denne kategori bliver betegnet som datamængdens minimum eller Side 30 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt maksimum. Fraktiler anvendes derfor ofte til at beskrive fordelingsbredden, da enkelte ekstreme værdiers påvirkning på fordelingsbredden minimeres, og den interne validitet styrkes. De fraktiler, der oftest bliver anvendt, er kvartiler og percentiler. Problemet ved at anvende kvartiler er, at datamængden bliver opdelt i 4 lige store grupper, hvorved alt under den 1. og alt over den 3. kvartil bliver ekskluderet. Dette medfører at fordelingsbredden kun udtrykkes som data mellem 1. og 3. kvartilen, hvilket svarer til 50 % af værdierne i datamængden. (26, s. 37-41). I projektet anvendes 95 %-percentiler i stedet, hvor de yderste 2,5 % af datamængden bliver ekskluderet. Dette styrker projektets interne validitet, da fordelingsbredden dækker over et mere repræsentativt område. 5.5.3. Beregning Den interne validitet styrkes af, at Excel 2013 blev anvendt til beregning af medianen og 95 %-percentilerne i dette projekt. Excel indeholder formler og beregningsmuligheder for simple statistiske begreber. Det var derfor ikke nødvendigt at anvende mere kompliceret statistisk software, hvorfor dette program blev anvendt til at beregne disse simple statistiske udregninger. 5.6. Diskussion af ”Overensstemmelse mellem vurderingerne af de spontane og de kunstige koagler” En vurdering af celleindholdet i et koagel er subjektivt og kan være tilfældig, hvis vurderingen ligger lige på grænsen mellem 2 kategorier. Der blev beregnet vægtede Cohens kappa-koefficienter for at bedømme, om der var reel forskel mellem vurderingerne af de 2 koagler, eller om forskellen blot skyldtes tilfældigheder. De 4 vægtede Cohens kappa-koefficienter, der blev beregnet, viste at der var en ”fair” overensstemmelse mellem de spontane og de kunstige koagler. Det betyder, at der er forskel mellem vurderingerne af de 2 typer af koagler, men at denne forskel godt kunne have været større. Wilcoxons rangsumstest viste dog, at der kun var signifikant forskel mellem medianer af det vurderede erythrocytindhold af de 2 typer af koagler. Da vurderingerne var blevet foretaget af projektgruppen, må forskellen i vurderingerne antages at skyldes en forskel i celleindholdet af de 2 typer af koagler. Dette resultat stemmer overens med resultatet fra Side 31 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt afsnittet ”Vurdering af celleindholdet i koaglerne vha. søjlediagrammer” samt understøttes af undersøgelsen foretaget af Jalal et al. (10). 5.6.1. Beregning De vægtede Cohens kappa-koefficienter blev beregnet på hjemmesiden graphpad.com, der er lavet af Graphpad Software Inc. Dette er et firma, der producerer et biomedicinsk statistiksoftware, og som har gjort det muligt at lave simple statistik udregninger på deres hjemmeside. Til at udfører Wilcoxons rangsumstestene blev der anvendt hjemmesiden vassarstats.net. Hjemmesiden er skrevet af Richard Lowry der er professor i psykologi på Vassar College. Hjemmesidens formål er at gøre statistiske beregninger lette og tilgængelige for alle personer, gennem beregningsmulighederne og en online statistiklærebog. Det har ikke været muligt at vurdere hvilken en betydning, anvendelsens af disse hjemmesider, havde for projektets interne validitet, da en vurdering af hjemmesidernes egen validitet ikke har været mulig at finde. 5.7. Diskussion af ”Overensstemmelse mellem vurderinger foretaget af den rutinerede cytobioanalytiker og projektgruppen” Der blev også beregnet en vægtet Cohens kappa-koefficient mellem vurderingerne foretaget af projektgruppen og vurderingerne foretaget af en rutineret cytobioanalytiker. Denne vægtet Cohens kappa-koefficient svarede til, at der var en ”moderat” overensstemmelse mellem vurderingerne. Dette betyder, at overensstemmelsen mellem de vurderinger projektgruppen og de vurderinger cytobioanalytikeren udførte, kunne have været bedre, hvilket svækker projektets interne validitet. En Wilcoxons rangsumstest viste dog, at der ikke er signifikant forskel på medianen af projektgruppens og cytobioanalytikerens vurderinger. Den lille forskel der ses skyldes formodentligt, at den rutineret cytobioanalytiker har mere erfaring i genkendelse af de forskellige celletyper. Dette kan betyde, at der blev vurderet anderledes, da Side 32 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt cytobioanalytikeren havde større indblik i hvor mange celler, der normalt forekommer i disse koagler. 