Tillåter smart design
kristallografins år 2014 Tillåter smart design [Av Elisabeth Sauer-Eriksson, Kemiska Institutionen, Umeå universitet, Anders Liljas, Institutionen för biokemi och strukturbiologi, Lunds universitet, Helena Käck, Discovery Sciences, AstraZeneca R&D, Mölndal] Hur och varför binder målprotein och förhoppningsfull läkemedelsmolekyl till varandra? Den frågan kan den snabbt växande makromolekylära kristallografin svara på. M akromolekylär kristallografi har genomgått en fantastisk utveckling sedan metoden på allvar började tillämpas i slutet av 1960-talet. Under de senaste 2030 åren har antalet deponerade strukturer i proteindatabanken ökat exponentiellt. En milstolpe värd att nämna passerades i maj 2014 då struktur nummer 100 000 publicerades i proteindatabanken (www.rcsb.org). Redan vid analysen av de allra första proteinstrukturerna stod det klart att även små molekyler bundna till proteiner kan påvisas. De allra första icke-proteinmolekylerna som identifierades från en proteinkristallstruktur var hem-gruppen, bunden till hemoglobin och myoglobin, och allteftersom proteinstrukturernas upplösning och kvalitet förbättrades kunde även mindre molekyler som vatten och enatomjoner identifieras. Intressant är att man redan på 70-talet började använda hemoglobinstrukturen som mall för att utforma nya hem-liknande molekyler med funktion att stabilisera proteinet, ett exempel på tidig strukturbaserad design [1]. I Sverige var karboanhydras det första proteinet som strukturbestämdes med röntgenkristallografi [2]. Proteinet är involverat i flera sjukdomar och den första strukturen har följts upp av ett antal strukturer av proteinet i komplex med olika inhibitorer, varav några idag är läkemedel som används bl a för behandling av epilepsi och glaukom. På 80- och 90-talet utvecklades kristallografin allt snabbare med etablering av nya synkrotroner, mätningar vid låg temperatur (100 K), snabbare detektorer och ökad datorkapacitet. Istället för att ta år kunde nu strukturer bestämmas inom månader. Parallellt utvecklades även andra discipliner som organisk syntes och beräkningskemi. Samtidigt började nya angreppssätt och koncept etableras inom läkemedelsindustrin, t ex identifiering av nya mediciner baserad på s k high throughput screening (HTS), med stort fokus på förståelse av substansernas verkningsmekanism, mode-of-action. Under 90-talet satsade både Astra och Pharmacia, Sveriges ledande läkemedelsföretag, på kompetens inom strukturbaserad läkemedelsdesign där proteinkristallografi spelar en avgörande roll. AstraZeneca är fortfarande verksamma i Sverige och ett av företagets center för strukturbaserad läkemedelsutveckling ligger i Mölndal. Konceptet läkemedelsdesign innefattar flera moment: identifiering av målprotein kopplat till den sjukdom man avser att behandla; identifiering av startmolekyler med intressanta kemiska egenskaper; optimering – där ett mindre antal kemiska startmolekyler väljs för utveckling till mer läkemedelslika molekyler (se Lipinskis fem regler) – leads; lead optimering där man optimerar egenskaper och effekt hos ett fåtal utvalda molekyler samt candidate selection där den slutgiltiga molekylen som går vidare in i kliniska prövningar väljs ut. Förhoppningen är positiva resultat vad gäller både klinisk effekt och säkerhet och att molekylen ska nå marknaden som en ny effektiv behandlingsmetod för patienter. Figur 1. Ett exempel på fragmentbaserad lead-generering för proteinet HSP90 utfört av Astex Pharmaceuticals. En av de tidiga startmolekylerna identifierade i en screening av 1600 fragment visas bunden till HSP90 i figur 1a, Kd=790μM. Figur 1b illustrerar hur en vätebindning till en aspartat sidokedja (Asp) har bildats genom att en hydroxylgrupp adderats till molekylen (1). Samtidigt har metoxygruppen ersatts av en grenad butyl som bättre interagerar med de hydrofoba sidokedjorna (2). Slutligen har de flexibla etylgrupperna ersatts av en indolgrupp (3). Kd= 0.54 nM. Figur 1c visar hur molekylens egenskaper har modulerats genom addition av en metylerad piperazinring som inte direkt interagerar med proteinet. Affiniteten för HSP90 påverkas inte nämnvärt denna modifikation. Kd=0.70 nM. Denna molekyl är i klinisk fas där den testas för lungcancer och melanom. Figurerna är baserade på pdbkoderna 2xdl, 2xab och 2xjx. 20 Kemivärlden Biotech med Kemisk Tidskrift. Nr 7-8 Juli/Augusti 2014 Styrkan med proteinkristallografi i läkemedelsdesign är att man i detalj kan studera bindningen mellan målproteinet och den kemiska molekylen (substansen). Det öppnar för ökad förståelse av interaktioner mellan protein och substans, t ex vilka kemiska element i substansen som är kritiska för bindning och vilka som kan förbättras eller helt enkelt kan uteslutas och påverkar på så sätt riktningen av den medicinska kemin i ett projekt. Typiska applikationer av strukturell information inom läkemedelsdesign kan vara: • Optimera affinitet för en kemisk substans till målproteinet t ex. genom att möjliggöra nya vätebindningar eller hydrofoba interaktioner och anpassa formen av substansen till proteinets bindningsficka (Figur 1a,b). Bindningspotens är viktigt för att kunna minimera dosen av läkemedel och därmed också risken för bieffekter. • Optimera selektivitet över besläktade proteiner genom att fokusera på element som är distinkta för målproteinet och bygga in element som förhindrar bindning till besläktade proteiner. Selektivitet är viktigt för att undvika oönskade toxiska sidoeffekter. • Överlagring av flera kristallstrukturer möjliggör design av hybrider där man kombinerar de bästa elementen från olika kemiska substanser (scaffold hopping). Det ger ofta upphov till nya startmolekyler, ökar möjligheten att optimera substanserna för det givna målproteinet och kan vara betydelsefullt i patentsammanhang. • En lead molekyl måste ofta modifieras för t ex ökad biotillgänglighet, löslighet eller livslängd, alternativt för att undvika kemiska motiv som medför toxicitet. Strukturinformation kan vägleda modifieringarna så att de inte ger negativ effekt på bindningspotensen (Figur 1c). Det finns många alternativa tillvägagångssätt för identifiering av startmolekyler idag, typiskt används HTS där substansbibliotek med hundratusentals olika kemiska föreningar testas mot ett visst målprotein. Ett alternativ eller komplement till HTS som har utvecklats sedan början av 2000-talet är fragmentbaserad lead-generering (FBLG). Principen utgår från screening av ett begränsat substansbibliotek med fragment (molekyler med vikt < 300 Da) i en assay med hög känslighet. Figur 1. En dimer av HIV-proteas (rosa och turkos) med Nelfinavir, det första icke peptidlika HIV-läkemedlet, bundet. Den katalytiska asparaginsyran är markerad i strukturen (Asp resp. Asp’). Nelfinavir, här visad som van der Waals-sfär, binder till aktiva ytan på proteinet och blockerar dess aktivitet. Figuren är baserad på pdbkoden 1ohr. Fragment kan sedan expanderas stegvis för att öka affiniteten mot målproteinet, samtidigt som önskvärda egenskaper kan läggas till. Den kemiska rymden utforskas på så vis mer effektivt än med större molekyler och resultatet är inte sällan en molekyl med bättre egenskaper än vad man får genom HTS. Avgörande för FBLG är tillgång till strukturinformation för att förstå hur tidiga ”träffar” effektivt kan byggas på. Det finns idag ett flertal molekyler i kliniska studier för olika sjukdomar där FBLG spelat en avgörande roll, t ex föreningar riktade mot -sekretas (Alzheimers) och kinaser (cancer) [3]. I figur 1 visas ett exempel