1. No category

Angelica Sahlin
Karlstads universitet
Identifiering av molekyler med förmåga att modulera aktivitet hos
indolamin-2,3-dioxygenas 1
Indolamin-2,3-dioxygenas 1 (IDO1) är ett enzym med immunreglerande effekter. IDO1
katalyserar degraderingen av den essentiella aminosyran tryptofan via kynurenine pathway.
När tryptofan bryts ner bildas metaboliter, s.k. kynureniner, som inducerar immuntolerans.
Enzymet består av en non-katalytisk domän och en katalytisk domän och innehåller två
immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs (ITIMs), dessa kan antingen mediera
proteasomal degradering av IDO1, vilket leder till immunogent respons, eller IDO1signalering, vilket leder till immuntolerans.
IDO1 är en av huvudorsakerna till resistens vid neoplasi och virusinfektioner men det är
även involverat i autoimmuna sjukdomar så som diabetes. Av den anledningen söker man
efter olika sätt att inhibera eller förstärka dess uttryck och aktivitet. Ett flertal molekyler
undersöktes därför i denna studie med avseende på deras förmåga att modulera IDO1aktivitet.
P1-tumörceller, transfekterade med wild-type IDO1 (wtIDO1) eller med IDO1 muterad i båda
sina ITIMs- domäner (IDO1 Y115FY253F), behandlades med fjorton olika molekyler varefter
påverkan av kynureninproduktion och celltoxicitet utvärderades. Mutationen gör så att ITIMs
inte kan fosforyleras och binda proteiner (SOCS3, SHPs), därmed kan ingen IDO1degradering eller signalering ske.
Analys av kynureninproduktionen visade att ett antal molekyler hade förmåga att förändra
den katalytiska aktiviteten hos IDO1. Resultat från cellräkningen visade att vissa molekyler
var toxiska och de uteslöts därför från vidare analys. Fyra molekyler valdes ut för bestämning
av IC50, ett mått på hur mycket av en inhibitorsubstans som behövs för att nå 50 % inhibition.
Detta värde bör inte vara alltför högt eftersom det reflekterar dålig effektivitet. Som
föregående analys i den här studien, visade IC50-värdena för molekyl 110 att den hade
förmåga att inhibera den enzymatiska aktiviteten hos IDO1 Y115FY253F men inte wtIDO1, till
skillnad från övriga molekyler.
Effekten av molekyl 110 studerades ytterligare med avseende på gen- och proteinuttryck.
Plasmacytoida dendritceller (pDCs) som naturligt uttrycker IDO1 behandlades med molekyl
110 varefter uttrycket av Ido1- genen analyserades, resultatet visade att genuttrycket
uppreglerades av molekyl 110. En del celler användes också för analys av proteinuttryck.
Angelica Sahlin
Karlstads universitet
Kontrollen visade normalt IDO1- proteinuttryck medan cellerna behandlade med molekyl 110
visade förstärkt proteinuttryck.
Tre av molekylerna (103, 112, 115) utvalda för IC50- bestämning var inte bra på att
diskriminera mellan wtIDO1 och IDO1 Y115FY253F och agerade på ett liknande sätt
oberoende av intakt signaleringsfunktion. Molekyl 110 var den enda som visade på en tydlig
skillnad i den aspekten. Att molekyl 110 inhiberade IDO1 Y115FY253F men inte wtIDO1 tyder
på den non-katalytiska domänen (innehåller ITIM), som var fullt fungerande i wtIDO1,
påverkades på något sätt. Om molekylen hade involverat enbart den katalytiska domänen
borde kynureninproduktionen hos wtIDO1 också reducerats precis som hos IDO1 Y115FY253F.
Det är möjligt att molekyl 110, genom bindning av IDO1, inducerade en
konformationsändring som ledde till ITIM-bindning av proteiner. Interaktioner mellan ITIMs
och SHPs var troligen favoriserande eftersom bindning av SOCS3 skulle resultera i
proteasomal IDO1-degradering och minskade kynureninnivåer. Ökningen av gen- och
proteinuttryck inducerat av molekyl 110 stärker hypotesen om konformationsändring som
gynnar SHPs-bindning eftersom detta leder till uppreglerat Ido1 uttryck, vilket kunde ses i
pDCs i den här studien.
Sammanfattningsvis indikerar data från dessa experiment att molekyl 110 alltså kan modulera
signaleringsfunktionen hos IDO1 in vitro vilket leder till ökat enzymuttryck. Ytterligare
analyser av TGF-β och IFN-α/β borde utföras för att se om de är ökade vilket skulle stärka
hypotesen ännu mer. Det är också nödvändigt att studera om molekylen har IDO1-medierade
immunosuppressiva effekter i experimentella in vivo- modeller av autoimmunitet och/eller
kronisk inflammation, vilket är troligt då IDO1/SHPs-signalering inducerar immuntolerans.