6. Konklusion Formålet med dette projekt er at undersøge forskellen på det celleindhold man fandt i spontant dannede koagler og kunstigt producerede koagler fra serøse pleuravæsker, og derved undersøge om en ny metode skal implementeres. Det konkluderes, at der er en ”fair” overensstemmelse mellem indholdet af de forskellige celletyper, af de 2 typer af koagler, hvilket betyder at der er forskel. Der blev foretaget 37 % (28/75) ønskede vurderinger af de spontane koagler frem for kun 17 % (13/75) af de kunstige. Dette betyder, at man med fordel kan anvende de spontane koagler til diagnosticering af cancer i pleura. Det konkluderes dog også, at der kun blevet fundet signifikant forskel mellem vurderingerne af erythrocytindholdet i de 2 typer af koagler. Det konkluderes, at dette resultat medfører, at der ikke er grund til at implementere ændringer i præparationsmetoden af pleuravæsker indeholdende et spontant koagel, hvorved kvaliteten af udredningen ikke ændres for patienten. Projektets eksterne validitet styrkes, da der er overensstemmelse mellem projektets resultater og resultater fra en anden forskningsbaseret undersøgelse. Dog findes der uoverensstemmelse mellem projektets resultat og andre forskningsbaseret undersøgelser, hvorved projektets eksterne validitet også svækkes, medmindre denne uoverensstemmelse skyldes forskel i præparationsmetode af de kunstige koagler og anvendelsen af andre vurderingskriterier. Grundet overholdensen af projektets inklusions- og eksklusionkriterier, samt at der ikke blevet fundet signifikant forskel på vurderingerne foretaget af projektgruppen og cytobioanalytikeren, blev projektets interne validitet og reliabilitet styrket, og resultatet kan dermed give svar på, hvorvidt der er forskel på celleindholdet mellem de spontane og kunstige koagler. Projektets interne validitet og reliabilitet kunne dog have været bedre, hvis der var blevet anvendt en valideret metode. Desuden blev metodens interne validitet svækket af, at der var blevet anvendt de rutinemæssige procedure, frem for procedurer der blev understøttet af mest empirisk evidens. Derudover svækkes reliabiliteten af, at der Side 33 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt kun blev fundet en ”moderat” overensstemmelse mellem vurderingerne fortaget af projektgruppen og den rutinerede cytobioanalytiker. Der findes på den måde faktorer, der både styrker og svækker resultaternes validitet og reliabilitet. Projektets generaliserbarhed blev sikret ved, at der blev anvendt en kvantitativ beskrivende metode. Dette betyder, at resultat kan overføres til alle pleuravæsker indeholdende spontane koagler, men ikke nødvendigvis de serøse pleuravæsker der ikke indeholder et spontant koagel. 7. Perspektivering I dette afsnit overvejes, hvilke konsekvenser projektets resultater har på det diagnostiske arbejde samt implementeringen og den videre udvikling af emnet. Dette er med henblik på at synliggøre projektets brugbarhed (36, s. 87-88). Resultatet af dette projekt kan anvendes af Patologisk Institutter i hele landet, da resultatet er generaliserbart. Hvis nogle af disse Patologiske Institutter ikke anvender spontane koagler fra pleuravæsker til cancer diagnostik, viser resultatet fra dette projekt, at de med fordel kan begynde at anvende disse. Ved Patologisk Institut på Regionshospitalet Viborg anvendes disse spontane koagler allerede til cancer diagnostikken, hvis pleuravæsken indeholder et sådant koagel. Resultatet af dette projekt viser, at der ikke bør implementeres ændringer i denne fremgangsmåde. Man kunne vælge at producere kunstige koagler på disse prøver alligevel for at sikre, at den korrekte diagnose stilles, da der kun er blevet fundet svag forskel på koaglerne. Da der på den måde ville blive produceret flere kunstige koagler, ville dette dog have økonomiske omkostninger. Det er derfor værd at overveje om fordelene opvejer ulemperne ved dette. Hvis de Patologiske Institutter vælger at implementere ændringer i fremgangsmåden i forhold til diagnosticering af cancer i pleura, vil det dog være relevant at overveje hvilken yderligere viden, der er behov for. Det vil være nødvendigt at igangsætte et større projekt, der bygger på flere ressourcer, for at fastslå den fulde betydning de spontane og kunstige koagler har for diagnostikken af Side 34 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt cancer i pleura. Man ville her kunne anvende en metode baseret på den metode Jalal et al. anvendte i deres undersøgelse (10). Når der findes maligne celler i koaglerne, bliver der oftest udført immunhistocytokemiske undersøgelser på prøven, da disse er essentielle for identifikationen af cancertypen. Dette projekt har dog ikke beskæftiget sig med, hvilken betydning forskellen i de 2 typer koagler kan have på disse immunhistocytokemiske farvninger. Det kunne derfor være relevant af udføre en undersøgelses af dette. Metoden af en sådan undersøgelse kunne være inspireret af undersøgelsen fortaget af Jing et al., der undersøgte præparationsmetodens betydning for cellernes morfologiske udseende og de immunhistocytokemiske farvninger for 3 forskellige typer af celleblokke. (37). Det kunne også være interessant at undersøge den prognostiske anvendelsesmulighed af de spontane og kunstige koagler ved patienter med