med HSP90, som är av intresse att blockera eftersom proteinet påverkar tumörtillväxt [4]. Utvecklingen av inhibitorer mot HIVproteas är ett klassiskt exempel på framgångsrik, strukturbaserad design (figur 2). Enzymet HIV-proteas aktiverar HIVvirusproteiner och identifierades tidigt som ett viktigt målprotein för utveckling av läkemedel mot HIV. Kristallografi har använts, inte bara för design av läkemedel, men dessutom för att förstå bakgrunden till resistens mot olika inhibitorer av HIVproteas och för att utveckla strategier för att övervinna resistens [5]. I dag finns ett antal kraftfulla inhibitorer mot HIV-proteas på marknaden som utvecklats med hjälp av strukturbaserad design. Läkemedelsdesign handlar inte bara om målproteiner direkt kopplade till sjukdom. I ett nyligen publicerat arbete har kristallografi framgångsrikt använts för att studera bindning till så kallade CYP-enzymer [6]. De är viktiga för kroppens förmåga att bryta ned främmande substanser, inklusive läkemedel. CYP:ar – vi har cirka 60 olika va- rianter – utgör därför nyckelproteiner för nedbrytning av läkemedel, vilket gör det speciellt viktigt för oss att förstå CYP- metabolism och undvika inhibering av dem. Ett annat spännande utvecklingsområde för strukturbaserad design är membranproteiner, särskilt G-proteinkopplade receptorer, GPCR. De är målproteiner för ca 40 % av alla läkemedel på grund av sin centrala funktion i många cellulära processer. Membranproteinkristallografi är en utmaning, men de senare åren har en rad framgångar inom området ökat möjligheterna att kunna strukturbestämma GPCRproteiner med bundna kemiska föreningar och därmed också för design av läkemedel. Den första kristallstrukturen av en GPCR, i komplex med sitt G-protein, framtagen av Brian Kobilka och Robert Lefkowitz, belönades 2012 med Nobelpriset i kemi, vilket understryker vikten av arbetet [7]. Läkemedelsutveckling spänner över många discipliner och kräver samarbeten över gränser för att vara framgångsrik. I det sammanhanget kan man se proteinkristallografi som en viktig kugge som idag starkt bidrar till förståelse och utveckling av nya säkrare mediciner. KB Lipinskis fem-regler Reglerna (som innehåller fem eller multiplar av fem) beskriver kemiska och biologiska egenskaper hos en molekyl och används som indikator för dess potential som ett oralt läkemedel dvs beskriver hur läkemedelslik en molekyl är. • Inte mer än 5 vätedonatorer • Inte mer än 10 väteacceptorer • En molekylvikt under 500 g/mol • En fördelningskoefficient (log P) mindre än 5 Referenser: 1. Beddell CR, Goodford PJ, Norrington FE, Wilkinson S, Wootton R (1976) Compounds designed to fit a site of known structure in human haemoglobin. Br J Pharmacol 57: 201-209. 2. Liljas A, Kannan KK, Bergsten PC, Waara I, Fridborg K, et al. (1972) Crystal structure of human carbonic anhydrase C. Nat New Biol 235: 131-137. 3. Baker M (2013) Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov 12: 5-7. 4. Woodhead AJ, Angove H, Carr MG, Chessari G, Congreve M, et al. (2010) Discovery of (2,4-dihydroxy-5-isopropylphenyl)-[5-(4-methylpiperazin-1-ylmethyl)-1,3-dihydrois oindol-2-yl]methanone (AT13387), a novel inhibitor of the molecular chaperone Hsp90 by fragment based drug design. J Med Chem 53: 5956-5969. 5. Wlodawer A (2002) Rational approach to AIDS drug design through structural biology. Annual Review of Medicine 53: 595-614 6. Branden G, Sjogren T, Schnecke V, Xue Y (2014) Structure-based ligand design to overcome CYP inhibition in drug discovery projects. Drug Discov Today 19: 905-911. 7. Andrews SP, Brown GA, Christopher JA (2014) Structure-based and fragment-based GPCR drug discovery. ChemMedChem 9: 256-275 Kemivärlden Biotech med Kemisk Tidskrift. Nr 7-8 Juli/Augusti 2014 21
© Copyright 2024