primær eller sekundær cancer i pleura. Denne undersøgelse kunne baseres på undersøgelsen af Shabaik et al., hvor de undersøgte reliabiliteten af nogle prognostiske immunhistocytokemiske farvninger på forskellige prøver herunder pleuravæsker. (38). Der findes andre metoder til at producere celleblokke samt modificeret versioner af de metoder, der blev anvendt i dette projekt, og det vil derfor være interessant at undersøge, om nogle af disse er bedre til anvendelse ved diagnostik af cancer i pleura. En modificeret version af plasma-thrombin celleblok kunne være metoden undersøgt af Wen et al. Denne metode var en kapsel-baseret plasma-thrombin celleblok, hvor koaglet blev fremstillet i en gelatin kapsel. (39). Side 35 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Referencer 1. Sundhedsstyrelsen.dk, Sundhedsstyrrelsen. Folkesygdomme. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://sundhedsstyrelsen.dk/da/sundhed/folkesygdomme# 2. Sundhed.dk, Rørth M, Hansen-Nord G, Hansen BL. Hvad er kræft?. 2013 (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: https://www.sundhed.dk/borger/sygdomme-aaa/kraeft/om-kraeft/kraeft/ 3. Sundhed.dk, Lange P, Hansen BVL. Pleurapunktur. 2012 (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: https://www.sundhed.dk/borger/sygdomme-aaa/undersoegelser/undersoegelser/oevrige-undersoegelser/pleurapunktur/ 4. Thomsen U. Basisbog i eksfoliativ cytologi: Gynækologisk cytologi, respirationsvejs cytologi, serøse væskers cytologi, urinvejs cytologi. København: Bioanalytikeruddannelsen i København; 2001. 5. Petersen L. 17.3.1. Exudater, pleura- og acitesvæsker. 6. udgave. Patologisk Institut, Hospitalsenhed Midt; 2012. 6. Danske Bioanalytikeres Hovedbestyrelse. Bioanalytikeres Kernefaglighed og Professionsidentitet. 2. udgave. København: Danske Bioanalytikere; 2009. 7. Köksal D, Demırağ F, Bayız H, Koyuncu A, Mutluay N, Berktaş B, et al. The cell block method increases the diagnostic yield in exudative pleural effusions accompanying lung cancer. Türk Patoloji Derg. 2013;29(3):165–70. 8. Kulkarni MB, Desai SB, Ajit D, Chinoy RF. Utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions. Diagn Cytopathol. 2009 Feb;37(2):86–90. 9. Bhanvadia VM, Santwani PM, Vachhani JH. Analysis of diagnostic value of cytological smear method versus cell block method in body fluid cytology: study of 150 cases. Ethiop J Health Sci. 2014 Apr;24(2):125–31. 10. Jalal R, Aftab K, Hasan SH, Pervez S. Diagnostic value of clot examination for malignant cells in serous effusions. Cytopathol Off J Br Soc Clin Cytol. 2009 Aug;20(4):231–4. 11. Sundhedsstyrelsen. Pakkeforløb for lungehindekræft. 1. udgave. København: Sundhedsstyrelsen; 2015. 12. qac.asct.com, American Society for Cytotechnology. What is a Cell Block?. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://qac.asct.com/workbench/cell-blockbasics/204/01 13. Shidham VB, Falzon M. Serous effusions. In: Gray W, Kocjan G, editors. Diagnostic Cytopathology. 3rd ed. London: Chruchill Livingston Elsevier; 2010. Side 36 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 14. Sundhed.dk, Lange P, Hansen BVL. Pleuravæske. 2012 (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: https://www.sundhed.dk/sundhedsfaglig/laegehaandbogen/lunger/symptomer-ogtegn/pleuravaeske/ 15. Sand O, Sjaastad ØV, Haug E, Bjålie JG. Menneskets anatomi og fysiologi. 2. udgave. København: Gads Forlag; 2008. 16. Mescher AL. Junqueira’s Basic Histology : Text and Atlas. 12. udgave. New York, N.Y.: McGraw-Hill Medical; 2010. 17. Vyberg M. Patologi og farmakologi. 3rd ed. København: Munksgaard Danmark; 2010. 18. qac.asct.com, American Society for Cytotechnology. Preparing a Cell Block. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://qac.asct.com/workbench/cell-blockbasics/204/02 19. qac.asct.com, American Society for Cytotechnology. The Plasma-Thrombin Method. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://qac.asct.com/workbench/cellblock-basics/204/12 20. Jelsbak V, Hallager K. Farvning af celler og væv - Noter. 5. udgave. Aarhus: VIA University College Bioanalytikeruddannelsen; 2013. 21. PathologyOutlines.com, Pernick N. Stains - Alcian blue (AB). 2013 (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://www.pathologyoutlines.com/topic/stainsalcianblue.html 22. PathologyOutlines.com, Pernick N. Cervix-cytology - Papanicolaou (Pap) stain. 2011 (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://www.pathologyoutlines.com/topic/cervixcytologypap.html 23. Thisted J. Forskningsmetode i praksis: Projektorienteret videnskabsteori og forskningsmetodik. 1. udgave. København: Munksgaard Danmark; 2010. 24. Kampmann JP, Christensen E. Den randomiserede kliniske undersøgelse. In: Jørgensen T, Christensen E, Kampmann JP, editors. Klinisk forskningsmetode: en grundbog. 3rd ed. København: Munksgaard Danmark; 2011. 25. Statnoter.dk, Bendsen T. Måleskalaer. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://statnoter.dk/index.php?pageID=143 26. Lund H, Røgind H. Statistik i ord. 1. udgave. København: Munksgaard Danmark; 2010. 27. GraphPad.com, GraphPad Software, Inc. QuickCalcs - Quantify agreement with kappa. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://graphpad.com/quickcalcs/kappa1/?K=5 Side 37 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 28. VassarStats.com, Lowry R. Wilcoxon Signed-Rank Test. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://vassarstats.net/wilcoxon.html 29. wma.net, World Medical Association, Inc. WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://www.wma.net/en/30publications/10policies/b3/ 30. Glasdam S, Beedholm K, Dansk Sygeplejeråd. Bachelorprojekter inden for det sundhedsfaglige område: indblik i videnskabelige metoder. 1. udgave. København: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck; 2011. 31. US National Library of Medicine, National Institute of Health. PubMed. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 32. Karolinska Institutet. SveMed+. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://svemedplus.kib.ki.se/Default.aspx 33. OBSCO Industries, Inc. CINAHL Complete. (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: http://web.b.ebscohost.com.ezaaa.statsbiblioteket.dk:2048/ehost/search/advanced?sid=fd73aa5d-7f33-40f3-b993ee52e390fae4%40sessionmgr198&vid=2&hid=101 34. John Wiley & Sons, Inc. http://www.cochranelibrary.com/ Cochrane Library. Tilgængelig på: 35. Sundhed.dk, Lange P, Hansen BL, Rørth M. Mesoteliom. 2013 (Set d. 22. maj 2015). Tilgængelig på: https://www.sundhed.dk/sundhedsfaglig/laegehaandbogen/lunger/tilstande-ogsygdomme/svulster/mesoteliom/ 36. Lindahl M, Juhl C. Den sundhedsvidenskabelige opgave - vejledning og værktøjskasse. 2. udgave. København: Munksgaard Danmark; 2010. 37. Jing X, Li QK, Bedrossian U, Michael CW. Morphologic and immunocytochemical performances of effusion cell blocks prepared using 3 different methods. Am J Clin Pathol. 2013 Feb;139(2):177–82. 38. Shabaik A, Lin G, Peterson M, Hasteh F, Tipps A, Datnow B, et al. Reliability of Her2/neu, estrogen receptor, and progesterone receptor testing by immunohistochemistry on cell block of FNA and serous effusions from patients with primary and metastatic breast carcinoma. Diagn Cytopathol. 2011 May;39(5):328– 32. 39. Wen C-H, Tsao S-C, Su Y-C, Wu C-C, Chai C-Y. Utility of the capsule-based technique for cell block preparation - in body fluids and Liqui-PREPTM specimens. Acta Cytol. 2011;55(5):460–6. Side 38 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilagsfortegnelse Bilag 1 – Materialeliste Bilag 2 - 17.3.1. Exudater, pleura- og acitesvæsker (DDKM 2.8.3) Bilag 3 – Vurderingsskema til vurdering af cellemængden i prøverne Bilag 4 – Vurderingsskema til vurdering af celleindhold i koagler Bilag 5 – Søgeord fundet ved bevidst tilfældig søgning Bilag 6 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på PubMed Bilag 7 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på SveMed+ Bilag 8 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på CINAHL Complete Bilag 9 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på Cochrane Library Bilag 10 – Relevante artikler fundet på PubMed Bilag 11 - Vurdering af cellemængde i prøverne Bilag 12 – Vurdering af celleindhold i koaglerne Bilag 13 - Vurdering af koagel opdelt efter cellemængden i prøverne Bilag 14 – Fordeling af de forskellige vurderinger delt op efter cellemængde Bilag 15 – Den centrale tendens og fordelingsbredden delt op efter cellemængde Bilag 16 - Vægtede Cohens kappa-koefficienter delt op efter cellemængde Bilag 17 - Wilcoxons rangsumstests delt op efter cellemængde Bilag 18 - Vægtet Cohens kappa-koefficient og Wilcoxons rangsumstest mellem vurderingerne fortaget af projektgruppen og cytobioanalytiker Side 39 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 1 – Materialeliste I dette bilag fremgår en liste over de materialer, der er blevet anvendt til projektet herunder reagenser, utensilier og apparatur. Reagenser: Pleuravæsker indeholdende et spontant koagel fra Regionshospitalet Viborg og Regionshospitalet Silkeborg Mayers sure hamotoxylin Patient plasma fra Regionshospitalet Viborg Thrombin fra bovin plasma 10 % neutralt bufferet formalin Utensilier: Vævsindstøbnings kassetter Tissue Specimen Bags Engangspipetter Superfrost® Super objektglas Objektglas Træpinde Farvevugge Fæces skåle Apparatur: Labelprinter Rotofix 32 (Centrifuge) Lysmikroskop Side 40 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 2 - 17.3.1. Exudater, pleura- og acitesvæsker (DDKM 2.8.3) 17.3.1. Exudater, pleura- og acitesvæsker (DDKM 2.8.3) Udgiver Hospitalsenhed Midt > Patologisk Institut Fagligt ansvarlig Lis Petersen/LPETER/RegionMidtjylland Version 6 Kvalitetsansvarlig Malene Kloster Graversen/MALGRA/RegionMidtjylland Gældende fra 04-12-2012 Ledelsesansvarlig Lis Lykke Gregersen/LISLGR/RegionMidtjylland Næste revision 29-11-2015 Ændringskommentar intet Formål Patientgruppe/Patientforløb/Anden målgruppe Definition af begreber Fremgangsmåde Dokumentation Ansvar Referencer Formål Laboratorieprocedure til præparering af serøse væsker Tilbage til top Patientgruppe/Patientforløb/Anden målgruppe Bioanalytikere, Patologisk Institut, Regionshospital Viborg Tilbage til top Definition af begreber Ingen Tilbage til top Fremgangsmåde Eksudater – prøvetype: 1CEX Prøven modtages ufikseret i 100 ml. præp.glas med blåt skruelåg Makrobeskrivelse og etiketter Patologisystemet 1 Scan mikr.nummer Oversigt/klarmeld 2 Beskrivelse af mængde, farve, konsistens Præp.makro og evt. koagel HUSK Gem Sign STATUS Makre 3 Udskriv etiketter 4 MGG og PAP på coatede glas plastikbakker 5 HE og PAB på alm. objektglas papbakker Hvis der er spontant koagel 1 Anbring koaglet i en pose, tilsæt 1 dråbe methylviolet 17.3.1. Exudater, pleura- og..., version 6. Udskrevet: 15-04-2015 af Anonymous Side 41 af 62 1 af 3 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 2 Posen foldes og anbringes i gul biopsikassette mrk. med mikr.nr 3 Kassetten anbringes i fæcesæske med formalin 4 Fæcesæske/kassetten sættes i udskæringsbordet Rum: udskæring 5 Papbakken med HE og PAB glas sættes i rød bakke (farvninger) Rum: skæreriet 6 Restmaterialet hældes tilbage i præp.glas Centrifugering og udstrygninger 1 1900 omdrejninger i 10 min 2 Supernatanten afpipetteres i fæcesæske 3 Af bundfaldet fremstilles 2 udstrygninger 4 MGG lufttørres 5 PAP tørres let og fikseres i 96 % alkohol i 10 min Rotofix Fremstilling af kunstigt koagel 1 Resterende bundfald tilsættes 2-3 dråber plasma, rystes let frys - rum: skærelab 2 Derefter tilsættes 3-4 dråber trombin, rystes let frys – rum: skærelab 3 Henstår 30 min 4 Behandles efterfølgende som spontant koagel Farvning og montering 1 PAP farve i farvemaskine Farvelab 3 Monteres i maskine program 2 Farvelab 4 MMG farves efter forskrift Farvelab. 5 Monteres i maskine program 2 Afslutning 1 De farvede glas KLAR meldes på glasniveau (patologisystemet) Oversigt/klarmeld 2 De farvede glas stilles i det høje skab cytlab 3 Restmateriale i vævsdepot Tilbage til top Dokumentation 17.3.1. Exudater, pleura- og..., version 6. Udskrevet: 15-04-2015 af Anonymous Side 42 af 62 2 af 3 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Patologisystemet Tilbage til top Ansvar Bioanalytikere på alle kompetenceniveauer Tilbage til top Referencer Ingen Tilbage til top 17.3.1. Exudater, pleura- og..., version 6. Udskrevet: 15-04-2015 af Anonymous Side 43 af 62 3 af 3 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 3 – Vurderingsskema til vurdering af cellemængden i prøverne Dette bilag består af det vurderingsskema, der blev anvendt af projektgruppen til vurdering af cellemængden i de forskellige prøver Prøve nr. Mesotelceller og makrofager Erythrocytter Leukocytter Cancerceller 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 … 25 Tabel B3.1: Vurderingsskema til vurdering af cellemængden i prøverne. Side 44 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 4 – Vurderingsskema til vurdering af celleindhold i koagler Dette er vurderingsskemaet projektgruppen anvendte til at vurdering af celleindholdet koaglerne. Prøv e nr. Mesotelceller og makrofager Sponta Kunsti nt gt Erythrocytter Sponta nt Kunsti gt Leukocytter Sponta nt Kunsti gt Cancerceller Sponta nt Kunsti gt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 … 25 Tabel B4.1: Vurderingsskema til vurdering af celleindhold i koaglerne. Side 45 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 5 – Søgeord fundet ved bevidst tilfældig søgning I dette bilag fremgår hvordan de søgeord, der er blevet anvendt til projektets systematiske litteratursøgning, blev fundet. Emneord Fundet ved: Pleural Effusions (MeSH-term) Ved at søge på ”Pleural effusions” i MeSHterm databasen på PubMed. Pleural Effusuins, Malignant (MeSH-term) Ved at søge på ”Pleural effusions” i MeSHterm databasen på PubMed. Pleural fluid Oversættelse af pleuravæske Cell block Det blev forslået når man søgte på ”Plasma thrombin” på google. Clot* Clot section* Nogle artikler anvendet denne form i stedt for formen uden bindestreg Oversættelse af koagel Blev fundet i relevante artikler Specimen Handling (MeSH-term) Fundet I MeSH-termerne fra relevante artikler Cytological Techniques (MeSH-term) Fundet I MeSH-termerne fra relevante artikler Cytodiagnosis (MeSH-term) Fundet I MeSH-termerne fra relevante artikler Cell-block Tabel B5.1: Tabel over anvendte søgeord til systematisk søgning, og hvordan de er fundet. Side 46 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 6 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på PubMed I dette bilag fremgår søgehistorikken for den systematiske litteratursøgning, der blev udført på PubMed. Disse søgninger blev udført med filtrene: Udgivet inden for de sidste 10 år, mennesker og engelsk. Search #1 #2 #3 Query ""Pleural Effusion""[Mesh] ""Pleural Effusion, Malignant""[Mesh] pleural fluid ((""Pleural Effusion""[Mesh]) OR ""Pleural Effusion, Malignant""[Mesh]) OR pleural fluid Items found 3.817 1.122 2.105 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 cell block cell-block clot* clot section* "Search (((cell block) OR cell-block) OR clot*) OR clot section* ""Specimen Handling""[Mesh] ""Cytological Techniques""[Mesh] ""Cytodiagnosis""[Mesh] 15.698 409 14.514 10 30.164 82.861 261.011 69.354 #13 ((""Specimen Handling""[Mesh]) OR ""Cytological Techniques""[Mesh]) OR ""Cytodiagnosis""[Mesh] 273.660 #14 (((((""Pleural Effusion""[Mesh]) OR ""Pleural Effusion, Malignant""[Mesh]) OR pleural fluid)) AND ((((cell block) OR cell-block) OR clot*) OR clot section*)) AND (((""Specimen Handling""[Mesh]) OR ""Cytological Techniques""[Mesh]) OR ""Cytodiagnosis""[Mesh]) 43 #4 4,705 Tabel B6.1: Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på PubMed. Side 47 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 7 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på SveMed+ Søgehistorikken fra den systematiske litteratursøgning på SveMed+. Ved fri-tekst søgningerne er de engelske ord anvendt, men der er så vidt muligt også forsøgt at finde nordiske alternativer. Nr Söksträng Antal träffar Tid 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 exp:"Pleural Effusion" exp:"Pleural Effusion, Malignant" pleural fluid pleuravätska pleuravaeske #1 OR #2 OR #3 OR #4 OR #5 cell block cell-block celleblok clot* koagel* propp* clot section* vævssnit* vevssnit* vävnadssnit* 39 5 3 8 3 44 9 5 0 177 1 4 0 0 0 3 2015-05-15 11:31:03 2015-05-15 11:31:17 2015-05-15 11:31:43 2015-05-15 11:33:54 2015-05-15 11:34:16 2015-05-15 11:35:09 2015-05-15 11:38:54 2015-05-15 11:39:01 2015-05-15 11:40:47 2015-05-15 11:41:01 2015-05-15 11:41:32 2015-05-15 11:41:41 2015-05-15 11:42:10 2015-05-15 11:43:05 2015-05-15 11:43:15 2015-05-15 11:43:32 17 #7 OR #8 OR #9 OR #10 OR #11 OR #12 OR #13 OR #14 OR #15 OR #16 194 2015-05-15 11:44:09 18 19 20 21 22 exp:"Specimen Handling" exp:"Cytological Techniques" exp:"Cytodiagnosis" #18 OR #19 OR #20 #6 AND #17 AND #21 883 939 500 1314 0 2015-05-15 11:45:38 2015-05-15 11:45:54 2015-05-15 11:46:10 2015-05-15 11:46:26 2015-05-15 11:47:04 Tabel B7.1: Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på SveMed+. Side 48 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 8 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på CINAHL Complete I dette bilag fremgår søgehistorikken fra den systematiske litteratursøgning foretaget i databasen CINAHL Complete. # S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 Query (MH "Pleural Effusion") (MH "Pleural Effusion, Malignant") Limiters/Expanders Search modes – Phrase Results 1,725 Search modes – Phrase 343 pleural fluid S1 OR S2 OR S3 cell block cell-block clot* clot section* S5 OR S6 OR S7 OR S8 (MH "Specimen Handling") (MH "Cytological Techniques") (MH "Cytodiagnosis") S10 OR S11 OR S12 S4 AND S9 AND S13 Search modes – Phrase Search modes – Phrase Search modes – Phrase Search modes – Phrase Search modes – Phrase Search modes – Phrase Search modes – Phrase Search modes – Phrase 443 2,194 106 39 10,620 7 10,726 5,335 Search modes – Phrase 1,864 Search modes – Phrase Search modes – Phrase Search modes – Phrase 598 7,653 3 Tabel B8.1: Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på CINAHL. Side 49 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 9 – Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på Cochrane Library Her fremgår søgehistorikken fra den systematiske litteratursøgning, der blev foretaget på Cochrane Library. ID #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 Search MeSH descriptor: [Pleural Effusion] explode all trees Hits 269 MeSH descriptor: [Pleural Effusion, Malignant] explode all trees pleural fluid #1 or #2 or #3 cell block cell-block clot* clot section* #5 or #5 or #7 or #8 MeSH descriptor: [Specimen Handling] explode all trees 101 288 463 1,317 27 5,691 276 6,840 6563 #11 MeSH descriptor: [Cytological Techniques] explode all trees 15,856 #12 MeSH descriptor: [Cytodiagnosis] explode all trees 5,248 #13 #14 #10 or #11 or #12 #4 and #9 and #13 17,138 2 Tabel B9.1:Søgehistorik fra systematisk litteratursøgning på Cochrane Library. Side 50 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 10 – Relevante artikler fundet på PubMed Liste over relevante artikler fundet ved systematisk litteratursøgning på PubMed. 1: Bhanvadia VM, Santwani PM, Vachhani JH. Analysis of diagnostic value of cytological smear method versus cell block method in body fluid cytology: study of 150 cases. Ethiop J Health Sci. 2014 Apr;24(2):125-31. PubMed PMID: 24795513; PubMed Central PMCID: PMC4006206. 2: Jing X, Li QK, Bedrossian U, Michael CW. Morphologic and immunocytochemical performances of effusion cell blocks prepared using 3 different methods. Am J Clin Pathol. 2013 Feb;139(2):177-82. doi: 10.1309/AJCP83ADULCXMAIX. PubMed PMID: 23355202. 3: Köksal D, Demırağ F, Bayız H, Koyuncu A, Mutluay N, Berktaş B, Berkoğlu M. The cell block method increases the diagnostic yield in exudative pleural effusions accompanying lung cancer. Turk Patoloji Derg. 2013;29(3):165-70. doi: 10.5146/tjpath.2013.01184. PubMed PMID: 24022305. 4: Ghosh I, Dey SK, Das A, Bhattacharjee D, Gangopadhyay S. Cell block cytology in pleural effusion. J Indian Med Assoc. 2012 Jun;110(6):390-2, 396. PubMed PMID: 23360042. 5: Shabaik A, Lin G, Peterson M, Hasteh F, Tipps A, Datnow B, Weidner N. Reliability of Her2/neu, estrogen receptor, and progesterone receptor testing by immunohistochemistry on cell block of FNA and serous effusions from patients with primary and metastatic breast carcinoma. Diagn Cytopathol. 2011 May;39(5):328-32. doi: 10.1002/dc.21389. PubMed PMID: 21488175. 6: Wen CH, Tsao SC, Su YC, Wu CC, Chai CY. Utility of the capsule-based technique for cell block preparation - in body fluids and Liqui-PREP™ specimens. Acta Cytol. 2011;55(5):460-6. doi: 10.1159/000330674. Epub 2011 Oct 8. PubMed PMID: 21986175. 7: Jalal R, Aftab K, Hasan SH, Pervez S. Diagnostic value of clot examination for malignant cells in serous effusions. Cytopathology. 2009 Aug;20(4):231-4. doi: 10.1111/j.1365-2303.2008.00577.x. Epub 2009 Jul 8. PubMed PMID: 18627403. Side 51 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt 8: Kulkarni MB, Desai SB, Ajit D, Chinoy RF. Utility of the thromboplastin-plasma cellblock technique for fine-needle aspiration and serous effusions. Diagn Cytopathol. 2009 Feb;37(2):86-90. doi: 10.1002/dc.20963. PubMed PMID: 19021217. Side 52 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 11 - Vurdering af cellemængde i prøverne Rådata fra vurdering af cellemængden i prøverne der indgik i projektet. Beskrivelse Lav cellemængde Medium cellemængde Tegn ○ ○○ Beskrivelse Høj cellemængde Ikke vurderet Tegn ○○○ IV Tabel B11.1: Oversigt over tegnforklaring. Prøve nr. Mesotelceller og Makrofager Erythrocytter Leukocytter Cancerceller 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 ○○ ○ ○ ○ ○ ○ IV ○○ ○○○ ○○ ○○ ○ ○○ ○○ ○ ○ ○○○ ○ ○ ○○ ○ ○○ ○ ○ ○ ○○ ○ ○○ ○ ○ ○ ○○ ○○ ○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○ ○○ ○ ○○ ○○ ○○○ ○○ ○○○ ○ ○○○ ○○○ ○○ ○ ○○ ○○ ○ ○ ○ ○ ○ ○○ ○○ ○ ○○○ ○○ ○ ○ ○○○ ○○ ○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ ○○ IV IV IV IV IV IV ○ IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV IV Tabel B11.2: Rådata over cellemængden i prøverne. Side 53 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 12 – Vurdering af celleindhold i koaglerne Rådata fra vurdering af celleindhold i de spontane og kunstige koagler. Beskrivelse Ingen celler i koagel, men celler i prøve Flere celler i koagel end i prøve Tegn Ø + Beskrivelse Færre celler i koagel end i prøve Mange flere celler i koagel end i prøve Tegn ++ Beskrivelse Lige mange celler i koagel og prøve Tegn Ikke vurderet IV / Tabel B12.1: Oversigt over tegnforklaring. Mesotelceller og Erythrocytter Leukocytter Cancerceller makrofager Prøve nr. Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt 1 / / ++ + IV 2 ++ + Ø / + + IV 3 / / / / IV 4 / IV 5 / / Ø / ++ / IV 6 ++ + + + ++ IV 7 IV ++ ++ + + ++ + 8 + + / / IV 9 Ø / / / IV 10 / Ø / / IV 11 + Ø / / / IV 12 + / + / + IV 13 / / IV 14 Ø / + / IV 15 / / / / IV 16 ++ + / + / / IV 17 / / / / / / IV 18 + / ++ ++ ++ ++ IV 19 / / + + + / IV 20 / / / / IV 21 + / + + + + IV 22 / + / / IV 23 / / / / / / IV 24 Ø Ø / / / / IV 25 / / / / IV Tabel B12.2: Rådata fra vurdering af celleindhold i koaglerne. Side 54 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 13 - Vurdering af koagel opdelt efter cellemængden i prøverne Rådata fra vurdering af celleindholdet i koaglerne, opdelt efter rådata fra vurdering af cellemængden i prøverne. Beskrivelse Tegn Ingen celler i koagel, men celler i prøve Ø Færre celler i koagel end i prøve - Lige mange celler i koagel og prøve / Beskrivelse Flere celler i koagel end i prøve Mange flere celler i koagel end i prøve Ikke vurderet Anden cellemængde i prøven Tegn + ++ IV AC Tabel B13.2: Oversigt over tegnforklaring. Lav cellemængde Prøve nr. 2 3 4 5 6 7 8 9 12 15 16 17 18 19 21 23 24 25 Mesotelceller og Erythrocytter Leukocytter Cancerceller makrofager Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt ++ + Ø / + + IV / / AC AC IV AC IV / / Ø / ++ / IV ++ + + + ++ IV IV AC + + ++ + AC AC / / IV AC Ø / / / IV + / AC + IV / / / / IV ++ + AC / / IV AC / / AC IV + / AC AC IV / / AC + / IV + / AC AC IV / / / / AC IV Ø Ø AC AC IV / AC AC IV Tabel B13.3: Rådata fra vurdering af celleindholdet i koaglerne, fra prøverne med lav cellemængde. Side 55 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Medium Mesotelceller og Erythrocytter Leukocytter Cancerceller cellemængde makrofager Prøve nr. Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt 1 / / ++ + IV 3 AC / / IV 4 AC AC / IV 7 AC ++ ++ AC IV 8 + + AC IV 10 / Ø / / IV 11 + Ø / / / IV 12 AC + / AC IV 13 / / AC IV 14 Ø / ++ / IV 16 AC / + AC IV 18 AC ++ ++ ++ ++ IV 19 AC + + AC IV 20 / / AC / IV 21 AC + + + + IV 22 / + AC / IV 23 AC AC / / IV 24 AC AC / / IV 25 AC AC / IV Tabel B13.4: Rådata fra vurdering af celleindholdet i koaglerne, fra prøverne med medium cellemængde. Høj cellemængde Prøve nr. 9 13 17 20 22 24 25 Mesotelceller og makrofager Erythrocytter Leukocytter Cancerceller Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt Spontant Kunstigt AC AC IV AC AC IV / / AC / / IV AC / AC IV AC / AC IV AC / / AC IV AC / / AC IV Tabel B13.5: Rådata fra vurdering af celleindholdet i koaglerne, fra prøverne med høj cellemængde. Side 56 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 14 – Fordeling af de forskellige vurderinger delt op efter cellemængde Fordelingen af vurderingerne af koaglernes celleindhold ved de forskellige cellegrupper opdelt efter cellemængden i prøverne. Mesotelceller og makrofager ++ + / - Ø 12 11 8 3 4 5 4 6 5 2 2 33 11 0 Spontant Alle Kunstigt Alle 4 3 2 0 1 0 2 1 1 Spontant - Kunstigt - Lav Spontant Lav Medium 2 3 2 0 1 Kunstigt Medium 00 11 0 00 11 0 Spontant - Kunstigt - Høj Høj Figur B14.1: Søjlediagram over fordelingen af de forskellige vurderingen af mesotelcelle- og makrofagindholdet i de spontane og kunstige koagler. Forekomsterne er opdelt i forskellige niveauer af cellemængde i prøven, samt en samlet gruppe. Erythrocytter ++ + / - Ø 15 9 6 4 4 2 6 5 2 3 0 Spontant Alle Kunstigt Alle 0 1 22 3 5 2 00 2 0 3 2 55 1 Spontant - Kunstigt - Lav Spontant Lav Medium 2 4 1 22 0 Kunstigt Medium 00 0 00 00 Spontant - Kunstigt - Høj Høj Figur B14.2: Søjlediagram magen til søjlediagrammet fra figur B14.1, blot med vurdering af indholdet af erythrocytter frem for mesotelceller og makrofager. Side 57 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Leukocytter ++ + / - Ø 15 9 6 8 7 4 3 6 5 4 3 2 0 0 Spontant Alle Kunstigt Alle 1 1 0 1 2 55 1 2 0 1 0 Spontant - Kunstigt - Lav Spontant Lav Medium 1 2 2 0 Kunstigt Medium 00 11 0 00 11 0 Spontant - Kunstigt - Høj Høj Figur B14.3: Søjlediagram magen til søjlediagrammet fra figur B14.1, blot med vurdering af indholdet af leukocytter frem for mesotelceller og makrofager. Cancerceller ++ 1 0000 Spontant Alle 0 1 000 Kunstigt Alle 1 0000 0 1 + 000 / - Ø 00000 00000 00000 00000 Spontant - Kunstigt - Lav Spontant Lav Medium Kunstigt Medium Spontant - Kunstigt - Høj Høj Figur B14.4: Søjlediagram magen til søjlediagrammet fra figur B14.1, blot med vurdering af indholdet af cancerceller frem for mesotelceller og makrofager. Side 58 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 15 – Den centrale tendens og fordelingsbredden delt op efter cellemængde I dette bilag fremgår de beregnede medianer og 95 %-percentiler, opdelt efter cellegruppe og forskellige cellemængder i prøverne. Mesotelceller og makrofager Alle cellemængde Lav cellemængde Medium cellemængde Høj cellemængde Median 95 %-percentil Median 95 %-percentil Median 95 %-percentil Median 95 %-percentil Erythrocytter Spontant koagel Kunstigt koagel Spontant koagel Kunstigt koagel / Ø til ++ / Ø til ++ / Ø til + / - til / / Ø til + / Ø til + / Ø til + / - til / Ø til ++ Ø til + / Ø til ++ / - til / / - til ++ / - til / + - til ++ / / Tabel B15.2: Tabel over median og 95 %-percentil af de forskellige vurderinger der er blevet foretaget af henholdsvis mesotelcelle- og makrofag- samt erythrocytindholdet i de spontane og kunstige koagler, opdelt efter prøvernes forskellige niveauer af cellemængde. Leukocytter Alle cellemængde Lav cellemængde Medium cellemængde Høj cellemængde Median 95 %-percentil Median 95 %-percentil Median 95 %-percentil Median 95 %-percentil Cancerceller Spontant koagel Kunstigt koagel Spontant koagel Kunstigt koagel / - til ++ + - til ++ / - til ++ / - til / / - til ++ / - til ++ / - til ++ / - til / ++ + ++ + Tabel B15.3: Tabel over median og 95 %-percentil magen til tabel B15.1, blot for leukocytter og cancerceller i stedet. Side 59 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 16 - Vægtede Cohens kappa-koefficienter delt op efter cellemængde Se separat Excel fil ”Bilag 16-18”. Side 60 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 17 - Wilcoxons rangsumstests delt op efter cellemængde Se separat Excel fil ”Bilag 16-18”. Side 61 af 62 Kristoffer Søndergaard Vinter ([email protected]) VIA University College – Bioanalytikeruddannelsen i Aarhus Modul 14 Bachelorprojekt Bilag 18 - Vægtet Cohens kappa-koefficient og Wilcoxons rangsumstest mellem vurderingerne fortaget af projektgruppen og cytobioanalytiker Se separat Excel fil ”Bilag 16-18”. Side 62 af 62
© Copyright 2024